Đồ án Thu nhận sophorolipids tổng hợp từ chủng candida bombicola với nguồn đường glucose và dầu hạt cải

n Thị Yến Nhi Sinh viên trường: Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh Khoa: Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp: 13DSH02 MSSV: 1311100539 Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Hoàng Dũng và ThS. Lê Quỳnh Loan, thực hiện tại Viện Sinh học Nhiệt đới. Những số liệu và kết quả phân tính trong đề tài này hoàn toàn trung thực, không sao chép từ bất kỳ nguồn tài liệu tham khảo nào khác dưới bất kỳ hình thức nào. Một số nội dung trong đồ án tốt nghiệp có tham khảo và sử dụng dữ liệu trích dẫn được công bố công khai trên các website, tác phẩm theo danh mục tài liệu tham khảo của đồ án. Nếu có bất cứ sự sao chép và không trung thực trong bài báo này, người thực hiện đề tài xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường và trươc ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. Ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Yến Nhi i Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Trong thời gian vừa qua, được sự giới thiệu của trường Đại Học Công Nghệ TP. HCM, em đã có dịp thực tập và tìm hiểu về Viện Sinh Học Nhiệt Đới. Tại trung tâm, em được ôn lại, kiểm chứng những kiến thức đã được tích lũy trên ghế nhà trường vào trong thực tiễn và học được nhiều bài học kinh nghiệm thực tế hơn, được tiếp xúc, tìm hiểu các loài vi sinh vật và các trang thiết bị trong phòng vi sinh. Để hoàn thành đợt thực tập này, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm và giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô, các anh chị và các bạn. Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Tiến sĩ Nguyễn Hoàng Dũng và Thạc sĩ Lê Quỳnh Loan đã mở lòng nhận em vào thực tập tại trung tâm. Trong suốt thời gian thực tập, thầy và chị cũng đã hết lòng hướng dẫn em, để em có thể đạt được kết quả nghiên cứu tốt nhất, cũng như am hiểu toàn bộ về các phương pháp nghiên cứu. Bên cạnh đó em xin cám ơn Tiến sĩ Hoàng Quốc Khánh và thầy Ngô Đức Duy. Dù không trực tiếp hướng dẫn nghiên cứu, nhưng vẫn cho em những lời khuyên vô cùng quý báu, sâu sắc và những nụ cười rạng rỡ mỗi ngày. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến đến quý Thầy/Cô Khoa Công nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh đẫ tận tình truyền đạt những kiến thức hết sức bổ ích cho em khi còn ngồi trên giảng đường trường đại học. Lời cuối cùng, em xin gửi lời chúc tới toàn thể quý thầy quý cô đang giảng dạy, nghiên cứu tại Viện Sinh học Nhiệt Đới cũng như tại Đại học thành phố Hồ Chí Minh, thật dồi dào sức khỏe, để tiếp tục thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau. Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Yến Nhi ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i LỜI CÁM ƠN ............................................................................................................ ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ v DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................ vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH .............................................................................. vii MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN ........................................................................................ 4 1.1. CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT (Surfactant) ............................................... 4 1.1.1. Định nghĩa ............................................................................................... 4 1.1.2. Cấu trúc phân tử ...................................................................................... 4 1.1.3. Đặc điểm ................................................................................................. 5 1.1.4. Phân loại ................................................................................................. 6 1.1.5. Ứng dụng ................................................................................................ 7 1.2. SOPHOROLIPIDS ........................................................................................ 8 1.2.1. Định nghĩa chât hoạt động bề mặt sinh học (Biosurfactants) ................. 8 1.2.2. Sophorolipid .......................................................................................... 10 1.2.3. Cấu trúc ................................................................................................. 11 1.2.4. Đặc tính ................................................................................................. 13 1.2.5. Hạn chế ................................................................................................. 15 1.3. Candida bombicola ATCC 22214 ............................................................... 15 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ....................................................................... 18 1.4.1. Ngoài nước ............................................................................................ 18 1.4.2. Trong nước ............................................................................................ 19 CHƯƠNG 2:PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................... 20 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................... 20 2.2. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 20 2.2.1. Chủng vi sinh ........................................................................................ 20 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................ 20 2.2.3. Hóa chất ................................................................................................ 21 2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 22 iii Đồ án tốt nghiệp 2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu .................................................................................. 22 2.3.2. Tăng sinh và bảo quản chủng Candida bombicola ATCC 22214 ........ 23 2.3.3. Xây dựng đường cong tăng trưởng của nấm men C. bombicola ATCC 22214 23 2.3.4. Lên men ................................................................................................ 23 2.3.5. Thu nhận sophorolipids thô .................................................................. 24 2.3.6. Chạy sắc ký bảng mỏng (TLC) ............................................................. 25 2.3.7. Xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch 26 2.3.8. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu bằng phương pháp đo độ đục (MIC) 27 2.3.9. Xác định hoạt tính bắt gốc tự do bằng phương pháp DPPH ................. 28 CHƯƠNG 3:KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 31 3.1. Đường cong tăng trưởng của nấm men C. bombicola ................................. 31 3.2. Lên men sophorolipids từ C. bombicola ..................................................... 32 3.3. Thu nhận sophorolipids từ C. bombicola .................................................... 32 3.4. Sắc ký bảng mỏng (TLC) ............................................................................ 34 3.5. Xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch . 35 3.6. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu bằng phương pháp đo độ đục ............... 37 3.7. Xác định hoạt tính bắt gốc tự do bằng phương pháp DPPH ....................... 38 CHƯƠNG 4:KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 40 4.1. Kết luận ........................................................................................................ 40 4.2. Kiến nghị ..................................................................................................... 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 42 PHỤ LỤC A: SỐ LIỆU KHẢO SÁT CÁC HOẠT TÍNH CỦA SOPHOROLIPID .. 1 1. Số liệu khảo sát đường cong tăng trưởng của nấm men C. bombicola ATCC 22214 ....................................................................................................................... 1 2. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (mm) ............................................................................................... 2 3. Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa của SLs (OD517) ............................ 2 4. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs bằng phương pháp MIC (OD600) ..................................................................................................................... 3 iv Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: HÌNH ẢNH KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM ............................................... 4 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CHDBM Chất hoạt động bề mặt CHDBMSH Chất hoạt động bề mặt sinh học DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl IC50 Inhibitory concentration 50% LB Luria Bertani LM Môi trường lên men chính MIC Minimum inhibitory concentration OD Optical density SLs Sophorolipids TLC Thin-layer chromatography YM Môi trường tăng sinh/giữ giống v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số vi khuẩn tổng hợp nên các loại CHDBMSH quan trọng (Desai vs cs, 1997) ...................................................................................................................... 9 Bảng 1.2. Hoạt tính nhũ hóa của SLs đối với một số loại dầu (Daverey và Pakshirajan, 2009) ..................................................................................................... 14 Bảng 1.3. Phân loài nấm Candida bombicola (Kurtzman và Fell, 2001) ................ 15 Bảng 1.4. Khả năng sinh hóa nguồn carbon của C.bombicola (Spencer vs cs, 1970). ................................................................................................................................... 17 Bảng 3.1. Đường kính vòng kháng khuẩn của hợp chất SLs ................................... 36 Bảng 3.2. Nồng độ ức chế tối thiểu của SLs lên một số chủng vi khuẩn ................. 38 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Natri stearate (C17H35COONa) – thành phần chính trong xà phòng .......... 4 Hình 1.2. Màng liên pha giữ dầu và nước .................................................................. 5 Hình 1.3. Các dạng phân bố của phân tử hoạt động bề mặt ....................................... 5 Hình 1.4. Sự khác nhau về hoạt độ nước và cấu trúc phân tử .................................... 6 Hình 1.5. Sophorolipids tổng hợp bởi Starmerella bombicola (Parekh và cộng sự, 2012).......................................................................................................................... 10 Hình 1.6. Hai dạng SLs: lactonic (trái) – acidic (phải) ............................................ 11 Hình 1.7. Quy trình sinh tổng hợp nên SLs trong tế bào (Van Bogaert và cộng sự, 2007).......................................................................................................................... 12 Hình 1.8. Tế bào C.bombicola.................................................................................. 16 Hình 1.9. Khuẩn lạc nấm C.bombicola 2 ngày tuổi trên môi trường YM. .............. 16 Hình 2.1. Quy trình thu nhận SLs thô từ quá trình lên men chủng C. bombicola ... 25 Hình 2.2. Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của SLs trên đĩa 96 giếng. ......................................................................................................................... 28 Hình 2.3. Cơ chế chuyển màu của DPPH khi nhận một phân tử hydro từ chất chống oxy hóa. .......................................................................................................... 29 Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng kháng oxy hóa của SLs trên đĩa 96 giếng. ......................................................................................................................... 30 Hình 3.1. Biểu đồ đường cong tăng trưởng của nấm men C. bombicola ATCC 22214. ........................................................................................................................ 31 Hình 3.2. Môi trường lên men chính trước (trái) và sau (phải) sau 7 ngày.............. 32 Hình 3.3. Dịch lên men sau 7 ngày vẫn còn một lượng dầu. ................................... 32 Hình 3.4. Màng liên pha giữa Hexane và dịch lên men xuất hiện bọt. .................... 33 Hình 3.5. Sophorolipids thô thu nhận được.............................................................. 34 Hình 3.6. Kết quả chạy sắc ký TLC ......................................................................... 35 Hình 3.7. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch. .................................................................................... 37 Hình 3.8. Biểu đồ thể hiện khả năng kháng oxy hóa của hỗn hợp SLs thô. ............ 39 vii Đồ án tốt nghiệp Hình 1. Dịch lên men trước (trái) và sau (phải) khi chiết với hexane ........................ 4 Hình 2. Quá trình chiết dịch lên men với ethyl acetate .............................................. 4 Hình 3. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Bacillus subtilis của SLs ................... 5 Hình 4. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Escherichia coli của SLs ................... 5 Hình 5. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Pseudonomas aeruginosa của SLs..... 6 Hình 6. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Salmonella typhimurium của SLs. .... 6 Hình 7. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Staphylococus aureus của SLs. ......... 7 Hình 8. Thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu .............................................. 7 Hình 9. Thí nghiệm khảo sát khả năng chống oxy hóa .............................................. 8 viii Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Mỗi năm trên toàn thế giới người ta sản xuất ra khoảng 10 triệu tấn chất hoạt động bề mặt (CHDBM), mức tiêu thụ được chia đều cho ứng dụng trong các hợp chất tẩy rửa và ứng dụng trong công nghiệp (Van Bogaert và cộng sự, 2007). CHDBM được biết đến bởi phạm trù ứng dụng rộng rãi như: chất tẩy rửa, thực/dược/mỹ phẩm, chế phẩm nông nghiệp. Nhưng vì chủ yếu CHDBM được tổng hợp theo con đường hóa học và nguồn gốc là từ dầu mỏ, khó phân hủy và có khả năng gây độc cho môi trường. Vì thế trọng tâm nghiên cứu CHDBM trong thời gian gần đây là tìm ra CHDBM có nguồn gốc từ sinh học, chủ yếu là do vi sinh vật tổng hợp. Ưu điểm của chất hoạt động bề mặt sinh học (CHDBMSH) là độc tính thấp, khả năng phân hủy sinh học cao và khả năng ứng dụng rộng hơn. CHDBMSH chủ yếu là glycolipid, phospholipids, hợp chất polyme và lipopeptides. Sophorolipid (SLs) là một trong những CHDBMSH, được cấu thành từ đường sophorose liên kết với một chuỗi acid béo, chiều dài chuỗi phụ thuộc vào nguồn carbon được sử dụng. SLs là một trong những CHDBMSH có thể tổng hợp từ các nguồn nguyên liệu tái sử dụng. Không chỉ dừng lại ở đó, SLs còn có khả năng ức chế một số loại nấm men (Van Bogaert và cộng sự, 2007), nấm bệnh thực vật (Yoo và cộng sự, 2005) và vi khuẩn (Mager và cộng sự, 1987; Lang và cộng sự, 1989). Ngoài ra SLs còn có khả năng chống bám, ức chế sự hình thành của màng sinh học (Zezzi do và cộng sự, 2012). Năm 2016, tại Việt Nam công trình nghiên cứu về SLs đầu tiên được hoàn thành - Thu nhận và khảo sát một số hoạt tính của SLs từ quá trình lên men chủng Candida bombicola từ dầu dừa (L.Q. Loan và cộng sự, 2016). Tuy vậy, nhưng kết quả khảo sát hoạt tính SLs của nghiên cứu này thu được chỉ từ một nguồn dầu dừa. Do đó nghiên cứu này sẽ tiếp tục mở rộng sang nguồn nguyên liệu lên men khác, sử dụng nguồn dầu hạt cải – chứa 61% acid oleic và đường glucose – đơn tử cấu thành sophorose, kế đó khảo sát một số hoạt tính sinh học của sophorolipid thu được. 1 Đồ án tốt nghiệp 2. Tình hình nghiên cứu Van Bogaert và cộng sự đã công khai bài báo cáo khoa học nghiên cứu toàn diện về mọi khía cạnh trong quy trình sản xuất thu nhận SLs (tăng sinh nấm men, con đường tổng hợp sinh học, ảnh hưởng của thành phần môi trường, điều kiện lên men). Chủ yếu nhóm nghiên cứu tập trung vào mục tiêu tối ưu hóa điều kiện lên men cho vi sinh vật để tổng hợp nên SLs trong quá trình lên men chìm. Đáng chú ý nhất là năm 2005, Vishal Shah và cộng sự đã đưa ra những kết quả đầu tiên chứng tỏ khả năng ức chế virus HIV của SLs. Tại nồng độ 3mg/ml tất cả các dẫn xuất SLs đều có hoạt tính kháng virus HIV, khử hoạt tính của virus trong vòng chưa đầy 2 phút. Riêng dẫn xuất diacetate ethyl ester SLs là dẫn xuất hoạt động mạnh nhất. Ngoài ra năm 2012, Shao và cộng sự đã nghiên cứu khả năng kháng ung thư thực quản của SLs trên người. Kết quả chứng minh rằng có sự ức chế của SLs lactonic lên tế bào thực quản (ở nồng độ 30 µg/ml). Sự khác biệt về độ bão hòa acid béo trong phân tử SLs có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng gây độc cho tế bào ung thư. Năm 2016, tại Việt Nam công trình nghiên cứu về SLs đầu tiên được hoàn thành “Thu nhận và khảo sát một số hoạt tính của SLs từ quá trình lên men chủng Candida bombicola từ dầu dừa” (L.Q. Loan và cộng sự, 2016). Hứa hẹn cho công cuộc sản xuất một hợp chất CHDBMSH mới, có ứng dụng rộng rãi hơn trong đời sống và công nghiệp. 3. Mục đích nghiên cứu Khảo sát hoạt tính của Sophorolipids thu nhận qua quá trình lên men chủng Candida bombicola ATCC 22214 từ nguồn dầu hạt cải và đường glucose. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Lên men chủng nấm Candida bombicola ATCC 22214 - Thu nhận SLs từ dịch lên men - Định tính SLs. - Khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu nhận được - Khảo sát khả năng chống oxy của SLs thu nhận được. 5. Phương pháp nghiên cứu 2 Đồ án tốt nghiệp Thu nhận SLs thông qua nuôi cấy chủng C. bombicola ATCC 22214 ở điều kiện 25oC, tốc độ lắc 180 vòng/phút. Định tính SLs bằng kỹ thuật sắc ký bảng mỏng (Thin Layer Chromatography – TLC) Xác định khả năng kháng khuẩn của SLs bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Xác định khả năng chống oxy hóa của SLs thông qua khả năng bắt gốc tự do 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). 6. Kết quả đạt được Sản lượng SLs thô thu được từ dịch nuôi cấy nấm C. bombicola ATCC 22214 từ nguồn dầu hạt cải và đường glucose là 20.76 g/l. Trong hỗn hợp SLs thô thu được có sự hiện diện của 1,4” – Sophorolactone 6’,6” – diacetate. Ngoài ra trong hỗn hợp thu được còn có các SLs cấu trúc khác và một số chất khác. Khả năng ức chế chủng Staphylococus aureus là đáng chú ý, cao gấp 3 lần các chủng vi khuẩn khảo sát còn lại. Khả năng kháng của SLs đối với các chủng Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudonomas aeruginosa, Salmonella typhimurium không có sự khác biệt đáng kể. Nồng độ ức chế tối thiểu của SLs đối với 3 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococus aureus là cao nhất (12.5 mg/ml). Nồng độ ức chế tối thiểu của SLs đối với chủng Salmonella typhimurium là khá thấp so với các chủng khác (0.7812 mg/ml). Khả năng kháng oxy hóa đạt 77.64% ở nồng độ 20 mg/ml. Nồng độ bắt gốc tự do của sophorolipids thu nhận là 4.51 mg/ml. 7. Kết cấu của đồ án - Chương 1: Tổng quan - Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - Chương 3: Kết quả và thảo luận - Chương 4: Kết luận và kiến nghị 3 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT (Surfactant) 1.1.1. Định nghĩa Chất có hoạt tính bề mặt là những hợp chất làm giảm sức căng bề mặt liên pha giữa hai chất lỏng hoặc giữa chất rắn và chất lỏng. Từ “Surfactant” được viết tắt từ cụm từ surface active agent, tức là tác nhân hoạt động bề mặt. Chúng được ứng dụng làm chất tẩy rửa, chất thấm ướt, chất nhũ hóa, chất tạo bọt, chất phân tán. Chất hoạt động bề mặt (CHDBM) là một thành phần không thể thiếu trong cuộc sống chúng ta, và ứng dụng của chúng hứa hẹn còn vươn xa hơn so với nhu cầu của nhân loại. Do đó, sản lượng CHDBM thu được mỗi năm vượt qua con số 18 triệu tấn trên toàn thế giới, trong đó có 3 triệu tấn được sản xuất ở Tây Âu. Một nửa sản lượng này là thành phần trong chất tẩy rửa, phần còn lại ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm, hóa chất, sản xuất giấy, nông nghiệp, CHDBM được sản xuất từ 2 nguồn nguyên liệu chính: dầu mỏ hoặc chất thải có nguồn gốc sinh học. Việc tái sử dụng nguồn chất thải sinh học để sản xuất ra một nguyên liệu mới đã cải thiện đáng kể hiện tượng nhà kính, tuy vậy hoạt động sản CHDBM từ nguồn chất thải sinh học chỉ mới chiếm 25% trong tổng hoạt động sản xuất CHDBM. 1.1.2. Cấu trúc phân tử Chất hoạt động bề mặt thường là các hợp chất hữu cơ có đồng thời một phần ưa nước (tan trong nước) và một phần kỵ nước (tan trong dầu). Khi hòa vào một hệ nhũ tương, surfactant sẽ tập trung ở các màng liên pha không khí – nước, dầu – nước, gắn kết hai pha lại với nhau, làm cho hệ trở nên ổn định hơn. Lượng chất hoạt động bề mặt sản xuất ra trên toàn thế giới ước tính khoảng 15 triệu tấn/năm, chiếm gần một nữa lượng xà phòng. Hình 1.1. Natri stearate (C17H35COONa) – thành phần chính trong xà phòng 4 Đồ án tốt nghiệp 1.1.3. Đặc điểm Chất hoạt động bề mặt được dùng giảm sức căng bề mặt của một chất lỏng bằng cách làm giảm sức căng bề mặt tại màng liên pha (interface) của hai chất lỏng. Nếu có nhiều hơn hai chất lỏng không hòa tan thì chất hoạt hóa bề mặt làm tăng diện tích tiếp xúc giữa hai chất lỏng đó. Hình 1.2. Màng liên pha giữ dầu và nước Khi hòa chất hoạt hóa bề mặt vào trong một chất lỏng thì các phân tử của chất hoạt hóa bề mặt có xu hướng tạo đám (micelle), nồng độ mà tại đó các phân tử bắt đầu tạo đám được gọi là nồng độ tạo đám tới hạn. Nếu chất lỏng là nước thì các phân tử sẽ chụm đuôi kị nước lại với nhau và quay đầu ưa nước ra tạo nên những hình dạng khác nhau như hình cầu (0 chiều), hình que (1 chiều), màng (2 chiều). Hình 1.3. Các dạng phân bố của phân tử hoạt động bề mặt Tính ưa, kị nước của một chất hoạt hóa bề mặt được đặc trưng bởi một thông số là độ cân bằng ưa kị nước (tiếng Anh: Hydrophilic Lipophilic Balance-HLB), giá trị này có thể từ 0 đến 40. HLB càng cao thì hóa chất càng dễ hòa tan trong nước, HLB càng thấp thì hóa chất càng dễ hòa tan trong các dung môi không phân cực như dầu. 5 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.4. Sự khác nhau về hoạt độ nước và cấu trúc phân tử 1.1.4. Phân loại Tùy theo tính chất mà chất hoạt hóa bề mặt được phân theo các loại khác nhau. Nếu xem theo tính chất điện của đầu phân cực của phân tử chất hoạt hóa bề mặt thì có thể phân chúng thành các loại sau: 1.1.4.1. Chất hoạt hóa ion Chất hoạt hóa dương: khi bị phân cực thì đầu phân cực mang điện dương, ví dụ: Cetyl trimêtylamôni brômua (CTAB). - Cetyl trimetylammonium bromua (CTAB) - Cetyl pyridinium clorua (CPC) - Polyethoxylated tallow amin (POEA) - Benzalkonium clorua (BAC) - Benzethonium clorua (BZT) Chất hoạt hóa âm: khi bị phân cực thì đầu phân cực mang điện âm - Natri dodecyl sulfat (SDS), amoni lauryl sulfat, và các muối ankyl sulfat khác - Natri laureth sulfat, hay natri lauryl ete sulfat (SLSES) - Ankyl benzen sulfonat - Xà phòng và các muối của axit béo 1.1.4.2. Chất hoạt hóa phi ion - Ankyl poly (etylen oxit) 6 Đồ án tốt nghiệp - Copolymers của poly (etylen oxit) và poly (propylen oxit) - Ankyl polyglucozit, bao gồm: - Octyl glucozit - Decyl maltosit - Các rượu béo - Rượu cetyl - Rượu oleyl - Cocamit MEA, cocamit DEA 1.1.4.3. Chất hoạt hóa lưỡng cực Khi bị phân cực thì đầu phân cực có thể mang điện âm hoặc mang điện dương tùy vào pH của dung môi, ví dụ: Dodecyl đimêtylamin ôxít. - Dodecyl betain - Dodecyl dimetylamin ôxít - Cocamidopropyl betain - Coco ampho glycinat 1.1.5. Ứng dụng Chất hoạt hóa bề mặt ứng dụng rất nhiều trong đời sống hàng ngày. Ứng dụng phổ biến nhất là bột giặt, sơn, nhuộm... Ngoài ra những ứng dụng trong các lĩnh vực khác như: - Trong công nghiệp dệt nhuộm: Chất làm mềm cho vải sợi, chất trợ nhuộm - Trong công nghiệp thực phẩm: Chất nhũ hóa cho bánh kẹo, bơ sữa và đồ hộp - Trong công nghiệp mỹ phẩm: Chất tẩy rửa, nhũ hóa, chất tạo bọt - Trong ngành in: Chất trợ ngấm và phân tán mực in - Trong nông nghiệp: Chất để gia công thuốc bảo vệ thực vật, - Trong xây dựng: Dùng để nhũ hóa nhựa đường, tăng cường độ đóng rắn của bê tông - Trong dầu khí: Chất nhũ hóa dung dịch khoan - Trong công nghiệp khoáng sản: Làm thuốc tuyển nổi, chất nhũ hóa, chất tạo bọt để làm giàu khoáng sản 7 Đồ án tốt nghiệp 1.2. SOPHOROLIPIDS 1.2.1. Định nghĩa chât hoạt động bề mặt sinh học (Biosurfactants) Biosurfactants là các hợp chất hoạt động bề mặt có nguồn gốc sinh học (CHDBMSH), được sản xuất bới vi sinh vật. Trong những năm gần đây các nhà khoa học đang chú trọng đến lĩnh vực này, bởi chúng có độc tính thấp và phương thức sản xuất đơn giản. Bởi thế ứng dụng của CHDBMSH rất rộng: hóa chất hữu cơ, phân bón, thức ăn, đồ uống, mỹ phẩm, dược phẩm và bao gồm cả các ứng dụng của chất hoạt động bề mặt hóa học. Tuy rằng CHDBMSH có mặt khá rộng rãi trong tự nhiên, nhưng chi phí cho các quy trình tách chiết ở quy mô công nghiệp, quy trình tinh sạch đã tạo ra một rào cản khá lớn đối với các nhà sản xuất. Chi phí thu hồi, tinh sạch CHDBMSH luôn lớn hơn rất nhiều lần so với chi phí tổng hợp nên chúng. Trong nhóm các CHDBMSH ngoài Sophorolipid ra thì còn có: Rhamnolipids được tổng hợp từ một số chủng trong chi Pseudomonas, và Lecithin được thu hồi từ đậu nành và lòng đỏ chứng. CHDBMSH phổ biến là các chất hoạt động bề mặt có nguồn gốc từ vi sinh vật. Vì thời gian thế hệ và tốc độ phát triển của vi sinh vật cao hơn gấp nhiều lần so với các loài động/thực vật, nên dễ dàng đưa vào sản xuất quy mô công nghiệp. 8 Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1. Một số vi khuẩn tổng hợp nên các loại CHDBMSH quan trọng (Desai vs cs, 1997) Chất hoạt động bề mặt sinh học Vi khuẩn tổng hợp Glycolipids Rhamnolipids Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas sp. Trehalolipids Rhodococus Erythropolis, Nocardia erythropolis Mycobacterium sp. Sophorolipids Candida. bombicola, Camdida. apicola, and Rhodotorula bogoriensis Mannosylerythritol lipids Pseudozyma antarctica Cellobiolipids Ustilago zeae, U. maydis Lipopeptides và lipoproteins Peptide-lipid Bacillus licheniformis Serrawettin Serratia marcescens Viscosin Ps. fluorescens Surfactin Bacillus. subtilis Gramicidins Bacillus. brevis Polymyxins Bacillus. polymyxa Acid béo, lipid trung tính và phospholipids Fatty acids C. lepus Neutral lipids R. erythropolis Phospholipids Thiobacillus thiooxidans Polymer Emulsan Acinetobacter calcoaceticus Biodispersan Acinetobacter. calcoaceticus Mannan-lipid-protein Candida. tropicalis Carbohydrate-proteinlipid Pseudomonas.fluorescens, Debaryomyces polymorphis Protein PA Pseudomonas. aeruginosa 9 Đồ án tốt nghiệp 1.2.2. Sophorolipid Sophorolipid (SLs) là một hợp chất glycolipid hoạt động bề mặt, được tổng hợp bởi một số loài nấm men vô hại. Nghiên cứu đầu tiên về sophorolipid được công bố vào năm 1961 – một glycolipid ngoại bào được tổng hợp bởi nấm men Torulopsis magnolia. Sau đó vào năm 1968, Tulloch và Spencer đã công bố rằng chủng sinh SLs thực tế là Torulopsis apicola, hiện nay gọi là Candida Hình 1.5. Sophorolipids tổng hợp bởi Starmerella bombicola (Parekh và cộng sự, apicola. Tới năm 1970, Spencer 2012) tiếp tục phát hiện ra rằng chủng nấm men Candida bombicola cũng có thể sản xuất ra SLs. Trong đó chủng Candida bombicola ATCC 22214 được chú ý và nghiên cứu nhiều nhất do cho năng suất cao (400g/l) và đặc biệt chủng này không gây bệnh. Năm 2006, Chen và đồng nghiệp đã tìm ra được một chủng Wickerhamiella domericqiae mới có khả năng tổng hợp SLs. Chủng này tổng hợp ra hơn 6 glycolipids khác nhau. Một trong số đó có 17-L-(-oxy)-octadecanoic acid 1,4”-lactone 6’,6”- diacetate, đây là thành phần chính có trong SLs tổng hợp từ 2 loài C. apicola và C. bombicola. Nhưng mãi đến đầu thế kỷ 20 người ta mới chú trọng đến việc nghiên cứu kỹ lưỡng và tìm kiếm ứng dụng của sophorolipid, vì lúc này nhân loại mới nhận thức ra tầm quan trọng của việc bảo vệ môi trường. Ngày nay sophorolipid được xem là chất hoạt động bề mặt sinh học (bio-surfactants) có triển vọng cao. 10 Đồ án tốt nghiệp 1.2.3. Cấu trúc Sophorolipid thuộc nhóm glycolipid biosurfactans, kết hợp từ 1 đuôi acid kị nước (16 hoặc 18 phân tử carbon) và đầu carbohydrate ưa nước (sophorose – đường đôi glucose) thông qua liên kết β-glucosidic ở vị trí C1’. Phân tử carbon cuối cùng trong chuỗi đuôi của SLs vừa có thể este hóa với nhóm hydroxyl ở vị trí C 4” của sophorose tạo SLs dạng lactonic (dạng vòng); vừa có thể ở dạng tự do tạo SLs dạng acidic (dạng mở). Hình 1.6. Hai dạng SLs: lactonic (trái) – acidic (phải) Đuôi acid thường có 16 hoặc 18 phân tử carbon và có nhiều hơn một liên kết đôi. Tính chất hóa lý và đặc tính sinh học của SLs thu được phụ thuộc vào tỷ lệ thành phần giữa 2 dạng lactonic và acidic trong canh trường, vì cả 2 dạng này đều được vi sinh vật tổng hợp song song trong quá trình lên men sản xuất. Cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp SLs là glucose và acid béo. Ngoài ra các