Đồ án Thử nghiệm chế phẩm diệt sâu tơ plutella xylostella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn serratia marcescens SH4

TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM DIỆT SÂU TƠ PLUTELLA XYLOSTELLA TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS SH4 Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực hiện : TRƯƠNG HOÀI NGUYÊN MSSV: 1311100520 Lớp: 13DSH03 TP. Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hoài Hương ( Giảng viên Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại học Công nghệ TP.HCM). Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về khóa luận tốt nghiệp của mình. TP.HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực hiện TRƯƠNG HOÀI NGUYÊN Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, người đã nuôi nấng dạy dỗ con trong 23 năm qua, người đã cùng con trải qua biết bao nhiêu khó khăn trong cuộc sống và luôn qua tâm con, chăm sóc cho con. Người luôn bên con những lúc khó khăn nhất. Em cũng xin cảm ơn anh chị trong gia đình đã định hướng và ủng hộ em trên con đường học tập. Em xin cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã tận tâm dạy bảo và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 4 năm đại học. Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến cô Nguyễn Hoài Hương, người luôn nhiệt tình với học trò, luôn định hướng và cung cấp những kiến thức bổ ích cho chúng em, người trực tiếp hướng dẫn em xuyên suốt quá trình thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Hai người đã cho em lời khuyên trong quá trình nuôi sâu tơ thí nghiệm và cung cấp cho em giống nấm thí nghiệm. Em cũng xin cảm ơn thầy Nguyễn Trung Dũng, cô Nguyễn Trần Thái Khanh, anh Trần Thiện Đức đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng thí nghiệm. Đồng thời, xin cảm ơn đến bạn Đỗ Thị Cẩm Lụa, Cao Thị Thanh Thúy đã hổ trợ mình thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp, cảm ơn tất cả các bạn cùng thực hiện đồ án trong thời gian mình thực hiện đồ án ở phòng thí nghiệm đã giúp đỡ mình trong suốt quá trình làm thí nghiệm. Cảm ơn em Hồ Trung Lộc lớp 14DSH, em Trần Nguyễn Tuấn Minh 14DSH, em Bùi Nhật Minh 14DSH đã phụ giúp anh trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn ! TP.HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017 TRƯƠNG HOÀI NGUYÊN Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC ................................................................................................................... 1 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................... 4 DANH MỤC HÌNH ẢNH .......................................................................................... 5 DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... 6 CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 9 1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học ................................................................. 9 1.1.1 Khái niệm thuốc trừ sâu sinh học .............................................................. 9 1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học trên thị trường hiện nay ............ 9 1.1.3 Những ưu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học ........................... 10 1.1.4 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học Abamectin ...................................... 10 1.1.4.1 Ưu điểm ............................................................................................. 11 1.1.4.2 Nhược điểm ....................................................................................... 11 1.1.4.3 Cơ chế tác động ................................................................................ 12 1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens ........................................................ 12 1.2.1 Lịch sử phát hiện ...................................................................................... 12 1.2.2 Phân loại .................................................................................................. 13 1.2.3 Đặc điểm của Serratia marcescens .......................................................... 13 1.2.4 Đặc điểm sinh lí ....................................................................................... 14 1.1.3.1 Đặc điểm sinh hóa ............................................................................. 15 1.1.3.2 Đặc điểm phân bố ............................................................................. 16 1.2 Giới thiệu về Prodigiosin ................................................................................ 17 1.3.1 Khái niệm về prodigiosin ......................................................................... 17 1.3.2 Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin ..................................................... 17 1.3.3 Hoạt tính sinh học của prodigiosin .......................................................... 20 1.3 Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin của Serratia marcescens ........................... 20 1.4 Enzyme ............................................................................................................ 25 1.5 Yếu tố độc lực của Serratia marcescens ......................................................... 25 1.6 Một số nghiên cứu trên thế giới ...................................................................... 26 1.6.1 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens .............................................. 26 1 Đồ án tốt nghiệp 1.6.2 Tình hình nghiên cứu Prodigiosin ........................................................... 27 1.6.3 Tình hình nghiên cứu nấm gây bệnh ........................................................ 27 1.6.3.1 Nấm Fusarium solani sp ................................................................... 27 1.6.3.2 Nấm Paecilomyces sp ........................................................................ 28 1.6.3.3 Nấm Trichoderma ............................................................................. 28 1.6.3.4 Nấm Aspergillus flavus ..................................................................... 29 1.7 Khái quát về sâu tơ Plutella xylostella ............................................................ 29 1.7.1 Đặc điểm hình thái, sinh học ................................................................... 29 1.7.2 Tập quán sinh sống và cách gây hại ........................................................ 30 1.7.3 Biện pháp phòng trừ ................................................................................. 30 CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 32 2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu ...................................................................... 32 2.1.1 Thời gian .................................................................................................. 32 2.1.2 Địa điểm ................................................................................................... 32 2.2 Vật liệu, hóa chất, thiết bị ............................................................................... 32 2.2.1 Nguồn vi khuẩn Serratia mascescens ....................................................... 32 2.2.2 Nguồn nấm ............................................................................................... 32 2.2.3 Nguồn ấu trùng Artemia nauplii .............................................................. 32 2.2.4 Nguồn cải ngọt Brassica integrifolia. ...................................................... 32 2.2.5 Nguồn cá bảy màu Poecilia reticulate ..................................................... 32 2.2.6 Môi trường nuôi cấy và hóa chất ............................................................. 32 2.2.7 Dụng cụ, thiết bị ....................................................................................... 33 2.3 Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 34 2.4 Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 34 2.5 Phương pháp thí nghiệm ................................................................................. 34 2.5.1 Phương pháp luận .................................................................................... 34 2.5.2 Bố trí thí nghiệm....................................................................................... 35 2.6 Phương pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm .................................................. 36 2.6.1 Phương pháp nuôi sâu trong phòng thí nghiệm ...................................... 36 2.6.2 Phương pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens ......................... 37 2.6.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học ................................................ 37 2.6.3.1 Phương pháp định tính enzyme ............................................................. 37 2 Đồ án tốt nghiệp 2.6.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng kháng nấm ........................................ 42 2.6.3.3 Khảo sát hiệu lực diệt sâu bằng phương pháp quét lá ......................... 44 2.6.3.4 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên ấu trùng Artemia nauplii ........................................................................................................................... 45 2.6.3.5 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên cải ngọt Brassica integrifolia ......................................................................................................... 47 2.6.3.6 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên cá bảy màu ................... 48 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ................................................................... 51 3.1 Khả năng tiết enzyme ngoại bào ..................................................................... 51 3.2 Hoạt tính kháng nấm ....................................................................................... 52 3.3 Hiệu lực diệt sâu từ chế phẩm ......................................................................... 55 3.4 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên ấu trùng Artemia nauplii ........ 57 3.5 Khảo sát tác động của chế phẩm lên cải ngọt Brassica integrifolia ............... 58 3.6 Khảo sát tác động của chế phẩm lên cá bảy màu Poecilia reticulata ............. 61 1.Kết luận .............................................................................................................. 65 2. Kiến nghị ........................................................................................................... 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 67 PHỤ LỤC A. THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƯỜNG .............................................. 71 PHỤ LỤC B: HÌNH ẢNH ........................................................................................ 74 PHỤ LỤC C: BIỂU ĐỒ ............................................................................................ 86 PHỤ LỤC D: SỐ LIỆU THỐNG KÊ ....................................................................... 89 3 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Artemia nauplii : A.nauplii Brassica integrifolia : B. integrifolia Serratia mascescens : S.mascescens Plutella xylostella : P.xylostella Pepton glycerol : PG QCVN : Quy chuẩn Việt Nam. BNNVPTNT : Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn. 4 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát được dưới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011) .............................................................................................................. 14 Hình 1.2 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens ........ 14 Hình 1.3 Cấu trúc của prodigiosin (Krishna, 2008) ................................................. 18 Hình 1.4 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) ......................................... 18 Hình 1.5 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001) .................................. 21 Hình 1.6 Con đường được đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp prodigiosin. ......... 24 Hình 1.7 Vòng đời của sâu tơ Plutella xylostella ..................................................... 30 Hình 2.1 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học, khả năng diệt sâu và độc tính của chế phẩm. ......................................................................................................................... 36 Hình 2.2 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Casein ......... 38 Hình 2.3 Cách bố trí nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Lipit ......................... 40 Hình 2.2 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Chitin ......... 41 Hình 2.3 Bố trí các nghiệm thức kháng nấm trên đĩa thạch PDA ............................ 43 Hình 2.6 Bố trí thử nghiệm chế diệt sâu tơ P. xylostella phẩm bằng phương pháp quét lá (Maureen và cộng sự, 2012). ................................................................................. 45 Hình 3.1 Hiệu lực diệt sâu tơ P.xylostella của chế phẩm từ dịch nuôi cấy vi khuẩn S.mascescens SH4 theo thời gian (Abbott 1925). ..................................................... 56 Hình 3.2 Tỉ lệ chết của ấu trùng Artemia nauplli theo Log nồng độ prodigiosin (mg/ml). ..................................................................................................................... 58 Hình 3.3. Tỉ lệ nảy mầm của cải ngọt B. integrifolia sau khi ngâm chế phẩm ........ 59 Hình 3.4. Tỉ lệ nảy chết của cải ngọt B. integrifolia sau khi phun chế phẩm .......... 60 Hình 3.5 Sơ đồ quy trình sản xuất thuốc trừ sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serrastia marcescens SH4 ........................................................................................................ 63 5 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens ................................. 15 Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) ................................................................................................................................... 19 Bảng 3.1 các enzyme ngoại bào trong canh trường lên men sau xử lí acid. ............ 52 Bảng 3.2 Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus flavus CDP1 ............................................... 52 Bảng 3.3 Tỉ lệ ức chế nấm Fusarium sp. .................................................................. 53 Bảng 3.4 Tỉ lệ ức chế nấm Trichoderma sp.............................................................. 54 Bảng 3.5 Tỉ lệ ức chế nấm Paecilomyces sp. ........................................................... 54 Bảng 3.5 Tỉ lệ chết của sâu tơ tuổi 3. ....................................................................... 56 Bảng 3.6 Độc tính của chế phẩm đối với cây cải ngọt sau 9 ngày thử nghiệm. ....... 61 Bảng 3.7 Tỉ lệ chết của cá sau 5 ngày thử nghiệm. .................................................. 62 6 Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Theo thống kê của tổ chức Lương – Nông thế giới cho thấy: các loài cây trồng hiện nay phải chống đỡ với 100.000 loài sâu hại khác nhau, 10.000 loài nấm, 200 loài vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng và 600 loài virus gây bệnh. Đây quả là một lực lượng hùng hậu tấn công cây trồng, gây tổn thất lớn cho mùa màng. Để giải quyết vấn đề trên, con người đã tích cực tìm kiếm các biện pháp phòng chống các tác nhân gây hại. Từ đó đã ra đời nền công nghiệp thuốc trừ sâu hóa học, diệt các mầm bệnh cho cây trồng. Tuy nhiên, người nông dân đã dùng thuốc hóa học với liều lượng quá mức cho phép, vô tình tạo cho côn trùng khả năng kháng thuốc, làm cho tình hình sâu hại trở nên nghiêm trọng hơn, diễn biến phức tạp hơn. Trong đó, sâu tơ Plutella xylostella là loài sâu đa thực và gây hại nặng đến màu màng, chúng gây hại trên hầu hết các loại rau cải, đặc biệt có nhiều trên cây cải ngọt . Chúng có khả năng kháng thuốc hóa học nếu người dùng lạm dụng quá nhiều thuốc trừ sâu hóa học không đúng cách. Vì vậy, xu hướng sử dụng các biện pháp phòng trừ sinh học đã và đang trở nên rất hữu ích vì tiết kiệm chi phí, có tác dụng phòng trừ lâu dài, an toàn cho sức khỏe con người, đồng thời không gây ô nhiễm môi trường. Những năm gần đây, việc trích ly được hợp chất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens có khả năng diệt sâu đã mở ra một triển vọng mới trong việc tạo chế phẩm trừ sâu sinh học là hợp chất thứ cấp của vi sinh vật. Tuy nhiên, tại Việt Nam hiện nay chỉ có một vài đề tài nghiên cứu về hợp chất thứ cấp này mà chưa có nghiên cứu nào về ứng dụng tạo phẩm diệt sâu từ hợp chất prodigiosin hoặc đã nghiên cứu nhưng vẫn chưa hoàn thiện được sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học. Dựa trên cơ sở đó mà người thực hiện đề tài đã chọn hướng cho Đồ ÁN tốt nghiệp là: “Thử nghiệm chế phẩm diệt sâu tơ Plutella xylostella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens SH4” 2. Mục đích nghiên cứu 7 Đồ án tốt nghiệp Sản xuất chế phẩm sinh học diệt sâu chứa prodigiosin từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens SH4. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu Sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy Serratia marcescens SH4 Thử nghiệm tính an toàn sinh học của chế phẩm lên cây cải ngọt để đánh giá an toàn sinh học của chế phẩm. Thử nghiệm độc tính của chế phẩm lên ấu trùng Artemia nauplii và thủy sinh đại diện là cá bảy màu 4. Kết quả cần đạt được Khảo sát được ảnh hưởng của việc xử lý acid lên enzyme ngoại bào của vi khuẩn S.marcesscens trong dịch nuôi cấy. Khảo sát được hoạt tính của dịch nuôi cấy sau xử lý: kháng nấm, kháng sâu tơ. Khảo sát được độc học của vi khuẩn tác động lên ấu trùng A.nauplii. Khẳng định tính an toàn của chế phẩm trong việc ứng dụng chế phẩm ngoài thực tế. 8 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học 1.1.1 Khái niệm thuốc trừ sâu sinh học Thuốc trừ sâu sinh học bao gồm các loại chế phẩm có nguồn gốc sinh học. Thành phần giết sâu có trong thuốc sinh học có thể là các vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, virus) và các hợp chất thứ cấp do vi sinh vật tiết ra ( thường là các chất kháng sinh), các chất có trong cây cỏ (chất độc hoặc dầu thực vật). 1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học trên thị trường hiện nay 1. NPV là chế phẩm trừ sâu hoạt lực cao, gồm 2 loại V- Ha và V- S1. Thuốc chuyên dùng để diệt trừ sâu xanh, sâu khoang, sâu xanh đốm trắng, sâu tơ trên các loại cây rau màu, cây công nghiệp, cây ăn quả với hiệu quả rất cao. NPV có nồng độ đặc hơn so với các loại thuốc khác, sử dụng tương đối dễ dàng: chỉ cần hoà thuốc vào bình và phun bình thường với liều lượng 1,0- 1,2 kg/ha. 2. Chế phẩm Bt: Gồm 2 loại: dạng sữa 4.000 IU/ml và dạng bột Biotox 16.000 IU/mg chuyên dùng trừ sâu tơ, sâu xanh hại rau, sâu kéo ra lá, các loại sâu thuộc họ Leptidopera. 3. Chế phẩm M&B có 2 loại: Metarhizium và Beauveria. Metarhizium anisopliae 1,6- 2,5 x 109Bt/gr bọ hại dừa. Thử nghiệm tại Đà Nẵng, Phú Yên đạt hiệu quả tới 86,5%. Dạng nấm xanh được dùng để trừ rầy, bọ xít trên lúa và cây ăn quả đạt 70- 90%, dạng nấm trắng đạt 50- 85%. Chế phẩm Beauveria chuyên dùng để trị sâu róm thông và sâu đo nâu hại bồ đề với hiệu quả tiêu diệt sâu tới gần 87%. TS. Nguyễn Văn Vấn cho biết: “Loại thuốc này có thể sử dụng để tiêu diệt sâu róm hại thông đang xảy ra tại Nghệ An hiện nay”. 4. Chế phẩm tuyến trùng EPN Biostar 15- 20 x 106 IJs trừ sâu xám hại thuốc lá, đặc biệt là mía đạt hiệu quả khá cao. Hiện những sản phẩm đầu tiên đã được đưa vào ứng dụng để diệt trừ sâu xám hại thuốc lá tại Ba Vì (Hà Tây), bọ hung hại mía tại Thạch Thành (Thanh Hoá). 9 Đồ án tốt nghiệp 5. Chế phẩm hoá sinh Momosertatin (MM) 2IU/lít trừ các loại sâu hại rau màu đạt 45- 50%. 6. Chế phẩm Ditacin 8% và Ketomium 1,5 x 106 Cfu/g, trừ bệnh hại trên cây ăn quả, cây lâu năm. (Nguyễn Văn Tấn, 2004) 1.1.3 Những ưu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học Ưu điểm  Không độc với người và các sinh vật có ích nên có thể bảo vệ được sự cân bằng sinh học trong tự nhiên (cân bằng giữa thiên địch và sâu hại), ít gây tình trạng bùng phát dịch côn trùng.  Thời gian phân hủy trong tự nhiên nhanh chóng, ít để lại dư lượng độc trên nông sản và có thời gian cách ly ngắn nên rất thích hợp sử dụng cho các nông sản yêu cầu có độ sạch cao như các loại rau, chè  Ngoài ra, các nguyên liệu để làm thuốc trừ sâu sinh học thường có sẵn và rất phổ biến ở mọi nơi, mọi lúc như ớt, tỏi, hành, rừng... Chi phí sản xuất khi tự làm thuốc trừ sâu sinh học thấp hơn so với thuốc trừ sâu hóa học, do vậy sẽ tiết kiệm hơn cho người dân mà vẫn mang lại hiệu quả cao. Hạn chế  Các thuốc vi sinh thường thể hiện hiệu quả diệt sâu tương đối chậm hơn so với thuốc hóa học.  Sự bảo quản và khả năng hỗn hợp của các thuốc sinh học thường yêu cầu điều kiện cũng chặt chẽ hơn. 1.1.4 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học Abamectin Abamectin là thuốc trừ sâu sinh học thế hệ mới, là hỗn hợp của Avermectin B1a (80%) và Avermectin B1b (20%) được phân lập từ quá trình lên men của vi khuẩn Streptomycin avermitilis được sử dụng phổ biến để phòng trừ sâu hại trên nhiều loại cây trồng đặc biệt là rau, hoa, chè, lúa. Hoạt chất Abamectin được 97 công ty đăng ký với 534 loại thuốc thương phẩm, gồm 294 thuốc thương phẩm đơn chất Abamectin (Abatin 1.8 EC; Alfatin 1.8 EC; Binhtox 1.8 EC; Reasgant 1.8EC; Tervigo 020SC) và 240 thuốc thương phẩm 10 Đồ án tốt nghiệp dạng hỗn hợp với các hoạt chất khác như Emamectin benzoate (Sieufatoc 36EC), Azadirachtin (Goldmectin 36EC), Alpha – cypermethrin (Shepatin 18EC), Acetamiprid (Acelant 4EC) dầu khoáng (Đầu trâu Bihopper 24.5EC), Bacillus thuringiensis var.kurstaki (Kuraba WP ) 1.1.4.1 Ưu điểm - Hoạt chất Abamectin có hiệu lực diệt sâu nhanh, mạnh, kéo dài và ít chịu tác động của điều kiện thời tiết. - Thuốc ít hình thành tính kháng của dịch hại, ít gây độc cho người sử dụng. - Phổ tác động rộng, trừ được nhiều loài sâu miệng nhai, miệng chích hút thuộc bộ cánh vảy, bộ hai cánh, bộ cánh đều như ruồi đục lá, sâu tơ, sâu xanh, bọ trĩ, nhện ở liều lượng 5,4 -25gai/ha trên nhiều loại cây trồng như rau họ thập tự, họ cà, cây ăn quả (cam, quýt, chè), lúa. 1.1.4.2 Nhược điểm - Các loại thuốc hoạt chất Abamectin thuộc nhóm độc II, LD50 qua miệng 300 mg/kg, LD50 qua da > 1800 mg/kg, dễ kích thích da và mắt. Thời gian cách ly ngắn nhất là 3 ngày, phổ biến là 7 ngày. - Hoạt chất Abamectin có chỉ số tác động môi trường (EIQ 36,68) cao hơn so với nhiều hoạt chất khác, kể cả một số thuốc thuộc nhóm lân hữu cơ như Acephate (EIQ 24,88), Chlopyriphos( EIQ 26,85). - Thuốc thuộc nhóm độc II, thời gian cách ly tương đối dài (7 ngày), mức độ ảnh hưởng của thuốc đối với người phun thuốc, người tiêu dùng không lớn nhưng độc đối với cá và ong. Vì vậy, mặc dù đã được đăng ký phòng trừ sâu hại trên cây rau nhưng Abamectin không có trong Danh mục các hoạt chất thuốc BVTV khuyến cáo lựa chọn để sử dụng trên rau an toàn khi cần thiết (Ban hành kèm theo văn bản số 580/BVTV- QLT ngày 17/4/2014 của Cục Bảo vệ thực vật). 11 Đồ án tốt nghiệp 1.1.4.3 Cơ chế tác động Thuốc ngăn chặn chất truyền luồng thần kinh gamma aminobutyric acid (GABA) tại chỗ nối cơ thần kinh của côn trùng. Thuốc làm côn trùng ngừng ăn hoặc ngừng đẻ trứng ngay, chúng có thể chết sau vài ngày. 1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens 1.2.1 Lịch sử phát hiện Lịch sử của sắc tố màu đỏ trên thực phẩm được nhìn thấy đầu tiên ở thế kỷ thứ 6 trước công nguyên, khi Pythagoras báo cáo về “máu” đôi khi xuất hiện trên bánh mì. Sau đó, vào năm 332 trước công nguyên, những người lính trong quân đội Macedonian của Alexander nhận thấy rằng bánh mì của họ đôi khi dường như có “máu” trên đó. Và họ cho rằng hiện tượng kỳ lạ này chính là bằng chứng cho thấy máu sẽ sớm chảy trong thành phố Tyre và Alexander sẽ giành chiến thắng. Năm 1800, Christian phát hiện gần 100 tài liệu trong lịch sử nói đến sự xuất hiện kỳ diệu của “máu” trên thực phẩm. Nhà sử học và vi sinh vật học Gaughran (1969), đã phát hiện hơn 35 báo cáo lịch sử về “máu” từ bánh Thánh, trong đó, sự cố như vậy được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1169 tại Đan Mạch. Trong bóng tối và sự ẩm ướt của nhà thờ thời Trung Cổ, miếng bánh Thánh được sử dụng trong Thánh lễ thường xuyên bị nhiễm Serratia marcescens. Tuy nhiên, điều này lại khiến nhiều người nghĩ rằng đó là máu của Chúa Christ và cho đó là một phép lạ (Gillen và Gibbs, 2011). Bizio, một dược sĩ ở Padua (Italya), là người đầu tiên phát hiện và đặt tên Serratia marcescens cho nguyên nhân gây nên sự đổi màu kỳ lạ của bột ngô sang màu đỏ máu. Năm 1817, Bizio đã làm ẩm một miếng bánh mì và polenta sau đó để ở nơi khô ráo. Sau 24 giờ, cả bánh mì và polenta đều được bao phủ bởi một lớp vi sinh vật màu đỏ. Năm 1819, Bizio đã đặt tên cho vi sinh vật màu đỏ này là Serratia, theo tên nhà vật lý nổi tiếng người Italya đã phát minh ra tàu hơi nước là Serrati, tên loài marcescens có nguồn gốc từ tiếng Latin, có nghĩa là phân hủy vì vi sinh vật này phân hủy rất nhanh bánh mì và polenta. 12 Đồ án tốt nghiệp Ban đầu Bizio mô tả Serratia marcescens như một loại nấm, do ông nhìn thấy những đốm đỏ dưới kính hiển vi. Thời gian sau đó, vào những năm 1850, các nhà khoa học đã phân loại lại Serratia marcescens là vi khuẩn. 1.2.2 Phân loại Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae, là một nhóm vi khuẩn có liên quan với nhau về hình thái và trình tự DNA. Trong đó, loài điển hình của chi Serratia là Serratia marcescens. Theo Bizio (1823), Serriatia marcescens được phân loại như sau: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gramma proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Serratia Loài: Serratia marcescens 1.2.3 Đặc điểm của Serratia marcescens Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi. Serratia marcescens có hình que, đường kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm. Serratia marcescens phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 5 – 40oC và có thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012). 13 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát được dưới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011) Hình 1.2 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens 1.2.4 Đặc điểm sinh lí Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trường nutrient agar được mô tả là khuẩn lạc tròn, lồi và các khuẩn lạc này có màu trắng, hồng hay đỏ, đó cũng chính là sắc tố thường thấy trong các khuẩn lạc. Các sắc tố của Serratia marcescens thường bị mất đi trên các khuẩn lạc cũ (David, 2012). Vi khuẩn Serratia marcescens có thể bám dính với nhau trên môi trường thạch, tạo thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8 %); các cụm tế bào này có chiều dài từ 5 – 30 μl. Serratia marcescens cũng có thể tạo thành một màng sinh học. 14 Đồ án tốt nghiệp 1.1.3.1 Đặc điểm sinh hóa Serratia marcescens có thể phát triển trong môi trường hiếu khí và kỵ khí. Chủ yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên men để lấy năng lượng và nhờ có các enzyme như superoxide dismutase, calatas, peroxides,bảo vệ chúng khỏi các phản ứng oxy hóa. Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và gelatinase (Giri và cộng sự, 2004). Ngoài ra, các đặc điểm khác để xác định Serratia marcescens là khả năng di động và sinh một số enzyme ngoại bào như nuclease, protease và haemolysin (Hejazi và Falkiner, 1997). Trong đó, thủy phân casein là một đặc điểm chung của Serratia marcescens. Casein là một protein kết tủa trong sữa và là cơ sở cho sản xuất phomat và một số chất dẻo. Serratia marcescens sử dụng enzyme protease ngoại bào để phá vỡ liên kết peptide (CO-NH) trong casein. Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens STT Đặc điểm sinh hóa Kết quả 1 Di động + 2 Indole - 3 Methyl Red - 4 Voges Proskauer + 5 Citrate + 6 Dnase + 7 Catalase + 8 Oxidase - 9 Urease - 10 Gelatinase + 11 Chitinase + 15 Đồ án tốt nghiệp 12 Triple sugar iron Môi trường chuyển sang không sinh khí và không sinh H2S 13 Hydrogen sulphide - 14 Lysine decarboxylase + 15 Ornithine decarboxylase + 16 Lên men glucose + 17 Lên men sucrose + 18 Lên men sorbitol + 19 Lên men fructose - 20 Lên men xylose - 21 Lên men rhaminose - 22 Lên men lactose - 23 Lên men arabinose - 1.1.3.2 Đặc điểm phân bố Trong nước và đất: đã có 150 chủng Serratia được phân lập trong nước sông và Serratia marcescens chiếm 75%. Trong côn trùng: sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các loài côn trùng (Grimont và cộng sự, 1979) cho thấy Serratia marcescens chiếm ưu thế. Serratia marcescens được coi là một trong những tác nhân gây bênh tiềm năng đối với côn trùng, chúng làm côn trùng chết bằng cách gây ra sự nhiễm trùng huyết sau khi xâm nhập (Francine và Patrick, 2006). Hơn nữa, Serratia marcescens cũng được tìm thấy nhiều trong thực phẩm, nhất là trong tinh bột biến tính, vì đây là môi trường rất thuận lợi cho sự tăng trưởng của chúng (Singlton và Sainsbury, 2001). Gần đây, người ta ...cho sâu tơ phát triển 25 ± 2oC, và ẩm độ 70 ± 5%. Sâu tơ Plutella xylostella được thu mẫu từ vườn cải ngọt tại huyện hóc môn, Tp.HCM, sâu tơ ngoài đồng mang về nuôi được tính là sâu thế hệ P. 36 Đồ án tốt nghiệp Thế hệ P được nuôi trong hộp nhựa và cho ăn bằng lá cải ngọt cho tới khi hóa nhộng. Khi sâu vào giai đoạn hóa nhộng, lót khăn giấy trong hộp nhựa và cho ăn bằng lá cải ngọt cho tới khi 4 - 7 ngày hóa nhộng trong hộp. Sau khi vũ hóa, ngài thuộc thế hệ P được ghép cặp với nhau trong các hộp nhựa được lót lá cải ngọt và cung cấp thức ăn dưới dạng lỏng là nước đường pha loãng (tỉ lệ 1:10). Tiến hành kiểm tra thu trứng, thay thức ăn và vệ sinh hàng ngày. Thu lá cải ngọt khoảng 2 ngày 1 lần để thu trứng từ thế hệ P đã được ghép cặp. Tiếp tục cho lá cải ngọt mới vào hộp để tạo diều kiện cho ngài đẻ trứng. Sau 2 ngày, trứng nở ra sâu non F1, sâu non được nuôi với thức ăn là lá cải ngọt. Nhân nuôi sâu tơ Plutella xylostella cho đến khi đủ số lượng để tiến hành thí nghiệm. 2.6.2 Phương pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh 48 giờ trong chai có chứa 20 ml môi trường peptone glycerol broth vô trùng, với tỉ lệ cấy giống 1%. Nuôi ủ vi khuẩn ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút, tránh ánh sáng, trong 48 giờ. Sau khi tăng sinh 48 giờ, thu nhận toàn bộ dịch nuôi cấy và đem xử lí với acid HCl 1N. Với mục đích đưa môi trường về pH = 2, tiêu diệt tế bào vi khuẩn, dùng pipetman hút 450 휇푙 dung dịch acid HCl 1N cho vào chai dịch nuôi cấy lên men. Lắc 150 vòng / phút, ủ trong tối trong 4 giờ. Sau đó, đưa môi trường về pH = 7 với 450 휇푙 dung dịch NaOH 1N. (Lê Thị Ngọc Dung, 2016 Tạo chế phẩm diệt sâu khoang Spodoptera litura từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia mascescens SH1, Đồ án tốt nghiệp, trường Đại học Công nghệ TP. HCM) 2.6.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học 2.6.3.1 Phương pháp định tính enzyme Chuẩn bị dịch nuôi cấy vi khuẩn: Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh trong môi trường PG ở nhiệt độ phòng, ủ tối trong 48 giờ. Chuẩn bị dịch nuôi cấy vi khuẩn đã xử lí: 37 Đồ án tốt nghiệp Sau khi tăng sinh vi khuẩn trong môi trường PG broth vô trùng, dùng pipetman hút 450 휇푙 HCl 1N cho vào dịch nuôi cấy lên men, lắc 150 vòng/ phút, trong 4 giờ. Tiến hành thêm 450 휇푙 NaOH 1N để đưa dịch nuôi cấy về pH = 7. Hút 20 휇l Tween 80 vô trùng cho vào 10 ml dịch nuôi cấy đã được xử lý acid. Chuẩn bị Tween 80 0,02%: Hút 20 휇l Tween 80 cho vào lần lượt các dịch pha loãng với thể tích 10 ml. Thử nghiệm hoạt tính protease Pha môi trường casein agar, hấp 121oC trong 15 phút. Để môi trường nguội đến khoảng 65oC đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi trường, đường kính mỗi giếng thạch là 0,5 cm (d). Đối chứng dương: Dùng pipetman hút 20 휇푙 dịch nuôi cấy lên men vi khuẩn thử nghiệm cho vào giếng thạch. Ủ 24 giờ, tráng TCA 10%, đo đường kính vòng phân giải. Các thử nghiệm: Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau xử lí acid, dùng pippet thủy tinh 10ml, tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy lên men đã xử lí acid thành dãy các nồng độ pha loãng : 2, 4, 8, 16, 32 và 64. Dùng pipetman hút 20 휇푙 ở các nồng độ pha loãng cho vào 3 giếng thạch ở môi trường thử hoạt tính casein, như hình 2.3 Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần. ĐC Hình 2.2 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Casein 38 Đồ án tốt nghiệp Đọc kết quả: Sau thời gian ủ tối 24 giờ, tráng TCA 10% lên đĩa môi trường: Nếu dịch nuôi cấy có enzyme protease thì xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Nếu dịch nuôi cấy không có enzyme lipase thì không xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Khả năng phân giải casein được đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng lớn, khả năng giữ lại enzyme protease sau xử lí acid càng lớn. Trong đó : D: đường kính vòng phân giải (mm) d: đường kính giếng thạch (mm) Thử nghiệm hoạt tính enzyme Lipase Pha môi trường thử nghiệm hoạt tính lipase, hấp 1210C trong 15 phút. Để môi trường nguội đến khoảng 650C đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi trường, đường kính mỗi giếng thạch là 0,5 cm (d). Đối chứng dương: Hút 20 휇푙 sinh khối của chủng vi sinh vật thử nghiệm vào giữa đĩa petri môi trường thử nghiệm hoạt tính lipase. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Đo đường kính vòng tủa trên bề mặt môi trường. Các thử nghiệm: Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau xử lí acid, dùng pippet thủy tinh 10 ml, tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy lên men đã qua xử lí acid thành dãy các nồng độ pha loãng : 2, 4, 8, 16, 32 và 64. Dùng pipet man hút 20 휇푙 ở các nồng độ pha loãng cho vào 3 giếng thạch ở môi trường thử hoạt tính lipit, như hình 2.2 Thí nghiệm lặp lại 3 lần. 39 Đồ án tốt nghiệp Hình 2.3 Cách bố trí nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Lipit Đọc kết quả: Nếu dịch nuôi cấy có enzyme lipase thì xuất hiện vòng tủa xung quanh giếng thạch. Nếu dịch nuôi cấy không có enzyme lipase thì không xuất hiện vòng tủa xung quanh giếng thạch Khả năng phân giải lipit được đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng lớn, khả năng giữ lại enzyme lipit sau xử lí acid càng lớn. Trong đó : D: đường kính vòng phân giải (mm) d: đường kính giếng thạch (mm) Thử nghiệm hoạt tính Chitinase Pha môi trường thạch huyền phù chitin 1%, hấp 121oC trong 15 phút. Để môi trường nguội đến khoảng 65oC, đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi trường, đường kính mỗi giếng thạch là 0,5 cm (d). Đối chứng dương: Dùng pipetman hút 20 sinh khối của chủng vi sinh vật thử nghiệm vào đĩa petri môi trường thử nghiệm hoạt tính chitin. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Tráng lugol, đo đường kính vòng phân giải trên bề mặt môi trường. 40 Đồ án tốt nghiệp Các thử nghiệm: Canh trường vi khuẩn sau xử lí acid, dùng pippet thủy tinh 10 ml, tiến hành pha loãng canh trường lên men đã xử lí acid thành dãy các nồng độ phaloãng : 2, 4, 8, 16, 32 và 64. Dùng pipetman hút 20 ở các nồng độ pha loãng cho vào 3 giếng thạch ở môi trường thử hoạt tính lipit, như hình 2.4 Thí nghiệm lặp lại 3 lần. ĐC Hình 2.2 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Chitin Đ ọc kết quả: Sau thời gian ủ tối 24 giờ, tráng lugol lên đĩa môi trường: Nếu dịch nuôi cấy có enzyme chitinase thì xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Nếu dịch nuôi cấy không có enzyme chitinase thì không xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Khả năng phân giải chitin được đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng lớn, khả năng giữ lại enzyme chitinase sau xử lí acid càng lớn. Trong đó : D: đường kính vòng phân giải (mm) d: đường kính giếng thạch (mm) 41 Đồ án tốt nghiệp 2.6.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng kháng nấm Thí nghiệm được thực hiện bằng phương pháp đục giếng thạch dựa vào khả năng khuếch tán của các hợp chất có khả năng kháng khuẩn vào môi trường thạch. Phương pháp này được thực hiện như sau: Nấm thử nghiệm – Trichoderma sp., Paecilomyces sp., Aspergillus flavus CDP1, Fusarium sp. Pha môi trường PDA bổ sung thêm kháng sinh choramphenycol 0,25%, vô trùng que cấy thẳng, tiến hành cấy điểm nấm bệnh từ môi trường thạch nghiêng sang môi trường PDA có bổ sung kháng sinh, ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Sau đó, đục thạch có đường kính 5 mm cấy sinh khối nấm vào đĩa PDA không bổ sung kháng sinh. Nuôi ủ tơ nấm trong 7 ngày ở nhiệt độ phòng. Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh và xử lý acid như phương pháp định tính enzyme như mục 2.6.3.1. Tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy thành dãy các nồng độ pha loãng: 2, 4, 8, 16, 32 và 64. Tiến hành đo OD499 ở từng nồng độ pha loãng. Pha loãng dịch nuôi cấy đã xử lý acid thêm 20 휇푙 Tween 80 vô trùng vào 10 ml dịch. Chuẩn bị 10 ml môi trường PG vô trùng thêm 20 휇푙 Tween 80 vào các môi trường PG pha loãng vô trùng để đạt nồng độ Tween 80 0,02% ở dãy các nồng độ pha loãng: 2, 4, 8, 16, 32 và 64. Đối chứng âm : chuẩn bị 20 ml PG vô trùng đã bổ sung Tween 80 0,02%. Đối chứng dương : Chế phẩm Carbenzim hút 0,15 ml pha loãng với 100 ml nước cất vô trùng. Tiến hành kháng nấm: Chuẩn bị môi trường PDA vô trùng. Tiến hành đục giếng thạch 5mm. Vô trùng cây đục thạch và đục lấy khối thạch với đường kính 5mm có sinh khối nấm từ đĩa PDA phía trên và đặt vào trung tâm đĩa PDA như hình 2.3 Hút 20 휇l dịch nuôi cấy đã xử lí acid ở các nồng độ pha loãng cho vào giếng thạch. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng, từ 3 – 5 ngày. 42 Đồ án tốt nghiệp Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần. Nấm Hình 2.3 Bố trí các nghiệm thức kháng nấm trên đĩa thạch PDA Đọc kết quả thí nghiệm: Nếu xảy ra hiện tượng kháng nấm thì sự phát triển của nấm ở đĩa thí nghiệm sẽ bị ức chế và đường kính nấm ở đĩa thí nghiệm sẽ nhỏ hơn đường kính của nấm ở đĩa đối chứng Nếu không xảy ra hiện tượng kháng nấm thì sự phát triển của nấm ở đĩa thí nghiệm sẽ không bị ức chế, phát triển bình thường như nấm ở đĩa đối chứng. Tỷ lệ ức chế được đánh giá theo công thức sau (Pander và cộng sự, 1982)  Đo đường kính khuẩn lạc (cm) trong 3, 5 và 7 ngày sau cấy  Tỷ lệ (%) ức chế được tính theo công thức: 퐷−푋 U = x100 퐷 Trong đó:  U: % khuẩn lạc bị ức chế.  D: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức đối chứng.  X: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức xử lý thuốc. 43 Đồ án tốt nghiệp Trong đó: đường kính khuẩn lạc bằng đường kính sau khi đo trừ đi đường kính khối thạch Chỉ tiêu đánh giá ảnh hưởng của thuốc được đánh giá theo bốn cấp độ (Hassan, 1989):  Cấp 1: không ảnh hưởng (<50% )  Cấp 2: ảnh hưởng yếu (50 – 79%)  Cấp 3: ảnh hưởng vừa (80 – 90%) + Cấp 4: ảnh hưởng cao (>90%) 2.6.3.3 Khảo sát hiệu lực diệt sâu bằng phương pháp quét lá Sâu thí nghiệm – sâu tơ Plutela xylostella Sâu tơ đầu tuổi 3 được chọn ra 30 con, tiến hành cân trọng lượng cả 30 con rồi cho vào hộp có thể tích 950ml. Các hộp nuôi sâu đã được thanh trùng. Lặp lại 24 hộp Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh và xử lý acid như phương pháp định tính enzyme như mục 2.6.3.1. Tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy, pha loãng 25 lần với dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng PG vô trùng để OD 499 trong khoảng 0,924 chuẩn hóa dịch gốc xem như đây là dịch gốc. Tiến hành pha loãng thành dãy các nồng độ pha loãng: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6. Từ dịch gốc pha loãng 25 lần hút 2 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn đã xử lý acid pha loãng với 18 ml PG vô trùng. Hút 9 ml dịch pha loãng ở các nồng độ rồi tiến hành đo OD499 ở từng nồng độ pha loãng. Sau đó, hút 1 ml phụ gia có chứa Tween 80 0,02 % , rỉ đường 1%, dịch CMC 1% cho vào 9 ml dịch pha loãng còn lại. Tiến hành thí nghiệm. Phương pháp quét lá (Maureen và cộng sự, 2012) phương pháp này mô phỏng gần giống với các điều kiện phun thuốc trực tiếp ngoài đồng nhằm khảo sát khả năng diệt sâu qua đường tiêu hoá của hợp chất prodigiosin của chủng SH4. Lá cải ngọt được rửa sạch và để ráo nước, cắt với diện tích 15 × 10 (cm2). Hút 100 휇l dịch pha loãng lên lá, vô trùng que cấy để tiến hành trang đều dịch ở các nồng độ pha loãng lên lá cải ngọt. Sau đó cho lá vào hộp nuôi sâu. Theo dõi số lượng sâu 44 Đồ án tốt nghiệp chết và trọng lượng của sâu trong 5 ngày theo các mốc thời gian: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ. Thí nghiệm được bố trí như hình 2.6 Hình 2.6 Bố trí thử nghiệm chế diệt sâu tơ P. xylostella phẩm bằng phương pháp quét lá (Maureen và cộng sự, 2012). Ở hộp đối chứng âm: tiến hành cho sâu khoang ăn lá cải ngọt được trang đều 100 휇푙 PG vô trùng được bổ sung 450 휇푙 HCl 1N, 450 휇푙 NaOH 1N. Hút 1ml phụ gia chứa Tween 80 0,02%, rỉ đường 1%, dịch CMC 1% vào 9ml dịch trên. Ở hộp đối chứng dương: tiến hành cho sâu tơ ăn lá cải ngọt được trang đều 100 휇푙 thuốc trừ sâu Reasgant 3.6EC (abamectin) đã được pha loãng đạt nồng độ 7.5 ng/cm2. Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần Đọc kết quả kháng sâu: Dựa vào số lượng sâu tơ P. xylostella chết ở từng mốc thời gian để đánh giá hiệu quả diệt sâu của chế phẩm. Tính tỉ lệ sâu chết theo công thức Abbott (1925). 2.6.3.4 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên ấu trùng Artemia nauplii Ấu trùng thử nghiệm: Artemia nauplii. 45 Đồ án tốt nghiệp Trứng bào xác Artemia nauplii được ấp nở bằng nước biển có độ mặn 30‰, pH 7,5 – 8,5. Tỷ lệ trứng là 0,5g – 1g/ lít nước biển. Quá trình ấp nở trứng để nơi thoáng mát, có ánh sáng, nhiệt độ 26 – 300C sục khí liên tục. Trứng nở sau 20 - 35 giờ. Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh và xử lý acid như phương pháp định tính enzyme như mục 2.6.3.1. Tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy, pha loãng 25 lần với dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng PG vô trùng để OD 499 trong khoảng 0,924 chuẩn hóa dịch gốc xem như đây là dịch gốc. Tiến hành pha loãng thành dãy các nồng độ pha loãng: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6. Từ dịch gốc pha loãng 25 lần hút 2 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn đã xử lý acid pha loãng với 18 ml nước muối 30‰ vô trùng thành dãy nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6. Sau đó, hút 2 ml phụ gia có chứa Tween 80 0,02 % , rỉ đường 1%, dịch CMC 1% cho vào các dịch pha loãng trên. Tiến hành thí nghiệm Đếm chính xác 30 ấu trùng A.nauplii cho vào cốc nhựa đã kẻ vạch 20 ml đã chuẩn bị. Cho dịch pha loãng ở các nồng độ vào các cốc có chứa ấu trùng A.nauplii, tiếp tục cho các dịch pha loãng theo dãy các nồng độ. Cốc đối chứng âm : chuẩn bị 20 ml PG vô trùng có bổ sung 450 휇푙 HCl 1N, 450 휇푙 NaOH 1N. Hút 2 ml dịch PG có bổ sung 450 휇푙 HCl 1N, 450 휇푙 NaOH 1N cho vào 18 ml nước muối 30‰ vô trùng. Thêm 2 ml phụ gia vào dịch trên rồi cho vào cốc chứa 30 ấu trùng A.nauplii. Cốc đối chứng dương : hút 100 휇푙 thuốc trừ sâu Reasgant 3.6EC đã được pha loãng đạt nồng độ 7.5 ng/cm2 cho vào cốc chứa 30 ấu trùng A.nauplii. Định mức thể tích ở cốc đối chứng dương sao cho đạt cốc đạt 20 ml. Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần với thể tích thực của cốc là 20 ml. Đọc kết quả thử độc tính từ ấu trùng A.nauplii Đếm số lượng ấu trùng A.nauplii sống sau 4 giờ. Tính LC50, LC90 46 Đồ án tốt nghiệp 2.6.3.5 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên cải ngọt Brassica integrifolia Hạt cải ngọt - Brassica integrifolia Hạt cải ngọt Brassica integrifolia thời vụ quanh năm, chu kì sinh trưởng từ 32 - 35 ngày sau khi gieo độ sạch ≥ 98%, độ nảy mầm ≥85%, độ ẩm ≤10%. Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh và xử lý acid như phương pháp định tính enzyme như mục 2.6.3.1. Tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy, pha loãng 25 lần với dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng PG vô trùng để OD 499 trong khoảng 0,924 chuẩn hóa dịch gốc xem như đây là dịch gốc. Tiến hành pha loãng thành dãy các nồng độ pha loãng: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6. Từ dịch gốc pha loãng 25 lần hút 4 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn đã xử lý acid pha loãng với 36 ml nước cất vô trùng thành dãy nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10- 4, 10-5 và 10-6. Hút 4 ml phụ gia có chứa Tween 80 0,02 % , rỉ đường 1%, dịch CMC 1% vào các dịch pha loãng. Đối chứng âm : Chuẩn bị 40 ml PG vô trùng hút 900 휇푙 HCl 1N và 900 휇푙 NaOH 1N. Hút bỏ 4 ml PG dịch trên rồi thêm 4 ml phụ gia chứa Tween 80 0,02 % , rỉ đường 1%, dịch CMC 1%. Đối chứng dương: Hút 0,75 m푙 Reagants 3.6EC pha loãng vào 100ml nước cất vô trùng. Tiến hành thí nghiệm Đếm chính xác 40 hạt cải ngọt thương phẩm cho vào ống nghiệm. Hút 1 ml dịch pha các nồng độ thí nghiệm ngâm hạt cải trong 2 giờ, pha nước ấm với tỉ lệ nước 3 sôi : 2 lạnh ở 20 – 350C. Cân 1 kg đất trồng cho vào các hộp nhựa diện tích 15 x 21cm. Dùng thun chia hộp thành 3 lô với diện tích mỗi lô là 7 x 15 cm với mỗi lô gieo 40 hạt cải ngọt. Dùng giấy thấm khô hạt và gieo hạt đã ngâm vào các hộp đất đã chuẩn bị. Dùng bình xịt phun 1ml các nồng độ thí nghiệm khi cây ra lá sau 3 ngày ngâm. Phun chế phẩm định kì sau 3, 6, 9 ngày theo dõi. Chỉ phun 1 lần trong các ngày theo dõi. 47 Đồ án tốt nghiệp Quan sát cây, tưới nước 2 ngày một lần vào buổi sáng sớm và lúc chiều tối cho các nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức được lập lại 3 lần. Đọc kết quả thí nghiệm: Đếm số lượng hạt nảy mầm sau khi gieo. Tỉ lệ nảy mầm được tính theo công thức Tổng số hạt nảy mầm sau khi gieo ( ) × 100 Tổng số hạt ban đầu trước khi gieo Đọc kết quả thử độc tính ở cải ngọt sau 3 ngày phun. Tỉ lệ chết của cây được tính theo công thức Abbott (1925), theo dõi biểu hiện của cây sau khi phun chế phẩm. Nếu cây có biểu hiện ngộ độc như cháy, vàng lá, héo, chết cây thì ước lượng độ độc theo thang đánh giá như sau: Phân cấp mức độ độc của thuốc khảo nghiệm đối với cây trồng Cấp Triệu chứng nhiễm độc. 1 Cây chưa có biểu hiện ngộ độc. 2 Ngộ độc nhẹ, sinh trưởng của cây giảm nhẹ. 3 Có triệu chứng ngộ độc nhẹ nhìn thấy bằng mắt. 4 Triệu chứng ngộ độc như (mất diệp lục) nhưng chưa ảnh hưởng đến năng suất. 5 Cành lá biến màu hoặc cháy, thuốc gây ảnh hưởng đến năng suất. 6 Thuốc làm giảm năng suất ít. 7 Thuốc gây ảnh hưởng nhiều đến năng suất. 8 Triệu chứng ngộ độc tăng dần tới làm chết cây. 9 Cây bị chết hoàn toàn. QCVN 01 – 143 : 2013/BNNVPTNT 2.6.3.6 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên cá bảy màu Cá bảy màu - Poecilia reticulate 48 Đồ án tốt nghiệp Tuyển chọn cá mái, chiều dài 2,0 ± 1,0 cm, bơi nhanh linh hoạt, không bị dị tật ở vây, đuôi Chọn cá hoàn toàn khỏe mạnh sạch bệnh. Pha môi trường nước nuôi cá thử nghiệm theo tiêu chuẩn (ISO 6341 – 1982). Nước có độ cứng với tổng nồng độ ion Ca và Mg trong nước là 2,5mmol/l. Tỉ lệ Ca : Mg là 4 : 1 và ion Na : K là 10 : 1, chỉ số acid KS4.3 là 0,8mmol/l (Fish, Acute Toxicity Test, 1992). Thiết lập hệ thông bán tĩnh thay nước 2 ngày/lần, thay ¾ lượng nước. Tỉ lệ nước và trọng lượng cá là 25 g/lít. Chiếu sáng liên tục 12 giờ/ngày. Cá được nuôi trong môi trường nước thử nghiệm trong 7 ngày để cá thích nghi, nhiệt độ duy trì ở 21 - 250C, lượng oxi hòa tan ≥ 60%. Cá được cho ăn mỗi ngày 1 lần, khối lượng thức ăn được cho ăn bằng 1% trọng lượng cá thí nghiệm Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh và xử lý acid như phương pháp định tính enzyme như mục 2.6.3.1. Tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy, pha loãng 25 lần với dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng PG vô trùng để OD 499 trong khoảng 0,924 chuẩn hóa dịch gốc xem như đây là dịch gốc. Tiến hành pha loãng thành dãy các nồng độ pha loãng: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6. Từ dịch gốc pha loãng 25 lần hút 1 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn đã xử lý acid pha loãng với 9 ml PG vô trùng thành dãy nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5. Hút 1 ml phụ gia có chứa Tween 80 0,02 % , rỉ đường 1%, dịch CMC 1% vào các dịch pha loãng. Ở các nồng độ thí nghiệm pha loãng: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 hút 1,7 ml mẫu cho vào 10g thức ăn cho cá, tiếp tục cho 3 ml nước cất vô trùng vào hỗn hợp. Dùng thìa vô trùng tán mạnh, trộn đều hỗn hợp tới khi hỗn hợp hoàn toàn đồng nhất. Sấy mẩu thức ăn cho cá ở 450C trong 5 giờ. Đối chứng âm : Chuẩn bị 20 ml PG vô trùng hút 450 휇푙 HCl 1N và 450 휇푙 NaOH 1N. Hút 9 ml PG rồi thêm 1 ml phụ gia chứa Tween 80 0,02 % , rỉ đường 1%, dịch CMC 1%. Hút 1,7 ml đối chứng âm cho vào 10g thức ăn cho cá, tiếp tục cho 3 49 Đồ án tốt nghiệp ml nước cất vô trùng vào hỗn hợp. Dùng thìa vô trùng tán mạnh, trộn đều hỗn hợp tới khi hỗn hợp hoàn toàn đồng nhất. Sấy mẩu thức ăn cho cá ở 450C trong 5 giờ. Tiến hành thí nghiệm Thiết lập hệ thống thử nghiệm bán tĩnh, thay nước 2 ngày/lần, thay ¾ lượng nước thí nghiệm cá. Tỉ lệ nước và trọng lượng cá là 25 g/lít. Chiếu sáng liên tục 12 giờ/ngày. Đếm chính xác 10 con cá bảy màu mái, tuyển chọn cá không dị tật ở vây, đuôi, mang Cá có chiều dài 2,0 ± 1,0 cm cho vào các hộp chứa nước thử nghiệm chuẩn bị sẳn. Sục khí liên tục tạo lượng oxi hòa tan trong nước ≥ 60%. Nhiệt độ thích hợp thử nghiệm cho cá trong khoảng 21 - 250C Cá được cho ăn mỗi ngày 1 lần, khối lượng thức ăn được cho ăn bằng 1% trọng lượng cá thí nghiệm. Theo dõi cá thí nghiệm theo các mốc thời gian 24, 48, 72, 96 và 120 giờ. Mỗi nghiệm thức lập lại 2 lần. Đọc kết quả thí nghiệm : Đọc kết quả thử nghiệm độc tính của chế phẩm trên cá sau 5 ngày theo dõi. Tỉ lệ chết của cá thử nghiệm được tính theo công thức Abbott (1925). Theo dõi biểu hiện của cá sau khi ăn thức ăn có chế phẩm theo dãy nồng độ thí nghiệm. Quan sát tất cả biểu hiện trên cơ thể cá, dị tật, hành vi bơi. 50 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 3.1 Khả năng tiết enzyme ngoại bào Ngoài prodigiosin là tác nhân gây chết côn trùng thì enzyme Serralysin metalloprotease cũng được coi là yếu tố độc lực của S. marcescens trên sâu vì vậy dịch nuôi cấy phải thể hiện hoạt tính này. Thử nghiệm hoạt tính protease Sau quá trình ủ, khả năng phân giải casein của vi sinh vật bằng trichloroacetic acid (TCA). Casein sẽ tác dụng với TCA tạo thành phức hợp tủa có màu trắng đục do enzyme protease có mặt trong canh trường lên men vi khuẩn, enzyme này phân giải casein trong môi trường nên TCA tạo phức với casein.Vùng có sự phân giải casein sẽ trong suốt vì không có phức hợp tủa giữa casein với TCA 10% Kết quả khi tiến hành trên môi trường casein thì tất cả các nồng độ đều có khả năng phân giải casein. Xung quanh vòng phân giải là phức hợp TCA 10% – casein trắng đục dễ dàng nhận thấy. Thử nghiệm hoạt tính Chitinase Tiến hành thí nghiệm trên môi trường huyền phù Chitin 1%, kết quả cho thấy khi hạ pH môi trường về pH 2 để diệt tế bào vi khuẩn đã làm ảnh hưởng đến enzyme chitinase, làm enzyme này bị bất hoạt hoặc biến tính, mất khả năng phân giải chitin trong môi trường. Thử nghiệm hoạt tính lipase Enzyme lipase xúc tác thủy phân các cầu nối ether của triacylglycerol để tạo ra glycerol acid béo. Có thể dễ dàng phát hiện enzyme lipase của vi sinh vật trên môi trường đĩa thạch chứa tween 80 và CaCl2. Lipase sẽ thủy phân tween 80 trong môi trường tạo ra các acid béo, các acid béo được giải phóng sẽ kết tủa với muối calcium trong môi trường. Phức hợp acid béo – calcium sẽ làm đục môi trường xung quanh điểm cấy. Kết quả khi tiến hành thử nghiệm hoạt tính lipase không có thấy sự hiện diện của enzyme lipase của các chủng vi sinh vật thử nghiệm. 51 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1 các enzyme ngoại bào trong canh trường lên men sau xử lí acid. Đường kính vòng phân giải (D-d) mm trên môi Hệ số pha Stt trường tương ứng loãng Casein agar Tween 80 agar Chitin agar 1 21 12 ± 0,1b 0 0 2 22 11,3 ± 0,1b 0 0 3 23 11,3 ± 0,6b 0 0 4 24 10 ± 0,1bc 0 0 5 25 10,0 ± 0,2bc 0 0 6 26 7,3 ± 0,6c 0 0 Sau khi tiến hành thí nghiệm khảo sát định tính các enzyme ngoại bào gồm: lipase, protease và chitinase. Kết quả cho thấy việc hạ đột ngột pH môi trường từ trung tính (pH 7) về acid pH 2 không gây ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme protease. Enzyme chitinase và lipase của vi khuẩn bị bất hoạt. Tóm lại, enzyme ngoại bào là protease đã giữ được hoạt tính trong suốt quá trình xử lí acid HCl 1N. 3.2 Hoạt tính kháng nấm Nấm Aspergillus flavus CDP1 và nấm Fusarium sp được xem là loài nấm gây bệnh, sinh ra độc tố gây hại cho cây trồng. Vì vậy thử nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm bệnh để đánh giá khả năng kháng nấm của dịch nuôi cấy vi khuẩn sau xử lý acid. Bảng 3.2 Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus flavus CDP1 Khả năng kháng nấm Aspergillus flavus CDP1 Nghiệm thức pha loãng Đường kính vòng nấm (mm) Tỉ lệ ức chế (%) 21 30,0 ± 2,6 17,1 ± 2,8bc 22 29,6 ± 4,1 10,8 ± 4,8cd 23 28,0 ± 1,0 19,0 ± 1,6bc 24 28,0 ± 3,6 19,0 ± 10,0bc 25 27,3 ± 2,5 24,4 ± 3,6b 52 Đồ án tốt nghiệp 26 28,6 ± 1,5 18,4 ± 4,3bc Đối chứng 31,0 ± 4,0 0 Carbenzim 0 100a Bảng 3.3 Tỉ lệ ức chế nấm Fusarium sp. Khả năng kháng nấm Fusarium sp. Nghiệm thức pha loãng Đường kính vòng nấm (mm) Tỉ lệ ức chế (%) 21 25 ± 0,2 26,6 ± 3,3bc 22 25,6 ± 1,5 25,1 ± 2,0bc 23 29,0 ± 2,6 19,0 ± 5,9c 24 25,6 ± 6,6 29,8 ± 2,7b 25 28,3 ± 1,1 19,7 ± 3,1c 26 26,6 ± 0,6 24,1 ± 1,5bc Đối chứng 32,6 ± 2,5 0 Carbenzim 0 100a Dựa trên chỉ tiêu đánh giá ảnh hưởng của thuốc được đánh giá theo bốn cấp độ (Hassan, 1989) thì tỉ lệ kháng nấm của dịch nuôi cấy sau xử lý acid với nấm Aspergillus flavus CDP1 cao nhất ở hệ số pha loãng 25 là 24,4 ± 3,6b (%) ≤ 50 (%) ở cấp độ 1 được xem là không kháng. Tương tự với nấm Fusarium sp. 29,8 ± 2,7b (%) ≤ 50 (%) ở cấp độ 1 được xem là không kháng. Ở thí nghiệm kháng nấm Trichoderma sp. cho thấy enzyme protease vốn có của vi khuẩn trong dịch nuôi cấy đã xử lí, vẫn còn khả năng ức chế việc phát tiển của tơ nấm Trichoderma sp. nhưng không cao. Điều này chứng tỏ chế phẩm từ dịch nuôi cấy vi khuẩn S. marcescens có thể được sử dụng đồng thời cùng chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma sp., nấm có lợi trong việc hổ trợ sự phát triển của cây trồng và tăng khả năng diệt trừ các loại côn trùng gây hại, cạnh tranh với các loại nấm gây hại cây trồng. Tuy nhiên chế phẩm này có thể ức chế nấm Pacelopmyces sp. ở nồng độ pha loãng 24 với tỷ lệ kháng là 34,8 ± 11,5 %. 53 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4 Tỉ lệ ức chế nấm Trichoderma sp. Khả năng kháng nấm Trichoderma sp. Nghiệm thức pha loãng Đường kính vòng nấm (mm) Tỉ lệ ức chế (%) 21 69,6 ± 0,5b 9,5 ± 0,7bc 22 73,6 ± 3,5b 4,3 ± 4,6bc 23 73,6 ± 3,0b 4,3 ± 3,9bc 24 62,6 ± 10,6a 18,6 ± 13,8b 25 70,3 ± 0,5ab 8,6 ± 0,7bc 26 68,3 ± 2,5ab 11,2 ± 3,2bc Đối chứng 73,6 ± 3,0b 0 Carbenzim 0 100 Bảng 3.5 Tỉ lệ ức chế nấm Paecilomyces sp. Khả năng kháng nấm Paecilomyces sp. Nghiệm thức pha loãng Đường kính vòng nấm (mm) Tỉ lệ ức chế (%) 21 20,0 ± 1,0 13,0 ± 4,3cd 22 20,3 ± 0,5 11,6 ± 2,5cd 23 15,3 ± 3,2 33,3± 14,0bc 24 15,0 ± 2,6 34,8 ±11,5b 25 16,0 ± 2,6 28,3 ± 7,8bc 26 20,3 ± 2,5 17,4 ± 19,2bcd Đối chứng 23,0 ± 0,4 0 Carbenzim 0 100a Kết quả thí nghiệm cho thấy tỉ lệ ức chế nấm Paecilomyces sp. cao nhất ở hệ số pha loãng 24 là 34,8 ± 11,5 (%), với đường kính vòng nấm 15,0 ± 2,6 (mm) Dựa trên chỉ tiêu đánh giá ảnh hưởng của thuốc được đánh giá theo bốn cấp độ (Hassan, 1989) thì tỉ lệ kháng nấm của dịch nuôi cấy sau xử lý acid với nấm 54 Đồ án tốt nghiệp Trichoderma sp. cao nhất ở hệ số pha loãng 24 là 18,6 ± 13,8 (%) ≤ 50 (%) ở cấp độ 1 được xem là không kháng. Tương tự với nấm Paecilomyces sp. dịch nuôi cấy sau xử lý acid kháng nấm ở hệ số pha loãng 24 là 34,8 ± 11,8 ≤ 50 (%) ở cấp độ 1 là không kháng. 3.3 Hiệu lực diệt sâu từ chế phẩm Thí nghiệm hiệu lực diệt sâu được thực hiện bằng phương pháp quét lá với các nồng độ theo hệ số pha loãng để xác định giá trị nồng độ nào diệt sâu tốt nhất. Tiến hành thử nghiệm với 1 đối chứng dương là thuốc trừ sâu sinh học Reasgant 3.6EC và 1 đối chứng âm là môi trường PG broth vô trùng có bổ sung Tween 80 0,02%, rỉ đường 1 % và CMC 1 % , cùng 6 nghiệm thức chế phẩm ở nồng độ pha loãng là 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6 , theo dõi số lượng sâu chết mỗi 24 tiếng trong vòng 6 ngày. Ngoài hoạt chất diệt sâu là prodigiosin thì chế phẩm được bổng sung phụ gia trong đó có rỉ đường, CMC và Tween 80 giúp nâng cao khả năng kháng sâu tơ. Bổ sung CMC 1% giúp tăng độ kết bám của chế phẩm lên trên lá, giảm thất thoát prodigiosin. Bên cạnh đó, rỉ đường kích thích khẩu vị của sâu giúp sâu ăn ngon miệng nên sâu ăn nhiều hấp thu lượng prodigiosin lớn trên bề mặt lá. Đồng thời rỉ đường còn là chất che giúp bảo vệ prodigiosin dưới tác dộng của ánh sáng, đây là một trong những nguyên nhân hàng đầu dễ gây biến tính prodigion ngoài tự nhiên. Khi sâu tơ tiêu hóa chế phẩm, lượng Tween 80 bổ sung vào trong chế phẩm giúp prodigiosin khuếch tán tốt vào cơ thể sâu, ngoài ra còn có các enzyme ngoại bào như protease, lipase giúp cho hoạt chất prodigiosin hoạt động tốt và gây chết sâu nhanh hơn. 55 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.5 Tỉ lệ chết của sâu tơ tuổi 3. Tỉ lệ chết (%) Nồng độ pha loãng 0h 24h 48h 72h 96h 120h Đối chứng âm 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 10-1 0,0 18,9 51,1 61,8 69,3 83,7 10-2 0,0 22.2 60,0 60,0 84,1 91,9 10-3 0,0 26,7 52,2 73,0 85,2 95,3 10-4 0,0 48,9 70,0 86,5 100,0 100,0 10-5 0,0 27,8 55,6 73,0 85,2 91,9 10-6 0,0 55,6 73,3 78,7 86,4 91,9 Reagant 3.6 EC 0,0 43,3 78,9 88,8 100,0 100,0 KHẢ NĂNG DIỆT SÂU CỦA CHẾ PHẨM 120,0 100,0 80,0 60,0 Reagants 3.6 EC 7,5 ng/cm2 2607,89 ng/cm2 40,0 1491,34 ng/cm2 149,13 ng/cm2 TỈ LỆ CHẾT (%) TỈCHẾT LỆ 14,91 ng/cm2 20,0 1,49 ng/cm2 0,15 ng/cm2 Đối chứng âm 0 ng/cm2 0,0 0 24 48 72 96 120 THỜI GIAN (GIỜ) Hình 3.1 Hiệu lực diệt sâu tơ P.xylostella của chế phẩm từ dịch nuôi cấy vi khuẩn S.mascescens SH4 theo thời gian (Abbott 1925). 56 Đồ án tốt nghiệp Kết quả cho thấy, hệ số pha loãng 10-4 có nồng độ prodigiosin 14.91 ng/cm2 cho kết quả kháng sâu là tốt nhất, kết quả này tương tự như kết quả của Lê Thị Ngọc Dung (2016). Tương đương với khả năng diệt sâu của thuốc trừ sâu sinh học Reasgant. Trong 24 giờ đầu, so với thuốc trừ sâu Reasgant chỉ đạt 43,3%, tỉ lệ chết của sâu tơ đạt giá trị 48,9% ở nồng độ pha loãng 10-4, cao gấp 1,13 lần đối chứng Reasgant. Song hiệu lực cao nhất trong 24 giờ đầu lại là nồng độ pha loãng 10-6 cao gấp 1,28 lần đối chứng Reasgant. Xuyên suốt quá trình theo dõi tỉ lệ chết của sâu tơ theo thời gian thì nồng độ pha loãng 10-4 đã chứng tỏ hiệu lực diệt sâu cao tương đương đối chứng dương (Reasgant). Sau 3 ngày, tỉ lệ sâu chết đã đạt 100% cho kết quả tương đương với đối chứng Reasgant 3.6EC. Điều đó cũng khẳng định rằng nồng độ pha loãng 10-4 thích hợp cho việc chọn làm nó làm thông số kĩ thuật khi sản xuất chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học từ dịch nuôi cấy vi khu...tế bào hoàn toàn vì lý do an toàn sinh học. Điều chỉnh dịch nuôi cấy sau xử lý acid ở OD 499 vào khoảng 0,924, tiến hành pha loãng 10 lần rồi phối trộn với phụ gia. 63 Đồ án tốt nghiệp Chế phẩm thu được có khối lượng là 1500g khi sử dụng cần pha loãng 100 lần để nồng độ prodigiosin đạt hiệu lực diệt sâu cực đại (14,9 ng/cm2) và tỉ lệ các thành phần Tween 80 0,02 % , rỉ đường 1%, dịch CMC 1%. 64 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.Kết luận Dịch nuôi cấy vi khuẩn S. marcescens đã xử lí acid vẫn thể hiện hoạt tính protease, một trong những yếu tố độc lực của vi khuẩn S. marcescens. Dịch nuôi cấy từ vi khuẩn đã xử lý acid đều không có khả năng kháng tất cả các chủng nấm khảo sát: dịch có khả năng kháng cao nhất là 34,8 % đối với nấm Pacelopmyces sp., thấp nhất là 18,6 % đối với Trichoderma sp., chứng tỏ có thể sử dụng dịch nuôi cấy vi khuẩn S. marcescens SH4 có thể được sử dụng đồng thời cùng chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma sp. và Pacelopmyces sp. Hiệu quả diệt sâu của dịch nuôi cấy vi khuẩn S. marcescens SH4 xử lý acid có bổ sung phụ gia rỉ đường 0,02 % Tween 80 0,004 %và CMC 0,02 % và chế phẩm sinh học diệt sâu tốt nhất ở nồng độ pha loãng 104 dịch nuôi cấy OD 499 = 0,924 có nồng độ prodigiosin 14,9 ng/cm2 . Sau 3 ngày, tỉ lệ sâu chết đã đạt 100 % cho kết quả tương đương với đối chứng Reasgant 3.6EC. Kết quả thử nghiệm trên A. nauplii cho thấy tỉ lệ chết cao nhất ở nồng độ đậm đặc pha loãng 10 lần dịch nuôi cấy OD 499 = 0,924 tuy nhiên nồng độ thích hợp diệt sâu ở độ pha loãng 10-4 cho tỉ lệ ấu trùng chết khá thấp so với đối chứng dương là Reagants 3.6EC Khi xử lý hạt giống bằng chế phẩm từ dịch vi khuẩn đã qua xử lý cho thấy không ảnh hưởng đến khả năng nảy mầm của hạt giống và ảnh hưởng đến sự phát triển của cây. Các nghiệm thức ở các nồng độ theo dõi theo hầu hết cho tỉ lệ chết ở cây non, cao nhất là (10,83 ± 3,81) % ở nồng độ pha loãng 10 lần dịch nuôi cấy OD 499 = 0,924 sau 3 ngày phun chế phẩm. Kết quả thử nghiệm cá cho thấy Khảo sát độc tính trên cá cho tỉ lệ chết không cao ở hệ số pha loãng 10-4 và 10-3 với tỉ lệ chết ko quá 10% trên số cá thí nghiệm. Prodigiosin là hợp chất thứ cấp không tan nên khó có khả năng gây ô nghiễm môi trường. 65 Đồ án tốt nghiệp 2. Kiến nghị - Khảo sát độc tính trên chuột thí nghiệm, thiên địch của sâu như: ong kí sinh, bọ rùa - Khảo sát thời gian và hiệu lực bảo quản của chế phẩm để bảo quản chế phẩm lâu dài. - Thay đổi thành phần phụ gia nâng cao hoạt tính của chế phẩm. - Mở rộng phổ ký chủ cho chế phẩm sinh học diệt sâu: sâu xám, sâu xanh, sâu cuốn lá - Mở rộng thí nghiệm trên qui mô lớn, thí nghiệm trên đồng ruộng. 66 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Thị Ngọc Dung (2016) Tạo chế phẩm diệt sâu khoang Spodoptera litura từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens SH1, đồ án tốt nghiệp, trường Đại học Công nghệ TP.HCM. Nguyễn Hoài Hương, Nguyễn Hoàng Anh Kha(2015) Khả năng diệt sâu khoang Spodoptera litura của vi khuẩn Serratia marcescens phân lập từ tuyến trùng EPN và hợp chất thứ cấp prodigiosin của vi khuẩn này, Tạp chí phát triển KH & CN, tập 18. Nguyễn Hoàng Anh Kha (2013) Thu nhận sắc tố màu đỏ dạng prodigiosin tổng hợp bởi vi khuẩn phân lập từ tuyến trùng EPN, Đồ án tốt nghiệp, trường Đại học Công nghệ TP. HCM. Trần Văn Mão (2002). Sử dụng côn trùng và vi sinh vật có ích. Tập II. Hà Nội: Nhà xuất bản Nông Nghiệp. Tài liệu nước ngoài Anuradha V Giri et al (2004), A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil, BMC Microbiology 2004, 4:11. Anita Khanafari, Mahnaz Mazaheri Assadi and Fatemeh Ahmadi Fakhr (2006), Review of Prodigiosin, Pigmentation in Serratia marcescens, Online Journal of Biological Sciences 6 (1): 1-13, 2006. Cang S., Sanada M., Johdo O., Ohta S., Nagamatsu Y., Yoshimoto A. (2000). High production of prodigiosin by Serratia marcescens grown on ethanol, Biotechnol Lett, 22: 1761-1765. Chidambaram Kulandaisamy et al (2009), An Insightful Overview on Microbial Pigment, Prodigiosin, Electronic Journal of Biology, 2009, Vol. 5(3): 49-61. Giri, A. V., Anandkumar, N., Muthukumaran, G. and Pennathur, G. (2004). A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil. BMC Microbiology 4: 1- 10. 67 Đồ án tốt nghiệp Grimont, P.A.D., Grimont, F., Irino, K.1982a. Biochemical characterization of Serratia liquefaciens sensu stricto, Serratia proteamaculans, and Serratia grimesiisp. nov.Current Microbiology 7:69–74. Grimont, P.A.D., Grimont, F., Lysenko, O. 1979b. Species and biotype identification of Serratiastrainsassociated with insects.Current Microbiology 2:139– 142. Grimont, P.A.D., Grimont, F., Richard, C., Davis, B.R., Steigerwalt, A.G., Brenner, D.J. 1978a. Deoxyribonucleic acid relatedness between Serratia plymuthica and other Serratia specieswith a description of Serratia odorifera sp. Hejazi, A. and Falkiner, F. R. (1997). Serratia marcescens. Journal of Medical Microbiology 46, 903-912. Hubbard, R. and Rimington, C. (1950). The biosynthesis of prodigiosin, the, tripyrrylmethene pigment from Bacillus prodigiosus (Serratia marcescens). Biochemical Journal 46: 220-225. Helvia W. Casullo de Araújo, K. Fukushima, and Galba M. Campos Takaki (2010), Prodigiosin Production by Serratia marcescens UCP 1549 Using RenewableResources as a Low Cost Substrate, Molecules 2010, 15, 6931-6940. Hyung Wook Jeong, Hye Yeon Mun, Hyung Keun Oh, Seung Bum Kim, Kwang Yeol Yang, Iksoo Kim, and Hyang Burm Lee, Evalutation Evaluation of Insecticidal Activity of a Bacterial Strain, Serratia sp. EML-SE1 against Diamondback Moth, 2010, Vol. 48, No. 4, pp. 541-545 Jatala, P.1986. Biological control of plant parasitic nematodes. - Ann.Rev.Phytopath. 24: 453-489. Kamble K.D, Hiwarale V.D (2012), Prodigiosin production from Serratia marcescens strains obtained from farm soil, INTERNATIONAL JOURNAL OF ENVIRONMENTAL SCIENCES Volume 3, No 1, 2012. Khanafari A., Assadi M.M. and Fakhr F.A. (2006). Review of prodigiosin, pigmentation in Serratia marcescens, Online J Biol Sci, 6: 1-13. 68 Đồ án tốt nghiệp Kenichi Ishii, Tatsuo Adachi, Takashi Hara, Hiroshi Hamamoto, Kazuhisa Sekimizu (2014), Identification of a Serratia marcescens virulence factor that promotes hemolymph bleeding in the silkworm, Bombyx mori, Journal of Invertebrate Pathology 117 (2014) 61–67. Krishna J.G. (2008) Pigment production by marine Serratia sp. BTWJ8, PhD dissertation, Microbial Technology Laboratory, Department of Biotechnology Cochin University of Science and Technology, Kerala, India. Lapenda Lins et al (2014), Production and toxicological evaluation of Prodigiosin from Serratia marcescens UCP/WFCC1549 on Mannitol Solid Medium, International Journal of Applied Research in Natural Products, Vol. 7 (2), pp. 32-38. Lewis S.M., Corpe W.A. (1964). Prodigiosin producing bacteria from marine sources, Appl Microbiol, 12: 13-17. Mekhael, R., Yousif, S. Y. (2009). The role of red pigment produced by Serratia marcescens as antibacterial and plasmid curing agent. Journal of Duhok University12: 268-274. OECD GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS, Fish Acute Toxicity Test 203, 1992. Qadri S.M.H. and Williams R.P. (1972). Induction of Prodigiosin Biosynthesis after Shift-Down in Temperature of Nonproliferating Cells of Serratia marcescens, Appl. Microbiol, 23: 704-709. Ramina M. và Samira Y.Y. (2009). The role of red pigment produced by Serratia marcescens as antibacterial and plasmid curing agent, University of Duhok, vol 12: 268- 274. SamsonR. A. (1974) Paecilomyces and some allied Hyphomycetes, Studies in Mycology, 1 –199. Vijayalakshmi et al (2016), Production of Prodigiosin from Serratia marcescens and its antioxidant and anticancer potential, International Journal of Advanced Research in Biological Sciences Volume 3, Issue 3 – 2016, 3(3): 75 – 88. 69 Đồ án tốt nghiệp Zong Qi Liang , Yan Feng Han, Hua Li Chu and Ai Ying Liu (2005).Studies on the genus Paecilomyces in China. 70 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A. THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƯỜNG Môi trường Peptone glycerone agar Peptone 5,00 gram/lít Glycerone 10,00 ml/lít Agar 18,00 gram/lít Môi trường Peptone glycerone broth Peptone 5,00 gram/lít Glycerone 10,00 ml/lít Môi trường Potato dextro agar Khoai tây 200,00 gram/lít Glucose 20,00 ml/lít Agar 20,00 gram/lít Môi trường thử nghiệm hoạt tính lipase (gram/lit) Glucose 1,00 Yeast extract 3,6 Tween 80 30,00 ml NH4Cl 5,00 K2HPO4 0,10 MgCl2 0,01 CaCl2 0.444 pH cuối ở 250C là 7,0 ± 0,2 Thành phần môi trường casein (gram/lít) Casein 10,00 Agar 15,00 Thành phần môi trường thạch huyền phù chitin Dịch huyền phù chitin 1% 100ml Agar 1,50g Chuẩn bị dịch huyền phú chitin 1% theo phương pháp của Dai et al., (2011) 71 Đồ án tốt nghiệp Do đặc tính của chitin không tan trong nước nên để tiến hành xác định hoạt tính của enzyme chitinase cần huyền phù chitin. Lấy 1g chitin hòa tan trong 20ml HCl đậm đặc đặc khuấy đều và để ở 40C qua đêm. Thêm vào hỗn hợp 200ml ethanol lạnh (-100C) khuấy đều thật nhanh và ủ qua đêm. Dịch huyền phù được thu lại bằng cách lọc hoặc ly tâm (4000 vòng/phút trong 20 phút). Huyền phù này được được rửa với nước cất nhiều lần cho đến khi pH trung tính. Thêm vào tủa nước cất cho đến thể tích 100ml. Sau đó bảo quản lạnh dịch huyền phù. Thức ăn cho cá được sản xuất tại công ty Cao Quý 2 số 122/5A ấp 5 xã Xuân Thới Thượng, Hóc Môn. Thành phần dinh dưỡng Phần trăm (%) Protein 38 Chất béo 5 Chất tro 10 Chất xơ 4 Thành phần khác 43 Thành phần môi trường nước trong 1 lít nước nuôi cá thử nghiệm độc tính: Dung dịch stock Caxi (gram/lít) CaCl2.2H20 11,76 g Nước cất 1 lít Dung dịch stock Magie (gram/lít) MgSO4.7H20 4,93 g Nước cất 1 lít Dung dịch stock Natri (gram/lít) NaHCO3 2,59 g 72 Đồ án tốt nghiệp Nước cất 1 lít Dung dịch stock Kali (gram/lít) KCl 0,23 g Nước cất 1 lít Với mối dung dịch stock muối tan, hút 25 ml của từng dung dịch stock định mức tới 1000 ml nước không có khoáng. Sao cho tổng nồng độ ion Ca : Mg trong nước là 2,5mmol/l. Tỉ lệ Ca : Mg là 4 : 1 và ion Na : K là 10 : 1, chỉ số acid KS4.3 là 0,8mmol/l theo tiêu chuẩn ISO 6341-1982 (Fish, Acute Toxicity Test, 1992). 73 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: HÌNH ẢNH A1 A2 A3 Khả năng phân giải enzyme Protease A4 A5 A6 Hình 1.1: Khả năng phân giải Protein. A1 , A2, A3, A4, A5, A6: Khả năng phân giải Casein theo nồng độ pha loãng: 21, 22, 23, 24, 25, 26 B1 B2 B3 B4 B5 B6 Hình 1.2: Khả năng phân giải chitin. B1, B2, B3, B4, B5, B6: Khả năng phân giải Chitinase theo nồng độ pha loãng tương ứng: 21, 22, 23, 24, 25, 26 74 Đồ án tốt nghiệp C1 C2 C3 C4 C5 C6 Hình 1.3: Khả năng phân giải lipit của enzyme lipase B1, B2, B3, B4, B5, B6: Khả năng phân giải Chitinase theo nồng độ pha loãng tương ứng: 21, 22, 23, 24, 25, 26 75 Đồ án tốt nghiệp C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 Hình 2.1: Khả năng kháng nấm Trichoderma sp. của canh trường đã xử lí acid. 1 2 3 4 5 6 C1, C2, C3, C4, C5, C6: Tương ứng với các nồng độ pha loãng 2 , 2 , 2 , 2 , 2 , 2 C7, C8: đối chứng âm, đối chứng dương Carbenzim. 76 Đồ án tốt nghiệp D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 Hình 2.2: Khả năng kháng nấm Paecilomyces sp. của canh trường đã xử lí acid. 1 2 3 4 5 6 D1, D2, D3, D4, D5, D6: Tương ứng với các nồng độ pha loãng: 2 , 2 , 2 , 2 , 2 , 2 D7, D8: Đối chứng âm, đối chứng dương Carbenzim 77 Đồ án tốt nghiệp E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 Hình 2.3: Khả năng kháng nấm Aspergillus flavus CDP1 của canh trường đã xử lí acid. 1 2 3 4 5 6 E1, E2, E3, E4, E5, E6: Kháng nấm theo nồng độ pha loãng 2 , 2 , 2 , 2 , 2 , 2 E7, E8: Đối chứng âm, đối chứng dương Carbenzim 78 Đồ án tốt nghiệp F1 F2 F3 F4 F5 F6 Khả năng kháng nấm Fusarium của canh trường đã xử lí acid C5 C6 C4 F7 F8 C7 C8 Hình 2.4: Khả năng kháng nấm Fusarium sp. của canh trường đã xử lí acid. 1 2 3 4 5 6 F1, F2, F3, F4, F5, F6: Kháng nấm theo nồng độ pha loãng 2 , 2 , 2 , 2 , 2 , 2 F7, F8: Đối chứng âm, đối chứng dương Carbenzim 79 Đồ án tốt nghiệp G1 G2 Hình 3.1 : Sâu tơ Plutella xylostella ở tuổi 3 G1: sâu tở ở tuổi 3 G2: sâu tơ ăn chế phẩm sau 3 ngày G3 G4 Hình 3.2 : Nhộng chết sau khăn chế phẩm 4 ngày. G3: Nhộng chết chuyển màu nâu đen ở nồng độ pha loãng 106 G4: Nhộng chết hóa đỏ tím ở nồng độ pha loãng 105 80 Đồ án tốt nghiệp G1 G1 Hình 3.3 : Sâu sau khi ăn lá có quét chế phẩm hóa nhộng chết chuyển sang màu đỏ đến đỏ nâu. G3 G4 Hình 3.4. Bướm sâu khi vũ hóa bị dị tật ở cá bộ phận như: cánh, chân, bụng, cánh biến dạng mất khả năng bay. 81 Đồ án tốt nghiệp Hình 4.1: Ấu trùng khi bổ sung chế phẩm với các nồng độ tương ứng Hình 5.1: Nồng độ pha loãng của chế phẩm thử nghiệm trên cây 82 Đồ án tốt nghiệp H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 Hình 5.2 : Cây sau khi phun lần 3 sau 9 ngày thử nghiệm. -1 -2 -3 H1, H2, H3, H4, H5, H6: Phun chế phẩm ở nồng độ pha loãng tương ứng: 10 , 10 , 10 , 10-4, 10-5, 10-6 H7, H8: phun nước, phun thuốc trừ sâu sinh học Reasgant 83 Đồ án tốt nghiệp Hình 6.1 : Cá chết sau 3 ngày cho ăn thức ăn có phối trộn chế phẩm. I1 I2 84 Đồ án tốt nghiệp I4 I3 I5 I6 Hình 6.2: Khảo sát độc tính trên cá bảy màu sau 5 ngày thử nghiệm. -1 -2 -3 -4 -5 I1, I2, I3, I4, I5: nồng độ pha loãng tương ứng: 10 , 10 , 10 , 10 , 10 . I6: Đối chứng âm PG 85 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C: BIỂU ĐỒ y = 0,0029x + 0,0071 Đường chuẩn Prodigiosin R² = 0,984 0,030 0,025 0,020 0,015 mg/ml 0,010 0,005 0,000 0,000 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000 6,000 7,000 OD 499 Biểu đồ 1: Đường chuẩn prodigiosin, OD 499nm Tỉ lệ kháng nấm Aspergillus flavus CDP1 a 100 90 80 70 60 50 40 b b Tỉ lệ lệ Tỉ kháng (%) 30 b b b 20 c 10 d 0 2 lan 4 lan 8 lan 16 lan 32 lan 64 lan Đối chứng Carbenzim âm Biểu đồ 1: Tỉ lệ kháng nấm Aspergillus flavus CDP1của dịch nuôi cấy vi khuẩn S.marcescens SH4 sau xử lí acid 86 Đồ án tốt nghiệp Tỉ lệ kháng nấm Fusarium sp. a 100 90 80 70 60 50 40 b bc bc Tỉ lệ lệ Tỉ kháng (%) 30 c c bc 20 10 d 0 2 lan 4 lan 8 lan 16 lan 32 lan 64 lan Đối chứng Carbenzim âm Biểu đồ 2: Tỉ lệ kháng nấm Fusarium sp. của dịch nuôi cấy vi khuẩn S.marcescens SH4 sau xử lí acid Tỉ lệ kháng nấm Trichoderma sp. a 100 90 80 70 60 50 40 30 Tỉ lệ kháng (%) lệkháng Tỉ b 20 bc cd c 10 cd cd d 0 2 lan 4 lan 8 lan 16 lan 32 lan 64 lan Đối chứng Carbenzim âm Biểu đồ 3:Tỉ lệ kháng nấm Trichoderma sp của dịch nuôi cấy vi khuẩn S.marcescens SH4 sau xử lí acid 87 Đồ án tốt nghiệp Tỉ lệ kháng nấm Pacelomyces sp. a 100 90 80 70 60 50 c b 40 c bc Tỉ lệ lệ Tỉ kháng (%) 30 bc 20 bc 10 d 0 2 lan 4 lan 8 lan 16 lan 32 lan 64 lan Đối chứng Carbenzim âm Biểu đồ 4: Tỉ lệ kháng nấm Paecilomyces sp của dịch nuôi cấy vi khuẩn S.marcescens SH4 sau xử lí acid 88 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC D: SỐ LIỆU THỐNG KÊ ‘KHA NANG PHAN GIAI PROTEIN.’ The ANOVA Procedure Dependent Variable: tilekhang Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 6 1.68000000 0.28000000 13.67 <.0001 Error 14 0.28666667 0.02047619 Corrected Total 20 1.96666667 R-Square Coeff Var Root MSE tilekhang Mean 0.854237 12.62603 0.143095 1.133333 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F nongdo 6 1.68000000 0.28000000 13.67 <.0001 The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for tilekhang Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 14 Error Mean Square 0.020476 Critical Value of Studentized Range 4.82904 Minimum Significant Difference 0.399 Means with the same letter are not significantly different. Tukey Grouping Mean N nongdo A 1.7333 3 vksong B 1.2000 3 2lan B B 1.1333 3 4lan B 89 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. Tukey Grouping Mean N nongdo B 1.1333 3 8lan B C B 1.0000 3 16lan C B C B 1.0000 3 32lan C C 0.7333 3 64lan ‘TY LE KHANG NAM FUSARIUM SP.’ The ANOVA Procedure Dependent Variable: tilekhang Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 18287.04408 2612.43487 316.25 <.0001 Error 16 132.17040 8.26065 Corrected Total 23 18419.21447 R-Square Coeff Var Root MSE tilekhang Mean 0.992824 9.409962 2.874135 30.54353 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F nongdo 7 18287.04408 2612.43487 316.25 <.0001 The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for tilekhang Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 16 Error Mean Square 8.26065 Critical Value of Studentized Range 4.89622 Minimum Significant Difference 8.1247 90 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. Tukey Grouping Mean N nongdo A 100.000 3 carbenzi B 29.841 3 16lan B C B 26.888 3 4lan C B C B 24.762 3 2lan C B C B 24.127 3 64lan C C 19.683 3 32lan C C 19.048 3 8lan D 0.000 3 Dcam ‘TY LE KHANG NAM CDP1.’ The ANOVA Procedure Dependent Variable: tilekhang Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 19854.72405 2836.38915 136.70 <.0001 Error 16 331.97290 20.74831 Corrected Total 23 20186.69695 R-Square Coeff Var Root MSE tilekhang Mean 0.983555 17.44480 4.555031 26.11111 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F nongdo 7 19854.72405 2836.38915 136.70 <.0001 91 Đồ án tốt nghiệp The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for tilekhang Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 16 Error Mean Square 20.74831 Critical Value of Studentized Range 4.89622 Minimum Significant Difference 12.876 Means with the same letter are not significantly different. Tukey Grouping Mean N nongdo A 100.000 3 carbenzi B 24.444 3 32lan B C B 19.048 3 8lan C B C B 19.048 3 16lan C B C B 18.413 3 64lan C B C B 17.143 3 2lan C C D 10.794 3 4lan D D 0.000 3 Dcam TY LE KHANG NAM TRICHODERMA SP The ANOVA Procedure Dependent Variable: tilekhang Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 22819.75611 3259.96516 108.13 <.0001 92 Đồ án tốt nghiệp Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Error 16 482.37461 30.14841 Corrected Total 23 23302.13072 R-Square Coeff Var Root MSE tilekhang Mean 0.979299 28.03016 5.490757 19.58874 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F nongdo 7 22819.75611 3259.96516 108.13 <.0001 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for tilekhang Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 16 Error Mean Square 30.14841 Critical Value of t 2.11991 Least Significant Difference 9.5039 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 100.000 3 carbenzi B 18.615 3 16lan B C B 11.255 3 64lan C B C B 9.524 3 2lan C C D 8.658 3 32lan C D C D 4.329 3 8lan 93 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo C D C D 4.329 3 4lan D D 0.000 3 Dcam ‘TY LE KHANG NAM PAECILOMYCES SP.’ The ANOVA Procedure Dependent Variable: tilekhang Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 19865.65647 2837.95092 27.96 <.0001 Error 16 1623.96269 101.49767 Corrected Total 23 21489.61916 R-Square Coeff Var Root MSE tilekhang Mean 0.924430 33.80277 10.07461 29.80408 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F nongdo 7 19865.65647 2837.95092 27.96 <.0001 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for tilekhang Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 16 Error Mean Square 101.4977 Critical Value of t 2.11991 Least Significant Difference 17.438 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 100.000 3 carbenzi 94 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo B 34.783 3 16lan B B 33.333 3 8lan B C B 28.288 3 32lan C B C B D 17.391 3 64lan C D C D 13.043 3 2lan C D C D 11.594 3 4lan D D 0.000 3 Dcam ‘TI LE CHET SAU 1 NGAY The ANOVA Procedure Dependent Variable: Tilechet Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 6858.796296 979.828042 10.74 <.0001 Error 16 1459.259259 91.203704 Corrected Total 23 8318.055556 R-Square Coeff Var Root MSE Tilechet Mean 0.824567 31.39747 9.550063 30.41667 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Tilechet 95 Đồ án tốt nghiệp Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 16 Error Mean Square 91.2037 Critical Value of t 2.11991 Least Significant Difference 16.53 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 55.556 3 10^-6 A A 48.889 3 10^-4 A B A 43.333 3 Reasgant B B C 27.778 3 10^-5 C C 26.667 3 10^-3 C C 22.222 3 10^-2 C C 18.889 3 10^-1 D 0.000 3 Dcam ‘TI LE CHET SAU 2 NGAY The ANOVA Procedure Dependent Variable: Tilechet Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 13198.14815 1885.44974 45.25 <.0001 Error 16 666.66667 41.66667 96 Đồ án tốt nghiệp Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Corrected Total 23 13864.81481 R-Square Coeff Var Root MSE Tilechet Mean 0.951917 11.33556 6.454972 56.94444 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F nongdo 7 13198.14815 1885.44974 45.25 <.0001 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Tilechet Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 16 Error Mean Square 41.66667 Critical Value of t 2.11991 Least Significant Difference 11.173 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 78.889 3 Reasgant A A 73.333 3 10^-6 A B A 70.000 3 10^-5 B A B A 70.000 3 10^-4 B B C 60.000 3 10^-2 C C 52.222 3 10^-3 C 97 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo C 51.111 3 10^-1 D 0.000 3 Dcam TI LE CHET SAU 3 NGAY The ANOVA Procedure Dependent Variable: Tilechet Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 16351.38889 2335.91270 34.56 <.0001 Error 16 1081.48148 67.59259 Corrected Total 23 17432.87037 R-Square Coeff Var Root MSE Tilechet Mean 0.937963 12.35795 8.221471 66.52778 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F nongdo 7 16351.38889 2335.91270 34.56 <.0001 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Tilechet Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 16 Error Mean Square 67.59259 Critical Value of t 2.11991 Least Significant Difference 14.231 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 88.889 3 Reasgant A 98 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo B A 86.667 3 10^-4 B A B A C 78.889 3 10^-6 B C B D C 73.333 3 10^-3 B D C B D C 73.333 3 10^-5 D C D C 67.778 3 10^-2 D D 62.222 3 10^-1 E 1.111 3 Dcam ‘TI LE CHET SAU 4 NGAY The ANOVA Procedure Dependent Variable: Tilechet Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 20981.01852 2997.28836 124.50 <.0001 Error 16 385.18519 24.07407 Corrected Total 23 21366.20370 R-Square Coeff Var Root MSE Tilechet Mean 0.981972 6.388254 4.906534 76.80556 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F nongdo 7 20981.01852 2997.28836 124.50 <.0001 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Tilechet 99 Đồ án tốt nghiệp Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 16 Error Mean Square 24.07407 Critical Value of t 2.11991 Least Significant Difference 8.4927 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 100.000 3 10^-4 A A 100.000 3 Reasgant B 86.667 3 10^-6 B B 85.556 3 10^-5 B B 85.556 3 10^-3 B B 84.444 3 10^-2 C 70.000 3 10^-1 D 2.222 3 Dcam ‘TI LE CHET SAU 5 NGAY The ANOVA Procedure Dependent Variable: Tilechet Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 21488.42593 3069.77513 245.58 <.0001 100 Đồ án tốt nghiệp Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Error 16 200.00000 12.50000 Corrected Total 23 21688.42593 R-Square Coeff Var Root MSE Tilechet Mean 0.990778 4.278293 3.535534 82.63889 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F nongdo 7 21488.42593 3069.77513 245.58 <.0001 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Tilechet Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 16 Error Mean Square 12.5 Critical Value of t 2.11991 Least Significant Difference 6.1196 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 100.000 3 10^-4 A A 100.000 3 Reasgant A B A 95.556 3 10^-3 B B 92.222 3 10^-6 B B 92.222 3 10^-5 B B 92.222 3 10^-2 101 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo C 84.444 3 10^-1 D 4.444 3 Dcam TI LE CHET ARTEMIA 4h The ANOVA Procedure Dependent Variable: TILECHET Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 6 2361.238095 393.539683 137.74 <.0001 Error 14 40.000000 2.857143 Corrected Total 20 2401.238095 R-Square Coeff Var Root MSE TILECHET Mean 0.983342 13.49676 1.690309 12.52381 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NONGDO 6 2361.238095 393.539683 137.74 <.0001 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for TILECHET Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 14 Error Mean Square 2.857143 Critical Value of t 2.14479 Least Significant Difference 2.9601 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NONGDO A 30.000 3 Reagants A 102 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NONGDO A 28.000 3 10lan B 9.667 3 100lan C 6.667 3 100000la C D C 6.000 3 10000lan D C D C 4.000 3 1000lan D D 3.333 3 1000000l TI LE CHET CAI 3 NGAY The ANOVA Procedure Dependent Variable: Tilechet Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 1212.239583 173.177083 10.08 <.0001 Error 16 275.000000 17.187500 Corrected Total 23 1487.239583 R-Square Coeff Var Root MSE Tilechet Mean 0.815094 46.82294 4.145781 8.854167 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F nongdo 7 1212.239583 173.177083 10.08 <.0001 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Tilechet Alpha 0.05 103 Đồ án tốt nghiệp Error Degrees of Freedom 16 Error Mean Square 17.1875 Critical Value of t 2.11991 Least Significant Difference 7.1759 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 25.833 3 Reasgant B 10.833 3 10^-1 B B 8.333 3 10^-2 B B 8.333 3 10^-4 B B 7.500 3 10^-3 B C B 5.833 3 10^-5 C B C B 4.167 3 10^-6 C C 0.000 3 Dcam TI LE CHET CAI 5 NGAY The ANOVA Procedure Dependent Variable: Tilechet Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 3308.072917 472.581845 24.52 <.0001 Error 16 308.333333 19.270833 Corrected Total 23 3616.406250 104 Đồ án tốt nghiệp R-Square Coeff Var Root MSE Tilechet Mean 0.914740 36.01933 4.389856 12.18750 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F nongdo 7 3308.072917 472.581845 24.52 <.0001 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Tilechet Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 16 Error Mean Square 19.27083 Critical Value of t 2.11991 Least Significant Difference 7.5984 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 42.500 3 Reasgant B 10.833 3 10^-1 B B 10.000 3 10^-4 B C B 8.333 3 10^-3 C B C B 8.333 3 10^-2 C B C B 8.333 3 10^-6 C B C B 7.500 3 10^-5 C C 1.667 3 Dcam 105 Đồ án tốt nghiệp TI LE CHET CAI 9 NGAY The ANOVA Procedure Dependent Variable: Tilechet Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 7241.406250 1034.486607 57.57 <.0001 Error 16 287.500000 17.968750 Corrected Total 23 7528.906250 R-Square Coeff Var Root MSE Tilechet Mean 0.961814 24.66302 4.238956 17.18750 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F nongdo 7 7241.406250 1034.486607 57.57 <.0001 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Tilechet Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 16 Error Mean Square 17.96875 Critical Value of t 2.11991 Least Significant Difference 7.3372 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 62.500 3 Reasgant B 15.833 3 10^-5 B C B 11.667 3 10^-3 C B C B 11.667 3 10^-6 106 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo C B C B 11.667 3 10^-4 C B C B 10.833 3 10^-2 C C 8.333 3 10^-1 C C 5.000 3 Dcam 107