BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
THIẾT LẬP QUY TRÌNH LÊN MEN VI KHUẨN
SERRATIA MARCESCENS ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ
PHẨM DIỆT SÂU
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hƣớng dẫn :T.S NGUYỄN HOÀI HƢƠNG
Sinh viên thực hiện : CAO THỊ THANH THÚY
MSSV: 1311101044 Lớp: 13DSH05
TP. Hồ Chí Minh, 2017
Đồ án tốt nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu của tôi
121 trang |
Chia sẻ: huong20 | Ngày: 05/01/2022 | Lượt xem: 397 | Lượt tải: 0
Tóm tắt tài liệu Đồ án Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
i dƣới sự
hƣớng dẫn của TS Nguyễn Hoài Hƣơng.
Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công
bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã đƣợc chỉ rõ
nguồn gốc.
TP. HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017
Sinh viên thực hiện
Cao Thị Thanh Thúy
Đồ án tốt nghiệp
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên cho con xin gởi tất cả lòng biết ơn sâu sắc nhất đến cha mẹ, là
ngƣời đã sinh thành, nuôi dƣỡng, giáo dục, động viên... là chỗ vựa tinh thần vững
chắc cho con, là ngƣời giúp con đứng vững sau mỗi lần vấp ngã để con có đƣợc
nhƣ ngày hôm nay.
Với lòng biết ơn sâu sắc. Em xin gửi lời cám ơn chân thành và sự tri ân sâu
sắc tới tập thể quý thầy cô giáo trong trƣờng Đại học Công Nghệ TP.HCM nói
chung và các thầy cô giáo trong khoa Công Nghệ Sinh Học-Thực Phẩm-Môi
Trƣờng, bộ môn Công Nghệ Sinh Học nói riêng đã tận tình giảng dạy, truyền đạt
cho em những kiến thức, kinh nghiệm quý báo trong suốt thời gian qua.
Đặc biệt, em xin đƣợc chân thành biết ơn cô TS. Nguyễn Hoài Hƣơng, ngƣời
thầy đáng kinh, cô đã tận tình giúp đỡ, trực tiếp chỉ bảo, hƣớng dẫn và tạo điều kiện
thuận lợi cho em trong suốt quá trình làm đồ án tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Trung Dũng, cô Nguyễn Trần Thái
Khanh, anh Nguyễn Trần Thiện Đức đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ
án tại phòng thí nghiệm Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trƣờng,
trƣờng Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh.
Cảm ơn tất cả các bạn đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình thời gian
học tập tại trƣờng. Cảm ơn chị Vũ Hoàng Minh Ngọc, bạn Trƣơng Hoài Nguyên,
bạn Đỗ Thị Cẩm Lụa, bạn Lê Thị Thu đã đồng hành chia sẻ buồn vui cùng em trong
suốt thời gian làm đồ án tốt nghiệp.
Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc!
TP. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2017
Sinh viên thực hiện
Cao Thị Thanh Thúy
Đồ án tốt nghiệp
MỤC LỤC
MỤC LỤC .................................................................................................................i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ....................................................................... iv
DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... v
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................... vii
MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................ 1
2. Mục đích của nghiên cứu .............................................................................. 1
3. Nhiệm vụ của nghiên cứu .............................................................................. 2
4. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài ................................................................... 2
5. Kết cấu của đồ án .......................................................................................... 2
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3
1.1. Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật .............................................. 3
1.1.1. Hợp chất thứ cấp ..................................................................................... 3
1.1.2. Triển vọng và tiếm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật ........ 3
1.2. Giới thiệu về Prodigiosin ........................................................................... 5
1.2.1. Khái niệm về Prodigiosin ..................................................................... 5
1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của Prodigiosin ................................................. 6
1.2.3. Hoạt động sinh học của Prodigiosin .................................................... 9
1.2.4. Cơ chế tổng hợp Prodigiosin của Serratia marcescens ..................... 10
1.3. Giới thiệu về Serratia marcescens .......................................................... 14
1.3.1. Lịch sử phát hiện ................................................................................ 14
1.3.2. Phân loại khoa học của Serratia marcescens .................................... 15
1.3.3. Đặc điểm của Serratia marcescens .................................................... 15
1.4. Một số hợp chất đƣợc tổng hợp từ Serratia marcescens ........................ 19
1.4.1. Sắc tố .................................................................................................. 19
1.4.2. Biosurfactant ...................................................................................... 20
1.4.3. Acid béo .............................................................................................. 20
1.4.4. Enzyme................................................................................................ 20
i
Đồ án tốt nghiệp
1.4.5. Yếu tố động lực của Serratia marcescens .......................................... 21
1.5. Khả năng diệt sâu của Serratia marcescens ............................................ 22
1.6. Điều kiện tối ƣu cho sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens
24
1.7. Thu nhận và tinh sạch prodigiosin ......................................................... 27
1.8. Một số nghiên cứu trên thế giới .............................................................. 30
1.8.1. Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens ...................................... 30
1.8.2. Tình hình nghiên cứu prodigiosin ..................................................... 30
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 33
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................... 34
2.1.1. Thời gian. ........................................................................................... 34
2.1.2. Địa điểm .............................................................................................. 34
2.2. Vật liệu – hóa chất – thiết bị .................................................................... 34
2.2.1. Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens ................................................ 34
2.2.2. Môi trường nuôi cấy và hóa chất. ...................................................... 34
2.2.3. Dụng cụ, thiết bị ................................................................................. 35
2.3. Phƣơng pháp thí nghiệm ......................................................................... 36
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................... 41
2.4.1. Phương pháp chọn lọc chủng Serratie marsescens có khả năng tổng
hợp prodigiosin và enzyme ngoại bào mạnh nhất. ......................................... 41
2.4.2. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường nhân giống .................. 44
2.4.3. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường lên men và chế độ lên
men 44
2.4.4. Phương pháp phân tích ...................................................................... 47
Mục đích ........................................................................................................... 47
Nội dung ........................................................................................................... 47
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 48
3.1. Chọn lọc chủng vi khuẩn Serratia marcescens sinh tổng hợp enzyme
ngoại bào và prodigiosin cao nhất .................................................................... 48
ii
Đồ án tốt nghiệp
3.1.1. Khả năng tiết enzyme ngoại bào ........................................................ 48
3.1.2. Trích ly thu prodigiosin ...................................................................... 52
3.1.3. So sánh hình thái, sinh lý, khả năng tiết enzyme ngoại bào của
chủng SH4 với chủng SH1 (ĐATN Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013) ............ 54
3.2. Thiết lập môi trƣờng nhân giống ............................................................ 56
3.3. Thiết lập môi trƣờng lên men và chế độ lên men ................................... 58
3.3.1. Thiết lập môi trường lên men ............................................................ 58
3.3.2. Thiết lập chế độ lên men .................................................................... 64
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................... 70
1. Kết luận ........................................................................................................ 70
2. Kiến nghị ...................................................................................................... 70
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 70
PHỤ LỤC ............................................................................................................... 76
A. PHỤ LỤC 1. THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƢỜNG, THUỐC THỬ,
PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ......................................................................... 76
B. PHỤ LỤC 2. HÌNH ẢNH ........................................................................ 82
C. PHỤ LỤC 3. SỐ LIỆU THỐNG KÊ ...................................................... 87
iii
Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
EPN: Entomopathogenic nematodes
OD: mật độ quang (Optical Density)
λmax : bƣớc sóng hấp thụ cực đại
LMTL: lên men tiếp liệu
PG: peptone glycerol
PGTL: peptone glycerol tiếp liệu
MT1: môi trƣờng 1
MT2: môi trƣờng 2
iv
Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Cấu trúc hình học phẳng của hợp chất Prodigiosin (Krishna, 2008) .......... 6
Hình 1.2 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) ........................................... 7
Hình 1.3 Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin (Ramina và Samira, 2009) ............ 9
Hình 1.4 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC
39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ
Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001) ................................. 11
Hình 1.5 Con đƣờng đƣợc đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp prodigiosin. .......... 13
Hình 1.6 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens. ....... 16
Hình 1.7 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi (Gillen và
Gibbs, 2011) ............................................................................................................ 16
Hình 1.8 Cơ chế gây bệnh của enzyme Serralysin metalloprotease của
S.marcescens đối với ấu trùng tằm (K Ishii et al; 2014). ......................................... 23
Hình 1.9 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi
Serratia marcescens đƣợc ghi nhận bởi Sundaramoorthy và cộng sự (2009) .......... 27
Hình 1.10 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodiosin bởi
Serratia sp. BTWJ8 đƣợc ghi nhận bởi Krishna (2008) .......................................... 27
Hình 2.1 Quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm
prodigiosin thô. ....................................................................................................... 37
Hình 2.2 Quy trình chọn lọc chủng vi sinh vật. ....................................................... 38
Hình 2.3 Quy trình khảo sát thiết lập môi trƣờng nhân giống vi khuẩn Serratia
marcescens SH4 ...................................................................................................... 39
Hình 2.4 Quy trình khảo sát thiết lập môi trƣờng lên men vi khuẩn Serratia
marcescens SH4 ...................................................................................................... 40
Hình 2.5. Quy trình trích ly thu prodigiosin từ dịch lên men vi khuẩn .................... 43
Hình 2.6 Quy trình tiếp liệu glycerol ....................................................................... 46
Hình 3.1 Khả năng tiết ezyme protease của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và
HB ........................................................................................................................... 49
Hình 3.2 Khả năng tiết ezyme lipase của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB
................................................................................................................................ 50
Hình 3.3 Khả năng tiết ezyme chitinase của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và
HB. .......................................................................................................................... 51
Hình 3.4 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD 499) và tế bào (OD 620) của các
chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. ................................................................... 53
Hình 3.5 Hình thái khuẩn lạc của chủng SH4 và SH1 ............................................. 54
Hình 3.6 Kết quả nhuộm Gram hai chủng SH1 và SH4 .......................................... 55
Hình 3.7 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của hai chủng SH4 và SH1 ................... 55
Hình 3.8 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 theo thời
gian trên các môi trƣờng nhân giống khác nhau. ..................................................... 57
Hình 3.9 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các
môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống MT2 theo thời gian. ....... 60
v
Đồ án tốt nghiệp
Hình 3.10 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các
môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian. ........... 61
Hình 3.11 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các
môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian. ........... 63
Hình 3.12 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên đƣợc
môi trƣờng lên men PG tại các nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian. ............... 65
Hình 3.13 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh và OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn
S.marcescens SH4 trên môi trƣờng lên men peptone glycerol tại các nồng độ tiếp
liệu glycerol theo thời gian. ..................................................................................... 67
Hình 3.14 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD 499 nm) của vi khuẩn
S.marcescens SH4 trên môi trƣờng lên men PG ở các nồng độ tiếp liệu tại 48h. (số
liệu thô xem ở bảng 5 - phụ lục A và hình 9 - phụ lục B) ....................................... 68
vi
Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chât thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật ............ 4
Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) . 8
Bảng 1.3 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens ................................. 17
Bảng 1.4 So sánh quá trình tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens trong các
môi trƣờng và các nhiệt độ khác nhau (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). ..... 25
Bảng 1.5 Một số bằng sáng chế về prodigiosin ....................................................... 32
Bảng 3.1 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng S.marcescens SH4, SH5
và HB. ..................................................................................................................... 51
Bảng 3.2 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD499nm) , tế bào (OD620nm) sau xử lý
acid và (OD535nm) sắc tố sau trích ly của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB.
................................................................................................................................ 53
Bảng 3.3 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng SH4 và SH1 ......................... 56
Bảng 3.4 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các
môi trƣờng nhân giống theo thời gian. .................................................................... 57
Bảng 3.5 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các
môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống MT2 theo thời gian. ........ 59
Bảng 3.6 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các
môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian. ........... 61
Bảng 3.7 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các
môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian. ........... 62
Bảng 3.8 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên đƣợc
môi trƣờng lên men PG tại các nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian. ............... 65
vii
Đồ án tốt nghiệp
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Prodigiosin là một sắc tố đỏ có bản chất là một alkaloid, và có hoạt tính kháng
vi sinh vật đã đƣợc bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1960, nay thu hút đƣợc nhiều
quan tâm do khả năng sử dụng làm màu tự nhiên và ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ
thực vật cũng nhƣ hoạt chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u (D’Alessio và
Rossi, 1996; Azuma và cộng sự, 2000; Bennet và Bentley, 2000; Melvin và cộng
sự, 2000, Tsuji và cộng sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji, 1992; Songia
và cộng sự, 1997). Prodigiosin đƣợc tìm thấy trong quá trình lên men của một số
loài vi sinh vật nhƣ Alteromonas rubra Moss, 2002 ; Rugamonas rubra Gerber,
1975; Serratia rubidaea Moss, 2002; Streptoverticillium rubrireticuli Gerber, 1975
Vibrio gazogenes Moss, 2002 và một số loài Serratia, đặc biệt loài Serratia mar-
censcens có khả năng tổng hợp sắc tố đỏ (red pigment) prodigiosin (2-methyl-3-
amyl-6-methoxyprodigiosene) (C20H25N3O = 323,44) (Williams và Qadri, 1980,
Kobayashi và El-Barrad, 1996; Press và cộng sự, 1997; Someya và cộng sự, 2000;
Roberts và cộng sự, 2005). Serratia marcescens đƣợc phân lập từ tuyến trùng EPN
và đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng peptone glycerol, nutrient broth, môi trƣờng đậu
phộng, môi trƣờng hạt mè,.... Một số nghiên cứu thu prodigiosin từ dịch nuôi cấy
Serratia marcescens thông thƣờng cần trích ly lỏng rắn bằng ethanol/methanol, sau
đó trích ly lỏng lỏng bằng dung môi kém phân cực hơn để đƣợc prodigiosin tinh
sạch một phần. Việc thu hồi prodigisin và tinh sạch một phần prodigiosin cho mục
đích sản xuất thuốc trừ sâu rất tốn kém vì vậy một số nghiên cứu đã sử dụng trực
tiếp dịch nuôi cấy (canh trƣờng) Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt
sâu.. Với mục tiêu tìm ra môi trƣờng nuôi cấy và điều kiện để sinh tổng hợp
prodigiosin trong môi trƣờng bằng nuôi cấy lỏng ngƣời thực hiện đề tài đã chọn
hƣớng cho đồ án tốt nghiệp là “ Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia
marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu”.
2. Mục tiêu của nghiên cứu
1
Đồ án tốt nghiệp
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế
phẩm diệt sâu.
3. Nội dung nghiên cứu
Tuyển chọn chủng Serratia marcescens sinh tổng hợp prodigiosin và enzyme
ngoại bào.
Thiết lập môi trƣờng nhân giống để thu đƣợc sinh khối nhiều nhất.
Thiết lập môi trƣờng lên men để thu prodigiosin nhiều nhất.
4. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài
Chọn lọc đƣợc chủng S.marcescens sinh tổng hợp prodigiosin, enzyme ngoại
bào protease và lipase cao nhất.
Khảo sát thiết lập môi trƣờng nhân giống thu đƣợc sinh khối nhiều nhất.
Khảo sát thiết lập đƣợc môi trƣờng lên men thu đƣợc prodigiosin cao nhất.
Khảo sát thiết lập đƣợc chế độ lên men thu đƣợc prodigiosin cao nhất.
5. Kết cấu của đồ án
Đồ án “ Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản
xuất chế phẩm diệt sâu” đƣợc trình bày gồm 3 chƣơng:
1. Tổng quan tài liệu
Giới thiệu về prodigiosin các tính chất đặc trƣng của hợp chất thứ cấp
prodigiosin, phân loại loài cũng nhƣ các đặc trƣng sinh hóa của vi khuẩn Serratia
marcescens.
2. Vật liệu và phƣơng pháp thí nghiệm
Giới thiệu về các phƣơng pháp đƣợc sử dụng trong quá trình làm đồ án. Cách
bố trí các nghiệm thức trong từng thí nghiệm.
3. Kết quả và thảo luận
Trình bày chi tiết các kết quả đạt đƣợc của từng thí nghiệm đƣợc tiến hành.
2
Đồ án tốt nghiệp
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật
1.1.1. Hợp chất thứ cấp
Hợp chất thứ cấp là chất đƣợc tạo ra từ hợp chất sơ cấp, có trọng lƣợng phân
tử nhỏ, thƣờng đƣợc gọi là chất có hoạt tính sinh học đóng vai trò điều hòa quan hệ
sinh thái của chủ thể với các tác động lên chủ thể của môi trƣờng xung quanh.
Hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật là những hợp chất đƣợc vi sinh vật tạo ra từ
quá trình chuyển hóa hợp chất sơ cấp.
1.1.2. Triển vọng và tiếm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật
Vi sinh vật đã đƣợc sử dụng trong một thời gian dài cho sản xuất các phân
tử sinh học nhƣ thuốc kháng sinh, enzyme, vitamine và các tác nhân chỉ thị. Có
sự quan tâm ngày càng tăng trong ngành công nghiệp thực phẩm trong việc sử
dụng các thành phần tự nhiên. Các thành phần, chẳng hạn nhƣ hợp chất thứ cấp,
đƣợc xem là tự nhiên khi xuất phát từ nguồn gốc sinh học nhƣ động vật, thực
vật hoặc vi sinh vật. Hợp chất thứ cấp của vi sinh vật đƣợc sử dụng trong ngành
công nghiệp chế biến cá, ví dụ nhƣ để tăng màu hồng của cá hồi nuôi. Hơn nữa,
một số hợp chất tự nhiên có tiềm năng thƣơng mại để sử dụng nhƣ chất chống
oxy hóa. Ngành công nghiệp hiện nay đã sản xuất một số hợp chất từ vi sinh
vật ứng dụng trong thực phẩm, mỹ phẩm hoặc vật liệu dệt. Trong tự nhiên
phong phú về hợp chất và vi sinh vật sản xuất hợp chất (nấm, nấm men và vi
khuẩn). Trong các sắc tố tự nhiên thì vi sinh vật cung cấp một số lƣợng hợp
chất rất lớn nhƣ: carotenoid, melanin, flavin, quinone, prodigiosin và cụ thể
hơn là monascin, violacein hoặc indigo (Dufosse, 2009). Các loại hợp chất này
có tiềm năng khai thác cao, vì quá trình sản xuất đơn giản, sự đa dạng di truyền
ở vi sinh vật, cũng nhƣ có thể dễ dàng tối ƣu hóa quy trình công nghệ (Juailova
và cộng sự, 1997.
Bên cạnh đó, một số vi sinh vật có khả năng sản xuất hợp chất với hiệu suất
cao, bao gồm các chi Monascus (Hajjaj và cộng sự, 2000) và Serratia
(Willliams và cộng sự, 1971a). Các chi vi sinh vật khác nhƣ: Rhodotorula,
3
Đồ án tốt nghiệp
Bacillus, Achrombacter, Yarrowia và Phaffia cũng có khả năng sản xuất số
lƣợng lớn hợp chất thứ cấp (Krishna, 2008), trong đó kháng sinh, nhóm hoạt
chất có khả năng gây chết hoặc kiềm hãm vi sinh vật phát triển, đƣợc một số vi
sinh vật (fungi, acmomycetes, bacteria) tạo ra, là một trong những thành tựu
quan trọng của việc sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật. Mỗi kháng sinh có
phổ tác động riêng của mình. Bảng 1.1 tóm tắt về một số hợp chất thứ cấp đƣợc
sản xuất bởi vi sinh vât.
Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chât thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật
Vi sinh vật Hợp chất thứ Ứng dụng Kiểu tác động
cấp ức chế
Penicillium Penicilin Ức chế tụ cầu Ức chế tạo
notatum, khuẩn, nhiễm polymer vách tế
Penicillium trùng kỵ khí, bào vi khuẩn, ức
chrysogenum giang mai, hen chế hấp thụ
suyễn. amini acid và
protein, ứ chế
tạo enzyme.
Streptomyces Streptomycin Ức chế vi Ức chế ghép nối
griceus khuẩn Gram âm một số amino
và Gram acid vào
dƣơng. Trị bệnh protein, tác
lao, bệnh viêm động lên hệ
màng não, ho enzyme cả vi
gà. khuẩn tham gia
chuyển pyruvate
vào chu trình
Creb, ...
Streptomyces Chloranphenicol Ức chế đối với Ức chế đặc hiệu
venezuelas bệnh lỵ, sốt sinh tổng hợp
4
Đồ án tốt nghiệp
cao, sốt phát protein vi khuẩn
ban. liên quan đến
peptidyl
transferase
trong tiểu đơn
vị Ribosome
50s, ngăn không
cho tạo liên kết
peptide.
Streptomyces Tetracilin Ức chế phổ Ức chế tổng
aureomycin rộng vi khuẩn hợp protein
Gram âm,
Gram dƣơng
Streptomyces Erythromycin Chữa bệnh do Ức chế vi khuẩn
erythraeus tụ cầu khuẩn Gram âm và
Streptococcal Gram dƣơng
gây ra
Sttreptomyces Neomycin Tác dụng vi Hơi độc
fradiae khuẩn Gram âm
và Gram dƣơng
Streptomyces Kanamycin Điều trị lao, ức Tác động giống
kanamycetius chế vi khuẩn nhƣ
Gram âm và Streptomycin và
Gram dƣơng Neomycin
Streptomyces Cycloserine Điều trị bệnh Cản trở tổng
lavendulae lao hơp vách tế bào
1.2. Giới thiệu về Prodigiosin
1.2.1. Khái niệm về Prodigiosin
5
Đồ án tốt nghiệp
Prodigiosin là một tripyrrole đƣợc phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc
trƣng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc từ
“prodigious” có nghĩa là một điều gì đó kỳ diệu. Prodigiosin đƣợc tìm thấy ở dạng
túi bên ngoài tế bào cũng nhƣ các tế bào liên kết và dạng hạt ở bên trong tế bào
(Kobayashi và Ichikawa, 1991).
Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin đƣợc tổng hợp từ vi khuẩn
Serratia marcescens (Han và cộng sự, 1998). Các sắc tố thuộc nhóm này bao gồm:
prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG-HCl), uncedylprodigiosin, meta-
cycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đó, khả năng ức chế miễn dịch
có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin hydrochlo-
ride (cPrG-HCl).
1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của Prodigiosin
Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)-
methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân tử C20H25N3O và trọng
lƣợng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự, 2006; Wil-
liamson và cộng sự, 2006).
Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrrole
tạo thành bộ khung pyrrolypyrromethane, trong đó hai vòng đầu liên kết trực tiếp
với nhau, còn vòng thứ ba đƣợc gắn vào thông qua cầu nối methane (Qadri và Wil-
liams, 1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đôi và đƣợc
miêu tả là tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008).
Hình 1.1 Cấu trúc hình học phẳng của hợp chất Prodigiosin (Krishna, 2008)
6
Đồ án tốt nghiệp
Các sắc tố màu đỏ của S.marcescens đã đƣợc phân lập và đặt tên là “prodigio-
sine” bởi Kraft (1902). Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác của prodi-
giosin tổng hợp bởi S.marcescens mới đƣợc biết đến (Rapoport và Holden, 1962).
Do sự tiến bộ nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ trong những năm
tiếp theo prodigiosin trở nên rõ ràng hơn (Hesse, 2000), có một loạt các chất đều
mang cùng pyrrolypyrromethene (prodigionine) với nhóm thế alkyl khác nhau
(Wasserman và cộng sự, 1969). Những nhóm thế thƣờng gắn trở lại để tạo thành
vòng tròn hoặc macrocycles, nhƣ thể hiện trong hình 1.4, Furstner (2003) cho rằng
danh pháp truyền thống là rất phù hợp và do đó khuyến khích sử dụng “prodigiosin”
để chỉ tất cả. Đƣợc phân lập và đặt tên là “prodigiosine” bởi Kraft (1902).
Hình 1.2 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003)
Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và không tan trong nƣớc. Prodigiosin có
thể tan tƣơng đối trong alcohol và ether; bên cạnh đó, nó dễ tan trong chloroform,
7
Đồ án tốt nghiệp
methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977; Khanafar và cộng sự,
2006). Hầu hết các sắc tố này hấp thụ ánh sáng ở một bƣớc sóng nhất định và sự
biểu hiện sắc tố có thể dễ dàng theo dõi bằng quang phổ.
Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams,
1973)
Trọng lƣợng
Loài Tên sắc tố Danh pháp phân tử và công
prodigiosin thức
Serratia Prodigiosine 2-Methyl- 3-
marcescens amyl-6-methoxy- 323,4 Da
prodigiosene C20H25N3O
Serratia Norprodigiosin 2-Methyl-3-amyl-
marcescens 6-hydroxy- 309,4 Da
prodigiosene C10H23N3O
Serratia Dipyrrolyl- 2-(2-pyrryl)-4-6-
marcescens dipyrromelhenr dimethoxypy- 334,4 Da
prodigiosin prodigiosene C19H18N4O2
Nocardia Nonylprodigiosin 2-Nonly-6- 363,5 Da
(Actinomadura) methoxy- C23H31N3O
madurae prodigiosene
Nocardia Cyclononyl- 2,10-Nonano-6- 265,5 Da
(Actinomadura) prodigiosin melhoxy- C23H33N3O
madurae prodigiosene
Nocadia Methylcyclodccyl- 2,10-Nonano-6-
(Actinomadura) prodigiosin Methoxy- 391,5 Da
pellctieri prodigiosene C25H33N3O
Streptomyces Undccyl- 2-Undecyl-6- 393,6 Da
longisporusruber prodigiosin Rnethoxy- C25H35N3O
và Nocardia prodigiosene
8
Đồ án tốt nghiệp
(Actonomadura)
pelletieri
Streptomyces Metacyclo- 2,4-(9- 391,6 Da
longisporusber prodigiosin Ethylnonano)-6- C25H33N3O
methoxy-
prodigiosene
1.2.3. Hoạt động sinh học của Prodigiosin
Prodigiosin có khả năng ức chế sự tăng trƣởng của một số loại vi khuẩn
(Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là do khả
năng thấm qua màng ngoài tế bào và khả năng tổng hợp các enzyme nhƣ DNA
gyrase, topoisomerase IV,... dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trƣởng của tế bào vi
khuẩn (Ramina và Samira, 2009).
Hình 1.2 Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin (Ramina và Samira, 2009)
A. Đối kháng với Staphylococcus aureus B. Đối kháng với Echerichia Ecoli
Nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể
kháng một số loài vi khuẩn nhƣ: Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes,
Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus
mirabilis, Klebsielpneumoniae, Bacillus cereus. (Ramina và Samira, 2009; Chandni
và cộng sự, 2012).
9
Đồ án tốt nghiệp
Ngoài ra, hoạt chất prodigiosin còn có khả chống ung thƣ (Pandey và cộng sự,
2009; Pe1rez – Tomás và Vias, 2010) và ức chế miễn dịch (Pandey và cộng sự,
2007).
1.2.4. Cơ chế tổng hợp Prodigiosin của Serratia marcescens
Các gene sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia nằm trong một operon lớn.
Cấu tạo của các gene sinh tổng hợp prodigiosin (pig) trong Serratia sp. ATCC
39.006 (Serratia 39.006) và trong chủng Serratia marcescens ATCC 274 (Sma 274)
đã đƣợc báo cáo (Cerdeno và cộng sự, 2001).
Nhiều chủng Serrtia marcescens sản xuất sắc tố thông qua con đƣờng ngƣng
tụ enzyme 2-methyl-3-amylpyrrole (MAP) và enzyme 4-methoxy-2, 2’-bipyrrile-5-
ca...(ESI-MS). Sau đó, các sắc tố
chƣa tinh khiết đã thu đƣợc sẽ tiếp tục đƣợc thực hiện phƣơng pháp HPLC. Một cột
đảo pha Nucleosil C18 (250x4 mm, 10 휇m) đã đƣợc sử dụng với một gradient tuyến
tính 0% đến 100% trong 30 phút (A: 10 mM amoni acetate, pH 7,0, B: 100% ace-
tonitrile). Việc rửa giải đƣợc theo dõi bằng cách sử dụng cả hai máy dò UV diode-
array và ESI-MS (Montaner và Perez-Tomas, 2001; Tomas và Montaner, 2003).
- Sau khi lên men S. marcescens phân lập từ đất, canh trƣờng đƣợc lấy
từ những chất hấp thụ trong bioreactor (IAB) và sau đó, 1 lít ethanol 95% (v:v) đã
acid hóa (pH 3,0) đƣợc thêm vào IAB. Các sắc tố đƣợc chiết xuất bằng cách sử
dụng một vòng tròn giải hấp impller trong IAB, ở 200 vòng trong 5 giờ, rồi đem cô
đặc và ly tâm. Sau đó, nó đƣợc thu bằng cách sử dụng nƣớc và chloroform để tách
pha. Prodigiosin màu đỏ đi vào chiếm hết chỗ ở phía dƣới của pha chloroform và
đƣợc cô quay chân không. Prodigiosin đƣợc phân tách bằng sắc ký cột silicagel (2,5
× 30 cm). Nó đƣợc rửa với một hỗn hợp hexane:ethyl acetate (2:1, v:v). Các sắc tố
cô đặc đã đƣợc tách ra bởi việc sử dụng hỗn hợp chloroform: methanol 95:5 (v:v)
trong TLC. Sau đó, màu đỏ duy nhất của prodigiosin (giá trị Rf là 0,43) đã đƣợc thu
nhận và hòa tan trong acetone. Các sắc tố chƣa tinh khiết sẽ tiếp tục đƣợc thực hiện
phƣơng pháp TLC (với tỷ lệ dung môi chloroform:methanol:diethyl ether là 6:2:2)
và cuối cùng là tinh chế bằng HPLC (với cột C18 (2,5×10 cm). Sau đó, nó đƣợc
tách rửa với hỗn hợp methanol:nƣớc (7:3, v:v) đã đƣợc điều chỉnh pH = 3,0 bằng
HCl 0,1N với tốc độ dòng chảy là 20 ml/phút. Một lƣới thép không gỉ lớn với kích
thƣớc lỗ 0,5 cm đã đƣợc sử dụng nhƣ sự hỗ trợ cho chất hấp phụ bên trong. Nồng
độ của các prodigiosin sản xuất ra đƣợc ƣớc tính bằng cách đo độ hấp thụ quang ở
bƣớc sóng 535 nm trong methanol đã đƣợc acid hóa (HCl 0,001N 4 ml + 96 ml
methanol) (Goldschmidt và Williams, 1968). Khối lƣợng phân tử của chất màu tinh
29
Đồ án tốt nghiệp
khiết đƣợc xác định bằng việc sử dụng quang phổ khối. Các 1H- và 13C-NMR của
các mẫu màu đƣợc ghi nhận sau khi hòa tan trong CDCl3. Các dịch chuyển hóa đã
đƣợc đối chiếu trong một TMS (trimetylsilyl) tín hiệu. Phổ FT-IR của các sắc tố
đƣợc ghi nhận (Song và cộng sự, 2006).
- Các sắc tố đƣợc sản xuất bởi Serratia marcescens SM∆R đã đƣợc tinh
sạch thực hiện NMR và phổ khối để xác định cấu trúc hóa học của nó (Wei và
Chen, 2005). Các sắc tố đƣợc chiết xuất từ canh trƣờng lên men bằng methanol và
sau đó tinh chế bằng cách sử dụng một cột silica gel hexane-balanced để thu các sản
phẩm mục tiêu trong cột (Cang và cộng sự, 2000; Montaner và cộng sự, 2000). Sau
đó cột đƣợc rửa với ethyl acetate 10M để giải phóng các sản phẩm hấp thụ. Màu
cam sau khi rửa giải đã đƣợc thu và làm khô trong máy sấy chân không ở 45oC
để có đƣợc những sản phẩm tinh khiết (bột màu đỏ). Các sắc tố thu đƣợc trong
nghiên cứu đã đƣợc báo cáo là undecylprodigiosin dựa trên phân tích NMR và MS,
còn đƣợc gọi là prodigiosin 25-C, là một trong những sắc tố đỏ đƣợc sản xuất bởi
Serratia sp. và Streptomyces sp. Nó có hoạt động ức chế miễn dịch và quá trình
apoptosis-inducing tƣơng tự nhƣ prodigiosin, nhƣng ít đƣợc nghiên cứu hơn (Tomas
và cộng sự, 2003).
1.8. Một số nghiên cứu trên thế giới
1.8.1. Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens
Brigida và Itamar (2006), đã tiến hành nghiên cứu về sự đối kháng của Serra-
tia marcescens với Phytophthora paeasitica, cũng nhƣ ảnh hƣởng của S. marces-
cens lên thúc đẩy tăng trƣởng của cây thuộc chi cam chanh.
Maria và cộng sự (2012), đã tiến hành thử nghiệm về quá trình lây nhiễm Ser-
ratia marcescens cùng tuyến trùng Steinernema cerpocapsae vào ấu trùng Galleria
mellonella và đạt đƣợc kết quả gây chết 100% ấu trùng.
1.8.2. Tình hình nghiên cứu prodigiosin
Sundaramoorthy và cộng sự (2009), thực hiện nghiên cứu để sàng lọc những
chủng Serratia có hiệu quả sản xuất prodigiosin và đã phân lập đƣợc chủng Serratia
marcescens NY1 từ đất.
30
Đồ án tốt nghiệp
Helvia và cộng sự (2010), đã tối ƣu hóa quá trình sản xuất prodigiosin bởi Ser-
ratia marcescens UCP 1549 bằng việc sử dụng 6% nƣớc thải từ công nghiệp chế
biến sắn và bổ sung 2% mannitol ở 28oC và pH =7 trong 48 giờ. Kết quả cho thấy
Serratia marcescens sản xuất prodigiosin ở mức cao nhất là 49,5 g/l.
Antony và cộng sự (2011), đã thực hiện quá trình tối ƣu hóa sản xuất prodigio-
sin bởi Serratia marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của prodigio-
sin. Kết quả cho thấy điều kiện tối ƣu cho việc sản xuất prodigiosin trong môi
trƣờng Nutrient broth là ở nhiệt độ 28oC, pH = 7 và trong thời gian 72 giờ. Và quá
trình chiết xuất prodigiosin đƣợc thực hiện bằng ethanol:hydrochloric acid (9,5:0,5)
hoặc acetone: ethyl acetate (1:1). Ngoài ra, prodigiosin thu nhận đƣợc có tác dụng
ức chế tốt ở cả vi khuẩn Gram dƣơng và vi khuẩn Gram âm.
Chandni và cộng sự (2012), đã nhận thấy rằng prodigiosin có khả năng kháng
khuẩn nhƣ Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và kháng nấm bệnh nhƣ Candi-
da albicans, Candida parapsilosis và Cryptococcus sp., hơn nữa, prodigiosin có khả
năng chống oxy hóa ở nồng độ 22,05 μg/ml và có tiềm năng nhuộm, cùng với
việc không bị ảnh hƣởng bởi acid, kiềm, chất tẩy rửa, mà có thể ứng dụng rộng rãi
trong ngành dệt và các ngành công nghiệp trị liệu.
Shahitha và Poornima (2012), đã tiến hành cải tiến quá trình sản xuất prodi-
giosin trong Serratia marcescens. Họ nhận thấy rằng trong số các môi trƣờng dầu
khác nhau thì dầu đậu phộng sản xuất prodigiosin cao nhất (2,72 mg/ml) và có thể
sử dụng để nhuộm bông tạo ra màu đẹp.
Nghiên cứu của Ananda và cộng sự (2013) đã sử dụng prodigiosin thu nhận từ
chủng Serratia marcescens CMST 07 để chống lại các vi khuẩn nhƣ Alteromonas
sp. và Gallionella sp., cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu là khoảng 6,75 μg/ml và
nồng độ diệt khuẩn tối thiểu là khoảng 12,5 μg/ml. Bên cạnh đó, Ananda và cộng sự
cũng đã sử dụng prodigiosin để nghiên cứu độc tính trên Artemia cho thấy LD50
khoảng 50 μg/ml.
Một số bằng sáng chế về prodigiosin đƣợc liệt kê trong bảng 1.6 (Krishna,
2008).
31
Đồ án tốt nghiệp
Bảng 1.5 Một số bằng sáng chế về prodigiosin
Tên Patent Tóm tắt Tác giả Ngày công
bố
United States A novel use of prodigiosin Kim Hwanmook, 10/28/2003
Patent for treating diabetes mellitus Han Sangbae,
6638968 without any side effect Lee Changwoo,
Lee Kihoon,
Park Sehyung,
Kim Youngkook.
United States The prodigiosin from Kim Hwanmook, 11/11/2003
Patent Serratia marcescens is useful Kim Youngkook,
6645962 as an immunosuppressive in Han Sangbae,
various fields, including the Yoo Sungak.
treatment of the diseases
requiring immunosuppression
and the basic research for the
diseases, the transplantation
of the organs or tissues. and
the immune cells.
United States The invention relates to novel Kim Hwan- 07/01/2004
Patent use of prodigiosin for the Mook Han Sang-
4266028 treatment of Rheumatic Bac Lee Chang-
m1hritis and can provide Woo Lee Ki-
excellent treatment effect to Hoon Park Se-
Rheumatic arthritis by Hyung Kim Hy-
treating composition oung Chin
including prodigiosin isolated Kim Young-
from Serratia marcescens as Kook
an active principle to DBA-l
32
Đồ án tốt nghiệp
mouse of collageninduced
Rheumatic al1hritis animal
model and thereby inhibiting
production of internal
cytokine which is a important
pathogen of Rheumatic
33
Đồ án tốt nghiệp
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Thời gian.
Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 30/04/2017 đến ngày 16/07/2017.
2.1.2. Địa điểm
Phòng thí nghiệm Vi sinh Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi
Trƣờng, trƣờng Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.
2.2. Vật liệu – hóa chất – thiết bị
2.2.1. Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens
Giống vi khuẩn Serratia marcescens SH4 và SH5 đƣợc phân lập từ đồ án tốt
nghiệp của Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013 đƣợc lƣu trữ tại trƣờng Đại Học Công
Nghệ TP. Hồ Chí Minh.
Giống vi khuẩn Serratia marcescens HB đƣợc phân lập từ đồ án tốt nghiệp
của Lê Quốc Vũ, 2015 đƣợc lƣu trữ tại trƣờng Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí
Minh.
2.2.2. Môi trường nuôi cấy và hóa chất.
a. Môi trƣờng ( Thành phần môi trƣờng xem phụ lục 1)
- Môi trƣờng Peptone glycerone agar (PGA)
- Môi trƣờng Peptone glycerone broth (PG)
- Môi trƣờng Casein
- Môi trƣờng Lipit
- Môi trƣờng huyền phù Chitin 1%
- Môi trƣờng nhân giống 1 (MT1)
- Môi trƣờng nhân giống 2 (MT2)
- Môi trƣờng lên men (MTLM)
b. Hóa chất sử dụng
- Cồn 70, cồn 96
- NaCl
- HCl, NaOH
34
Đồ án tốt nghiệp
- Petroleum ether
- Nƣớc muối bão hòa
2.2.3. Dụng cụ, thiết bị
a. Dụng cụ
- Phiễu chiết
- Ống nghiệm
- Đĩa petri
- Erlen 50ml, 100ml, 250ml
- Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml
- Pipetman 100μl, 1000μl.
- Đầu típ
- Đũa thủy tinh
- Bao hấp, giấy gói, thun
- Đèn cồn, que cấy vòng
- Bông không thấm, bông thấm
- Chai syrum 100ml.
b. Thiết bị
- Tủ cấy vi sinh
- Tủ lạnh
- Cân phân tích
- Bếp từ
- Máy nƣớc cất
- Autolave
- Tủ hút
- Máy ly tâm
- Máy lắc
- Máy đo quang phổ
- Máy cô quay
- Bể điều nhiệt
35
Đồ án tốt nghiệp
- Kính hiển vi
2.3. Phƣơng pháp thí nghiệm
2.3.1 Mục đích
Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế
phẩm diệt sâu.
2.3.2 Nội dung nghiên cứu
Tuyển chọn chủng Serratia marcescens sinh tổng hợp prodigiosin, enzyme
ngoại bào.
Thiết lập môi trƣờng nhân giống để thu đƣợc sinh khối nhiều nhất.
Thiết lập môi trƣờng lên men và chế độ lên men để thu prodigiosin nhiều nhất.
2.3.3 Phương pháp luận
Prodigiosin là hợp chất thứ cấp, quá trình tổng hợp thƣờng không trễ pha với
quá trình tăng trƣởng tế bào. Dịch môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy quyết định
nồng độ prodigiosin tổng hợp. Nghiên cứu này dựa trên các báo cáo trƣớc đó của
các tác giả trong và ngoài nƣớc để xác định môi trƣờng dinh dƣỡng và điều kiện
nuôi cấy cho chủng phân lập của phòng thí nghiệm.
2.3.4 Bố trí thí nghiệm
Các bƣớc bố trí thí nghiệm đƣợc trình bày tóm tắt theo sơ đồ sau:
36
Đồ án tốt nghiệp
Chủng vi sinh vật (S.marcescens
SH4, SH5 và HB)
Chọn lọc chủng
Thiết lập môi trƣờng nhân giống
Thiết lập môi trƣờng lên men và chế
độ lên men
Chế phẩm prodigiosin thô
Hình 2.1 Quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm
prodigiosin thô.
37
Đồ án tốt nghiệp
Chủng vi sinh vật (S.marcescens
SH4, SH5 và HB).
Nuôi cấy lỏng lắc, MTPG
Thử nghiệm enzyme ngoại
Trích ly thu prodigiosin
bào
Lipase Protease Chitinase
Hình 2.2 Quy trình chọn lọc chủng vi sinh vật.
38
Đồ án tốt nghiệp
Chủng vi khuẩn Serratia
marcescens SH4
Tăng sinh trên môi Tăng sinh trên môi Tăng sinh trên môi
trƣờng MT1 trƣờng MT2 trƣờng PG
0h 4h 8h 16h 20h 24h
Đo độ đục (mật độ tê bào)
OD = 620nm
Hình 2.3 Quy trình khảo sát thiết lập môi trƣờng nhân giống vi khuẩn Serratia mar-
cescens SH4
39
Đồ án tốt nghiệp
Chủng vi khuẩn Serratia
marcescens SH4
Tăng sinh trên môi Tăng sinh trên môi
trƣờng MT2 trƣờng PG
Lên men
Lên men Lên men trên môi Lên men trên
trên môi
trên môi trƣờng LMTL, môi trƣờng
trƣờng
trƣờng PG PGTL LMTL, PGTL
PG
Tiếp liệu Glycerol
0h 9h 24h 33h 48h 57h
Đo prodigiosin OD = 499nm
Đo độ đục (mật độ tế bào) OD = 620nm
Hình 2.4 Quy trình khảo sát thiết lập môi trƣờng lên men vi khuẩn Serratia mar-
cescens SH4
40
Đồ án tốt nghiệp
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp chọn lọc chủng Serratie marsescens có khả năng tổng
hợp prodigiosin và enzyme ngoại bào mạnh nhất.
2.4.1.1. Phương pháp định tính enzyme
Chuẩn bị canh trƣờng vi khuẩn: Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh trong
môi trƣờng peptone glycerol vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trên máy
lắc và ủ tối trong 48h.
Thử nghiệm hoạt tính lipase
Pha môi trƣờng thử nghiệm hoạt tính lipase, hấp 121oC trong 15 phút. Để môi
trƣờng nguội đến khoảng 50oC đổ ra các đĩa petri. Dùng que cấy thẳng cấy sinh
khối chủng vi sinh vật thử nghiệm vào giữa đĩa petri môi trƣờng thử nghiệm hoạt
tính lipase. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
Đo đƣờng kính vòng tủa trên bề mặt môi trƣờng. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Đọc kết quả:
Nếu vi khuẩn có khả năng sinh enzyme lipase thì xuất hiện vòng tủa xung
quanh điểm cấy.
Nếu vi khuẩn không có khả năng sinh enzyme lipase thì không xuất hiện vòng
tủa xung quanh điểm cấy.
Khả năng phân giải lipid đƣợc đánh giá qua đƣờng kính vòng tủa trên đĩa
thạch mm. Vòng tủa càng lớn, vi khuẩn có khả năng sinh enzyme lipase càng nhiều.
Thử nghiệm hoạt tính protease
Pha môi trƣờng geltatine agar và môi trƣờng casein agar, hấp 121oC trong 15
phút. Để môi trƣờng nguội đến khoảng 50oC đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch
trên mỗi đĩa agar môi trƣờng, đƣờng kính giếng thạch là 0.5 cm (d). Cho 20μl dịch
trong của canh trƣờng tăng sinh vi khuẩn vào các giếng thạch. Ủ tất cả các đĩa thạch
ở nhiệt độ phòng, 24 giờ.
Sau thời gian ủ, tráng TCA 10%. Đo kích thƣớc vòng phân giải (D-d, mm),
với D là đƣờng kính vòng phân giải. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Đọc kết quả:
41
Đồ án tốt nghiệp
Nếu vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease thì xuất hiện vòng trong suốt
xung quanh giếng thạch.
Nếu vi khuẩn không có khả năng sinh enzyme protesae thì không xuất hiện
vòng trong suốt xung quanh giếng thạch.
Khả năng phân giải casein đƣợc đánh giá qua hiệu số (D- d) mm. Hiệu số càng
lớn, vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease càng nhiều.
Thử nghiệm hoạt tính chitinase
Pha môi trƣờng thạch huyền phù chitin, hấp 121oC trong 15 phút. Để môi
trƣờng nguội đến khoảng 50oC đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa
agar môi trƣờng, đƣờng kính mỗi giếng thạch là 0.5 cm (d). Cho 20μl dịch trong
của canh trƣờng tăng sinh vi khuẩn vào các giếng thạch. Ủ tất cả các đĩa thạch ở
nhiệt độ phòng, 24 giờ.
Sau thời gian ủ, tráng thuốc thử lugol. Đo kích thƣớc vòng phân giải (D-d,
mm), với D là đƣờng lính vòng phân giải. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Đọc kết quả:
Nếu vi khuẩn có khả năng sinh enzyme chitinase thì xuất hiện vòng trong suốt
xung quanh giếng thạch.
Nếu vi khuẩn không có khả năng sinh enzyme chitinase thì không xuất hiện
vòng trong suốt xung quanh giếng thạch.
Khả năng phân giải chitin đƣợc đánh giá qua hiệu số (D- d) mm. Hiệu số càng
lớn, vi khuẩn có khả năng sinh enzyme chitinase càng nhiều.
2.4.1.2. Phương pháp trích ly thu prodigiosin
Chuẩn bị canh trƣờng vi khuẩn: Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh trong
môi trƣờng peptone glycerol vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trên máy
lắc và ủ tối trong 48h. Sau khi tăng sinh, diệt tế bào vi khuẩn bằng cách đƣa về pH
=2 trong 4 giờ; cho 450μl HCl 1N vào trong canh trƣờng, để trên máy lắc trong 4
giờ, lắc 150 vòng/phút, ủ tối. Dịch canh trƣờng sau khi sử lý acid HCl trong 4 giờ,
sẽ đƣợc thêm 450μl NaOH 1N để đƣa về pH =7, đem đo OD620nm và OD499nm, song
song đó tiến hành trích ly lỏng lỏng theo sơ đồ hình:
42
Đồ án tốt nghiệp
Canh trƣờng sau nuôi cấy
Xử lý acid
Trung hòa
Đo độ đục (mật độ tế
NaOH 1N bào) OD = 600 nm
Đo prodigiosin OD =
Ly tâm 4000 vòng/phút 499 nm
trong 15 phút
Ethanol:
HCl 1N
Dịch trong Sinh khối (95:5;
v:v)
Ly tâm 4000 vòng/phút
trong 15 phút
Sắc tố thô Dịch trong
Trích ly Đo prodigiosin sau trích ly
lỏng lỏng OD = 535 nm
Hình 2.5. Quy trình trích ly thu prodigiosin từ dịch lên men vi khuẩn
Sau khi cô quay mẫu sau trích ly lỏng lỏng, định mức lên 25ml và pha loãng
mẫu bằng dung môi Ethanol:HCl 1N (95:5, v;v), ngƣời thực hiện đề tài tiến hành đo
OD535 nm, xác định nồng độ prodigiosin sau khi thay giá trị OD vào phƣơng trình
43
Đồ án tốt nghiệp
2
đƣờng chuẩn prodigiosin y = 1,1003x + 0.0041 (R = 0,9991) (Nguyễn Hoàng Anh
Kha, 2013).
2.4.2. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường nhân giống
Tăng sinh vi khuẩn trong môi trƣờng peptone glycerol vô trùng ở nhiệt độ
phòng, lắc 150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 24h.
Pha các môi trƣờng thử nghiệm: môi trƣờng 1 (MT1 - môi trƣờng thu sinh khối cực
đại theo ĐATN Nguyễn Thị Tâm, 2010), môi trƣờng 2 (MT2 – môi trƣờng thu sinh
khối theo J.-L. Tao và cộng sự, 2005), môi trƣờng peptone glycerol (thành phần và
cách pha môi trƣờng xem phụ lục 1). Chỉnh pH môi trƣờng về 7. Tỷ lệ cấy giống là
5%. ủ ở nhiệt độ phòng, bao tối và lắc 150 vòng/phút trên máy lắc.
Tiến hành đo mật độ tế bào OD620nm tại các mốc thời gian:
t = 0h, t = 4h, t = 8h, t =16h, t = 20h, t = 24h.
Theo dõi mật độ tế bào tổng hợp đƣợc. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. Vẽ đƣờng
cong tăng trƣởng của chủng vi sinh vật.
Xác định mật độ tế bào bằng phƣơng pháp đo quang ở bƣớc sóng 620 nm.
2.4.3. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường lên men và chế độ lên men
2.4.3.1. Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường lên men
- Tăng sinh vi khuẩn trong môi trƣờng peptone glycerol vô trùng ở
nhiệt độ phòng, lắc150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 24h.
Pha các môi trƣờng thử nghiệm: môi trƣờng lên men (LMTL – môi trƣờng lên
men theo J.-L. Tao và cộng sự, 2005), môi trƣờng peptone glycerol (thành phần và
cách pha môi trƣờng xem phụ lục 1). Chỉnh pH môi trƣờng về 7. Tỷ lệ cấy giống là
5%. Ủ ở nhiệt độ phòng, bao tối và lắc 150 vòng/phút trên máy lắc.
Sau 9h, 24h, 33h, 48h. Tiếp liệu glycerol trên môi trƣờng lên men (LMTL) và
môi trƣờng peptone glycerol (PGTL) với nồng độ glycerol là 5g/l.
Đối chứng môi trƣờng peptone glycerol (PG) không tiếp liệu.
Tiến hành đo OD499nm và OD620nm tại các mốc thời gian:
t = 0h, t = 9h, t = 24h, t = 33h, t = 48h, t = 57h.
44
Đồ án tốt nghiệp
Vẽ đƣờng cong tăng trƣởng và đƣờng cong tổng hợp sắc tố của chủng vi sinh
vật.
- Tăng sinh vi khuẩn trong môi trƣờng nhân giống 2 (MT2 – môi
trƣờng thu sinh khối theo J.-L. Tao và cộng sự, 2005) vô trùng ở nhiệt độ phòng, lắc
150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 24h.
Pha các môi trƣờng thử nghiệm: môi trƣờng lên men (LMTL), môi trƣờng
peptone glycerol (thành phần và cách pha môi trƣờng xem phụ lục 1). Chỉnh pH
môi trƣờng về 7. Tỷ lệ cấy giống là 5%. Ủ ở nhiệt độ phòng, bao tối và lắc 150
vòng/phút trên máy lắc.
Sau 9h, 24h, 33h, 48h. Tiếp liệu glycerol trên môi trƣờng lên men (LMTL) và
môi trƣờng peptone glycerol (PGTL) tiếp liệu với nồng độ glycerol là 5 g/l.
Đối chứng môi trƣờng peptone glycerol (PG) không tiếp liệu.
Tiến hành đo OD499nm và OD620nm tại các mốc thời gian:
t = 0h, t = 9h, t = 24h, t = 33h, t = 48h, t = 57h.
Vẽ đƣờng cong tăng trƣởng và đƣờng cong tổng hợp sắc tố của chủng vi sinh
vật.
2.4.3.2. Phương pháp khảo sát thiết lập chế độ lên men
Tăng sinh vi khuẩn trong môi trƣờng nhân giống peptone glycerol vô trùng ở
nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trên máy lắc và ủ tối trong 24h.
Pha các môi trƣờng thử nghiệm: môi trƣờng peptone glycerol (PGTL) (thành
phần và cách pha môi trƣờng xem phụ lục 1). Chỉnh pH môi trƣờng về 7. Tỷ lệ cấy
giống là 5%. Ủ ở nhiệt độ phòng, bao tối và lắc 150 vòng/phút trên máy lắc.
Sau 9h, 24h, 33h, 48h. Tiếp liệu glycerol môi trƣờng peptone glycerol (PGTL) với
nồng độ glycerol là 2.5 g/l, 5 g/l. 7.5 g/l và 10 g/l theo sơ đồ sau:
45
Đồ án tốt nghiệp
Chủng vi khuẩn Serratia
marcescens SH4
Tăng sinh trên môi
trƣờng PG
Lên men trên Lên men trên
môi trƣờng
môi trƣờng PG
PGTL
Tiếp liệu Tiếp liệu Tiếp liệu Tiếp liệu
Glycerol Glycerol 5 Glycerol Glycerol
2.5 g/l g/l 7.5 g/l 10 g/l
0h 9h 24h 33h 48h 57h
Đo prodigiosin OD = 499nm
Đo độ đục (mật độ tế bào) OD = 620nm
Hình 2.6 Quy trình tiếp liệu glycerol
46
Đồ án tốt nghiệp
Đối chứng môi trƣờng peptone glycerol (PG) không tiếp liệu.
Tiến hành đo OD499nm và OD620nm tại các mốc thời gian:
t = 0h, t = 9h, t = 24h, t = 33h, t = 48h, t = 57h.
Vẽ đƣờng cong tăng trƣởng và đƣờng cong tổng hợp sắc tố của chủng vi sinh
vật.
2.4.4. Phương pháp phân tích
2.4.4.1. Phương pháp định lượng hợp chất prodigiosin
Mục đích
Xác định đƣợc lƣợng hợp chất prodigiosin có trong mẫu từ đó đƣa ra kết
luận cho thí nghiệm.
Nội dung
Nồng độ hợp chất prodigiosin đƣợc xác định dựa vào đƣờng chuẩn hợp
chất và giá trị đo OD tại λmax của hợp chất prodigiosin.
2.4.4.2. Phương pháp xử lý số liệu thống kê
Các số liệu thô đƣợc xử lý outlier trên phần mềm Statgraphics Centurion
XV. Các số liệu sau đó đƣợc phân tích ANOVA và đƣợc trắc nghiệm phân
hạng LSD với mức ý nghĩa 0,05.
Các số liệu đƣợc tính toán và xử lý trên phần mềm Microsoft Office Excel
2010. Các biểu đồ cũng đƣợc thể hiện bằng phần mềm này.
47
Đồ án tốt nghiệp
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Chọn lọc chủng vi khuẩn Serratia marcescens sinh tổng hợp enzyme
ngoại bào và prodigiosin cao nhất
Để đạt mục tiêu trên, các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB đƣợc nuôi cấy
trong môi trƣờng peptone glycerol. Dịch nuôi cấy đƣợc đƣa đi khảo sát hoạt tính
enzyme ngoại bào protease, chitinase bằng phƣơng pháp khuếch tán trên giếng
thạch và lipase bằng phƣơng pháp cấy điểm. Đồng thời prodigiosin đƣợc trích ly từ
dịch nuôi cấy bằng Ethanol:HCl 1N (95:5, vv) và xác định nồng độ nhờ phƣơng
pháp đo OD535nm và xác định nồng độ prodigiosin sau khi thay giá trị OD535nm vào
2
phƣơng trình đƣờng chuẩn prodigiosin y = 1,1003x + 0.0041 (R = 0,9991) (Nguyễn
Hoàng Anh Kha, 2013).
3.1.1. Khả năng tiết enzyme ngoại bào
Mục tiêu của lên men S.marcescens trong đề tài là sản xuất chế phẩm prodigi-
osin thô từ đó tạo chế phẩm diệt sâu. Xoang máu và ống tiêu hóa của côn trùng
đƣợc cấu thành từ các thành phần chính gồm lipid, protein và bộ xƣơng ngoài là
chitin. Ngoài việc thu nguồn prodigiosin thì chủng vi sinh vật chọn lọc cần đòi hỏi
phải tổng hợp các enzyne ngoại bào có khả năng thủy phân protein, lipid và chitin
Thử nghiệm hoạt tính protease
Sau khi bổ sung dịch nuôi cấy vi khuẩn sống vào giếng thạch môi trƣờng chứa
casein, ủ 24 giờ và nhỏ thuốc thử trichloroacetic acid (TCA), đo vòng phân giải ca-
sein. Phần còn lại là casein chƣa bị thủy phân sẽ tác dụng với TCA tạo thành phức
hợp tủa có màu trắng đục.
Kết quả khi tiến hành trên môi trƣờng casein thì tất cả các chủng đều có khả
năng phân giải casein là nhƣ nhau . Xung quanh vòng phân giải là phức hợp TCA –
casein trắng đục dễ dàng nhận thấy (hình 3.1 và bảng 3.1).
48
Đồ án tốt nghiệp
SH4
SH5
HB
Hình 3.1 Khả năng tiết ezyme protease của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và
HB
Thử nghiệm hoạt tính lipase
Lipase xúc tác thủy phân các cầu nối ether của triacylglycerol để tạo ra
glycerol acid béo. Có thể dễ dàng phát hiện enzyme lipase của vi sinh vật trên môi
trƣờng đĩa thạch chứa tween 80 và CaCl2. Lipase sẽ thủy phân tween 80 trong môi
trƣờng tạo ra các acid béo, các acid béo đƣợc giải phóng sẽ kết tủa với muối
calcium trong môi trƣờng. Phức hợp acid béo – calcium sẽ làm đục môi trƣờng
xung quanh điểm cấy.
49
Đồ án tốt nghiệp
Kết quả khi tiến hành thử nghiệm hoạt tính lipase có thấy sự hiện diện của
enzyme lipase của các chủng vi sinh vật thử nghiệm. Tween 80 bị enzyme lipase
thủy phân tạo ra các acid béo và các acid béo này tạo phức với Ca2+ làm môi trƣờng
xung quanh vết cấy trắng đục. Kết quả hình 3.2 và bảng 3.1 thì chủng SH4 và HB là
các chủng có khả năng phân giải casein mạnh nhất với đƣờng kính vòng phân giải
(D – d) mm trên môi trƣờng tween là 27,3 A ± 1,70 và 24,7 AB ± 1,25, chủng SH5 có
khả năng phân giải casein kém nhất với đƣờng kính vòng phân giải (D – d) mm trên
môi trƣờng casein là 27,3 A ± 1,70.
SH4 SH5 HB
Hình 3.2 Khả năng tiết ezyme lipase của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB
Thử nghiệm hoạt tính chitinase
Sau khi bổ sung dịch nuôi cấy vi khuẩn sống vào giếng thạch môi trƣờng
thạch huyền phù chitin chứa 1% chitin, ủ 24 giờ và nhỏ thuốc thử lugol, đo vòng
phân giải chitin.
Khi chitinase có mặt trong môi trƣờng chitin nó sẽ phân giải chitin thành N-
acetyl glucosamine và cấu trúc mạch ngắn hơn không băt màu với thuốc thử lugol.
Khi tác dụng với thuốc thử lugol, độ lớn của phần môi trƣờng trong suốt phản ánh
hoạt tính chitinase của chủng vi sinh vật.
Khi bổ sung dịch vi khuẩn vào giếng thạch trên môi trƣờng thạch huyền phù
chitin chứa 1% chitin, kết quả hình 3.2 các chủng khảo sát đều không có hoạt tính
chitinase. Kết luận các chủng vi sinh vật không có khả năng tiết enzyme chitinase
phân giải chitin có trong môi trƣờng.
50
Đồ án tốt nghiệp
SH4 SH5 HB
Hình 3.3 Khả năng tiết ezyme chitinase của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và
HB.
Bảng 3.1 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng S.marcescens
SH4, SH5 và HB.
Stt Chủng Đƣờng kính vòng phân giải (D – d) mm trên môi trƣờng
khảo sát tƣơng ứng
Casein agar Tween 80 agar Chitin agar
1 SH4 37,0A ± 4,32 24,7 AB ± 1,25 0
2 SH5 32,0A ± 6,68 24,0 B ± 0,82 0
3 HB 37,7A ± 4,11 27,3 A ± 1,70 0
Nhƣ vậy dịch nuôi cấy các chủng S.marcescens phân lập từ tuyến trùng EPN
trên môi trƣờng peptone glycerol chứa enzyme protease và lipase, trong khi đó
không thể hiện hoạt tính chitinase. Theo Brurberg và cộng sự, 2010; Shingh và cộng
sự, 2007 và nhiều tác giả khác thì S. marcescens có khả năng tiết enzyme ngoại bào
chitinnase. Điều này cho thấy hoạt tính chitinase của các chủng trên là có thể là
không ổn định hoặc trong thời gian bảo quản đã mất hoạt tính của enzyme chitinase.
Trong 3 hoạt tính enzyme ngoại bào liên quan đến khả năng diệt sâu của các
chủng Serratia marcescens thì còn giữ đƣợc 2 trong 3 hoạt tính, điều này cho thấy
quá trình giữ giống gốc vô cùng quan trọng đối vi sinh công nghiệp. Theo K Ishii et
al. (J Invertebr Pathol 117, 61-67. 2014), Serralysin metalloprotease góp phần vào
cơ chế gây bệnh của S.marcescens đối với côn trùng bằng cách ức chế quá trình làm
lành vết thƣơng, dẫn đến tổn thất lớn huyết tƣơng từ ấu trùng tằm (silkworm lar-
51
Đồ án tốt nghiệp
vae). Kết quả của thí nghiệm cho thấy hai chủng SH4 và HB có khả năng tổng hợp
protease cao nhất, góp phần vào hoạt tinh diệt sâu của các chủng S.marcescens.
3.1.2. Trích ly thu prodigiosin
Prodigiosin đƣợc biết đến là sắc tố đỏ có bản chất là một chất chuyển hóa thứ
cấp chỉ xuất hiện sau giai đoạn phát triển của vi khuẩn S. mercescens, và đƣợc nghiên
cứu từ lâu để ứng dụng hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học nhƣ hoạt động ức chế
miễn dịch, kháng ung thƣ, kháng khuẩn và một số nấm mốc cũng nhƣ có khả năng
diệt sâu...Những nghiên cứu trƣớc đó cho thấy prodigiosin thể hiện hiệu lực diệt sâu
khoang Spodoptera litura và sâu xanh da láng Spodoptera exigua. Để sản xuất chế
phẩm diệt sâu chứa prodigiosin ta có có hai cách là sử dụng trực tiếp dịch canh
trƣờng vi khuẩn sau lên men hoặc trích ly thu hồi prodigiosin. Vì vậy ngƣời thực
hiện đề tài so sánh khả năng sinh tổng hợp prodigiosin từ các chủng SH4, SH5 và
HB trong môi trƣờng peptone glycerol. Với mục đích tiêu diệt tế bào vi khuẩn nhằm
đảm bảo an toàn sinh học ngƣời thực hiện đề tài tiến hành xử lý dịch canh trƣờng
bằng acid HCl 1N và trung hòa bằng NaOH về pH trung tính. Để đánh giá khả năng
sinh tổng hợp prodigiosin của các chủng nghiên cứu ngƣời thực hiện đề tài đo
OD499nm và OD620nm dịch canh trƣờng sau xử lý acid (Mekhael và Yuosif, 2009) và
song song đó tiến hành trích ly thu prodigiosin bằng dung môi Ethanol:HCl 1N
(95:5, v:v) để thu sắc tố đỏ. Sau khi cô quay mẫu sau trích ly lỏng lỏng, định mức
lên 25ml và pha loãng 100 lần mỗi mẫu bằng dung môi Ethanol:HCL 1N (95:5,
v:v), ngƣời thực hiện đề tài tiến hành đo OD535nm, xác định nồng độ prodigiosin thu
đƣợc sau trích ly bằng cách thay giá trị OD vào phƣơng trình đƣờng chuẩn prodigi-
2
osin y = 1,1003x + 0.0041 (R = 0,9991) (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013).
52
Đồ án tốt nghiệp
Bảng 3.2 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD499nm) , tế bào (OD620nm) sau
xử lý acid và (OD535nm) sắc tố sau trích ly của các chủng S.marcescens SH4,
SH5 và HB.
STT Chủng vi OD499nm OD620nm hiệu OD535nm hiệu
khuẩn hiệu chỉnh chỉnh chỉnh
1 SH4 9,739A±0,25 4,004B±0,06 12,42A±0,49
2 SH5 8,461B±0,5 3,383C±0,04 7,617C±0,14
3 HB 10,21A±0,51 4,480A±0,11 11,13B±0,51
14 12,42 a
11,13 b
12
9,739 a 10,21 a
10 8,461 b
7,617 c
8
OD499nm
6
4,004 b 4,480 a OD620nm
3,383 c
OD hiệu chỉnh OD hiệu 4 OD535nm
2
0
SH4 SH5 HB
Chủng vi khuẩn
Hình 3.4 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD 499) và tế bào (OD 620) của các
chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB.
Từ kết quả ở bảng 3.2 và hình 3.4, ngƣời thực hiện đề tài nhận thấy rằng các
chủng có khả năng sinh prodigiosin cao nhất là chủng SH4 và HB thể hiện qua giá
trị OD499nm (đo prodigiosin trực tiếp trong canh trƣờng) và kết quả OD535nm (đo pro-
digiosin sau trích ly).
53
Đồ án tốt nghiệp
Tóm lại hai chủng SH4 và HB vừa có khả năng sinh tổng hợp prodigiosin và
enzyme protease, lipase nhƣ nhau; cao hơn chủng SH5 trong cùng một điều kiện
khảo sát. Trong khuôn khổ của đồ án tốt nghiệp ngƣời thực hiện đề tài sẽ sử dụng
chủng S.marcescens SH4 để thực hiện các thử nghiệm tiếp theo. Dựa vào đƣờng
chuẩn thì chủng SH4 khi tổng hợp prodigiosin thì nồng độ cực đại thu đƣợc sau
trích ly là 13,67 mg/ml trong điều kiện nuôi cấy phòng thí nghiệm.
3.1.3. So sánh hình thái, sinh lý, khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng SH4
với chủng SH1 (ĐATN Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013)
Hình thái khuẩn lạc
A C
B D
Hình 3.5 Hình thái khuẩn lạc của chủng SH4 và SH1
A. Khuẩn lạc của chủng SH4 trên môi trƣờng PGA.
B. Khuẩn lạc của chủng SH4 soi nghiêng trên môi trƣờng PGA.
Dựa vào kết quả soi khuẩn lạc hình 3.5 thì ch...arcescens. Microbiology and Immunology 35: 607- 614.
Kenichi Ishii, Tatsuo Adachi, Takashii Hara, Hiroshi Hamamoto,
Kazuhisa Sekimizu. (2014). Identification of a Serratia marcescens virulence
factor that promotes hemolymph bleeding in the silkworm, Bombyx mori, J In-
vertebr Pathol 117, 61-67.
Krishna J.G. (2008) Pigment production by marine Serratia sp. BTWJ8,
PhD dissertation, Microbial Technology Laboratory, Department of Biotech-
nology Cochin University of Science and Technology, Kerala, India.
Lawanson A.O. and Sholeye F.O. (1975). Inhibition of prodigiosin for-
mation in Serratia marcescens by adenosine triphosphate, Experientia, 32: 439-
440.
Lewis S.M., Corpe W.A. (1964). Prodigiosin producing bacteria from ma-
rine sources, Appl Microbiol, 12: 13-17.
Lynch, D. L., T. E. Worthy, and G. C. Kresheck (1968) Chromatographic
separation of the pigment fractions from a Serratia marcescensstrain. Appl.
Microbiol. 16: 13-20.
Mandarville R.A. (2001). Synthesis, Proton affinity and Anticancer properties
of the prodigiosin group of natural product, Curr Med Chem, 1: 195-218.
Matsuyama, T., Murakami, T., Fujita, M., Fujita, S.and Yano, T. (1986).
Extracellular vesicle formation and biosurfactant production by Serratia
marcescens. Journal of General Microbiology 132: 865-875.
Mekhael, R., Yousif, S. Y. (2009). The role of red pigment produced
by Serratia marcescens as antibacterial and plasmid curing agent. Journal
of Duhok University12: 268-274.
Maeda, H., and K. Morihara. 1995. Serralysin and related bacterial
proteinases. Methods Enzymol. 248 :395-413.
74
Đồ án tốt nghiệp
Nakashima, Tamura, Kurachi, M., Yamaguchi, K. and Oda, T.
(2005).Apoptosis-mediated cytotoxicity of prodigiosin-like red pigment produced
by gammaProteobacterium and its multiple bioactivities. Biological and
Pharmaceutical Bulletin 28: 2289–2295.
Qadri S.M.H. and Williams R.P. (1972). Induction of Prodigiosin Biosyn-
thesis after Shift-Down in Temperature of Nonproliferating Cells of Serratia
marcescens, Appl. Microbiol, 23: 704-709.
Ramina M. và Samira Y.Y. (2009). The role of red pigment produced by
Serratia marcescens as antibacterial and plasmid curing agent, University of
Duhok, vol 12: 268-274.
Rosenberg, M., Y. Blumberger, H. Judes, R. Barness, E. Rubinstein, and Y.
Mazor (1986) Cell surface hydrophobicity of pigmented and nonpigmented clinical
Serratia marcescensstains. Infect. Immun.51: 932-935.
Rokem, J. S. and P. Weitzman (1987) Prodigiosin formation by Serratia
marcescensin a chemostat. Enzyme Microb. Technol. 9: 53-155
Sole, M., A. Francia, N. Rius, and J. G. Loren (1997). The role of pH in the
glucose effect on prodigiosin production by non-proliferating cells of Serratia mar-
cescens. Lett. Appl. Microbiol. 25: 81-84.
Sole, M., Francia, A., Rius, N. and Loren, J.G. (1997).The role of pH in the
‘glucose effect’ on prodigiosin production by non-proliferating cells of
Serratia marcescens. Letters in Applied Microbiology 25: 81–84.
Yutaka Kida, Hiroyoshi Inoue, Koichi Kuwano, 2007; Serratia marcescens
Serralysin Indues Inflammatory responses through protease.
75
Đồ án tốt nghiệp
PHỤ LỤC
A. PHỤ LỤC A. THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƢỜNG, THUỐC THỬ,
PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
Môi trƣờng Peptone glycerone agar
Peptone 5,00 gram/lít
Glycerone 10,00 ml/lít
Agar 18,00 gram/lít
Môi trƣờng Peptone glycerone broth
Peptone 5,00 gram/lít
Glycerone 10,00 ml/lít
Môi trƣờng thử nghiệm hoạt tính lipase (gram/lit)
Glucose 1,00
Yeast extract 3,6
Tween 80 30,00 ml
NH4Cl 5,00
K2HPO4 0,10
MgCl2 0,01
CaCl2 0.444
pH cuối ở 250C là 7,0 ± 0,2
Thành phần môi trƣờng casein (gram/lít)
Casein 10,00
Agar 15,00
Thảnh phần môi trƣờng thạch huyền phù chitin
Dịch huyền phù chitin 1% 100ml
Agar 1,50g
Môi trƣờng nhân giống 1 (MT1)
Meat 3,00 gram/lít
76
Đồ án tốt nghiệp
Yeast extract 5.33 gram/lít
Sucrose 11,72 gram/lít
Môi trƣờng nhân giống 2 (MT2)
Glycerol 10,00 gram/lít
Tryptone 2,00 gram/lít
Yeast extract 1,00 gram/lít
(NH4)2SO4 6,00 gram/lít
K2HPO4 10,00 gram/lít
NaCl 0.5 gram/lít
MgSO4 0.5 gram/lít
Môi trƣờng lên men (MTLM)
Glycerol 10,00 gram/lít
Tryptone 10,00 gram/lít
Yeast extract 10,00 gram/lít
Chuẩn bị dịch huyền phú chitin 1% theo phƣơng pháp của Dai et al., (2011)
Do đặc tính của chitin không tan trong nƣớc nên để tiến hành xác định hoạt
tính của enzyme chitinase cần huyền phù chitin.
- Lấy 1g chitin hòa tan trong 20ml HCl đậm đặc đặc khuấy đều và để ở
40C qua đêm. Thêm vào hỗn hợp 200ml ethanol lạnh (-100C) khuấy đều thật nhanh
và ủ qua đêm.
- Dịch huyền phù đƣợc thu lại bằng cách lọc hoặc ly tâm (4000
vòng/phút trong 20 phút). Huyền phù này đƣợc đƣợc rửa với nƣớc cất nhiều lần cho
đến khi pH trung tính. Thêm vào tủa nƣớc cất cho đến thể tích 100ml. Sau đó bảo
quản lạnh dịch huyền phù.
Chuẩn bị hóa chất nhuộm Gram
- Dung dịch Drystal violet
2g crystal violet hòa tan trong 20ml ethanol 96%
0,8g ammon oxalat hòa tan trong 80ml nƣớc cất
77
Đồ án tốt nghiệp
Trộn hai dung dịch nói trên với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc. Bảo quản trong lọ tối,
sử dụng đƣợc vài tháng.
- Dung dịch Iodine
Hòa tan 1g iodine trong 3 – 5ml nƣớc cất, thêm 2g KI (Kali iodide), khuấy cho
tan hết, thêm nƣớc cất cho đủ 300ml. Bảo quản trong lọ tối.
- Dung dịch tẩy màu: Ethanol 96%
- Dung dịch nhuộm bổ sung
0,3g fuchsin kiềm hòa tan trong 10ml ethanol 96%
5g phenol hòa tan trong 95ml nƣớc cất
Trộn hai dung dịch nói trên rồi pha loãng 5 lần. Bảo quản trong lọ tối.
Phƣơng pháp quan sát hình thái sinh lý, sinh hóa
Soi khuẩn lạc
Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng PGA. Dùng dao sắc, nhỏ, cắt một miếng
thạch mỏng, mép cắt sát với mép khuẩn lạc. Quan sát dƣới kính hiển vi ở hai góc độ
là từ trên xuống và soi nghiêng ở vật kính 4X và 10X.
Nhuộm Gram:
Nguyên tắc nhuộm Gram:
Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm
tím kết tinh và iod mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau:
Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không rửa
trôi khi xử lý bằng cồn. Vi sinh vật có phức chất này là vi khuẩn Gram dƣơng.
Loại phức chất thứ hai không giữ đƣợc màu thuốc nhuộm nên mất màu khi xử
lý bằng cồn và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung. Vi sinh vật có phức chất này là vi
khuẩn Gram âm.
Các bƣớc tiến hành:
Tăng sinh chủng vi khuẩn vứa chọn lọc với chủng vi khuẩn đối chứng là
Serratia marcescens SH1 trong môi trƣờng PG 24 giờ, lắc 150 vòng/phút trong tối ờ
nhiệt độ phòng.
Làm tiêu bản
78
Đồ án tốt nghiệp
- Chọn lame sạch và khô. Dùng que cây vô trùng lấy một chút sinh khối
vi sinh vật làm vết bôi trên lame.
- Dùng kẹp gỗ ho nhẹ mặt dƣới của lame trên ngọn lửa đèn cồn để cố
định vết bôi.
Nhuộm tiêu bản
- Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm Crystal violet trong 1 phút, rửa
nƣớc, thấm khô.
- Nhuộm lại bằng dung dịch Iodine trong 1 phút, rửa nƣớc, thấm khô.
- Tẩy cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn
cho đến khi tan hết màu, rửa nƣớc, thấm khô.
- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fuchsin 30 giây, rửa nƣớc, thấm khô.
- Quan sát vi sinh vật dƣới kính vật kính 100X với một giọt dầu soi
kính. Vi khuẩn Gram âm sẽ bắt màu hồng, vi khuẩn Gram dƣơng sẽ bắt màu tím.
Bảng 1. Giá thành phần môi trƣờng:
STT Hóa chất Đơn vị Giá (Đồng) Giá (1gram,
1ml/đồng)
1 Tryptone 500g/chai 880000 1760
2 Glycerol 1 lít 121000 121
3 Meat extract 250g/chai 530000 2120
4 Yeast extract 500g/chai 660000 1320
5 Sucrose 1kg 18000 18
6 (NH4)2SO4 1kg 100000 100
7 K2HPO4 1kg 154000 154
8 NaCl 1kg 66000 66
9 MgSO4 1kg 77000 77
79
Đồ án tốt nghiệp
Bảng 2. Bảng giá môi trƣờng 1 (môi trƣờng thu sinh khối cực đại - ĐATN
Nguyễn Thị Tâm, 2010)
STT Hóa chất Số lƣợng (g/l) Giá (đồng)
1 Meat extract 3 6360
2 Yeast extract 5,33 7035.6
3 Sucrose 11.72 210.96
Tổng tiền 13606.56
Bảng 3. Bảng giá môi trƣờng 2 (môi trƣờng thu sinh khối theo J.-L. Tao và
cộng sự, 2005)
STT Hóa chất Số lƣợng (g/l) Giá (đồng)
1 Glycerol 10 1210
2 Tryptone 2 3520
3 NaCl 0.5 33
4 MgSO4 0.5 38.5
5 K2HPO4 10 1540
6 (NH4)2SO4 6 600
7 Yeast extract 1 1320
Tổng tiền 8261.5
Bảng 4. Bảng giá môi trƣờng lên men (môi trƣờng lên men theo J.-L. Tao
và cộng sự, 2005)
STT Hóa chất Số lƣợng (g/l) Giá (đồng)
1 Tryptone 10 17600
2 Yeast extract 10 13200
3 Glycerol 10 1210
Tổng tiền 32010
80
Đồ án tốt nghiệp
Bảng 5. Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4
trên môi trƣờng lên men PG tại các nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian.
Stt Thời OD 499nm hiệu chỉnh
gian ĐC 2.5 g/l 5 g/l 7.5 g/l 10 g/l
(h)
1 0 0,184J±0,004 0,184J±0,004 0,184J±0,004 0,184J±0,004 0,184J±0,004
2 9 1,183I±0,059 1,205I±0,016 1,092G±0,051 1,183I±0,091 1,169I±0,022
3 24 2,836GH±0,06 7,593CD±0,27 3,094G±0,137 2,462GH±0,107 2,570GH±0,098
3 1
4 33 3,261EF±0,10 7,841C±0,241 6,903DE±0,17 2,955GH±0,368 2,433GH±0,144
5 9
5 48 3,858F±0,285 10,69A±0,696 6,965DE±0,41 2,265H±0,049 2,475GH±0,107
3
6 57 3,258FG±0,20 9,473B±0,548 6,5E±0,498 2.223H±0,066 2,217H±0,042
7
81
Đồ án tốt nghiệp
B. PHỤ LỤC B. HÌNH ẢNH
SH4 SH5 HB
Hình 1 Dịch canh trƣờng của các chủng vi khuẩn Serratia marcescens
sau khi xử lý acid
SH4 SH5 HB
Hình 2 Dịch canh trƣờng của các chủng vi khuẩn Serratia maecescens
sau khi ly tâm.
82
Đồ án tốt nghiệp
Hình 3 Sau quá trình trích ly lỏng- lỏng với hệ dung môi
petroleum ether: nƣớc muồi bảo hòa (2:3, v:v).
SH4 SH5 HB
Hình 4 H ợp chất prodigiosin sau khi trích ly bằng bỗn hợp dung môi Ethanol:HCl (95:5).
83
Đồ án tốt nghiệp
MT1 MT2 PG
0H
4H
8H
16H
20H
24H
Hình 5 Tốc độ tăng trƣởng của vi khuẩn Serratia marcescens SH4 trên các môi
trƣờng nhân giống theo thời gian
84
Đồ án tốt nghiệp
ĐC PG LM
0H
9H
24H
33 H
48 H
57H
Hình 6 Tốc độ tăng trƣởng và tổng hợp prodigiosin của vi khuẩn Serratia
marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống
MT2 theo thời gian.
85
Đồ án tốt nghiệp
ĐC PG LM
0H
9H
24H
33H
48H
57H
Hình 7 Tốc độ tăng trƣởng và tổng hợp prodigiosin của vi khuẩn Serratia
marcescens SH4 trên các môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống
PG theo thời gian.
86
Đồ án tốt nghiệp
ĐC 2,5 G/L 5 G/L 7,5 G/L 10 G/L
0h
0H
9H
24H
33H
48H
57H
Hình 8 Tốc độ tăng trƣởng và tổng hợp prodigiosin của vi khuẩn Serratia
marcescens SH4 trên môi trƣờng PG theo thời gian.
87
Đồ án tốt nghiệp
12
Môi trường PG đối
10 chứng
8 Môi Trường PG tiếp
liệu glycerol 2.5 g/l
6 Môi Trường PG tiếp
liệu glycerol 5 g/l
4
Môi Trường PG tiếp
OD 499nm hiệu chỉnh499nmhiệuOD 2 liệu glycerol 7.5 g/l
Môi Trường PG tiếp
0 liệu glycerol 10 g/l
0 20 40 60
Thời gian (h)
Hình 9. Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên môi
trƣờng lên men PG tại các nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian.
88
Đồ án tốt nghiệp
C. PHỤ LỤC C. SỐ LIỆU THỐNG KÊ
1. Thí nghiệm chọn chủng vi sinh
A. Thí nghiệm hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng Serratia
marcescens SH4, SH5 và HB
Hoạt tính protease
Class Level Information
Class Levels Values
CHUNG 3 Hb Sh4 Sh5
Number of Observations Read 9
Number of Observations Used 9
Dependent Variable: PRODI
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 2 57.5555556 28.7777778 0.72 0.5256
Error 6 240.6666667 40.1111111
Corrected Total 8 298.2222222
R-Square Coeff Var Root MSE PRODI Mean
0.192996 17.81250 6.333333 35.55556
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
CHUNG 2 57.55555556 28.77777778 0.72 0.5256
t Tests (LSD) for PRODI
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the
experimentwise error rate.
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 6
Error Mean Square 40.11111
Critical Value of t 2.44691
Least Significant Difference 12.653
89
Đồ án tốt nghiệp
Means with the same letter are not significantly different.
t Grouping Mean N CHUNG
A 37.667 3 Hb
A 37.000 3 Sh4
A 32.000 3 Sh5
Hoạt tính lipasease
Class Level Information
Class Levels Values
CHUNG 3 Hb Sh4 Sh5
Number of Observations Read 9
Number of Observations Used 9
Dependent Variable: PRODI
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 2 18.66666667 9.33333333 3.65 0.0917
Error 6 15.33333333 2.55555556
Corrected Total 8 34.00000000
R-Square Coeff Var Root MSE PRODI Mean
0.549020 6.310305 1.598611 25.33333
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
CHUNG 2 18.66666667 9.33333333 3.65 0.0917
t Tests (LSD) for PRODI
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the
experimentwise error rate.
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 6
Error Mean Square 2.555556
Critical Value of t 2.44691
Least Significant Difference 3.1939
90
Đồ án tốt nghiệp
Means with the same letter are not significantly different.
t Grouping Mean N CHUNG
A 27.333 3 Hb
B A 24.667 3 Sh4
B 24.000 3 Sh5
B. Thí nghiệm trích ly thu prodigiosin từ các chủng Serratia
marcescens SH4, SH5 và SH1
OD 499nm hiệu chỉnh sau xử lý acid
Class Level Information
Class Levels Values
CHUNG 3 Hb Sh4 Sh5
Number of Observations Read 9
Number of Observations Used 9
Dependent Variable: PRODI
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 2 4.91372356 2.45686178 8.50 0.0178
Error 6 1.73431200 0.28905200
Corrected Total 8 6.64803556
R-Square Coeff Var Root MSE PRODI Mean
0.739124 5.677383 0.537636 9.469778
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
CHUNG 2 4.91372356 2.45686178 8.50 0.0178
t Tests (LSD) for PRODI
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the
experimentwise error rate.
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 6
Error Mean Square 0.289052
91
Đồ án tốt nghiệp
Critical Value of t 2.44691
Least Significant Difference 1.0741
Means with the same letter are not significantly different.
t Grouping Mean N CHUNG
A 10.2093 3 Hb
A 9.7393 3 Sh4
B 8.4607 3 Sh5
OD 620 nm hiệu chỉnh sau xử lý acid
Class Level Information
Class Levels Values
CHUNG 3 Hb Sh4 Sh5
Number of Observations Read 9
Number of Observations Used 9
Dependent Variable: PRODI
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 2 1.81448089 0.90724044 103.37 <.0001
Error 6 0.05265867 0.00877644
Corrected Total 8 1.86713956
R-Square Coeff Var Root MSE PRODI Mean
0.971797 2.368249 0.093683 3.955778
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
CHUNG 2 1.81448089 0.90724044 103.37 <.0001
t Tests (LSD) for PRODI
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the
experimentwise error rate.
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 6
Error Mean Square 0.008776
92
Đồ án tốt nghiệp
Critical Value of t 2.44691
Least Significant Difference 0.1872
Means with the same letter are not significantly different.
t Grouping Mean N CHUNG
A 4.48000 3 Hb
B 4.00400 3 Sh4
C 3.38333 3 Sh5
OD 535 nm hiệu chỉnh sau trích ly
Class Level Information
Class Levels Values
CHUNG 3 Hb Sh4 Sh5
Number of Observations Read 9
Number of Observations Used 9
Dependent Variable: PRODI
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 2 37.03012356 18.51506178 71.62 <.0001
Error 6 1.55117511 0.25852919
Corrected Total 8 38.58129867
R-Square Coeff Var Root MSE PRODI Mean
0.959795 4.895082 0.508458 10.38711
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
CHUNG 2 37.03012356 18.51506178 71.62 <.0001
t Tests (LSD) for PRODI
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the
experimentwise error rate.
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 6
Error Mean Square 0.258529
93
Đồ án tốt nghiệp
Critical Value of t 2.44691
Least Significant Difference 1.0158
Means with the same letter are not significantly different.
t Grouping Mean N CHUNG
A 12.4167 3 Sh4
B 11.1280 3 Hb
C 7.6167 3 Sh5
C. So sánh hoạt tính enzyme của chủng SH4 với SH1
Hoạt tính enzyme protease
Class Level Information
Class Levels Values
CHUNG 2 Sh1 Sh4
Number of Observations Read 6
Number of Observations Used 6
Dependent Variable: PRODI
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 1 0.28166667 0.28166667 3.60 0.1308
Error 4 0.31333333 0.07833333
Corrected Total 5 0.59500000
R-Square Coeff Var Root MSE PRODI Mean
94
Đồ án tốt nghiệp
R-Square Coeff Var Root MSE PRODI Mean
0.473389 10.17749 0.279881 2.750000
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
CHUNG 1 0.28166667 0.28166667 3.60 0.1308
t Tests (LSD) for PRODI
Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the
experimentwise error rate.
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 4
Error Mean Square 0.078333
Critical Value of t 2.77645
Least Significant Difference 0.6345
Means with the same letter
are not significantly different.
t Grouping Mean N CHUNG
A 2.9667 3 Sh4
A 2.5333 3 Sh1
Hoạt tính enzyme lipase
Class Level Information
Class Levels Values
95
Đồ án tốt nghiệp
Class Level Information
Class Levels Values
CHUNG 2 Sh1 Sh4
Number of Observations Read 6
Number of Observations Used 6
Dependent Variable: PRODI
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 1 0.32666667 0.32666667 4.90 0.0913
Error 4 0.26666667 0.06666667
Corrected Total 5 0.59333333
R-Square Coeff Var Root MSE PRODI Mean
0.550562 4.666245 0.258199 5.533333
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F
CHUNG 1 0.32666667 0.32666667 4.90 0.0913
t Tests (LSD) for PRODI
Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the
experimentwise error rate.
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 4
96
Đồ án tốt nghiệp
Error Mean Square 0.066667
Critical Value of t 2.77645
Least Significant Difference 0.5853
Means with the same letter
are not significantly different.
t Grouping Mean N CHUNG
A 5.7667 3 Sh4
A 5.3000 3 Sh1
2. Thí nghiệm thiết lập môi trƣờng nhân giống
Class Level Information
Class Levels Values
moitruong 4 20h MT1 MT2 PG
thoigian 8 0h 16h 20h 24h 4h 8h MT2 PG
moitruongthoigian 20 20h PG MT1 0h MT1 16h MT1 20h MT1 24h MT1 4h
MT1 8h MT1 MT2 MT2 0h MT2 16h MT2 20h MT2
24h MT2 4h MT2 8h PG 0h PG 16h PG 20h PG 24h
PG 4h PG 8h
Number of Observations Read 81
Number of Observations Used 50
Dependent Variable: Y
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
97
Đồ án tốt nghiệp
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 16 552.9292253 34.5580766 123.94 <.0001
Error 33 9.2016907 0.2788391
Corrected Total 49 562.1309159
R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean
0.983631 13.07694 0.528052 4.038040
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F
moitruong 2 178.8852946 89.4426473 320.77 <.0001
thoigian 5 322.0413832 64.4082766 230.99 <.0001
moitruongthoigian 9 52.0025474 5.7780608 20.72 <.0001
Duncan's Multiple Range Test for Y
Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the
experimentwise error rate.
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 33
Error Mean Square 0.278839
Harmonic Mean of Cell Sizes 2.914286
Note: Cell sizes are not equal.
98
Đồ án tốt nghiệp
Means with the same letter are not
significantly different.
Duncan Grouping Mean N moitruongthoigian
A 9.3210 3 MT1 24h
A 8.6600 3 MT1 20h
A 8.6407 3 MT2 24h
A 8.6000 3 MT2 20h
B 7.2033 3 MT1 16h
B 6.6100 MT2 16h
C 6.0213 3 MT1 8h
C 5.1840 3 MT2 8h
D 2.9020 3 PG 20h
D 2.7510 3 MT1 4h
D 2.7480 2 PG 24h
D 2.0890 3 MT2 4h
D 1.9360 3 PG 16h
E 1.0060 3 PG 8h
E 0.4440 3 MT1 0h
E 0.3890 3 PG 4h
E 0.2253 3 MT2 0h
E 0.0960 3 PG 0h
99
Đồ án tốt nghiệp
3. Thí nghiệm hiết lập môi trƣờng lên men và chế độ lên men
A. Thiết lập môi trƣờng lên men
B. OD 499 nm hiệu chỉnh từ môi trƣờng nhân giống MT2
C. Class Level Information
Class Levels Values
MOITRUONG 3 LM PG PGTL
THOIGIAN 6 0h 24h 33h 48h 57h 9h
MOITRUONGTHOIGIAN 18 LM 0h LM 24h LM 33h LM 48h LM 57h LM
9h PG 0h PG 24h PG 33h PG 48h PG 57h PG
9h PGTL 0h PGTL 24h PGTL 33h PGTL 48h
PGTL 57h PGTL 9h
Number of Observations Read 54
Number of Observations Used 54
Dependent Variable: Y
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 17 99.4524468 5.8501439 36.52 <.0001
Error 36 5.7666000 0.1601833
Corrected Total 53 105.2190468
R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean
0.945194 16.60740 0.400229 2.409944
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F
100
Đồ án tốt nghiệp
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F
MOITRUONG 2 20.20880044 10.10440022 63.08 <.0001
THOIGIAN 5 69.83413306 13.96682661 87.19 <.0001
MOITRUONGTHOIGIAN 10 9.40951333 0.94095133 5.87 <.0001
Duncan's Multiple Range Test for Y
Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experi-
mentwise error rate.
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 36
Error Mean Square 0.160183
Means with the same letter are not
significantly different.
Duncan Grouping Mean N MOITRUONGTHOIGIAN
A 5.0833 3 LM 57h
B 4.3280 3 LM 48h
C B 3.7580 3 LM 33h
C 3.4880 3 PG 48h
C D 3.3880 3 LM 24h
C D E 3.0433 3 PG 33h
F D E 2.7333 3 PG 24h
F D E 2.6907 3 LM 9h
101
Đồ án tốt nghiệp
Means with the same letter are not
significantly different.
Duncan Grouping Mean N MOITRUONGTHOIGIAN
F E 2.5200 3 PGTL 48h
F E 2.3817 3 PGTL 33h
F G E 2.3147 3 PGTL 24h
F G 2.2820 3 PGTL 57h
F G 2.2480 3 PG 57h
H G 1.6060 3 PG 9h
H 1.0410 3 PGTL 9h
I 0.1843 3 LM 0h
I 0.1443 3 PG 0h
I 0.1443 3 PGTL 0h
OD 499 nm hiệu chỉnh từ môi trƣờng nhân giống peptone glycerol
Class Level Information
Class Levels Values
MOITRUONG 2 PGDC PGTL
THOIGIAN 6 0h 24h 33h 48h 57h 9h
MOITRUONGTHOIGIAN 12 PGDC 0h PGDC 24h PGDC 33h PGDC
48h PGDC 57h PGDC 9h PGTL 0h PGTL 24h PGTL 33h PGTL 48h
PGTL 57h PGTL 9h
Number of Observations Read 36
Number of Observations Used 36
Dependent Variable: Y
102
Đồ án tốt nghiệp
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 11 32.07697156 2.91608832 178.14 <.0001
Error 24 0.39287533 0.01636981
Corrected Total 35 32.46984689
R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean
0.987900 7.047129 0.127945 1.815556
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F
MOITRUONG 1 3.35134044 3.35134044 204.73 <.0001
THOIGIAN 5 24.50947689 4.90189538 299.45 <.0001
MOITRUONGTHOIGIAN 5 4.21615422 0.84323084 51.51
<.0001
Duncan's Multiple Range Test for Y
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the
experimentwise error rate.
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 24
Error Mean Square 0.01637
Means with the same letter are not significantly different.
Duncan Grouping Mean N MOITRUONGTHOIGIAN
A 3.6040 3 PGTL 48h
B 3.3640 3 PGTL 57h
C 2.4220 3 PGTL 33h
C 2.3507 3 PGDC 48h
D 1.9800 3 PGDC 33h
E 1.6613 3 PGTL 24h
E 1.5600 3 PGDC 57h
E 1.5053 3 PGDC 24h
F 1.1470 3 PGTL 9h
103
Đồ án tốt nghiệp
F 1.1410 3 PGDC 9h
G 0.5257 3 PGDC 0h
G 0.5257 3 PGTL 0h
OD 620 nm hiệu chỉnh từ môi trƣờng nhân giống peptone glycerol
Class Level Information
Class Levels Values
MOITRUONG 3 LM PG PGTL
THOIGIAN 6 0h 24h 33h 48h 57h 9h
MOITRUONGTHOIGIAN 8 LM 0h LM 24h LM 33h LM 48h LM
57h LM 9h PG 0h PG 24h PG 33h PG 48h PG 57h PG 9h
PGTL 0h PGTL 24h PGTL 33h PGTL 48h PGTL 57h PGTL 9h
Number of Observations Read 54
Number of Observations Used 54
Dependent Variable: Y
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 17 70.23312565 4.13136033 84.86 <.0001
Error 36 1.75256667 0.04868241
Corrected Total 53 71.98569231
R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean
0.975654 13.08162 0.220641 1.686648
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F
MOITRUONG 2 36.27666515 18.13833257 372.58 <.0001
THOIGIAN 5 24.05226254 4.81045251 98.81 <.0001
MOITRUONGTHOIGIAN 10 9.90419796 0.99041980 20.34
<.0001
Duncan's Multiple Range Test for Y
104
Đồ án tốt nghiệp
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the
experimentwise error rate.
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 36
Error Mean Square 0.048682
Means with the same letter are not significantly different.
Duncan Grouping Mean N MOITRUONGTHOIGIAN
A 3.5920 3 LM 57h
A 3.5580 3 LM 33h
A 3.4767 3 LM 24h
A 3.2617 3 LM 48h
B 2.7360 3 LM 9h
C 1.9860 3 PGTL 48h
C 1.9800 3 PGTL 57h
D 1.5693 3 PGDC 48h
E D 1.4600 3 PGTL 33h
E D 1.3483 3 PGDC 33h
E F 1.1587 3 PGDC 24h
E F 1.1467 3 PGTL 24h
G F 0.8200 3 PGDC 9h
G F 0.8190 3 PGTL 9h
G H 0.5320 3 PGDC 57h
H 0.3573 3 LM 0h
H 0.2790 3 PGTL 0h
H 0.2790 3 PGDC 0h
D. Thiết lập chế độ lên men
OD 499 nm hiệu chỉnh
105
Đồ án tốt nghiệp
Class Level Information
Class Levels Values
MOITRUONG 11 PG0h PG24h PG48h PG57h PG9h PGTL0h
PGTL24h PGTL33h PGTL48h PGTL57h
PGTL9h
THOIGIAN 5 10g 2.5g 5g 7.5g DC
MOITRUONGTHOIGIAN 29 PG0h DC PG24h DC PG48h DC PG57h DC
PG9h DC PGTL0h 10g PGTL0h 2.5g PGTL0h
5g PGTL0h 7.5g PGTL24h 10g PGTL24h
2.5g PGTL24h 5g PGTL24h 7.5g PGTL33h
10g PGTL33h 2.5g PGTL33h 5g PGTL33h
7.5g PGTL48h 10g PGTL48h 2.5g PGTL48h
5g PGTL48h 7.5g PGTL57h 10g PGTL57h
2.5g PGTL57h 5g PGTL57h 7.5g PGTL9h
10g PGTL9h 2.5g PGTL9h 5g PGTL9h 7.5g
Number of Observations Read 90
Number of Observations Used 90
Dependent Variable: Y
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 28 740.0586983 26.4306678 136.02 <.0001
Error 61 11.8529948 0.1943114
Corrected Total 89 751.9116931
R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean
106
Đồ án tốt nghiệp
R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean
0.984236 13.46695 0.440808 3.273256
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F
MOITRUONG 10 359.3172470 35.9317247 184.92 <.0001
THOIGIAN 3 231.5961649 77.1987216 397.29 <.0001
MOITRUONGTHOIGIAN 15 149.1452864 9.9430191 51.17 <.0001
Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate,
not the experimentwise error rate.
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 61
Error Mean Square 0.194311
Harmonic Mean of Cell Sizes 3.052632
Note: Cell sizes are not equal.
Means with the same letter are not
significantly different.
Duncan Grouping Mean N MOITRUONGTHOIGIAN
A 10.6890 3 PGTL48h 2.5g
B 9.4733 3 PGTL57h 2.5g
C 7.8407 3 PGTL33h 2.5g
D C 7.5933 3 PGTL24h 2.5g
107
Đồ án tốt nghiệp
Means with the same letter are not
significantly different.
Duncan Grouping Mean N MOITRUONGTHOIGIAN
D E 6.9650 3 PGTL48h 5g
D E 6.9033 3 PGTL33h 5g
E 6.5000 3 PGTL57h 5g
F 3.8580 3 PG48h DC
G F 3.2580 3 PG57h DC
G 3.0940 3 PGTL24h 5g
G H 2.9550 3 PGTL33h 7.5g
G H 2.8355 6 PG24h DC
G H 2.5700 3 PGTL24h 10g
G H 2.4750 3 PGTL48h 10g
G H 2.4620 3 PGTL24h 7.5g
G H 2.4330 3 PGTL33h 10g
H 2.2650 3 PGTL48h 7.5g
H 2.2230 3 PGTL57h 7.5g
H 2.2170 3 PGTL57h 10g
I 1.2053 3 PGTL9h 2.5g
I 1.1827 3 PG9h DC
I 1.1827 3 PGTL9h 7.5g
I 1.1693 3 PGTL9h 10g
108
Đồ án tốt nghiệp
Means with the same letter are not
significantly different.
Duncan Grouping Mean N MOITRUONGTHOIGIAN
I 1.0920 3 PGTL9h 5g
J 0.1840 3 PG0h DC
J 0.1840 3 PGTL0h 10g
J 0.1840 3 PGTL0h 2.5g
J 0.1840 3 PGTL0h 5g
J 0.1840 3 PGTL0h 7.5g
OD 620 nm hiệu chỉnh
Class Level Information
Class Levels Values
MOITRUONG 3 LM PG PGTL
THOIGIAN 6 0h 24h 33h 48h 57h 9h
MOITRUONGTHOIGIAN 18 LM 0h LM 24h LM 33h LM 48h LM 57h LM 9h PG
0h PG 24h PG 33h PG 48h PG 57h PG 9h PGTL 0h
PGTL 24h PGTL 33h PGTL 48h PGTL 57h PGTL
9h
Number of Observations Read 54
Number of Observations Used 54
Dependent Variable: Y
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 17 99.4524468 5.8501439 36.52 <.0001
109
Đồ án tốt nghiệp
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
Error 36 5.7666000 0.1601833
Corrected Total 53 105.2190468
R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean
0.945194 16.60740 0.400229 2.409944
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F
MOITRUONG 2 20.20880044 10.10440022 63.08 <.0001
THOIGIAN 5 69.83413306 13.96682661 87.19 <.0001
MOITRUONGTHOIGIAN 10 9.40951333 0.94095133 5.87 <.0001
Duncan's Multiple Range Test for Y
Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 36
Error Mean Square 0.160183
Means with the same letter are not
significantly different.
Duncan Grouping Mean N MOITRUONGTHOIGIAN
A 5.0833 3 LM 57h
B 4.3280 3 LM 48h
B
C B 3.7580 3 LM 33h
C 3.4880 3 PG 48h
110
Đồ án tốt nghiệp
Means with the same letter are not
significantly different.
Duncan Grouping Mean N MOITRUONGTHOIGIAN
C D 3.3880 3 LM 24h
C D E 3.0433 3 PG 33h
F D E 2.7333 3 PG 24h
F D E 2.6907 3 LM 9h
F E 2.5200 3 PGTL 48h
F E 2.3817 3 PGTL 33h
F G E 2.3147 3 PGTL 24h
F G 2.2820 3 PGTL 57h
F G 2.2480 3 PG 57h
H G 1.6060 3 PG 9h
H 1.0410 3 PGTL 9h
I 0.1843 3 LM 0h
I 0.1443 3 PG 0h
I 0.1443 3 PGTL 0h
111
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- do_an_thiet_lap_quy_trinh_len_men_vi_khuan_serratia_marcesce.pdf