Đồ án Tạo chế phẩm diệt sâu khoang spodoptera litura từ dịch nuôi cấy vi khuẩn serratia marcescens sh1

ố liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác. Tơi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đƣợc cám ơn và các thơng tin trích dẫn trong Luận văn đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015 Sinh viên thực hiện luận văn Lê Thị Ngọc Dung Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trong suốt quãng đời con đi học, chƣa một ngày nào bố mẹ thơi lo lắng và chăm sĩc cho con, nhƣng con khơng mấy khi biểu hiện hay đơn giản là câu nĩi “con thƣơng bố mẹ”. Nhân lúc này đây, con xin đƣợc ghi khắc cơng ơn dƣỡng dục của bố mẹ, cĩ những lúc con vơ tình làm bố mẹ buồn, nhƣng cả hai đã khơng bỏ mặc con với khĩ khăn mà đã luơn dõi theo, giúp đỡ và sát cánh bên con để con đƣợc trƣởng thành đến ngày hơm nay. Bố mẹ là chỗ dựa tinh thần vững chắc mỗi khi con gặp phải vấn đề khĩ khăn; là động lực để con đứng dậy sau mỗi lần vấp ngã; là bách khoa tồn thƣ giúp con giải quyết mọi vấn đề. Và sẽ luơn là nhƣ vậy cho đến mãi sau này. Với lịng biết ơn sâu sắc. Em xin chân thành cảm ơn tồn thể quý thầy cơ trƣờng đại học Cơng nghệ Tp.Hồ Chí Minh đã nhiệt tình truyền đạt cho em những kiến thức quý giá ngay từ những ngày đầu em bƣớc vào giảng đƣờng đại học. Đặc biệt, em xin đƣợc chân thành biết ơn cơ Nguyễn Hồi Hƣơng, ngƣời thầy đáng kính, luơn quan tâm và tận tình chỉ dạy để em cĩ thể hồn thành đồ án. Và quan trọng hơn là cơ đƣa ra những lời khuyên và chỉ dạy em cách đối mặt với những va chạm trong cuộc sống, và đĩ sẽ là những trang vàng trong hành trang sau này của em. Em cũng xin chân thành cảm ơn cơ Nguyễn Thị Hai đã quan tâm và cĩ những hƣớng dẫn đúng lúc khi em đang tập nuơi sâu khoang và cơ là ngƣời cho con nguồn nấm bệnh trong phịng thí nghiệm. Em cũng xin chân thành cảm ơn cơ Đỗ Thị Tuyến đã hết lịng giúp đỡ, hỗ trợ em về địa điểm quét phổ UV – vis. Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành, thầy Nguyễn Trung Dũng, cơ Nguyễn Trần Thái Khanh đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phịng thí nghiệm. Cảm ơn tất cả các bạn lớp 12DSH01 và 12DSH02 đã luơn động viên, giúp đỡ mình trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Cảm ơn anh Nguyễn Hồng Anh Kha, anh Lê Quốc Vũ, bạn Vũ Hồng Minh Ngọc, bạn Kiều Nguyễn Phƣơng Vy, bạn Phan Thị Gìn cùng các em Trƣơng Hồi Nguyên lớp 13DSH03, em Nguyễn Thị Đồ án tốt nghiệp Băng Khanh, em Nguyễn Trung Hậu, em Lê Thị Ngọc Hân đã cùng đồng hành và sát cánh trong suốt những ngày làm đồ án tố nghiệp. Xin chân thành cảm ơn! Tp.Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2016 SVTH: Lê Thị Ngọc Dung Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC ................................................................................................................... i DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. iv DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... v MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 Chƣơng 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 4 1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học ...................................................................... 4 1.1.1 Khái niệm về thuốc trừ sâu sinh học ................................................................ 4 1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học hiện nay ........................................... 4 1.1.3 Những mặt ƣu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học ............................ 5 1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens. ............................................................ 7 1.2.1 Lịch sử phát hiện ................................................................................................ 7 1.2.2 Phân loại khoa học của Serratia marcescens. .................................................... 8 1.2.3 Đặc điểm của Serratia marcescens. ................................................................... 8 1.2.3.1 Đặc điểm sinh lí .............................................................................................. 9 1.2.3.2 Đặc điểm sinh hĩa ........................................................................................... 9 1.2.3.3 Đặc điểm phân bố .......................................................................................... 11 1.3 Một số hợp chất đƣợc tổng hợp từ Serratia marcescens. .................................. 11 1.3.1 Sắc tố ................................................................................................................ 11 1.3.2 Biosurfactants ................................................................................................... 12 1.3.3 Acid béo ........................................................................................................... 13 1.3.4 Enzyme ............................................................................................................. 13 1.3.5 Yếu tố độc lực của Serratia marcescens. ......................................................... 13 1.4 Giới thiệu về Prodigiosin .................................................................................... 14 1.4.1 Khái niệm về prodigiosin ................................................................................. 14 1.4.2 Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin .............................................................. 15 1.4.3 Hoạt động sinh học của prodigiosin ................................................................. 18 ______________________________i______________________________ Đồ án tốt nghiệp 1.5 Tiềm năng tạo chế phẩm trừ sâu từ prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens. ............................................................................................................... 19 1.6 Cơ chế tổng hợp prodigiosin của Serratia marcescens....................................... 20 1.7 Một số nghiên cứu trên thế giới .......................................................................... 25 1.7.1 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens ..................................................... 25 1.7.2 Tình hình nghiên cứu prodigiosin .................................................................... 25 1.8 Khái quát về sâu khoang Spodoptera litura ........................................................ 27 1.8.1 Đặc điểm hình thái ........................................................................................... 27 1.8.2 Đặc điểm sinh học và sinh thái ........................................................................ 28 1.8.3 Thiên địch ......................................................................................................... 29 1.8.4 Biện pháp phịng trừ ......................................................................................... 29 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 30 2.1 Thời gian, địa điểm ............................................................................................. 30 2.1.1 Thời gian .......................................................................................................... 30 2.1.2 Địa điểm ........................................................................................................... 30 2.2 Vật liệu – thiết bị – hĩa chất .............................................................................. 30 2.2.1 Nguồn vi sinh vật ............................................................................................. 30 2.2.1.1 Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens ........................................................... 30 2.2.1.2 Nguồn vi khuẩn chỉ thị .................................................................................. 30 2.2.1.3 Nguồn nấm bệnh ........................................................................................... 31 2.2.1.4 Nguồn sâu khoang Spodoptera litura ........................................................... 31 2.2.2 Mơi trƣờng nuơi cấy và hĩa chất ..................................................................... 31 2.2.3 Dụng cụ, thiết bị ............................................................................................... 31 2.3 Bố trí thí nghiệm ................................................................................................. 33 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm ...................................................... 37 2.4.1 Phƣơng pháp nuơi sâu trong phịng thí nghiệm ............................................... 37 2.4.2 Phƣơng pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens .................................. 37 2.4.2.1 Phƣơng pháp xử lí acid ................................................................................. 37 2.4.2.2 Phƣơng pháp xử lí nhiệt ................................................................................ 38 ______________________________ii______________________________ Đồ án tốt nghiệp 2.4.3 Phƣơng pháp khảo sát hoạt tính sinh học ......................................................... 39 2.4.3.1 Phƣơng pháp định tính enzyme ..................................................................... 39 2.4.3.2 Phƣơng pháp khảo sát khả năng kháng khuẩn .............................................. 43 2.4.3.3 Phƣơng pháp khảo sát khả năng kháng nấm ................................................. 46 2.4.3.4 Khảo sát hiệu lực diệt sâu bằng phƣơng pháp quét lá ................................... 48 2.4.4 Khảo sát thời gian bảo quản canh trƣờng lên men sau xử lí ............................ 49 2.4.5 Khảo sát hiệu lực diệt sâu invivo ..................................................................... 50 2.4.6 Khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm ............................................................ 51 Chƣơng 3. KẾT QUẢ, THẢO LUẬN ...................................................................... 53 3.1 Xác định thời gian, độ pH tiêu diệt 100% tế bào vi khuẩn Serratia marcescens từ phƣơng pháp xử lí acid HCl 1N ............................................................................ 53 3.2 Xác định thời gian, nhiệt độ tiêu diệt 100% tế bào vi khuẩn Serratia marcescens từ phƣơng pháp xử lí nhiệt độ .................................................................................. 60 3.3 Khả năng tiết enzyme ngoại bào ........................................................................ 62 3.3.1 Khả năng giữ lại enzyme ngoại bào từ phƣơng pháp xử lí acid ...................... 62 3.3.2 Khả năng giữ lại enzyme ngoại bào từ phƣơng pháp xử lí nhiệt độ ................ 66 3.4 Khả năng kháng khuẩn ........................................................................................ 68 3.4.1 Khả năng kháng khuẩn của dịch canh trƣờng đã xử lí bằng phƣơng pháp xử lí acid ............................................................................................................................ 68 3.5 Hoạt tính kháng nấm ........................................................................................... 69 3.5.1 Khả năng kháng nấm của dịch canh trƣờng đã xử lí bằng phƣơng pháp xử lí acid ............................................................................................................................ 69 3.6 Hiệu lực diệt sâu .................................................................................................. 71 3.6.1 Hiệu lực diệt sâu từ canh trƣờng lên men đã qua xử lí .................................... 71 3.6.2 Hiệu lực diệt sâu từ chế phẩm ......................................................................... 73 3.7. Xác định thời gian bảo quan canh trƣờng đã xử lí ............................................. 75 3.8. Xác định điều kiện bảo quản chế phẩm ............................................................. 79 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 85 ______________________________iii______________________________ Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số đặc điểm sinh hĩa của Serratia marcescens .................................... 10 Bảng 1.2. Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) ... ....................................................................................................................................... 17 Bảng 1.3. Một số bằng sáng chế về prodigiosin .......................................................... 26 Bảng 3.1 Prodigiosin unit/tế bào của chủng SH1. ........................................................ 60 Bảng 3.2. Khả năng bảo tồn các enzyme ngoại bào trong canh trƣờng đƣợc xử lí bằng phƣơng pháp xử lí acid. ........................................................................................ 64 Bảng 3.3. Khả năng bảo tồn các enzyme ngoại bào trong canh trƣờng đƣợc xử lí bằng phƣơng pháp xử lí nhiệt........................................................................................ 66 Bảng 3.4. Khả năng kháng khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus của hoạt chất prodigiosin trong canh trƣờng đã xử lí. ......................................................... 68 Bảng 3.5. Tỉ lệ ức chế nấm Fusarium sp. của canh trƣờng đã xử lí ............................. 70 Bảng 3.6. Tỉ lệ tử vong của sâu khoang tuổi 3. ............................................................ 73 Bảng 3.7 Tỉ lệ tử vong của sâu khoang tuổi 3 .............................................................. 75 Bảng 3.8. Tỉ lệ prodigiosin cịn lại sau 7 ngày bảo quản (%) ....................................... 82 ______________________________iv______________________________ Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens ......... 8 Hình 1.2 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011) ................................................................................................................ 9 Hình 1.3. Cấu trúc hình học phẳng của hợp chất prodigiosin (Krishna, 2008) ....... 16 Hình 1.4. Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) ........................................ 17 Hình 1.5. Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin (Ramina và Samira,2009) ...... 19 Hình 1.6. So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001) .................................. 22 Hình 1.7. Quá trình sinh tổng hợp prodigiosin (Caspi R, 2014) .............................. 24 Hình 1.8. Vịng đời của sâu khoang Spodoptera litura ........................................... 28 Hình 2.1 Quy trình khảo sát khả năng tiêu diệt tế bào vi khuẩn S.mercescens và hoạt tính diệt sâu của prodigiosin trong canh trƣờng đã xử lí. ............................... 34 Hình 2.2 Quy trình thử nghiệm khảo sát thời gian tiêu diệt tế bào vi khuẩn S.mercescens ............................................................................................................. 35 Hình 2.3 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học của canh trƣờng vi khuẩn sau khi xử lí acid ......................................................................................................................... 36 Hình 2.4 Quy trình khảo sát chế phẩm diệt sâu từ prodigiosin ................................ 36 Hình 2.5 Cách bố trí nghiệm thức trên đĩa thạch mơi trƣờng Lipit .......................... 40 Hình 2.6 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch mơi trƣờng Casein ......... 41 Hình 2.7 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch mơi trƣờng huyền phù chitin 1%. .................................................................................................................. 43 Hình 2.8 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức kháng khuẩn trên đĩa thạch mơi trƣờng NA. ............................................................................................................................ 45 Hình 2.9 Bố trí các nghiệm thức kháng nấm trên đĩa thạch PDA ............................ 47 Hình 3.1. Khả năng tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens SH1 tại các thời điểm 2 giờ, 4 giờ và 24 giờ tại pH 1 và pH 2 ............................................................ 56 ______________________________v______________________________ Đồ án tốt nghiệp Hình 3.2. Giá trị OD499 của prodigiosin trong canh trƣờng xử lí acid tại từng nghiệm thức ............................................................................................................... 57 Hình 3.3 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD 499) và tế bào (OD 620) trong từng nghiệm thức ............................................................................................................... 59 Hình 3.4 Canh trƣờng đã xử lí acid đƣợc trang trên đĩa mơi trƣờng PGA, sau 24h ủ tối. .............................................................................................................................. 61 Hình 3.5. Khả năng bảo tồn các enzyme ngoại bào trong canh trƣờng S.marcescens đã xử lí ................................................................................................ 64 Hình 3.6. Khả năng bảo tồn các enzyme ngoại bào trong canh trƣờng lên men đã xử lí ........................................................................................................................... 66 Hình 3.7 Khả năng kháng khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus của hoạt chất prodigiosin trong canh trƣờng lên men đã xử lí. ....................................... 68 Hình 3.8 Khả năng kháng nấm Fusarium sp. của canh trƣờng đã xử lí so với đối chứng ......................................................................................................................... 70 Hình 3.9. Nồng độ pha lỗng cho thí nghiệm hiệu lực diệt sâu: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6. ................................................................................................................ 72 Hình 3.10 Tỉ lệ sâu chết bởi canh trƣờng đã xử lí acid ........................................... 72 Hình 3.11 Tỉ lệ sâu chết theo thời gian do prodigiosin trong canh trƣờng S.marcescens đã xử lí acid ........................................................................................ 73 Hình 3.12 Chế phẩm và các nồng độ pha lỗng:10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và10-6 .... 74 Hình 3.13. Tỉ lệ sâu chết cho chế phẩm theo thời gian ............................................ 75 Hình 3.14. Tỉ lệ prodigiosin cịn lại trong canh trƣờng nuơi cấy vi khuẩn S.marcescens đã xử lí ở mơi trƣờng ngồi sáng ........................................................ 76 Hình 3.15. Tỉ lệ prodigiosin cịn lại trong canh trƣờng đã xử lí ở mơi trƣờng tối ... 77 Hình 3.16. So sánh tỉ lệ prodigiosin cịn lại sau 7 ngày bảo quản, ở nhiệt độ 2oC .. 78 Hình 3.17. So sánh tỉ lệ prodigiosin cịn lại sau 7 ngày bảo quản, ở nhiệt độ phịng ................................................................................................................................... 78 Hình 3.18. So sánh tỉ lệ prodigiosin cịn lại sau 7 ngày bảo quản, ở điều kiện ngồi trời ............................................................................................................................. 79 ______________________________vi______________________________ Đồ án tốt nghiệp Hình 3.19. Chế phẩm trƣớc và sau 7 ngày bảo quản. ............................................... 80 Hình 3.20. Trích ly lỏng – lỏng chế phẩm ................................................................ 80 Hình 3.21. Tỉ lệ prodigiosin cịn lại trong chế phẩm sau 7 ngày theo dõi ở các điều kiện mơi trƣờng: -18oC, 2oC, nhiệt độ phịng, nhiệt độ ngồi trời và nhiệt độ cao (60oC) ........................................................................................................................ 82 ______________________________vii______________________________ Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Các sản phẩm xuất khẩu là mặt hàng nơng nghiệp của Việt Nam đang dần cĩ chỗ đứng trên thị trƣờng quốc tế, nhƣ: Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc. Tuy nhiên, việc sản xuất và thu hoạch các loại nơng sản thiếu tính chuyên nghiệp và khoa học, lạm dụng các chất bảo vệ thực vật hĩa học gây tồn đọng dƣ lƣợng thuốc trong sản phẩm – là lí do làm sản phẩm Việt khĩ cĩ chỗ đứng ở các thị trƣờng lớn. Thêm vào đĩ là tình hình thời tiết những năm trở lại đây cĩ chuyển biến phức tạp do hiện tƣợng thời tiết El Niđo đã làm ảnh hƣởng đến sự phát triển của cây trồng và sự xuất hiện của các lồi cơn trùng gây hại. Để hạn chế sự tấn cơng của cơn trùng lên rau màu, ngƣời nơng dân đã dùng thuốc hĩa học với liều lƣợng quá mức cho phép, vơ tình tạo cho cơn trùng khả năng kháng thuốc, làm cho tình hình sâu hại trở nên nghiêm trọng hơn, diễn biến phức tạp hơn. Trong đĩ, sâu khoang Spodoptera litura là lồi sâu đa thực và gây hại nặng đến màu màng. Chúng cĩ thể phá hại đến 290 loại cây trồng thuộc 99 họ thực vật bao gồm các loại rau đậu, cây thực phẩm, cây cơng nghiệp, cây lƣơng thực, cây phân xanh,... cĩ khả năng kháng thuốc hĩa học nếu ngƣời dùng lạm dụng quá nhiều thuốc trừ sâu hĩa học khơng đúng cách. Vì vậy, xu hƣớng sử dụng các biện pháp phịng trừ sinh học đã và đang trở nên rất hữu ích vì tiết kiệm chi phí, cĩ tác dụng phịng trừ lâu dài, an tồn cho sức khỏe con ngƣời, đồng thời khơng gây ơ nhiễm mơi trƣờng. Trong các biện pháp sinh học đƣợc sử dụng hiện nay thì các loại thuốc phịng trừ sinh học cĩ nguồn gốc từ hợp chất thứ cấp đang chiếm đƣợc sự chú ý của ngƣời dùng, vì khả năng tiêu diệt sâu bệnh mà khơng gây độc hại cho con ngƣời và mơi trƣờng xung quanh. Tuy nhiên, các sản phẩm trên chƣa thật sự nổi bật. Những năm gần đây, việc trích ly đƣợc hợp chất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens cĩ khả năng diệt sâu đã mở ra một triển vọng mới trong việc tạo chế phẩm trừ sâu sinh học là hợp chất thứ cấp của vi sinh vật. Tuy nhiên, tại Việt Nam hiện nay chỉ cĩ một vài đề tài nghiên cứu về hợp chất thứ cấp này mà chƣa cĩ nghiên cứu nào về ứng dụng tạo chế ______________________________1______________________________ Đồ án tốt nghiệp phẩm diệt sâu từ hợp chất prodigiosin. Vì những lợi ích của hợp chất thứ cấp prodigiosin, ngƣời tiến hành đề tài đã chọn hƣớng cho đồ án tốt nghiệp là: “Tạo chế phẩm diệt sâu khoang Spodoptera litura từ dịch nuơi cấy vi khuẩn Serratia marcescens SH1”. 2. Mục đích nghiên cứu Sản xuất chế phẩm sinh học diệt sâu chứa prodigiosin. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu Xác định phƣơng pháp tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens trong canh trƣờng lên men Sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuơi cấy Serratia marcescens SH1 phân lập từ tuyến trùng diệt sâu EPN bỏ qua quá trình trích ly prodigiosin, khơng cịn chứa tế bào sống. 4. Các kết quả cần đạt đƣợc Khảo sát đƣợc khả năng sử dụng acid để diệt tế bào (ảnh hƣởng của chế độ xử lý acid lên tế bào, prodigiosin và enzyme trong dịch nuơi cấy) Khảo sát đƣợc khả năng xử lý nhiệt để diệt tế bào (ảnh hƣởng của chế độ xử lý acid lên tế bào, prodigiosin và enzyme trong dịch nuơi cấy). Chọn chế độ xử lý thích hợp (tế bào chết, nồng độ prodigiosin cao, cịn giữ đƣợc hoạt tính enzyme). Khảo sát đƣợc hoạt tính của dịch nuơi cấy sau xử lý: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng sâu Spodoptera litura tuổi ) Khảo sát đƣợc hiệu lực diệt sâu của chế phẩm từ dịch nuơi cấy xử lý acid Khảo sát đƣợc sự ảnh hƣởng của các điều kiện bảo quản lên chế phẩm. 5. Kết cấu của đồ án Đồ án “Tạo chế phẩm diệt sâu khoang Spodoptera litura từ chủng vi khuẩn Serratia marcescens SH1 phân lập từ nguồn tuyến trùng EPN” đƣợc trình bày gồm 3 chƣơng: 1. Tổng quan tài liệu ______________________________2______________________________ Đồ án tốt nghiệp Giới thiệu về định nghĩa thuốc trừ sâu sinh học, phân loại lồi cũng nhƣ các đặc trƣng sinh hĩa của vi khuẩn Serratia marcescens, tính chất đặc trƣng của hợp chất thứ cấp prodigiosin, giới thiệu về sâu khoang. 2. Vật liệu và phƣơng pháp thí nghiệm Giới thiệu về các phƣơng pháp đƣợc sử dụng trong quá trình làm đề tài. Cách bố trí các nghiệm thức trong từng thí nghiệm. 3. Kết quả thảo luận Trình bày chi tiết các kết quả đạt đƣợc của từng thí nghiệm đƣợc tiến hành. ______________________________3______________________________ Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học 1.1.1 Khái niệm về thuốc trừ sâu sinh học Thuốc trừ sâu sinh học là những chế phẩm cĩ nguồn gốc sinh học, đƣợc làm từ những nguyên liệu rất dễ kiếm nhƣ gừng, tỏi, ớt, xả, các loại lá, các chủng nấm vi sinh, hợp chất thứ cấp của vi sinh vật cĩ hiệu quả cao trong việc phịng trừ các loại sâu bệnh nhƣng lại rất an tồn với sức khỏe con ngƣời và mơi trƣờng đất. (Nguyễn Văn Tấn, 2004) 1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học hiện nay trên thị trường Nhƣ chúng ta đã biết, các thuốc trừ sâu hĩa học cĩ ƣu điểm rõ rệt là hiệu quả diệt sâu nhanh nhƣng cĩ nhƣợc điểm quan trọng là cĩ độ độc cao với ngƣời và các động vật cĩ ích (trong đĩ cĩ các lồi thiên địch), gây ơ nhiễm mơi trƣờng. Vì vậy, do yêu cầu bảo vệ sức khỏe con ngƣời và sự trong sạch của mơi trƣờng, các thuốc trừ sâu hĩa học cần đƣợc hạn chế sử dụng dần và thay vào đĩ là các thuốc trừ sâu sinh học. Hiện nay, trên thị trƣờng thuốc bảo vệ thực cĩ cĩ 7 loại thuốc trừ sâu sinh học: 1. NPV là chế phẩm trừ sâu hoạt lực cao, gồm 2 loại V- Ha và V- S1. Thuốc chuyên dùng để diệt trừ sâu xanh, sâu khoang, sâu xanh đốm trắng, sâu tơ trên các loại cây rau màu, cây cơng nghiệp, cây ăn quả với hiệu quả rất cao. NPV cĩ nồng độ đặc hơn so với các loại thuốc khác, sử dụng tƣơng đối dễ dàng: chỉ cần hồ thuốc vào bình và phun bình thƣờng với liều lƣợng 1,0- 1,2 kg/ha. 2. Chế phẩm Bt: Gồm 2 loại: dạng sữa 4.000 IU/ml và dạng bột Biotox 16.000 IU/mg chuyên dùng trừ sâu tơ, sâu xanh hại rau, sâu kéo ra lá, các loại sâu thuộc họ Leptidopera. 3. Chế phẩm M&B cĩ 2 loại: Metarhizium và Beauveria. Metarhizium anisopliae 1,6- 2,5 x 109Bt/gr bọ hại dừa. Thử nghiệm tại Đà Nẵng, Phú Yên đạt hiệu quả tới 86,5%. Dạng nấm xanh đƣợc dùng để trừ rầy, bọ xít trên lúa và cây ăn quả ______________________________4______________________________ Đồ án tốt nghiệp đạt 70- 90%, dạng nấm trắng đạt 50- 85%. Chế phẩm Beauveria chuyên dùng để trị sâu rĩm thơng và sâu đo nâu hại bồ đề với hiệu quả tiêu diệt sâu tới gần 87%. TS. Nguyễn Văn Vấn cho biết: “Loại thuốc này cĩ thể sử dụng để tiêu diệt sâu rĩm hại thơng đang xảy ra tại Nghệ An hiện nay”. 4. Chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma 3- 3,2 x 109Bt/gr trừ bệnh hại cây trồng nhƣ bệnh lở cổ rễ bắp cải, nấm đất đạt 41,5- 60%. 5. Chế phẩm tuyến trùng EPN Biostar 15- 20 x 106 IJs trừ sâu xám hại thuốc lá, đặc biệt là mía đạt hiệu quả khá cao. Hiện những sản phẩm đầu tiên đã đƣợc đƣa vào ứng dụng để diệt trừ sâu xám hại thuốc lá tại Ba Vì (Hà Tây), bọ hung hại mía tại Thạch Thành (Thanh Hố). 6. Chế phẩm hố sinh Momosertatin (MM) 2IU/lít trừ các loại sâu hại rau màu đạt 45- 50%. 7. Chế phẩm Ditacin 8% và Ketomium 1,5 x 106 Cfu/g, trừ bệnh hại trên cây ăn quả, cây lâu năm. (Nguyễn Văn Tấn, 2004) 1.1.3 Những mặt ưu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học. Nhìn chung, thuốc trừ sâu cĩ nguồn gốc từ vi sinh vật cĩ nhiều ƣu điểm so với thuốc trừ sâu hĩa học, nhƣ:  Ƣu điểm nổi bật nhất của thuốc trừ sâu sinh học là ít độc với ngƣời và mơi trƣờng. Các chế phẩm vi sinh vật dùng trừ sâu và dầu thực vật hầu nhƣ khơng độc với ngƣời và các sinh vật cĩ ích.  Ít độc với các lồi thiên địch nên thuốc sinh học bảo vệ đƣợc sự cân bằng sinh học trong tự nhiên (cân bằng giữa thiên địch và sâu hại), ít gây tình trạng bùng phát sâu hại.  Ít độc với ngƣời và mau phân hủy trong tự nhiên, các thuốc sinh học ít để lại dƣ lƣợng độc trên nơng sản và cĩ thời gian cách ly ngắn nên rất thích hợp sử dụng cho các nơng sản yêu cầu cĩ độ sạch cao nhƣ các loại rau, chè Muốn cĩ nơng ______________________________5______________________________ Đồ án tốt nghiệp sản sạch và an tồn, một biện pháp quan trọng là sử dụng các thuốc sinh học trừ sâu.  Ngồi ra, các yếu tố sinh học trừ sâu nhƣ các vi sinh vật và thực vật thƣờng cĩ sẵn và rất phổ biến ở mọi nơi, mọi lúc, vì vậy nguồn khai thác rất dễ dàng và hầu nhƣ vơ tận. Đồng thời với các chế phẩm đƣợc sản xuất theo quy mơ cơng nghiệp, hiện nay ngƣời ta vẫn cĩ thể dùng các phƣơng pháp chế biến thơ sơ để sử dụng. Cĩ thể ra đồng thu thập các sâu bị chết vì nấm bệnh, nghiền nát trong nƣớc rồi phun lên cây để trừ sâu. Các cây thuốc lá, thuốc lào, hạt xoan, rễ dây thuốc cá băm nhỏ và đập nát ngâm lọc trong nƣớc để phun cũng rất cĩ hiệu quả. Bên cạnh những ƣu điểm vƣợt trội vừa nêu ở trên đây, thuốc trừ sâu bệnh hại sinh học vẫn cịn những điểm hạn chế nhƣ:  Các thuốc vi sinh thƣờng thể hiện hiệu quả diệt sâu tƣơng đối chậm hơn so với thuốc hĩa học.  Sự bảo quản và khả năng hỗn hợp của các thuốc sinh học thƣờng yêu cầu điều kiện cũng chặt chẽ hơn. Nhƣng so với các ƣu điểm to lớn thì các nhƣợc điểm trên đây của thuốc sinh học là rất nhỏ và hồn tồn cĩ thể khắc phục đƣợc. Vì vậy, thuốc trừ sâu sinh học ngày càng đƣợc khai thác sử dụng nhiều. Ở nƣớc ta, ngồi các chế phẩm Bt đã đƣợc biết đến tƣơng đối lâu, hiện nay cĩ nhiều chế phẩm mới đã đƣợc đăng ký sử dụng. Yêu cầu ngày càng cĩ nhiều nơng ...(2011), đã thực hiện quá trình tối ƣu hĩa sản xuất prodigiosin bởi Serratia marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của prodigiosin. Kết ______________________________25______________________________ Đồ án tốt nghiệp quả cho thấy prodigiosin thu nhận đƣợc cĩ tác dụng ức chế tốt ở cả vi khuẩn Gram dƣơng và vi khuẩn Gram âm. Chandni và cộng sự. (2012), đã nhận thấy rằng prodigiosin cĩ khả năng kháng khuẩn nhƣ Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và kháng nấm bệnh nhƣ Candida albicans, Candida parapsilosis và Cryptococcus sp.. Nghiên cứu của San và cộng sự (2012) cho thấy prodigiosin cĩ khả năng diệt cơn trùng. Nghiên cứu của Ananda và cộng sự (2013) đã sử dụng prodigiosin thu nhận từ chủng Serratia marcescens CMST 07 để chống lại các vi khuẩn nhƣ Alteromonas sp. và Gallionella sp., cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu là khoảng 6,75 g/ml và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu là khoảng 12,5 g/ml. Bên cạnh đĩ, Ananda và cộng sự cũng đã sử dụng prodigiosin để nghiên cứu độc tính trên Artemia cho thấy LD50 khoảng 50 g/ml. Bảng 1.3. Một số bằng sáng chế về prodigiosin Ngày cơng Tên Patent Tĩm tắt Tác giả bố Kim Hwanmook, Han Sangbae, United States Một ứng dụng mới của prodigiosin Lee Changwoo, Patent để điều trị bệnh tiểu đƣờng mà 10/28/2003 Lee Kihoon, 6638968 khơng cĩ bất kỳ tác dụng phụ nào. Park Sehyung, Kim Youngkook. Prodigiosin từ Serratia marcescens Kim Hwanmook, United States cĩ tác dụng nhƣ một ức chế miễn Kim Youngkook, Patent 11/11/2003 dịch trong nhiều lĩnh vực khác Han Sangbae, 6645962 nhau. Yoo Sungak. United States Prodigiosin, một loại kháng sinh, Nakamura 05/05/1981 ______________________________26______________________________ Đồ án tốt nghiệp Patent đƣợc sản xuất một cách hiệu quả Katsumi 4266028 bằng chủng Serratia marcescens Kitamura R-2. Kumpei Kim Hwan-Mook Han Sang-Bac Lee Chang-Woo United States Sử dụng prodigiosin cho việc điều Lee Ki-Hoon Patent 07/01/2004 trị bệnh viêm thấp khớp. Park Se-Hyung 20040127547 Kim Hyoung Chin Kim Young-Kook 1.8 Khái quát về sâu khoang Spodoptera litura. Sâu khoang cịn đƣợc gọi là sâu ăn tạp gây hại trên tất cả các loại rau, là đối tƣợng gây hại nặng trên rau, đậu. Sâu non tuổi nhỏ thƣờng gây hại nghiêm trọng nhất bởi vì hàng trăm con sâu non tập trung lại ăn lá cây và nhanh chĩng làm lá cây xơ xác. Sâu non cịn cĩ thể gặm ăn vỏ quả làm giảm phẩm chất. 1.8.1 Đặc điểm hình thái Sâu khoang cĩ nhiều loại, trƣởng thành là loại ngài cĩ màu xám hoặc nâu xám, cánh trƣớc cĩ màu nâu vàng, cĩ các vân ngang bạc trắng ĩng ánh, cánh sau màu hơi trắng. Trứng hình bán cầu, mới đẻ màu vàng, sau màu tro tối xếp với nh au thành ổ, cĩ phủ một lớp lơng màu vàng rơm. ______________________________27______________________________ Đồ án tốt nghiệp Sâu non mới nở cĩ màu xanh sáng, Sâu tuổi lớn cĩ màu từ xám xanh đến nâu đen với những sọc vàng hoặc trắng, đốt bụng thứ nhất cĩ một vết đen to bao quanh, trên mỗi mảnh lƣng cĩ vân hình trăng khuyết. Nhộng màu đỏ sẫm, cuối bụng cĩ một đơi gai ngắn. 1.8.2 Đặc điểm sinh học và sinh thái Vịng đời: 25 - 48 ngày  Trứng: 3 - 7 ngày  Sâu non: 12 - 27 ngày  Nhộng: 8 -10 ngày  Trƣởng thành: 2 – 4 ngày Hình 1.8. Vịng đời của sâu khoang Spodoptera litura Ngài hoạt động mạnh vào ban đêm, cĩ xu tính với mùi chua ngọt và ánh sáng bƣớc sĩng ngắn. Trứng đẻ thành ổ trên lá, một ổ cĩ từ 50 - 200 trứng. Một con cái cĩ thể đẻ từ 500 – 2.000 trứng. Sâu tuổi nhỏ sống tập trung ăn hết thịt lá chừa lại biểu bì và gân. Ở tuổi 3 – 4 sâu phân tán và ăn khuyết lá hoặc cĩ khi ăn trụi lá. Sâu non cĩ 6 tuổi, khi đẫy sức ở tuổi 6 ______________________________28______________________________ Đồ án tốt nghiệp dài từ 35 - 50 mm. Khi mật độ sâu cao cĩ thể làm cho lá rụng nhanh. Tuy nhiên sự gây hại thƣờng khơng nghiêm trọng lắm do khả năng tự đền bù của cây. Khi đẫy sức sâu chui xuống đất hố nhộng, sau khoảng 10 ngày thì vũ hố. 1.8.3 Thiên địch Các lồi ăn mồi: Bọ rùa, kiến, bọ xít ăn thịt, bọ cánh cứng. Ong kí sinh: Cotesia prodeniae, Telenomus remus. Vi khuẩn BT, virus nhân đa diện. 1.8.4 Biện pháp phịng trừ Biện pháp canh tác: Vệ sinh đồng ruộng trƣớc và sau khi trồng, cày ải phơi đất. Dẫn nƣớc ngập ruộng trƣớc khi làm đất. Biện pháp cơ giới vật lý: Diệt ổ trứng và sâu non bằng tay. Biện pháp sinh học: Hạn chế phun thuốc để bảo tồn các lồi thiên địch thƣờng xuất hiện trên ruộng nhƣ nhện, bọ rùa, ong kí sinh... Dùng bẫy pheromone hoặc bẫy chua ngọt cĩ hiệu quả. Biện pháp hĩa học: Dùng các loại thuốc ít độc nhƣ nhĩm Abamectin (Abamectin; Tập kỳ 1.8 EC Abatin 1.8 EC; Silsau 3.6 EC); các loại chế phẩm vi sinh: thuốc cĩ nguồn gốc từ Bt nhƣ V-BT; Biocin 8000 SC, Dipel 32 WP cĩ nguồn gốc NPV nhƣ Vicin- S hoặc thuốc thảo mộc nhƣ Rotenone hoặc Neem. Cĩ thể dùng thuốc gốc Cúc tổng hợp nhƣ Karate 2.5 EC, SecSaigon 5 EC /. (Phịng kỹ thuật thuộc chi cục bảo vệ thực vật Tp.HCM, 2010) ______________________________29______________________________ Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 2.1.1 Thời gian Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 16/05/2016 đến ngày 07/08/2016 2.1.2 Địa điểm Phịng thí nghiệm Vi sinh thuộc khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trƣờng, trƣờng Đại học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. 2.2 Vật liệu – thiết bị – hĩa chất 2.2.1 Nguồn vi sinh vật 2.2.1.1 Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens Chủng vi khuẩn Serratia marcessens – SH1, do anh Nguyễn Hồng Anh Kha phân lập đƣợc từ tuyến trùng Steinerma quangdosense XT (S –XT) và Heterorhabditis indica CP 16 (H – CP16) vào năm 2009. 2.2.1.2 Nguồn vi khuẩn chỉ thị Nguồn vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus do anh Lê Quốc Vũ, sinh viên khĩa 2011, khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trƣờng cung cấp. 2.2.1.3 Nguồn nấm bệnh Nguồn nấm bệnh Fusarium sp., Collectotrichum sp. do TS. Nguyễn Thị Hai phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trƣờng, trƣờng đại học Cơng nghệ thành phố Hồ Chí Minh cung cấp. 2.2.1.4 Nguồn sâu khoang Spodoptera litura Sâu khoang Spodoptera litura đƣợc bắt ngồi thiên nhiên và nhân nuơi trong mơi trƣờng nhân tạo với nguồn thức ăn chính là lá thầu dầu. 2.2.2 Mơi trường nuơi cấy và hĩa chất a. Mơi trường nuơi cấy (xem ở Phụ lục A) ______________________________30______________________________ Đồ án tốt nghiệp Mơi trƣờng Nutrient agar (NA) Mơi trƣờng Nutrient broth (NB) Mơi trƣờng Peptone Glycerol agar (PGA) Mơi trƣờng Peptone Glycerol broth (PG) Mơi trƣờng Casein Mơi trƣờng Lipit Mơi trƣờng huyền phù Chitin 1% Mơi trƣờng Potato Dextrose agar (PDA) b. Hĩa chất, thuốc thử Cồn 70, cồn 96 HCl 1N NaOH 1N Trichloroacetic acid (TCA) 10% Thuốc thử lugol Tween 80 0,02% Rỉ đƣờng 1% Carboxymethyl cellulose (CMC) 1% 2.2.3 Dụng cụ, thiết bị a. Dụng cụ Hộp nuơi sâu Thùng nuơi bƣớm Ống nghiệm Đĩa petri Erlen 100 ml, 250 ml, 1000 ml Pipet 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml Pipetman 100 , 1000 Đầu cơn 100 , 1000 ______________________________31______________________________ Đồ án tốt nghiệp Đũa thủy tinh Bao hấp, giấy gĩi, thun Đèn cồn, que cấy vịng, que cấy thẳng, que cấy trang Bơng thấm, bơng khơng thấm Kim tiêm b. Thiết bị Autolave Tủ cấy vi sinh Tủ sấy Tủ ủ vi sinh Tủ lạnh Cân phân tích Bếp từ Máy nƣớc cất Máy ly tâm Máy lắc Bể điều nhiệt 2.3 Phƣơng pháp thí nghiệm Mục đích: sản xuất chế phẩm sinh học diệt sâu chứa prodigiosin. Mục tiêu: sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuơi cấy Serratia marcescens SH1 phân lập từ tuyến trùng diệt sâu EPN bỏ qua quá trình trích ly prodigiosin, khơng cịn chứa tế bào sống. Nội dung i) Khảo sát khả năng sử dụng acid để diệt tế bào (ảnh hƣởng của chế độ xử lý acid lên tế bào, prodigiosin và enzyme trong dịch nuơi cấy) ______________________________32______________________________ Đồ án tốt nghiệp ii) Khảo sát khả năng xử lý nhiệt để diệt tế bào (ảnh hƣởng của chế độ xử lý acid lên tế bào, prodigiosin và enzyme trong dịch nuơi cấy). Chọn chế độ xử lý thích hợp (tế bào chết, nồng độ prodigiosin cao, cịn giữ đƣợc hoạt tính enzyme). iii) Khảo sát hoạt tính của dịch nuơi cấy sau xử lý: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng sâu Spodoptera litura tuổi 3 iv) Khảo sát hiệu lực diệt sâu của chế phẩm từ dịch nuơi cấy xử lý acid v) Khảo sát ảnh hƣởng của các điều kiện bảo quản lên chế phẩm. Phƣơng pháp luận Các nghiên cứu trƣớc đã chứng minh prodigiosin từ Serratia marcescens SH1 (phân lập từ tuyến trùng EPN) cĩ hiệu lực diệt sâu khá mạnh. Để phát triển một chế phẩm diệt sâu cần đơn giản hĩa tối đa các quá trình downtream processing đối với canh trƣờng lên men vi khuẩn. Vì vậy hai phƣơng pháp đƣợc đề nghị là xử lý acid hoặc xử lý nhiệt để tiêu diệt tế bào S. marcescens SH1 và sau đĩ làm chế phẩm. Tiêu chí của chế độ xử lý canh trƣờng lên men là tiêu diệt tế bào mà khơng ảnh hƣởng lên nồng độ prodigiosin tổng hợp cũng nhƣ ít ảnh hƣởng nhất lên enzyme ngoại bào. Để khảo sát hoạt tính dịch nuơi cấy sau xử lý, thử nghiệm kháng khuẩn, kháng nấm đƣợc sử dụng cĩ ý nghĩa thăm dị. Hoạt tính diệt sâu đƣợc thử nghiệm trên Spodoptera litura là đối tƣợng trƣớc kia đã thử nghiệm cho prodigiosin sau trích ly. Chế phẩm bƣớc đầu đƣợc sản xuất bằng cách bổ sung Tween 80 phá vỡ màng nhốt prodigiosin, CMC là tác nhân tạo độ nhớt, độ kết dính, rỉ đƣờng kích thích sâu ăn Bố trí thí nghiệm Các bƣớc bố trí thí nghiệm đƣợc trình bày tĩm tắt theo sơ đồ Hình 2.1 ______________________________33______________________________ Đồ án tốt nghiệp Giống vi khuẩn S.mercescens Tăng sinh 48h Xử lý Xử lý với acid HCl 1N nhiệt ở 65oC Khảo sát hoạ t tính sinh học Thử nghiệm kh ả năng diệt sâu Tạo ch ế phẩm Thử nghiệm kh ả năng diệt sâu Khảo sát thời gian b ảo quản của chế phẩm Hình 2.1 Quy trình khảo sát khả năng tiêu diệt tế bào vi khuẩn S.mercescens và hoạt tính diệt sâu của prodigiosin trong canh trƣờng đã xử lí. ______________________________34______________________________ Đồ án tốt nghiệp Giống vi khuẩn S.mercescens Tăng sinh 48 giờ Đo quang A = 620 nm Đo quang A = 499 nm Xử lý Xử lý o với acid HCl 1N nhiệt ở 65 C Kiểm tra khả năng tiêu diệt tế bào vi khuẩn ở Đo quang, Đếm khuẩn lạc A = 620 nm và A = 499 nm Hình 2.2 Quy trình thử nghiệm khảo sát thời gian tiêu diệt tế bào vi khuẩn S.mercescens ______________________________35______________________________ Đồ án tốt nghiệp Giống vi khuẩn S.mercescens Xử lí acid Khảo sát hoạt tính sinh học Khả năng Kháng Kháng nấm Enzyme diệt sâu khuẩn Hình 2.3 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học của canh trƣờng vi khuẩn sau khi xử lí acid Giống vi khuẩn S.mercescens Xử lí acid HCl 1N, 4 giờ Tạo chế phẩm Khả năng Khảo sát Khảo sát diệt sâu thời gian bảo quản điều kiện bảo quản Hình 2.4 Quy trình khảo sát chế phẩm diệt sâu từ prodigiosin ______________________________36______________________________ Đồ án tốt nghiệp 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm 2.4.1 Phương pháp nuơi sâu trong phịng thí nghiệm Phịng nuơi sâu phải đảm bảo điều kiện nhiệt độ thích hợp cho sâu khoang phát triển 25 ± 2oC, và ẩm độ 70 ± 5%. Sâu khoang Spodoptera litura đƣợc thu mẫu từ ruộng rau đắng tại huyện Cần Giờ, Tp.HCM, sâu khoang ngồi đồng mang về nuơi đƣợc tính là sâu thế hệ P. Thế hệ P đƣợc nuơi trong hộp nhựa và cho ăn bằng lá thầu dầu cho tới khi hĩa nhộng. Khi sâu vào giai đoạn hĩa nhộng, lĩt khăn giấy trong hộp nhựa và cho ăn bằng lá thầu dầu cho tới khi 5 - 6 ngày hĩa nhộng trong hộp. Sau khi vũ hĩa, ngài thuộc thế hệ P đƣợc ghép cặp với nhau trong các thùng giấy đƣợc lĩt giấy mềm và cung cấp thức ăn dƣới dạng lỏng là nƣớc đƣờng pha lỗng (tỉ lệ 1:10). Tiến hành kiểm tra thu trứng, thay thức ăn và vệ sinh hàng ngày. Sau 2 ngày, trứng nở ra sâu non F1, sâu non đƣợc nuơi với thức ăn là lá thầu dầu. Nhân nuơi sâu khoang Spodoptera litura cho đến khi đủ số lƣợng để tiến hành thí nghiệm. 2.4.2 Phương pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens 2.4.2.1 Phương pháp xử lí acid Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 48 giờ trong Erlen cĩ chứa 300 ml mơi trƣờng peptone glycerol broth vơ trùng, với tỉ lệ cấy giống 1%. Nuơi ủ vi khuẩn ở nhiệt độ phịng, lắc 150 vịng/phút, tránh ánh sáng, 48 giờ. Sau khi tăng sinh 48 giờ, thu nhận tồn bộ canh trƣờng và đem xử lí với acid HCl 1N. Từ 300ml canh trƣờng vi khuẩn, dùng pipet vơ trùng hút 20 ml canh trƣờng lên men vi khuẩn cho vào lần lƣợt vào 13 chai tăng sinh đã vơ trùng. Với mục đích đƣa mơi trƣờng về pH = 1, tiêu diệt tế bào vi khuẩn, dùng pipetman hút 1000 dung dịch acid HCl 1N cho vào 3 chai canh trƣờng lên men. ______________________________37______________________________ Đồ án tốt nghiệp Lắc 150 vịng / phút, ủ trong tối. Theo dõi ở các mốc thời gian: 2 giờ, 4 giờ và 24 giờ. Sau đĩ, đƣa mơi trƣờng về pH = 7 với 1000 dung dịch NaOH 1N, đem đo OD620nm 0 và OD499nm, song song đĩ tiến hành cấy trang vi khuẩn ở các nồng độ pha lỗng 10 , 10-1 và 10-2. Ủ đĩa trong tối, 24 giờ Với mục đích đƣa mơi trƣờng về pH = 2, tiêu diệt tế bào vi khuẩn, dùng pipetman hút 450 dung dịch acid HCl 1N cho vào 3 chai canh trƣờng lên men. Lắc 150 vịng / phút, ủ trong tối. Theo dõi ở các mốc thời gian: 2 giờ, 4 giờ và 24 giờ. Đƣa mơi trƣờng của canh trƣờng lên men về pH = 7 với 450 dung dịch NaOH 1N, đem đo OD620 và 0 -1 OD499, song song đĩ tiến hành cấy trang vi khuẩn ở các nồng độ pha lỗng 10 , 10 và 10-2. Ủ đĩa trong tối, 24 giờ. Đối chứng dƣơng: canh trƣờng lên men 48 giờ của vi khuẩn đƣợc tiếp tục tăng sinh trên máy lắc 150 vịng / phút. Theo dõi ở các mốc thời gian: 2 giờ, 4 giờ và 24 giờ kế tiếp. Thu nhận mẫu canh trƣờng lên men, đo OD620 và OD499, song song đĩ tiến hành cấy trang vi khuẩn ở các nồng độ pha lỗng 10-6, 10-7 và 10-8. Ủ đĩa trong tối, 24 giờ. Đọc kết quả: Sau 24 giờ ủ đĩa trong tối, tiến hành đếm khuẩn lạc đặc trƣng của vi khuẩn Serattia marcescens trên mơi trƣờng peptone glycerol agar (PGA). Tính prodigiosin unit/tế bào sau xử lí acid. 2.4.2.2 Phương pháp xử lí nhiệt Chuẩn bị vi khuẩn khảo sát: Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 48 giờ trong Erlen cĩ chứa 300 ml mơi trƣờng peptone glycerol broth vơ trùng, với tỉ lệ cấy giống 1%. Nuơi ủ vi khuẩn ở nhiệt độ phịng, lắc 150 vịng/phút, tránh ánh sáng. Sau khi tăng sinh 48 giờ, thu nhận tồn bộ canh trƣờng và đem xử lí ở nhiệt độ 65oC trong vịng 15 phút: từ 300ml canh trƣờng, dùng pipet vơ trùng hút 20 ml canh trƣờng lên men vi khuẩn cho vào lần lƣợt vào 13 chai tăng sinh đã vơ trùng. ______________________________38______________________________ Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm thực hiện ở 3 nghiệm thức nhiệt độ: 50oC, 65oC và 80oC đƣợc xử lí trong vịng 15 phút. Sau xử lí nhiệt, tiến hành cấy trang dịch canh trƣờng lên thạch PGA ở các nồng độ pha lỗng 100,10-1 và 10-2. Ủ tối 24h, nhiệt độ phịng. Đồng thời tiến hành trích ly thơ dịch canh trƣờng ở mỗi nhiệt độ xử lí, đo OD 535nm nhằm xác định lƣợng prodigiosin đƣợc sinh ra. Đối chứng dƣơng: vi khuẩn khảo sát sau khi tăng sinh 48h tiến hành cấy trang trên đĩa PGA ở các nồng độ pha lỗng 10-3,10-4 và 10-5. Mỗi nghiệm thức nhiệt độ đƣợc lặp lại 3 lần. Đọc kết quả: Sau 24 giờ ủ đĩa trong tối, tiến hành đếm khuẩn lạc đặc trƣng của vi khuẩn Serattia marcescens trên mơi trƣờng peptone glycerol agar (PGA). Tính tỉ lệ tế bào vi khuẩn bị tiêu diệt. Tính tỉ lệ tế bào vi khuẩn bị tiêu diệt. Tính lƣợng prodigiosin thu đƣợc từ giá trị OD535nm 2.4.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học 2.4.3.1 Phương pháp định tính enzyme Chuẩn bị canh trƣờng vi khuẩn: Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh trong mơi trƣờng PG ở nhiệt độ phịng, ủ tối trong 48 giờ. Chuẩn bị canh trƣờng vi khuẩn đã xử lí: Sau khi tăng sinh vi khuẩn trong mơi trƣờng PG broth vơ trùng, dùng pipetman hút 450 HCl 1N cho vào canh trƣờng lên men, lắc 150 vịng/ phút, trong 4 giờ. Tiến hành thêm 450 NaOH 1N để đƣa canh trƣờng về pH = 7. Thêm vào 100 Tween 80 0,02% Chuẩn bị Tween 80 0,02%: Tween 80 đƣợc pha lỗng về nồng độ 1%, sau đĩ hút 100 l Tween 80 1% cho vào lần lƣợt các dịch canh trƣờng đƣợc pha lỗng với thể tích 5 ml. Thử nghiệm hoạt tính lipase Pha mơi trƣờng thử nghiệm hoạt tính lipase, hấp 121oC trong 15 phút. Để mơi ______________________________39______________________________ Đồ án tốt nghiệp trƣờng nguội đến khoảng 65oC đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar mơi trƣờng, đƣờng kính mỗi giếng thạch là 0,7 cm (d). Đối chứng dƣơng: Dùng que cấy thẳng cấy sinh khối của chủng vi sinh vật thử nghiệm vào giữa đĩa petri mơi trƣờng thử nghiệm hoạt tính lipase. Ủ ở nhiệt độ phịng trong 24 giờ. Đo đƣờng kính vịng tủa trên bề mặt mơi trƣờng. Các thử nghiệm: Canh trƣờng vi khuẩn sau xử lí acid, dùng pippet thủy tinh 5 ml, tiến hành pha lỗng canh trƣờng lên men đã qua xử lí acid thành dãy các nồng độ pha lỗng : 2, 4, 8, 16 và 32. Dùng pipetman hút 20 ở các nồng độ pha lỗng cho vào 3 giếng thạch ở mơi trƣờng thử hoạt tính lipit, nhƣ hình 2.5 ĐC Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Hình 2.5 Cách bố trí nghiệm thức trên đĩa thạch mơi trƣờng Lipit Đọc kết quả: Nếu dịch canh trƣờng cĩ enzyme lipase thì xuất hiện vịng tủa xung quanh giếng thạch. Nếu dịch canh trƣờng khơng cĩ enzyme lipase thì khơng xuất hiện vịng tủa xung quanh giếng thạch Khả năng phân giải lipit đƣợc đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng lớn, khả năng giữ lại enzyme lipit sau xử lí acid càng lớn. ______________________________40______________________________ Đồ án tốt nghiệp Trong đĩ : D: đƣờng kính vịng phân giải (mm) d: đƣờng kính giếng thạch (mm) Thử nghiệm hoạt tính protease Pha mơi trƣờng casein agar, hấp 121 oC trong 15 phút. Để mơi trƣờng nguội đến khoảng 65 oC đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar mơi trƣờng, đƣờng kính mỗi giếng thạch là 0,7 cm (d). Đối chứng dƣơng: Dùng pipetman hút 20 canh trƣờng lên men vi khuẩn thử nghiệm cho vào giếng thạch. Ủ 24 giờ, tráng TCA 10%, đo đƣờng kính vịng phân giải. Các thử nghiệm: Canh trƣờng vi khuẩn sau xử lí acid, dùng pippet thủy tinh 5 ml, tiến hành pha lỗng canh trƣờng lên men đã xử lí acid thành dãy các nồng độ pha lỗng : 2, 4, 8, 16 và 32. Dùng pipetman hút 20 ở các nồng độ pha lỗng cho vào 3 ĐC giếng thạch ở mơi trƣờng thử hoạt tính casein, nhƣ hình 2.6. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Hình 2.6 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch mơi trƣờng Casein Đọc kết quả: Sau thời gian ủ tối 24 giờ, tráng TCA 10% lên đĩa mơi trƣờng: ______________________________41______________________________ Đồ án tốt nghiệp Nếu dịch canh trƣờng cĩ enzyme protease thì xuất hiện vịng trong suốt xung quanh giếng thạch. Nếu dịch canh trƣờng khơng cĩ enzyme lipase thì khơng xuất hiện vịng trong suốt xung quanh giếng thạch. Khả năng phân giải casein đƣợc đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng lớn, khả năng giữ lại enzyme protease sau xử lí acid càng lớn. Trong đĩ : D: đƣờng kính vịng phân giải (mm) d: đƣờng kính giếng thạch (mm) Thử nghiệm hoạt tính chitinase Pha mơi trƣờng thạch huyền phù chitin 1%, hấp 121oC trong 15 phút. Để mơi trƣờng nguội đến khoảng 65 oC , đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar mơi trƣờng, đƣờng kính mỗi giếng thạch là 0,7 cm (d). Đối chứng dƣơng: Dùng pipetman hút 20 sinh khối của chủng vi sinh vật thử nghiệm vào đĩa petri mơi trƣờng thử nghiệm hoạt tính chitin. Ủ ở nhiệt độ phịng trong 24 giờ. Tráng lugol, đo đƣờng kính vịng phân giải trên bề mặt mơi trƣờng. Các thử nghiệm: Canh trƣờng vi khuẩn sau xử lí acid, dùng pippet thủy tinh 5 ml, tiến hành pha lỗng canh trƣờng lên men đã xử lí acid thành dãy các nồng độ pha lỗng : 2, 4, 8, 16 và 32. Dùng pipetman hút 20 ở các nồng độ pha lỗng cho vào 3 giếng thạch ở mơi trƣờng thử hoạt tính lipit, nhƣ hình 2.7. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. ______________________________42______________________________ Đồ án tốt nghiệp ĐC Hình 2.7 Cách b ố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch mơi trƣờng huyền phù chitin 1%. Đọc kết quả: Sau thời gian ủ tối 24 giờ, tráng lugol lên đĩa mơi trƣờng: Nếu dịch canh trƣờng cĩ enzyme chitinase thì xuất hiện vịng trong suốt xung quanh giếng thạch. Nếu dịch canh trƣờng khơng cĩ enzyme chitinase thì khơng xuất hiện vịng trong suốt xung quanh giếng thạch. Khả năng phân giải chitin đƣợc đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng lớn, khả năng giữ lại enzyme chitinase sau xử lí acid càng lớn. Trong đĩ : D: đƣờng kính vịng phân giải (mm) d: đƣờng kính giếng thạch (mm) 2.4.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng kháng khuẩn Theo phương pháp đục giếng thạch. ______________________________43______________________________ Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp đục giếng thạch dựa vào khả năng khuếch tán của các hợp chất cĩ khả năng kháng khuẩn vào mơi trƣờng thạch. Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện nhƣ sau: Vi khuẩn chỉ thị - Escherichia coli, Staphylococcus aureus: Vi khuẩn chỉ thị đƣợc tăng sinh 24 giờ trong mơi trƣờng lỏng TBS vơ trùng, lắc 150 vịng/ phút. Sau 24 giờ, khử trùng que cấy vịng tiến hành ria vi khuẩn lên mơi trƣờng thạch NA, ủ 24 giờ ở nhiệt độ là 37oC. Dùng dây cấy vơ trùng lấy sinh khối vi khuẩn từ đĩa NA cho vào 9 ml nƣớc muối sinh lí vơ trùng rồi so với thang McFahrland, pha lỗng đến khi đạt mật độ 106 cfu/ml. Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 48 giờ trong mơi trƣờng lỏng PG vơ trùng, ủ tối và lắc 150 vịng/ phút. Sau tăng sinh, diệt tế bào vi khuẩn bằng cách đƣa về pH 2 trong 4 giờ; cho 450 HCl 1N vào canh trƣờng, để máy lắc trong 4 giờ, lắc 150 vịng/ phút, ủ tối. Dịch canh trƣờng đã đƣợc xử lí acid HCl 1N trong 4 giờ, sẽ đƣợc thêm 450 NaOH 1N để đƣa về pH = 7. Dịch ly tâm: Sử dụng 10ml canh trƣờng vi khuẩn S.marcescens đã xử lí đem đi ly tâm 10.000 vịng/phút trong vịng 10 phút; tiếp theo tiến hành lọc dịch ly tâm để thu dịch canh trƣờng vơ khuẩn. Tiến hành pha lỗng dịch ly tâm thành dãy các nồng độ pha lỗng: 2, 4, 8, 16 và 32. Tiến hành thêm 100 Tween 80 0,02% Dịch canh trƣờng đã xử lí acid HCl 1N, tiến hành pha lỗng dịch canh trƣờng thành dãy các nồng độ pha lỗng: 2, 4, 8, 16 và 32. Tiến hành đo OD 499nm ở từng nồng độ pha lỗng. Tiến hành nhỏ 100 Tween 80 0,02 % Kháng sinh chloramphenicol 20 mg/ml để làm đối chứng đối chứng dƣơng. Mơi trƣờng PG vơ trùng đƣợc thêm Tween 80 0,02% để làm đối chứng âm. Tiến hành thí nghiệm Dùng tăm bơng vơ trùng quét đều dịch pha lỗng vi khuẩn chỉ thị lên bề mặt mơi trƣờng NA. Tiến hành đục giếng thạch 7mm nhƣ hình 2.8 ______________________________44______________________________ Đồ án tốt nghiệp ĐC . Hình 2.8 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức kháng khuẩn trên đĩa thạch mơi trƣờng NA. Hút 20 l dịch ly tâm ở các nồng độ pha lỗng cho vào 3 giếng thạch, và 20 l mơi trƣờng PG vơ trùng vào giếng thạch cịn lại để làm đối chứng âm. Ủ đĩa ở nhiệt độ phịng, trong tối, 24 giờ. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Hút 20 l dịch canh trƣờng đã xử lí acid ở các nồng độ pha lỗng cho vào 3 giếng thạch, và 20 l mơi trƣờng PG vơ trùng vào giếng thạch cịn lại để làm đối chứng âm. Ủ đĩa ở nhiệt độ phịng, trong tối, 24 giờ. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Đối chứng dƣơng: Hút 20 l chất kháng sinh chloramphenicol 20mg/ml giếng thạch trên đĩa NA đã quét vi khuẩn. Đối chứng âm: Hút 20 l mơi trƣờng PG vơ trùng cĩ bổ sung Tween 80 đã chuẩn bị trƣớc đĩ cho vào giếng thạch ở giữa đĩa mơi trƣờng NA. Đọc kết quả thí nghiệm: ______________________________45______________________________ Đồ án tốt nghiệp Nếu xảy ra hiện tƣợng kháng khuẩn thì sẽ hình thành những vịng trong suốt quanh giếng thạch. Nếu khơng xảy ra hiện tƣợng kháng khuẩn thì sẽ khơng hình thành những vịng trong suốt quanh giếng thạch. Khả năng kháng khuẩn đƣợc đánh giá qua hiệu số (D – d) mm. Hiệu số càng lớn, khả năng kháng khuẩn càng tốt Trong đĩ : D: đƣờng kính vịng phân giải (mm) d: đƣờng kính giếng thạch (mm) 2.4.3.3 Phương pháp khảo sát khả năng kháng nấm Thí nghiệm đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp đục giếng thạch dựa vào khả năng khuếch tán của các hợp chất cĩ khả năng kháng khuẩn vào mơi trƣờng thạch. Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện nhƣ sau: Nấm bệnh – Colletotrichum sp., Fusarium sp. Pha mơi trƣờng PDA bổ sung thêm kháng sinh, vơ trùng que cấy thẳng, tiến hành cấy điểm nấm bệnh từ mơi trƣờng thạch nghiêng sang mơi trƣờng PDA cĩ bổ sung kháng sinh, ủ ở nhiệt độ phịng trong 3 ngày. Sau đĩ, đục thạch cĩ đƣờng kính 5 mm cấy sinh khối nấm vào đĩa PDA khơng bổ sung kháng sinh. Nuơi ủ tơ nấm trong 7 ngày ở nhiệt độ phịng. Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 48 giờ trong mơi trƣờng lỏng PG vơ trùng, ủ tối và lắc 150 vịng/ phút. Sau tăng sinh, diệt tế bào vi khuẩn bằng cách đƣa về pH 2 trong 4 giờ; cho 450 HCl 1N vào canh trƣờng, để máy lắc trong 4 giờ, lắc 150 vịng/ phút, ủ tối. Dịch canh trƣờng đã đƣợc xử lí acid HCl 1N trong 4 giờ, sẽ đƣợc thêm 450 NaOH 1N để đƣa về pH = 7. Dịch ly tâm: Sử dụng 10ml canh trƣờng vi khuẩn S.marcescens đã xử lí ly tâm 10.000 vịng/phút trong 10 phút; tiếp theo tiến hành lọc dịch ly tâm để thu dịch canh trƣờng đã ______________________________46______________________________ Đồ án tốt nghiệp xƣ lí đƣợc vơ khuẩn. Tiến hành pha lỗng dịch ly tâm thành dãy các nồng độ pha lỗng: 2, 4, 8, 16 và 32. Tiến hành thêm 100 Tween 80 0,02% Dịch canh trƣờng đã xử lí acid HCl 1N, tiến hành pha lỗng dịch canh trƣờng thành dãy các nồng độ pha lỗng: 2, 4, 8, 16 và 32. Tiến hành đo OD499 ở từng nồng độ pha lỗng. Tiến hành nhỏ 100 Tween 80 0,02 % Tiến hành kháng nấm: Chuẩn bị mơi trƣờng PDA vơ trùng. Tiến hành đục giếng thạch 7mm. Vơ trùng cây đục thạch và đục lấy khối thạch với đƣờng kính 5mm cĩ sinh khối nấm từ đĩa PDA phía trên và đặt vào trung tâm đĩa PDA nhƣ hình 2.8. Hút 20 l dịch ly tâm ở các nồng độ pha lỗng cho vào 3 giếng thạch. Ủ đĩa ở nhiệt độ phịng, trong tối, 72 giờ. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Nấm bệnh Hút 20 l dịch canh trƣờng đã xử lí acid ở các nồng độ pha lỗng cho vào 3 giếng thạch. Ủ đĩa ở nhiệt độ phịng, trong tối, 72 giờ. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Hình 2.9 Bố trí các nghiệm thức kháng nấm trên đĩa thạch PDA Đọc kết quả thí nghiệm: ______________________________47______________________________ Đồ án tốt nghiệp Nếu xảy ra hiện tƣợng kháng nấm thì sự phát triển của nấm ở đĩa thí nghiệm sẽ bị ức chế và đƣờng kính của khuẩn lạc ở đĩa thí nghiệm sẽ nhỏ hơn đƣờng kính của khuẩn lạc ở đĩa đối chứng Nếu khơng xảy ra hiện tƣợng kháng nấm thì sự phát triển của nấm ở đĩa thí nghiệm sẽ khơng bị ức chế, phát triển bình thƣờng nhƣ nấm ở đĩa đối chứng. Tỷ lệ ức chế đƣợc đánh giá theo cơng thức sau (Pander và cộng sự, 1982) Đọc kết quả thí nghiệm: Nếu xảy ra hiện tƣợng kháng nấm thì sự phát triển của nấm ở đĩa thí nghiệm sẽ bị ức chế và đƣờng kính của khuẩn lạc ở đĩa thí nghiệm sẽ nhỏ hơn đƣờng kính của khuẩn lạc ở đĩa đối chứng Nếu khơng xảy ra hiện tƣợng kháng nấm thì sự phát triển của nấm ở đĩa thí nghiệm sẽ khơng bị ức chế, phát triển bình thƣờng nhƣ nấm ở đĩa đối chứng. Tỷ lệ ức chế đƣợc đánh giá theo cơng thức sau (Pander và cộng sự, 1982) ( ) Trong đĩ: đƣờng kính khuẩn lạc bằng đƣờng kính sau khi đo trừ đi đƣờng kính khối thạch 2.4.3.4 Khảo sát hiệu lực diệt sâu bằng phương pháp quét lá Sâu thí nghiệm – sâu khoang Spodoptera litura. Sâu khoang đầu tuổi 3 đƣợc chọn ra 30 con, tiến hành cân trọng lƣợng cả 30 con rồi cho vào hộp cĩ thể tích 950ml. Các hộp nuơi sâu đã đƣợc thanh trùng. Lặp lại 24 hộp Vi khuẩn thử nghiệm – Serratia marcescens Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 48 giờ trong mơi trƣờng lỏng PG vơ trùng, ủ tối và lắc 150 vịng/ phút. Sau tăng sinh, diệt tế bào vi khuẩn bằng cách đƣa về pH 2 trong 4 giờ; cho 450 HCl 1N vào canh trƣờng, để máy lắc trong 4 giờ, lắc 150 vịng/ phút, ủ tối. Dịch canh trƣờng đã đƣợc xử lí acid HCl 1N trong 4 giờ, sẽ đƣợc thêm 450 ______________________________48______________________________ Đồ án tốt nghiệp NaOH 1N để đƣa về pH = 7. Tiến hành pha lỗng dịch canh trƣờng thành dãy các -1 -2 -3 -4 -5 -6 nồng độ pha lỗng: 10 , 10 , 10 , 10 , 10 và 10 . Tiến hành đo OD499 ở từng nồng độ pha lỗng. Tiến hành nhỏ 100 Tween 80 0,02 % Tiến hành thí nghiệm. Phƣơng pháp nhỏ giọt trên bề mặt lá (Maureen và cộng sự, 2012) Phƣơng pháp này mơ phỏng gần giống với các điều kiện phun thuốc trực tiếp ngồi đồng nhằm khảo sát khả năng diệt sâu qua đƣờng tiêu hố của hợp chất prodigiosin của chủng SH1. Lá thầu dầu đƣợc rửa sạch và để ráo nƣớc, cắt với diện tích 15 10 (cm2). Hút 100 l dịch pha lỗng lên lá, vơ trùng que cấy để tiến hành trang đều dịch ở các nồng độ pha lỗng lên lá thầu dầu. Sau đĩ cho lá vào hộp nuơi sâu. Theo dõi số lƣợng sâu chết và trọng lƣợng của sâu trong 5 ngày theo các mốc thời gian: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Ở hộp sâu đối chứng âm: tiến hành cho sâu khoang ăn lá thầu dầu đƣợc trang đều 100 canh trƣờng PG vơ trùng đƣợc bổ sung 450 HCl 1N, 450 NaOH 1N và Tween 80 0,02% Ở hộp đối chứng dƣơng: tiến hành cho sâu khoang ăn lá thầu dầu đƣợc trang đều 100 thuốc trừ sâu Reasgant với Abamectin 1,8%. Abamectin là thuốc trừ sâu sinh học thế hệ mới, là hỗn hợp của Avermectin B1a (80%) và Avermectin B1b (20%) đƣợc ...ức nhiệt độ cùng khoảng thời gian thích hợp để tiêu diệt vi khuẩn S.marcescen. Thí nghiệm nhằm tạo mơi trƣờng nghiên cứu an tồn bằng phƣơng pháp xử lý nhiệt canh trƣờng sau tăng sinh vi khuẩn SH1, đảm bảo vi sinh vật chết hồn tồn, đồng thời khảo sát sự ảnh hƣởng của quá trình xử lý nhiệt nào sẽ thu nhận nhiều sắc tố thơ nhất. Kết quả nhận đƣợc từ đĩa mơi trƣờng PGA đƣợc trang canh trƣờng S.marcescens tại mức nhiệt 50oC, sau khi ủ tối suốt 24h cĩ sự xuất hiện những khuẩn lạc hình trịn, lồi, bĩng và cĩ màu đỏ đậm. Cĩ thể thấy, vi khuẩn SH1 cĩ khả năng sống sĩt ở mức nhiệt khá cao là 50oC, tại mức nhiệt này giá trị OD của prodigiosin là 1,200b.Vậy sử dụng phƣơng pháp xử lí nhiệt ở mức nhiệt 50oC để tiêu diệt tế bào là khơng khả thi. Kết quả nhận đƣợc từ đĩa mơi trƣờng PGA đƣợc trang canh trƣờng S.marcescens tại mức nhiệt 65oC, sau khi ủ tối suốt 24h khơng cĩ sự xuất hiện những khuẩn lạc hình trịn, lồi, bĩng và cĩ màu đỏ đậm. Cĩ thể thấy, vi khuẩn bị tiêu diệt ở mức nhiệt 65oC, tại mức nhiệt này giá trị OD của prodigiosin đo đƣợc là 1,287a.Vậy sử dụng phƣơng pháp xử lí nhiệt ở mức nhiệt 50oC để tiêu diệt tế bào là khả thi. Kết quả nhận đƣợc từ đĩa mơi trƣờng PGA đƣợc trang canh trƣờng S.marcescens tại mức nhiệt 80oC, sau khi ủ tối suốt 24h khơng sự xuất hiện những khuẩn lạc hình trịn, lồi, bĩng và cĩ màu đỏ đậm. Cĩ thể thấy, vi khuẩn SH1 bị tiêu diệt hồn tồn năng ở mức nhiệt cao là 80oC, tại mức nhiệt này giá trị OD của prodigiosin ______________________________60______________________________ Đồ án tốt nghiệp đo đƣợc là 1,122c .Vậy sử dụng phƣơng pháp xử lí nhiệt ở mức nhiệt 80oC để tiêu diệt tế bào là là khả thi. Vì mục đích cuối cùng là tạo đƣợc chế phẩm diệt sâu với quy mơ sản xuất cơng nghiệp, nên xử lí canh trƣờng lên men bằng phƣơng pháp nhiệt ở 65oC, 15 phút là biện pháp hợp lí, giảm đƣợc hao mịn vật tƣ sau này. Hình 3.4 Canh trƣờng đã xử lí acid trƣợc trang trên đĩa mơi trƣờng PGA, sau 24h ủ tối. 3.3 Khả năng tiết enzyme ngoại bào Đa phần các bộ phận trên cơ thể cơn trùng đƣợc cấu tạo bởi 3 thành phần là lipit, protein và chitin. Vì vậy canh trƣờng sau lên men thu hồi đƣợc lƣợng prodigiosin cao – là yếu tố độc lực. Để hoạt tính của prodigiosin trong chế phẩm sau này hoạt động tối ƣu thì cần cĩ sự hỗ trợ từ các enzyme ngoại bào nhƣ lipase, protease hay chitinase. 3.3.1 Khả năng giữ lại enzyme ngoại bào từ phương pháp xử lí acid Kết quả thu đƣợc sau 24 giờ, ủ tối trên mơi trƣờng thạch Tween 20 là sự hình thành vịng tủa trắng đục do khả năng phân giải lipit của enzyme lipase cĩ mặt trong canh trƣờng lên men. Tween 20 bị enzyme lipase thủy phân tạo ra các acid béo và các acid béo này tạo phức với ion Ca2+ làm mơi trƣờng xung quanh giếng thạch cĩ màu trắng đục. Tại các giếng thạch đƣợc bơm trực tiếp canh trƣờng lên men vi khuẩn mà khơng qua ly tâm loại bỏ tế bào cĩ sự xuất hiện vịng tủa trắng đục. Kết quả này tƣơng ______________________________61______________________________ Đồ án tốt nghiệp đồng với các giếng bơm dịch ly tâm. Điều này giúp khẳng định lại thí nghiệm xử lí acid để tiêu diệt tế bào vi khuẩn là hồn tồn khả thi. Thí nghiệm định tính protease tiến hành trên mơi trƣờng Casein khi cho kết quả enzyme protease gần nhƣ khơng bị ảnh hƣởng, cho vịng phân giải rất lớn. Khi nhỏ TCA 10% lên mơi trƣờng thấy sự xuất hiện vịng trịn trong suốt xung quanh giếng thạch, và mơi trƣờng chung quanh hĩa đục, đây là phức hợp TCA – casein do enzyme protease cĩ mặt trong canh trƣờng lên men vi khuẩn, enzyme này phân giải casein trong mơi trƣờng nên TCA tạo phức với casein. Vịng trịn trong suốt dễ dàng quan sát đƣợc. Tiến hành thí nghiệm trên mơi trƣờng huyền phù Chitin 1%, kết quả cho thấy khi hạ pH mơi trƣờng về khoảng acid (pH = 1 hay pH = 2) để diệt tế bào vi khuẩn đã làm ảnh hƣởng đến enzyme chitinase, làm enzyme này bị bất hoạt hoặc biến tính, mất khả năng phân giải chitin trong mơi trƣờng. Sau khi tiến hành thí nghiệm khảo sát định tính các enzyme ngoại bào gồm: lipase, protease và chitinase. Kết quả cho thấy việc hạ đột ngột pH mơi trƣờng từ trung tính (pH 7 0,5) về acid (pH = 2) khơng gây ảnh hƣởng đến hoạt tính của enzyme protease. Enzyme lipase của vi khuẩn khơng giữ đƣợc hoạt tính mạnh nhƣ ban đầu, nhƣng khả năng thủy phân lipit của enzyme này đƣợc bảo tồn đƣợc một phần trong mơi trƣờng acid khi xử lí. Chế phẩm diệt sâu từ prodigiosin sau này sẽ hồn hảo hơn nếu giữ đƣợc enzyme ngoại bào chitinase, nhƣng pH mơi trƣờng acid khi xử lí đã làm mất hoạt tính phân giải chitin của enzyme này. Tĩm lại, 2 trong 3 enzyme ngoại bào là lipase và protease đã giữ đƣợc hoạt tính trong suốt quá trình xử lí acid HCl 1N. ______________________________62______________________________ Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2. Khả năng bảo tồn các enzyme trong canh trƣờng lên men bằng phƣơng pháp xử lí acid. Đƣờng kính vịng phân giải (D – d) mm Hệ số trên mơi trƣờng tƣơng ứng STT pha lỗng Casein agar Tween 20 Chitin agar agar 1 21 28,3 1,5 15,7 2,9 0 2 22 27,3 0,6 13,3 1,2 0 3 23 28,3 3,9 12,3 1,5 0 4 24 25,3 2,5 0 0 5 25 17,0 14,8 0 0 ______________________________63______________________________ Đồ án tốt nghiệp A1 B1 C1 A2 B2 C2 A3 B3 C3 A4 B4 C4 A5 B5 C5 Hình 3.5. Khả năng bảo tồn1 các enzyme trong canh trƣờng đã xử lí 1 2 3 4 A1, A2, A3, A4, A5: Khả năng thủy phân Casein theo nồng độ pha lỗng : 2 , 2 , 2 , 2 , 25 1 2 3 4 5 B1, B2, B3, B4, B5: Khả năng thủy phân Lipit theo nồng độ pha lỗng: 2 , 2 , 2 , 2 , 2 ______________________________64______________________________ Đồ án tốt nghiệp 1 2 3 4 5 C1, C2, C3, C4, C5: Khả năng thủy phân Chitin theo nồng độ pha lỗng: 2 , 2 , 2 , 2 , 2 3.3.2 Khả năng giữ lại enzyme ngoại bào từ phương pháp xử lí nhiệt độ Kết quả thu đƣợc sau 24 giờ, ủ tối trên mơi trƣờng thạch Tween 20 cho thấy việc xử lí canh trƣờng ở 65oC đã làm mất đi hoạt tính phân giải lipit của enzyme lipase. Vì vậy, xung quanh giếng thạch khơng cĩ sự xuất hiện của vịng tủa trắng đục. Sau khi tiến hành thí nghiệm khảo sát định tính các enzyme ngoại bào gồm: lipase, protease và chitinase. Kết quả cho thấy xử lí canh trƣờng lên men vi khuẩn bằng phƣơng pháp nhiệt, tại mức nhiệt 65oC đã gây ảnh hƣởng một phần đến hoạt tính của enzyme protease. Enzyme lipase và chitinase của vi khuẩn bị biến tính hồn tồn. Tĩm lại, với thí nghiệm định tính enzyme đƣợc tiến hành ở phƣơng pháp xử lí nhiệt và phƣơng pháp xử lí acid nhằm khảo sát khả năng bảo tồn hoạt tính của các enzyme ngoại trong canh trƣờng xử lí. Kết quả cho thấy phƣơng pháp xử lí acid cĩ ƣu điểm bảo tồn đƣợc hoạt tính của 2 trong 3 enzyme ngoại bào là lipase và protease so với phƣơng pháp xử lí nhiệt. Bảng 3.3. Khả năng bảo tồn các enzyme trong canh trƣờng đã xử lí bằng phƣơng pháp xử lí nhiệt. Đƣờng kính vịng phân giải (D – d) mm Hệ số STT trên mơi trƣờng tƣơng ứng pha lỗng Casein agar Tween 20 agar Chitin agar 1 21 19,3 0,6 0 0 2 22 17,7 1,2 0 0 3 23 14,7 0,6 0 0 4 24 0 0 0 5 25 0 0 0 ______________________________65______________________________ Đồ án tốt nghiệp Hình 3.6. Khả năng bảo tồn các enzyme trong canh trƣờng đã xử lí 1 2 3 A1, A2, A3,: Khả năng thủy phân Casein theo nồng độ pha lỗng: 2 , 2 , 2 A1 B1 C1 A2 B2 C2 A3 B3 C3 1 2 3 B1, B2, B3,: Khả năng thủy phân Lipit theo nồng độ pha lỗng: 2 , 2 , 2 1 2 3 C1, C2, C3,: Khả năng thủy phân Chitin theo nồng độ pha lỗng: 2 , 2 , 2 Sau đây phƣơng pháp xử lý acid dịch nuơi cấy vi khuẩn Serratia marcescens đƣợc chọn để khảo sát hoạt tính sinh học của prodigiosin dƣới dạng chƣa trích ly bằng dung mơi. ______________________________66______________________________ Đồ án tốt nghiệp 3.4 Khả năng kháng khuẩn 3.4.1 Khả năng kháng khuẩn của prodigiosin từ phương pháp xử lí acid Prodigiosin cĩ khả năng ức chế sự tăng trƣởng của một số lồi vi khuẩn (Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là do khả năng thấm qua màng ngồi tế bào và khả năng tổng hợp các enzyme nhƣ DNA gyrase, topoisomerase IV, dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trƣởng của tế bào vi khuẩn (Ramina và Samira,2009). Kết quả kháng khuẩn cho thấy dịch nuơi cấy S. marcescens xử lý acid khả năng kháng khuẩn cả vi khuẩn Gram âm E.coli và Staphylococcus aureus là vi khuẩn Gram dƣơng (Bảng 3.4 và hình 3.7) Bảng 3.4. Khả năng kháng khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus của hoạt chất prodigiosin trong canh trƣờng lên men. Khả năng kháng khuẩn STT Hệ số pha lỗng Vịng kháng khuẩn Vịng kháng khuẩn S. E.coli (D – d) mm aureus (D – d) mm 1 21 6,7 1,1 8 0,0 2 22 5,7 2,5 7,7 0,6 3 23 0 0 4 24 0 0 5 25 0 0 ______________________________67______________________________ Đồ án tốt nghiệp A B Hình 3.7 Khả năng kháng khuẩn Escherichia coli(A) và Staphylococcus aureus(B) của hoạt chất prodigiosin trong canh trƣờng đã xử lí. 3.5 Hoạt tính kháng nấm Nấm Fusarium sp. và Collectotrichum sp. là hai lồi nấm bệnh gây hại cho cây trồng rất thƣờng gặp và gây thiệt hại về kinh tế rất nghiêm trọng. Prodigiosin sau khi tinh sạch một phần bằng trích ly lỏng lỏng khơng thể hiện hoạt tính kháng nấm. Dịch nuơi cấy S. marcescens sau khi xử lý acid cịn giữ lại một phần hoạt tính protease, mặc dù đã mất hoạt tính chitinase cĩ thể hiện hoạt tính kháng nấm khơng? Đĩ là lý do vì sao thí nghiệm này đƣợc tiến hành. 3.5.1 Khả năng kháng nấm của prodigiosin từ phương pháp xử lí aci Kết quả kháng nấm Fusarium sp. và Collectotrichum sp. cho thấy enzyme chitinase vốn cĩ của vi khuẩn vẫn tồn tại trong canh trƣờng đã xử lí, đã ức chế việc phát tiển của tơ nấm Fusarium sp., nhƣng canh trƣờng đã xử lí khả năng ức chế đối với nấm bệnh Collectotrichum sp là khơng cao. ______________________________68______________________________ Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.5. Tỉ lệ ức chế nấm Fusarium sp. của canh trƣờng đã xử lí Nấm bệnh Fusarium sp. Đối chứng dƣơng Fusarium sp. – canh trƣờng đã xử lí Đƣờng kính vịng nấm 47 2,2 22,7 2,5 (mm) Tỉ lệ ức chế (%) 53,19 5,6 ______________________________69______________________________ Đồ án tốt nghiệp ĐC ĐC Hình 3.8 Khả năng kháng nấm Fusarium sp. của canh trƣờng đã xử lí so với đối chứng 3.6 Hiệu lực diệt sâu Sâu khoang Spodoptera litura là lồi ăn tạp, phá hoại trên nhiều cây kí chủ khác nhau nhƣ: rau muống, cây họ đậu, cải ngọt,... Việc thử canh trƣờng lên men cĩ chứa prodigiosin lên lồi sâu này giúp mở ra một bƣớc phát triển mới về chế phẩm trừ sâu sinh học từ hợp chất thứ cấp của vi khuẩn. 3.6.1 Hiệu lực diệt sâu từ canh trường lên men đã qua xử lí ______________________________70______________________________ Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm hiệu lực diệt sâu đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp quét lá với các nồng độ riêng biệt để xác định giá trị nồng độ nào diệt sâu tốt nhất. Tiến hành thử nghiệm với 1 đối chứng dƣơng là thuốc trừ sâu sinh học REASGANT 3.6EC và 1 đối chứng âm là mơi trƣờng PG broth vơ trùng, cùng 6 nghiệm thức nồng độ pha lỗng là 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6, theo dõi số lƣợng sâu chết mỗi 24 tiếng trong vịng 6 ngày. Kết quả cho thấy, với nồng độ pha lỗng là 10-4 cĩ nồng độ prodigiosin là 16,5 ng/cm2 cho kết quả kháng sâu là tốt nhất, tƣơng đƣơng với khả năng kháng sâu của thuốc trừ sâu sinh học Reasgant. Trong vịng 72h, tỉ lệ tử vong của sâu khoang đạt giá trị 56,67 %. Đến ngày thứ 6 của thí nghiệm, số lƣợng sâu tử vong đạt 100%. So sánh kết quả với khả năng diệt sâu khoang tuổi 3 đƣợc báo cáo trong đồ án của anh Nguyễn Hồng Anh Kha, 2009, thì nồng độ prodigiosin trong canh trƣờng đã qua xử lí thấp hơn so với nồng độ prodigiosin đã thực hiện ở báo cáo của tác giả. Cĩ thể thấy các enzyme ngoại bào đã hỗ trợ cho quá trình kháng sâu của hợp chất prodigiosin. ______________________________71______________________________ Đồ án tốt nghiệp Hình 3.9. Thí nghiệm hiệu lực diệt sâu theo thứ tự pha lỗng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6. Hình 3.8 Sâu chết bởi canh trƣờng đã xử lí acid Bảng 3.9. Tỉ lệ tử vong của sâu khoang tuổi 3. Tỉ lệ tử vong (%) Nồng độ pha lỗng 0h 24h 48h 72h 96h 120h 10-1 0.00 0.00 23.33 40.00 46.67 53.33 10-2 0.00 3.33 20.00 40.00 50.00 56.67 10-3 0.00 6.67 16.67 50.00 56.67 66.67 ______________________________72______________________________ Đồ án tốt nghiệp 10-4 0.00 10.00 30.00 56.67 83.33 100.00 10-5 0.00 10.00 23.33 40.00 50.00 60.00 10-6 0.00 6.67 6.67 33.33 43.33 56.67 Khả năng diệt sâu của dịch nuơi cấy đã xử lí acid HCl 1N 120 100 80 2246.0 ng/cm2 1645.6 ng/cm2 60 164.6 ng/cm2 16.5 ng/cm2 40 1.6 ng/cm2 Tỉ lệ sâu chết (%) chếtsâulệ Tỉ 0.2 ng/cm2 20 Thuốc trừ sâu (6ng/cm2) 0 0 2 4 6 8 Thời gian (ngày) Hình 3.11 Tỉ lệ sâu chết theo thời gian do canh trƣờng S.marcescens đã xử lí acid (Abbout,1925) 3.6.2 Hiệu lực diệt sâu từ chế phẩm Thí nghiệm hiệu lực diệt sâu đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp quét lá với các nồng độ riêng biệt để xác định giá trị nồng độ nào diệt sâu tốt nhất. Tiến thử nghiệm với 1 đối chứng dƣơng là thuốc trừ sâu sinh học REASGANT 1.8EC và 1 đối chứng âm là mơi trƣờng PG broth vơ trùng cĩ bổ sung Tween 80 0,02%, rỉ đƣờng 1 % và CMC 1 % , cùng 6 nghiệm thức chế phẩm ở nồng độ pha ______________________________73______________________________ Đồ án tốt nghiệp lỗng là 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6 , theo dõi số lƣợng sâu chết mỗi 24 tiếng trong vịng 6 ngày. Kết quả cho thấy, với nồng độ pha lỗng là 10-4 cĩ nồng độ prodigiosin là 16,5 mg/ml cho kết quả kháng sâu là tốt nhất, tƣơng đƣơng với khả năng diệt sâu của thuốc trừ sâu sinh học Reasgant. Trong vịng 48h, tỉ lệ tử vong của sâu khoang đạt giá trị 56,67 %. Vì canh trƣờng đã xử lí đƣợc bổng sung vào rỉ đƣờng, CMC và Tween 80 giúp nâng cao khả năng kháng sâu khoang. Bổ sung CMC 1% giúp tăng độ kết bám của chế phẩm lên trên lá, giảm thất thốt prodigiosin. Bên cạnh đĩ, lồi sâu này thích vị chua ngọt nên khi bổ sung rỉ đƣờng vào chế phẩm giúp kích thích sự khẩu vị của nĩ, khi đƣợc tiêu hĩa vào trong cơ thể lƣợng Tween bổ sung vào trong chế phẩm giúp prodigiosin khuếch tán tốt vào cơ thể, ngồi ra cịn cĩ các enzyme ngoại bào giúp cho hoạt chất prodigiosin hoạt động tốt và gây chết sâu nhanh hơn so với thử nghiệm diệt sâu của canh trƣờng S.marcescens đã xử lí. Hình 3.12Chế phẩm và các nồng độ pha lỗng lần lƣợt 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và10-6 Bảng 3.10Tỉ lệ tử vong của sâu khoang tuổi 3. Tỉ lệ tử vong Nồng độ pha 0h 24h 48h 72h 96h 120h lỗng 10-1 0.00 10.00 16.67 53.33 83.33 90.00 ______________________________74______________________________ Đồ án tốt nghiệp 10-2 0.00 3.33 20.00 60.00 70.00 86.67 10-3 0.00 13.33 30.00 70.00 76.67 90.00 10-4 0.00 30.00 56.67 86.67 100.00 100.00 10-5 0.00 26.67 36.67 53.33 76.67 90.00 10-6 0.00 6.67 20.00 43.33 63.33 90.00 Khả năng diệt sâu của chế phẩm 120.0 100.0 80.0 2246.0 ng/cm2 1645.6 ng/cm2 60.0 164.6 ng/cm2 16.5 ng/cm2 40.0 1.6 ng/cm2 Tỉ lệ sâu chết (%) chếtsâulệ Tỉ 0.2 ng/cm2 20.0 Thuốc (6 ng/cm2) 0.0 0 1 2 3 4 5 6 7 Thời gian (ngày) Hình 3.13. Tỉ lệ sâu chết cho chế phẩm theo thời gian (Abbott, 1925) 3.7 Xác định thời gian bảo quan canh trường S.marcescens đã xử lí Tiến hành thí nghiệm bảo quản canh trƣờng nhằm xác định khoảng nhiệt độ cùng thời gian làm prodigiosin bị biến tính để tìm ra hƣớng bảo quản chế phẩm trừ sâu tốt hơn. Thí nghiệm đƣợc thực hiện ở 3 mơi trƣờng nhiệt độ khác nhau: ngồi trời, nhiệt độ phịng và nhiệt độ tủ mát (2oC). Kết quả xử lí số liệu phần mềm SAS 9.0 và thống kê ANOVA, với kết quả tin cậy là 95%. Cho thấy nồng độ của prodigiosin ở nghiệm thức ngồi sáng, giảm dần từ ngày ______________________________75______________________________ Đồ án tốt nghiệp thứ 3 đến ngày thứ 7 của quá trình bảo quản. Tại nghiệm thức nhiệt độ 2oC và ngồi trời cĩ hiệu suất bảo quản lần lƣợt là 94,2a và 90,3b, khác biệt cĩ nghĩa. Và hiệu suất bảo quản tại nhiệt độ phịng 85,9b. (Hình 3.14) Ở kết quả xử lí thống kê SAS với độ tin cậy 95%, nồng độ của prodigiosin ở nghiệm thức trong tối, giảm dần từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7 của quá trình bảo quản. Tại nghiệm thức nhiệt độ 2oC và ngồi trời cĩ hiệu suất bảo quản lần lƣợt là 94,2a và 93,3a, khơng khác biệt cĩ nghĩa. Và hiệu suất bảo quản tại nhiệt độ phịng 85,9b. (Hình 3.15) Khả năng bảo quản dịch nuơi cấy đã xử lí (ngồi sáng) 120.0 100.0 80.0 60.0 Nhiệt độ 2oC Nhiệt độ phịng 40.0 Nhiệt độ ngồi trời Tỉ lệ prodigiosin (%) 20.0 0.0 0 2 4 6 Thời gian (ngày) Hình 3.14. Tỉ lệ prodigiosin cịn lại trong canh trƣờng S.marcescens đã xử lí ở mơi trƣờng ngồi sáng ______________________________76______________________________ Đồ án tốt nghiệp Khả năng bảo quản dịch nuơi cấy đã xử lí (bao tối) 120.0 100.0 80.0 60.0 Nhiệt độ 2oC Nhiệt độ phịng 40.0 Nhiệt độ ngồi trời Tỉ lệ prodigiosin (%) 20.0 0.0 0 1 2 3 4 5 6 Thời gian (ngày) Hình 3.15. Tỉ lệ prodigiosin cịn lại trong canh trƣờng đã xử lí ở mơi trƣờng tối Khi so sánh khả năng bảo quản canh trƣờng lên men trong 7 ngày giữa mơi trƣờng trong tối và ngồi sáng thì kết quả cho thấy, ở điều kiện bảo quản là 2oC và ngồi trời thì hiệu suất bảo quản là tốt nhất và khơng cĩ khác biệt cĩ nghĩa khi xử lí bằng phần mềm SAS và ANOVA. Tuy nhiên, khơng loại trƣờng điều kiện khách quan là nhiệt độ mơi trƣờng, nên dẫn đến khơng khác biệt cĩ nghĩa. So sánh ở cùng nhiệt độ 2oC, thì bảo quản ở điều kiện trong tối và ngồi sáng cho kết quả xử lí thống kê SAS với độ tin cậy 95%, hiệu suất bảo quản là nhƣ nhau và khơng cĩ sự khác biệt. (Hình 3.16) So sánh ở cùng nhiệt độ phịng, thì bảo quản ở điều kiện trong tối và ngồi sáng cho kết quả xử lí thống kê SAS với độ tin cậy 95%, hiệu suất bảo quản là nhƣ nhau và khơng cĩ sự khác biệt. (Hình 3.17) So sánh ở cùng nhiệt độ ngồi trời, thì bảo quản ở điều kiện trong tối và ngồi sáng cho kết quả xử lí thống kê SAS với độ tin cậy 95%, hiệu suất bảo quản là nhƣ nhau và khơng cĩ sự khác biệt. (Hình 3.18) ______________________________77______________________________ Đồ án tốt nghiệp Nhiệt độ 2oC 108.0 106.0 104.0 102.0 100.0 98.0 96.0 94.0 92.0 90.0 Tỉ Tỉ lệ Prodigiosincịn lại 88.0 86.0 Ngồi Trong Ngồi Trong Ngồi Trong Ngồi Trong Ngồi Trong sáng tối sáng tối sáng tối sáng tối sáng tối Ngày thứ nhất Ngày thứ 3 Ngày thứ 5 Ngày thứ 6 Ngày thứ 7 Hình 3.16. So sánh tỉ lệ prodigiosin cịn lại trong canh trƣờng ở nhiệt độ 2oC Nhiệt độ phịng 105.0 100.0 95.0 90.0 85.0 80.0 Tỉ Tỉ lệ prodigiosincịn lại 75.0 Ngồi Trong Ngồi Trong Ngồi Trong Ngồi Trong Ngồi Trong sáng tối sáng tối sáng tối sáng tối sáng tối Ngày thứ nhất Ngày thứ 3 Ngày thứ 5 Ngày thứ 6 Ngày thứ 7 Hình 3.17. So sánh tỉ lệ prodigiosin cịn lại trong canh trƣờng ở nhiệt độ phịng ______________________________78______________________________ Đồ án tốt nghiệp Nhiệt độ ngồi trời 104.0 102.0 100.0 98.0 96.0 94.0 92.0 90.0 88.0 Tỉ Tỉ lệ prodigiosincịn lại 86.0 84.0 Ngồi Trong Ngồi Trong Ngồi Trong Ngồi Trong Ngồi Trong sáng tối sáng tối sáng tối sáng tối sáng tối Ngày thứ nhất Ngày thứ 3 Ngày thứ 5 Ngày thứ 6 Ngày thứ 7 Hình 3.18. So sánh tỉ lệ prodigiosin cịn lại trong canh trƣờng ở ngồi trời 3.8 Xác định mơi trường bảo quan chế phẩm. Thí nghiệm đƣợc tiến hành với mục địc cĩ thể bảo quản prodigiosin trong chế phẩm càng ít biến tính và thất thốt do các yếu tố khách quan càn tốt, giúp đảm bảo hoạt lực diệt sâu của chế phẩm. Kết quả sau quá trình trích ly lỏng – lỏng thu đƣợc các kết quả. Ở nhiệt độ -20oC, thu nhận 8,184 mg/ml, đạt hiệu suất 38,16. Ở nhiệt độ tủ mát (2oC) thu nhận 20,016 mg/ml, đạt hiệu suất 93,32. Ở nhiệt độ phịng (37oC) thu nhận 18,228 mg/ml, đạt hiệu suất 84,99. Ở điều kiện mơi trƣờng nhiệt độ 60oC thu nhận 7,808 mg/ml, đạt hiệu suất 36,40. Ở điều kiện mơi trƣờng ngồi trời, chế phẩm tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời thu nhận 3,973 mg/ml, đạt hiệu suất 18,52. Tĩm lại, hoạt chất prodigiosin đƣợc bảo quản tốt nhất ở điều kiện mát mẻ (2 1 oC); trong khi prodigiosin bị biến tính trong điều kiện bảo quản là dƣới ánh sáng mặt trời (ngồi trời) và hoạt chất bị biến tính đến 80% lƣợng prodiosin ban đầu. ______________________________79______________________________ Đồ án tốt nghiệp Hình 3.19. Chế phẩm trƣớc và sau 7 ngày bảo quản. Canh trƣờng vi khuẩn SH1 đƣợc xử lí với acid trong 4h, đƣợc đƣa về pH 7 và thêm các phụ gia để tăng độ bám của prodigiosin trên lá (CMC 1%), tăng khả năng khuếch tán của prodigiosin (Tween 80 0,02%) và giảm sự tiếp xúc trực tiếp của prodigiosin với ánh sáng (rỉ đƣờng 1%). Vì vậy, chế phẩm sinh học diệt sâu ở nồng độ đậm đặc sẽ ở trạng thái huyền phù, hơi sệch lại. Nếu đo trực tiếp canh trƣờng với OD 499 sẽ dẫn đến sai số, ảnh hƣởng kết quả hiệu suất thu hồi. Vì vậy, tiến hành trích ly lỏng – lỏng canh trƣờng đã xử lí với petroleum ether, đo ở OD 535. Hình 3.20. Trích ly lỏng – lỏng chế phẩm ______________________________80______________________________ Đồ án tốt nghiệp Sau khi tiến hành trích ly lỏng – lỏng, để thu lại prodigiosin cịn lại trong chế phẩm. Xử lí thống kê với phần mềm SAS và ANOVA với khoảng tin cậy 95%, kết quả cho thấy sau 7 ngày bảo quản, nồng độ prodigiosin cịn lại trong mơi trƣờng nhiệt độ tử mát thì cao nhất 20,016a mg/ml, ở nhiệt độ phịng cĩ lƣợng prodigiosin sau thu hồi là 18,228b mg/ml, và ở mơi trƣờng ngồi trời cĩ nồng độ prodigiosin sau thu hồi là thấp nhất (Bảng 3.14). Cĩ thể nĩi, chế phẩm sau khi bổ sung các chất phụ gia cĩ khả năng bảo quản đƣợc 7 ngày trong điều kiện nhiệt độ mát mẻ (2oC) hoặc ở nhiệt độ phịng (30 3oC). Mặc dù bổ sung rỉ đƣờng giúp chế phẩm tránh ánh sáng trực tiếp, nhƣng tia UV cĩ trong tia nắng mặt trời làm biến tính gần nhƣ hồn tồn prodigiosin khi để chế phẩm ở mơi trƣờng ngồi trời. Bảng 3.14. Giá trị nồng độ prodigiosin sau 7 ngày bảo quản (mg/ml) Trƣớc khi cho Bảo quản sau phụ gia 7 ngày Nhiệt độ tủ đơng (-20oC) 21,449 8,184c 0,2 Nhiệt độ mát (2oC) 21,449 20,016a 0,5 Nhiệt độ phịng 21,449 18,228b 1,7 Nhiệt độ 60oC 21,449 7,808d 0,1 Nhiệt độ ngồi trời 21,449 3,973e 0,1 Dựa vào bảng 3.14, tính đƣợc hiệu suất bảo quản prodigiosin trong chế phẩm sau 7 ngày bảo quản ở các điều kiện khác nhau là -18oC, 2oC, nhiệt độ phịng, 60oC và ngồi trời. Từ đĩ chọn ra mơi trƣờng bảo quản tốt nhất cho chế phẩm. Qua kết quả xử lí thống kê SAS và phân tích ANOVA, hiệu suất ở nhiệt độ 2oC là 93,319 2,3 là giá trị hiệu suất bảo quản tốt nhất trong 5 điều kiện khảo sát, đạt giá trị tin cậy 95%. Hiệu suất bảo quản ở nhiệt độ phịng cũng cho giá trị khá ổn ở mức 85 7,9. Đạt hiệu suất thấp nhất trong 5 điều kiện bảo quản là nhiệt độ ngồi trời với 18,52 0,4. Do ảnh ______________________________81______________________________ Đồ án tốt nghiệp hƣởng trực tiếp của tia mặt trời làm prodigiosin bị biến tính. Vậy nên, việc bảo quản chế phẩm tốt nhất nên ở nhiệt độ 2oC. (xem ở bảng 2 phụ lục B) Khả năng bảo quản chế phẩm 100.00 90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 Tỉ lệ lệ Tỉ prodigiosin lại cịn 10.00 0.00 Nhiệt độ tủ Nhiệt độ mát Nhiệt độ phịng Nhiệt độ 60oC Nhiệt độ ngồi đơng (-18oC) (2oC) trời Điều kiện bảo quản Hình 3.21. Hiệu suất bảo quản chế phẩm sau 7 ngày theo dõi ở các điều kiện mơi trƣờng: -18oC, 2oC, nhiệt độ phịng, nhiệt độ ngồi trời và nhiệt độ cao (60oC) ______________________________82______________________________ Đồ án tốt nghiệp KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Sau khi canh trƣờng S.marcescens SH1 đƣợc xử lí nhiệt 65oC, 15 phút, tế bào vi khuẩn bị tiêu diệt hồn tồn và prodigiosin cĩ giá trị OD 535 là 1,278; tuy nhiên các enzyme ngoại bào nhƣ chitinase, lipase bị bất hoạt hồn tồn và giữ lại một phần enzyme protease. Sau khi xứ lý canh trƣờng S.marcescens SH1 bằng HCl 1N về pH = 2 trong 4 giờ, tồn bộ vi khuẩn cũng bị tiêu diệt, pH 1 và pH 2, tế bào của vi khuẩn Serratia marcescens bị tiêu diệt hồn tồn. Riêng pH2 cĩ giá trị OD 499 của prodigiosin tại thời điểm ngƣng xử lí với acid là 18,00. Khi canh trƣờng S.marcescens đƣợc xử lí bằng phƣơng pháp acid cĩ đƣợc ƣu điểm so với phƣơng pháp xử lí nhiệt là các enzyme ngoại bào khơng bị biến tính. Vì vậy, phƣơng pháp xử lí acid HCl 1N, đƣa về pH 2 trong 4 giờ xử lí là biện pháp tiêu diệt tế bào vi khuẩn khả thi và phù hợp để thu hợp chất prodigiosin nhằm tạo chế phẩm sinh học diệt sâu. Canh trƣờng vi khuẩn S.marcescens đã xử lí cĩ khả năng kháng nấm đối với nấm Fusarium sp. với tỉ lệ ức chế là 53,19%, Canh trƣờng vi khuẩn S.marcescens đã xử lí khả năng cạnh tranh lấn át với các vi khuẩn gây bệnh Escherichia coli và Staphylococcus aureus. Hiệu quả diệt sâu của canh trƣờng vi khuẩn S.marcescens và chế phẩm sinh học diệt sâu tốt nhất ở nồng độ pha lỗng là 10-4, tƣơng đƣơng nồng độ prodigiosin là 16,5 ng/cm2. Với canh trƣờng vi khuẩn đã qua xử lí acid, trong vịng 72h tỉ lệ sâu tử vong là 56,67% đến hết ngày thứ 5 thì tỉ lệ sâu tử vong đạt 100%. Đối với chế phẩm diệt sâu sinh học, tỉ lệ tử vong ở sâu khoang tuổi 3 là 56,67% chỉ sau 48h cho ăn bằng phƣơng pháp quét lá và đạt tỉ lệ tử vong 100% trong vịng 96h, cĩ khả năng diệt sâu tƣơng đƣơng với thuốc trừ sâu sinh học REASGANT 3.6EC. ______________________________83______________________________ Đồ án tốt nghiệp Cả canh trƣờng vi khuẩn sau xử lí và chế phẩm sinh học trừ sâu cĩ thể bảo quản tốt ở nhiệt độ là 2oC, và nên tránh ánh sáng trực tiếp từ mặt trời. Đối với canh trƣờng vi khuẩn sau xử lí, tỉ lệ prodigiosin cịn lại sau 7 ngày bảo quan đạt 94,2 ở cả hai mơi trƣờng ủ tối và ngồi sáng tại nhiệt độ 2oC. Ở nhiệt độ phịng, hiệu quả của việc bảo quản ở ngồi sáng và ủ tối là 85,7 và 85,9. Ở nhiệt độ mơi trƣờng ngồi trời (30 3oC) khi ở ngồi sáng và ủ tối là 90,3 và 93,3. Đối với chế phẩm, mơi trƣờng bảo quản tốt nhất là 2oC với hiệu suất là 93,3, lần lƣợt ở các mơi trƣờng nhiệt độ phịng là 84,9, nhiệt độ -18oC và 60oC là 38,6, 36,4; mơi trƣờng ngồi trời là 18,5. Từ đây, cĩ thể rút ra kết quả chung cho tồn bộ quá trình là sử dụng phƣơng pháp xử lí acid HCl 1N, pH 2 trong 4 giờ để tiêu diệt hồn tồn tế bào vi khuẩn. Khả năng diệt sâu khoang của canh trƣờng đã xử lí khi đƣợc pha lỗng với nồng độ 10-4 để đạt hiệu quả diệt sâu là tối ƣu. Đồng thời bảo quản canh trƣờng cũng nhƣ chế phẩm ở điều kiện nhiệt độ mát mẻ (2oC) vì đây là mơi trƣờng nhiệt độ bảo quản tối ƣu. 2. Kiến nghị Tiếp tục khảo sát khả năng diệt sâu của các chủng Serratia marcescens SB và HB. Khảo sát sự ảnh hƣởng của chế phẩm lên thực vật, mơi trƣờng. Mở rộng phổ ký chủ cho chế phẩm sinh học diệt sâu. ______________________________84______________________________ Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt: Nguyễn Hiếu Dân (2013) Khảo sát hoạt tính sinh học của vi khuẩn Serratia marcescens phân lập từ tuyến trùng EPN và hợp chất màu dạng prodigiosin tổng hợp bởi vi khuẩn này, Đồ án tốt nghiệp, trƣờng Đại học Cơng nghệ TP. HCM. Nguyễn Hồng Anh Kha (2013) Thu nhận sắc tố màu đỏ dạng prodigiosin tổng hợp bởi vi khuẩn phân lập từ tuyến trùng EPN, Đồ án tốt nghiệp, trƣờng Đại học Cơng nghệ TP. HCM. Nguyễn Hồi Hƣơng, Nguyễn Hồng Anh Kha, Nguyễn Hiếu Dân, Nguyễn Thị Hai (2013) Phân lập chủng vi khuẩn từ tuyến trùng EPN và khảo sát độc lực của chúng trên sâu khoang Spodoptera litura, Báo cáo khoa học, P1 -16. Nguyễn Hồi Hƣơng, Nguyễn Hồng Anh Kha(2015) Khả năng diệt sâu khoang Spodoptera litura của vi khuẩn Serratia marcescens phân lập từ tuyến trùng EPN và hợp chất thứ cấp prodigiosin của vi khuẩn này, Tạp chí phát triển KH & CN, tập 18. Tài liệu tiếng Anh Pryce L. Haddix* and Terry F. Werner (2000) Spectrophotometric Assay of Gene Expression:Serratia marcescens Pigmentation. Lapenda Lins et al (2014), Production and toxicological evaluation of Prodigiosin from Serratia marcescens UCP/WFCC1549 on Mannitol Solid Medium, International Journal of Applied Research in Natural Products, Vol. 7 (2), pp. 32-38. Kamble K.D, Hiwarale V.D (2012), Prodigiosin production from Serratia marcescens ______________________________85______________________________ Đồ án tốt nghiệp strains obtained from farm soil, INTERNATIONAL JOURNAL OF ENVIRONMENTAL SCIENCES Volume 3, No 1, 2012 Vijayalakshmi et al (2016), Production of Prodigiosin from Serratia marcescens and its antioxidant and anticancer potential, International Journal of Advanced Research in Biological Sciences Volume 3, Issue 3 – 2016, 3(3): 75 – 88. Chidambaram Kulandaisamy et al (2009), An Insightful Overview on Microbial Pigment, Prodigiosin, Electronic Journal of Biology, 2009, Vol. 5(3): 49-61 Anuradha V Giri et al (2004), A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil, BMC Microbiology 2004, 4:11 Anita Khanafari, Mahnaz Mazaheri Assadi and Fatemeh Ahmadi Fakhr (2006), Review of Prodigiosin, Pigmentation in Serratia marcescens, Online Journal of Biological Sciences 6 (1): 1-13, 2006 Helvia W. Casullo de Arẳjo, K. Fukushima, and Galba M. Campos Takaki (2010), Prodigiosin Production by Serratia marcescens UCP 1549 Using Renewable- Resources as a Low Cost Substrate, Molecules 2010, 15, 6931-6940 Tài liệu cĩ nguồn từ Internet dac-diem-cua-hoat-chat-abamectin.html 7547&detail-level=2&orgids=(AAEO224324%20ECOLI)# ______________________________86______________________________