Đồ án Thử nghiệm tận dụng bã vỏ chuối sản xuất bioethanol để tiếp tục thu nhận sản phẩm bằng phương pháp thủy phân và lên men đồng thời (ssf) với saccharomyces cerevisiae và pichia anomala

17 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CAM ĐOAN Là sinh viên năm cuối của trƣờng Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, nay đƣợc vinh dự làm đồ án tốt nghiệp để hoàn thành chƣơng trình học của mình. Tôi xin cam đoan đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn của Ths. Trần Thị Tƣởng An tiến hành tại Phòng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học và Biomass, ĐH Bách Khoa, ĐH Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh. Những số liệu, hình ảnh trong bài hoàn toàn trung thực chƣa từng đƣợc ai công bố. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2017 Sinh viên thực hiện Trần Thị Ánh Nguyệt ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên cho con gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cha mẹ, là ngƣời đã sinh thành, nuôi dƣỡng, giáo dục và động viên, là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho con, là ngƣời giúp con đứng vững sau những lần vấp ngã. Em xin chân thành cảm ơn toàn thể quý Thầy Cô Trƣờng Đại học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình truyền đạt cho em những kiến thức quý giá ngay từ những ngày đầu tiên bƣớc chân vào giảng đƣờng đại học. Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Trần Thị Tƣởng An đã trực tiếp hƣớng dẫn dìu dắt em trong suốt quá trình làm đồ án tốt nghiệp vừa qua. Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Hoài Hƣơng, ngƣời đã giới thiệu em với cô Trần Thị Tƣởng An để tiến hành làm đề tài. Em cũng xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Đình Quân đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học và Biomass, ĐH Bách Khoa, ĐH Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh. Cảm ơn các bạn Châu Nguyễn Quỳnh Nhƣ, Nguyễn Đăng Nguyên, Võ Mạnh Hùng, Văn Bảo Huy, Nguyễn Minh Thiện, Võ Thị Thảo Trang, Phạm Nhƣ Ngọc và anh Nguyễn Anh Duy đã cùng đồng hành, sát cánh và giúp đỡ mình trong suốt những ngày làm đồ án tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn! Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2017 SVTH: Trần Thị Ánh Nguyệt ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC ................................................................................................................... i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ iii DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... iv DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. v LỜI MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 4 1.1. Giới thiệu sơ lƣợc về Bioethanol ................................................................... 4 1.1.1. Khái niệm về Bioethanol .......................................................................... 4 1.1.2. Sản xuất Bioethanol. ................................................................................ 4 1.2. Nguyên liệu Lignocellulose ........................................................................... 5 1.2.1. Cellulose .................................................................................................. 6 1.2.2. Hemicellulose ........................................................................................... 7 1.3. Qúa trình sản xuất Bioethanol từ lignocellulose ............................................ 9 1.3.1. Quá trình tiền xử lý .................................................................................. 10 1.3.2. Qúa trình thủy phân ................................................................................. 12 1.3.3. Qúa trình lên men .................................................................................... 15 1.4. Giới thiệu sơ lƣợc nguyên liệu vỏ chuối ........................................................ 22 1.4.1. Chuối ....................................................................................................... 22 1.4.2. Thànhphần hóa học của chuối ................................................................ 22 1.4.3. Diện tích và sản lượng trồng chuối ở nước ta ........................................ 23 1.5. Tình hình nguyên cứu bioethanol tại Việt Nam và trên thế giới ................... 25 1.5.1. Tại Việt Nam ............................................................................................ 25 1.5.2. Trên thế giới ............................................................................................. 25 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 26 2.1. Địa điểm, thời gian và đối tƣợng nghiên cứu ................................................ 26 2.2. Nguyên vật liệu............................................................................................... 26 i ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.2.1. Nguyên liệu vỏ chuối ............................................................................... 26 2.2.2. Enzyme ..................................................................................................... 26 2.2.3. Nấm men .................................................................................................. 26 2.2.4. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................... 26 2.2.5. Môi trường nuôi cấy và hóa chất sử dụng .............................................. 28 2.3. Bố trí thí nghiệm ............................................................................................. 30 2.3.1. Sơ đồ quy trình ......................................................................................... 30 2.3.2. Bố trí thí nghiệm ...................................................................................... 31 2.4. Phƣơng pháp phân tích ................................................................................... 33 2.4.1. Phương pháp hóa lý ................................................................................. 33 2.4.2. Phƣơng pháp vi sinh. ............................................................................... 40 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................ 43 3.1. Kết quả khảo sát đặc điểm của chủng nấm men sử dụng trong đề tài .......... 43 3.1.1. Saccharomyces cerevisiae ....................................................................... 43 3.1.2. Pichia anomala ........................................................................................ 44 3.2. Phân tích thành phần vỏ chuối và bã nguyên liệu sau khi lên men lần 1 ...... 46 3.3. Quá trình thủy phân và lên men đồng thời .................................................... 47 3.3.1. Khảo sátquá trình SSF lần 2 theo thời gian ............................................ 47 3.3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme bổ sung ...................................................... 52 3.3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men bổ sung .................................................... 55 3.3.4. Ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đến quá trình lên men ............. 58 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 61 4.1. Kết luận ....................................................................................................... 61 4.2. Đề nghị ....................................................................................................... 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 63 PHỤ LỤC ....................................................................................................... 1 ii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT: Số thứ tự SHF: Separate Hydrolysis and Fermentation SSF: Simultaneous Saccharification Fermentation SSCF: Simultaneous Saccharification and Cofermentation Máy UV-VIS: Ultraviolet–visible spectroscopy HL: Hàm lƣợng SDA: Sabouraud Dextrose Agar SDB: Sabouraud Dextrose Broth iii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Sự tác động của các phƣơng pháp tiền xử lý khác nhau lên cấu trúc lignocellulose. ............................................................................................................. 11 Bảng 1.2. Đặc điểm của các loại nấm men và vi khuẩn đƣợc xem xét để sản xuất ethanol từ nguyên liệu lignocellulose ........................................................................ 19 Bảng 1.3. Diện tích gieo trồng chuối phân theo các vùng (Đơn vị: ha) .................... 23 Bảng 1.4. Sản lƣợng trồng chuối phân theo các vùng (Đơn vị: tấn) ......................... 24 Bảng 1.5. Thành phần dinh dƣỡng của các loại chuối trong 100g chuối chín .......... 24 Bảng 2.1.Hóa chất sử dụng ........................................................................................ 28 Bảng 3.1. Thành phần vỏ chuối khô trƣớc lên men và bã chuối sau lên men lần 1 . 46 Bảng 3.2.Tổng hợp kết quả nghiên cứu thu đƣợc theo thời gian .............................. 48 Bảng 3.3. Tổng hợp kết quả nghiên cứu các tỷ lệ enzyme bổ sung khác nhau ở 48h ..................................................................................................................................... 52 Bảng 3.4. Tổng hợp kết quả nghiên cứu các tỷ lệ nấm men bổ sung khác nhau ở 48h .............................................................................................................................. 55 Bảng 3.5. Tổng hợp kết quả nghiên cứu các nồng độ pH khác nhau ........................ 58 iv ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Thành phần lignocellulose ........................................................................... 5 Hình 1.2. Tỉ lệ các thành phần có trong lignocellulose ............................................... 5 Hình 1.3. Cấu trúc của lignocellulose .......................................................................... 6 Hình 1.4. Công thức hóa học của cellulose ................................................................. 7 Hình 1.5. Các đơn vị cơ bản của lignin ........................................................................ 8 Hình 1.6. Quy trình chuyển hóa sinh khối lignocellulose thành bioethanol ............... 9 Hình 1.7. Sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất và chuyển hóa phức hợp thành sản phẩm ..................................................................................................................... 13 Hình 1.8. Sơ đồ các bƣớc thủy phân cellulose bởi cellulase ..................................... 15 Hình 1.9. Qúa trình đƣờng phân ................................................................................ 16 Hình 1.10. Quá trình pyruvate chuyển hóa thành ethanol ......................................... 17 Hình 1.11. S. cerevisiae và P. anomala ..................................................................... 20 Hình 1.12. Quả chuối sứ ............................................................................................. 22 Hình 2.1.Sơ đồ bố trí thí nghiệm ................................................................................ 30 Hình 2.2. Mẫu sau khi đun bằng phƣơng pháp Miller ............................................... 37 Hình 2.3. Mẫu sau khi đun bằng phƣơng pháp Kiursher – Hoff ............................... 38 Hình 2.4. Mẫu sau khi chuẩn độ acid ......................................................................... 39 Hình 2.5. Nguyên liệu sau khi đƣợc trung hòa bằng NaOH 10N ............................. 40 Hình 2.6. S. cerevisiae và P.anomala đã đƣợc nhân giống trên môi trƣờng SDB ... 41 Hình 2.7. Cấy trang .................................................................................................... 42 Hình 3.1. Đặc điểm đại thể (a), vi thể (b) của S.cerevisiae ....................................... 43 Hình 3.2. Đƣờng cong sinh trƣởng của S. cerevisiae (môitrƣờng SDB) .................. 44 Hình 3.3. Đặc điểm đại thể (a) và vi thể (b) của P. anomala .................................... 45 Hình 3.4. Đƣờng cong sinh trƣởng của P. anomala (môi trƣờng SDB) ................... 46 Hình 3.5. Vỏ chuối khô trƣớc lên men và bã chuối sau lên men lần 1 ..................... 47 Hình 3.6. Sự biến đổi của HL đƣờng khửtheo thời gian ........................................... 49 Hình 3.7. Sự biến đổi của HL cồn theo thời gian ...................................................... 49 v ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.8. Sự biến đổi của HLcellulose theo thời gian ............................................... 50 Hình 3.9. Ảnh hƣởng của thời gian đến sự phát triển tế bào ..................................... 50 Hình 3.10. Sự biến đổi HL đƣờng khử phụ thuộc vào tỷ lệ enzyme bổ sung ........... 53 Hình 3.11. Sự biến đổi HL cellulose phụ thuộc vào tỷ lệ enzyme bổ sung .............. 53 Hình 3.12. Sự biến đổi HL cồn phụ thuộc vào tỷ lệ enzyme bổ sung ...................... 54 Hình 3.13. Sự biến đổi HL đƣờng khử phụ thuộc vào tỷ lệ nấm men bổ sung ....... 56 Hình 3.14. Sự biến đổi HL cellulose phụ thuộc vào tỷ lệ nấm men bổ sung ............ 56 Hình 3.15. Sự biến đổi HL cồn phụ thuộc vào tỷ lệ nấm men bổ sung .................... 57 Hình 3.16. Sự biến đổi của HL đƣờng khử phụ thuộc vào các nồng độ pH khác nhau ..................................................................................................................................... 58 Hình 3.17. Sự biến đổi của HL cellulose phụ thuộc vào các nồng độ pH khác nhau ..................................................................................................................................... 59 Hình 3.18. Sự biến đổi HL cồn phụ thuộc vào các nồng độ pH khác nhau .............. 59 vi ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Trong bối cảnh hiện nay, thế giới đang đứng trƣớc nguy cơ khủng hoảng năng lƣợng trầm trọng do nguồn năng lƣợng hóa thạch có hạn trên trái đất đang dần đi đến cạn kiệt. Từ rất lâu dầu mỏ luôn giữ một vai trò quan trọng trong chiến lƣợc phát triển kinh tế của mỗi quốc gia, dầu mỏ và khí đốt hiện chiếm 68 – 80% nguồn năng lƣợng thế giới. Theo dự báo của các nhà khoa học trên thế giới nguồn năng lƣợng này sẽ bị cạn kiệt trong vòng 40 – 50 năm nữa[15]. Những nguồn năng lƣợng mới đã và đang dần đƣợc giới khoa học và con ngƣời quan tâm hơn, trong đó nghiên cứu phát triển nhiên liệu sinh học có nguồn gốc từ sinh khối động, thực vật là một hƣớng đi có thể tạo ra nguồn nhiên liệu thay thế phần nào cho nguồn nhiên liệu hóa thạch đang cạn kiệt, đảm bảo đƣợc an ninh năng lƣợng cho từng quốc gia. Nhiên liệu sinh học là nhiên liệu có nguồn gốc từ sinh vật, thân thiện với môi trƣờng vì nguyên liệu để sản xuất nhiên liệu sinh học có hàm lƣợng lƣu huỳnh thấp, không chứa các chất độc hại và các hợp chất thơm, mặt khác khi thải nhiên liệu sinh học vào đất thì tốc độ phân hủy sinh học nhanh hơn gấp 4 lần so với nhiên liệu dầu mỏ[16]. Nhiên liệu sinh học ít gây hiệu ứng nhà kính, đặc biệt nhiên liệu này có khả năng tái sinh và gần nhƣ vô tận. Bioethanol đƣợc sản xuất bằng phƣơng pháp lên men và chƣng cất từ các loại ngũ cốc chứa tinh bột (bắp) và đƣờng (mía). Ngoài ra, ethanol có thể đƣợc sản xuất từ lignocellulose, từ những phụ phẩm có chứa hợp chất cellulose cao.Lignocellulose là loại biomass phổ biến nhất trên thế giới. Chính vì vậy, sản xuất ethanol từ biomass cụ thể là lignocellulose từ phế phẩm nông nghiệp là một giải pháp thích hợp trong bối cảnh giá nhiên liệu tăng cao, ô nhiễm môi trƣờng ngày càng trầm trọng và vấn đề an ninh lƣợng thực lại càng đƣợc chú ý và tiếp tục nghiên cứu hoàn thiên trên thế giới[2]. Hàng năm, sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam tạo ra một lƣợng lớn phế phẩm nông nghiệp, chủ yếu là lignocellulose từ các mùa vụ. Phế phụ phẩm nông nghiệp 1 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP nhƣ rơm rạ, bã mía, vỏ cacao, vỏ chuối có tiềm năng năng lƣợng lớn, nhƣng việc sử dụng phế phụ phẩm nông nghiệp dƣới dạng nhiên liệu sinh học vẫn còn hạn chế và đây đƣợc coi là một hƣớng nghiên cứu mới và cần thiết tại Việt Nam. Vỏ chuối là nguồn phế phẩm nông nghiệp giàu lignocellulose nên có thể sử dụng để lên men tạo bioethanol rất hiệu quả, tận dụng đƣợc nguồn vỏ phế phẩm. Hiện nay, lƣợng vỏ chuối phế thải sau khi bóc vỏ từ các nhà máy sản xuất các sản phẩm làm từ chuối, các khu chợ, quán xá và hộ gia đình đƣợc thải ra nhƣ rác. Đây là một trong những tác nhân gây hại cho môi trƣờng. Hoặc chỉ sử dụng một phần để làm thức ăn cho gia súc mang lại hiệu quả kinh tế không cao. Với tình hình phế phẩm vỏ chuối nhƣ vậy và qua nhiều công trình liên quan của tác giả đi trƣớc về bioethanol thì việc lên men vỏ chuối tạo thành rƣợu ethanol là rất có hiệu quả. Nhƣng mặt khác, sau quá trình lên men vỏ chuối chuyển hóa đƣờng thành ethanol nhƣ vậy, thì lƣợng đƣờng không chuyển hóa hết và còn sót lại rất cao. Để tiết kiệm đƣợc chi phí thì việc tái sử dụng lại nguồn bã nguyên liệu là rất cần thiết. Chính vì ý nghĩa thực tế trên, đề tài “Thử nghiệm tận dụng bã vỏ chuối sản xuất bioethanol để tiếp tục thu nhận sản phẩm bằng phƣơng pháp thủy phân và lên men đồng thời (SSF) với Saccharomyces cerevisiae và Pichia anomala” nhằm tìm ra khả năng tái sử dụng của bã cơ chất vỏ chuối để tiếp tục lên men bioethanol. 2. Mục đích nghiên cứu Mục đích của đề tài nhằm khảo sát khả năng thu nhận bioethanol bằng phƣơng pháp SSF sử dụng bã nguyên liệu vỏ chuối đã lên men trƣớc đó. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu - Tìm hiểu tổng quan tài liệu. - Khảo sát đặc điểm của S. cerevisiae và P. anomala. - Khảo sát một số thành phần hóa học của vỏ chuối và bã nguyên liệu lên men ethanol lần 1. - Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men bằng nấm men. 2 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 4. Kết quả đạt đƣợc của đề tài - Khảo sát đƣợc một số thành phần hóa học của vỏ chuối và bã nguyên liệu lên men lần 1: o Vỏ chuối khô: độ ẩm 7,5%, độ tro 9,4%, lignin 22,3%, hàm lƣợng đƣờng khử 142,6 mg/g, hàm lƣợng cellulose 367,8 mg/g. o Bã nguyên liệu lên men lần 1: độ ẩm 42,0%, lignin 0,15%, hàm lƣợng đƣờng khử 59,7 mg/g, hàm lƣợng cellulose 38,5 mg/g. - Các thông số lên men: o Thời gian lên men là 48h. o Xác định tỷ lệ giống nấm men bổ sung cho quá trình lên men là 5% (v/v) cho mỗi loại. o Xác định tỷ lệ enzyme bổ sung cho quá trình lên men là 0,5% (v/v). o Xác định nồng độ pH môi trƣờng ban đầu là 5,0. o Lƣợng ethanol thu đƣợc là 1,6%. - So với đề tài trƣớc (lên men lần 1) o Thời gian lên men: 72h o Tỷ lệ giống nấm men: 9% (v/v) o Tỷ lệ enzyme bổ sung: 0,7% (v/v) o pH môi trƣờng ban đầu là 5,5 o Lƣợng ethanol thu đƣợc là 2,75%  Khả năng tái sử dụng: vẫn sinh ra cồn từ bã cơ chất vỏ chuối.  Tiết kiệm về mặt chi phí, năng lƣợng, thời gian 3 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu sơ lƣợc về Bioethanol 1.1.1. Khái niệm về Bioethanol Ethanol theo phƣơng pháp sinh học (gọi tắt là Bioethanol) là ethanol thu đƣợc từ quá trình lên men vi sinh. Các loại nguyên liệu chứa đƣờng, tinh bột, hoặc cellulose đƣợc thủy phân thành đƣờng, sau đó đƣợc vi sinh vật sử dụng làm nguồn thức ăn để thực hiện lên men tạo ra ethanol và khí CO2. Bioethanol đƣợc sản xuất bằng nguồn nguyên liệu là sinh khối có từ sản phẩm và phế phẩm nông nghiệp, nguồn nguyên liệu có sẵn trong tự nhiên và có thể tái tạo. Với một nƣớc nông nghiệp lâu đời nhƣ Việt Nam thì đây là nguồn nguyên liệu rất đa dạng và phong phú. Vì vậy tổng hợp ethanol bằng con đƣờng sinh học là phƣơng pháp thích hợp để nâng cao hiệu quả kinh tế, tận dụng nguồn phế phẩm nông nghiệp và bảo vệ môi trƣờng. 1.1.2. Sản xuất Bioethanol.  Bioethanol thế hệ thứ nhất Bioethanol thế hệ thứ nhất là bioethanol làm từ đƣờng, tinh bột bằng cách sử dụng công nghệ thông thƣờng. Các nguyên liệu cơ bản để sản xuất Bioethanol thế hệ đầu tiên thƣờng là hạt giống hoặc các loại ngũ cốc nhƣ lúa mì, tinh bột.  Bioethanol thế hệ thứ hai Bioethanol thế hệ thứ hai đƣợc sản xuất bằng cách lên men thực vật không sử dụng cho các mục đích thực phẩm (không phải cây lƣơng thực) nhƣ cỏ jatropha, lục bình, hoặc phế phẩm nông nghiệp nhƣ rơm rạ, trấu, lá cây, bã mía.  Bioethanol thế hệ thứ ba Bioethanol thế hệ thứ ba từ tảo (nƣớc ngọt và nƣớc biển), cây Jatropha curcas (cây cộc rào hay cây dầu mè), cỏ swichgrass, cây halophyte. 4 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.2. Nguyên liệu Lignocellulose Lignocellulose là vật liệu phổ biến nhất trên trái đất. Trong tự nhiên, chúng ta có thể tìm thấy lignocellulose ở thực vật hay các chất thải nông nghiệp, lâm nghiệp và các chất thải rắn trong thành phố. Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thành tế bào thực vật. Thành phần chủ yếu của lignocellulose là cellulose, hemicellulose và lignin (hình 1.1). Hình 1.1. Thành phần lignocellulose Hình 1.2. Tỉ lệ các thành phần có trong lignocellulose 5 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Về cơ bản, trong lignocellulose, cellulose tạo thành khung chính và đƣợc bao bọc bởi những chất có chức năng tạo mạng lƣới nhƣ hemicellulose và kết dính nhƣ lignin[11]. Cellulose, hemicellulose và lignin sắp xếp gần nhau và liên kết cộng hóa trị với nhau (hình 1.3). Các đƣờng nằm ở mạch nhánh nhƣ arabinose, galactose, và acid 4-O-methylglucuronic là các nhóm thƣờng liên kết với lignin. Hình 1.3. Cấu trúc của lignocellulose Trong lignocellulose, các mạch cellulose tạo thành các sợi cơ bản. Các sợi này đƣợc gắn lại với nhau nhờ hemicellulose tạo thành cấu trúc vi sợi với chiều rộng khoảng 25nm. Các vi sợi này đƣợc bao bọc bởi hemicellulose và lignin, giúp bảo vệ cellulose khỏi sự tấn công của enzyme cũng nhƣ các hóa chất trong quá trình thủy phân[9]. 1.2.1. Cellulose Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức (C6H10O5)n, là một polymer mạch thẳng của D-glucose, các D-glucose đƣợc liên kết với nhau bằng liên kết β 1-4 glucosid. Cellulose là loại polymer phổ biến nhất trên trái đất, độ trùng hợp đạt đƣợc 3.500 – 10.000 DP. Các nhóm OH ở hai đầu mạch có tính chất hoàn toàn khác nhau, cấu trúc hemiacetal tại C1 có tính khử, trong khi đó OH tại C4 có tính chất của rƣợu[1]. Các mạch cellulose đƣợc liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết Van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là kết tinh và vô định hình. Trong 6 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP vùng kết tinh, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng nhƣ hóa chất. Ngƣợc lại trong vùng vô định hình, cellulose liên kết không chặt chẽ với nhau nên dễ bị tấn công[9]. Hình 1.4. Công thức hóa học của cellulose 1.2.2. Hemicellulose Hemicellulose là một loại polymer phức tạp và phân nhánh, độ trùng hợp khoảng 70 – 200 DP. Hemicellulose chứa cả đƣờng 6 gồm glucose, mannose, galactose và đƣờng 5 gồm xylose, arabinose. Thành phần cơ bản của hemicellulose là β-D xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β-(1-4)[9]. Cấu tạo của hemicellulose khá phức tạp và đa dạng tùy vào nguồn nguyên liệu, tuy nhiên có một vài điểm chung gồm:  Mạch chính của hemicellulose đƣợc cấu tạo từ liên kết β-(1-4).  Xylose là thành phần quan trọng nhất.  Nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl O – liên kết với vị trí 2 hoặc 3.  Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thƣờng là disaccharide hoặc trisaccharide. Sự liên kết của hemicellulose với các nhóm polysaccharide khác và với lignin là nhờ các mạch nhánh này. Cũng vì hemicellulose có mạch nhánh nên tồn tại ở dạng vô định hình và vì thế dễ bị thủy phân. 1.2.3. Lignin 7 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Lignin là một phức hợp hóa học phổ biến đƣợc tìm thấy trong hệ mạch thực vật, chủ yếu là giữa các tế bào, trong thành tế bào thực vật. Lignin có cấu trúc không gian 3 chiều, phức tạp, vô định hình, chiếm 17% đến 33% thành phần của gỗ. Lignin không phải là carbohydrate nhƣng có liên kết chặt chẽ với nhóm này để tạo nên màng tế bào giúp thực vật cứng chắc và giòn, có chức năng vận chuyển nƣớc trong cơ thể thực vật (một phần là để làm bền thành tế bào và giữ cho cây không bị đổ, một phần là điều chỉnh dòng chảy của nƣớc), giúp cho cây phát triển và chống lại sự tấn công của côn trùng và mầm bệnh. Thực vật càng già, lƣợng lignin tích tụ càng lớn. Hơn nữa lignin đóng vai trò quan trọng trong chu trình carbon, tích lũy carbon khí quyển trong mô của thực vật thân gỗ lâu năm, là một trong các thành phần bị phân hủy lâu nhất của thực vật sau khi chết. Lignin là một loại polyphenol có cấu trúc mở. Trong tự nhiên lignin chủ yếu đóng vai trò chất liên kết trong thành tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và hemicellulose, rất khó để tách lignin ra hoàn toàn. Lignin là polymer, đƣợc cấu thành từ các đơn vị phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc điển hình đƣợc đề nghị là: guaiacyl (G), chất gốc là rƣợu trans-coniferyl; syringly (S), chất gốc là rƣợu trans-sinapyl; p-hydroxylphenyl (H), chất gốc là rƣợu trans-p-courmary (hình 1.5). Hình 1.5. Các đơn vị cơ bản của lignin Cấu trúc của lignin đa dạng, tùy thuộc vào loại gỗ, độ tuổi của cây hoặc cấu trúc của nó trong gỗ ngoài việc đƣợc phân loại theo lignin của gỗ cứng, gỗ mềm và 8 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP cỏ, lignin có thể đƣợc phân thành hai loại chính: guaicyl lignin và guaicy-syringly lignin. Gỗ mềm chứa chủ yếu là guaiacyl, gỗ cứng chứa chủ yếu syringyl. Nghiên cứu chỉ ra rằng guaiacyl lignin hạn chế sự trƣơng nở của sơ sợi và vì vậy loại nguyên liệu đó sẽ khó bị tấn công bởi enzyme hơn syringly lignin[9]. Do sự liên kết chặt chẽ của lignin với mạng cellulose và hemicellulose nên yêu cầu cần một quá trình tiền xử lý ban đầu nhằm phá vỡ cấu trúc giữa lignin- cacbohydrate giải phóng cellulose, giúp cho quá trình thủy phân bằng enzyme hay acid diễn ra dễ dàng hơn. 1.3. Qúa trình sản xuất Bioethanol từ lignocellulose Có rất nhiều nguồn nguyên liệu để sản xuất bioethanol trong đó nguồn nguyên liệu lignocellulose là nguồn nguyên liệu phong phú để sản xuất bioethanol. Quy trình sản xuất bioethanol từ nguồn lignocellulose đƣợc thể hiện qua hình 1.6. Hình 1.6. Quy trình chuyển hóa sinh khối lignocellulose thành bioethanol 9 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Qúa trình lên men ethanol từ các nguồn nguyên liệu lignocellulose cũng giống nhƣ từ tinh bột hay rỉ đƣờng. Bao gồm 4 bƣớc cơ bản: - Tiền xử lý nguyên liệu. - Thủy phân nguyên liệu. - Lên men. - Tinh chế sản phẩm (chƣng cất, tách nƣớc, bốc hơi, tách lỏng rắn) tùy thuộc vào nồng độ cồn mà ta dùng các phƣơng pháp tinh chế khác nhau. 1.3.1. Quá trình tiền xử lý Mục đích để làm tăng khả năng xâm nhập của enzyme vào cấu trúc nguyên liệu lignocellulose, làm giảm hàm lƣợng lignin, tăng diện tích bề mặt và mức độ cấu trúc vô định hình của nguyên liệu, tăng tốc độ thủy phân của enzyme vào cấu trúc cellulose và làm tăng hàm lƣợng đƣờng[14]. Yêu cầu của quá trình tiền xử lý: Các tiêu chuẩn để đánh giá quá trình tiền xử lý: - Giữ lại đƣợc các gốc đƣờng C5, C6 trong thành phần cellulose và hemicellulose. - Giảm thiểu đƣợc hàm lƣợng và sự biến chất của lignin trong nguyên liệu. - Sử dụng ít năng lƣợng. - Sử dụng các phƣơng pháp và tác nhân tiền xử lý giá thành thấp. Không có một phƣơng pháp tiền xử lý nào gọi là hoàn thiện, chúng đều tồn tại các nhƣợc điểm nhƣ: tạo ra các chất hóa học gây ức chế (acid, furan, phenol), tiêu tốn nhiều năng lƣợng hoặc kém hiệu quả trong phân riêng dung dịch đƣờng và bã rắn[13]. Điều kiện tiền xử lý xác định là yêu cầu cho từng loại nguyên liệu riêng.Vấn đề rất quan trọng đó là phải tối ƣu quá trình tiền xử lý nguyên liệu lignocellulose bởi vì đây là một trong những giai đoạn tốn nhiều chi phí nhất trong quá trình chuyển hóa 10 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP tạo thành ethanol. Ví dụ Mosier et al (2005) đã tính toán rằng quá trình tiền xử lý có chi phí ~30 UScent/gallon sản phẩm bioethanol[13]. Về cơ bản, phƣơng pháp tiền xử lý phải làm cho cellulose trở nên dễ bị enzyme thủy phân bằng cách phá vỡ cấu trúc kết tinh của nguyên liệu và để làm đƣợc điều này thì lớp lignin bao bọc cần phải đƣợc phá bỏ. Kỹ thuật tiền xử lý nguyên liệu lignocellulose đƣợc chia thành 4 nhóm chính bao gồm vật lý, hóa học, hóa – lý và sinh học. Tiền xử lý vật lý làm tăng diện tích bề mặt bằng việc giảm kích thƣớc nguyên liệu. Tiền xử lý hóa học loại bỏ một phần hemicellulose và lignin, phá vỡ cấu trúc mạng lƣới lignin – hemicellulose. Tiền xử lý hóa – lý đòi hỏi điều kiện vận hành, kiểm soát cao bởi vì phản ứng xảy ra ở nhiệt độ và áp suất cao[12]. Tiền xử lý sinh học đƣợc sử dụng để loại bỏ lignin trong cấu trúc lignocelluloses[7]. Bảng 1.1. Sự tác động của các phƣơng pháp tiền xử lý khác nhau lên cấu trúc lignocellulose. Nghiền Nổ hơi Acid Kiềm Oxy Nổ hơi nƣớc hóa CO2 Diện tích bề mặt H H H H H H Mức độ suy giảm cấu H - - - n.d - trúc vô định hình của cellulose Độ hòa tan hemicellulose - H H L - H Loại bỏ lignin - M M M M - Hợp chất ức chế sinh ra - H H L L - Sự thay đổi cấu trúc - H H H L - lignin H: tác động cao; M: tác động trung bình; L: tác động thấp; n.d: không xác định ( Nguồn: P. Alvira, 2010) 11 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.3.2. Qúa trình thủy phân Sau quá trình tiền xử lý, cellulose và hemicellulose sẽ bị thủy phân thành các đƣờng đơn (hexose và pentose). Ở đây, quan tâm nhiều đên sự thủy phân cellulose, do nó là thành phần chính trong sinh khối lignocellulos. Phƣơng trình phản ứng tổng quát (PT1): enzyme (C6H10O5)n + nH2O nC6H12O6 (PT1) Quá trình thủy phân cellulose đƣợc thực hiện bởi acid thủy phân hoặc enzyme thủy phân. 1.3.2.1. Cellulase a) Khái niệm Cellulase là một loại enzyme có thể đƣợc sản xuất từ nấm mốc, vi khuẩn hoặc sinh vật đơn bào, có khả năng thủy phân cellulose và cả hemicellulose. Ký hiệu là EC 3.2.1.4 b) Yêu cầu đối với cellulose Sự phát triển củ