Đồ án Sản xuất nấm paecilomyces sp để phòng trừ tuyến trùng meilodogyne sp gây hại trên cây hồ tiêu

ự của cá nhân em dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hai – giảng viên Khoa Công Nghê Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM. Đề tài được thực hiện dựa trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và tiến hành nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Khoa Công Nghê Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM. Tất cả các số liệu, hình ảnh, các kết quả là nghiên cứu hoàn toàn trung thực. Đồ án không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, nếu có phát hiện sự gian lận em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Tp. HCM, ngày 15 tháng 8 năm 2016 Sinh viên thực hiện Phan Ánh Ngân i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập tại trường đến nay, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè. Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô ở Khoa Công Nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập tại trường. Và đặc biệt, trong học kỳ này. Nếu không có những lời hướng dẫn, dạy bảo của các thầy cô thì em nghĩ bài thu hoạch này của em rất khó có thể hoàn thiện được. Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy. Bài báo cáo đồ án tốt nghiệp thực hiện trong khoảng thời gian 3 tháng. Bước đầu đi vào thực tế của em còn hạn chế và còn nhiều bỡ ngỡ. Do vậy, không tránh khỏi những thiếu sót là điều chắc chắn, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của quý Thầy Cô và các bạn học cùng lớp để kiến thức của em trong lĩnh vực này được hoàn thiện hơn. Em xin gởi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với các thầy cô của trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM, đặc biệt là TS. Nguyễn Thị Hai, giảng viên khoa Công Nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường của trường đã tạo điều kiện cho em để em có thể hoàn thành tốt bài báo cáo đồ án tốt nghiệp này. Và em cũng xin chân thành cám ơn các thầy cô ở phòng thí nghiệm, các anh chị, các bạn đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành báo cáo đồ án tốt nghiệp. Trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp, cũng như là trong quá trình làm bài báo cáo, khó tránh khỏi sai sót đồng thời do trình độ lý luận cũng như kinh nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của Thầy/Cô để em học thêm được nhiều kinh nghiệm và áp dụng vào công việc sắp tới. Em xin chân thành cảm ơn ! ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ..........................................................................................................i LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. ii MỤC LỤC .................................................................................................................. iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.................................................................................. vi DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. vii DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. viii ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................................. 1 MỤC ĐÍCH .................................................................................................................. 2 NỘI DUNG................................................................................................................... 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3 Giới thiệu về nấm Paecilomyces sp. ..................................................................... 3 1.1.1. Phân loại khoa học ............................................................................................. 3 1.1.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................................. 4 1.1.3. Cơ chế tiết độc tố của nấm Paecilomyces .......................................................... 5 1.1.4. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của nấm Paecilomyces spp. đối với tuyến trùng .............................................................................................................................. 6 1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. ................. 7 Tổng quan về tuyến trùng Meloidogyne sp. gây bệnh bướu rễ trên cây hồ tiêu 11 1.2.1. Tổng quan về tuyến trùng ký sinh thực vật ..................................................... 11 1.2.2. Phân loại khoa học ........................................................................................... 14 Các nghiên cứu nước ngoài về nhân nuôi và sử dụng nấm Paecilomyces sp. trong phòng từ tuyến trùng hại cây trồng................................................................... 19 Các nghiên cứu trong nước về nhân nuôi và sử dụng Paecilomyces sp. trong phòng trừ tuyến trùng hại cây .................................................................................... 22 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................. 24 Thời gian và địa điểm nghiên cứu....................................................................... 24 iii Vật liệu nghiên cứu, thiết bị và hóa chất ............................................................ 24 2.2.1. Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 24 2.2.2. Thiết bị .............................................................................................................. 24 2.2.3. Các loại môi trường sử dụng ............................................................................ 25 Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 26 2.3.1. Hoạt hóa nguồn nấm Paecilomycse sp. ........................................................... 27 2.3.2. Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng ..................................................... 28 2.3.3. Các phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật ................................... 28 2.3.4. Phương pháp tách tuyến trùng từ rễ tiêu (dẫn theo Lê Thị Mai Châm, 2014) 29 2.3.5. Khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. trên các loại môi trường nhân sinh khối (theo Lê Hữu Phước, 2009) ............................................................... 30 2.3.6. Khảo sát ảnh hưởng của các loại cơ chất khác nhau lên sự phát triển của nấm Paecilomyces sp.......................................................................................................... 30 2.3.7. Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu, bệnh đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. ................................................................................................................................ 31 2.3.8. Khảo sát khả năng kí sinh con cái tuyến trùng Meloidogyne sp. của nấm Paecilomyces sp.......................................................................................................... 35 2.3.9. Đánh giá tác động của chế phẩm nấm Paecilomyces sp. trong việc phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. trên cây hồ tiêu ............................................................ 36 2.3.10. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................. 37 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 38 Kết quả hoạt hóa nguồn nấm Paecilomyces sp. .................................................. 38 Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm, trừ sâu đến sự phát triển của Paecilomyces sp.......................................................................................................... 39 iv 3.2.1. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ sâu đến sự phát triển của Paecilomyces sp. ..................................................................................................................................... 39 3.2.2. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển của Paecilomyces sp. ..................................................................................................................................... 41 3.2.3. Khảo sát khả năng đồng sinh trưởng của nấm Trichoderma sp. và Paecilomyces sp.......................................................................................................... 43 Khảo sát sự ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng đến sự hình thành và phát triển của nấm Pacilomyces sp. (môi trường lỏng) ............................................. 44 3.3.1. Khảo sát môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm Paecilomyces sp.......................................................................................................... 44 3.3.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng đến sự hình thành và phát triển của nấm Paecilomyces sp. (môi trường rắn) ........................................ 49 Khảo sát khả năng phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces sp.......................................................................................................... 52 3.4.1. Trong điều kiện phòng thí nghiệm ................................................................... 52 3.4.2. Trên đồng ruộng ............................................................................................... 55 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 58 Kết luận................................................................................................................ 58 Kiến nghị ............................................................................................................. 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 59 Tài liệu tiếng việt ........................................................................................................ 59 Tài liệu tiếng anh ........................................................................................................ 59 Tài liệu từ internet ...................................................................................................... 61 PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 1 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CDB: Czapeck – Dox. CMB: Complete Media NSC: ngày sau cấy. NT: nghiệm thức. PDA: Potato D – Glucose Agar SDAY1: Sabourand dextrose Yeast SDAY3: Sabourand dextrose Yeast bổ sung khoáng. vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2. 1. Bố trí thí nghiệm ....................................................................................... 31 Bảng 2. 2. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thuốc trừ sâu ....................................... 32 Bảng 2. 3. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng thuốc trừ nấm ............................................. 33 Bảng 2. 4. Bố trí thí nghiệm khả năng đồng sinh trưởng của Trichoderma sp. và Paecilomyces sp.......................................................................................................... 35 Bảng 2. 5. Bố trí thí nghiệm đánh giá tác động của chế phẩm Paecilomyces sp. ..... 37 Bảng 3. 1. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. trên 4 loại môi trường trừ nấm. . 40 Bảng 3. 2. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển nấm Paecilomyces sp.......................................................................................................... 40 Bảng 3. 3. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. .................................................... 41 Bảng 3. 4. Tỷ lệ khuẩn lạc bị ức chế .......................................................................... 41 Bảng 3. 5. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. .................................................... 43 Bảng 3. 6. Đường kính tản nấm Trichoderma sp. khi cấy đồng thời với nấm Paecilomyces sp.......................................................................................................... 43 Bảng 3. 7. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp. sau thời gian nuôi cấy trên môi trường lỏng lắc. ........................................................................................................... 44 Bảng 3. 8. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp. tính theo logarit ............................ 46 Bảng 3. 9. Số lượng bào tử sau 14 ngày nuôi cấy .................................................... 51 Bảng 3. 10. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp. nhân nuôi trên khay ngô mảnh và gạo tấm........................................................................................................................ 52 Bảng 3. 11. Tỷ lệ phần trăm số tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bị nấm Paecilomyces sp. ký sinh. ........................................................................................... 53 Bảng 3. 12. Đánh giá cấp hại của tuyến trùng trên cây hồ tiêu. ................................ 55 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Đại thể nấm Paecilomyces sp. được nuôi nấy trên môi trường PDA. ........ 4 Hình 1.2. Nấm Paecilomyces sp, được chụp dưới kính hiển vi .................................. 5 Hình 1.3. Cấu trúc Leucinostatins (paecilotoxin) ........................................................ 6 Hình 1.4. Cấu tạo tuyến trùng ký sinh thực vật ......................................................... 15 Hình 1.5. Vòng đời tuyến trùng Meloidogyne sp. ..................................................... 17 Hình 1.6. Một số chế phẩm từ nấm Paecilomyces sp. phòng trừ tuyến trùng. ......... 22 Hình 3.1. Nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA. ........................................... 38 Hình 3.2. Tản nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA có bổ sung các loại thuốc hóa học. (A: Actara 25WG; B: Sherpa 25EC; C: Plutel 1,8 EC; D: Oshin 20WP; E: đối chứng) .................................................................................................. 39 Hình 3.3. Nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA có bổ sung các loại thuốc hóa học.. (A: Antracol 70WP; B: Cup 2,9 SL; C: Saizole 5SC; D: Carbenzin 50WP; E: đối chứng) .................................................................................................. 42 Hình 3.4. Đĩa nấm khi cấy đồng thời Trichoderma sp. và Paecilomyces sp. ........... 44 Hình 3.5. Dịch nuôi cấy nấm Paecilomyces sp. trên 4 loại môi trường. (A: Môi trường CDB; B: Môi trường CMB; C: Môi trường SDAY1; D: Môi trường SDAY3). ..................................................................................................................... 45 Hình 3.6. Mật độ bào tử tính theo logarit trên bốn loại môi trường lỏng. ................ 48 Hình 3.7. Hình nấm Paecilomyces sp. được nuôi cấy trên 4 loại môi trường rắn(A: môi trường ngô mảnh, B: môi trường gạo tấm, C: môi trường lúa, D: môi trường cám) ............................................................................................................................ 50 Hình 3.8. Mật độ tế bào sau 14 ngày lên men rắn trên 4 loại môi trường. .............. 51 Hình 3.9. Nấm Paecilomyces sp. nhân nuôi trên khay. ............................................. 52 Hình 3.10. Tỷ lệ tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bị chết ở các ngày sau khi lây nhiễm. ........................................................................ Error! Bookmark not defined. Hình 3.11. Nấm Paecilomyces sp. tấn công con cái và trứng tuyến trùng Meloidogyne sp.; (A, B: con cái tuyến trùng trước khi lây nhiễm nấm; C, E: con cái tuyến trùng bị lây nhiễm nấm được soi dưới kính hiển vi; D, F: con cái và con cái viii mang túi trứng của tuyến trùng bị nhiễm nấm Paecilomyces sp. soi dưới kính hiển vi sau khi nhuộm Methylene blue). ............................................................................ 54 Hình 3.12. Người dân pha chế phẩm Paecilomyces sp. tưới vào gốc cây hồ tiêu .... 56 Hình 3.13. Trước khi tưới. ......................................................................................... 57 Hình 3.14. Sau khi tưới. ............................................................................................. 57 ix Đồ án tốt nghiệp ĐẶT VẤN ĐỀ Hồ tiêu được xem là một trong những cây trồng chủ lực chính của Việt Nam. Hồ tiêu (piper nigrumL.) được xem là “vua của các loại gia vị” và trở thành sản phẩm nông nghiệp quan trọng nhất của Việt Nam. Năm 2015, mặc dù chưa có thống kê đầy đủ, nhưng dự báo diện tích hồ tiêu cả nước đã vượt con số 100.000 ha (Theo số liệu Hiệp Hội hồ tiêu Việt Nam, 2015). Tuy nhiên, cũng như các ngành nông nghiệp khác, ngành hồ tiêu cũng phải đối mặt với các vấn đề về thiệt hại năng suất gây nên do dịch hại. Do đó, bảo vệ thực vật là một trong những phần rất quan trọng trong việc nâng cao năng suất hồ tiêu vì dịch hại được xem như nguyên nhân chính làm giảm năng suất và chất lượng hồ tiêu (Trịnh Thị Thu Thủy và ctv, 2012). Bên cạn các loại bệnh hại, tuyến trùng là dịch hại nguy hiểm trên cây hồ tiêu. Theo kết quả điều tra của Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp miền Nam thì tuyến trùng xuất hiện phổ biến ở tất cả các vùng trồng tiêu trong cả nước với mức độ gây hại cao. Việc tìm ra giải pháp để kiếm soát tác nhân tuyến trùng gây hại rất quan trọng. Hiện nay, đa số nông dân thường sử dụng các loại thuốc hóa học để phòng trừ. Tuy có tác dụng nhanh và hiệu quả nhưng các loại thuốc hóa học lại gây ra tác động xấu đối với môi trường, để lại tồn dư trong nông sản, tăng tính kháng của sâu bệnh làm cho việc phòng trừ trở nên khó khăn hơn. Vì vậy, hiện nay, các tác nhân sinh học là một trong những hướng tiềm năng trong việc phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu. Trên thế giới hiện nay có rất nhiều nghiên cứu sử dụng tác nhân sinh học để phòng trừ tuyến trùng. Đặc biệt, nấm Paecilomyces sp. được xem là một trong những loài nấm diệt tuyến trùng giệu quả cao nhất (Burges H. D., 1998; Butt T. M và Copping L., 2000). Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu về nấm Paecilomyces vẫn còn hạn chế. Năm 2014, Phùng Lê Kim Yến thuộc trường đại học Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh, phân lập được chủng nấm Paecilomyces sp. và đã chứng minh chủng nấm này có hiệu lực trừ tuyến trùng tốt. Tuy nhiên, tác giả chưa đưa ra được môi trường sản xuất thích hợp đối với chủng nấm này để ứng dụng trên đồng ruộng. Vì vậy, sinh viên chọn đề tài: “Sản xuất nấm Paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. gây hại trên cây hồ tiêu”. 1 Đồ án tốt nghiệp MỤC ĐÍCH Chọn môi trường tốt nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm Paecilomyces sp. và đánh giá khả năng phòng trừ tuyến trùng của chế phẩm nấm Paecilomyces sp. NỘI DUNG ❖ Hoạt hóa nguồn nấm Paecilomyces sp. ❖ Khảo sát ảnh hưởng của các loại thuốc trừ sâu, bệnh đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. ❖ Khảo sát ảnh hưởng của các loại cơ chất khác nhau lên sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. ❖ Đáng giá khả năng trừ tuyến trùng hại hồ tiêu trong điều kiện in vitro và trên đồng ruộng. 2 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu về nấm Paecilomyces sp. 1.1.1. Phân loại khoa học Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Eurotiales Họ: Trichocomaceace Chi: Paecylomyces Chi Paecilomyces do Bainier mô tả năm 1907, sau đó được nhiều tác giả chấp nhận chi mới này và bổ sung nhiều loài mới. Paecilomyces lilacinum đã được phân loại trong phần Isarioidea, mà trạng thái hoàn hảo vẫn chưa được tìm thấy. Nấm Paecilomyces spp. có rất nhiều loài trên thế giới, khoảng 31 loài và phân bố trên diện rộng trong đó có thể kể đến là Paecilomyces farinosus, Paecilomyces fumosoroseus, Paecilomyces amoeneroseus, Paecilomyces javanicus, Paecilomyces tenuipes, Paecilomyces cicadae, Paecilomyces lilacinus (Dilip K. Arora, P. D. Bridge, Deepak Bhatnagar, 2004). Nấm Paecilomyces sp. có rất nhiều loài, có phổ ký sinh tuyến trùng rất rộng, cả ở vùng nhiệt đới và ôn đới (Trần Văn Mão, 2002). Nấm Paecilomyces spp. dễ dàng tìm thấy ở đất tơi xốp, phân hữu cơ và thức ăn, xác bã hữu cơ, dư thừa thực vật. Chúng hiện diện ở những nơi ẩm ướt cả trong phòng và ngoài tự nhiên. Một số loài quan trọng trong phòng trừ sinh học như: - Paecilomyces carneus: phân lập từ đất và xác chết tuyến trùng - Paecilomyces farinosus: phân lập từ đất - Paecilomyces fumosoroseus: phân lập từ đất, bơ, gelatin, tuyến trùng. - Paecilomyces lilacinus phân lập từ xác bã hữu cơ, đôi khi ở tuyến trùng chết, rừng cao su, đất trồng tiêu... (Crop Protection Compennium, 2002). 3 Đồ án tốt nghiệp 1.1.2. Đặc điểm hình thái Paecilomyces sp. là loài nấm sợi được tìm thấy trong đất hay xác tuyến trùng. Khi được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo nấm thường phát triển khá chậm, có dạng thảm nhung, dạng bó sợi và thường lúc đầu có màu trắng sau đố khi bào tử phát triển thì chuyển sang màu hồng nhạt, màu tím hay màu lục nhạt (nên thường được gọi là nấm tím) tùy vào từng loài. Cũng có loài màu nâu hay vàng sẫm. Sợi nấm mềm, có vách, trong suốt và rộng từ 2,5 - 4 µm (Wikipedia). Cuống bào tử phân sinh phân nhánh, mức độ phân nhánh của nấm Paecilomyces sp. thường lớn hơn nấm mốc xanh Penicillium, gốc cuống dạng bình phình to, phía trên nhỏ và uốn cong. Cuống bình thường sắp xếp dạng vòng hoặc không đồng đều. Bào tử phân sinh đơn bào, không màu, mọc thành chuỗi, hình bầu dục, bề mặt nhẵn hoặc có gai (Trần Văn Mão, 2002). Khuẩn lạc mọc theo đường tròn đồng tâm. Có thể phân biệt các loài khác nhau của Paecilomyces thông qua hình thái đại thể và vi thể. (Phùng Lê Kim Yến, 2014) Hình 1.1. Đại thể nấm Paecilomyces sp. được nuôi nấy trên môi trường PDA. (Nguồn: Thể bình gồm một phần đuôi phình to, thon dần ở phần đầu như một cái cổ. Bào tử trong chuỗi có nhiều dạng từ elip đến hình thoi. Bào tử có thành trơn hoặc hơi nhám, không có bào tử chống chịu. 4 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2. Nấm Paecilomyces sp, được chụp dưới kính hiển vi (Nguồn: 1.1.3. Cơ chế tiết độc tố của nấm Paecilomyces Khi được nuôi cấy lên men chìm người ta đã chiết tách được hoạt chất sinh học có tên gọi là leucinostatins (còn gọi là paecilitoxin). Leucinostatins là một peptide trung tính với cấu trúc gồm: α - aminoisobutyric acid, L-leucine, β - alanine và theo sau bởi 3 acid amin bất thường (L – threo – β - hydroxy leucine, 2 – amino – 2 – hydroxy – 4 – methyl – 8 oxodecanoicacid và cis – 4 – methyl – L - proline (theo Mori et al. 1982). Leucinostatins có 6 loại đã được mô tả là A, B, C, D, E, F. Leucinostatins có khả năng kháng khuẩn, chống lại vi khuẩn Gram dương và nhiều loại nấm (theo Fukushima et al. 1983 a,b). Tuy nhiên trong cơ chế kiểm soát tuyến trùng không có sự tham gia của loại độc tố này. Tùy từng loài Paecilomyces khác nhau mà có sinh ra các độc tố khác như: bysochlamic acid, variotin, ferriunbin, viriditoxin, indole-3-acetic acid, fusigen và patulin. Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp này có thể gây ra tác động diệt tuyến trùng. 5 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3. Cấu trúc Leucinostatins (paecilotoxin) 1.1.4. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của nấm Paecilomyces spp. đối với tuyến trùng Nhiều loài vi nấm được phân lập từ trứng tuyến trùng sần rễ (Stirling và West, 1991). Được nghiên cứu nhiều nhất là Paecilomyces lilacinus và Paecilomyces chalmydosporia, chúng được xem là có khả năng ký sinh tuyến trùng hiệu quả nhất, có thể kí sinh cả trứng lẫn con cái (Siddiqui và Mahmood, 1996). Có hai rào cản đối với nấm kí sinh tuyến trùng khi xâm nhiễm kí chủ là lớp biểu bì ấu trùng tuổi 2 (J2) và vỏ trứng. Một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình xâm nhiễm là khả năng tiết enzyme protease và chitinase, bởi vì vỏ trứng được cấu tạo bởi 3 lớp riêng biệt: lớp vitelline bên ngoài, một lớp chitin và một lớp lipoprotein bên trong. Theo Llorca và Claugher (1990), trong quá trình xâm nhiễm, ở giai đoạn đầu, một mạng lưới sợi nấm phân nhánh tiếp xúc với vỏ trứng, sau đó chúng tiết enzyme để phân hủy vỏ trứng dẫn đến sự tan rã của lớp vitellin, sự phân hủy lớp chitin và lipoprotein (Morton et al., 2004). Các loài nấm khác nhau có khả năng xâm nhiễm tuyến trùng và trứng theo các phương thức khác nhau. Ban đầu, các bào tử và sợi nấm tiếp xúc với vỏ trứng. Nấm kí sinh tuyến trùng sử dụng cả cách thức hóa học (tiết enzyme) và cơ học. Nấm tiết ra các enzyme làm mềm vỏ trứng và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử mộc mầm, thông qua lổ thủng đó mầm của bào tử nấm sẽ xâm nhập vào bên trong 6 Đồ án tốt nghiệp trứng tuyến trùng (Perry và Starr, 2009). Khả năng tiết enzyme chitinase và protease đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập trứng tuyến trùng của các loài nấm (Tikhonov et al., 20002) do vỏ trứng được cấu tạo từ chitin và protein tạo thành một cấu trúc sợi nhỏ và vô định hình (Wharton, 1980). Sau khi xâm nhập vào bên trong chúng hoạt động, tiết ra các độc tố làm tê liệt và phá hủy bên trong cơ thể tuyến trùng, hút dinh dưỡng để sinh sản, tiêu diệt trứng, ấu trùng, làm thay đổi sự trao đổi chất, hoạt động sinh lý, dẫn đến cái chết của tuyến trùng. 1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. Các nhà khoa học cũng cho biết rằng nấm Paecilomyces spp. khi tấn công vào cơ thể tuyến trùng nếu gặp những điều kiện không thích hợp về nhiệt độ và ẩm độ, ánh sáng thì nấm sẽ tạo nên những thể chịu đựng (resistant structures) để đối phó lại với môi trường (Penland, 1982). 1.1.5.1 Nguồn dinh dưỡng Trong quá trình phát triển, nấm Paecilomyces sp. cần nhiều dưỡng chất, nếu thiếu dinh dưỡng sẽ làm hạn chế khả năng gây bệnh của nấm đối với tuyến trùng (theo trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2002). Carbon và Nitơ cùng với sự cân bằng giữa chúng có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển cũng như sự hình thành bào tử của nấm Paecilomyces sp. (theo trích dẫn của Rayati và ctv, 2001). Các nghiên cứu cho biết, việc bổ sung nguồn đường có ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme của nấm (dẫn theo Rayati và ctv, 2001). Các tác giả còn cho biết sucrose là cơ chất tốt nhất (8,725 cm) cho sự tăng trưởng, tiếp theo là glucose (5,625 cm). Liang, K. (1981) đã cho biết nấm Paecilomyces tenuipes khi thiếu nguồn nitơ động vật tính gây bệnh giảm xuống rõ rệt (Hill, K. L, 1999, trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2002). 1.1.5.2 Nhiệt độ Nhiệt độ và độ ẩm tương đối được coi là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển, hình thành bào tử và lây nhiễm của các loài nấm kí sinh tuyến trùng (Ayyasamy và Baskaran, 2005). Nhiệt độ thích hợp cho nấm trong khoảng 20 – 25 0C, nhưng ở 25 0C nấm phát triển tốt nhất (Lee et al., 1999). Gần đây, Stather và 7 Đồ án tốt nghiệp ctv đã công bố những kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. và xác định nấm Paecilomyces sp. thích hợp ở nhiệt độ 28 0C. Nếu nhiệt độ cao bào tử dễ bị chết hoặc không hình thành, khi tấn công tuyến trùng nếu gặp điều kiện nhiệt độ, ẩm độ hay ánh sáng không thích hợp thì nấm Paecilomyces sp. sẽ tạo nên những thể chịu đựng để đối phó lại môi trường (theo Penland, 1982). Khi nuôi nấm Paecilomyces farinosus ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau cho thấy nhiệt độ 15 0C có lợi cho sự hình thành bào tử hơn là nhiệt độ 24 0C. Khi nuôi nấm Paecilomyces papillata, nhiệt độ thích hợp nhất là 24 - 26 0C, nhưng ở nhiệt độ 18 0C tỷ lệ ký sinh cao hơn 18 % so với nhiệt độ 25 0C. Nguyên nhân có thể là do dưới nhiệt độ thấp sẽ làm giảm quá trình, dị hóa, làm tăng quá trình đồng hóa, từ đó làm tăng hoạt chất cho cá thể (Trần Văn Mão, 2002). Julio J. D và ctv. (2004) đã chứng minh rằng rất ít hoặc không có bào tử nấm được tạo nên ở các nhiệt độ 12 0C, 16 0C và 30 0C. 1.1.5.3 Ẩm độ Nấm phát triển thích hợp ở ẩm độ 80 – 90% (Phạm Thị Thùy, 2004). Ẩm độ cao sẽ rất có lợi cho bào tử nảy mầm và sinh trưởng của sợi nấm, tuy nhiên ẩm độthấp sẽ có lợi cho duy trì sự sống của nấm. Bào tử phân sinh của nấm Paecilomyces sp. có khả năng sống lâu trong điều kiện ẩm độ từ 0 – 34 % hơn là khi ẩm độ 75 %. 1.1.5.4 pH pH môi trường được quyết định bởi nồng độ ion H+, chính nồng độ ion H+ có ảnh hưởng đến hệ thống enzyme của tế bào và ảnh hưởng việc hấp thu khoáng, acid hữu cơ của tế bào nấm cho quá trình phát triển cũng như hình thành bào tử (Dasrupta, 1994). Nấm thường sống trong phạm vi pH = 3,5 – 8. Nhưng nấm tuyến trùng ưa pH hơi acid và nấm phát triển thích hợp ở pH = 5,5 – 6. Theo nghiên cứu của Sung Mi Shim et al., (2003), thì giá trị pH phù hợp cho sự phát triển của P. fumosoroseus nằm trong khoảng 6 – 9, còn P. japonica phát triển tối ưu ở pH 7 (Choi et al., 1999), P. sinclairii phát triển tối ưu ở pH 8 (Shim et al., 2003). 1.1.5.5 Ánh sáng 8 Đồ án tốt nghiệp Các loài nấm ký sinh tuyến trùng, tuyến trùng rất cần ánh sáng cho sự phát triển và tạo bào tử. Ánh sáng là nhân tố không thể thiếu cho việc hình thành bào tử (theo trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2002). Ánh sáng cũng rất cần thiết cho quá trình sinh bào tử của nấm Paecilomyces spp. Nếu thiếu ánh sáng thì nấm Paecilomyces spp. sẽ không tạo nhiều bào tử. 1.1.5.6 Độ thoáng khí Nấm tuyến trùng đa số đều thuộc loại hiếu khí. Khi nấm phát triển chúng đòi hỏi có lượng oxy thích hợp trong dụng cụ nhân nuôi hay trong cả biên độ rộng của không gian nuôi cấy, nếu phù hợp nấm sẽ phát triển tốt. 1.1.5.7 Môi trường nuôi cấy Năm 1986, tác giả Jeanne M. M. I. và CS. (1986) đã thử nghiệm nuôi cấy nấm Paecilomyces sp. bằng phương pháp lên men chìm. Tác giả đã tiến hành thử nghiệm các điều kiện nhân sinh khối tạo bào tử chồi (Blastospore) bằng các nguồn nitơ và cacbon khác nhau. Kết...yến trùng chết trong đĩa nấm nghi nhiễm Paecilomyces sp. Dùng đũa thủy tinh vô trùng nghiền mẫu với 10 ml nước cất vô trùng. Pha loãng mẫu thành các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6. Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml dịch mẫu pha loãng ở nồng độ 10-6 và tiến hành trãi đĩa trên môi trường PDA. ❖ Làm thuần bằng phương pháp cấy đơn bào tử Chuẩn bị đĩa petri có chứa sẵn 1 lớp mỏng môi trường thạch nước cất WA. Tạo dung dịch bào tử bằng cách dùng que cấy đã khử trùng lấy bào tử từ ổ bào tử (chú ý không lấy quá nhiều bào tử) khoảng 1 - 10 bào tử trên quang trường vật kín x10. Hòa bào tử vào ống nghiệm chứa 10 ml nước cất vô trùng. Lắc đều tay để bào tử hòa loãng đều trong ống nghiệm trong vòng 15 – 20 phút. Đổ dịch bào tử vào đĩa petri có chứa 1 lớp mỏng môi trường thạch nước cất và tráng qua toàn bộ đĩa rồi lắc nhẹ cho dịch tràn đều trên toàn bộ bề mặt môi trường trong thời gian từ 30 giây đến 1 phút. Trút bỏ toàn bộ dung dịch trong đĩa môi trường. Dán đĩa bằng paraffin và đặt đĩa môi tường nghiêng khoảng 30 – 400 cho ráo nước trong điều kiện tối từ 18 – 20 giờ. Quan sát đĩa môi trường dưới kính lúp để tìm bào tử nẩy mầm. Dùng que cấy dẹt, sắt để cắt xung quanh bào tử (cắt toàn bộ môi trường phía dưới của bào tử) và chuyển miếng thạch có bào tử đó sang đĩa môi trường mới. Ủ đĩa trong điều kiện phòng thí nghiệm và quan sát hình thái tản nấm sau 2 ngày. 27 Đồ án tốt nghiệp 2.3.2. Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng Chuẩn bị các ống nghiệm chứa môi trường PDA tiến hành hấp khử trùng. Sau khi hấp khử trùng xong để nghiêng một góc 45 0C các ống thạch này trên giá gỗ. Tiến hành cấy truyền giữ giống nấm trên bề mặt thạch nghiêng. Sau đó bảo quản các ống giống này trong điều kiện lạnh. (3 – 5 0C) 2.3.3. Các phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật 2.3.3.1. Phương pháp đổ/trải đĩa đếm khuẩn lạc ❖ Chuẩn bị đĩa petri vô trùng Môi trường được chuẩn bị - hấp khử trùng và được bảo quản mát ở 45 0C trong bể điều nhiệt. Hút 1ml mẫu vào đĩa trống (chọn nồng độ thích hợp). Đổ vào đĩa đã cấy 10 – 15ml môi trường, lắc đều. Để nguội môi trường và đem ủ. ❖ Đếm tất cả khuẩn lạc đơn lẻ mọc trên môi trường • Thường chọn những đĩa có số khuẩn lạc khoảng 30 –300. • Dùng bút để đếm các khuẩn lạc đã đếm. • Tính toán kết quả (dựa trên số khuẩn lạc đếm được và độ pha loãng để tính ra số khuẩn lạc vsv trong dung dịch ban đầu). 2.3.3.2. Phương pháp đếm trực tiếp tế bào trong buồng đếm hồng cầu Phương pháp này thường áp dụng để đếm tế bào nấm men hoặc bào tử nấm mốc. ❖ Chuẩn bị nước muối sinh lý và 0,1% Tween 80. ❖ Chuyển khoảng 10ml nước muối sinh lý này sang đĩa petri chứa bào tử (đường kính 9 cm), dùng que cấy vòng cào bào tử trên bề mặt đĩa, chuyển bào tử sang bình định mức 100 ml bằng pipet Pastuer, lặp lại các bước này tối thiểu ba lần bảo đảm chuyển hết bào tử sang bình định mức 100 ml. ❖ Lắc đều, pha loãng đến nồng độ 10-1, 10-2,... (sao cho mỗi ô nhỏ chứa 5-10 tế bào) ❖ Đếm trong buồng đếm hồng cầu. ❖ Đậy buồng đếm bằng một phiến kính mỏng. 28 Đồ án tốt nghiệp ❖ Nhẹ nhàng dùng đầu pipet (chứa 1 giọt huyền phù vi sinh vật), đặt vào cạnh buồng đếm (nơi tiếp giáp với phiến kính mỏng). Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn. Buồng đếm được chuẩn bị đúng khi chỉ có cùng không gian nằm giữa lá kính và buồng đếm được phủ bởi dịch huyền phù tế bào, còn các rãnh chung quanh thì không bị dính ướt. ❖ Di chuyển nhẹ nhàng khung đếm để dịch huyền phù tràn đầy các khoang. Khi đó, dịch nằm trong khoang có độ dày khoảng 0,1 mm. ❖ Đặt buồng đếm lên kính hiển vi, sử dụng vật kính x4 để tìm buồng đếm. Chỉnh thật rõ, sau đó chuyển qua vât kính x10 hoặc x40 để đếm. ❖ Điều chỉnh cường độ ánh sáng bằng cửa sập để có thể quan sát rõ ràng cả tế bào lẫn các đường kẻ. Tùy vào số lượng tế bào mà có thể chọn cách đếm tất cả các tế bào có trong ô trung tâm hay chỉ đếm các tế bào có trong một số ô vuông lớn đại diện. Đếm bào tử trong vùng có chữ W (vùng đếm bạch cầu). ❖ Bắt đầu đếm tế bào sau khi nhỏ giọt dịch từ 3-5 phút; phải đếm các tế bào nằm trên 2 đường kẻ kề nhau được chọn của từng ô. • Mật độ bào tử trong mẫu là: Bào tử / 1mm3 = 퐵 = 퐵 1푚푚2.0,1 푚푚 10 Bào tử / 1ml = B.1000.10 (B là số bào tử trung bình đếm được) • Số bào tử trong dung dịch gốc: Bào tử / ml = B.1000.10.F (F là hệ số pha loãng) • Số bào tử trên 1 đĩa Petri 9 cm = B.104.F 2.3.4. Phương pháp tách tuyến trùng từ rễ tiêu (dẫn theo Lê Thị Mai Châm, 2014) ❖ Trứng và con cái Meloidogyne spp. được tách ra từ rễ cây hồ tiêu thu được ở tỉnh Bình Phước. Mẫu rễ lấy về được rửa sạch dưới vòi nước chảy, để khô tự nhiên, cân khối lượng và đánh giá mức độ nguy hại trước khi tách tuyế trùng. Các cấp đô nguy hại của rễ được đánh giá dựa vào sự hiện diện của các nốt sần. ❖ Mẫu rễ lấy về được rửa sạch dưới vòi nước chảy, để trên giấy thấm khô tự nhiên. Sau đó, dùng dao cấy nhọn tách từ từ phần rễ dưới ánh đèn sáng và 29 Đồ án tốt nghiệp bắt con cái, túi trứng trong nốt sần. Con cái có màu trắng đục, hình quả lê, kích thước tùy vào con to nhỏ khác nhau, thường dài khoảng 600 - 700 nm, rộng 400 - 500 nm. Túi trứng có màu hơi vàng nâu, hình bầu dục với kích thước tương đương với kích thước con cái. 2.3.5. Khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. trên các loại môi trường nhân sinh khối (theo Lê Hữu Phước, 2009) ❖ Thí nghiệm được bố trí như sau  NT1: môi trường Czapeck- Dox  NT2: môi trường CMB  NT3: môi trường SDAY1  NT4: môi trường SDAY3 ❖ Bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức tương ứng với 4 loại môi trường CDB, CMB, SDAY1, SDAY3 và 3 lần lặp lại. Mỗi đơn vị thí nghiệm tương ứng với 1 bình tam giác 500ml (chứa 250ml môi trường thử nghiệm). Các bình tam giác chứa môi trường này đã được thanh trùng bằng autoclave ở 121 0C trong 15 phút. Ở mỗi bình tam giác, chủng 25 ml huyền phù bào tử nấm có mật số 4,72.106 bào tử / ml. Các đơn vị thí nghiệm (bình chứa môi trường) được đặt trên máy lắc tốc độ 120 vòng / phút ở nhiệt độ phòng, thời gian 12 giờ sáng / 12 giờ tối. ❖ Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng bào tử quan sát và đếm được vào các thời điểm: 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày sau khi lắc cho tất cả các thí nghiệm. Ở mỗi thời điểm, tiến hành pha loãng dung dịch huyền phù bào tử nấm trong mỗi bình môi trường. Đếm mật số bào tử / ml cho từng nghiệm thức. 2.3.6. Khảo sát ảnh hưởng của các loại cơ chất khác nhau lên sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. 30 Đồ án tốt nghiệp Bảng 2. 1. Bố trí thí nghiệm Nghiệm thức Cơ chất Khối lượng NT1 Lúa 100g NT2 Gạo Tấm 100g NT3 Cám trấu 100g NT4 Ngô mảnh 100g Cấy giống có mật độ 9,44 x 106 bào tử / ml. Bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức tương ứng với 4 loại môi trường cám, gạo tấm, lúa, ngô mảnh và 3 lần lặp lại. Thí nghiệm được thực hiện trên chai thủy tinh. ❖ Chỉ tiêu đánh giá: Số lượng bào tử quan sát và đếm được vào thời điểm 14 ngày sau khi lắc. Ở thời điểm 14 ngày, tiến hành pha loãng dung dịch huyền phù bào tử nấm trong mỗi bình môi trường theo nồng độ 10-7 10-8 10-9. Đếm mật số bào tử / ml cho từng nghiệm thức. Số liệu mật số bào tử / ml được đổi sang logarit thập phân để xử lý trên phần mềm SAS và excel. 2.3.7. Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu, bệnh đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. 2.3.7.1. Khảo sát ảnh hưởng của các loài thuốc trừ sâu đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. 31 Đồ án tốt nghiệp Bảng 2. 2. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thuốc trừ sâu Nghiệm thức Thuốc trừ nấm Hoạt chất Liều lượng NT 1 Đối chứng Nước cất - NT 2 Sherpa 25EC Cypermethrin 0,125% NT 3 Plutel 1,8 EC Abamectin 1,8% 0,75% NT 4 Oshin 20WP Dinotefuran 0,6% NT 5 Actara 25WG Thiamethoxam 0,6% ❖ Chuẩn bị nguồn nấm thí nghiệm và môi trường nuôi cấy Nguồn nấm Paecilomyces: Chủng Paecilomyces sp. được nuôi cấy trên môi trường PDA và ủ ở nhiệt độ phòng trong 14 ngày. Môi trường nuôi cấy: Mỗi chai môi trường PDA sau khi được hấp khử trùng ở 121 0C, 1 atm trong 15 phút sẽ được để nguội đến 50 0C rồi bổ sung từng loại thuốc bảo vệ thực vật (ứng với từng nghiệm thức) theo liều lượng khuyến cáo của nhà sản xuất. ❖ Tiến hành nuôi cấy: Đổ đĩa và để nguội cho đến khi môi trường đông lại trong đĩa petri rồi dùng khoanh thạch hình trụ, đường kính 5 mm đục một miếng thạch có chứa nấm Paecilomyces sp. từ đĩa nấm đã chuẩn bị và đặt vào vị trí tâm đĩa môi trường vừa chuẩn bị xong. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 1 đĩa petri và đem ủ ở nhiệt độ phòng. ❖ Các chỉ tiêu theo dõi: • Đo đường kính khuẩn lạc (cm) trong 3, 5 và 7 ngày sau cấy • Tỷ lệ (%) ức chế được tính theo công thức: U = 퐷−푋x100 퐷 Trong đó: • U: % khuẩn lạc bị ức chế. • D: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức đối chứng. • X: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức xử lý thuốc. Chỉ tiêu đánh giá ảnh hưởng của thuốc được đánh giá theo bốn cấp độ (Hassan, 1989): 32 Đồ án tốt nghiệp  Cấp 1: không ảnh hưởng (<50% )  Cấp 2: ảnh hưởng yếu (50 – 79%)  Cấp 3: ảnh hưởng vừa (80 – 90%)  Cấp 4: ảnh hưởng cao (>90%) 2.3.7.2. Khảo sát ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. Bảng 2. 3. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng thuốc trừ nấm Nghiệm thức Thuốc trừ sâu Hoạt chất Liều lượng NT1 Đối chứng Nước cất - NT2 Saizole 5SC Hexaconazole 0,2% NT3 Carbenzim 500FL Carbendazim 0,2% NT4 Antracol propineb 2,5% NT5 Cup 2,9SL Nano đồng 0,25% ❖ Chuẩn bị nguồn nấm thí nghiệm và môi trường nuôi cấy Chủng Paecilomyces sp. được nuôi cấy trên môi trường PDA và ủ ở nhiệt độ phòng trong 14 ngày. Môi trường nuôi cấy: Mỗi chai môi trường PDA sau khi được hấp khử trùng ở 121 0C, 1atm trong 15 phút được để nguội đến 50 0C rồi bổ sung từng loại thuốc bảo vệ thực vật (ứng với từng nghiệm thức) theo liều lượng khuyến cáo của nhà sản xuất. ❖ Tiến hành nuôi cấy: Đổ đĩa và để nguội cho đến khi môi trường đông lại trong đĩa petri rồi dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5 mm đục một miếng thạch có chứa nấm Paecilomyces sp. từ đĩa nấm đã chuẩn bị và đặt vào vị trí tâm đĩa môi trường vừa chuẩn bị xong. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 1 đĩa petri và đem ủ ở nhiệt độ phòng. ❖ Các chỉ tiêu theo dõi: • Đường kính khuẩn lạc (cm) • Tỷ lệ ức chế: 33 Đồ án tốt nghiệp U = 퐷−푋x100 퐷 Trong đó: • U: % khuẩn lạc bị ức chế. • D: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức đối chứng. • X: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức xử lý thuốc. ❖ Chỉ tiêu đánh giá ảnh hưởng của thuốc được đánh giá theo bốn cấp độ (Hassan, 1989):  Cấp 1: không ảnh hưởng (<50% )  Cấp 2: ảnh hưởng yếu (50 – 79%)  Cấp 3: ảnh hưởng vừa (80 – 90%)  Cấp 4: ảnh hưởng cao (>90%) 2.3.7.3. Khảo sát khả năng đồng sinh trưởng của nấm Paecilomyces sp. và nấm Trichoderma sp. ❖ Chuẩn bị: Chủng Trichoderma sp. được nuôi cấy trong môi trường PDA sau 7 ngày và chủng Paecilomyces sp. được nuôi cấy trong môi trường PDA sau 14 ngày được cấy truyền để quan sát khả năng đồng sinh trưởng. Môi trường PDA được hấp khử trùng ở 121 0C, 1 atm trong 15 phút. Sau khi hấp khử trùng, nhiệt độ môi trường giảm xuống còn 50 – 60 0C, rót 20 ml môi trường vào các đĩa petri đã hấp khử trùng, đặt đĩa trên mặt phẳng cho đến khi thạch đông hoàn toàn. ❖ Tiến hành: Đĩa đối chứng dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5 mm đục một miếng thạch trên có nấm Paecilomyces sp. Dùng dao cất chuyển miếng thạch đặt cách mép đĩa petri 1 cm. Đĩa đối kháng dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5 mm đục một miếng thạch trên đĩa môi trường PDA có nấm Paecilomyces sp. Dùng dao cấy chuyển miếng thạch này đặt vào đĩa môi trường mới (đặt cách mép đĩa 1 cm). Sau đó, dùng một khoan thạch khác đục một miếng thạch của nấm Trichoderma sp. đặt vào vị trí đối xứng qua tâm đường kính đĩa thạch (đặt cách mép đĩa 1 cm giống như cách đặt nấm Paecilomyces sp.) Các thao tác trên đều được tiến hành trong tủ cấy vi sinh dưới ngon lửa đèn cồn. Nuôi ủ các đĩa ở nhiệt độ phòng, điều kiện ánh sáng 12 giờ sáng / 12 giờ tối. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 34 Đồ án tốt nghiệp Sau 3, 5 và 7 ngày, tiến hành đo đường kính khuẩn lạc của các tản nấm ở hai đĩa và tính tỷ lệ phần trăm ức chế của hai loại nấm. Bảng 2. 4. Bố trí thí nghiệm khả năng đồng sinh trưởng của Trichoderma sp. và Paecilomyces sp. Nghiệm thức Bố trí thí nghiệm Lặp lại Nghiệm thức 1 Đối chứng Paecilomyces sp. 3 Nghiệm thức 2 Trichoderma sp. + Paecilomyces sp. 3 ❖ Chỉ tiêu theo dõi: quan sát hình thái của cả ai chủng nấm sau 3, 5, 7 ngày nuôi cấy. Ở mỗi thời điểm, tiến hành đo đường kính tản nấm của hai loại nấm Trichoderma sp., Paecilomyces sp. và tỷ lệ ức chế sự phát triển được tính theo công thức (Fokkema, 1973) X= 푅1−푅2 푥 100 푅1 Trong đó: • X là phần trăm ức chế; • R1 là đường kính khuẩn lạc nấm bệnh phát triển trong đĩa đối chứng khi không có chủng đối kháng (mm); • R2 là đường kính khuẩn lạc nấm phát triển trong đĩa đối kháng khi có chủng đối kháng (mm); Mức độ ức chế sự phát triển được phân thành 4 cấp độ và đánh giá mức độ ức chế (Nguyễn Thị Thuần và cộng sự, 1996; Trần Kim Loang và cộng sự, 2009): • Cấp độ 1: ức chế cao: nấm Trichoderma ức chế trên 60 %; • Cấp độ 2: đối kháng trung bình: nấm Trichoderma ức chế bệnh từ 40 đến 59 %; • Cấp độ 3: đối kháng yếu: nấm Trichoderma ức chế từ 20 đến 40 %; • Cấp độ 4: không đối kháng: nấm Trichoderma ức chế dưới 19 %. 2.3.8. Khảo sát khả năng kí sinh con cái tuyến trùng Meloidogyne sp. của nấm Paecilomyces sp. Tiến hành nuôi cấy huyền phù bào tử nấm Paecilomyces sp. trên các đĩa Petri môi trường PDA. Sau 5 ngày nuôi cấy nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA 35 Đồ án tốt nghiệp tiến hành cấy tuyến trùng cái Meloidogyne sp. (8 tuyến trùng cái/ 1 đĩa PDA) vào mép khuẩn lạc nấm Paecilomyces sp. Tiến hành thí nghiệm trong thời gian 4 ngày. Bố trí thí nghiệm gồm 4 đĩa và lặp lại 3 lần. Sau mỗi ngày, thu kết quả thí nghiệm bằng cách dùng nước cất vô trùng cho vào các đĩa Petri rồi dùng kim mũi mác thu tuyến trùng cái. Quan sát sự lây nhiễm nấm Paecilomyces sp. trên tuyến trùng cái bằng cách làm tiêu bản nhuộm với methylene blue và soi dưới kính hiển vi. 2.3.9. Đánh giá tác động của chế phẩm nấm Paecilomyces sp. trong việc phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. trên cây hồ tiêu ❖ Mục đích: xác định hiệu quả phòng trị tuyến trùng hại hồ tiêu trên đồng ruộng của chủng nấm Paecilomyces sp. ❖ Bố trí thí nghiệm: • Địa điểm trên vườn tiêu bị tuyến trùng gây hại tại xã Đa Kia, huyện Bù Gia Mập, tỉnh Bình Phước. • Vườn tiêu được chia thành 2 lô thí nghiệm: Lô đối chứng do nông dân tự phòng trị. Lô thí nghiệm tưới nấm Paecilomyces sp., liều lượng 106 bào tử / ml, mỗi trụ tiêu tưới 1 lít dung dịch nấm sau khi pha. ❖ Mỗi công thức chọn 12 cây có tỷ lệ bị hại ở cấp 2 (Theo QCVN 01 - 172 : 2014/BNNPTNT) 36 Đồ án tốt nghiệp Bảng 2. 5. Bố trí thí nghiệm đánh giá tác động của chế phẩm Paecilomyces sp. Nghiệm thức Công thức Liều dùng NT1 Phun thuốc hóa học phòng Tưới nước, bón phân và phun trừ tuyến trùng thuốc hóa học VIFU-SUPER 5G (Hoạt chất: Carbosulfan), cách dùng: pha từ 20 - 30 kg/ha. NT2 Phun chế phẩm nấm Chế phẩm từ nấm Paecilomyces sp. Paecilomyces sp. có mật độ ban đầu là 1010 bào tử / g được pha loãng với nước nồng độ 106 bào tử / ml, tưới đều vào các gốc tiêu. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bị hại trước và sau khi tưới nấm. Cấp hại Tỷ lệ (%) bị hại được đánh giá theo QCVN 01 - 172 : 2014/BNNPTNT • Cấp 1 (nhẹ): ≤1/3 số rễ bị hại hoặc diện tích tán cây bị vàng, cành bị khô. • Cấp 2 (trung bình): >1/3 -<2/3 số rễ bị hại hoặc diện tích tán cây bị vàng, cành bị khô. • Cấp 3 (nặng): ≥2/3 số rễ bị hại hoặc diện tích tán cây bị vàng, cành bị chết khô hại trước và sau khi tưới nấm. 2.3.10. Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng phần mềm Excel và SAS để xử lý số liệu. 37 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả hoạt hóa nguồn nấm Paecilomyces sp. Sử dụng nguồn nấm Paecilomyces sp. của Phùng Lê Kim Yến (2014) và Lê Trần Quang Huy (2015), sinh viên tiến hành nhiễm lại trên con cái và trứng tuyến trùng, theo dõi trong phòng thí nghiệm.. Từ những cá thể con cái và trứng bị nghi ngờ bị chết do nhiễm nấm Paecilomyces sp,, sinh viên đã tiến hành phân lập lại và sau 7 ngày nuôi cấy, trên môi trường PDA đã xuất hiện tản nấm có màu trắng xốp sau sang màu hồng rồi màu hồng tím như hình 3.1. Hình 3.1. Nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA. Tản nấm có hình tròn đồng tâm, dạng thảm nhung khi nuôi cấy trên môi trường PDA. Ban đầu sợi tơ nấm có màu trắng, mềm, mịn. Sau 4 ngày nuôi cấy sợi nấm bắt đầu chuyển sang màu hồng nhạt và chuyển sang màu tím ở 14 ngày nuôi cấy. Khi quan sát dưới kính hiển vi có thể thấy cuốn bào tử dài, cong mọc phân nhánh từ các sợi nấm, các thể bình có dạng hình chai nước ở gốc phồng to, ở cổ thì nhỏ dần và mộc vươn thẳng. Các bào tử hình oval, dài khoảng 1,5 – 2,5 μm, mọc thưa thớt trên các thể bình liên kết với nhau thành chuỗi dài, hay bị đứt đoạn. 38 Đồ án tốt nghiệp Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm, trừ sâu đến sự phát triển của Paecilomyces sp. 3.2.1. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ sâu đến sự phát triển của Paecilomyces sp. Tiến hành thí nghiệm như mục 2.3.7.2 để khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. trên các môi trường thuốc trừ nấm, sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy trên các loại môi trường, thu được kết quả như hình 3.2. B E A D C Hình 3.2. Tản nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA có bổ sung các loại thuốc hóa học. (A: Actara 25WG; B: Sherpa 25EC; C: Oshin 20WP; D: Plutel 1,8 EC; E: đối chứng) 39 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3. 1. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. trên 4 loại môi trường trừ nấm. Đường kính tán nấm (cm) qua các ngày nuôi cấy Nghiệm thức 3 NSC 5 NSC 7 NSC Đối chứng 2,46a ± 0,05 3,18a ± 0,07 3,80a ± 0,17 Sherpa 25EC 1,70b ± 0,00 2,23b ± 0,05 2,80b ± 0,10 Plutel 1,8 EC 1,30c ± 0,17 1,78c ± 0,07 2,13c ± 0,15 Oshin 20WP 1,97b ± 0,11 3,03a ± 0,03 3,63a ± 0,37 Actara 25WG 2,33a ± 0,11 3,1a ± 0,10 3,77a ± 0,05 CV (%) 5,60 3,28 6,48 Bảng 3. 2. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển nấm Paecilomyces sp. Tỷ lệ (%) khuẩn lạc bị ức chế ở Cấp độ ức chế nấm của các Nghiệm thức các ngày sau cấy loại thuốc hóa học 5 NSC 7 NSC 5 NSC 7 NSC Đối chứng - - - - Sherpa 25EC 28,80c 26,11b 1 1 Plutel 1,8 EC 43,96b 40,08b 1 1 Oshin 20WP 4,70d 5,98c 1 1 Actara 25WG 2,60d 2,56c 1 1 CV (%) 7,72 19,42 Số liệu ở bảng 3.2 cho thấy, vào thời điểm 5NSC và 7 NSC, cả 4 loại thuốc trừ sâu đều có tác động đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Paecilomyces sp., tuy nhiên các loại thuốc thử nghiệm nêu trên chỉ có tác động thấp (chỉ bị ảnh hưởng ở cấp 1, cấp thấp nhất, theo Hassan (1999). Trong 4 loại thuốc hóa học, thuốc Actara 25WG có ảnh hưởng thấp nhất (ở 5 NSC là 2,6 % và ở 7 NSC là 2, 56 %), tiếp theo là Oshin 20WP (ở 5 NSC là 4,7 % và 7 NSC là 5,98 %), Sherpa 25EC xếp thứ ba (5 NSC là 28,8 và 7 NSC là 26,11 %). Plutel 1,8 EC có tác động nhiều nhất 40 Đồ án tốt nghiệp trong 4 loại thuốc (ở 5 NSC là 43,96% và ở 7 NSC là 40,08%). Kết quả trên cho thấy, khi sử dụng chế phẩm sinh học phòng trừ tuyến trùng từ nấm Paecilomyces sp. trong trường hợp cần thiết có thể kết hợp sử dụng chung với cả bốn loại thuốc hóa học trên. 3.2.2. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển của Paecilomyces sp. Bảng 3. 3. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. Đường kính tán nấm (cm) qua các ngày nuôi cấy Nghiệm thức 3 NSC 5 NSC 7 NSC Đối chứng 2,37a ± 0,15 3,18a ± 0,07 3,8a ± 0,17 Carbenzim 50WP 0,00c ± 0,00 0,00c ± 0,00 0,00c ± 0,00 Cup 2,9 SL 1,95b ± 0,38 2,1b ± 0,1 3,03b ± 0,06 Saizole 5SC 0,00c ± 0,00 0,00c ± 0,00 0,00c ± 0,00 Antracol 70WP 0,00c ± 0,00 0,00c ± 0,00 0,00c ± 0,00 CV (%) 21,83 5,33 5,97 Bảng 3. 4. Tỷ lệ khuẩn lạc bị ức chế Tỷ lệ (%) khuẩn lạc bị ức chế ở Cấp độ ức chế nấm của các Nghiệm thức các ngày sau cấy loại thuốc hóa học 5 NSC 7 NSC 5 NSC 7 NSC Đối chứng - - - - Carbenzim 100,00a 100,00a 4 4 50WP Cup 2,9 SL 33,99b 20,09b 1 1 Saizole 5SC 100,00a 100,00a 4 4 Antracol 100,00a 100,00a 4 4 70WP CV (%) 2,61 2,25 41 Đồ án tốt nghiệp Kết quả ở bảng 3.3 và bảng 3.4 cho thấy có 3 loại thuốc trừ bệnh ức chế hoàn toàn 100 % sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. là Saizole 5SC, Antracol 70WP và Carbenzin 50WP. Riêng thuốc Cup 2,9 SL có tỷ lệ ức chế khuẩn lạc thấp nhất là 33.9% sau 5 NSC và 20,09 % ở thời điểm 7 NSC, chỉ ức chế ở cấp 1 (theo Hassan, 1989). Vì vậy, khi phun chế phẩm nấm Paecilomyces sp. cần lưu ý không phun đồng thời cùng với các loại thuốc hóa học là Carbenzin 50 WP, Saizole 5SC và Antracol 70WP. Còn thuốc hóa học Cup 2,9 SL có tác động ức chế thấp đối với nấm Paecilomyces sp. nên có thể sử dụng chung khi phun trên đồng ruộng. A B E C D Hình 3.3. Nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA có bổ sung các loại thuốc hóa học.. (A: Antracol 70WP; B: Cup 2,9 SL; C: Saizole 5SC; D: Carbenzin 50WP; E: đối chứng) 42 Đồ án tốt nghiệp 3.2.3. Khảo sát khả năng đồng sinh trưởng của nấm Trichoderma sp. và Paecilomyces sp. Tiến hành thí nghiệm như ở mục 2.3.8 và lần lượt đo đường kính khuẩn lạc của nấm Paecilomyces sp. sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy. Bảng 3. 5. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. Đường kính tản nấm Tỷ lệ ức chế Mức độ đối Công thức sau 7 ngày nuôi cấy (%) kháng Đối chứng 2,80 ± 0,36 - - Nấm Paecilomyces Đối kháng yếu 2,10 ± 0,30 24,33 sp. nuôi cấy (-) Bảng 3. 6. Đường kính tản nấm Trichoderma sp. khi cấy đồng thời với nấm Paecilomyces sp. Đường kính tản nấm Tỷ lệ ức chế Mức độ đối Công thức sau 7 ngày nuôi cấy (%) kháng Đối chứng 8,3 ± 0,26 - - Nấm Trichoderma sp. Đối kháng yếu 5,57 ± 0,66 32,93 nuôi cấy (-) Theo như kết quả thu nhận được, khi nuôi cấy đồng thời hai loại nấm Trichoderma sp. và Paecilomyces sp. trên môi trường PDA, nấm Trichoderma sp. có ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp., tuy nhiên chỉ có ảnh hưởng yếu. Ở thời điểm 7 NSC, tỷ lệ ức chế nấm Paecilomyces sp. và nấm Trichoderma sp. lần lượt là 24,33 % và 32,93 %, nấm Trichoderma sp. đối kháng yếu với nấm Paecilomyces sp., theo hình chụp được từ kính hiển vi, hai loại nấm này chỉ cạnh tranh chất dinh dưỡng và không gian sống. Vì vậy, khi sử dụng chế phẩm Paecilomyces sp. có thể kết hợp sử dụng Trichoderma sp. nhưng cần lưu ý sử dụng liều lượng hợp lý. 43 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.4. Đĩa nấm khi cấy đồng thời Trichoderma sp. và Paecilomyces sp. Khảo sát sự ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng đến sự hình thành và phát triển của nấm Pacilomyces sp. (môi trường lỏng) 3.3.1. Khảo sát môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm Paecilomyces sp. Bảng 3. 7. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp. sau thời gian nuôi cấy trên môi trường lỏng lắc. Thời điểm nuôi cấy (x108 cfu) 2 ngày 4 ngày 6 ngày 9 ngày 12 ngày 14 ngày CDB 2,14b 2,57c 10,40bc 6,45c 2,87c 1,14b CMB 1,45b 1,95c 3,60c 2,18d 2,45c 0,80b SDAY1 7,25a 20,95b 21,35b 15,65b 7,11b 5,49a 44 Đồ án tốt nghiệp SDAY3 5,49ab 37,24a 45,30a 33,70a 11,57a 3,73ab CV (%) 22,37 20,69 18,82 8,22 25,28 23,89 Nấm Paecilomyces sp. được nuôi cấy lỏng lắc trên 4 loại môi trường thí nghiệm trong 14 ngày, ở mỗi thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày tiến hành lấy dịch sinh khối. A B C D Hình 3.5. Dịch nuôi cấy nấm Paecilomyces sp. trên 4 loại môi trường. (A: Môi trường CDB; B: Môi trường CMB; C: Môi trường SDAY1; D: Môi trường SDAY3). 45 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3. 8. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp. tính theo logarit Mật độ bào tử tính theo logarit 2 ngày 4 ngày 6 ngày 9 ngày 12 ngày 14 ngày CDB 8,32a ± 0,15 8,79bc ± 0,49 8,99bc ± 0,20 8,80ab ± 0,07 8,45b ± 0,08 8,06b ± 0,00 CMB 7,93a ± 0,70 8,28c ±0,16 8,55c ± 0,05 7,97b ± 0,92 8,39b ± 0,06 7,90b ± 0,07 SDAY1 8,86a ± 0,00 9,31ab ± 0,13 9,32ab ±0,11 9,19ab ± 0,05 8,85a ± 0,07 8,74a ± 0,01 SDAY3 8,74a ± 0,00 9,57a ± 0,01 9,65a ± 0,02 9,53a ± 0,01 9,06a ± 0,10 8,56a ± 0,16 CV(%) 4,23 2,96 1,28 5,19 0,91 1,03 Qua kết quả ở bảng 3.8 cho thấy, ở các thời điểm đều có sự gia tăng về sinh khối nấm so với lượng sinh khối nấm cấy vào ban đầu. Ở thời điểm 2 ngày sau cấy, môi trường SDAY1 có ưu thế tạo nhiều bào tử hơn (mật độ bào tử là 7,25.108 bào tử / ml), tiếp đến là môi trường SDAY3 với mật độ bào tử là 5,49.108 bào tử / ml. Tuy nhiên, cả 2 môi trường này đều tạo ra số lượng bào tử tương đối như nhau, không có sự sai khác có nghĩa về mặt thống kê với mức ý nghĩa 5 %. Ở thời điểm 4 ngày sau khi cấy, môi trường SDAY3 cho lượng bào tử cao nhất, đạt 37,24.108 bào tử / ml, tiếp đến là môi trường SDAY1 là 20,95.108 bào tử / ml. Cả hai môi trường CDB (2,57.108 bào tử / ml) và CMB (1,95.108 bào tử / ml) cho lượng bào tử thấp hơn nhiều so với 2 loại môi trường trên. Ở thời điểm 6, 9 và 12 ngày sau khi cấy, môi trường SDAY3 vẫn trội hơn ba loại môi trường còn lại. Mật độ bào tử lần lượt sau 6, 9 và 12 ngày sau cấy là 45,30.108 bào tử / ml, 33,70.108 bào tử / ml, 11,57.108 bào tử / ml. Tiếp theo là môi trường SDAY1 với mật độ bào tử lần lượt là 21,35.108 bào tử / ml, 15,65.108 bào tử / ml, 7,11.108 bào tử / ml. Môi trường CDB đạt lượng bào tử thấp hơn là 10,40.108 bào tử / ml, 6,45.108bào tử / ml và 2,87.108 bào tử / ml.Môi trường CMB cho lượng bào tử thấp nhất là 3,60.108 bào tử / ml; 2,18.108 bào tử / ml; 2,45.108 bào tử / ml. Điều này cũng phù hợp với nghiên cứu của Lê Hữu Phước (2009), tác giả đã khẳng 46 Đồ án tốt nghiệp định rằng ở thời điểm 6 NSC là thời điểm thu mật độ bào tử cao nhất cho nấm Paecilomyces sp. Ở thời điểm 14 ngày sau cấy, hai môi trường SDAY1 và SDAY3 đều cho lượng bào tử (5,49.108 bào tử / ml và 3,73.108 bào tử / ml) cao hơn so với hai loại môi trường CDB, CMB. Tuy nhiên, không có sự khác biệt có nghĩa ở hai môi trường SDAY1 và SDAY3 với mức ý nghĩa 1%. Điều này cũng trùng khớp với các nghiên cứu của Trần Thị Tho (2014), trong các loại môi trường trên, môi trường SDAY3 là loại môi trường thích hợp để nhân nuôi nấm Paecilomyces sp. Kết quả này cũng hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của Boucias và Pendland (1998), các tác giả nhận định rằng nấm Paecilomyces có thể dễ dàng nuôi cấy trên môi trường Sabouraud dextrose. Ngoài ra, các nghiên cứu được tiến hành trongnước cũng có kết quả tương tự, Phạm Thị Thùy và ctv. (1995) đã xác định môi trường Sabouraud bổ sung thêm khoáng chất là môi trường nhân giống nấm Paecilomyces sp. tốt nhất. 47 Đồ án tốt nghiệp Mật độ bào tử tính theo logarit 12.00 10.00 9.57 9.66 9.53 9.31 9.32 9.00 9.19 9.06 8.86 8.79 8.81 8.85 8.74 8.55 8.568.74 8.32 8.28 8.398.45 8.00 7.93 7.97 7.908.06 6.00 4.00 2.00 0.00 2 ngày 4 ngày 6 ngày 9 ngày 12 ngày 14 ngày CDA CMA SDAY1 SDAY3 Hình 3.6. Mật độ bào tử tính theo logarit trên bốn loại môi trường lỏng. 48 Đồ án tốt nghiệp Dựa vào biểu đồ về khả năng sinh bào tử sau 14 ngày nuôi cấy, tất cả 4 loại môi trường đều làm tăng mật độ bào tử. Hai môi trường SDAY1 và SDAY3 cho mật số bào tử cao hơn so với CDB và CMB ở thời điểm 2 ngày, tuy giữa chúng không khác biệt nhau về mặt thống kê. Có thể thấy rằng, bắt đầu từ thời điểm 6 ngày sau cấy, mật độ bào tử đạt cao nhất và bắt đầu giảm xuống ở thời điểm 9 ngày, 12 ngày và 14 ngày. Khả năng tạo bào tử ở 4 môi trường dinh dưỡng cao nhất ở 6 ngày. Mật độ bào tử cao nhất ở môi trường SDAY3 (45,30 x108 bào tử / ml) và thấp nhất là môi trường CMB, chỉ có 3,60 x108 bào tử / ml. Hai môi trường SDAY1 và CDB cho mật số bào tử lần lượt là 21,45 x108 bào tử / ml và 10,40 x108 bào tử / ml. Vì vậy, khi lên men thu sinh khối nấm Paecilomyces sp. trên môi trường lỏng, lắc 150 vòng/ phút, thời điểm thu sinh khối để cho lượng sinh khối đạt cao nhất là 6 ngày sau khi cấy. 3.3.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng đến sự hình thành và phát triển của nấm Paecilomyces sp. (môi trường rắn) Chủng nấm Paecilomyces sp. đã được nhân giống cấp 1 trên môi trường PDA. Tiến hành thí nghiệm xác định môi trường nhân sinh khối nấm cấp 2 trong chai trên các nguồn cơ chất như trấu, ngô mảnh , lúa và gạo tấm sau 14 ngày. 49 Đồ án tốt nghiệp A B C D Hình 3.7. Hình nấm Paecilomyces sp. được nuôi cấy trên 4 loại môi trường rắn(A: môi trường ngô mảnh, B: môi trường gạo tấm, C: môi trường lúa, D: môi trường cám) Sau 14 ngày, tiến hành lấy sinh khối nấm pha loãng đến nồng độ 109 và cấy trang trên môi trường PDA. Kết quả xác định môi trường tối ưu nhân sinh khối nấm được thể hiện trong bảng 3.9. 50 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3. 9. Số lượng bào tử sau 14 ngày nuôi cấy Số lượng bào tử Mật độ tế bào Nghiệm thức (*1010 bào tử / g) theo logarit Lúa 0,55c 9,74c ± 0,02 Cám trấu 0,21c 9,32d ± 0,05 Gạo tấm 2,34b 10,37b ± 0,06 Ngô mảnh 3,64a 10,55a ± 0,09 CV (%) 22,84 0,60 Ghi chú: lượng cấy giống ban đầu là 9,44x106 bào tử / g cơ chất. Mật độ tế bào trên 4 loại môi trường rắn theo logarit. 11 10.5 10 Mật độ tế bào 9.5 theo logarit 9 8.5 Gạo Bắp Lúa Cám Hình 3.8. Mật độ tế bào sau 14 ngày lên men rắn trên 4 loại môi trường. Kết quả cho thấy rằng, sau 14 ngày nuôi cấy, mật độ bào tử đạt cao nhất khi nuôi cấy trên môi trường ngô mảnh (3,643 x 1010 bào tử / g), tiếp theo là môi trường gạo tấm (2, 343 x 1010 bào tử / g), nuôi cấy cho sinh khối thấp nhất ở môi trường lúa (0,500 x 1010 bào tử / g) và cám t...iống sản xuất chủng nấm Paecilomyces sp. - Trong các loại thuốc BVTV khảo nghiệm, các loại thuộc trừ sâu Sherpa 25EC, Plutel 1,8 EC, Oshin 20WP và Actara 25WG đều có ảnh hưởng nhẹ đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. Trong các loại thuốc trừ nấm, Cup 2,9 SL có ảnh hưởng nhẹ đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp., còn các loại thuốc Carbenzim 50WP, Saizole 5SC và Antracol 70 WP đều có tác động mạnh (cấp độ 4). - Nấm Paecilomyces sp. có khả năng kí sinh tuyến trùng cái Meloidogyne sp. hại cây hồ tiêu với tỷ lệ 82,29 % sau 4 ngày. - Trên đồng ruộng, nấm Paecilomyces sp. có khả năng làm giảm triệu chứng bệnh do tuyến trùng Meloidogyne sp. gây hại trên cây hồ tiêu ở thời điểm 15 ngày sau khi tưới. Kiến nghị - Định danh chủng nấm Paecilomyces sp. để có kết luận chính xác hơn và phù hợp hơn với các nghiên cứu khoa học khác. - Xác định LD50 và LC50 của nấm Paecilomyces sp. trên tuyến trùng, xác định liều lượng sử dụng trong công tác BVTV sao cho hiệu quả và tiết kiệm. - Tiến hành khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo chế phẩm từ nấm Paecilomyces sp. như độ ẩm, các loại khoáng chất, nhiệt độ,... và thời gian bảo quản chế phẩm. - Tiến hành đánh giá khả năng ký sinh tuyến trùng của chế phẩm Paecilomyces sp. ở quy mô lớn hơn. 58 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Lê Thị Mai Châm (2014). Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp. trên cây hồ tiêu. Ngô Thị Thu Hà (2013). Nghiên cứu phân lập nấm Purpureocillium lilacinum để phòng trừ tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp. Nguyễn Hoài Hương (2014). Công nghệ lên men. Đại học Công Nghệ Tp. HCM. Lê Trần Quang Huy (2015). Đánh giá khả năng kí sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại cây trồng của chủng nấm Paecilomyces sp. Lê Hữu Phước (2009). Phân lập và chọn môi trường nhân sinh khối ba loài nấm ký sinh tuyến trùng Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok, Beauveria bassiana (Bals.) Vuill và Paecilomyces spp. trên nhóm rau ăn lá ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Bùi Cách Tuyến – Lê Đình Đôn. Cây hồ tiêu Bệnh hại và biện pháp phòng trừ. Nhà xuất bản nông nghiệp. Trần Thị Tho, Trần Văn Hai, Trịnh Thị Xuân (2014). Khảo sát đặc tính sinh học của các chủng nấm tím Paecilomyces javanicus ký sinh rệp sáp giả tại Đồng Bằng Sông Cửu Long. Phùng Lê Kim Yến (2014). Phân lập nấm Paecilomyces spp. và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được. Tài liệu tiếng anh A. Usman and M.A. Siddiqui (2012). Effect of some fungal strains for the management of rootknot nematode (Meloidogyne incognita) on eggplant (Solanum melongena). Journal of Agricultural Technology 8(1): 213-218. Abhishek Sharma & Satyawati Sharma & Aditya Mittal & Satya Narayan Naik, 2012. Statistical optimization of growth media for Paecilomyces lilacinus 6029 using non-edible oil cakes. 59 Đồ án tốt nghiệp Huma Abbas , Nazir Javed , Sajid Aleem Khan , Muhammad Kamran , Muhammad Atiq, 2016. Exploitation of Nematicidal Potential of Paecilomyces lilacinus against Root Knot Nematode on Eggplant. Juan Morales – Ramos, Guadalupe Rojas, David I. Shapiro-Ilan, 2014. Mass production of benefical organisms. Lee JS, Iung WC, Park SJ, Lee KE, Shin WC, Hong Ex, 2012. Culture conditions and medium components for the production of mycelial biomass and exo-polysaccharides with Paecilomyces japonica in liquid culture. Li Gao, 2014. Optimization of Culture Medium for Sporulation and Biomass Production of a Nematophagous Fungus: Consideration of Nutritional and Environmental Conditions. M. Nars Esfahani and B. Ansari Pour, 2006. The effects of Paecilomyces lilacinus on the Pathogenesis of Meloidogyne Javanica and Tomato plant growth parameters. Marie-Stéphane Tranier, Johan Pognant-Gros, Reynaldo De la Cruz Quiroz, Cristóbal Noé Aguilar González , Thierry Mateille , Sevastianos Roussos, 2014. Commerical biological control agents targeted against plant-parasitic root – knot namatodes. Mark A. Jackson, Micheal R. Macguire, Lawrence A. Lacey and Stephen P. Wraight, 1997. Liquid culture production of desiccation tolerant blastospores of the bioinsecticidal fungus Paecilomyces fumosoroseus Mendoza A. R., R. A. Sikora, và S. Kiewnick ,2007. Effects of Paecilomyces lilacinus protease and chitinase on the eggshell structures and hatching of Meloidogyne javanica juveniles. Mendoza A. R., R. A. Sikora, and S. Kiewnick. 2007. Influence of Paecilomyces lilacinus strain 251 on the biological control of the burrowing nematode Radopholus similisin banana. Nematropica 37:203-213. 60 Đồ án tốt nghiệp Pau, C.G., C.T.S. Leong, S.K. Wong, L. Eng, M. Jiwan, F.R. Kundat, Z.F.B.A. Aziz, O.H. Ahmed and N.M. Majid, 2012. Isolation of Indigenous Strains of Paecilomyces lilacinus with Antagonistic Activity against Meloidogyne incognita Poornima Sharma1 and Rakesh Pandey, 2009. Biological control of root- knot nematode; Meloidogyne incognita in the medicinal plant; Withania somnifera and the effect of biocontrol agents on plant growth. R. P. Esser and N. E. El-Gholl, 1993. Paecilomyces lilacinus, a fungus that parasitizes nematode eggs. S. Prabhu, S. Kumar and S. Subramanian, 2008. Mass production and commercial formulation of Paecilomyces lilacinus. Zhen Yu, You – chi Zhang, Xiang Zhang và Yin Wang, 2015. Conversion of food waste into biofertilizer for the biocontrol of root - knot nematode by Paecilomyces lilacinus. Tài liệu từ internet https://translate.google.com.vn/translate?hl=vi&sl=en&u=https://en.wikipedia.org/ wiki/Purpureocillium&prev=search https://en.wikipedia.org/wiki/Paecilomyces https://en.wikipedia.org/wiki/Purpureocillium https://www.google.com.vn/search?q=N%E1%BA%A5m+Paecilomyces+sp+chuy %E1%BB%83n+th%C3%A0nh+n%E1%BA%A5m+purple&oq=N%E1%BA%A5 m+Paecilomyces+sp+chuy%E1%BB%83n+th%C3%A0nh+n%E1%BA%A5m+pur ple&aqs=chrome..69i57.21784j0j7&sourceid=chrome&ie=UTF- 8#q=n%E1%BA%A5m+Paecilomyces+sp+wiki Incognita-tren-ca-phe-cua-nam-Paecilomyces-Javanicus-8655.html 61 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A. XỬ LÝ THỐNG KÊ A.1. ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC TRỪ BỆNH ĐẾN ĐƯỜNG KÍNH KHUẨN LẠC NẤM PAECILOMYCES SP. Đường kính tản nấm ở thời điểm 3NSC 14:48 Wednesday, January 7, 2004 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NT 5 Actara 25WG Oshin 20WP Plutel Sherpa 25EC ĐC Dependent Variable: KQ Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 2.69733333 0.67433333 56.19 <.0001 Error 10 0.12000000 0.01200000 Corrected Total 14 2.81733333 R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 0.957407 5.608081 0.109545 1.953333 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 4 2.69733333 0.67433333 56.19 <.0001 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for KQ Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.012 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 0.1993 Means with the same letter are not significantly different. 1 Đồ án tốt nghiệp t Grouping Mean N NT A 2.46667 3 ĐC A 2.33333 3 Actara 25WG B 1.96667 3 Oshin 20WP C 1.70000 3 Sherpa 25EC D 1.30000 3 Plutel Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.012 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 0.2835 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NT A 2.46667 3 ĐC A 2.33333 3 Actara 25WG B 1.96667 3 Oshin 20WP B 1.70000 3 Sherpa 25EC C 1.30000 3 Plutel Đường kính tản nấm ở thời điểm 5NSC Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 4.67166667 1.16791667 152.34 <.0001 Error 10 0.07666667 0.00766667 Corrected Total 14 4.74833333 R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 0.983854 3.283481 0.087560 2.666667 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 4 4.67166667 1.16791667 152.34 <.0001 Alpha 0.01 2 Đồ án tốt nghiệp Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.007667 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 0.2266 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NT A 3.18333 3 ĐC A 3.10000 3 Actara 25WG A 3.03333 3 Oshin 20WP B 2.23333 3 Sherpa 25EC C 1.78333 3 Plutel Đường kính khuẩn lạc ở thời điểm 7NSC Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 6.48933333 1.62233333 38.63 <.0001 Error 10 0.42000000 0.04200000 Corrected Total 14 6.90933333 R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 0.939213 6.351416 0.204939 3.226667 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 4 6.48933333 1.62233333 38.63 <.0001 Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.042 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 0.5303 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NT A 3.8000 3 ĐC 3 Đồ án tốt nghiệp A 3.7667 3 Actara 25WG A 3.6333 3 Oshin 20WP B 2.8000 3 Sherpa 25EC C 2.1333 3 Plutel A.2. TỶ LỆ (%) ỨC CHẾ SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM PAECILOMYCES SP. Ở thời điểm 3NSC Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 17413.20603 4353.30151 95.16 <.0001 Error 10 457.45727 45.74573 Corrected Total 14 17870.66329 R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 0.974402 17.59083 6.763559 38.44933 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 4 17413.20603 4353.30151 95.16 <.0001 Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 45.74573 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 17.502 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NT A 100.000 3 ĐC B 46.500 3 Plutel C B 29.480 3 Sherpa 25EC C D 12.167 3 Oshin 20WP D 4.100 3 Actara 25WG Ở thời điểm 5NSC Sum of 4 Đồ án tốt nghiệp Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 18880.65776 4720.16444 603.40 <.0001 Error 10 78.22593 7.82259 Corrected Total 14 18958.88369 R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 0.995874 7.723513 2.796890 36.21267 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 4 18880.65776 4720.16444 603.40 <.0001 Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 7.822593 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 7.2375 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NT A 100.000 3 ĐC B 43.960 3 Plutel C 29.820 3 Sherpa 25EC D 4.667 3 Oshin 20WP D 2.617 3 Actara 25WG Ở thời điểm 7NSC Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 18682.77103 4670.69276 101.59 <.0001 Error 10 459.74507 45.97451 Corrected Total 14 19142.51609 R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 0.975983 19.42414 6.780450 34.90733 5 Đồ án tốt nghiệp Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 4 18682.77103 4670.69276 101.59 <.0001 Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 45.97451 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 17.546 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NT A 100.000 3 ĐC B 40.083 3 Plutel B 25.907 3 Sherpa 25EC C 5.983 3 Oshin 20WP C 2.563 3 Actara 25WG A.3. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LOẠI THUỐC TRỪ NẤM LÊN NẤM PAECILOMYCES SP. Ở thời điểm 3 ngày The ANOVA Procedure Dependent Variable: KQ Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 16.01066667 4.00266667 121.91 <.0001 Error 10 0.32833333 0.03283333 Corrected Total 14 16.33900000 R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 0.979905 21.83129 0.181200 0.830000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 4 16.01066667 4.00266667 121.91 <.0001 anh huong tren MT khang benh 3N 4 6 Đồ án tốt nghiệp 02:59 Saturday, January 17, 2004 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for KQ Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.032833 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 0.4689 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NT A 2.3667 3 ĐC B 1.7833 3 Cup C 0.0000 3 Carbenzi C 0.0000 3 Saizole C 0.0000 3 Antracol Ở thời điểm 5 ngày The ANOVA Procedure Dependent Variable: KQ Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 26.88266667 6.72066667 2122.32 <.0001 Error 10 0.03166667 0.00316667 Corrected Total 14 26.91433333 R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 0.998823 5.325534 0.056273 1.056667 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 4 26.88266667 6.72066667 2122.32 <.0001 The ANOVA Procedure 7 Đồ án tốt nghiệp t Tests (LSD) for KQ Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.003167 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 0.1456 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NT A 3.18333 3 ĐC B 2.10000 3 Cup C 0.00000 3 Carbenzi C 0.00000 3 Saizole C 0.00000 3 Antracol A.4. SỐ LƯỢNG BÀO TỬ NẤM PAECILOMYCES SP. Ở thời điểm 2 ngày Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 45.42430000 15.14143333 18.12 0.0086 Error 4 3.34190000 0.83547500 Corrected Total 7 48.76620000 R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 0.931471 22.37560 0.914043 4.085000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 3 45.42430000 15.14143333 18.12 0.0086 Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 0.835475 Critical Value of t 4.60409 Least Significant Difference 4.2083 8 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NT A 7.2500 2 SDAY1 B A 5.4950 2 SDAY3 B 2.1450 2 CDB B 1.4500 2 CMB Ở thời điểm 4 ngày Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 1.7064142E19 5.6880475E18 54.04 0.0011 Error 4 4.210045E17 1.0525113E17 Corrected Total 7 1.7485147E19 R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 0.975922 20.69197 324424298 1567875000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 3 1.7064142E19 5.6880475E18 54.04 0.0011 Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 1.053E17 Number of Means 2 3 4 Critical Range 1493677775 1531787379 1546129321 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N NT A 3724500000 2 SDAY3 B 2095000000 2 SDAY1 C 257000000 2 CDB C 195000000 2 CMB Ở thời điểm 6 ngày 9 Đồ án tốt nghiệp Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 2.0058538E19 6.6861792E18 46.40 0.0014 Error 4 5.7645E17 1.441125E17 Corrected Total 7 2.0634988E19 R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 0.972064 18.82810 379621522 2016250000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 3 2.0058538E19 6.6861792E18 46.40 0.0014 Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 1.441E17 Critical Value of t 4.60409 Least Significant Difference 1.75E9 t Grouping Mean N NT A 4530000000 2 SDAY3 B 2135000000 2 SDAY1 C B 1040000000 2 CDB C 360000000 2 CMB Ở thời điểm 9 ngày Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 1270.167459 423.389153 317.90 <.0001 Error 4 5.327263 1.331816 Corrected Total 7 1275.494722 R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 0.995823 8.225906 1.154043 14.02938 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 3 1270.167459 423.389153 317.90 <.0001 10 Đồ án tốt nghiệp Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 1.331816 Critical Value of t 4.60409 Least Significant Difference 5.3133 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NT A 33.700 2 SDAY3 B 15.650 2 SDAY1 C 6.455 2 CDB D 0.313 2 CMB Ở thời điểm 12 ngày Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 1.093128E18 3.64376E17 15.83 0.0110 Error 4 9.21E16 2.3025E16 Corrected Total 7 1.185228E18 R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 0.922293 25.28998 151739909 600000000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 3 1.093128E18 3.64376E17 15.83 0.0110 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 2.303E16 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 4.21E8 t Grouping Mean N NT A 1157000000 2 SDAY3 B 711000000 2 SDAY1 11 Đồ án tốt nghiệp C 287000000 2 CDB C 245000000 2 CMB Ở thời điểm 14 ngày Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 2.9682316E17 9.8941053E16 22.22 0.0059 Error 4 1.7809E16 4.45225E15 Corrected Total 7 3.1463216E17 R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 0.943397 23.89015 66725183 279300000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 3 2.9682316E17 9.8941053E16 22.22 0.0059 Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 4.452E15 Number of Means 2 3 4 Critical Range 307208563 315046664 317996408 Duncan Grouping Mean N NT A 549000000 2 SDAY1 B A 373500000 2 SDAY3 B 114500000 2 CDB B 80200000 2 CMB A.5. MẬT ĐỘ BÀO TỬ TRONG CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG RẮN Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 2.3150298E21 7.7167661E20 52.06 <.0001 Error 8 1.1857867E20 1.4822333E19 Corrected Total 11 2.4336085E21 R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 12 Đồ án tốt nghiệp 0.951275 22.84063 3849978355 1.68558E10 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 3 2.3150298E21 7.7167661E20 52.06 <.0001 Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 1.482E19 Critical Value of t 3.35539 Least Significant Difference 105E8 t Grouping Mean N NT A 3.64E10 3 BAP B 2.342E10 3 GAO C 5503333333 3 LUA C 2100000000 3 CAM A.6. MẬT ĐỘ BÀO TỬ TRÊN MÔI TRƯỜNG LỎNG TÍNH THEO LOGARIT 16:55 Tuesday, January 6, 2004 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values MTLONG 4 CDB CMB SDAY1 SDAY3 Ở thời điểm 2 ngày The ANOVA Procedure Dependent Variable: KQ Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 1.08911056 0.36303685 2.83 0.1700 Error 4 0.51223482 0.12805870 Corrected Total 7 1.60134538 13 Đồ án tốt nghiệp R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 0.680122 4.229408 0.357853 8.461065 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F MTLONG 3 1.08911056 0.36303685 2.83 0.1700 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 0.128059 Number of Means 2 3 4 Critical Range 0.994 1.015 1.021 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N MTLONG A 8.8606 2 SDAY1 A 8.7400 2 SDAY3 A 8.3180 2 CDB A 7.9257 2 CMB Ở thời điểm 4 ngày The ANOVA Procedure Dependent Variable: KQ Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 2.07463299 0.69154433 9.76 0.0260 Error 4 0.28354698 0.07088674 Corrected Total 7 2.35817996 R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 0.879760 2.959605 0.266246 8.995986 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F MTLONG 3 2.07463299 0.69154433 9.76 0.0260 Mat do tren MT long 16:55 Tuesday, January 6, 2004 3 14 Đồ án tốt nghiệp The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for KQ Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 0.070887 Number of Means 2 3 4 Critical Range .7392 .7554 .7593 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N MTLONG A 9.6090 2 SDAY3 B A 9.3109 2 SDAY1 B C 8.7888 2 CDB C 8.2753 2 CMB Ở thời điểm 6 ngày The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values MTLONG 4 CDB CMB SDAY1 SDAY3 Number of observations 8 Mat do tren MT long 6N 16:55 Tuesday, January 6, 2004 14 The ANOVA Procedure Dependent Variable: KQ Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 1.32443510 0.44147837 32.39 0.0029 Error 4 0.05452325 0.01363081 Corrected Total 7 1.37895835 R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 15 Đồ án tốt nghiệp 0.960461 1.278488 0.116751 9.131963 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F MTLONG 3 1.32443510 0.44147837 32.39 0.0029 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for KQ Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 0.013631 Number of Means 2 3 4 Critical Range .5375 .5512 .5564 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N MTLONG A 9.6558 2 SDAY3 B A 9.3218 2 SDAY1 B C 8.9954 2 CDB C 8.5548 2 CMB Ở thời điểm 9 ngày The ANOVA Procedure Dependent Variable: KQ Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 2.70089446 0.90029815 4.25 0.0980 Error 4 0.84765622 0.21191406 Corrected Total 7 3.54855068 R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 0.761126 5.187303 0.460341 8.874384 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F MTLONG 3 2.70089446 0.90029815 4.25 0.0980 16 Đồ án tốt nghiệp Mat do tren MT long 9N 16:55 Tuesday, January 6, 2004 23 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for KQ NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 0.211914 Number of Means 2 3 4 Critical Range 1.278 1.306 1.313 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N MTLONG A 9.5275 2 SDAY3 B A 9.1931 2 SDAY1 B A 8.8067 2 CDB B 7.9701 2 CMB Ở thời điểm 12 ngày The ANOVA Procedure Dependent Variable: KQ Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 0.61438049 0.20479350 32.58 0.0029 Error 4 0.02514549 0.00628637 Corrected Total 7 0.63952598 R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 0.960681 0.912709 0.079287 8.686956 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F MTLONG 3 0.61438049 0.20479350 32.58 0.0029 Mat do tren MT long 12N 16:55 Tuesday, January 6, 2004 28 17 Đồ án tốt nghiệp The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for KQ Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 0.006286 Number of Means 2 3 4 Critical Range .3650 .3744 .3779 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N MTLONG A 9.05714 2 SDAY3 A 8.84903 2 SDAY1 B 8.45424 2 CDB B 8.38741 2 CMB Ở thời điểm 14 ngày The ANOVA Procedure Dependent Variable: KQ Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 0.95211943 0.31737314 42.92 0.0017 Error 4 0.02957659 0.00739415 Corrected Total 7 0.98169602 R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 0.969872 1.034209 0.085989 8.314494 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F MTLONG 3 0.95211943 0.31737314 42.92 0.0017 Mat do tren MT long 14N 16:55 Tuesday, January 6, 2004 32 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for KQ 18 Đồ án tốt nghiệp Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 0.007394 Number of Means 2 3 4 Critical Range .3959 .4060 .4098 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N MTLONG A 8.73951 2 SDAY1 A 8.55824 2 SDAY3 B 8.05880 2 CDB B 7.90142 2 CMB A.7. MẬT ĐỘ BÀO TỬ NẤM TRÊN MÔI TRƯỜNG RẮN TÍNH THEO LOGARIT Mat do 16:44 Tuesday, January 6, 2004 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values MT 4 Bap Cam Gao Lua Number of observations 12 Mat do 16:44 Tuesday, January 6, 2004 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: KQ Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 2.91698572 0.97232857 269.93 <.0001 Error 8 0.02881762 0.00360220 Corrected Total 11 2.94580334 R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 19 Đồ án tốt nghiệp 0.990217 0.600442 0.060018 9.995691 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F MT 3 2.91698572 0.97232857 269.93 <.0001 Mat do 16:44 Tuesday, January 6, 2004 4 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for KQ Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 0.003602 Critical Value of t 3.35539 Least Significant Difference 0.1644 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N MT A 10.55529 3 Bap B 10.36684 3 Gao C 9.74043 3 Lua D 9.32021 3 Cam A.8. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỒNG SINH TRƯỞNG CỦA NẤM PAECILOMYCES SP. VÀ NẤM TRICHODERMA SP. Ở thời điểm 3 ngày The SAS System 18:36 Friday, January 16, 2004 5 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values DK 2 DC Tricho Number of observations 6 The SAS System 18:36 Friday, January 16, 2004 6 The ANOVA Procedure Dependent Variable: KQ 20 Đồ án tốt nghiệp Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 1 0.48166667 0.48166667 6.28 0.0663 Error 4 0.30666667 0.07666667 Corrected Total 5 0.78833333 R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 0.610994 5.870406 0.276887 4.716667 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F DK 1 0.48166667 0.48166667 6.28 0.0663 The SAS System 18:36 Friday, January 16, 2004 7 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for KQ Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 0.076667 Number of Means 2 Critical Range .6277 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N DK A 5.0000 3 DC A 4.4333 3 Tricho Ở thời điểm 5 ngày Number of observations 6 The SAS System 18:36 Friday, January 16, 2004 10 The ANOVA Procedure Dependent Variable: KQ Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 1 4.50666667 4.50666667 22.92 0.0087 21 Đồ án tốt nghiệp Error 4 0.78666667 0.19666667 Corrected Total 5 5.29333333 R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 0.851385 7.825962 0.443471 5.666667 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F DK 1 4.50666667 4.50666667 22.92 0.0087 The SAS System 18:36 Friday, January 16, 2004 12 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for KQ Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 0.196667 Number of Means 2 Critical Range 1.667 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N DK A 6.5333 3 DC B 4.8000 3 Tricho Ở thời điểm 7 ngày The ANOVA Procedure Dependent Variable: KQ Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 1 11.20666667 11.20666667 43.66 0.0027 Error 4 1.02666667 0.25666667 Corrected Total 5 12.23333333 R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean 0.916076 7.307060 0.506623 6.933333 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F 22 Đồ án tốt nghiệp DK 1 11.20666667 11.20666667 43.66 0.0027 The SAS System 18:36 Friday, January 16, 2004 16 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for KQ Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 0.256667 Number of Means 2 Critical Range 1.905 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N DK A 8.3000 3 DC B 5.5667 3 Tricho B. XỬ LÝ EXCEL B.1. ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC TRỪ SÂU Tỷ lệ ức chế (%) 3NSC 5NSC 7NSC ĐC 100 100 100 Sherpa 29,17 29,03 30,07 25EC Plutel 37,5 41,93 41,03 Oshin 12,5 0 0 20WP Actara 8,3 3,23 5,13 25WG ĐC 100 100 100 Sherpa 32 32,3 28,21 25EC Plutel 52 43,08 48,72 23 Đồ án tốt nghiệp Oshin 24 4,62 17,95 20WP Actara 4 4,62 2,56 25WG ĐC 100 100 100 Sherpa 27,27 28,13 19,44 25EC Plutel 50 46,87 30,5 Oshin 0 9,38 0 20WP Actara 0 0 0 25WG B.2. ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC TRỪ SÂU Tỷ lệ ức chế (%) 3 NSC 5 NSC 7 NSC ĐC 0 0 0 Carbenzin 50WP 100 100 100 Cup 2,9 SL 43,75 38,46 23,08 Saizole 5SC 100 100 100 Antracol 70WP 100 100 100 ĐC 0 0 0 Carbenzin 50WP 100 100 100 Cup 2,9 SL 20 31,25 20,51 Saizole 5SC 100 100 100 Antracol 70WP 100 100 100 ĐC 0 0 0 Carbenzin 50WP 100 100 100 24 Đồ án tốt nghiệp Cup 2,9 SL 9,09 32,26 16,67 Saizole 5SC 100 100 100 Antracol 70WP 100 100 100 B.3. KHẢ NĂNG ĐỒNG SINH TRƯỞNG CỦA NẤM PAECILOMYCES SP. VÀ TRICHODERMA SP. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. (cm) 3 ngày 5 ngày 7 ngày ĐC Pae 1,60 2,60 2,90 Pae 1,20 1,30 1,80 ĐC Pae 1,70 2,10 3,10 Pae 1,60 1,30 2,40 ĐC Pae 1,50 2,20 2,40 Pae 1,40 1,90 2,10 Đường kính tản nấm Trichoderma sp. (cm) 3 NSC 5 NSC 7 NSC DC 5,10 6,40 8,00 Tricho 4,00 4,10 4,80 DC 4,90 6,70 8,50 Tricho 4,70 5,10 5,90 DC 5,00 6,50 8,40 Tricho 4,60 5,20 6,00 B.4. MẬT ĐỘ BÀO TỬ NẤM PAECILOMYCES SP. TRÊN MÔI TRƯỜNG LỎNG THEO LOGARIT 2 ngày 4 ngày 6 ngày 9 ngày CDB 8,21 8,44 8,86 8,86 25 Đồ án tốt nghiệp CMB 7,43 8,16 8,59 8,62 SDAY1 8,86 9,22 9,24 9,16 SDAY3 8,74 9,56 9,64 9,52 CDB 8,43 9,13 9,13 8,75 CMB 8,42 8,39 8,52 7,32 SDAY1 8,86 9,41 9,40 9,23 SDAY3 8,74 9,58 9,67 9,54 B.5. MẬT ĐỘ BÀO TỬ NẤM PAECILOMYCES SP. TRÊN MÔI TRƯỜNG RẮN Gao 20260000000 Bap 28400000000 Lua 5640000000 Cam 2300000000 Gao 23300000000 Bap 41300000000 Lua 5270000000 Cam 2170000000 Gao 26700000000 Bap 39500000000 Lua 5600000000 Cam 1830000000 B.6. SỐ LƯỢNG TUYẾN TRÙNG CÁI LÂY NHIỄM NẤM PAECILOMYCES SP. Lần 1 Lần 2 Lần 3 1 ngày 2 3 4 3 3 2 3 3 4 2 ngày 5 4 4 6 4 4 3 6 4 26 Đồ án tốt nghiệp 3 ngày 6 5 3 4 3 7 5 7 3 4 ngày 8 6 5 7 8 8 6 5 4 C. HÌNH ẢNH 27 Đồ án tốt nghiệp 28 Đồ án tốt nghiệp 29