Giám sát sự lưu hành virus cúm A/H5N1 trên đàn vịt nuôi tại tỉnh Nam Định

Bé gi¸o dôc vµ ®µo t¹o TR¦êNG §¹I HäC N¤NG NGHIÖP Hµ NéI -----
----- TRẦN BÁ ðỨC GIÁM SÁT SỰ LƯU HÀNH VIRUS CÚM A/H5N1 TRÊN ðÀN VỊT NUÔI TẠI TỈNH NAM ðỊNH LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI - 2011 Bé gi¸o dôc vµ ®µo t¹o TR¦êNG §¹I HäC N¤NG NGHIÖP Hµ NéI -----
----- TRẦN BÁ ðỨC GIÁM SÁT SỰ LƯU HÀNH VIRUS CÚM A/H5N1 TRÊN ðÀN VỊT NUÔI TẠI TỈNH NAM ðỊNH LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: TS. Trần Thị Lan Hương HÀ NỘI - 2011 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………………. i LỜI CAM ðOAN T«i xin cam ®oan r»ng: - C¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu trong luËn v¨n lµ trung thùc, kh¸ch quan vµ ch−a ®−îc sö dông ®Ó b¶o vÖ mét häc vÞ nµo. - Mäi sù gióp ®ì cho viÖc thùc hiÖn luËn v¨n ®· ®−îc c¶m ¬n vµ c¸c th«ng tin trÝch dÉn trong luËn v¨n ®· ®−îc chØ râ nguån gèc. Hµ Néi, th¸ng 10 n¨m 2011 T¸c gi¶ luËn v¨n TrÇn B¸ §øc Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………………. ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt 2 năm học tập và hoàn thành luận văn, cùng với nỗ lực của bản thân tôi ñã nhận ñược sự giúp ñỡ, hướng dẫn tận tình của nhiều cá nhân và tập thể, cho phép tôi ñược tỏ lòng biết ơn và cảm ơn chân thành tới: Ban Giám hiệu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội; Viện ðào tạo Sau ðại học; Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y và các thầy cô giáo ñã giúp ñỡ, tạo ñiều kiện ñể tôi học tập, tiếp thu kiến thức của chương trình học. Tiến sĩ Trần Thị Lan Hương, người trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện luận văn tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn Phòng Dịch tễ, Trung tâm Chẩn ñoán thú y Trung ương - Cục Thú y; Chi cục Thú y tỉnh Nam ðịnh ñã giúp ñỡ tôi hoàn thành chương trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi ñược gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia ñình, người thân cùng bạn bè ñã ñộng viên giúp ñỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, thực hiện ñề tài. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 10 năm 2011 Tác giả Trần Bá ðức Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………………. iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AI: Avian Influenza ARN: Axit Ribonucleic FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations Ig: Immunoglobulin GETS: Gathering Evidence for a Transitional Strategy GIS: Geographic Infomation System HI: Hemagglutination inhibition test HPAI: Highly Pathogenic Avian Influenza IVPI: Intravenous Pathogenicity Index LPAI: Low Pathogenic Avian Influenza OIE: Office Internationale des Epizooties PBS: Phosphate Buffered Saline Re: Reassortant Avian Influenza RRT-PCR: Realtime Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction WHO: World Health Organization Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………………. iv MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii 1. MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2 1.3 Ý nghĩa khoa học của ñề tài 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Giới thiệu chung về bệnh cúm gia cầm 3 2.2 Lịch sử bệnh cúm gia cầm 3 2.3 Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới và tại Việt Nam 5 2.3.1 Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới 5 2.3.2 Tình hình dịch cúm gia cầm ở Việt Nam 6 2.4 ðặc tính sinh học của virus cúm type A 10 2.4.1 Hình thái và cấu trúc 10 2.4.2 ðặc tính kháng nguyên 15 2.4.3 Thành phần hóa học 15 2.4.4 Quá trình nhân lên của virus 15 2.4.5 ðộc lực của virus 17 2.4.6 Phân loại virus 18 2.4.7 Danh pháp 19 2.4.8 Nuôi cấy và lưu giữ virus cúm 20 2.4.9 Miễn dịch chống bệnh của gia cầm 20 2.5 Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm 24 2.5.1 Phân bố dịch bệnh 24 2.5.2 ðộng vật cảm nhiễm 24 2.5.3 ðộng vật mang virus 25 2.5.4 Sự truyền lây 25 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………………. v 2.5.5 Sức ñề kháng của virus cúm 26 2.5.6 Mùa vụ phát bệnh 26 2.5.7 Tỷ lệ mắc, tỷ lê chết 27 2.6 Triệu chứng, bệnh tích của bệnh cúm gia cầm 27 2.6.1 Triệu chứng lâm sàng 27 2.6.2 Bệnh tích ñại thể của bệnh cúm gia cầm 27 2.6.3 Bệnh tích vi thể 28 2.7 Chẩn ñoán bệnh 28 2.8 Kiểm soát bệnh 29 2.9 Vacxin cúm gia cầm 30 3. ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 3.1 ðối tượng, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 32 3.2 Nội dung nghiên cứu 32 3.3 Nguyên liệu và dụng cụ 32 3.4 Phương pháp nghiên cứu 33 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39 4.1 Tình hình chăn nuôi, dịch bệnh cúm gia cầm tại tỉnh Nam ðịnh 39 4.1.1 Tình hình chăn nuôi gia cầm tỉnh Nam ðịnh từ 2008 - 2011 39 4.1.2 Tình hình dịch cúm gia cầm tại tỉnh Nam ðịnh 41 4.2 Xây dựng bản ñồ dịch tễ bệnh cúm gia cầm của tỉnh Nam ðịnh 43 4.3 Kết quả xác ñịnh hàm lượng kháng thể cúm sau tiêm phòng 47 4.3.1 Kết quả tiêm vacxin cúm cho vịt tại Nam ðịnh từ 2008 - 2010 47 4.3.2 Hàm lượng kháng thể cúm của vịt sau tiêm phòng năm 2010 50 4.4 Giám sát sự lưu hành của virus cúm gia cầm trên ñàn vịt 58 4.4.1 Giám sát sự lưu hành virus cúm tháng 12/2009 và tháng 01/2010 59 4.4.2 Giám sát virus cúm gia cầm trên ñàn vịt chỉ báo 63 4.4.3 Giám sát sự lưu hành của virus cúm tại chợ 70 4.4.4 Giám sát cúm gia cầm các ổ dịch nghi ngờ 71 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 75 5.1 Kết luận 75 5.2 ðề nghị 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH MINH HỌA Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………………. vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Thống kê số lượng người nhiễm, chết do cúm A/H5N1 4 Bảng 2.2: Các phân type virus cúm A 19 Bảng 4.1: Số lượng gia cầm của tỉnh Nam ðịnh từ năm 2008 - 2011 39 Bảng 4.2: Số lượng gia cầm chết, tiêu hủy do dịch cúm tại Nam ðịnh 42 Bảng 4.3: Số xã có dịch cúm gia cầm tại tỉnh Nam ðịnh từ 2004 - 2011 44 Bảng 4.4: Tỉ lệ tiêm vacxin cúm cho ñàn vịt tại Nam ðịnh từ 2008 - 2010 49 Bảng 4.5: Hàm lượng kháng thể vịt sau tiêm vacxin H5N1 ñợt 1 năm 2010 51 Bảng 4.6: Hàm lượng kháng thể vịt sau tiêm vacxin H5N1 ñợt 2 năm 2010 55 Bảng 4.7: Tỉ lệ bảo hộ của vịt sau tiêm phòng ñợt 1 và ñợt 2 năm 2010 57 Bảng 4.8: Giám sát sự lưu hành virus cúm A/H5N1 trên ñàn vịt (12/2009) 60 Bảng 4.9: Giám sát sự lưu hành virus cúm A/H5N1 trên ñàn vịt (01/2010) 62 Bảng 4.10: Phân bố ñàn vịt chỉ báo tại các huyện, thành phố 64 Bảng 4.11: Kết quả giám sát huyết thanh cúm gia cầm trên ñàn vịt chỉ báo 66 Bảng 4.12: Giám sát sự lưu hành của virus cúm trên ñàn vịt chỉ báo 69 Bảng 4.13: Kết quả khảo sát cúm gia cầm tại chợ, ñiểm giết mổ gia cầm 71 Bảng 4.14: Kết quả xác ñịnh virus cúm gia cầm từ các mẫu bệnh phẩm 73 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………………. vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Cấu trúc virus H5N1 13 Hình 2.2: Cấu trúc Haemagglutinin và Neuraminidase 13 Hình 4.1: Bản ñồ dịch cúm gia cầm tỉnh Nam ðịnh từ năm 2004 - 2011 45 Hình 4.2: Sự xuất hiện chủng virus cúm A/H5N1 mới tại xã Nghĩa An 47 Hình 4.3: Tỉ lệ bảo hộ của vịt sau tiêm phòng vắc xin ñợt 1 năm 2010 53 Hình 4.4: Tỉ lệ bảo hộ của vịt sau tiêm phòng vắc xin ñợt 2 năm 2010 55 Hình 4.5: Tỉ lệ bảo hộ của vịt sau tiêm phòng ñợt 1 và ñợt 2 năm 2010 58 Hình 4.6: Kết quả ñiều tra sàng lọc và các ổ dịch cúm sau ñợt kiểm tra 63 Hình 4.7: Các xã có ñàn vịt chỉ báo tại Nam ðịnh năm 2010 - 2011 65 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 1 1. MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề Bệnh cúm gia cầm thể ñộc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza - HPAI) là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở gia cầm gây ra bởi virus cúm type A thuộc họ Orthomyxoviridae. Cuối năm 2003, cúm gia cầm type A/H5N1 lần ñầu tiên xuất hiện tại Việt Nam, từ ñó ñến nay dịch liên tục xảy ra tại nhiều ñịa phương trong cả nước và trở thành vấn ñề dịch tễ phức tạp do xuất hiện những phân dòng (clade) virus mới có ñộc lực mạnh. Tại tỉnh Nam ðịnh, từ khi ổ dịch cúm gia cầm A/H5N1 ñầu tiên ñược phát hiện vào tháng 01/2004 ñến nay dịch cũng ñã làm chết, tiêu huỷ hàng trăm nghìn con gia cầm, gây thiệt hại hàng tỷ ñồng cho nền kinh tế và ảnh hưởng trực tiếp ñến ñời sống, sức khoẻ nhân dân. ðể phòng, chống bệnh cúm gia cầm bên cạnh nhiều biện pháp kỹ thuật khác thì giải pháp tiêm vacxin phòng bệnh ñã ñược các tổ chức quốc tế như tổ chức Nông nghiệp và Lương thực liên hợp quốc (FAO), tổ chức Thú y thế giới (OIE) cũng như Chính phủ ñồng ý thực hiện tại Việt Nam từ năm 2005 và ñã thu ñược những kết quả nhất ñịnh trong việc phòng chống dịch, giảm thiệt hại kinh tế do dịch cúm gây ra. Tuy nhiên, dịch cúm gia cầm vẫn xảy ra do ñã xuất hiện những phân dòng virus cúm A/H5N1 mới có khả năng gây bệnh cho cả gia cầm ñã ñược tiêm phòng bởi chúng có cấu trúc gen không tương ñồng với virus dùng sản xuất vacxin. Hiện nay, dịch cúm gia cầm trên ñịa bàn tỉnh Nam ðịnh tạm thời ổn ñịnh, năm 2009 toàn tỉnh không xảy ra ổ dịch nào nhưng nguy cơ tái phát dịch vẫn còn cao. ðể chủ ñộng xây dựng chiến lược phòng chống bệnh cúm gia cầm trong ñiều kiện hiện tại vấn ñề bức thiết ñặt ra là cần có thêm những nghiên cứu, tìm hiểu về sự lưu hành của virus cúm gia cầm tại thực ñịa từ ñó có cơ sở khoa học ñể ñưa ra các giải pháp phòng chống dịch phù hợp, hạn chế thấp nhất thiệt Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 2 hại do dịch gây ra và tiến tới thanh toán bệnh cúm gia cầm trong tương lai. Xuất phát từ mục ñích trên chúng tôi tiến hành thực hiện ñề tài: “Giám sát sự lưu hành virus cúm A/H5N1 trên ñàn vịt nuôi tại tỉnh Nam ðịnh”. ðề tài ñược thực hiện trong khuôn khổ Dự án Thu thập các bằng chứng cho việc chuyển ñổi chiến lược tiêm phòng vacxin cúm gia cầm (Gathering Evidence for a Transitional Strategy Project - Dự án GETS). 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Xác ñịnh ñược sự lưu hành của virus cúm A/H5N1 trên ñàn vịt nuôi tại tỉnh Nam ðịnh, từ ñó ñề xuất các giải pháp nhằm khống chế dịch cúm gia cầm trên ñịa bàn tỉnh Nam ðịnh. 1.3 Ý nghĩa khoa học của ñề tài Kết quả nghiên cứu của ñề tài góp phần ñưa ra những thông tin chi tiết, những số liệu cụ thể tin cậy, những khuyến cáo và ñề nghị sát thực giúp cho việc quản lý, giám sát và phòng chống dịch cúm gia cầm trên ñịa bàn tỉnh Nam ðịnh. ðồng thời bổ sung, hoàn thiện thêm những thông tin về bệnh cúm gia cầm tại Việt Nam. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về bệnh cúm gia cầm Bệnh cúm ở gia cầm (Avian Influenza - AI) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm, thủy cầm và nhiều loài chim hoang dã. Bệnh ñược gây ra bởi virus cúm type A thuộc họ Orthomyxoviridae (Ito và Kawaoka, 1998). Trước ñây bệnh còn ñược gọi là bệnh dịch tả gà (Fowl plague) nhưng từ Hội nghị Quốc tế lần thứ nhất về bệnh cúm gia cầm tại Beltsville, Mỹ năm 1981 ñã thay thế tên này thành bệnh cúm gia cầm thể ñộc lực cao (Highly pathogenic avian influenza - HPAI) ñể chỉ virus cúm type A có ñộc lực mạnh (Trần Hữu Cổn và Bùi Quang Anh, 2004). Virus cúm gia cầm chủ yếu gây bệnh cho gà, vịt, ngan, ngỗng, ñà ñiểu, các loại chim. Những loài chim di cư mang mầm bệnh và thường không biểu hiện triệu chứng lâm sàng do chúng có sức ñề kháng tự nhiên. Loài thủy cầm mang mầm bệnh là nguồn tàng trữ và trở thành mối nguy hiểm lây nhiễm cho các loài gia cầm khác (Tô Long Thành, 2006). Virus cúm gia cầm còn gây bệnh cho cả con người và tất cả chúng ñều có nguồn gốc biến thể, biến chủng từ ñộng vật. Sau khi thích ứng trên người thì gây bệnh và có thể tạo nên những vụ dịch thảm khốc. 2.2 Lịch sử bệnh cúm gia cầm Năm 412 trước công nguyên, Hippocrate ñã mô tả về bệnh cúm. Năm 1878, ở Italy ñã xảy ra một bệnh gây tử vong rất cao ở ñàn gia cầm và ñược gọi là bệnh dịch tả gia cầm, bệnh ñược Porroncito mô tả và ông nhìn nhận một cách sáng suốt rằng tương lai sẽ là một bệnh quan trọng và nguy hiểm. ðến năm 1955, Achafer ñã xác ñịnh ñược căn nguyên gây chết nhiều gà, gà tây và chim hoang ở Bắc Mỹ, Nam Mỹ, Châu Phi, Trung Cận ðông thuộc nhóm virus cúm type A (Lê Văn Năm, 2004). Năm 1971, Beard ñã mô tả khá kỹ virus gây bệnh và ñặc ñiểm bệnh lý lâm sàng của gà trong các ổ dịch cúm xảy ra ở Mỹ mà chủng gây bệnh là H7N1. Các công trình nghiên cứu có hệ thống về bệnh cúm gia cầm lần lượt Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 4 ñược công bố ở Australia năm 1975, ở Anh năm 1979, ở Mỹ năm 1983 - 1984, ở Ireland năm 1983 - 1984 (Phạm Sỹ Lăng, 2004). Sự lây nhiễm từ chim hoang dã sang gia cầm ñã có bằng chứng từ trước năm 1970 nhưng chỉ ñược công nhận khi xác ñịnh ñược tỉ lệ nhiễm virus cúm cao ở một số loài thuỷ cầm di trú. Từ cuối tháng 12/2003 ñến nay, dịch cúm gia cầm do chủng virus A/H5N1 ñã liên tiếp xảy ra ở nhiều quốc gia ở ðông Nam Á và ðông Á làm hàng triệu con gia cầm bị tiêu hủy và nhiều người tử vong. Theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới - WHO (2011), từ năm 2003 ñến tháng 06/2011 ñã có 562 người nhiễm cúm A/H5N1 tại 15 quốc gia, trong ñó ñã có 329 người chết. Số liệu ñược trình bày ở bảng 2.1. Bảng 2.1: Số lượng người nhiễm, chết do cúm A/H5N1 từ 2003 - 6/2011 Thứ tự Quốc gia Số người chết/nhiễm 2003 - 2005 Số người chết/nhiễm 2006 - 2008 Số người chết/nhiễm 2009 - 2011 Tổng số chết/nhiễm 1 Azerbaijan 0/0 5/8 0/0 5/8 2 Bangladesh 0/0 0/1 0/2 0/3 3 Cambodia 4/4 3/4 7/8 14/16 4 Trung Quốc 6/9 15/22 5/9 26/40 5 Djibouti 0/0 0/1 0/0 0/1 6 Ai Cập 0/0 23/51 29/99 52/150 7 Indonesia 13/20 102/121 31/37 146/178 8 I rắc 0/0 2/3 0/0 2/3 9 Lào 0/0 2/2 0/0 2/2 10 Myanmar 0/0 0/1 0/0 0/1 11 Nigeria 0/0 1/2 0/0 1/2 12 Pakistan 0/0 1/3 0/0 1/3 13 Thái Lan 14/22 3/3 0/0 17/25 14 Thổ Nhĩ Kỳ 0/0 4/12 0/0 4/12 15 Việt Nam 42/93 10/14 7/12 59/119 Tổng số 79/148 171/247 79/167 329/562 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 5 2.3 Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới và tại Việt Nam 2.3.1 Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới Virus cúm gia cầm phân bố khắp toàn cầu, vì vậy dịch bệnh ñã xảy ra ở nhiều nước trên thế giới. Năm 1983 - 1984 ở Mỹ, dịch cúm gia cầm do chủng virus H5N2 ñã xảy ra trên ñàn gà ở 3 bang Pennsylvania, Virginia, New Jersey làm chết và tiêu huỷ hơn 19 triệu gà. Cũng trong thời gian này tại Ireland người ta ñã phải tiêu huỷ 270 nghìn con vịt tuy không có triệu chứng lâm sàng nhưng ñã phân lập ñược virus cúm chủng ñộc lực cao ñể loại trừ bệnh một cách hiệu quả, nhanh chóng. Năm 1986 ở Australia dịch cúm gà ñã xảy ra tại bang Victoria do chủng H5N2 gây ra. Năm 1997 ở Hồng Kông dịch cúm gia cầm ñã xảy ra do virus cúm type A subtype H5N1. Toàn bộ ñàn gia cầm của lãnh thổ này ñã bị tiêu diệt vì virus cúm ñã lây bệnh sang con người làm cho 18 người nhiễm bệnh, trong ñó có 6 người chết (Nguyễn Hoài Tao và Nguyễn Tuấn Anh, 2004). Năm 2003, ở Hà Lan dịch cúm gia cầm xảy ra với quy mô lớn do chủng H7N7, 30 triệu gia cầm bị tiêu hủy, 83 người lây nhiễm và 1 người chết, gây thiệt hại về kinh tế hết sức nghiêm trọng (Phạm Sỹ Lăng, 2004). Từ cuối năm 2003 ñến nay dịch cúm gia cầm do chủng virus H5N1 ñã liên tiếp gây ra các ñợt dịch và diễn biến hết sức phức tạp, ñã có hơn 50 nước trên thế giới phát hiện thấy virus cúm gia cầm, dịch ñã tái xuất hiện trở lại ở một số quốc gia như Việt Nam, Thái Lan, Indonesia,... Tình hình dịch cúm gia cầm A/H5N1 trên thế giới cụ thể như sau: - Từ năm 2003 - 2005, ñã có 11 nước xuất hiện dịch cúm gia cầm gồm Campuchia, Trung Quốc, Indonesia, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào, Malaysia, Pakistan, Thái Lan, Cộng hoà dân chủ nhân dân Triều Tiên và Việt Nam. - Năm 2006, ñã có hơn 36 nước và vùng lãnh thổ xuất hiện dịch cúm gia cầm H5N1 gồm Thái Lan, Indonesia, Trung Quốc, Hàn Quốc, Lào, Campuchia, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 6 Ai Cập, Áo, Croatia, ðan Mạch, Pháp, ðức, Hy Lạp, Hồng Kông, Hungary, Ấn ðộ, Indonesia, Irắc, Iran, Ý, Mông Cổ, Myanmar, Nigeria, Ba Lan, Rumania, Nga, Slovakia, Tây Ban Nha, Sudan, Thụy ðiển, Thụy Sĩ, Thổ Nhĩ Kỳ, Anh, Ukraina,... - Năm 2007, có 30 quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới báo cáo xuất hiện dịch cúm trên gia cầm do virus H5N1, ñặc biệt là tại Indonesia dịch cúm gia cầm phát sinh kéo dài, tại một số quốc gia châu Phi - nơi ñược cho là virus gia cầm có nguy cơ biến ñổi cũng ñã phát dịch. Các quốc gia có ngành chăn nuôi tiên tiến như Hàn Quốc, Nhật Bản và một số quốc gia ở châu Âu như Nga, Hungary, Rumani, Anh,... cũng ghi nhận có các ổ dịch trên gia cầm. - Năm 2008, dịch cúm trên gia cầm phát ra tại 28 quốc gia và vùng lãnh thổ bao gồm: Bangladesh, Benin, Campuchia, Canada, Trung Quốc, Hàn Quốc, Ai Cập, ðức, ðặc khu hành chính Hồng Kông, Ấn ðộ, Israel, Iran, Nhật Bản, Lào, Myanmar, Nigeria, Pakistan, Ba Lan, Rumani, Nga, Ả-rập Xê-út, Thụy Sỹ, Thái Lan, Togo, Thổ Nhĩ Kỳ, Ukraine, Vương quốc Anh và Việt Nam. - Năm 2009: dịch cúm gia cầm trên gia cầm phát ra tại 17 quốc gia và vùng lãnh thổ bao gồm: Afghanistan, Bangladesh, Campuchia, Trung Quốc, ðức, ðặc khu hành chính Hồng Kông, Ấn ðộ, Nhật Bản, Lào, Mông Cổ, Nepal, Nigeria, Nga, Tây Ban Nha, Thái Lan, Togo, Việt Nam. - Tám tháng ñầu năm 2010: dịch cúm gia cầm trên gia cầm phát ra tại 16 quốc gia và vùng lãnh thổ bao gồm: Bangladesh, Bhutan, Bungari, Campuchia, Trung Quốc, Hồng Kông, Ấn ðộ, Israel, Lào, Mông Cổ, Myanmar, Nepal, Rumani, Nga, Tây Ban Nha và Việt Nam. 2.3.2 Tình hình dịch cúm gia cầm ở Việt Nam Cuối năm 2003, dịch cúm gia cầm phát ra tại trại gà giống của Công ty thức ăn chăn nuôi CP Việt Nam (Thái Lan) ở xã Thuỷ Xuân Tiên, huyện Chương Mỹ, tỉnh Hà Tây (nay là Hà Nội) gây ốm, chết 8.000 gà. Ngày 02/01/2004, Công ty ñã tiến hành tiêu huỷ 100.000 gà (Ninh Văn Hiểu, 2005). Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 7 Dịch ñã nhanh chóng lây lan ra hầu hết các tỉnh trong cả nước, cụ thể như sau: * Năm 2003 - 2004: - ðợt dịch thứ nhất (từ tháng 12/2003 ñến 3/2004): Cuối năm 2003 dịch cúm gia cầm thể ñộc lực cao với tác nhân gây bệnh là virus cúm H5N1 xảy ra ở Việt Nam. ðây là lần ñầu tiên trong lịch sử nước ta dịch cúm gia cầm xuất hiện vì thế nó ñược coi là một bệnh mới ở gia cầm. Dịch lây lan một cách nhanh chóng cùng một lúc ở nhiều ñịa phương khác nhau và ñã gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm. Chỉ trong vòng 2 tháng, ñến ngày 27/02/2004 dịch ñã xuất hiện ở 2.574 xã, phường (chiếm 24,6%) thuộc 381 huyện, quận, thị xã của 57 tỉnh, thành phố trong cả nước. Tổng số gia cầm bị mắc bệnh, chết và tiêu hủy hơn 43,9 triệu con chiếm 16,8% tổng ñàn, trong ñó gà 30,4 triệu con; thủy cầm 13,5 triệu con. Ngoài ra còn có hàng triệu con chim cút và các loại chim khác bị chết và tiêu huỷ. - ðợt 2 (từ tháng 4/2004 ñến 11/2004): Dịch cúm gia cầm thể ñộc lực cao ñã tái xuất hiện vào giữa tháng 4 năm 2004 ở một số tỉnh thuộc ðồng bằng sông Cửu Long. Bệnh chủ yếu xuất hiện ở các hộ chăn nuôi nhỏ lẻ và hầu như không có trại chăn nuôi quy mô lớn nào bị nhiễm bệnh. Dịch có khuynh hướng xuất hiện ở những vùng có chăn nuôi nhiều thủy cầm. Dịch ñã xảy ra ở 46 xã phường của 32 quận, huyện, thị xã thuộc 17 tỉnh. Thời gian cao ñiểm nhất vào tháng 7 sau ñó giảm dần, ñến tháng 11 cả nước chỉ có 1 ñiểm phát dịch. Tổng số gia cầm bị tiêu huỷ trong thời gian này là 84.078 con, trong ñó có 55.999 gà, 8.132 vịt và 19.947 chim cút. * Năm 2005: - ðợt 1 (từ tháng 12/2004 ñến 5/2005): Trong thời gian này dịch ñã xuất hiện ở 670 xã của 182 huyện thuộc 36 tỉnh, thành phố (15 tỉnh phía Bắc, 21 tỉnh phía Nam). Dịch xuất hiện nhiều nhất vào tháng 1/2005 với 143 ổ dịch xảy ra trên 31 tỉnh, thành phố, số gia cầm tiêu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 8 hủy là 470.495 gà, 825.689 vịt, ngan và 551.029 chim cút. Bệnh xuất hiện ở tất cả các tỉnh, thành phố thuộc vùng ðồng bằng sông Cửu Long. Những tỉnh bị dịch bệnh nặng là Long An, Tiền Giang, Bạc Liêu, ðồng Tháp, ước tính thiệt hại khoảng 3.000 tỷ ñồng, trong ñó thiệt hại trực tiếp do gia cầm bị chết và tiêu hủy là 1.800 tỷ ñồng. - ðợt 2 (từ 10/2005 ñến 12/2005): Từ ñầu tháng 10/2005 ñến 15/12/2005 dịch ñã tái phát ở 285 xã, phường, thị trấn thuộc 100 quận, huyện của 24 tỉnh, thành phố. Số gia cầm ốm, chết và tiêu hủy là 3.735.620 con, trong ñó có 1.245.282 gà; 2.005.557 vịt; 484.781 chim cút, bồ câu, chim cảnh, tuy thiệt hại không lớn nhưng gây sự hoang mang trong cộng ñồng dân cư là dịch cúm vẫn còn dai dẳng xảy ra. Từ ngày 15/12/2005 ñến 05/12/2006 cả nước khống chế thành công dịch cúm gia cầm. * Năm 2007: - ðợt dịch 1 (từ 12/2006 ñến 01/2007), sau gần 1 năm khống chế dịch cúm gia cầm, từ ngày 6/12/2006 dịch cúm gia cầm tái phát tại Cà Mau, Bạc Liêu sau ñó xuất hiện ở 6 tỉnh khác là Hậu Giang, Cần Thơ, Trà Vinh, Vĩnh Long, Kiên Giang và Sóc Trăng và 3 tỉnh ðồng bằng sông Hồng (Hà Nội, Hà Tây, Hải Dương). ðợt dịch này ñã xảy ra ở 83 xã, phường của 33 huyện thuộc 11 tỉnh, thành phố. Tổng số gia cầm bệnh chết và tiêu huỷ là 45.581 con (gà chiếm 30%, vịt chiếm 70%). Trong ñợt dịch này, các ổ dịch xảy ra chủ yếu trên ñàn vịt chăn nuôi nhỏ lẻ, dưới 3 tháng tuổi, ấp nở trái phép và chưa ñược tiêm phòng vacxin. - ðợt dịch 2 (từ 5/2007 ñến 7/2007), dịch tái phát ở Nghệ An, sau ñó dịch lây lan và ñược phát hiện tại 167 xã, phường của 70 huyện thuộc 23 tỉnh. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 191.001 con (gà 23.877 con, vịt 161.462 con và ngan 5.662 con). - ðợt dịch 3: sau hơn một tháng khống chế thành công dịch cúm gia cầm trong phạm vi cả nước, từ ngày 1/10/2007 dịch ñã tái phát tại 15 xã, phường của Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 9 9 huyện thuộc 6 tỉnh. Tổng số gia cầm mắc bệnh chết và tiêu huỷ 7.488 con (1.024 gà, chiếm 13,7% và 6.464 vịt chiếm 86,3%). * Năm 2008: Dịch cúm gia cầm ñã xuất hiện tại 80 xã thuộc 54 huyện, quận, thị xã của 27 tỉnh, thành phố. Tổng số gia cầm chết và buộc phải tiêu huỷ là 76.095 con (gồm 28.928 gà, 44.202 vịt và 2.965 ngan). Dịch xuất hiện ở những ñàn gia cầm quy mô từ 100 - 2.000 con, không ñược tiêm phòng vacxin (44,59%), hoặc ñàn thủy cầm mới tiêm phòng 1 mũi (16,21%). * Năm 2009: Cả nước ñã có 129 ổ dịch tại 71 xã, phường, thị trấn của 35 huyện, thị xã thuộc 18 tỉnh, thành phố phát dịch cúm gia cầm là Bạc Liêu, Bắc Ninh, Cà Mau, ðiện Biên, ðồng Tháp, Hậu Giang, Khánh Hòa, Nghệ An, Ninh Bình, Quảng Ngãi, Quảng Ninh, Quảng Trị, Sóc Trăng, Thái Nguyên, Thanh Hóa, Thành phố Hà Nội, Vĩnh Long và Cao Bằng. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là 112.847 con, trong ñó gà 24.686 con, vịt 85.038 con và ngan 3.123 con. * Năm 2010: Dịch cúm gia cầm ñã xảy ra ở 63 xã, phường, thị trấn của 37 huyện, thị xã thuộc 23 tỉnh là Bắc Cạn, Bắc Ninh, Bến Tre, Cà Mau, ðắc Lắc, ðiện Biên, ðồng Tháp, Gia Lai, Hà Giang, Hà Tĩnh, Khánh Hòa, Kon Tum, Lạng Sơn, Nam ðịnh, Nghệ An, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Quảng Ninh, Quảng Trị, Sóc Trăng, Thái Bình, Thái Nguyên, Tuyên Quang. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là 75.769 con (gà 21.938 con, vịt 52.809 con, ngan 1.022 con). * Nhận xét về dịch tễ học: - Về phân bố ñịa lý: các ñợt dịch phát ra tập trung ở khu vực ðồng bằng sông Cửu Long và ðồng bằng sông Hồng. Những vùng này có nhiều hệ thống sông ngòi, kênh rạch, mật ñộ chăn nuôi cao, tổng ñàn gia cầm lớn và việc buôn bán, vận chuyển, tiêu thụ gia cầm cao hơn các vùng khác. - Về thời gian xảy ra dịch: dịch thường phát ra vào vụ ðông Xuân, cao Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 10 ñiểm vào cuối tháng 1 ñầu tháng 2. Trong thời gian này thời tiết thay ñổi, ñộ ẩm cao, nhiệt ñộ thường xuống thấp, tạo ñiều kiện thuận lợi cho virus cúm tồn tại, phát triển và lây lan. ðồng thời giai ñoạn này là lúc mật ñộ chăn nuôi gia cầm và hoạt ñộng vận chuyển gia cầm, sản phẩm gia cầm diễn ra sôi ñộng nhất trong năm cũng là ñiều kiện thuận lợi cho sự bùng phát và lây lan dịch. - Về loài mắc bệnh: ở ñợt dịch thứ nhất và thứ hai năm 2004 tỉ lệ gà mắc bệnh cao hơn vịt, ngan. Nhưng từ ñợt dịch năm 2005 ñã có sự thay ñổi lớn khi các thống kê cho thấy tỉ lệ mắc bệnh, chết và tiêu huỷ ở vịt cao gấp 2 lần gà. ðiều này cho thấy mầm bệnh ñã lây lan, tồn tại trong ñàn thuỷ cầm, có thể tăng ñộc lực và gây bệnh thành các ñợt dịch. - Về loại hình, quy mô và mức ñộ dịch: dịch phát ra ở tất cả các loại hình chăn nuôi, tỉ lệ mắc bệnh cao nhất ở loại hình chăn nuôi hỗn hợp các loài gia cầm (ñặc biệt chăn nuôi gà lẫn với vịt) và giảm dần ở những trại chăn nuôi gà có số lượng lớn. Quy mô của dịch ñợt 1 là lớn nhất, trong những ñợt dịch sau mặc dù dịch vẫn xảy ra ở nhiều tỉnh, thành phố nhưng quy mô giảm nhiều (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2005). Virus cúm A/H5N1 chính thức ñược công bố xuất hiện ở Việt Nam vào cuối tháng 12/2003 ñã nhanh chóng gây nên ñại dịch cúm gia cầm. ðây là lần ñầu tiên dịch cúm gia cầm xảy ra ở Việt Nam và chưa có những nghiên cứu một cách sâu sắc nên ñã lúng túng trong việc phòng chống cũng như dập tắt các ổ dịch. Chỉ trong một thời gian ngắn dịch cúm gia cầm bùng phát tại nhiều tỉnh, thành phố trong cả nước, hàng chục triệu gia cầm bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề về kinh tế và ñã có nhiều người mắc bệnh và tử vong do virus cúm A/H5N1. 2.4 ðặc tính sinh học của virus cúm type A 2.4.1 Hình thái và cấu trúc Virus cúm gia cầm thuộc type A là một trong 4 nhóm virus của họ Orthomyxoviridae, bao gồm: - Nhóm virus cúm A: gây bệnh cho mọi loài chim, một số ñộng vật có vú và cả con người. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 11 - Nhóm virus cúm B: chỉ gây bệnh cho người. - Nhóm virus cúm C: gây bệnh cho người, lợn. - Nhóm Thogotovirus. Virus thuộc họ Orthomyxoviridae có hệ gen là axit Ribonucleic (ARN) sợi ñơn, có cấu trúc sợi âm ñược ký hiệu là ss (-) ARN (Negative Single Stranded RNA). Sợi âm ARN của hệ gen có ñộ dài 10.000 - 15.000 nucleotit. Hạt virus (virion) có dạng hình cầu, ñôi khi có dạng hình sợi, ñường kính khoảng 80 - 120 nm. Phân tử lượng của một hạt virion vào khoảng 250 triệu Dalton. Vỏ virus, với bản chất protein có nguồn gốc từ màng tế bào mà virus ñã gây nhiễm ñã ñược ñặc hiệu hóa ñể gắn protein màng của virus vào, bao gồm một số protein ñược glycosyl hóa (glycoprotein) và một số protein dạng trần không ñược glycosyl hóa (non - glycosylated protein). Protein bề mặt có cấu trúc từ glycoprotein, bao gồm protein gây ngưng kết hồng cầu Haemagglutinin (HA), protein enzym cắt thụ thể Neuraminidase (NA) và protein ñệm Matrix (MA), ñó là những gai, mấu có ñộ dài 10 - 14 nm, ñường kính 4 - 6 nm. Virus cúm A có hệ gen gồm 8 phân ñoạn kế tiếp nhau mã hóa cho 10 loại protein khác nhau của virus là HA, NA, NP, M1, M2, PB1, PB2, PA, NS1, NS2. Tám phân ñoạn của sợi ARN có thể tách và phân biệt rõ ràng nhờ phương pháp ñiện di. + Phân ñoạn 1 - 3: mã hóa cho protein PB1, PB2 và PA là các protein có chức năng là enzym polymerase tổng hợp axit Ribonucleic nguyên liệu cho hệ gen và các ARN thông tin tổng hợp protein của virus. Trong ñó PB1 có phân tử lượng là 87 x 103 Dalton, PB2 có phân tử lượng là 84 x 103 Dalton và PA có phân tử lượng là 83 x 103 Dalton. + Phân ñoạn 4: mã hóa cho protein Haemagglutinin (HA) là một protein bề mặt cắm gốc vào bên trong, có chức năng bám dính vào thụ thể của tế bào, có khả năng gây ngưng kết hồng cầu, có khả năng hợp nhất vỏ virus với màng tế Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 12 bào nhiễm và tham gia vào phản ứng trung hòa virus. Phân tử lượng của HA là 63 x 103 Dalton (nếu không ñược glycosyl hóa) và có phân tử lượng là 77 x 103 Dalton (nếu ñược glycosyl hóa). HA là polypeptit gồm 2 chuỗi HA1 và HA2 nối với nhau bằng ñoạn oligopeptit ngắn ñặc trưng cho các subtype H (H1 - H16) trong tái tổ hợp tạo nên biến chủng. Chuỗi oligopeptit này chứa một số axit amin cơ bản làm khung, thay ñổi ñặc hiệu theo từng loại hình subtype H. Sự thay ñổi thành phần của chuỗi nối quyết ñịnh ñộc lực của virus thuộc biến chủng mới. + Phân ñoạn 5: mã hóa cho protein Nucleoprotein (NP) một loại protein ñược phosphoryl hóa, có biểu hiện tính kháng nguyên ñặc hiệu theo nhóm (Group - Specific), chúng tồn tại trong hạt virion trong dạng liên kết với mỗi phân ñoạn ARN nên loại NP còn ñược gọi là Ribonucleo protein. Phân tử lượng là 56 x 103 Dalton. + Phân ñoạn 6: mã hóa cho protein enzym Neuraminidase (NA), có chức năng là một enzym phân cắt HA sau khi virus vào bên trong tế bào nhiễm (Castrucci và Kawaoka, 1993). Phân tử lượng là 50 x 103 Dalton. + Phân ñoạn 7: mã hóa cho 2 tiểu phần protein ñệm M1 và M2, là protein màng không ñược glycosyl hóa, có vai trò làm ñệm bao bọc lấy ARN. M2 là một tetramer có chức năng tạo khe H+ giúp cởi bỏ virus sau khi xâm nhập vào tế bào cảm nhiễm. M1 có chức năng tham gia vào quá trình tổng hợp và nẩy mầm của virus (Holsingger và cộng sự, 1994). Phân tử lượng của M1 là 28 x 103 Dalton, M2 là 11 x 103 Dalton. + Phân ñoạn 8: có ñộ dài ổn ñịnh (890 nucleotit) mã hóa 2 tiểu phần protein không cấu trúc là NS1 và NS2 (non - structural protein) có chức năng chuyển ARN từ nhân ra kết hợp với M1, kích thích phiên mã, chống lại hiện tượng interferon. Phân tử lượng của NS1 là 27 x 103 Dalton, NS2 là 14 x 103 Dalton. Nghiên cứu cấu trúc không gian ba chiều của protein H5 của virus cúm A ở gà, H9 ở lợn và H5 của virus thích ứng gây bệnh trên người ñã cho thấy: virus cúm gà thích hợp với loại tế bào có thụ thể HA chứa axit sialic liên kết Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 13 với ñường Galactose, góc quay alpha - 2,3 tại vị trí Gln - 226; trong khi ở lợn và người virus thích hợp với thụ thể có góc quay alpha - 2,6 với nhóm hydroxyl (4 - OH) của ñường Galactose (glycosyl hóa) tại vị trí Leu - 226 (cúm người). Lợn có các loại tế bào tồn tại với thụ thể HA bề mặt có cả hai loại cấu trúc trên, diều ñó giải thích virus cúm gia cầm trung gian qua lợn ñể tiến hóa ._.tạo góc quay phù hợp thích ứng sang người. Hình 2.1: Cấu trúc virus H5N1 Haemagglutinin Neuraminidase Hình 2.2: Cấu trúc Haemagglutinin và Neuraminidase 2.4.2 ðặc tính kháng nguyên của virus cúm type A Các loại kháng nguyên ñược nghiên cứu nhiều nhất là protein nhân (NP), protein ñệm (M), protein gây ngưng kết hồng cầu (HA) và protein enzym cắt thụ thể (NA). Protein NP và M1 thuộc loại hình kháng nguyên ñặc hiệu nhóm (genus specific antigen), ký hiệu là gs kháng nguyên; HA và NA là protein thuộc loại hình kháng nguyên ñặc hiệu type và dưới type (type - specific Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 14 antigen), ký hiệu là ts kháng nguyên. Một ñặc tính quan trọng là virus cúm có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của nhiều loài ñộng vật. ðó là sự kết hợp giữa mấu lồi kháng nguyên HA trên bề mặt của virus cúm với thụ thể có trên bề mặt hồng cầu, làm cho hồng cầu ngưng kết với nhau tạo thành mạng ngưng kết thông qua cầu nối virus, gọi là phản ứng ngưng kết hồng cầu HA (Haemagglutination test). Kháng thể ñặc hiệu của kháng nguyên HA có khả năng trung hòa các loại virus tương ứng, chúng là kháng thể trung hòa có khả năng triệt tiêu virus gây bệnh. Nó có thể phong tỏa sự ngưng kết bằng cách kết hợp với kháng nguyên HA. Do vậy thụ thể của hồng cầu không bám vào ñược ñể liên kết tạo thành mạng ngưng kết. Người ta gọi phản ứng ñặc hiệu kháng nguyên kháng thể có hồng cầu tham gia là phản ứng ngăn cản ngưng kết hồng cầu HI (Haemagglutination inhibition test). Phản ứng ngưng kết hồng cầu HA và phản ứng ngăn cản ngưng kết hồng cầu HI ñược sử dụng trong chẩn ñoán cúm gia cầm. Theo Ito và Kawaoka (1998), vấn ñề phức tạp của kháng nguyên virus cúm là sự biến ñổi và trao ñổi trong nội bộ gen dẫn ñến sự biến ñổi liên tục về tính kháng nguyên. Có 2 cách biến ñổi kháng nguyên của virus cúm: - ðột biến ñiểm (ñột biến ngẫu nhiên hay hiện tượng trôi trượt, lệch lạc về kháng nguyên - Antigenic drift). ðây là kiểu ñột biến xảy ra liên tục thường xuyên trong quá trình tồn tại của virus mà bản chất là do có sự thay ñổi nhỏ về trình tự nucleotit của gen mã hóa, ñặc biệt ñối với kháng nguyên H và kháng nguyên N. Kết quả là tạo ra các phân type cúm hoàn toàn mới có tính thích ứng loài vật chủ khác nhau và mức ñộ ñộc lực gây bệnh khác nhau. Chính nhờ sự biến ñổi này mà virus cúm A tạo nên 16 biến thể gen HA (H1 - H16) và 9 biến thể NA (N1 - N9). - ðột biến tái tổ hợp di truyền (hiện tượng thay ca - Antigenic shift): hiện tượng tái tổ hợp gen ít xảy ra hơn so với hiện tượng ñột biến ñiểm, nó chỉ xảy ra Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 15 khi 2 hoặc nhiều loại virus cúm khác nhau cùng nhiễm vào một tế bào chủ do sự trộn lẫn 2 bộ gen của virus. ðiều này tạo nên sự sai khác cơ bản về bộ gen của virus cúm ñời con so với virus bố mẹ. Khi hiện tượng tái tổ hợp gen xuất hiện có thể sẽ gây ra các vụ dịch lớn cho người và ñộng vật với mức ñộ nguy hiểm không thể lường trước ñược. Theo Lê Văn Năm (2004), do hạt virus cúm A có cấu trúc là 8 ñoạn gen nên về lý thuyết từ 2 virus có thể tạo 256 kiểu tổ hợp của virus thế hệ sau. Khi nghiên cứu về ñặc tính kháng nguyên của virus cúm gia cầm cho thấy giữa các biến thể tái tổ hợp và biến chủng subtype về huyết thanh học cho thấy không hoặc rất ít có phản ứng chéo. ðây là ñiểm trở ngại lớn cho việc nghiên cứu nhằm tạo ra vacxin cúm ñể phòng bệnh cho người và ñộng vật (Ito và Kawaoka, 1998). Khi xâm nhiễm vào cơ thể ñộng vật, virus cúm A kích thích cơ thể sản sinh ra kháng thể ñặc hiệu, trong ñó quan trọng hơn cả là kháng thể kháng HA, chỉ có kháng thể này mới có vai trò trung hòa virus nhưng thông thường ñộng vật và người chết rất nhanh trước khi hệ miễn dịch sản sinh kháng thể. Một số kháng thể khác có tác dụng kìm hãm sự nhân lên của virus, ví dụ kháng thể kháng NA có tác dụng ngăn cản virus giải phóng, kháng thể kháng M2 không cho quá trình bao gói virus xảy ra. 2.4.3 Thành phần hóa học Nhân ARN của virus chiếm 0,8 - 1,1%; protein chiếm 70 - 75%; lipit chiếm 20 - 24%; hydratcarbon chiếm 5 - 8% khối lượng hạt virus. Lipit tập trung ở màng virus chủ yếu có gốc phospho. Số còn lại là cholesterol, glucolipit và một ít hydrocarbon gồm các loại ñường galactose, ribose, fructose, glucose. Protein của virus chủ yếu là glycoprotein. 2.4.4 Quá trình nhân lên của virus Fener và cộng sự mô tả quá trình nhân lên của virus cúm A ñược tóm tắt như sau: Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 16 Virus xâm nhập vào tế bào nhờ chức năng của protein HA thông qua hiện tượng ẩm bào (endocytosis) qua cơ chế trung gian tiếp hợp thụ thể. Thụ thể liên kết tế bào của virus cúm có bản chất là axit sialic cắm sâu vào glycoprotein hay glycolipit của vỏ virus. Trong khoang ẩm bào, khi nồng ñộ pH ñược ñiều hòa ñể giảm xuống mức thấp sẽ xảy ra quá trình hợp nhất màng tế bào và virus, sự hợp nhất này phụ thuộc vào sự cắt rời protein HA nhờ enzym peptidase và enzym protease của tế bào. Lúc này nucleocapsid của virus ñi vào trong nguyên sinh chất rồi vào trong nhân tế bào, chuẩn bị thực hiện quá trình tổng hợp ARN nguyên liệu hệ gen cho các virion mới. Hệ thống enzym sao chép của virus ngay lập tức tạo nên các ARN thông tin. Các phân ñoạn ARN hệ gen ñược mã hóa ở 10 - 13 nucleotit ñầu 5’ với nguyên liệu mã hóa lấy từ ARN tế bào, nhờ vào hoạt tính enzym PB2 của virus. ARN thông tin của virus sao chép trong nhân ñược vận chuyển ra nguyên sinh chất, ñược riboxom trợ giúp tổng hợp nên protein cấu trúc và protein nguyên liệu. Protein H, N, M2, ở lại trong nguyên sinh chất, ñược vận chuyển xuyên qua hệ thống võng mạc nội mô và bộ máy golgi sau ñó ñược cắm lên màng tế bào nhiễm. Protein NS1, NP, M1 ñược chuyển vận vào nhân ñể bao bọc ñệm lấy nguyên liệu ARN hệ gen mới ñược tổng hợp. Song song với quá trình sao chép ARN thông tin và tổng hợp protein cấu trúc, protein nguyên liệu, virus tiến hành tổng hợp nguyên liệu di truyền là các sợi ARN mới. Từ sợi ARN âm ñơn của virus ban ñầu, một sợi dương ARN toàn vẹn ñược tạo ra theo cơ chế bổ sung, sợi dương mới này lại làm khuôn ñể tổng hợp nên sợi âm ARN mới làm nguyên liệu. Các sợi âm ARN mới, một số vừa làm nguyên liệu ñể lắp ráp virion mới, số khác lại làm khuôn ñể tổng hợp ARN theo cơ chế như với sợi ARN của virus ñầu tiên. Các sợi ARN hệ gen ñược tạo ra là một sợi hoàn chỉnh về ñộ dài và ñược các protein ñệm (NS1, M1, NP) bao gói tạo nên ribonucleocapsid (nucleoriboprotein) ngay trong nhân tế bào nhiễm, sau ñó ñược vận chuyển ra nguyên sinh chất rồi ñược ñưa ñến vị trí màng tế bào Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 17 có sự biến ñổi ñặc hiệu với virus. Sự kết hợp cuối cùng của tổ hợp nucleoriboprotein với các protein cấu trúc (HA, NA, M2) tạo nên các hạt virus hoàn chỉnh mới và ñược giải phóng ra khỏi tế bào nhiễm theo hình thức nảy chồi. 2.4.6 ðộc lực của virus ðộc lực của virus cúm gia cầm có sự dao ñộng lớn, phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trước hết là protein HA. Có thể nói HA là một loại protein vừa quyết ñịnh tính kháng nguyên vừa quyết ñịnh tính ñộc lực của virus. Các nghiên cứu ở mức ñộ phân tử cho thấy khả năng lây nhiễm của virus phụ thuộc vào tác ñộng của enzym protease vật chủ ñến sự phá vỡ của liên kết hóa học sau khi dịch mã của phân tử ngưng kết, thực chất là sự cắt rời protein HA thành 2 tiểu phần HA1 và HA2. Tính thụ cảm của ngưng kết tố và sự phá vỡ liên kết của men protease lại phụ thuộc vào số lượng các amino axit cơ bản tại ñiểm bắt ñầu phá vỡ các liên kết. Các enzym giống trypsin có khả năng phá vỡ liên kết khi chỉ có một phân tử Arginin, trong khi ñó các enzym protease khác lại cần nhiều amino axit cơ bản. ðể ñánh giá ñộc lực của virus cúm một cách khoa học, các nhà khoa học sử dụng phương pháp gây bệnh cho gà 3 - 6 tuần tuổi bằng cách tiêm tĩnh mạch nước trứng ñã ñược gây nhiễm virus. Sau ñó ñánh giá mức ñộ nhiễm bệnh của gà ñể cho ñiểm (chỉ số IVPI - Intravenous Pathogenicity Index). ðiểm tối ña là 3 ñiểm và ñó là virus có ñộc lực cao nhất. Theo ñịnh nghĩa của OIE, virus cúm nào có chỉ số IVPI từ 1,2 trở lên thuộc loại có ñộc lực cao. Bằng cách tiêm tĩnh mạch 0,2 ml nước trứng gà ñã gây nhiễm virus ñược pha loãng ở nồng ñộ 1/10 cho gà mẫn cảm từ 3 - 6 tuần tuổi, các nhà khoa học ñã thống nhất chia ñộc lực của virus ra 3 loại: - Virus có ñộc lực cao: nếu sau khi tiêm tĩnh mạch 10 ngày làm chết 75 - 100% số gà thực nghiệm. Virus gây bệnh cúm gà (có thể là type phụ) phải làm chết 20% số gà mẫn cảm thực ñịa và phát triển tốt trên tế bào xơ phôi trong môi Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 18 trường nuôi cấy không có Trypsin. - Virus có ñộc lực trung bình: là những chủng virus gây dịch cúm gà với triệu chứng lâm sàng rõ rệt nhưng gây chết gà không quá 15% số gà bị nhiễm bệnh tự nhiên hoặc không gây quá 20% số gà mẫn cảm thực nghiệm. - Virus có ñộc lực thấp: là những virus phát triển tốt trong cơ thể gà, có thể gây ra dịch nhưng không có triệu chứng lâm sàng rõ rệt, không tạo ra bệnh tích ñại thể và không làm chết gà. Trong thực tế người ta chia virus cúm gà ra làm 2 loại: Loại virus có ñộc lực thấp (Low Pathogenic Avian Influenza - LPAI) và loại virus có dộc lực cao (Highly Pathogennic Avian Influenza - HPAI). Theo Horimoto và Kawaoka (1994), chỉ có 2 biến chủng virus có cấu trúc kháng nguyên H5, H7 ñược coi là loại có ñộc lực cao gây bệnh ở gia cầm, nhưng không phải tất cả các chủng mang gen H5, H7 ñều gây bệnh. Thực tế chứng minh rằng các chủng có ñộc lực thấp trong quá trình lưu hành trong thiên nhiên và trong ñàn thủy cầm có thể ñột biến nội gen hoặc ñột biến tái tổ hợp ñể trở thành các chủng có ñộc lực cao. 2.4.7 Phân loại virus Các chủng virus cúm khác nhau có thể phân biệt ñược bằng các kháng nguyên của chúng gồm haemagglutinin và neuraminidase bao phủ trên bề mặt của virus. Có 16 kháng nguyên Haemagglutinin (ký hiệu từ H1 - H16) và 9 kháng nguyên Neuraminidase (ký hiệu từ N1 - N9) ñã ñược phát hiện và mỗi phân type (subtype) virus ñược xác ñịnh bằng sự kết hợp cụ thể giữa 2 loại kháng nguyên của virus. Năm 1980, tổ chức Y tế thế giới ñã ñưa ra một hệ hống phân loại mới cho các virus cúm type A. Hệ thống phân loại mới của Tổ chức Y tế thế giới ñược trình bày theo bảng 2.2. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 19 Bảng 2.2: Các phân type virus cúm A Tên hiện tại Tên trước ñây Tên hiện tại Tên trước ñây H1 H0, H1, Hsw1 N1 N1 H2 H2 N2 N2 H3 H3, Heq2, Hav7 N3 Nav2 H4 Hav4 N4 Nav4 H5 Hav5 N5 NAv5 H6 Hav6 N6 Nav1 H7 Heq1, Hav1 N7 Neq1 H8 Hav8 N8 Neq2 H9 Hav9 N9 Nav6 H10 Hav2 H11 Hav3 H12 Hav10 H13 H14 H15 H16 Trong mỗi phân type, dựa vào cấu trúc gen người ta lại chia thành các nhánh (clade) virus khác nhau ñể phân biệt. Các nhánh virus này có cấu trúc gen, ñộc lực và khả năng gây bệnh khác nhau ñối với ñộng vật mẫn cảm. Virus cúm A/H5N1 dựa vào sự khác biệt di truyền gen HA khác nhau ñược phân loại thành 10 nhánh từ 0 ñến 9 như nhánh 1, nhánh 2.3.2, 2.3.4, nhánh 7,... (Nguyễn Tùng và cộng sự, 2011). 2.4.8 Danh pháp ðể ký hiệu, lưu trữ một cách khoa học và ñầy ñủ các chủng virus cúm phân lập ñược, năm 1980 Tổ chức Y tế thế giới ñã ñưa ra hệ thống phân loại Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 20 mới, ñược quy ñịnh cụ thể: chủng virus/loài vật chủ phân lập ñược virus/vị trí ñịa lý/quy ước chủng của phòng thí nghiệm/năm phân lập/loại subtype của virus. Ví dụ virus cúm có ký hiệu A/Ck/Vietnam/HG4/2005/H5N1 ñược hiểu là virus cúm nhóm A, ñược phân lập từ gà (Ck: Chicken), nơi phân lập là ViệtNam, quy ước chủng của phòng thí nghiệm là HG4 (HG: Hậu Giang), thời gian phân lập năm 2005, subtype H5N1 (Trần Quang Vui và cộng sự, 2010). 2.4.9 Nuôi cấy và lưu giữ virus cúm Virus cúm phát triển tốt trên phôi gà 9 - 11 ngày tuổi, trong nước phôi gà tập trung khá nhiều virus và có thể lưu giữ virus ñược vài tuần ở ñiều kiện 40C. Khả năng tồn tại và gây bệnh của virus rất cao nếu ta bảo quản nước phôi ñó ở - 700C hoặc cho ñông khô. Virus cúm gà cũng phát triển tốt trong tế bào xơ phôi gà (Chicken Embrio Fibroblast - CEF) và tế bào thận chó MDCK (Madin Darby Canine Kidney Cell) với ñiều kiện môi trường nuôi cấy tế bào không chứa trypsin. 2.4.10 Miễn dịch chống bệnh của gia cầm Theo Nguyễn Như Thanh (1997), miễn dịch là trạng thái ñặc biệt của cơ thể không mắc phải tác ñộng có hại của yếu tố gây bệnh, trong khi ñó các cơ thể cùng loài hoặc khác loài lại bị tác ñộng trong ñiều kiện sống như nhau. Cũng như các ñộng vật khác, miễn dịch chống virus cúm của gia cầm có 2 loại là miễn dịch ñặc hiệu và không ñặc hiệu. * Miễn dịch không ñặc hiệu: Khi mầm bệnh xâm nhập vào cơ thể, gia cầm bảo vệ trước hết bằng miễn dịch không ñặc hiệu nhằm ngăn cản hoặc giảm số lượng và khả năng gây bệnh của chúng. Miễn dịch không ñặc hiệu có vai trò quan trọng khi miễn dịch ñặc hiệu chưa phát huy tác dụng. Hệ thống miễn dịch không ñặc hiệu của gia cầm rất phát triển bao gồm: - Hàng rào vật lý: bao gồm da, niêm mạc và các dịch tiết có tác dụng bảo vệ cơ thể ngăn cản tác nhân gây bệnh xâm nhập vào cơ thể. - Hàng rào hóa học: khi mầm bệnh qua hàng rào da và niêm mạc nó sẽ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 21 gặp phải kháng thể dịch thể tự nhiên không ñặc hiệu: + Bổ thể: bổ thể có tác dụng làm tan màng vi khuẩn, làm tăng khả năng thực bào của ñại thực bào (opsonin hóa), ngoài ra bổ thể cũng có vai trò nhất ñịnh trong cơ chế ñáp ứng miễn dịch ñặc hiệu (nhiều trường hợp sự tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể cần sự có mặt của bổ thể). + Interferon (IFN): do nhiều loại tế bào tiết ra nhưng nhiều nhất là tế bào diệt tự nhiên (NK). Khi Interferon ñược sản sinh ra, nó gắn vào tế bào bên cạnh và cảm ứng tế bào ñó sản sinh ra protein AVP (antivirus protein), do ñó khi virus xâm nhập vào tế bào nhưng không nhân lên ñược. - Hàng rào tế bào gồm: + Tiểu thực bào, quan trọng nhất là bạch cầu ña nhân trung tính chiếm 60 - 70% tổng số bạch cầu ở máu ngoại vi, nó thực bào những phân tử nhỏ và vi khuẩn ngoài tế bào. + ðại thực bào là các tế bào lớn có khả năng thực bào, khi ñược hoạt hóa nó sẽ nhận biết và loại bỏ các vật lạ, ngoài ra nó còn giữ vai trò quan trọng trong sự trình diện kháng nguyên tới tế bào lympho T và kích thích tế bào lympho T sản sinh ra Inter leukin (IL-1). ðại thực bào còn tiết ra interferon có hoạt tính kháng virus, lysozym và các yếu tố khác có tác dụng kích thích phản ứng viêm. + Các tế bào diệt tự nhiên là một quần thể tế bào lâm ba cầu có nhiều hạt với kích thước lớn. Các tế bào này có khả năng tiêu diệt các tế bào ñã bị nhiễm virus và các tế bào ñích ñã biến ñổi, nó còn tiết ra interferon làm tăng khả năng thực bào của ñại thực bào. * Miễn dịch ñặc hiệu: Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, cơ thể sẽ sản sinh ra kháng thể ñặc hiệu ñể loại trừ kháng nguyên ñó. Kháng thể ñặc hiệu có thể là dịch thể hoặc có thể là tế bào, ñó là các lympho T mẫn cảm. Vì vậy người ta chia miễn dịch ñặc hiệu ra miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào. - Miễn dịch dịch thể: do tế bào lympho B ñảm nhiệm, nó tiết ra các loại Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 22 Immuno globulin (Ig) gồm có 3 lớp chính là IgM, IgG, IgA. Ở gia cầm IgG ñược gọi là IgY. Các lympho bào bắt nguồn từ tế bào nguồn ở tủy xương ñi tới túi Fabricius, ở ñây chúng ñược huấn luyện ñể trở thành các lympho B, sau ñó di tản ñến các cơ quan lympho ngoại biên, chúng khu trú ở các tâm ñiểm mầm, vùng tủy của lách và hạch bạch huyết. Mỗi tế bào lympho B ñều có globulin miễn dịch khác nhau trên bề mặt của nó. Kháng thể dịch thể chỉ có tác dụng với virus khi nó còn ở ngoài tế bào, lớp IgM và IgG kết hợp với virus với sự tham gia của bổ thể làm tiêu diệt virus, 2 lớp kháng thể này còn ngăn virus không cho kết hợp với Recepter của tế bào tương ứng, ngăn cản sự hòa màng giữa vỏ virus và màng tế bào. Lớp IgA có trong niêm mạc, nó diệt virus ngay trong hàng rào niêm mạc, không cho virus xâm nhập vào trong. Khi virus xâm nhập kích thích sinh ra kháng thể thì kháng thể có tính ñặc hiệu cao giúp ta ñịnh type virus gây bệnh bằng các phản ứng huyết thanh học. Một số lympho B sau khi nhận biết kháng nguyên sẽ thành thục thành lympho B nhớ, hiệu quả làm cho ñáp ứng miễn dịch lần 2 ñối với kháng nguyên nhanh hơn, mạnh hơn lần 1 và lớp kháng thể thường là IgG. - Miễn dịch ñặc hiệu qua trung gian tế bào: quá trình ñáp ứng miễn dịch ñặc hiệu qua trung gian tế bào do tế bào lympho T ñảm nhiệm. Các lympho bào bắt nguồn từ tủy xương di chuyển ñến tuyến ức, tại ñó chúng ñược huấn luyện, biệt hóa thành tiền lympho T, lympho T chưa chín, rồi thành lympho T chín. Từ tuyến ức chúng di tản ñến các cơ quan lympho ngoại vi như các hạch lâm ba, các mảng Payer ở ruột hoặc tới lách. Khi ñại thực bào ñưa thông tin ñến các lympho T, chúng tiếp nhận, biệt hóa trở thành nguyên bào lympho T rồi thành tế bào mẫn cảm với kháng nguyên có chức năng như một kháng thể ñặc hiệu và gọi là kháng thể tế bào. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 23 Các tế bào lympho T thực hiện 2 chức năng quan trọng: - Chức năng hỗ trợ: do các lympho T có dấu ấn CD4 ñảm nhiệm (TH) + Giúp ñỡ các tế bào lympho B phát triển thành tương bào ñể sản xuất kháng thể. + Giúp các tế bào lympho có dấu ấn CD8 trở thành tế bào TC gây ñộc. Tế bào TC ñược hoạt hóa và tiêu diệt tế bào ñích. + Thực hiện phản ứng quá mẫn muộn. + Sản xuất ra các cytokine có tác dụng ñiều khiển sự phát triển của các dòng tế bào bạch cầu và các tế bào mầm của hệ thống tạo máu. + Sản xuất các cytokine có tác dụng hoạt hóa các tế bào ñại thực bào. + Thúc ñẩy quá trình sản xuất các phân tử glycoprotein MHC trên các tế bào trình diện kháng nguyên. ða số các tế bào T hỗ trợ thể hiện dấu ấn CD4 nhận biết kháng nguyên ñược trình diện trên bề mặt của các tế bào trình diện kháng nguyên với các phân tử MHC lớp II. Chức năng này do 2 tiểu quần thể TH ñảm trách. TH1 tham gia phản ứng quá mẫn muộn, sản xuất IL-2 và interferon γ, TH2 hỗ trợ tế bào B và sản xuất chủ yếu IL-4, IL-5. - Chức năng loại trừ kháng nguyên: do các lympho T mang dấu ấn CD8 ñảm nhiệm, có 2 loại: + Lympho T gây ñộc (TC): chúng gây ñộc ñối với tế bào bị nhiễm virus, tế bào ung thư và mảnh ghép dị loài. Chúng có khả năng nhận biết các mảnh peptit kháng nguyên của tế bào ñích gắn với các phân tử MHC lớp I. + Lympho T ức chế (TS): chúng triệt thoái quá trình sản xuất immuno globulin của tế bào B và triệt thoái hoặc ức chế các phản ứng quá mẫn muộn và miễn dịch tế bào. * Những yếu tố ảnh hưởng ñến sự hình thành kháng thể: Sự hình thành kháng thể và quá trình ñáp ứng miễn dịch phụ thuộc rất nhiều yếu tố như trạng thái sức khoẻ của cơ thể, ñiều kiện ngoại cảnh, sự chăm Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 24 sóc nuôi dưỡng, nhưng quan trọng hơn cả là phụ thuộc vào bản chất kháng nguyên. Một số yếu tố ảnh hưởng ñến sự hình thành kháng thể như sau: + Bản chất kháng nguyên: kháng nguyên có bản chất là protein và có tính kháng nguyên cao sẽ kích thích sinh kháng thể tốt. + ðường ñưa kháng nguyên vào cơ thể: ñưa kháng nguyên vào theo ñường thích hợp thì lượng kháng thể sinh ra nhiều. + Liều lượng kháng nguyên: lượng kháng nguyên ñưa vào vừa ñủ ñể kích thích cơ thể sản sinh miễn dịch ở mức tối ña mà không gây ức chế và tê liệt miễn dịch. + Số lần ñưa kháng nguyên vào cơ thể: tiêm nhắc lại vacxin có tác dụng tốt, kháng thể sinh ra nhiều hơn và ñược duy trì trong thời gian lâu hơn. + Chất bổ trợ: chất bổ trợ cho vào khi chế vacxin với mục ñích giữ kháng nguyên lâu trong cơ thể nhờ ñó tạo kích thích liên tục, ñều ñặn các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch tạo ra kháng thể ở mức cao và duy trì ñược lâu hơn. Những chất bổ trợ thường dùng là keo phèn, nhũ tương, dầu khoáng, dầu thực vật, saponin. 2.5 Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm 2.5.1 Phân bố dịch bệnh Virus cúm gia cầm phân bố khắp thế giới trong các loài gia cầm, dã cầm, ñộng vật có vú. Sự phân bố và lưu hành của virus cúm khó xác ñịnh chính xác và chịu ảnh hưởng bởi cả loài vật nuôi, ñộng vật hoang dã, tập quán chăn nuôi gia cầm, ñường di trú của dã cầm, mùa vụ và hệ thống báo cáo dịch bệnh, phương pháp nghiên cứu (Trần Hữu Cổn và Bùi Quang Anh, 2004). 2.5.2 ðộng vật cảm nhiễm Tất cả các loài gia cầm (gà, vịt, ngan, ngỗng,...), các loài chim, chim hoang dã (ñặc biệt thủy cầm di trú) ñều mẫn cảm với virus. Ngoài ra virus cúm type A còn gây bệnh cho nhiều loài ñộng vật có vú như lợn, ngựa, chồn, hải cẩu, thú hoang dã và cả con người. Lợn mắc bệnh cúm thường do phân type H1N1 và H3N2. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 25 2.5.3 ðộng vật mang virus Virus cúm ñã phân lập ñược ở hầu hết các loài chim hoang dã như vịt trời, thiên nga, hải âu, mòng biển, vẹt, vẹt ñuôi dài, vẹt mào, chim thuộc họ sẻ, diều hâu. Tần suất và số lượng virus phân lập ñược ở thủy cầm (ñặc biệt vịt trời) ñều cao hơn các loài khác (Bùi Quang Anh và Văn ðăng Kỳ, 2004). Kết quả ñiều tra thủy cầm di trú ở Bắc Mỹ cho thấy trên 60% chim non bị nhiễm virus do tập hợp ñàn trước khi di trú. Sự kết hợp các kháng nguyên bề mặt H và N của các phân type virus cúm A thường diễn ra ở chim hoang dã. Những virus này không gây ñộc ñối với vật chủ, ñược nhân lên ở ñường ruột những chim này khiến cho chúng mang virus và là nguồn gieo rắc virus cho các loài khác (Alexander, 2003). 2.5.4 Sự truyền lây Khi gia cầm nhiễm virus cúm, virus ñược nhân lên trong ñường hô hấp và ñường tiêu hóa. Sự truyền lây của bệnh ñược thực hiện theo 2 phương thức. - Lây trực tiếp: do con vật mẫn cảm tiếp xúc với con vật mắc bệnh. - Lây gián tiếp: qua các hạt khí dung trong không khí với khoảng cách gần hoặc những dụng cụ chăn nuôi, phân, thức ăn, nước uống, quần áo, giầy dép, phương tiện vận chuyển, lồng nhốt, chim, thú, côn trùng có mang mầm bệnh. Như vậy virus cúm dễ dàng truyền tới vùng khác do con người, phương tiện vận chuyển, dụng cụ và thức ăn chăn nuôi. Bệnh chủ yếu truyền ngang (do tiếp xúc), chưa có bằng chứng cho thấy bệnh có thể truyền dọc (qua phôi thai) vì những phôi bị nhiễm virus thường chết mà không phát triển ñược (Lê Văn Năm, 2004). ðối với gia cầm nuôi, nguồn dịch ñầu tiên thường thấy là: + Từ các loài gia cầm nuôi khác nhau trong cùng một trang trại hoặc các trang trại khác liền kề như vịt lây sang gà. + Từ gia cầm nhập khẩu. + Từ chim di trú ñặc biệt thuỷ cầm ñược coi là ñối tượng chính dẫn nhập virus vào quần thể ñàn gia cầm nuôi. + Từ người và các ñộng vật có vú khác, phần lớn các ổ dịch cúm gia cầm Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 26 gần ñây ñã có sự lây lan thứ cấp thông qua con người (Trần Hữu Cổn và Bùi Quang Anh, 2004). 2.5.5 Sức ñề kháng của virus cúm Virus cúm gia cầm có sức ñề kháng yếu và bị “chết” dễ dàng trong môi trường bên ngoài nếu như không ñược bảo vệ bằng các chất hữu cơ có trong nước bọt hoặc phân. - Với nhiệt ñộ: mặc dù virus không bền vững với nhiệt ñộ tuy nhiên virus tồn tại khá lâu trong các vật chất hữu cơ như phân gà: ở 4oC, virus có thể “sống” ít nhất là 35 ngày; ở 37oC, virus có thể tồn tại vài ngày; ở 56oC virus có thể tồn tại vài giờ; ở 60oC, virus có thể tồn tại 30 phút. Trong thức ăn, nước uống bị ô nhiễm virus có khả năng tồn tại hàng tuần. ðây chính là nguồn bệnh nguy hiểm và tiềm tàng ñể làm lây lan dịch bệnh. Trong nước ao hồ virus vẫn có thể duy trì ñặc tính gây bệnh tới 4 ngày ở nhiệt ñộ 220C và trên 30 ngày ở nhiệt ñộ 00C. - Các hóa chất: do cấu trúc vỏ ngoài của virus là lipit nên chúng mẫn cảm với các chất dung môi và chất tẩy rửa như formalin, axit, ete, β - propiolacton, sau khi tẩy vỏ, các hóa chất như phenolic, NH4+, axit loãng, natrihypochlorit và hydroxylanine có thể phá hủy virus cúm gia cầm. Người ta thường dùng các hóa chất này như các chất sát trùng hữu hiệu ñể tẩy uế chuồng trại, dụng cụ và các thiết bị chăn nuôi. 2.5.6 Mùa vụ phát bệnh Bệnh cúm gia cầm xảy ra quanh năm nhưng thường tập trung vào vụ ñông xuân từ tháng 10 năm trước ñến tháng 2 năm sau. Khi có những biến ñổi bất lợi về ñiều kiện thời tiết như nhiệt ñộ lạnh, ñộ ẩm cao, thời tiết có những thay ñổi ñột ngột, làm giảm sức ñề kháng tự nhiên của con vật. Mặt khác thời ñiểm này có mật ñộ chăn nuôi cao nhất trong năm, các hoạt ñộng vận chuyển, giết mổ gia cầm diễn ra cao nhất trong năm cũng là ñiều kiện thuận lợi ñể dịch bệnh phát sinh lây lan. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 27 2.5.7 Tỷ lệ mắc, tỷ lê chết Khi virus cúm gia cầm ñộc lực cao xâm nhập vào cơ thể gia cầm, tỷ lệ mắc bệnh dao ñộng lớn có khi lên ñến 100%. Gia cầm mắc bệnh ở thể cấp tính và quá cấp tính có tỷ lệ chết cao 70 - 100% (Phạm Sỹ Lăng, 2004). 2.6 Triệu chứng, bệnh tích của bệnh cúm gia cầm 2.6.1 Triệu chứng lâm sàng Các biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh diễn biến rất ña dạng và phức tạp, nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố như ñộc lực, số lượng virus, loài nhiễm bệnh, mật ñộ chăn nuôi, tiểu khí hậu chuồng nuôi. Thời gian ủ bệnh ngắn thường chỉ vài giờ ñến 21 ngày, tổ chức Thú y thế giới ñề nghị nâng lên 28 ngày (Nguyễn Tiến Dũng, 2004). Các triệu chứng về hô hấp thường xuất hiện ñầu tiên và khá ñiển hình như khẹc, lắc ñầu, vẩy mỏ, khó thở, chảy nước mũi, nước mắt. Tiếp theo là mí mắt viêm sưng, phù mặt, phù ñầu. Mào và tích dầy lên do phù thũng, tím tái, xuất huyết. Thịt gà bị bệnh thâm tím. Xuất huyết dưới da chân là ñặc ñiểm ñặc trưng của bệnh cúm gia cầm. Ngoài các triệu chứng trên còn thấy các triệu chứng về thần kinh như ñi lại không bình thường, siêu vẹo, run rẩy, mệt mỏi, nằm li bì tụm ñống với nhau. Gia cầm tiêu chảy mạnh, phân loãng trắng, trắng xanh. Với gia cầm ñang ñẻ thì tỉ lệ ñẻ giảm rất nhanh. Bệnh lây lan nhanh, gia cầm chết ñột ngột. Với chủng virus ñộc lực cao (HPAI) tỉ lệ chết từ 15 - 100%, với chủng virus ñộc lực thấp (LPAI) tỉ lệ chết thấp hơn và mức ñộ biểu hiện triệu chứng cũng nhẹ hơn. Tuy nhiên khi có sự bội nhiễm của vi khuẩn hoặc ñiều kiện chăn nuôi bất lợi tỉ lệ tử vong cao hơn có thể tới 60 - 70% với các biểu hiện triệu chứng nặng hơn (Lê Văn Năm, 2004). 2.6.2 Bệnh tích ñại thể của bệnh cúm gia cầm Mức ñộ biến ñổi bệnh tích ñại thể bệnh cúm gia cầm cũng ña dạng và rất khác nhau trong cùng một ñàn, phụ thuộc rất nhiều vào ñộc lực virus, quá trình diễn biến của bệnh. Những biến ñổi mang tính tổng quan như sau: Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 28 Mào và tích thâm tím, phù nề, xuất huyết dưới da và rìa tích. Xuất huyết dưới da ống chân thành vệt, nốt. Khí quản viêm xuất huyết, chứa nhiều ñờm. Túi khí phù nề, thành túi khí dầy và có nhiều sợi fibrin bám dính. Phổi viêm cata, xuất huyết ñến viêm fibrin làm phổi dính vào lồng ngực. Viêm xuất huyết ñường ruột, ñặc biệt vùng hậu môn, van hồi manh tràng, dạ dày tuyến và niêm mạc tá tràng. Bao tim tích nước vàng, xuất huyết màng bao tim, mỡ vành tim, cơ tim. Lách biến màu lốm ñốm vàng, rắn chắc hơn bình thường. Tụy khô, xuất huyết. Viêm xuất huyết buồng trứng, ống dẫn trứng, nhiều trường hợp trứng non dập vỡ, xoang bụng tích nước vàng lợn cợn. Xuất huyết màng treo ruột, màng bao dạ dày tuyến, dạ dày cơ, màng xương lồng ngực có thể coi là ñặc ñiểm riêng của bệnh cúm gia cầm. 2.6.3 Bệnh tích vi thể Các biến ñổi ñặc trưng về tổ chức học bao gồm: phù nề, xung huyết, xuất huyết và thâm nhập lympho ñơn nhân ở cơ vân, cơ tim, lách, phổi, mào, tích, gan, thận, mắt và thần kinh (Lê Văn Năm, 2004). 2.7 Chẩn ñoán bệnh Việc chẩn ñoán bệnh do nhiễm virus cúm gia cầm type A, vấn ñề chủ yếu và quan trọng là phải phân lập, ñịnh danh ñược virus thông qua các xét nghiệm phi lâm sàng kết hợp chẩn ñoán lâm sàng (triệu chứng, bệnh tích, các ñặc ñiểm dịch tễ). * Phân lập virus Bệnh phẩm có thể là dịch ngoáy họng, dịch ổ nhớp hoặc các tổ chức phổi, khí quản, não, gan, lách, tim. Mẫu bệnh phẩm ñược bảo quản trong dung dịch PBS ở 40C và phải tiến hành phân lập trong vòng 48 giờ, nếu muốn bảo quản dài hơn phải giữ ở - 700C. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 29 * ðịnh danh virus ðể ñịnh danh virus phân lập ñược có thể dùng phản ứng HI hoặc dùng phản ứng RT - PCR với các cặp mồi chuẩn ñể xác ñịnh kháng nguyên H và N. ðể xác ñịnh kháng thể cúm trong huyết thanh có thể dùng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI, ELISA, phản ứng khuếch tán trong thạch. 2.8 Kiểm soát bệnh Bệnh cúm gia cầm cũng như các bệnh truyền nhiễm nói chung, quá trình sinh dịch có 3 khâu quan trọng là nguồn bệnh, nhân tố trung gian truyền bệnh, ñộng vật cảm thụ và có sự liên hệ chặt chẽ giữa 3 khâu. Nếu thiếu 1 trong 3 khâu, ñặc biệt là khâu thứ nhất thì bệnh không thể xảy ra. Nếu có ñủ 3 khâu nhưng không có sự liên hệ giữa các khâu thì bệnh cũng không thể xảy ra. ðể kiểm soát, khống chế bệnh cúm gia cầm có hiệu quả cần tác ñộng vào cả 3 khâu của quá trình sinh dịch. - ðối với nguồn bệnh: tiêu hủy triệt ñể gia cầm nhiễm bệnh, thực hiện tốt công tác vệ sinh khử trùng ñể tiêu diệt mầm bệnh. Tăng cường công tác giám sát phát hiện bệnh. Khi phát hiện thấy gia cầm mang virus phải tiêu hủy ngay. - ðối với n._. ñạt 37,0% và cao nhất ở lần lấy cuối cùng 3/2011 ñạt 52,7%. Tỉ lệ mẫu huyết thanh có kháng thể dương tính trên vịt báo là khá cao và không bình thường bởi những mẫu huyết thanh kiểm tra ñược lấy từ những vịt không tiêm phòng vacxin cúm gia cầm và các ñàn vịt vẫn khỏe mạnh, ñẻ trứng trong suốt quá trình lấy mẫu (trừ 01 ñàn vịt tại huyện Ý Yên bị chết do dịch bệnh vào tháng 11/2010). Theo lý thuyết vịt chưa ñược tiêm phòng nếu không nhiễm virus cúm thì khi kiểm tra huyết thanh sẽ không có kháng thể cúm. Chúng tôi cho rằng có kháng thể trong huyết thanh vịt chỉ báo là do một số ñàn vịt ñã ñược tiêm vacxin cúm gia cầm trước khi ký hợp ñồng với chủ hộ chăn nuôi nhưng ñịa phương vẫn chọn làm ñàn chỉ báo (hợp ñồng ñàn chỉ báo ñược ký vào tháng 4/2010). Tuy nhiên một vấn ñề khoa học nữa lại ñược ñặt ra là tại sao kháng thể này lại tồn tại ổn ñịnh suốt thời gian dài gần 1 năm trong khi theo khuyến cáo của nhà sản xuất vacxin cúm H5N1 thì miễn dịch bảo hộ sau tiêm phòng chỉ kéo dài từ 4 - 5 tháng. Trường hợp vịt ñã ñược tiêm phòng vacxin cúm trước thì nếu thực hiện lấy mẫu nhiều lần trên cùng một cá thể, cùng một ñàn thì kháng thể sinh ra sau khi ñạt hàm lượng nhất ñịnh sẽ có xu hướng giảm dần, ñồng thời tỉ lệ các mẫu huyết thanh có kháng thể cũng giảm dần. Tuy nhiên kết quả chúng tôi thu ñược lại không cho thấy ñiều ñó, tỉ lệ huyết thanh có kháng thể luôn ở mức ổn ñịnh khoảng 40%, thậm chí còn ñạt mức cao nhất ở lần lấy cuối cùng. ðiều này xảy ra khi có sự lưu hành virus cúm gia cầm ngoài môi trường xâm nhập vào gây ñáp ứng miễn dịch sinh kháng thể hoặc một số mẫu huyết thanh không ñược lấy ñúng trên những vịt chỉ báo ñã ñược ñánh dấu. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 68 Như ñã trình bày ở trên, mỗi ñàn vịt chỉ báo chỉ có 25 con vịt lấy mẫu ñược ñánh dấu, ñeo mã số riêng và không tiêm phòng. Những vịt còn lại trong ñàn ñược nuôi chung với vịt chỉ báo và vẫn ñược tiêm phòng vacxin cúm theo quy ñịnh. Trong thời gian thực hiện hợp ñồng một số vịt chỉ báo ñã bị mất vòng ñeo chân và bị lẫn trong ñàn nhưng hàng tháng số mẫu ñược lấy ở mỗi ñàn vẫn ñủ 25 mẫu. Do vậy có thể cán bộ lấy mẫu ñã lấy huyết thanh nhầm những vịt ñã ñược tiêm phòng vacxin dẫn ñến kết quả kiểm tra huyết thanh thấy tỉ lệ mẫu có kháng thể cúm dương tính khá cao. ðiều này cho thấy phương pháp chọn ñàn chỉ báo, cách bố trí thí nghiệm và phương pháp thực hiện chương trình giám sát cúm gia cầm ñàn vịt chỉ báo mà Dự án thực hiện chưa hợp lý và khoa học. Theo chúng tôi, các ñàn vịt là ñàn chỉ báo thì trước khi thực hiện hợp ñồng phải tiến hành kiểm tra kháng thể cúm trong huyết thanh và kết quả kiểm tra phải không có mẫu dương tính ñồng thời không tiêm phòng vacxin cúm cho tất cả số vịt trong ñàn (kể cả những vịt không phải vịt chỉ báo). Trong trường hợp có virus cúm gia cầm lưu hành ngoài môi trường thì có thể chúng sẽ gây bệnh cho gia cầm nếu là chủng virus cúm ñộc lực cao hoặc sẽ phát hiện ñược virus khi kiểm tra các mẫu dịch lấy từ gia cầm, và các mẫu môi trường (nước uống, phân,…). Thực tế trong thời gian thực hiện chương trình giám sát này ñã có 6 ổ dịch cúm gia cầm ñã xảy ra trên ñịa bàn tỉnh Nam ðịnh. Tuy nhiên, trong số các ñàn vịt chỉ báo chỉ có 01 ñàn tại xã Yên Hồng huyện Ý Yên bị chết do dịch. Vấn ñề này ñược chúng tôi làm rõ qua việc giám sát virus học trên ñàn vịt chỉ báo. 4.4.2.2 Giám sát virus học trên ñàn vịt chỉ báo Song song với việc lấy huyết thanh kiểm tra kháng thể chúng tôi tiến hành lấy mẫu dịch hầu họng vịt chỉ báo ñể kiểm tra phát hiện virus cúm gia cầm. Chúng tôi chia các huyện có vịt chỉ báo thành 2 nhóm: - Nhóm A: gồm các huyện Giao Thủy, Xuân Trường, Vụ Bản, Nghĩa Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 69 Hưng, Nam Trực và thành phố Nam ðịnh (41 ñàn) sẽ ñược lấy mẫu 5 lần vào các tháng 7, 9, 11 năm 2010 và tháng 01, 03 năm 2011. - Nhóm B: gồm các huyện Hải Hậu, Trực Ninh, Ý Yên và Mỹ Lộc (40 ñàn) sẽ lấy mẫu 4 lần vào các tháng 8, 10, 12 năm 2010 và tháng 02 năm 2011. Trong các lần lấy mẫu, mỗi ñàn chúng tôi lấy mẫu dịch hầu họng của 25 vịt chỉ báo, mẫu của 5 vịt ñược bỏ chung vào 1 ống nghiệm chứa dung dịch bảo quản (mẫu gộp) và làm một xét nghiệm Realtime RT-PCR ñể phát hiện virus cúm gia cầm. Tổng cộng chúng tôi ñã lấy ñược 1.800 mẫu gộp gửi xét nghiệm, kết quả ñược trình bày ở bảng 4.12. Bảng 4.12: Kết quả giám sát sự lưu hành của virus cúm gia cầm trên ñàn vịt chỉ báo bằng phương pháp RRT-PCR TT Tên huyện Nhóm Số lần kiểm tra Số mẫu gộp kiểm tra Số mẫu dương tính Tỉ lệ (%) 1 Giao Thủy A 5 200 0 0 2 Nam Trực A 5 200 0 0 3 Nghĩa Hưng A 5 200 0 0 4 TP Nam ðịnh A 5 25 0 0 5 Vụ Bản A 5 200 0 0 6 Xuân Trường A 5 185 0 0 7 Hải Hậu B 4 260 0 0 8 Mỹ Lộc B 4 100 0 0 9 Trực Ninh B 4 200 0 0 10 Ý Yên B 4 230 0 0 Tổng hợp 1.800 0 0 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 70 Qua kết quả bảng 4.12 cho thấy không phát hiện sự có mặt virus cúm gia cầm trong các mẫu dịch hầu họng của vịt chỉ báo tại tất cả các ñịa phương ñược lấy mẫu trong suốt thời gian thực hiện chương trình giám sát tại Nam ðịnh. Theo báo cáo của Cục Thú y năm 2010 kết quả giám sát sự lưu hành của virus tại 8 tỉnh có nguy cơ cao ñợt tháng 6 - 7/2010 thì tỉ lệ lưu hành virus cúm gia cầm trên vịt là 0,67% (5 mẫu dương tính trong tổng số 742 mẫu kiểm tra) trong ñó tỉnh Hà Nam liền kề với Nam ðịnh cũng không phát hiện sự có mặt virus cúm gia cầm. Theo Bùi Ngọc Anh, Nguyễn Tiến Dũng (2005) virus cúm thường tồn tại trong gia cầm và bài thải ra ngoài trong vòng 5 - 6 ngày kể từ khi bị nhiễm. Do vậy xác suất ñể bắt ñược virus trên con vật cụ thể là rất thấp. Tỉ lệ phát hiện virus cúm trong các ñàn gia cầm có huyết thanh dương tính là rất thấp chỉ 0,15%. Như vậy, mặc dù kết quả kiểm tra các ñàn vịt chỉ báo có tỉ lệ huyết thanh dương tính trên 40% nhưng qua giám sát virus học không phát hiện virus lưu hành tại nhiều thời ñiểm lấy mẫu khác nhau. Kết quả này chứng tỏ ñã có một số lượng nhất ñịnh mẫu huyết thanh vịt chỉ báo ñược lấy từ những vịt ñã ñược tiêm phòng vacxin cúm (do một số vịt chỉ báo ñã bị mất vòng ñeo chân). 4.4.3 Giám sát sự lưu hành virus cúm gia cầm tại chợ, ñiểm giết mổ gia cầm Bên cạnh chương trình giám sát virus cúm gia cầm tại các hộ chăn nuôi chúng tôi thực hiện giám sát cúm gia cầm tại chợ, ñiểm giết mổ gia cầm ñể phát hiện sự có mặt virus cúm A/H5N1 trên vịt. Chúng tôi thực hiện hai ñợt khảo sát cúm gia cầm tại một số chợ, ñiểm giết mổ vịt trên ñịa bàn tỉnh Nam ðịnh vào tháng 01/2011 và tháng 5/2011. Trong mỗi ñợt chúng tôi tiến hành khảo sát tại 20 chợ hoặc ñiểm giết mổ gia cầm thuộc 10/10 huyện, thành phố (mỗi huyện 2 chợ). Tại mỗi chợ thực hiện khảo sát vào 4 ngày có bán vịt sống. Nếu chợ không có ñủ vịt sống bán thì sẽ ñược thay thế bằng một ñiểm giết mổ vịt thuộc cùng huyện ñó. Nội dung khảo sát bao gồm phỏng vấn tất cả thương lái, người bán gia cầm có mặt ở chợ và lấy Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 71 20 mẫu dịch ổ nhớp, dịch hầu họng của 20 vịt sống ñược bán trong ngày. Mẫu dịch ổ nhớp và hầu họng của mỗi vịt sẽ ñược ñựng chung trong 1 ống có chứa dung dịch bảo quản ñược ñánh mã số. Khi xét nghiệm sẽ gộp 5 mẫu dịch của 5 vịt thành mẫu gộp làm xét nghiệm Realtime RT-PCR ñể phát hiện virus cúm gia cầm. Kết quả ñược chúng tôi trình bày ở bảng 4.13. Bảng 4.13: Kết quả khảo sát cúm gia cầm tại chợ, ñiểm giết mổ gia cầm Kết quả RRT-PCR Thời gian Số chợ/ñiểm giết mổ khảo sát Số mẫu kiểm tra Số mẫu dương tính Tỉ lệ (%) ðợt 1 (01/2011) 20 320 0 0 ðợt 2 (05/2011) 20 320 0 0 Tổng hợp 40 640 0 0 Qua bảng 4.13 cho thấy: lấy 640 mẫu dịch ổ nhớp và hầu họng của vịt còn sống, khỏe mạnh ñược bán tại chợ và vịt ñược ñưa vào các cơ sở giết mổ gia cầm tại các huyện, thành phố trong tỉnh ñể giám sát sự lưu hành của virus cúm gia cầm trong cả 2 ñợt kiểm tra tháng 01/2011 và tháng 5/2011 ñều không phát hiện thấy virus cúm gia cầm. Như vậy kết quả giám sát sự lưu hành virus cúm gia cầm trên ñàn vịt chỉ báo và tại các chợ buôn bán gia cầm tại Nam ðịnh trong thời gian từ tháng 6/2010 ñến tháng 5/2011 ñều không phát hiện ñược virus. Giải thích về các ổ dịch cúm gia cầm xảy ra trong khoảng thời gian này của tỉnh Nam ðịnh chúng tôi cho rằng có thể mầm bệnh ñược ñưa từ ñịa phương khác vào tỉnh thông qua các hoạt ñộng của con người và gây bệnh cho một số ñàn gia cầm. 4.4.4 Giám sát cúm gia cầm các ổ dịch nghi ngờ Tại tỉnh Nam ðịnh trong thời gian từ tháng 9/2009 - 3/2011 ñã xảy ra 8 ổ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 72 dịch cúm gia cầm, trong ñó có 2 ổ dịch xảy ra trên ñàn gà, 4 ổ dịch trên ñàn vịt, 2 ổ dịch nuôi hỗn hợp gà và vịt. Qua ñiều tra thực tế thì dịch xảy ra tại những ñàn vịt không thực hiện tiêm vacxin theo ñúng quy ñịnh (chỉ thực hiện tiêm một mũi hoặc không thực hiện tiêm phòng) và xảy ra trên một số ñàn gà (không tiêm phòng vacxin theo nội dung Dự án GETS). ðánh giá kết quả phòng chống dịch trong thời gian gần ñây tại Nam ðịnh chúng tôi thấy: - Dịch xảy ra ñều là các ổ dịch ñơn lẻ. - Ngành Thú y và các ñịa phương có dịch ñã chỉ ñạo tốt các biện pháp chống dịch khẩn cấp như tiêm phòng bao vây, vệ sinh khử trùng tiêu ñộc, tiêu hủy toàn bộ ñàn gia cầm nhiễm bệnh,... ðể thực hiện sớm, hiệu quả các biện pháp chống dịch thì việc phát hiện nhanh, kịp thời và chẩn ñoán sớm, chính xác căn bệnh là rất quan trọng. Từ tháng 9/2009 ñến 3/2011 tổng cộng Chi cục Thú y tỉnh Nam ðịnh ñã có báo cáo 9 ổ dịch nghi ngờ cúm gia cầm tại 7 xã thuộc 4 huyện là xã Nghĩa An huyện Nam Trực; xã Hải Hưng huyện Hải Hậu; xã Tân Thành huyện Vụ Bản và xã Yên Mỹ, Yên Hồng, Yên Phong, Yên Thọ huyện Ý Yên. Tất cả 9 ổ dịch nghi ngờ này Chi cục Thú y tỉnh ñều cử cán bộ kỹ thuật xuống ñiều tra, xác minh, chẩn ñoán và lấy mẫu phủ tạng gửi xét nghiệm, kết quả có 8 ñàn dương tính với virus cúm gia cầm, chiếm tỉ lệ 88,9% (8/9). Kết quả cụ thể ñược chúng tôi trình bày ở bảng 4.14. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 73 Bảng 4.14: Kết quả xác ñịnh virus cúm gia cầm từ các mẫu bệnh phẩm tại Nam ðịnh từ tháng 9/2009 - 3/2011 bằng phương pháp RRT-PCR Gà Vịt Thời gian Tên huyện Số ñàn gia cầm nghi mắc bệnh Số mẫu kiểm tra Số mẫu (+) Tỉ lệ (%) Số mẫu kiểm tra Số mẫu (+) Tỉ lệ (%) 02/2010 Nam Trực 1 0 0 0 3 3 100,0 3/2010 Hải Hậu 1 2 0 0 0 0 0 11/2010 Ý Yên 3 0 0 0 9 9 100,0 01/2011 Vụ Bản 1 0 0 0 3 3 100,0 02/2011 Ý Yên 1 0 0 0 3 3 100,0 3/2011 Nam Trực 1 3 3 100,0 0 0 0 3/2011 Ý Yên 1 3 3 100,0 0 0 0 Cộng 9 8 6 75,0 18 18 100,0 Nhận xét: - Những ca bệnh nghi ngờ cúm xuất hiện trên cả gà và vịt. Tổng cộng có 8 mẫu phủ tạng gà và 18 mẫu phủ tạng vịt ốm, chết ñược lấy. Kết quả xét nghiệm có 6 mẫu gà và 15 mẫu vịt dương tính với virus cúm gia cầm, tỉ lệ dương tính tương ứng là 75% với gà và 100% với vịt. - Dịch cúm gia cầm ñã tái phát tại 2 huyện Ý Yên và Nam Trực. ðặc biệt huyện Nam Trực dịch tái phát tại cùng một xã sau 1 năm là xã Nghĩa An. Virus cúm phân lập ñược từ mẫu bệnh phẩm ở 2 ổ dịch của xã Nghĩa An ñã ñược phân tích giải trình tự gen. Kết quả cho thấy ñây là 2 nhánh virus cúm gia cầm H5N1 khác nhau, trong ñó nhánh virus mới xuất hiện 2.3.2-B rất ñộc với gà. Trong thực tế trong một số trường hợp dựa trên các triệu chứng lâm sàng, mổ khám bệnh tích và các ñặc ñiểm dịch tễ thu thập ñược Chi cục Thú y tỉnh ñã Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 74 có nhận ñịnh sơ bộ ñàn gia cầm bị nhiễm virus cúm gia cầm thể ñộc lực cao và ñề nghị chính quyền ñịa phương và chủ hộ chăn nuôi tổ chức tiêu hủy ngay ñàn gia cầm nhiễm bệnh khi chưa có kết quả xét nghiệm bệnh phẩm, ñồng thời hướng dẫn ñịa phương và chủ chăn nuôi thực hiện ngay các biện pháp chống dịch khẩn cấp nhằm khoanh vùng, hạn chế lây lan và nhanh chóng dập tắt dịch. Cùng với phát hiện sự xuất hiện của nhánh virus cúm 2.3.2-B tại Nam ðịnh, các chương trình giám sát sự lưu hành của virus cúm gia cầm tại các tỉnh có nguy cơ cao trong cả nước ñã cho thấy virus nhánh 2.3.2 ñang lưu hành ở hầu khắp các tỉnh miền Bắc. ðây là căn cứ khoa học quan trọng giúp Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Cục Thú y ban hành các văn bản chỉ ñạo phòng chống cúm gia cầm. ðặc biệt qua ñánh giá hiệu lực của vacxin cúm H5N1 chủng Re-5 do Trung Quốc sản xuất mà Việt Nam dự kiến sử dụng ñể tiêm phòng năm 2011 và 2012 cho thấy vacxin có bảo hộ rất thấp với virus H5N1 nhánh mới 2.3.2 (hiện nay Trung Quốc ñã không tiếp tục sản xuất vacxin cúm H5N1 chủng Re-1). Từ kết quả này Chính phủ Việt Nam ñã dừng không thực hiện tiêm phòng ñợt 1 năm 2011 do chưa có vacxin tiêm phòng phù hợp. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 75 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết quả nghiên cứu của ñề tài chúng tôi có một số kết luận sau: 1. Tình hình chăn nuôi gia cầm của tỉnh Nam ðịnh từ năm 2008 - 2011 có mức tăng trưởng từ 2,3 - 8,0% và tăng cao nhất trong năm 2009. Dịch cúm gia cầm bắt ñầu xuất hiện tại tỉnh Nam ðịnh năm 2004 sau ñó dịch có xảy ra ở các năm tiếp theo 2005, 2007, 2008, 2010 và 2011. 2. ðã xây dựng ñược bản ñồ dịch cúm gia cầm của tỉnh Nam ðịnh từ năm 2004 ñến nay. Bản ñồ dịch cho thấy rõ hơn tình hình dịch cúm gia cầm xảy ra tại các ñịa phương trong tỉnh. 3. Tỉ lệ tiêm phòng vacxin cúm H5N1 cho ñàn vịt tại Nam ðịnh từ năm 2008 ñến 2010 ñều ñạt tỉ lệ cao từ 85,79 - 105,12% kế hoạch tiêm. Kết quả giám sát sau tiêm phòng vacxin cúm gia cầm H5N1 cho ñàn vịt năm 2010 tại thời ñiểm 1 tháng sau tiêm phòng mũi 1 cho thấy tỉ lệ bảo hộ của ñàn vịt nuôi tại 27 xã của 5 huyện Nam Trực, Trực Ninh, Xuân Trường, Ý Yên và thành phố Nam ðịnh ñạt tỉ lệ không cao. - ðợt 1: tỉ lệ bảo hộ dao ñộng từ 31,9 - 83,3%, trung bình ñạt 62,7%. - ðợt 2: tỉ lệ bảo hộ dao ñộng từ 35,4 - 88,9%, trung bình ñạt 61,1%. Dịch cúm gia cầm có xu hướng xảy ra tại những ñịa phương có tỉ lệ bảo hộ sau tiêm phòng vacxin thấp. Cần tiêm phòng nhắc lại mũi 2 cho những vịt mới tiêm 1 mũi vacxin ñể ñảm bảo miễn dịch phòng chống cúm gia cầm. 4. Tại tỉnh Nam ðịnh, trên những ñàn vịt ñã ñược tiêm phòng vacxin H5N1 cho thấy có sự lưu hành virus cúm A/H5N1 tỉ lệ lưu hành 6,4% trong ñợt kiểm tra lần 1 (tháng 12/2009) và 0,2% trong ñợt 2 (tháng 01/2010). Vịt nhiễm virus cúm nhưng vẫn khỏe mạnh, không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng. - Trên những vịt chỉ báo nuôi tại 81 xã của tỉnh Nam ðịnh không phát hiện sự lưu hành của virus cúm gia cầm trong thời gian từ 6/2010 - 3/2011. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 76 - Kết quả giám sát virus các mẫu dịch hầu họng, dịch ổ nhớp của vịt ñược lấy tại các chợ, ñiểm giết mổ vịt vào tháng 01/2011 và 05/2011 không phát hiện có sự lưu hành của virus cúm gia cầm. - Giám sát bị ñộng trong các ổ dịch nghi ngờ cúm gia cầm tại tỉnh Nam ðịnh ñã phát hiện ñược nhánh virus mới xuất hiện tại Nam ðịnh clade 2.3.2-B ở xã Nghĩa An huyện Nam Trực. 5.2 ðề nghị - ðề tài mới nghiên cứu trên một ñối tượng gây bệnh của virus cúm là vịt vì vậy cần tiến hành các nghiên cứu tiếp theo trên các ñối tượng khác như gà, ngan, chim cảnh, chim hoang,… - Cần ứng dụng phần mềm bản ñồ ArcGIS trong các lĩnh vực quản lý khác của ngành thú y như xây dựng bản ñồ phân bố vùng chăn nuôi các loại vật nuôi; bản ñồ phân bố nơi thu gom, tập trung ñộng vật; bản ñồ chuỗi cung ứng gia cầm (gia súc) bao gồm các chợ bán gia cầm (gia súc), lò ấp nở (trại giống), cơ sở giết mổ, cửa hàng bán thuốc thú y,… - Sớm nghiên cứu khảo nghiệm, thử nghiệm và sản xuất các loại vacxin tương ñồng với chủng virus cúm ñang lưu hành ñể thực hiện tiêm phòng ñảm bảo an toàn dịch bệnh cho ñàn gia cầm. - ðể lựa chọn gia cầm chỉ báo ngoài các thông tin thu ñược từ việc ñiều tra, phỏng vấn chủ hộ và cán bộ thú y cơ sở thì nhất thiết phải tiến hành lấy mẫu huyết thanh ñể kiểm tra kháng thể cúm. ðồng thời phải có biện pháp ñánh dấu phù hợp, dễ nhận biết với những gia cầm khác trong ñàn như cắt mỏ, phun sơn,… Những gia cầm khác trong ñàn chỉ báo cũng không tiêm phòng vacxin. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu Tiếng Việt 1. Vũ Triệu An (1998), Miễn dịch học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 2. Bùi Ngọc Anh, Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Thúy Diên, ðỗ Quý Phương, ðào Thanh Văn, Bùi Nghĩa Vượng, Nguyên Thế Vinh (2005), Giám sát bệnh cúm gia cầm tại Thái Bình. Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, tập XII số 2 - 2005. 3. Bùi Quang Anh và Văn ðăng Kỳ (2004), Bệnh cúm gia cầm: lưu hành bệnh, chẩn ñoán và kiểm soát dịch bệnh, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, tập XI số 3 - 2004. Tr. 69 - 75. 4. Ban Chỉ ñạo Quốc gia phòng chống dịch cúm gia cầm (2005), Báo cáo tổng kết công tác 2 năm (2004 - 2005) phòng chống dịch cúm gia cầm, Hội nghị Tổng kết 2 năm phòng chống dịch cúm gà, ngày 18/4/2005, Hà Nội. 5. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2005), Dự án sử dụng vacxin nhằm khống chế và thanh toán bệnh cúm gia cầm thể ñộc lực cao H5N1. 6. Bộ Nông nghiệp và PTNT, Bộ Y tế (2006), Việt Nam - Chương trình phối hợp hành ñộng quốc gia phòng chống dịch cúm gia cầm và cúm ở người 2006 - 2010 (Sách xanh). 7. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2011), Quyết ñịnh số 305/Qð-BNN- TY ngày 25/02/2011 về việc phê duyệt Dự án sử dụng vacxin nhằm khống chế và thanh toán bệnh cúm gia cầm thể ñộc lực cao giai ñoạn IV (2011 - 2012). 8. Nguyễn Văn Cảm, Tống Hữu Hiến, Nguyễn Tùng, Nguyễn Hoàng ðăng (2011), Kết quả công cường ñộc gà, vịt, ngan sau khi dùng vacxin cúm gia cầm tái tổ hợp H5N1 chủng Re-5 của Trung Quốc, Tạp chí Khoa học Thú y, tập XVIII số 2 - 2011. Tr. 12 - 16. 9. Trần Hữu Cổn và Bùi Quang Anh (2004), Bệnh cúm ở gia cầm và biện pháp phòng chống, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 10. Chi cục Thú y tỉnh Nam ðịnh, Báo cáo tổng kết công tác thú y của tỉnh Nam ðịnh năm 2008, 2009, 2010. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 78 11. Chi cục Thú y tỉnh Nam ðịnh (2011), Báo cáo tổng kết Dự án GETS. 12. Cục Thú y (2005), Các văn bản chỉ ñạo và hướng dẫn phòng chống dịch cúm gia cầm. 13. Cục thú y (2005), Sổ tay hướng dẫn phòng chống bệnh cúm gia cầm và bệnh cúm trên người, Hà Nội. 14. Cục Thú y, Báo cáo công tác phòng chống dịch cúm gia cầm các năm 2009 và 2010. 15. Cục Thú y (2011), Báo cáo công tác quản lý thú y năm 2010. 16. Cục Thú y (2011), Công văn số 864/TY-DT ngày 19/5/2011 về việc lưu hành virus và kế hoạch tiêm phòng vacxin cúm gia cầm ñợt 1 năm 2011. 17. Cục Thú y (2009), Công văn số 1313/TY-DT ngày 06/8/2009 về việc triển khai hoạt ñộng dự án GETS tại các tỉnh. 18. Trương Văn Dung và Nguyễn Viết Không (2004), Một số hoạt ñộng nghiên cứu khoa học của Viện Thú y quốc gia về bệnh cúm gia cầm và giải pháp khoa học công nghệ trong thời gian tới, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, tập XI số 3 - 2004. Tr. 62 - 68. 19. Nguyễn Tiến Dũng (2004), Hội thảo một số biện pháp khôi phục ñàn gia cầm sau dập dịch, Hà Nội. 20. Nguyễn Tiến Dũng, ðào Thanh Vân, Bùi Ngọc Anh, Kenjiro Inui, Bùi Nghĩa Vượng, Nguyễn Thế Vinh, Nguyễn Bá Thành, Phạm Thị Kim Dung (2005), Giám sát tình trạng nhiễm virus cúm gia cầm tại ñồng bằng sông Cửu Long cuối năm 2004, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, tập XII số 2 - 2005. Tr. 13-17. 21. Phạm Văn ðức (2010), Thử nghiệm vacxin cúm A/H5N1 (chủng NIBRG-14 ) do Việt Nam sản xuất trên ñàn gà nuôi tại tỉnh Nam ðịnh, Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, Gia Lâm, Hà Nội. 22. FAO (2007), Sổ tay chim hoang dã và bệnh cúm gia cầm. 23. Trần Xuân Hạnh (2004), Một vài vấn ñề phòng bệnh cúm gia cầm bằng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 79 vacxin, Khoa học Kỹ thuật Thú y, tập XI số 3 - 2004. Tr. 84 - 85. 24. Ninh Văn Hiểu (2005), Tình hình dịch cúm gia cầm và kết quả tiêm vacxin H5N2, H5N1 của Trung Quốc ñể phòng bệnh cho gà, vịt trên ñịa bàn tỉnh Nam ðịnh, Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, Gia Lâm, Hà Nội. 25. Phạm Sỹ Lăng (2004), Diễn biến bệnh cúm gia cầm ở Châu Á và các hoạt ñộng phòng chống bệnh, Khoa học Kỹ thuật Thú y, tập XI số 3 - 2004. Tr. 91 - 94. 26. Phạm Sĩ Lăng (2004), Hội thảo một số biện pháp khôi phục ñàn gia cầm sau dập dịch, Hà Nội. 27. Lê Văn Năm (2004), Bệnh cúm gà. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập XI số 1 - 2004. 28. Lê Văn Năm (2004), Kết quả khảo sát các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích ñại thể bệnh cúm gia cầm ở một số sơ sở chăn nuôi các tỉnh phía Bắc, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập XI số 3 - 2004. 29. Lê ðình Nghi, Trần Thị Dân, Nguyễn Tất Toàn (2010), Hiệu giá kháng thể sau tiêm phòng và tỉ lệ nhiễm bệnh cúm A (H5N1) trên ñàn vịt và ngan tại tỉnh ðồng Tháp, Tạp chí Khoa học Thú y, tập XVII số 6 - 2010. Tr. 5 - 10. 30. Nguyễn Hoài Tao, Nguyễn Tuấn Anh (2004), Một số thông tin về dịch cúm gia cầm, Chăn nuôi số 3 - 2004. 31. Nguyễn Như Thanh (1997), Miễn dịch học Thú y, Nhà xuất bản Nông nghiệp. 32. Tô Long Thành (2004), Thông tin cập nhật về tái xuất hiện bệnh cúm gia cầm tại các nước Châu Á, Khoa học Kỹ thuật Thú y, tập XI số 4 - 2004. Tr. 87 - 93. 33. Tô Long Thành (2006), Thông tin cập nhật về bệnh cúm gia cầm và vacxin phòng chống, Khoa học Kỹ thuật Thú y, tập XIII số 1 - 2006. Tr. 66 - 76. 34. Nguyễn Tùng, ðỗ Thị Hoa, Ngô Thị Thu Hương, Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn Bá Hiên (2011), Xác ñịnh một số ñặc tính virus cúm gia cầm ñộc lực cao H5N1 nhánh 7 phân lập ở Việt Nam, Tạp chí Khoa học Thú y, tập XVIII số 2 - 2011. Tr. 5 - 11. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 80 35. Nguyễn Tùng, Nguyễn Hoàng ðăng, Ngô Thị Thu Hương, ðỗ Thị Hoa, Kenjiro Inui, Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn Bá Hiên (2011), ðộc lực của virus cúm gia cầm ñộc lực cao H5N1 nhánh 7 trên gia cầm, Tạp chí Khoa học Thú y, tập XVIII số 3 - 2011. Tr. 5 - 10. 36. Trần Quang Vui, Nguyễn Thị Bích Nga, Nguyễn Bá Hiên, Lê Thanh Hòa, ðặc ñiểm gen NS của virus cúm A/H5N1 chủng A/Ck/Vietnam/HG4/2005 so sánh với một số chủng của Việt Nam Và thế giới, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập XVII số 3 - 2010. Tr. 5 - 13. 2. Tài liệu Tiếng Anh 37. Alexander, D.J. (2000), A review of avian infuenza in different bird species. Vet. Microbiol. 74: 3-13. 38. Alexander D.J (2003), Report on Avian Influenza in the Eastern Hemisphere during 1997-2002, Veterinary Laboratories Agency Weybridge, United Kingdom: 792-797. 39. Castrucci MR and Kawaoka Y (1993). Biologic importance of neuraminiase stalk length in influenza A virus. J Virol 67: 759-764. 40. Food and Agriculture Organization of the United Nations - FAO (2004), FAO, OIE & WHO Technical consultation on the Control of Avian Influenza, Animal health specical report. 41. Holsinger LJ, Nichani D, pinto LH and Lamb RA (1994). Influenza A virus M2 ion channel protein: a structure-fuction analysis. J virol 68: 1551-1563. 42. Horimoto T and Kawaoka Y (1994). Reverse genetics provides direct evidence for a correlation of hemagglutinin cleavability and virulence of an avian influenza A virus. J Virol 68: 3120-3128. 43. Ito T and Kawaoka Y (1998), Avian influenza. P. 126-136. In Nicholson KG, Webster RG, Hay AJ (eds.), Textbook of influenza, Blackwell Sciences Ltd., Oxford, United Kingdom. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 81 44. Webster RG, Peiris M, Chen H and Guan Y (2006). H5N1 Outbreaks and Enzootic Influenza. Emerg Infect Dis 12 (1). 3. Danh mục trang web 45. Các văn bản chỉ ñạo của Trung ương về phòng chống dịch cúm gia cầm trên trang web của Cục Thú y, 46. ESRI, ArcInfo. Nguồn Ngày truy cập 20/6/2011 47. Eropean Union (EU) Scientific Committee on Animal Health and Animal Welfare (SCAHAW) (2003). Food Safety: Diagnostic Techniques and Vaccines for Foot and Mouth Disease, Classical Swine Fever, Avian Influenza and some other important OIE List A Diseases. Report of the Scientific Committee on Animal Health and Animal Welfare. 48. Vidagis (2008), Phầm mềm GIS ESRI. Nguồn id=76&Itemid=98&lang=vi. Ngày truy cập 05/3/2011. 49. WHO (2011), Cumulative Number of Confirmed Human Cases of Avian Influenza A/H5N1, Reported to WHO. Nguồn 06_22/en/index.html. Ngày truy cập 23/6/2011. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… PHỤ LỤC 1. Môi trường bảo quản bệnh phẩm Bệnh phẩm là dịch ngoáy ổ nhớp, họng, khí quản ñược ñựng trong các ống chứa dung dịch bảo quản. Có thể sử dụng môi trường 199 hoặc môi trường glycerol có bổ sung kháng sinh, bảo quản ở 40C từ 1 - 2 ngày, nếu lâu nên giữ ở nhiệt ñộ -200C. - Môi trường 199 chứa 0,5% BSA (Albumin huyết thanh bò) Bổ sung kháng sinh Penicillin G 2.000.000U/lít Streptomycin 200 mg/lít Polymyxin B 2.000.000 U/lít Gentamicin 250 mg/lít Nystatin 500.000 U/lít Ofloxacin HCl 60 mg/lít Sulfmethoxasole 200 mg/lít - Môi trường Glycerol + Pha chế PBS NaCl 8 g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,15 g KH2PO4 0,2 g Nước cất vñ 1000 ml + Hấp vô trùng (1210C/15) phút, bổ sung kháng sinh (như trên) và trộn với glycerol theo tỷ lệ 1:1. Ngoài ra có thể sử dụng các môi trường bảo quản khác như: Muối ñệm Hank, môi trường M.E.M, PBS, Tryptose Phosphate broth, Veal Infusion Broth, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… Sucrose-phosphate buffer. Các dung dịch này có thể ñược bổ sung bovine serum albumin (BSA), gelatin 0,5 - 1%, các chất kháng sinh, kháng nấm. 2. Kỹ thuật chiết tách ARN (bộ kit Qiagen RNeasy) làm phản ứng RRT-PCR Các mẫu bệnh phẩm như mô, phủ tạng của gia cầm nghi mắc cúm ñược nghiền, pha 1/10 với dung dịch PBS pH 7,0 - 7,4 rồi ly tâm ở 1.000 vòng trong 10 phút lấy dịch nổi ñể chiết tách ARN. Mẫu dịch ngoáy hoặc dịch niệu mô thu hoạch sau khi tiêm trứng chỉ cần ly tâm như trên rồi lấy dịch nổi chiết tách. Kỹ thuật chiết tách bằng bộ kit Qiagen RNeasy thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất như sau: - Nhỏ 200 µl dịch nghiền mô (hoặc 500 µl dịch swab) vào ống ly tâm 1,5 ml cùng với 500µl Buffer RLT có bổ sung 1% β-ME, lắc ñều trên máy Votex rồi ly tâm nhẹ. - Thêm 500µl cồn Ethanol 70% vào ống, lắc mạnh bằng máy Votex rồi ly tâm nhẹ. - Chuyển tất cả dịch nổi sang cột lọc RNeasy Qiagen, ly tâm trong 15 giây với tốc ñộ ≥ 8.000 vòng ở nhiệt ñộ phòng. - Nhỏ 700 µl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột lọc RNeasy Qiagen, ly tâm trong 15 giây ở tốc ñộ ≥ 8.000 vòng, thay ống thu mới vào cột lọc. - Nhỏ 500 µl dung dịch rửa RPE buffer vào cột lọc và ly tâm trong 15 giây ở tốc ñộ ≥ 8.000 vòng, thay ống thu mới, lặp lại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer. - Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu trong 2 phút ở tốc ñộ tối ña, bỏ ống thu. - ðặt cột lọc vào ống thu ARN, nhỏ 50 µl RNase free H2O vào cột lọc, ủ ở nhiệt ñộ phòng trong ít nhất 1 phút. Tách ARN bằng cách ly tâm trong 1 phút ở tốc ñộ ≥ 8.000 vòng, bỏ cột lọc, giữ lại dịch trong ống thu ARN. - Bảo quản mẫu ARN thu ñược ở 4oC trong thời gian ngắn trước khi làm RRT-PCR, nếu sau 24 giờ, nên bảo quản mẫu ở - 20oC hoặc nhiệt ñộ thấp hơn. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 3. Công thức pha hỗn hợp phản ứng dùng trong kỹ thuật RRT-PCR: Công thức này có thể thay ñổi cho phù hợp với từng loại primer và từng loại kit rRT-PCR khác nhau. Công thức áp dụng cho kit RT-PCR 1 bước của hãng Qiagen: H2O 10,5 µl 5X reaction mix 5 µl MgCl2 1,2 µl Dntp 0.8µl Enzyme mix 1µl Primer forward 0,5 µl Primer reverse 0,5 µl Probe 0.5 µl Mẫu ARN 5 µl Tổng cộng 25 µl 4. Trình tự cặp mồi sử dụng cho phản ứng RRT-PCR Gen Trình tự mồi (primer) và mẫu dò (probe) M Mẫu dò: TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG Mồi xuôi: CAT GGA RTG GCT AA GAC AAG ACC Mồi ngược: AGG GCA TTT TGG ACA AAK CGT CTA H5 Mẫu dò: TCA ACA GTG GCG AGT TCC CTA GCA Mồi xuôi: ACG TAT GAC TAC CCG CAG TAT TCA Mồi ngược: AGA CCA GCT ACC ATG ATT GC N1 Mẫu dò: TGG TCT TGG CCA GAC GGT GC Mồi xuôi: TGG ACT AGT GGG AGC AGC AT Mồi ngược: TGT CAA GGT TAA GGG CAA CTC Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 5. Thời gian, nhiệt ñộ trong các chu kỳ nhiệt của bước phiên mã ngược, tổng hợp gen phản ứng RRT-PCR - Chu kỳ nhiệt của bước phiên mã ngược (RT) dùng cho Quiagen one step RT-PCR kit. Bước phiên mã ngược 1 chu kỳ 30 phút 500C 15 phút 950C - Chu kỳ nhiệt cho tổng hợp gen và các cặp mồi. Cặp mồi Bước Thời gian Nhiệt ñộ Biến tính 1 giây 940C AIV matrix 45 chu kỳ Bám của cặp mồi 20 giây 600C Biến tính 1 giây 940C H7 40 chu kỳ Bám của cặp mồi 20 giây 580C Biến tính 1 giây 940C Bám của cặp mồi 20 giây 570C H5 40 chu kỳ Kéo dài chuỗi tổng hợp 5 giây 720C Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… MỘT SỐ HÌNH MINH HỌA 1. Vacxin cúm H5N1 chủng Re-1 2. Tiêm phòng vacxin cúm gia cầm cho vịt 3. ðeo vòng chân cho vịt chỉ báo 4. Lấy mẫu huyết thanh vịt Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 5. Chiết tách ARN từ mẫu bệnh phẩm gia cầm 6. Màn hình hiển thị kết quả của phản ứng RRT-PCR 7. Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI 8. Ổ dịch cúm tháng 3/2011 tại xã Nghĩa An, huyện Nam Trực ._.