Giáo trình môn Vi sinh thực phẩm

, tảo, nguyên sinh động vật. 1.1 Hình thái, cấu tạo của vi khuẩn Vi khuẩn (bacteria) là nhóm vi sinh vật có nhiều hình dạng, có nhân nguyên thủy và sinh sản bằng cách phân đôi. Các nhóm vi khuẩn Kích thước Hình dạng Cầu khuẩn Đường kính 0,5 – 1 micromet Hình tròn, ovan,... Gồm 6 nhóm: - Đơn cầu khuẩn: Micrococcus - Song cầu khuẩn Diplococcus - Tứ cầu khuẩn: Tetracoccus - Bát cầu khuẩn: Sarcina - Tụ cầu khuẩn: Staphylococcus - Liên cầu khuẩn: Streptococcus Trực khuẩn 0,5-1 x 1-4 micromet Hình que Gồm 5 nhóm: -Bacillus: Gram (+), sinh bào tử -Bacterium: Gram (-), không sinh bào tử, thường có chu mao - Pseudomonas: Gram (-), không sinh bào tử, có 1 tiêm mao - Corynebacterium: Gram (+), không sinh bào tử, có hình dạng thay đổi tùy loại - Clostridium: Gram (+), sinh bào tử hình thoi hoặc hình dùi trống Xoắn khuẩn (0,5-3)x(5-40) mm Là vi khuẩn có từ hai vòng xoắn trở lên, Gram (+) Phẩy khuẩn (0,5-3)x(5-10) mm Là vi khuẩn có hình dấu phẩy, dưới 2 vòng xoắn Cấu tạo của vi khuẩn: Gồm màng nhầy (màng tế bào) có vai trò duy trì áp suất thẩm thấu, khống chế sự vận chuyển, trao đổi ra vào của các chất dinh dưỡng và các sản phẩm trao đổi chất, sinh tổng hợp các chất, tiến hành phosphoryl hóa và phosphoryl quang hợp, ... Tế bào chất gồm toàn bộ phần nằm trong màng tế bào, là vùng dịch thể dạng keo khi tế bào non và có cấu trúc phức tạp khi tế bào già. Gồm cơ chất tương bào chứa enzim, các cơ quan con như mesosome, ribosome, không bào, hạt sắc tố, chất dự trữ. Chất nhân Bào tử Tiên mao và nhung mao Hình 1: Cấu tạo của vi khuẩn 1.2 Hình thái, cấu tạo của nấm men Hình dạng:hình cầu, hình trứng, hình oval,... Cấu tạo: gồm màng tế bào, tế bào chất: lưới nội chất, nhân, ribosome, ty thể, lysosome, golgi Hình 2: Hình dạng và cấu tạo của nấm men Hình thái, cấu tạo của nấm mốc Hình sợi Sinh sản bằng bào tử, có các dạng: bào tử đính, bào nử nang, Hình 3: Hình thái của nấm mốc 2. Ảnh hưởng của yếu tố lý học đối với sự sinh trưởng , phát triển của vi sinh vật và ứng dụng trong bảo quản chế biến thực phẩm 2.1Ảnh hưởng của tác nhân vật lý Độ ẩm Hoạt động sống của vi sinh vật đều liên quan đến nước và tỷ lệ nước trong tế bào của chúng rất cao. Nấm men 73-82%, nấm mốc 84- 90%, vi khuẩn 75-85%. Vì vậy thiếu nước tế bào có thể bị chết do hiện tượng loại nước ra khỏi tế bào. Sự đề kháng của vi sinh vật với trạng thái khô phụ thuộc vào: +Nguồn gốc vi sinh vật: vi sinh vật trong không khí chịu khô tốt hơn vi sinh vật trong đất, nước. +Loại hình vi sinh vật: sự đề kháng với trạngthái khô của nhóm xạ khuẩn > vi khuẩn > nấm mốc. +Trạng thái tế bào:tế bào già, tế bào có nha bào đề kháng đè kháng tốt hơn tế bào khô, tế bào không có nha bào. Do vi khuẩn cần độ ẩm nhất định để sinh trưởng nên bằng cách phơi khô hoặc sấy khô, ta có thể bảo quản được lâu dài nhiều loại sản phẩm (hoa quả khô, cỏ khô, ruốc thịt khô,...). Nhiệt độ Hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn có thể coi là kết quả của các phản ứng hóa học. Vì các phản ứng này phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ, nên yếu tố nhiệt độ rõ ràng ảnh hưởng sâu sắc đến các quá trình sống của tế bào. Tế bào thu được nhiệt độ chủ yếu từ môi trường bên ngoài, một phần cũng do cơ thể thải ra, do kết quả của hoạt động trao đổi chất. Như đã nói trên, hoạt động của vi sinh vật bị giới hạn trong môi trường chứa nước ở dạng có thể hấp thụ. Vùng này của nước nằm từ 20 đến khoảng 1000 gọi là vùng sinh động học. Hầu hết tế bào sinh dưỡng của vi sinh vật bị chết ở nhiệt độ cao protein bị biến tính, một hoặc hàng loạt enzyme bị bất hoạt. Các enzyme hô hấp đặc biệt là các enzyme trong chu trình Krebs rất mẫn cảm với nhiệt độ. Sự chết của vi khuẩn ở nhiệt độ cao cũng có thể còn là hậu quả của sự bất hoạt hóa ARN và sự phá hoại màng tế bào chất (nói chung các acid nucleic ít mẫn cảm với nhiệt độ so với các enzyme). Nhiệt độ thấp: (dưới vùng sinh động học) có thể làm bất hoạt các chất vận chuyển các chất hòa tan qua màng tế bào chất, do thay đổi cấu hình không gian của permease chứa trong màng hoặc ảnh hưởng đến việc hình thành và tiêu thụ ATP cần cho quá trình vận chuyển chủ động các chất dinh dưỡng. Vi khuẩn thường chịu đựng được nhiệt độ thấp. Ở nhiệt độ dưới điểm băng hoặc thấp hơn chúng không thể hiện hoạt động trao đổi chất rõ rệt. Nhiệt độ thấp có thể coi là yếu tố chế khuẩn nếu làm lạnh quá nhanh. Trong trường hợp làm lạnh dần dần xuống dưới điểm băng, cấu trúc tế bào bị tổn hại do các tinh thể băng được tạo thành nhưng kích thước nhỏ, do tế bào không bị phân hủy. Nếu làm lạnh trong chân không, các tinh thể băng sẽ thăng hoa, đó là phương pháp đông khô vi sinh vật Nhiệt độ cao: Nhiệt độ cao trên 65oC sẽ gây tác hại cho vi sinh vật và ở nhiệt độ 100oC hoặc hơn vi sinh vật sẽ bị tiêu diệt gần hết trong một thời gian nhất định. Đó là do nhiệt độ cao đã làm biến tính protein tế bào, enzyme bất hoạt, mang tế bào bị phá hủy và có thể tế bào bị đốt cháy hoàn toàn. Tác dụng của nhiệt độ cao đối với vi sinh vật còn có quan hệ với các nhân tố khác như thời gian tác động, sức chịu nhiệt của vi sinh vật , sức chịu nhiệt phụ thuộc vào bản chất tế bào đó là tính di truyền, tuổi và có hay không có nha bào và sau cùng là sự tồn tại của chúng trong môi trường có độ pH, thẩm áp và hợp chất hữu cơ khác nhau. Đây chính là cơ sở của việc khử trùng nhiêt độ cao có hiệu quả. Giới hạn giữa nhiệt độ cực tiểu và nhiệt độ cực đại là vùng nhiệt sinh trưởng của vi sinh vật. Giới hạn này rất khác nhau giữa các loài vi khuẩn: tương đối rộng ở các vi khuẩn hoại sinh nhưng rất hẹp ở các vi khuẩn gây bệnh. Tùy theo quan hệ với vùng nhiệt có thể chia vi khuẩn thành một số nhóm. + Vi khuẩn ưa lạnh: sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ dưới 20oC thường gặp trong nước biển, các hồ sâu và suối nước lạnh, chẳng hạn vi khuẩn phát quang, vi khuẩn sắt, hoạt tính trao đổi chất ở các vi khuẩn này thấp. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhiều vi khuẩn ưa lạnh dễ dàng thích ứng với nhiệt độ cao hơn. + Vi khuẩn ưa ấm: chiếm đa số, cần nhiệt độ trong khoảng 20- 400C. Ngoài các dạng hoại sinh ta còn gặp các dạng ký sinh gây bệnh cho người và động vật, chúng sinh trưởng tốt nhất ở 37oC (tương ứng với nhiệt độ cơ thể người và động vật). + Vi khuẩn ưa nóng: giới hạn nhiệt độ sinh trưởng là 30-70oC, thích hợp 55-60oC gồm các vi sinh vật sinh trưởng trong đất, phân rác, suối nước nóng. Các vi khuẩn ưa nóng gồm chủ yếu là các xạ khuẩn, các vi khuẩn sinh bào tử. Thường gặp chúng trong suối nước nống, trong phân ủ. Các giới hạn nhiệt độ cực tiểu, tối thích và cực đại được trình bày trong bảng sau. Các loài Bacillus sống trong đất, thường có nhiệt độ sinh trưởng khá rộng (15 – 40oC). Vi khuẩn E. coli có nhiệt độ sinh trưởng 10 - 47,5oC. Vi khuẩn gây bệnh lậu gonococcus phát triển ở nhiệt độ 36 – 40oC. Năm 1983 J. A. Baross đã phát hiện có một loài vi khuẩn ưa nhiệt, sinh trưởng thích hợp ở 25 – 30oC. Áp suất thẩm thấu Áp suất thẩm thấu và áp lực thủy tĩnh cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào vi khuẩn. Màng tế bào vi khuẩn là màng bán thấm và việc điều chỉnh thẩm áp qua các hệ thống permease đều có liên quan đến màng này. Trong môi trường ưu trương tế bào mất khả năng hút nước và các chất hòa tan, tế bào chịu trạng thái khô sinh lý, bị co nguyên sinh chất và có thể chết nếu kéo dài. Trong thực tế người ta áp dụng hiện tượng này để bảo quản cá bằng muối, muối dưa, bảo quản trái cây. Ngược lại khi đưa vi khuẩn vào dung dịch nhược trương nước sẽ xâm nhập vào tế bào, áp lực bên trong tế bào tăng lên. Đa số vi khuẩn sinh trưởng tốt hơn trong môi trường chứa ít hơn 20% muối. Nồng độ muối cao hơn có hại cho tế bào, nhưng cũng có loại vi khuẩn sinh trưởng tốt trong môi trường chứa 30% muối, ta gọi chúng là vi khuẩn ưa muối, nhiều vi khuẩn ở biển thuộc nhóm này. Chúng có thể phát triển tốt trong môi trường có nồng độ đường cao gọi là vi khuẩn ưa đường. Sóng siêu âm Sóng âm thanh đặc biệt là trong vùng siêu âm có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của vi khuẩn. Với tần số 8.800-8.900Hz xử lý trong 40-60 phút sẽ giảm 99% vi khuẩn. Các tế bào sinh dưỡng bị chết nhanh chóng, tế bào non mẫn cảm hơn nhiều so với tế bào già. Mẫn cảm nhất là tác dụng của sóng siêu âm lên các tế bào hình sợi, ít mẫn cảm nhất là các tế bào hình cầu. Nhưng sóng siêu âm hầu như không có tác dụng với các bào tử và các tế bào vi khuẩn kháng acid. Do tác dụng của siêu âm mà độ nhớt của môi trường tăng lên, xuất hiện các chất nâng cao sức căng bề mặt và trong nguyên sinh chất hình thành bọt khí nhỏ. Kết quả là tế bào bị hủy hoại. Hiện nay người ta ứng dụng siêu âm để thu nhận các chế phẩm vô bào hoặc để tách các enzyme nội bào, phân lập một số thành phần của tế bào, riboxom, thành tế bào và màng tế bào chất. Sức căng bề mặt Khi sinh trưởng trong môi trường dịch thể, vi khuẩn chịu ảnh hưởng của sức căng bề mặt của môi trường. Đa số các môi trường dịch thể dùng trong phòng thí nghiệm có sức căng bề mặt trong khoảng 5,7- 0,63 mN/cm. Những thay đổi mạnh mẽ của sức căng bề mặt có thể làm ngừng sinh trưởng và làm chết tế bào. Khi sức căng bề mặt thấp, các thành phần tế bào bị tách khỏi tế bào. Điều này chứng tỏ thành tế bào bị tổn thương. Các chất nâng cao sức căng bề mặt, hầu hết là các muối vô cơ, các chất làm giảm sức căng bề mặt hầu hết là các acid béo, anchol, các chất này được gọi là các chất có hoạt tính bề mặt. Tác dụng của chúng thể hiện trong việc làm thay đổi các đặc tính của bề mặt tế bào vi khuẩn, trước hết là nâng cao tính thấm của tế bào. Trong thực tế người ta ứng dụng hiện tượng này trong nuôi cấy vi khuẩn kháng acid. Khác với các vi khuẩn khác, vi khuẩn kháng acid, có bề mặt kỵ nước và giảm sức căng bề mặt của môi trường sẽ kích thích sinh trưởng của chúng. Sức căng bề mặt còn ngăn cản vi khuẩn gắn vào bề mặt cứng, tránh cho chúng khỏi cạnh tranh sinh trưởng. Tia bức xạ Ánh sáng có thể gây ra những biến đổi hóa học và tổn thương sinh học, nếu tế bào hấp thu. Mức độ gây hại tùy thuộc vào mức năng lượng trong lượng tử ánh sáng hay tùy thuộc vào chiều dài bước sóng ánh sáng. Các tia bức xạ gây nên những biến đổi hóa học của các nguyên tử và phân tử có chiều dài sóng khoảng 10000 A0 . Thuộc loại sau: ánh sáng mặt trời, tia tử ngoại, tia X, tia Gamma và tia vũ trụ, các tia sáng này có frnăng lượng rất lớn. Khi được vật chất hấp phụ chúng có thể làm bắn ra các electron từ vật chất đó. Vì vậy các tia này được gọi là tia bức xạ ion hóa. Những bức xạ với chiều dài bước sóng lớn hơn có năng lượng quá nhỏ, không đủ gây nên những biến đổi hóa học và tác dụng biểu hiện chủ yếu là nhiệt như tia hồng ngoại. Ánh sáng mặt trời: Là nguồn tia sáng chiếu tự nhiên và có tác dụng phá hủy tế bào vi khuẩn (ngoại lệ vi khuẩn quang hợp sử dụng ánh sáng mặt trời làm nguồn năng lượng). Tác dụng này bị yếu đi nếu vi khuẩn chứa sắc tố hay vỏ nhầy. Ánh sáng mặt trời cũng có thể gián tiếp tác động lên tế bào làm biến đổi môi trường. Chẳng hạn, các tụ cầu khuẩn Staphylococcus không sinh trưởng được trong môi trường thạch bị chiếu tia sáng mặt trời vài giờ. Ảnh hưởng của ánh sáng mặt trời lên tế bào vi khuẩn được tăng cường khi xử lý tế bào bằng một số thuốc nhuộm (metylen,...). Người ta gọi hiện tượng này là có tác dụng quang động học ánh sáng. Tia tử ngoại (tia cực tím -UV): So với các bức xạ ion thì tia tử ngoại có năng lượng nhỏ hơn. Khi bị vật chất hấp phụ, tia tử ngoại không gây nên hiện tượng ion hóa nhưng kích thích các phân tử, nghĩa là chuyển điện tử đến một mức cao hơn. Tác dụng mạnh nhất của tia tử ngoại là là vùng có chiều dài bước sóng khoảng 254-260 nm nghĩa là vùng hấp thụ cực đại của acid nucleic và nucleoprotein. Dưới ảnh hưởng của tia tử ngoại, vi khuẩn bị chết hoặc bị đột biến theo loại vi khuẩn và liều lượng chiếu, bào tử của mốc có sức đề kháng cao. Điều đáng chú ý là những hư hại do tia tử ngoại gây ra cho tế bào phần nào có tính đảo ngược. Nếu sau khi chiếu tia tử ngoại, ta lại cho vi khuẩn chịu tác dụng của ánh sáng ban ngày, thì nhiều vi khuẩn có khả năng sống sót và tiếp tục phân chia.. Tia sáng mặt trời tuy có chứa một phần tia tử ngoại nhưng phần lớn những tia này bị khí quyển (mây, ozon,...) giữ lại. Vì vậy ánh nắng có tác dụng diệt khuẩn nhỏ hơn so với tia tử ngoại dùng trong phòng thí nghiệm. Do lực xuyên sâu của tia tử ngoại kém, chỉ xuyên qua lớp nước trong và thủy tinh mỏng nên thường được sử dụng trong khử trùng không khí, như buồng cấy vi sinh vật, phòng mổ. Ứng dụng trong bảo quản chế biến thực phẩm Dưới tác động của các yếu tố lý học, tế bào vi sinh vật bị ức chế một phần hoặc hoàn toàn. Trên cơ sở đó, người ta áp dụng các phương pháp vật lý để bảo quản thực phẩm khỏi tác hại của vi sinh vật Thanh trùng, tiệt trùng sản phẩm: sử dụng nhiệt độ cao để tiêu diệt vi sinh vật Khử trùng dụng cụ, buồng cấy bằng tia UV Bảo quản rau quả bằng cách ướp đường, ướp muối Ảnh hưởng của các yếu tố hóa học đến sự sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật và ứng dụng trong bảo quản chế biến thực phẩm Ảnh hưởng của yếu tố hóa học đối với sự sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật Độ pH Độ pH có quan hệ rất lớn đối với sự sinh trưởng của VSV. Giới hạn pH của sự sinh trưởng: là khoảng pH từ cực tiểu đến cực đại mà vsv có khả năng sinh trưởng. Trong khoảng pH này có pH thích hợp nhất, ở đó vsv có sự sinh trưởng và phát triển cao nhất. Tác dụng của pH có ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình trao đổi chất của tế bào vì pH cần cho hoạt động của nhiều enzyme, nồng độ ion H còn ảnh hưởng trực tiếp đến độ hòa tan của một số muối khoáng như K, Na, Mg do đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vsv. Đa số vsv thích ứng ở pH từ 4,5 đến 9,0, tùy từng chủng giống vsv khác nhau mà thích ứng khác nhau. Ví dụ: Rhizobium , pH thích hợp ở 6,5 đến 7,5 Saccharomyces, pH thích hợp ở 4,0 đến 6,0 Điện thế oxi hóa khử Trong hoạt động sống của vsv chịu ảnh hưởng rất lớn của điện thế oxi hóa khử trong môi trường, thường thì vsv yếm khí chịu được ở rH2 thấp từ 0-12 vôn, đối với vsv hảo khí từ 10-30 vôn. Tùy từng chủng giống vsv khác nhau mà chịu được rH2 khác nhau. Các chất sát trùng, ức chế, diệt khuẩn Chất sát trùng là chỉ những chất có thể giết chết vsv gây bệnh hoặc không gây bệnh nhưng không giết chết được nha bào Chất ức chế là những chất chỉ làm ngừng quá trình sinh trưởng, phát triển, vsv không bị giết chết mà ở trạng thái tiềm tàng. Chất diệt khuẩn là chỉ các chất có thể giết chết toàn bộ vi khuẩn kể cả nha bào. Ví dụ: HgCl, AgNO3, CuSO4 Một chất có thể vừa là chất sát trùng, ức chế hay diệt khuẩn tùy thuộc vào nồng độ, thời gian, loại vsv tác động và các yếu tố khác. Các chất hóa trị liệu Các chất hóa trị liệu gồm các chất có thể tổng hợp được bằng phương pháp hóa học, có tác dụng độc đối với vsv nhưng hầu như không gây hại cho động vật. Các chất hóa trị liệu có hoạt tính cao nên đã tranh chỗ trong phản ứng sinh tổng hợp của tế bào, vì vậy đã hình thành nên các hợp chất không cần thiết cho cơ thể làm cho các phản ứng sinh hóa của tế bào bị kìm hãm, gây ức chế quá trình sinh trưởng, phát triển của tế bào vi khuẩn. Ví dụ: sunfolamit. Các chất kháng sinh Kháng sinh là chất do vsv sinh ra, ngay ở nồng độ thấp, kháng sinh cũng có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt các vsv một cách đặc hiệu, mỗi kháng sinh chỉ tác động lên một vi khuẩn hoặc một nhóm vi khuẩn bằng cách gây rối loạn phản ứng sinh vật ở ngưỡng phân tử. Cơ chế tác động của thuốc kháng sinh lên vsv: + Ức chế sinh tổng hợp hoặc phá hủy vách tế bào, nên vi khuẩn sinh ra không có vách tế bào, do đó bị tiêu diệt + Gây rối loạn chức năng màng nguyên sinh, đặc biệt là chức năng thẩm thấu, chọn lọc, do đó làm ngừng quá trình trao đổi chất + Làm ngừng quá trình tổng hợp protein + Gây ức chế sự tổng hợp axit nucleic, ngăn cản sự sao chép AND, ngăn cản ính tổng hợp ARN-polimeraza, tức là ức chế sinh tổng hợp những chất cần thiết cho tế bào. Tùy từng chủng giống vsv khác nhau mà khả năng chịu được các loại thuốc và liều lượng kháng sinh khác nhau. Ứng dụng trong bảo quản chế biến thực phẩm Căn cứ vào tác động của các chất hóa học lên tế bào vi sinh vật mà có các cách bảo quản chế biến thực phẩm khác nhau. Ứng dụng giảm pH để bảo quản rau quả trong các sản phẩm rau quả dầm giấm, rau quả muối chua. Sử dụng một số chất bảo quản có bản chất là chất ức chế vi sinh vật Bài 2: Sự phân giải của hợp chất hữu cơ dưới tác dụng của Vi sinh vật và ứng dụng trong công nghiệp 1 Sự phân giải của các hợp chất hữu cơ có Nitơ Nitrogen cycle chu trình nitơ, sự tuần hoàn của nitơ giữa các sinh vật và môi trường. Nitơ dạng khí trong khí quyển chỉ được sử dụng trực tiếp bởi một số vi sinh vật (clostridium) và một số tảo lam (nostoc). Chúng biến đổi nitơ thành dạng amon, nitrit và nitrat, những chất này sau đó được giải phóng vào đất bởi các quá trình bài tiết và phân giải. Có một cách khác để niư tơ khí quyền được cố định là nhờ các tia lửa điện của sấm sét. Phần lớn thực vật chỉ có thể sử dụng nitơ dưới dạng nitrat, trừ một số thực vật cộng sinh với vi khuẩn nốt sần Rhizobium hoặc các sinh vật khác tạo nốt sẵn của rễ. Khi thực vật và động vật chất thì nitơ hữu cơ trong chúng biến đổi trở lại thành dạng nitrat trong quá trình gọi là nitrat hoá. Một phần nitrat này được thực vật hấp thụ, còn một phần bị mất do quá trình khử nitrit và quá tình rửa trôi. Sự tăng cường sử dụng phân bón trong nông nghiệp (nitrat amon) hiện nay trở thành một nhân tố quan trọng trong chu trình nitơ .x.nitrogen fixation. 1.1 Vai trò của vi sinh vật trong vòng tuần hoàn Nitơ Trong các môi trường tự nhiên, nitơ tồn tại ở các dạng khác nhau, từ nitơ phân tử ở dạng khí cho đến các hợp chất hữu cơ phức tạp có trong cơ thể động, thực vật và con người. Trong cơ thể sinh vật, nitơ tồn tại chủ yếu dưới dạng các hợp chất đạm hữu cơ như protein, axit amin. Khi cơ thể sinh vật chết đi, lượng nitơ hữu cơ này tồn tại ở trong đất. Dưới tác dụng của các nhóm vi sinh vật hoại sinh, protein được phân giải thành các axit amin. Các axit amin lại được một nhóm vi sinh vật phân giải thành NH3 hoặc NH4+ gọi là nhóm vi khuẩn amôn hoá. Quá trình này còn gọi là sự khoáng hoá chất hữu cơ vì qua đó nitơ hữu cơ được chuyển thành dạng nitơ khoáng. Dạng NH4+ sẽ được chuyển hoá thành dạng NO3- nhờ nhóm vi khuẩn nitrat hoá. Các hợp chất nitrat lại được chuyển hoá thành dạng nitơ phân tử, quá trình này gọi là sự phản nitrat hoá được thực hiện bởi nhóm vi khuẩn phản nitrat. Khí nitơ sẽ được cố định lại trong tế bào vi khuẩn và tế bào thực vật sau đó chuyển hoá thành dạng nitơ hữu cơ nhờ nhóm vi khuẩn cố định nitơ. Như vậy, vòng tuần hoàn nitơ được khép kín. Trong hầu hết các khâu chuyển hoá của vòng tuần hoàn đều có sự tham gia của các nhóm vi sinh vật khác nhau. Nếu sự hoạt động của một nhóm nào đó ngừng lại, toàn bộ sự chuyển hoá của vòng tuần hoàn cũng sẽ bị ảnh hưởng nghiêm trọng. 1.2 Quá trình amôn hoá Trong thiên nhiên tồn tại nhiều dạng hợp chất nitơ hữu cơ như protein, axit amin, axit nucleic, urê ... Các hợp chất này đi vào đất từ nguồn xác động, thực vật, các loại phân chuồng, phân xanh, rác rưởi. Thực vật không thể đồng hoá được dạng nitơ hữu cơ phức tạp như trên, nó chỉ có thể sử dụng được sau quá trình amôn hoá. Qua quá trình amôn hoá, các dạng nitơ hữu cơ được chuyển hoá thành dạng NH4+ hoặc NH3. 1.3 Sự amôn hoá urê Urê có trong thành phần nước tiểu của người và động vật, chiếm khoảng 2,2% nước tiểu. Urê chứa tới 46,6% nitơ, vì thế nó là một nguồn dinh dưỡng đạm tốt với cây trồng. Tuy nhiên, thực vật không thể đồng hoá trực tiếp Urê mà phải qua quá trình amôn hoá. Quá trình amiin hoá Urê chia ra làm 2 giai đoạn, giai đoạn đầu dưới tác dụng của enzym ureaza tiết ra bởi các vi sinh vật Urê sẽ bị thuỷ phân tạo thành muối cacbonat amoni, giai đoạn 2 cacbonat amoni chuyển hoá thành NH3, CO2 và H2O: Trong nước tiểu còn có axit uric, tồn tại trong đất một thời gian axit uric sẽ bị phân giải thành urê và axit tactronic. Sau đó urê sẽ tiếp tục bị phân giải thành NH3. Nhóm vi sinh vật phân giải Urê và axit uric còn có khả năng amôn hoá cyanamid canxi là một loại phân bón hoá học. Chất này sau khi đi vào đất cũng bị chuyển hoá thành Urê rồi sau đó qua quá trình amôn hoá được chuyển thành NH3: Nhiều loài vi khuẩn có khả năng amôn hoá Urê, chúng đều tiết ra enzym ureaza. Trong đó có một số loài có hoạt tính phân giải cao như Planosarcina ureae, Micrococcus ureae, Bacillus amylovorum, Proteus vulgaris ... Một số loài vi khuẩn có khả năng amôn hoá Urê. Đa số vi sinh vật phân giải Urê thuộc nhóm háo khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, chúng ưa pH trung tính hoặc hơi kiềm. Bởi vậy khi sử dụng Urê làm phân bón người ta thường kết hợp với bón vôi hoặc tro, đồng thời xới xáo làm thoáng đất. 1.4 Sự amôn hoá protein Khác với lên men, cơ chất của quá trình thối rữa là protein. Protein là một trong những thành phần quan trọng của xác động vật, thực vật và vi sinh vật. Protein thường chứa khoảng 15,0 - 17,6% nitơ (tính theo chất khô). Nếu như tổng lượng cacbon trong cơ thể các sinh vật sống trên mặt đất là vào khoảng 700 tỉ tấn thì tổng lượng nitơ ít ra cũng tới 10 - 25 tỉ tấn. Trong lớp đất sâu 30 cm bao quanh Trái Đất người ta còn thấy thường xuyên có khoảng 3 - 7,5 tỉ tấn nitơ mà phần lớn là tồn tại trong các hợp chất hữu cơ chứa nitơ. Sự phân giải các hợp chất hữu cơ chứa nitơ có ý nghĩa rất lớn đối với nông nghiệp và đối với vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Người ta còn gọi là quá trình phân giải này là quá trình amôn hoá. Muốn phân giải protein, cũng giống như đối với các hợp chất cao phân tử khác, đầu tiên vi sinh vật phải tiết ra các enzym phân giải protein ngoại bào và làm chuyển hoá protein thành các hợp chất có phân tử nhỏ hơn (các polipeptit và các oligopeptit). Các chất này hoặc tiếp xúc được phân huỷ thành axit amin nhờ các peptidaza ngoại bào, hoặc được xâm nhập ngay vào tế bào vi sinh vật sau đó mới chuyển hoá thành axit amin. Một phần các axit amin này được vi sinh vật sử dụng trong quá trình tổng hợp protein của chúng, một phần khác được tiếp tục phân giải theo những con đường khác nhau để sinh NH3, CO2 và nhiều sản phẩm trung gian khác. Những vi sinh vật không có khả năng sinh ra các enzym phân giải protein ngoại bào rõ ràng là không có khả năng đồng hoá được các loại protein thiên nhiên. Chúng chỉ có thể sử dụng được các sản phẩm thuỷ phân của protein (polipeptit, oligopeptit, axit amin) + Một số axit amin bị deamin hoá bởi VSV nhờ enzym deaminaza, 1 số phản ứng, một trong những sản phẩm cuối cùng là amôn, ví dụ: Đối với các axit amin có vòng như Triptophan, khi phân giải sẽ tạo thành các hợp chất có mùi thối như Indo vàScaton. Khi phân giải các axit amin chứa S như Metionin, Xistin, vi sinh vật giải phóng ra H2S, chất này độc đối với cây trồng. Một số hợp chất amin sinh ra trong quá trình amôn hoá có tác dụng độc đối với người và động vật. Ví dụ như histamin, acmatin ... đó chính là nguyên nhân bị nhiễm độc khi ăn thịt cá thiu thối hoặc thịt hộp để quá lâu (ô nhiễm thực phẩm). Tỷ lệ C : N trong đất rất quan trọng đối với nhóm vi sinh vật phân huỷ protein. Nếu như tỷ lệ này quá cao, trong đất quá ít đạm vi sinh vật sẽ tranh chấp thức ăn đạm đối với cây trồng, chúng phân huỷ được bao nhiêu là hấp thụ hết vào tế bào. Nếu tỷ lệ C : N quá thấp, đạm dư thừa, quá trình phaâ huỷ sẽ chậm lại, cây trồng không có đạm khoáng mà hấp thụ. Nhiều công trình nghiên cứu đã rút ra tỷ lệ C:N bằng 20 là thích hợp nhất cho quá trình amôn hoá protein, có lợi nhất đối với cây trồng. Nhiều vi sinh vật có khả năng amôn hoá protein. Trong nhóm vi khuẩn có Bacillus mycoides, Bacillus mesentericus, B. subtilis, Pseudomonas fluorescens, Clostridium sporogenes ... Xạ khuẩn có Streptomyces rimosus, Stretomyces griseus ... Vi nấm có Aspergillus oryzae, A. flavour, A. niger, Penicilium camemberti v.v.... Ngoài protein và ure, nhiều loài vi sinh vật có khả naăg amôn hoá kitin là một hợp chất cacbon chứa gốc amin. Kitin là thành phần của vỏ nhiều loại côn trùng, giáp xác. Hàng năm kitin được tích luỹ lại trong đất với một lượng không nhỏ. Nhóm vi sinh vật phân huỷ kitin có khả năng tiết enzym kitinaza và kitobiaza phân huỷ phân tử kitin thành các gốc đơn phân tử, sau đó gốc amin được amôn hoá tạo thành NH3. 1.5 Quá trình nitrat hoá Sau quá trình amôn hoá, NH3 được hình thành một phần được cây trồng hấp thụ, một phần phản ứng với các anion trong đất tạo thành các muối amôn. Một phần các muối amôn cũng được cây trồng và vi sinh vật hấp thụ. Phần còn lại được oxy hoá thành dạng nitrat gọi là quá trình nitrat hoá. Trước kia người ta cho rằng quá trình nitrat hoá là một quá trình hoá học thuần tuý. Sau này người ta mới tìm ra bản chất vi sinh vật học của nó. Nhóm vi sinh vật tiến hành quá trình này gọi chung là nhóm vi khuẩn nitrat hoá bao gồm hai nhóm tiến hành 2 giai đoạn của quá trình. Giai đoạn oxy hoá NH4+ thành NO2- gọi là giai đoạn nitrat hoá, giai đoạn oxy hoá NO2- thành NO3- gọi là giai đoạn nitrat hoá. Giai đoạn nitrit hoá Quá trình oxy hoá NH4+ tạo thành NO2+ được tiến hành bởi nhóm vi khuẩn nitrit hoá. Chúng thuộc nhóm vi sinh vật tự dưỡng hoá năng có khả năng oxy hoá NH4+ bằng oxy không khí và tạo ra năng lượng: NH4+ + 3/2 O2 → NO2+ + H2O + 2H + Năng lượng Năng lượng này dùng để đồng hoá CO2 → Cacbon hữu cơ Enzym xúc tác cho quá trình này là các enzym của quá trình hô hấp háo khí. Nhóm vi khuẩn nitrit hoá bao gồm 4 chi khác nhau: Nitrozomonas, Nitrozocystis, Nitrozolobus và Nitrosospira chúng đều thuộc loại tự dưỡng bắt buộc, không có khả năng sống trên môi trường thạch. Bởi vậy phân lập chúng rất khó, phải dùng silicagen thay cho thạch. Giai đoạn nitrat hóa Quá trình oxy hoá NO2- thành NO3- được thực hiện bởi nhóm vi khuẩn nitrat. Chúng cũng là những vi sinh vật tự dưỡng hoá năng có khả năng oxy hoá NO2- tạo thành năng lượng. Năng lượng này được dùng để đồng hoá CO2 tạo thành đường. NO2- + 1/2 O2 → NO3- + Năng lượng Nhóm vi khuẩn tiến hành oxy hoá NO2- thành NO3- bao gồm 3 chi khác nhau; Niitrobacter, Nitrospira và Nitrococcus. Ngoài nhóm vi khuẩn tự dưỡng hoá năng nói trên, trong đất còn có một số loài vi sinh vật dị dưỡng cũng tiến hành quá trình nitrat hoá. Đó là các loài vi khuẩn và xạ khuẩn thuộc các chi Pseudomonas, Corynebacterium, Streptomyces ... Quá trình nitrat hoá là một khâu quan trọng trong vòng tuần hoàn nitơ, nhưng đối với nông nghiệp nó có nhiều điều bất lợi: Dạng đạm nitrat thường dễ bị rửa trôi xuống các tầng sâu, dễ bị đi vào quá trình phản nitrat hoá tạo thành khí nitơ làm cho đất mất đạm. Anion NO3- thường kết hợp với ion H+ trong đất tạo thành HNO3 làm cho pH đất giảm xuống rất bất lợi đối với cây trồng. Hơn nữa, lượng NO3 dư thừa trong đất được cây trồng hấp thu nhiều làm cho hàm lượng nitrat trong sản phẩm lương thực, thực phẩm cao gây độc cho người. Bởi vậy ngày nay người ta thường hạn chế việc bón phân đạm hoá học có gốc nitrat. Quá trình phản nitrat hóa Các hợp chất đạm dạng nitrat ở trong đất rất dễ bị khử biến thành nitơ phân tử. Quá trình này gọi là quá trình phản nitrat hoá. Nó khác với quá trình oxy hoá nitrat tạo thành NH4+ còn gọi là quá trình amôn hoá. Có thể phân biệt hai quá trình trên qua sơ đồ sau: Quá trình amôn hoá nitrat do một số vi khuẩn dị dưỡng tiến hành trong điều kiện hiếu khí có chức năng cung cấp NH4+ cho tế bào vi khuẩn để tổng hợp axit amin. Phản ứng khử NO3 → N2 chỉ xảy ra trong điều kiện kỵ khí. NO3- là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi hô hấp kỵ khí, năng lượng tạo ra được dùng để tổng hợp nên ATP. Nhóm vi sinh vật thực hiện quá trình phản nitrat hoá phân bố rộng rãi trong đất. Thuộc nhóm tự dưỡng hoá năng có Thibacillus denitrificans, Hydrogenomonas agilis ... Thuộc nhóm dị dưỡng có Pseudomonas denitrificant, Micrococcus denitrificanas ... sống trong điều kiện kỵ khí (ngập nước). Đối với nông nghiệp quá trình phản nitrat hoá là một quá trình bất lợi vì nó là cho đất mất đạm. Quá trình này xảy ra mạnh trong điều kiện kỵ khí. Oxy có tác dụng ức chế các enzym xúc tác cho quá trình khử nitrat, đó là các enzym nitrat reductaza và nitrit reductaza. Ở các ruộng lúa nước người ta thường làm cỏ xục bùn để hạn chế quá trình này, đồng thời bón đạm amôn chứ không bón đạm nitrat. Trong các môi trường tự nhiên ngoài quá trình phản nitrat sinh học nói trên còn có quá trình phản nitrat hoá học thường xảy ra ở pH < 5,5. Các quá trình này không có sự tham gia của vi sinh vật: 2 Sự phân giải của các hợp chất hữu cơ không có Nitơ Vòng tuần hoàn cacbon trong tự nhiên Carbon cycle chu trình cacbon : Sự chu chuyển của nguyên tố cacbon giữa cơ thể và môi trường nhờ hoạt động sống của các sinh vật trong hệ sinh thái. Cacbon đioxit ( CO2) trong khí quyển hay trong nước được sinh vật tự dưỡng hấp thụ và biến đổi thành các hợp chất hữu cơ phức tạp như hyđrat cacbon, protein, lipit ... thông qua quá trình quang hợp và những phản ứng sinh hoá. Một phần các chất được tạo thành cấu trúc nên cơ thể thực vật. Thực vật được động vật hay các sinh vật dị dưỡng sử dụng, sau đó, các chất bài tiết cũng như xác chết của sinh vật bị vi khuẩn phân huỷ đến giai đoạn cuối cùng ( giai đoạn kháng hoá ) trả lại Cacbon đioxit cho môi trường. Hình 3.1 Chu trình cacbon Vai trò của vi sinh vật trong vòng tuần hoàn cacbon Cacbon trong tự nhiên nằm ở rất nhiều dạng hợp chất khác nhau, từ các hợp chất vô cơ đến các hợp chất hữu cơ. Các dạng này không bất biến mà luôn luôn chuyển hoá từ dạng này sang dạng khác, khép kín thành một chu trình chuyển hoá hoặc vòng tuần hoàn cacbon trong tự nhiên. Vi sinh vật đóng một vai trò quan trọng trong một số khâu chuyển hoá của vòng tuần hoàn này. Các hợp chất cacbon hữu cơ chứa trong động vật, thực vật, vi sinh vật, khi các vi sinh vật này chết đi sẽ để lại một lượng chất hữu cơ khổng lồ trong đất. Nhờ hoạt động của các nhóm vi sinh vật dị dưỡng cacbon sống trong đất, các chất hữu cơ này dần dần bị phân huỷ tạo thnàh CO2. CO2 được thực vật và vi sinh vật sử dụng trong quá trình quang hợp lại biến thành các hợp chất cacbon hữu cơ của cơ thể thực vật. Động vật và con người sử dụng cacbon hữu cơ của thực vật biến thành cacbon hữu cơ của động vật và người. Người, động vật, thực vật đều thải ra CO2 trong quá trình sống, đồng thời khi chết đi để lại trong đất một lượng chất hữu cơ, vi sinh vật lại bị phân huỷ nó. Cứ thế trong tự nhiên các dạng hợp chất cacbon được chuyển ... của sự biến đỏ được giải thích như sau: tôm tươi trong vỏ và thịt chứa chất astaxanthin có màu xanh tím, bình thường astaxanthin kết hợp với protein tạo thành phức bền nhưng dưới tác dụng của nhiệt, axit, sự phân huỷ của thịt tôm làm cho astaxanthin bị tách ra khỏi protein. Astaxnthin sẽ bị oxi hoá tạo thành astaxin có màu đỏ gạch. Tôm sau khi đánh bắt từ 8÷12h, bảo quản ở nhiệt độ 30÷400C thì sự biến đỏ xảy ra rất nhanh. Kèm theo sự biến đỏ là sự thối rữa protein làm cho chất lượng tôm giảm. Cơ chế của quá trình thối rửa: Protein peptone axit amin ammoniac, sunfuahydro, indol, cadaverin, mercaptal Sự biến đen của tôm: hiện tượng biến đen của tôm do hai nguyên nhân khác nhau. Thứ nhất là do vi khuẩn phát triển mạnh trên tôm sau khi đánh bắt tạo thành các khuẩn lạc màu đen. Thứ hai là do triozin bị oxi hoá tạo thành melanin, sự tích tụ melanin làm cho tôm có màu đen. Sự biến đen của tôm chỉ làm giảm giá trị cảm quan còn chất lượng dinh dưỡng vẫn đảm bảo. c. Phương pháp bảo quản tôm Để đảm bảo chất lượng tôm sau khi đánh bắt người ta dùng các biện pháp bảo quản sau đây: - Dùng nhiệt độ thấp như ướp đông. - Dùng nhiệt độ thấp kết hợp với các hoá chất trong điều kiện môi trường axit. - Sấy khô. 3. Hệ vi sinh vật trên mực a. Đặc điểm của mực Mực là động vật chân đầu phân bố rộng trong biển, toàn bộ cơ thể mực có lớp da bao phủ bên ngoài, vì vậy mực ít bị nhiễm vi sinh vật trong quá trình sống. Tuy nhiên trên da mực lại có chất nhớt rất thích hợp cho vi sinh vật phát triển sau khi mực chết. Về thành phần dinh dưỡng thì mực cũng là thực phẩm giàu dinh dưỡng: protein 17÷19%, lipid 0,2÷0,5%, nước 80%, nhiều các chất khoáng và vitaminCấu tạo của thịt mực chặt chẽ hơn cá, tôm nên sau khi đánh bắt mực lâu hư, thối hơn. b. Hệ vi sinh vật của mực và các dạng hư hỏng Dạng hư hỏng phổ biến ở mực chủ yếu là dạng thối rữa. Về cơ chế của sự thối rữa và vi sinh vật gây thối rữa giống ở tôm. Các vi khuẩn gây thối rữa chủ yếu là Pseudononas flourescens, Clostridium sporogenes, Clostridium putrificus, Proteus vulgaris Mực khô bị các vết màu là do nấm mấn mốc phát triển tạo thành các khuẩn lạc có màu đen, vàng, trắng c. Phương pháp bảo quản mực Mực chủ yếu được bảo quản đông lạnh và phơi khô. 4. Hệ vi sinh vật của động vật thân mềm a. Đặc điểm của động vật thân mềm Động vật thân mềm có vỏ cứng bằng đá vôi bao phủ, phần mềm ăn được chỉ chiếm từ 30÷40%, lượng nước chiếm tới 80%, protein chiếm 17÷19%, gluxid từ 2÷10%, lipid từ 0,2÷0,4%. Cấu tạo cơ của động vật thân mềm lỏng lẻo nên rất dễ tiêu hoá. Vì vậy chúng cũng dễ bị vi sinh vật gây thối phân huỷ. b. Hệ vi sinh vật của thân mềm và các dạng hư hỏng Sự hư hỏng của động vật thân mềm chủ yếu là quá trình thối rữa, ngoài các sản phẩm cấp thấp như ở cá, tôm, mực còn có các axit nên tạo thành mùi hôi thối khó chịu. Ngoài ra khi ướp đông thịt động vật thân mềm thường có màu vàng do quá trình oxi hoá. c. Phương pháp bảo quản động vật thân mềm Người ta thường bảo quản thịt của động vật thân mềm bằng phương pháp đông lạnh, sấy khô. Bài 5: Vi sinh vật trong bảo quản và chế biến đường bột bánh kẹo 1 Vi sinh vật trong bột Vi sinh vật trong bột do hai nguồn nhiễm chính là từ hạt (chủ yếu) và từ không khí, nước, dụng cụ xay xát, các đồ chứa đựng Hạt dùng để xay bột bao giờ cũng chứa một số lựơng vi sinh vật nhất định nào đó. Trong quá trình nghiền phần lớn các vi sinh vật trên bề mặt hạt chuyển vào trong bột. Số lượng vi sinh vật có trong bột ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng của bột vi sinh vật thường nhiều nhất là ở cám và bột có chất lượng cao thì ít vi sinh vật. Trong bột thường có vi khuẩn và nấm mốc. Trong các loài vi khuẩn có thể thấy các tế bào sinh dưỡng hay bào tử của trực khuẩn khoai tây (Bacillus mesentericus ) và trực khuẩn cỏ khô (Bacillus subtilis). Những trực khuẩn này lẫn trong bột và sau này gây ra bệnh khoai tây ở bánh mì. Ngoài ra còn có thể gặp E.coli nếu nước dùng để nghiền bột không hợp vệ sinh. 2 Ảnh hưởng của vi sinh vật đến phẩm chất của bột trong bảo quản Bột tương đối đủ các chất dinh dưỡng và vi sinh vật có thể dễ sử dụng các chất dinh dưỡng này để phát triển. Hơn nữa bột không có tính chất bảo vệ như hạt nguyên vẹn. Vì vậy chỉ cần nâng ẩm độ và nhiệt độ lên một ít cũng đủ tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật phát triển và gây hư hỏng bột. Trong điều kiện độ ẩm không khí dưới 79% và nhiệt độ dưới 20oC, ẩm độ của hạt dưới 15% vi sinh vật trong bột sẽ không tăng lên mà dần dần chết đi khi bảo quản bột trong thời gian dài. Nếu ẩm độ của bột chỉ cần tăng lên 1-2% thì vi khuẩn và nấm mốc trong bột sẽ phát triển mạnh. Tuỳ thuộc vào mức độ nhiễm vi sinh vật trong bột mà bột có thể bị những hư hỏng sau: mốc, tự bốc nóng, chua, ôi Mốc là hiện tượng hay gặp ở bột hơn cả. Ở đây ta thấy các loài nấm mốc như: Aspergillus, Penicilium mọc ở trong bột trong điều kiện ẩm độ thấp hơn vi khuẩn. Bột bị mốc ở điều kiện ẩm độ không khí cao hơn 80%, bột mốc sẽ bị giảm phẩm chất nhanh chóng vì mốc tạo cho bột hôi không thể khử được. Mùi hôi chủ yếu do Penicilium gây ra. Mốc làm tăng độ axit của bột, do mốc phân huỷ các chất béo tạo thành axit tự do, đồng thời làm giảm chất lượng gluten, bị mất tính đàn hồi và thẩm màu. Mốc bắt đầu từ bên ngoài rồi lan dần vào bên trong sau đó gây ra hiện tượng tự bốc nóng. Mốc và tự bốc nóng làm cho bột giảm chất lượng cảm quan và bột bị kết vón. Bột chua thường bắt đầu từ những lớp bên trong khác với hiện tượng mốc. Nguyên nhân gây ra bột chua là do vi khuẩn lactic và một số vi khuẩn khác lên men đường có trong bột thành những axit khác nhau. Kết quả là tạo cho bột có độ chua và độ axit trong bột tăng lên rõ rệt. Đường có trong bột là do enzyme amylase của bản thân bột và vi khuẩn phân huỷ tinh bột tạo thành đường. Bột bị ôi là do sự oxi hoá các chất béo trong bột bằng oxi không khí tạo thành các chất có vị ôi. Để bảo quản bột tốt cần bảo quản bột ở ẩm độ không khí dưới 79%, ẩm độ của bột không quá 14÷15% trong điều kiện nhiệt độ ổn định. Ở điều kiện này giữ bột được 3÷5 tháng, ở điều kiện ẩm độ bột từ 12÷13% giữ được 1 năm. 3 Vi sinh vật trong sản xuất bánh mì Quá trình làm bánh mì dựa trên hàng loạt các phản ứng hoá sinh do nấm men gây ra trong khi chuẩn bị nhào bột và nướng bánh. Nấm men biến đổi đường của bột thành rượu và khí cacbonic. Khí này làm phồng gluten của bột làm bánh nở. Ngoài nấm men còn có vi khuẩn lactis. Những vi khuẩn này hoạt động tạo ra axit làm giảm pH của môi trường tạo điều kiện cho nấm men phát triển. Những giai đoạn quan trọng của quá trình làm bánh mì: chuẩn bị nguyên liệu hỗn hợp bột lên men nặn bánh nướng bánh thành phẩm. Bột mì làm bánh được đánh giá phẩm chất dựa vào hai chỉ số chính là tạo khí và giữ khí. Ngoài ra cò chú ý đến độ mịn, màu sắc, độ axit Vi sinh vật dùng trong sản xuất bánh mì chủ yếu là Saccharomyces cerevisiae. a. Vi sinh vật làm nở bột nhào và tạo hương bánh mì Trong khi nhào bột có hai quá trình xảy ra là lên men rượu etylic tạo khí cacbonic nhờ nấm men bánh mì Saccharomyce cerevisiae, cùng với quá trình tạo ra axit hữu cơ (chủ yếu là axit lactic) nhờ vi khuẩn lactic có trong bột, sau đó axit hữu cơ tác dụng với rượu tao ra este có mùi vị thơm ngon. Để làm bánh mì người ta dùng các loại men nước, men khô, men ép từ loài Saccharomyce cerevisiae. Những vi sinh vật tạo hương của bánh mì: trong bột nhào còn có các vi khuẩn lactic lên men điển hình và không điển hình. Ngoài axit lactic nhóm lên men không điển hình còn tạo ra các axit bay hơi, khí hydro, khí cacbonic, rượu etylic. Các vi khuẩn này tạo ra các este và axit làm cho bánh mì có mùi thơm đặc biệt. Một số vi sinh vật khác: trong bột còn có thể có một số nấm men tạo màng lẫn vào như Candida, Torulopsis. Những nấm men này có sẵn trong bột hoặc lẫn vào nấm men ướt hoặc men ép. Những nấm men này có áp lực nở thấp, khi lên men chúng tạo ra sản phẩm phụ làm cho bánh mì có vị cay. Đây là những nấm men tạp làm giảm chất lượng bột nhào và bánh mì. Đôi khi còn thấy Escherichia aerogenes, một dạng của trực khuẩn đường ruột phát triển trong bột nhào, ngoài ra còn có thể gặp trực khuẩn khoai tây và trực khuẩn cỏ khô. Các vi khuẩn có trong bột nhào làm xấu bánh mì, các bào tử của chúng trong ruột bánh không bị chết khi nướng, gặp điều kiện thuận lợi chúng nẩy mầm và phát triển làm hỏng bánh mì. b. Các chất bổ sung trong bột nhào và ảnh hưởng của chúng đến hoạt động của vi sinh vật Trong khi làm bột nhào người ta thường thêm một số nhất như muối, đường, chất béo. Những chất này đếu có ảnh hưởng đến sự hoạt động của nấm men bánh mì và vi khuẩn lactis. Muối ăn: nồng độ muối ăn trên 0,8% kiềm hãm hoạt lực tạo khí của nấm men, làm giảm hoạt lực tạo axit của vi khuẩn lactic. Đường: khi thêm trên 5% đường sẽ làm tăng hoạt lực của nấm men và vi khuẩn lactic, khí tao thành nhiều hơn, nhưng khi thêm đường trên 10% thì hoạt lực của nấm men và vi khuẩn lactic bị giảm. Khi thêm trên 20% đường thì hoạt lực của nấm men và vi khuẩn bị ức chế hoàn toàn. Chất béo: lượng chất béo cho vào bột nhào dưới 5% không ảnh hưởng đến hoạt lực của nấn men. Khi nồng độ cao hơn 10% thì khả năng tạo khí của nấm men và hoạt lực của vi khuẩn bị giảm. Điều này có thể giải thích như sau khi các chất béo bao phủ tế bào nấm men và vi khuẩn lactic làm trở ngại cho quá trình trao đổi chất. c. Hệ vi sinh vật bánh mì Hệ vi sinh vật bánh mì bắt nguồn từ bột mì, men bánh mì và tạp nhiễm. Khi làm bột nhào men bánh mì hoạt động mạnh tao ra rượu và khí cacbonic làm nở bột nhào. Khi nắn bánh và đem nướng hầu hết vi sinh vật đều bị tiêu diệt trừ một số bào từ chịu nhiệt còn tồn tại. Khi nướng bánh nhiệt độ bên ngoài tới 180÷200oC, các vi sinh vật ngoài vỏ bánh chết hết và trong ruột bánh nóng dần lên nhưng ở giữa không quá 95÷98oC. các tế bào sinh dưỡng của vi sinh vật bị chết nhưng bào tử của chúng vẫn còn sống. Khi gặp điều kiện thuận lợi các bào tử của trực khuẩn khoai tây và trực khuẩn cỏ khô phát triển làm hỏng bánh mì. Trong quá trình vận chuyển và bảo quản còn bị tạp nhiễm các vi sinh vật trong đó có cả trực khuẩn đường ruột rất nguy hiểm. Vì vậy khi vận chuyển và bảo quản cần đảm bảo vệ sinh an toàn. d. Hư hỏng bánh do vi sinh vật Do bánh mì thành phẩm còn một số bào tử của các trực khuẩn không bị tiêu diệt khi nướng bánh hay các tế bào sinh dưỡng của một số vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình vận chuyển và bảo quản. Đó chính là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì. Bệnh nhớt ruột bánh mì do vi khuẩn Bacillus : bệnh này do trực khuẩn khoai tây và trực khuẩn cỏ khô gây ra. Bệnh này còn gọi là hỏng nhớt bánh mì. Trong bột mì có chất lượng kém có nhiễm các bào tử của hai loại trực khuẩn này. Khi chúng phát triển sẽ tiết ra enzyme protease thuỷ phân protein làm ruột bánh mì bị dính nhớt, thẫm màu và có mùi khó chịu. Để hạn chế bệnh này cần tăng độ axit của bột nhào, làm pH giảm xuống khoảng 4,5÷5 sẽ kiềm hãm trực khuẩn Bacillus mesentericus và Bacillus subtilis phát triển. Ruột bánh mì bị đỏ: có một số vi khuẩn và nấm sinh sắc tố phát triển trong ruột bánh mì và làm ruột bánh mì có màu đỏ. Bệnh này không nguy hiểm đối với người, thường gặp vi khuẩn Bacillus prodigiosum. Mốc bánh mì: bánh mì thường bị mốc bên ngoài do tạp nhiễm các bào tử nấm mốc và bảo quản trong điều kiện nóng ẩm cũng như ẩm độ của bánh mì cao và xếp quá chặt. Bệnh say bánh mì: bệnh này do nấm Fusarium sporotrichioides có lẫn trong bột mì từ những hạt lúa mì ở những cây có nấm này ký sinh trên đồng ruộng. Nấm này chiụ nhiệt cao và không bị chết khi nướng bánh. Khi chúng phát triển trên bánh mì không thấy dấu hiệu hư rỏ rệt nhưng chúng tiết ra độc tố khi ăn phải người bị ngộ độc thấy ngây ngất như say rượu. Bài 6: Vi sinh vật trong bảo quản và chế biến rau quả 1. Đặc điểm của rau quả Là thành phần thức ăn không thể thiếu trong khẩu phần ăn, cung cấp nhiều chất dinh dưỡng, hợp chất hữu cơ, đường, tinh bột, vitamin và muối khoáng. Sản phẩm tươi hay qua chế biến có nhiều dạng: lá, thân, củ, quả, hạt. Mỗi loại rau có đặc điểm sinh lý khác nhau. Nước chiếm phần lớn trong rau quả từ 85 ÷ 90%. Trong dịch tế bào có đường, axit hữu cơ, vitamin, khoáng chất sử dụng dễ dàng. pH trong quả nhỏ hơn 4,5, rau từ 4,5÷5. Rau quả sau khi hái vẫn còn sống, còn quá trình trao đổi chất và hô hấp sẽ tác động xấu đến quá trình bảo quản như héo, mềm , dập làm cho vi sinh vật dễ xâm nhập. Quả và rau tươi có khả năng miễn dịch trong thời gian nhất định do mô và thành tế bào còn nguyên lớp bảo vệ. Có tinh dầu, tanin ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật. 2. Hệ vi sinh vật của rau quả a. Nguồn lây nhiễm Do hạt giống hay quá trình chăm bón phân bón hữu cơ hay do vi sinh vật trong đất, trong không khí, nước. Do quá trình thu hái, vận chuyển và chế biến vi sinh vật xâm nhiễm vào rau quả. Thành phần và số lượng vi sinh vật nhiễm vào rau quả phụ thuộc vào từng loại, điều kiện địa lý và thu hái, tình trạng rau quả. b. Hệ vi sinh vật của rau qủa Thường gặp vi khuẩn, nấm men, nấm mốc. Hoa quả tươi lành lặn bên trong coi như vô trùng. Các hệ vi sinh vật xâm nhiễm vào rau quả làm hư hỏng, hư hỏng quả do nấm, hư hỏng rau do vi khuẩn. Hệ vi sinh vật rau quả gồm hai loại: Vi sinh vật hoại sinh: liên quan đến điều kiện trồng, thu hoạch rau qủa. Gồm vi khuẩn gram dương và vi khuẩn gram âm: vi khuẩn lactis, vi khuẩn axetic, vi khuẩn gây thối rữa. Ngoài ra còn có nấm men, nấm mốc dạng bào tử. Vi sinh vật hoại sinh từ 103 ÷ 106 tế bào trên 1 cm2 không gây hư hại rau quả lành lặn trong điều kiện thu hái, vận chuyển tốt. Vi sinh vật gây bệnh: xuất hiện trên rau quả trong điều kiện nhất định như: chăm bón, thu hái, vận chuyển, giốngĐây là vi sinh vật không tìm thấy trực tiếp trên rau quả nhưng làm giảm sức đề kháng rau quả và tấn công cây mẹ tạo điều kiện cho vi sinh vật khác tấn công rau quả sau thu hoạch. c. Sự hư hỏng của rau quả Nấm mốc là nguyên nhân đầu tiên gây hư hỏng rau quả, do pH của rau quả nhỏ hơn 4,5 tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển nhanh cho đến khi pH tăng lên vi khuẩn khác sẽ tấn công rau quả. Nấm mốc tồn tại dạng sợi và phát triển nhanh do rau quả có nhiều cenlulose, hemicenlulose, pectin. Vi sinh vật thường bắt đầu từ rau quả bị dập nát sau đó lan sang rau quả khác và làm hư hỏng rau quả. Nếu độ dập nát rau quả càng cao thì vi sinh vật xâm nhiễm và phát triển càng nhiều và phong phú. Chúng tiêu thụ nhiều chất khô và dịch tế bào do nấm mốc xâm hại phá huỷ thành tế bào chảy ra. Sự hư hỏng do vi khuẩn: Do nấm men phá vỡ thành tế bào làm cho vi khuẩn xâm nhập và phát triển mạnh làm pH giảm nên vi khuẩn gây thối chậm phát triển. Cuối cùng làm cho rau quả có vị chua và giảm chất lượng cảm quan. d. Bảo quản rau qủa + Bảo quản tươi Sư hư hỏng thường do một số quả quá chín vì vậy cần loại những quả đó ra. Rau quả không thể bảo quản ở nhiệt độ thường mà phải bảo quản ở nhiệt độ lạnh và cho thêm hoá chất bảo quản. Các hoá chất bảo quản thường dùng là: khí SO2, axit benzoic, muối benzoat những chất này tốt cho bảo quản và không độc hại. Ngoài ra còn dùng một số hợp chất hữu cơ như: nizin, axit sorbic, muối sorbat Nizin là chất sinh ra từ kháng sinh hoặc độc tố của vi khuẩn lactic vì vậy chúng tiêu diệt được vi khuẩn gây thối và không độc hại đối với con người. + Sấy khô Người ta thường sấy khô đến độ ẩm khoảng 15 đến 20% đối với rau và 8 đến 10% đối với quả. Ngày nay trên thị trường có rất nhiều sản phẩm sấy khô từ rau quả. + Chế biến Rau quả qua chế biến thành nhiều sản phẩm phù hợp khẩu vị, tạo ra sự phong phú đa dạng thức ăn và giúp bảo quản lâu hơn. Phương pháp thường dùng là ngâm đường để chiết suất dịch bào sau đó đem ra sử dụng. Tuy nhiên trong dịch bào thường có vi khuẩn lên men nên sản phẩm thường có mùi rượu. + Muối chua Phương pháp này giúp ta giữ rau quả lâu hơn, khoảng 1 đến 2 tháng. Bản chất của quá trình này là quá trình lên men lactic. + Đóng hộp Phương pháp này bảo quản rau quả được khá lâu, khoảng 6 tháng. Trước hết tiêt trùng rau quả bằng nhiệt độ cao, sau đó đóng hộp và thanh trùng 3. Hệ vi sinh vật một số sản phẩm rau quả a. Đồ hộp Bị lây nhiểm do các nguyên nhân sau đây: Do nguyên liệu: quá trình rửa, ngâm, muối, thanh trùng sẽ diệt được khoảng 90% lượng vi sinh vật, tuy nhiên còn 10% vi sinh vật sẽ phát triển nhanh và gây hư hại đồ hộp. Do khâu chuẩn bị đóng hộp: lượng vi sinh vật trong không khí do ruồi giấm mang đến, do vi sinh vật nhiễm từ công nhân. Nguyên nhân gây nhiễn đặc biệt quan trọng đối với đồ hộp gia nhiệt không cao do đựng trong các dụng cụ bằng nhựa. Ngoài ra còn có nguyên nhân do tiệt trùng hoặc thanh trùng không kỹ vì vậy lượng vi sinh vật còn lại sẽ ảnh hưởng đến quá trình bảo quản. Hay do yếu tố chủ quan của con người, ở những giai đoạn trước đã tiệt trùng kỹ nên những giai đoạn sau không thanh trùng vì vậy vi sinh vật mới xâm nhập sẽ phát triển và gây hư hại cho sản phẩm đồ hộp. Nhóm vi sinh vật đặc trưng là những vi khuẩn ưa nóng, chịu axit và có bào tử: Baccilus sporogenes, Baccilus subtilus, Clostridium botulinum Sau khi đóng hộp vẫn còn hiện tượng hư hỏng là do vi khuẩn lactisc, vi khuẩn axetic dùng đường có trong quả lên men tạo thành rượu, axit axetic, axit lactic tạo thành mùi rượu hay vị chua. Hay do vi khuẩn thuỷ phân thành khí H2S làm đồ hộp phồng lên. Ngoài ra vỏ đồ hộp thường làm bằng vỏ thiếc vì vậy trong môi trường axit hộp sẽ bị gỉ làm ảnh hưởng đến chất lượng rau quả. b. Muối chua Khi muối chua pH giảm nên môi trường có tính axit cao vì vậy sẽ ức chế các vi khuẩn gây thối rữa. Tuy nhiên trong môi trường axit nấm mốc và nấm men vẫn phát triển và gây hư hỏng sản phẩm. Khi nấm mốc phát triển làm giảm độ pH môi trường tạo điều kiện cho vi khuẩn gây thối rữa phát triển và làm hư hỏng sản phẩm muối chua. PHẦN II – THỰC HÀNH Bài thực hành số 1: Tiệt trùng môi trường làm việc và dụng cụ 1.Tiệt trùng bề mặt và môi trường làm việc Khi làm việc với vi sinh vật, để tránh bị lây nhiễm những vi sinh vật không mong muốn ở môi trường xung quanh, cần phải đảm bảo cho môi trường và bề mặt làm việc được vô khuẩn. - Làm sạch môi trường làm việc. - Tiệt trùng bề mặt làm việc bằng cồn 70% hoặc propanol 70%. Lưu ý: Khi lau cồn, lưu ý không được bật đèn cồn vì có thể gây hỏa hoạn. - Tủ cấy vô trùng: tiệt trùng không khí bằng đèn UV, quạt lọc gió. 2.Tiệt trùng dụng cụ làm việc Có 2 phương pháp để tiệt trùng dụng cụ làm việc + Phương pháp tiệt trùng bằng nhiệt khô: Sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 150- 160oC trong 2,5 đến 3 giờ Dùng cho dụng cụ thủy tinh không chứa môi trường nuôi cấy (có thể có nắp bông), pipet, hộp petri, que trang, phễu thủy tinh, đũa thủy tinh, + Phương pháp tiệt trùng bằng nhiệt ẩm: Hấp trong nồi hấp autoclave ở nhiệt độ 121oC trong 20-30 phút. Dùng cho các dụng cụ bằng kim loại, dụng cụ có nắp bằng cao su, giấy nhôm, màng; dụng cụ bằng nhựa chịu nhiệt; ống bóp cao su; ống nghiệm hay bình thủy tinh có chứa môi trường nuôi cấy; đầu pipetman; ống nghiệm chứa nước để pha loãng 2.1 Dụng cụ thủy tinh hoặc kim loại - Trước khi tiệt trùng dụng cụ thủy tinh cần được làm sạch và sấy khô. - Ống nghiệm thủy tinh: cần được đậy bằng nút bông không thấm nước, sau đó gói kín phần đầu ống nghiệm có nút bông bằng giấy. - Bình tam giác: cần được đậy kín bằng nút bông và gói phần có nút bông bằng giấy. - Hộp petri cần được gói kín trong giấy - Pipet thủy tinh cần được gắn một nút bông nhỏ ở phần cuối, sau đó bọc kín trong giấy. - Que trang, đũa thủy tinh nếu cần cũng phải được gói kín vào giấy. 2.2 Dụng cụ bằng nhựa chịu nhiệt Ống nghiệm có nắp nhựa chịu nhiệt, nắp bằng cao su hay đầu micropipette được tiệt trùng bằng nhiệt ẩm. 2.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật Môi trường nuôi cấy vi sinh vật thường được tiệt trùng trong nồi hấp tiệt trùng autoclave ở 121oC trong 20-30 phút. Đối với những thành phần của môi trường dinh dưỡng nhạy cảm với nhiệt độ cao thì cần dùng màng lọc vi khuẩn để tiệt trùng. Bài thực hành số 2: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi sinh vật 1.Nguyên lý Môi trường nuôi cấy cung cấp đầy đủ nhu cầu dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của vi sinh vật. Môi trường nuôi cấy cần được tiệt trùng trước khi sử dụng nuôi cấy vi sinh vật. Phân loại môi trường nuôi cấy: Theo cấu trúc: + Môi trường lỏng: thường để nhân giống, lên men hay nghiên cứu đặc tính của vi sinh vật; môi trường lỏng không chứa các chất làm đặc như agar, gelatin + Môi trường rắn (đặc): có thêm một hàm lượng nhỏ agar hoặc gelatin vào môi trường lỏng để làm đặc môi trường. Môi trường rắn thường dùng để phân lập vi sinh vật, quan sát hình thái khuẩn lạc, + Môi trường bán rắn: có cấu trúc dạng dẻo, hàm lượng chất tạo độ đặc ít hơn với môi trường rắn. Sử dụng để xác định khả năng chuyển động của một số vi khuẩn. Theo thành phần: + Môi trường tổng hợp: có thành phần hóa học xác định được một cách chính xác. + Môi trường tự nhiên:gồm những chất chưa xác định rõ thành phần, không có công thức hóa học rõ rang. VD: peptone, cao thịt, cao nấm men, + Môi trường hòa tan chuẩn bị sẵn: hòa tan vào nước một hàm lượng nhất định là có đủ tất cả các thành phần dinh dưỡng cần thiết. 2. Phương pháp chuẩn bị môi trường nuôi cấy 2.1 Chuẩn bị môi trường lỏng - Cân chính xác từng thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy theo hàm lượng đã định - Hòa tan từng thành phần trong một lượng nước nhỏ. Sau đó trộn lẫn tất cả các thành phần dinh dưỡng với nhau và làm đầy lên thể tích nhất định bằng nước. - Kiểm tra pH bằng máy đo pH hoặc quỳ tím, dùng NaOH hoặc HCl để điều chỉnh nếu pH không đúng với yêu cầu - Phân phối môi trường vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy, đóng nắp bằng nút bông không thấm nước - Tiệt trùng - Để nguội và bảo quản trong tủ lạnh. Hình 2. Các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật 2.2 Chuẩn bị môi trường rắn và bán rắn - Nấu chảy agar trong thể tích nước dùng để pha môi trường - Cân và hòa tan các thành phần khác của môi trường trong ½ lượng nước còn lại - Trộn lẫn và làm đầy lên thể tích cần thiết, sau đó phân phối ngay vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy khi dung dịch còn nóng. Nếu để nguội, agar sẽ đặc lại và không thể rót vào ống nghiệm được nữa. - Đóng nắp ống nghiệm và tiệt trùng giống với môi trường lỏng. - Đối với thạch nghiêng: đặt nghiêng khi môi trường còn nóng cho tới khi nguội - Bảo quản môi trường đã đông đặc trong tủ lạnh ở vị trí lật ngược Bài thực hành số 3: Quan sát tế bào vi sinh vật Quan sát tế bào vi khuẩn Làm tiêu bản cố định Rửa sạch phiến kính bằng xà phòng và lau khô Vẽ hai vòng tròn không dính nhau lên mặt dưới của phiến kính Nhỏ một giọt nước vô khuẩn lên một vòng tròn Hơ đỏ que cấy, làm nguội, sau đó lấy một phần nhỏ sinh khối vi sinh vật lên que cấy Trộn đều vi sinh vật trên que cấy vào giọt nước và dàn mỏng giọt nước trên phiến kính Cố định vi sinh vật lên phiến kính bằng cách hơ phiến kính nhanh vài lần qua ngọn lửa đèn cồn. Chú ý không hơ phiến kính quá sát đèn cồn sẽ làm biến dạng vi sinh vật. Nhỏ vài giọt xanh methylene lên tiêu bản, để trong 1 phút Nghiêng phiến kính và rửa bằng nước cất cho đến khi hết màu thừa Để phiến kính khô tự nhiên trong không khí hoặc thấm khô phiến kính bằng giấy thấm. Quan sát hình thái vi khuẩn dưới vật kính dầu Sau khi quan sát xong, lau sạch vật kính dầu. Làm tiêu bản giọt ép Nhỏ một giọt môi trường lỏng có chứa vi khuẩn muốn quan sát lên phiến kính sạch Lấy lá kính đậy lên phiến kính sao cho không tạo thành bọt khí giữa lá kính và phiến kính Quan sát phiến kính dưới kính hiển vi bằng vật kính dầu. Hình 3. Cấu tạo kính hiển vi Quan sát tế bào nấm men Nấm men là một nhóm vi sinh vật được dùng nhiều trong công nghiệp, hầu hết nấm men là đơn bào, không chuyển động. Hình dạng của nấm men thường có hình cầu, hình trứng, hình bầu dục kích thước 6-10 micromet. 2.1Quan sát nấm men sống và chết Dựa trên nguyên tắc: Tế bào chết dễ bắt màu, thuốc nhuộm đi qua tế bào chết dễ dàng hơn đi qua màng tế bào sống. Cho vài giọt canh trường nấm men Saccharomyces cerevisiae và một giọt thuốc nhuộm xanh methylene lên phiến kính Nhẹ nhàng trộn đều, đậy lá kính lại để yên trong 2-3 phút Quan sát dưới kính hiển vi quang học Tế bào chết bắt màu xanh còn tế bào sống không màu Quan sát nấm men nảy chồi Cho một giọt canh trường nấm men và một giọt NaOH hoặc H2SO4 10% lên phiến kính Trộn đều Đậy lá kính lại và đặt lên kính hiển vi để quan sát. Tế bào nấm men được xem là đang nảy chồi khi có những tế bào con bé hơn hoặc bằng ½ tế bào mẹ. Quan sát tế bào nấm sợi Nấm sợi có tế bào nấm thường phát triển thành hệ sợi gọi là khuẩn ty. Sợi nấm có thể có hoặc không có vách ngăn Quan sát hình thái khuẩn lạc, màu sắc sợi nấm trên hộp petri Lấy một miếng băng dính trong suốt, đặt mặt dính nhẹ lên khuẩn lạc nấm Lấy miếng băng dính ra và áp sát vào phiến kính Quan sát phiến kính dưới kính hiển vi Bài thực hành số 4: Xác định khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ của vi sinh vật Xác định khả năng lên men lactic của vi khuẩn lactic - Tiến hành: Dưa cải bẹ để héo, rửa sạch, cắt khúc, để ráo Pha nước muối 3- 3.5%, thêm đường Xếp vào lọ và ém chặt. Lên men ở nhiệt độ 28 – 30oC trong 2-3 ngày. Xác định đặc trưng của quá trình + Làm tiêu bản giọt ép từ nước dưa cải chua để quan sát hình dạng, sự sắp xếp tế bào của vi khuẩn lên men lactic + Định lượng acid lactic bằng phương pháp chuẩn độ Cho vào ống nghiệm 10ml nước dưa, 20 ml nước cất, 1-2 giọt phenolphthalein. Lắc thật kỹ để trộn đều các chất Khối lượng acid lactic (trong 10ml dịch lên men) được tính bằng: M = V NaOH 0.1N x 0.009 (g) (1 ml dung dịch NaOH tương đương với 0,009g acid lactic) 2. Xác định khả năng lên men rượu của nấm men - Làm môi trường lên men từ nước ép trái cây : nho, dâu, dứa, mơ v.v... hoặc từ nước mạch nha. - Điều chỉnh độ pH = 4 - 6 - Thanh trùng dịch ép trái cây theo phương pháp Tyndal hoặc khử trùng bằng nồi hấp ở áp suất 0,75 atm trong 20 phút. - Để môi trường nguội tới 30oC thì cấy men giống vào với tỉ lệ 2 - 5% thể tích dịch lên men. Đậy nút bình lên men. - Đặt bình có dịch lên men vào tủ ấm ở 28 - 30oC, sau 1-2 ngày lấy ra. Xác định các đối tượng vi sinh vật tham gia: - Làm tiêu bản giọt ép, giọt treo hay nhuộm đơn để thấy được hình dạng tế bào nấm men - Yêu cầu : quan sát tiêu bản ở vật kính (x40) trên kính hiển vi. Chú ý nhận biết các dấu hiệu đặc trưng về hình thái của mỗi loài Xác định chất lượng men giống trước khi cho lên men: - Xác định tỉ lệ tế bào nảy chồi trong dịch men giống bằng phương pháp đếm số lượng tế bào nảy chồi trên khung đếm Goriaep. Xác định tỉ lệ tế bào sống và chết bằng tiêu bản nhuộm sống nấm men (để phân biệt 2 loại tế bào này). - Xác định số lượng tế bào/1ml dịch men giống bằng phương pháp đếm số lượng tế bào trên khung đêm Goriaep. Xác định tốc độ quá trình lên men thông qua lượng CO2 tạo thành : * Nguyên tắc : - Dựa vào phương trình tổng quát của quá trình lên men : C6H12O6 → 2C2H5OH + CO2 + 27kcal - Lượng đường phân giải trong quá trình lên men càng nhiều thì lượng CO2 tạo ra càng lớn. - Tốc độ quá trình lên men chính là lượng CO2 bay ra từ 1 thể tích môi trường nhất định trong 1 khoảng thời gian xác định. 3.Xác định khả năng phân giải protein của vi sinh vật. 3.1. Thực hiện quá trình amôn hoá prôtit - Cho vào bình tam giác có thể tích 100 - 150ml 3 - 5g thịt + 20 - 30ml nước cất + Một cục đất nhỏ đã nghiền ra để cung cấp nguồn vi sinh vật. - Đun nóng bình tam giác ở nhiệt độ 80 - 900C để diệt các tế bào sinh dưỡng và giữ lại những tế bào mang bào tử. - Để bình vào tủ ấm ở nhiệt độ 27 - 280C trong 7 ngày. - Kẹp một miếng giấy quỳ đỏ trên miệng ống nghiệm để xác nhận NH3 được giải phóng ra trong quá trình phân giải prôtit. 3.2. Xác định các đặc trưng của quá trình a. Xác định thành phần loài vi sinh vật tham gia: - Làm tiêu bản từ dịch phân giải prôtit sau 2 - 4 ngày. - Nhuộm Gram hay nhuộm đơn vết bôi. - Quan sát tiêu bản bằng vật kính dầu (x 100) trên kính hiển vi. b. Các phản ứng định tính một số sản phẩm chủ yếu của quá trình phân giải prôtit * Nguyên tắc: Dựa trên những phản ứng màu, phản ứng kết tủa đặc trưng của các sản phẩm trong quá trình phân giải prôtit với các hoá chất khác nhau để xác nhận sự có mặt của chúng trong các quá trình này. * Cách tiến hành: - Xác định sự có mặt của prôtit trong quá trình amôn hoá prôtit bằng phản ứng màu: + Cho vào ống nghiệm: ƒ 5ml dung dịch lên men thối. ƒ 1ml dung dịch NaOH 30% ƒ 0,5ml dung dịch CuSO4 1% + Đun nhẹ ống nghiệm cho tới sôi Kết quả: Dung dịch có màu xanh tím nếu trong đó có prôtit. Dung dịch có màu hơi đỏ nếu trong đó có peptôn. Bài thực hành số 5: Các kĩ thuật phân lập và nuôi cấy vi sinh vật Kĩ thuật phân lập vi sinh vật Trong tự nhiên, phần lớn vi sinh vật tồn tại lẫn với nhau trong một tập hợp bao gồm nhiều vi sinh vật khác nhau. Để có thể nghiên cứu tính chất hoặc ứng dụng của vi sinh vật, thường phải phân lập chúng ra thành những vi sinh vật riêng rẽ. Các phương pháp dùng để phân lập vi sinh vật là phương pháp đổ đĩa, phương pháp dàn đều và phương pháp cấy ria. Phương pháp đồ đĩa Nguyên lý: một lượng nhỏ vi sinh vật đã pha loãng được trộn đều với môi trường agar nóng chảy và được đổ vào hộp petri đã vô khuẩn. Sau thời gian nuôi cấy thích hợp, vi sinh vật sẽ mọc thành những khuẩn lạc riêng rẽ. Mỗi khuẩn lạc sẽ chỉ bao gồm một loại vi sinh vật thuần chùng. Nấu chảy 3 ống nghiệm có chứa 19 ml môi trường dinh dưỡng đặc, đặt vào bể điều nhiệt có nhiệt độ 45-50 oC Hút 1ml dung dịch chứa hỗn hợp vi sinh vật cần phân lập cho vào ống nghiệm thứ nhất, lắc kĩ trên vortex, ta có độ pha loãng 1/20. Hút 1ml dung dịch ở độ pha loãng 1/20 sang ống nghiệm thứ 2, lắc kĩ, ta có độ pha loãng 1/400. Hút 1ml dung dịch ở độ pha loãng 1/400 sang ống nghiệm thứ 3, lắc kĩ, ta có độ pha loãng 1/8000. Đổ 3 ống nghiệm vào 3 hộp petri đã vô khuẩn, để nguội và nuôi cấy ở vị trí lật ngược ở nhiệt độ thích hợp. Sau thời gian nuôi cấy, tách riêng từng khuẩn lạc riêng rẽ. Phương pháp dàn đều Nguyên lý: một lượng nhỏ vi sinh vật đã được pha loãng trước được dàn đều lên trên bề mặt đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp. Đổ môi trường agar nóng chảy vào hộp petri vô khuẩn và để cho đặc lại Hút 0,1ml dung dịch chứa hỗn hợp vi sinh vật cần phân lập ở các độ pha loãng khác nhau bằng pipetman vào đĩa petri và dàn đều khắp bề mặt hộp bằng que trang vô khuẩ