Đồ án Phân lập vi khuẩn lactic trong khoang miệng có khả năng ức chế sự tạo màng sinh học của một số lactobacillus spp

hiện đề tài: Nguyễn Tuấn Anh Sinh viên trường: Đại học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh Khoa: Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trường Ngành: Cơng nghệ sinh học Chuyên ngành: Cơng nghệ sinh học Lớp: 13DSH02 MSSV: 1311100148 Đồ án tốt nghiệp này là cơng trình nghiên cứu của bản thân tơi dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Hồi Hương và TS. Nguyễn Hồng Dũng, thực hiện tại Viện Sinh học Nhiệt đới và phịng thí nghiệm lầu 7 trường Đại học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. Những số liệu và kết quả phân tính trong đề tài này hồn tồn trung thực, khơng sao chép từ bất kỳ nguồn tài liệu tham khảo nào khác dưới bất kỳ hình thức nào. Một số nội dung trong đồ án tốt nghiệp cĩ tham khảo và sử dụng dữ liệu trích dẫn được cơng bố cơng khai trên các bài báo khoa học, website, tác phẩm theo danh mục tài liệu tham khảo của đồ án. Nếu cĩ bất cứ sự sao chép và khơng trung thực trong bài báo này, người thực hiện đề tài xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trường và trươc ban giám hiệu trường Đại học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. Ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Tuấn Anh i Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Trong suốt quá trình học tập, rèn luyện và trau dồi kiến thức em đã gặp phải khơng ít lần khĩ khăn nhưng nhờ cĩ sự quan tâm, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của TS. Nguyễn Hồi Hương, cùng những kiến thức và kỹ năng cần thiết Cơ truyền dạy mà em cĩ thể hồn thành được tốt đồ án tốt nghiệp lần này. Từ tận đáy con tim, em xin chân thành cám ơn cơ Hồi Hương. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Tiến sĩ Nguyễn Hồng Dũng đã mở lịng nhận hướng dẫn em thực hiện đề tài tốt nghiệp tại Viện Sinh học Nhiệt đới (VSHND). Đây là một cơ hội cực kỳ quý báu mà thầy đã dành cho em, em xin cám ơn thầy Dũng rất nhiều. Ngồi ra, trên VSHND em cịn nhận khơng ít sự giúp đỡ từ Thạc sĩ Lê Quỳnh Loan . Suốt thời gian làm việc và nghiên cứu tại VSHND, chị là người luơn bên cạnh và nhắc nhở em rất nhiều những điều cần thiết khi thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu. Em xin cám ơn chị Loan. Ngồi ra, con xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến ba mẹ, gia đình, những người đã bên con và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp. Lời cuối cùng, em xin gửi lời chúc tới tồn thể quý thầy quý cơ đang giảng dạy, nghiên cứu tại Viện Sinh học Nhiệt Đới cũng như tại Đại học thành phố Hồ Chí Minh, thật dồi dào sức khỏe, để tiếp tục thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau. TP.HCM, ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Tuấn Anh ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................... i LỜI CÁM ƠN.................................................................................................... ii MỤC LỤC ...................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................... v DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................... vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ..................................................................... vii MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 10 CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN ............................................................................. 14 1.1. SÂU RĂNG ....................................................................................... 14 1.1.1. Bệnh học ........................................................................................ 14 1.1.2. Men răng ........................................................................................ 20 1.2. VI KHUẨN RĂNG MIỆNG ............................................................. 27 1.2.1. Streptococcus spp. .......................................................................... 27 1.2.2. Lactobacillus spp. ........................................................................... 29 1.2.3. Vi khuẩn lactic ............................................................................... 35 1.3. MÀNG SINH HỌC ........................................................................... 36 1.3.1. Sự hình thành ................................................................................. 36 1.3.2. Thành phần ..................................................................................... 38 1.3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng lên sự hình thành màng sinh học .......... 40 1.3.4. Tính chất của màng sinh học ......................................................... 42 1.3.5. Phân bố ........................................................................................... 43 1.3.6. Giả thuyết về cơ chế bảo vệ răng miệng của probiotic và LAB nĩi chung ........................................................................................................ 45 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ............................................................ 47 1.4.1. Ngồi nước ..................................................................................... 47 1.4.2. Trong nước ..................................................................................... 50 CHƯƠNG 2:PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .................... 51 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................... 51 2.2. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................... 51 iii Đồ án tốt nghiệp 2.2.1. Dụng cụ và thiết bị ......................................................................... 51 2.2.2. Giống vi khuẩn ............................................................................... 51 2.2.3. Hĩa chất ......................................................................................... 51 2.2.4. Các phần mềm sử dụng .................................................................. 54 2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................... 55 2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu ........................................................................... 55 2.3.2. Thu mẫu ......................................................................................... 56 2.3.3. Tăng sinh ........................................................................................ 58 2.3.4. Chọn lọc vi khuẩn lactic................................................................. 59 2.3.5. Bảo quản ........................................................................................ 59 2.3.6. Chọn lọc các chủng cĩ khả năng tạo màng sinh học mạnh ........... 59 2.3.7. Định danh các chủng BG ............................................................... 60 2.3.8. Khảo sát khả năng ức chế màng sinh học của NBG ...................... 64 CHƯƠNG 3:KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................... 65 3.1. Tình trạng răng miệng của các đối tượng thu mẫu ............................ 65 3.2. Phân lập vi khuẩn Lactic ................................................................... 65 3.3. Chọn lọc các chủng cĩ khả năng tạo màng sinh học mạnh ............... 67 3.4. Định danh .......................................................................................... 71 3.4.1. Ly trích, thu nhận DNA ................................................................. 71 3.4.2. Nhân sợi DNA bằng phương pháp PCR ........................................ 71 3.4.3. Xác định trình tự DNA – So sánh với ngân hàng dữ liệu gen NCBI. ........................................................................................................ 72 3.5. Khảo sát khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của vi khuẩn NBG đối với L. fermentum .................................................................................... 76 CHƯƠNG 4:KẾT LUẬN ................................................................................. 82 4.1. Kết luận ............................................................................................. 82 4.2. Kiến nghị ........................................................................................... 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 84 PHỤ LỤC BẢNG ............................................................................................... 1 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH ...................................................................................... 7 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT EPS Extracellular polymeric substance DT Decayed teeth FT Filled teeth MT Missing teeth DFMT Decayed teeth, filled teeth, and missing teeths HA Hydroxyapatite LBS Lactobacillus Selection medium LAB Lactic acid batería MRS deMan, Rogosa and Sharpe LBM Lactobacillus biofilm medium OD600 Opical density at 600 nm BG Biofilm group NBG Non-biofilm group v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Lactobacillus spp. phân lập được từ người lớn mắc bệnh sâu răng ................................................................................................................................... 33 Bảng 1.2. Lactobacillus spp. phân lập được từ trẻ em 4-7 tuổi mắc bệnh sâu răng ............................................................................................................................ 34 Bảng 1.3. Tổng hợp các nghiên cứu khảo sát một số chủng probiotic trong việc bảo vệ răng miệng . ................................................................................................... 48 Bảng 2.1. Thành phần mơi trường LBS (g/l) ................................................... 52 Bảng 2.2. Thành phần mơi trường MRS (g/l) .................................................. 52 Bảng 2.3. Thành phần mơi trường tạo màng sinh học của Lactobacillus spp. – Lactobacillus biofilm medium (LBM) ...................................................................... 52 Bảng 2.4. Thành phần mơi trường thử khả năng lên men các nguồn carbohydrates khác nhau (g/l) ................................................................................... 53 Bảng 2.5. Mơ tả các nghiệm thức (NT) trong thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học .............................................................................. 64 Bảng 3.1. Thơng kê khảo sát tình trạng răng miệng của các đối tượng thu mẫu . ................................................................................................................................... 65 Bảng 3.2. Danh sách các chủng vi khuẩn lactic phân lập được và hình thái tế bào của chúng ............................................................................................................ 66 Bảng 3.3. Kết quả định lượng khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn lactic ............................................................................................................... 69 Bảng 3.5. So sánh kết quả thử khả năng lên men các nguồn carbonhydrates khác nhau của 3 chủng 1B, 12R2 và 30B2 với một số lồi Lactobacillus cĩ trong kết quả hiển thị khi so sánh DNA trên ngân hàng gen NCBI. ............................................... 75 Bảng 3.4. So sánh độ tương đồng DNA của 3 chủng L. fermentum 1B, 12R2 và 30B2 (%) ................................................................................................................... 76 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Đốm trắng – dấu hiệu đầu tiên của sự khử khống ở men răng ............... 15 Hình 1.2. Răng bị tổn thương nghiêm trọng do quá trình khử khống .................... 16 Hình 1.3. Giản đồ mơ tả lý thuyết nguyên nhâu gây sâu răng ................................. 17 Hình 1.4. Cấu trúc của răng người ........................................................................... 20 Hình 1.5. Các cấp kết cấu của men răng .................................................................. 21 Hình 1.6. Mơ phỏng cột tinh thể HA ........................................................................ 22 Hình 1.7. Sơ đồ cấu trúc lục giác của HA khi nhìn dọc theo hướng trục C. ............ 22 Hình 1.8. Hình chụp cột tinh thể dưới kính hiển vi điện tử [37] .............................. 23 Hình 1.9. Hình vẽ mơ tả hướng phát triển của các rod ............................................ 24 Hình 1.10. Mặt cắt dọc men răng ............................................................................. 24 Hình 1.11. Mơ tả sự hình thành lỗ khĩa bởi Rod và Interrod .................................. 25 Hình 1.12. Các giai đoạn cột tinh thể HA bị bào mịn bởi acid A: cột tinh thể bình thường; B: giai đoạn đầu sự ăn mịn: C: bị ăn mịn hồn tồn .................................. 26 Hình 1.13. Cơ chế bảo vệ răng của các ion F- .......................................................... 26 Hình 1.14. Một số kiểu hình thái của Lactobacillus spp.. ........................................ 30 Hình 1.15. Tỷ lệ các Lactobacillus spp. phân lập được trong miệng của trẻ bị sâu răng và của người mẹ. ....................................................................................................... 34 Hình 1.16. Sự thay đổi về cấu trúc của màng sinh học khi bước qua giai đoạn phát tán. ............................................................................................................................. 37 Hình 1.17. Các giai đoạn hình thành màng sinh học. ............................................... 38 Hình 1.18. Mơ tả mạng lưới EPS ngoại bào và các lực tương tác giữa các polysaccharides. ........................................................................................................ 39 Hình 1.19. Mạng lưới EPS cùng tế bào vi khuẩn trong màng sinh học, hình thành dưới đáy một chai thủy tinh được chụp dưới kính hiển vi điện tử ............................ 40 Hình 1.20. Vi sinh vật, bùn đất bám dưới đáy tàu thơng qua sự hình thành màng sinh học ............................................................................................................................. 44 vii Đồ án tốt nghiệp Hình 1.21. Vi khuẩn chịu nhiệt hình thành màng sinh học dày khoảng 20 mm trong hồ nước nĩng Mickey, Oregon ................................................................................. 44 Hình 1.22. Cơ chế tác động của Lactobacillus spp. lên những vi khuẩn trong khoang miệng ......................................................................................................................... 47 Hình 2.1. Mơ tả phương pháp thu mẫu nước bọt ..................................................... 57 Hình 2.2. Một số vị trí lấy mẫu mảng bám răng. ..................................................... 58 Hình 2.3. Dùng lực chảy của dịch mơi trường để tác động lên màng sinh học. ...... 60 Hình 2.4. Mơ tả giai đoạn loại bỏ protein và tủa DNA ............................................ 62 Hình 2.5. Chu trình phản ứng PCR 16S rRNA ........................................................ 63 Hình 3.1. Hình thái tế bào của một số chủng trong nhĩm vi khuẩn lactic phân lập được dưới vật kính 100x. .......................................................................................... 67 Hình 3.2. Mật độ màng sinh học hình thành dưới đáy giếng của của 3 chủng 1Ba, 12R2a, 30B2b nhiều hơn so với chủng 21B2i ............................................................ 68 Hình 3.3. Các ống giống khảo sát khả năng hình thành màng sinh học sau 24 giờ ủ: ................................................................................................................................... 70 Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm tách chiết DNA của các chủng vi khuẩn. Nhìn vệt màu kéo dài cho thấy hệ DNA của vi khuẩn đã bị gãy thành rất nhiều đoạn cĩ kích thước khác nhau. ............................................................................................... 71 Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR các chủng vi khuẩn cho 1 vệt DNA đơn và rõ hơn hẳn kết quả điện di sản phẩm tách DNA. ...................................................... 72 Hình 3.6. Cây phát sinh lồi dựa trên phân tích trình tự vùng gen 16S rRNA của chủng 1B, 12R2 và 30B2 với một số các chủng khác trên ngân hàng gen NCBI. ... 73 Hình 3.7. Hình thái tế bào của các chủng 1B, 12R2, 30B2 và L. fermentum YB5 . 74 Hình 3.8. Kết quả khả năng kháng màng sinh học của NBG lên L. fermentum 1B. 78 Hình 3.9. Kết quả khả năng kháng màng sinh học của NBG lên L. fermentum 12R2 ................................................................................................................................... 78 Hình 3.10. Kết quả khả năng kháng màng sinh học của NBG lên L. fermentum 30B2 ................................................................................................................................... 79 viii Đồ án tốt nghiệp Hình 3.11. Kết quả khả năng kháng màng sinh học của NBG lên C.albicans......... 79 Hình 3.12. Kết quả so sánh khả năng tạo màng sinh học của một số chủng NBG và BG ở thí nghiệm chọn lọc vi khuẩn lactic cĩ khả năng tạo màng sinh học. ............. 80 Hình 3.13. Tổng hợp khả năng kháng sự tạo thành màng sinh học của các chủng NBG. ......................................................................................................................... 81 ix Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Bệnh sâu răng là bệnh khá phổ biến, gây hậu quả ở nhiều mức độ về sức khoẻ răng miệng và sức khoẻ chung. Bệnh sâu răng được Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization) xếp vào loại tai họa thứ ba của lồi người sau bệnh ung thư và tim mạch. Tháng 5 năm 2007, tại hội nghị sức khỏe răng miệng thế giới lần thứ 60, các nước thành viên của Tổ chức Y tế Thế giới đã thơng qua nghị quyết, đưa xúc tiến và phịng ngừa bệnh sâu răng vào quy hoạch phịng ngừa và điều trị tổng hợp bệnh mãn tính. Hiện nay, sức khỏe răng miệng là một trong 10 tiêu chuẩn lớn về sức khỏe theo xác định của Tổ chức Y tế Thế giới [1]. Vì vậy, việc chăm sĩc, dự phịng bệnh sâu răng là một vấn đề lớn được chính phủ các nước quan tâm. Mối quan hệ giữa Lactobacillus spp. và sâu răng đã được xác định hơn một thế kỷ qua. Một số nhà khoa học cũng đã khảo sát và nhận thấy rằng mật độ Lactobacillus spp. trong khoan miệng sẽ tăng lên sau giai đoạn đầu của bệnh sâu răng [2]. Sigurjons và cộng sự xác định được tỷ lệ Lactobacillus spp. trong mảng bám răng miệng chiếm tới 62% [3]. Beighton và cộng sự cũng đã tiến hành một cuộc khảo sát răng miệng ở trẻ từ 3 - 4 tuổi, kết quả là tỷ lệ phân lập được Lactobacillus spp. trong trẻ sâu răng là 54%, trong khi ở trẻ khơng sâu răng chỉ chiếm 7% [4]. Ngồi ra Matee và cộng sự cũng đã nhận định trong kết quả nghiên cứu của họ rằng tỷ lệ Lactobacillus spp. trong miệng trẻ sâu răng cao gấp 100 lần trẻ khơng sâu răng [5]. Chủ yếu L. fermentum là lồi chiếm đa số trong miệng của trẻ lẫn người lớn đang bị sâu răng [6] [7]. Mảng bám răng là một màng sinh học hình thành trong miệng, bao gồm nhiều lồi vi sinh vật khác nhau và gắn kết với nhau bởi mạng lưới polysacchrides khơng tan. Vì khả năng tạo màng sinh học là một yếu tố chính quyết định sự hình thành mảng bám răng, nên các nhà khoa học cũng đã nghiên cứu tìm ra các mối liên hệ giữa Lactobacillus spp. và sự hình thành mảng bám răng miệng. Wilcox và cộng sự đã phát hiện ra được 2/4 chủng L. salivarius và 2/3 chủng L. fermentum của họ cĩ khả năng gắn kết màng sinh học với S. salivarius, S. gordonii, S. crista, S. sanguis (một 10 Đồ án tốt nghiệp số lồi trong chi Streptococcus cĩ khả năng gây sâu răng) [8]. Filoche và cộng sự cũng đã phát hiện ra rằng, khả năng hình thành màng sinh học của các Lactobacillus spp. khi nuơi cấy đơn lẻ thì rất thấp, nhưng khi đồng nuơi cấy với một số lồi Actinomyces thì lại tăng gấp 4 – 20 lần [9]. Năm 2001, Tổ chức lương nơng thế giới (FAO) và Tổ chức y tế thế giới (WHO) đã đưa ra định nghĩa cho probiotic: “Probiotic những vi sinh vật cịn sống khi đưa vào cơ thể một lượng vừa đủ sẽ cĩ lợi cho sức khỏe của vật chủ”. Hầu hết các vi khuẩn probiotic thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium, chúng đã được ứng dụng trong gần 1 thế kỷ qua [10]. Trong những năm gần đây, ứng dụng vi khuẩn probiotic vào cơng cuộc chống sâu răng đang rất được chú trọng. Một số các thử nghiệm lâm sàng trên động vật đã khẳng định được khả năng bảo vệ răng miệng của probiotic [11]. Các phương thức bảo vệ răng miệng của probiotic được giả định bởi: khả năng tiết bacteriocin, cạnh tranh chất dinh dưỡng, cạnh tranh diện tích sống. Nhưng bản chất đối kháng thực sự với các vi khuẩn gây hại trong khoan miệng của probiotic vẫn chưa được thấu hiểu. Để gĩp phần tìm ra các chủng vi khuẩn tìềm năng mới cĩ thể ứng dụng để phịng ngừa bệnh sâu răng, đồng thời khảo sát khả năng tạo màng sinh học của vi khuẩn chi Lactobacillus, nhĩm thực hiện đồ án sẽ bước đầu phân lập một số vi khuẩn lactic trong khoang miệng cĩ khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của các Lactobacillus spp. cĩ trong mảng bám răng miệng. 2. Tình hình nghiên cứu Nhiều năm qua, đã cĩ nhiều nghiên cứu in vivo và in vitro nhằm tìm ra tác động của vi khuẩn lactic trong khoang miệng. Các nhà khoa học cũng mong muốn khi vi khuẩn lactic được sử dụng dưới dạng probiotic sẽ cĩ khả năng tồn tại một thời gian nhất định trong nước bọt. Năm 2006, Haukioja và cộng sự đã tìm được một số chủng probiotic cĩ khả năng này [12], khiến cho việc ứng dụng vi khuẩn lactic nĩi chung và probiotic nĩi riêng để bảo vệ răng miệng trở nên khả quan hơn. 11 Đồ án tốt nghiệp Bussher và cộng sự đã xác định được rằng L. acidophilus và L. casei cĩ trong sữa chua đã làm giảm tỷ lệ của các Lactobacillus spp. khác và Streptococcus mutans trong nước bọt và mảng bám răng của các đối tượng nghiên cứu xuống sau một tuần sử dụng [13]. Ahola và cộng sự cũng khảo sát tương tự nhưng trong sản phẩm lên men pho – mát, LGG và Lactobacillus rhamnosus LC 705 cĩ trong pho – mát cĩ thể giảm được tỷ lệ sâu răng ở trẻ nhỏ [14]. Tại Việt Nam, hiện tại chỉ cĩ duy nhất TS. Nguyễn Thị Mai Phương (Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam) là đang tập trung nghiên cứu về vấn đề bảo vệ răng miệng, nhưng chủ yếu là các hợp chất thứ cấp ức chế Streptococcus mutans như: Alpha-mangostin ức chế sự hình thành biofilm của vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans UA159; Ethyl acetate extract from (Rhodomyrtus tomentosa (Aliton) Hassk) leaves inhibits acid production and biofilm formation by Streptcocccus mutans; H2O2 inhibits NADH oxidase activity purified from streptococcus mutans,... [15] [16]. 3. Mục đích nghiên cứu Phân lập các vi khuẩn lactic trong khoang miệng cĩ khả năng ức chế sự hình màng sinh học của Lactobacillus spp. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Khảo sát mức độ sâu răng ở một nhĩm đối tượng - Phân lập vi khuẩn lactic trong khoang miệng - Khảo sát khả năng tạo màng sinh học của các vi khuẩn lactic trong răng miệng - Chọn ra các chủng cĩ khả năng tạo màng sinh học mạnh cĩ khả năng là tác nhân gây sâu răng. Định danh các chủng, chọn ra chi Lactobacillus. - Khảo sát khả năng ức chế màng sinh học của các vi khuẩn lactic lên các Lactobacillus spp. phân lập được 5. Phương pháp nghiên cứu - Thu mẫu răng miệng của 30 đối tượng từ 11 hộ gia đình. Bên cạnh đĩ ghi nhận tình trạng răng miệng của các đối tượng. 12 Đồ án tốt nghiệp - Phân lập vi khuẩn lactic trên mơi trường LBS thơng qua việc quan sát hình thái tế bào, khuẩn lạc, các thử nghiệm sinh lý (khả năng di động, khả năng sinh bào tử) và các thử nghiệm sinh hĩa (catalase). - Khảo sát khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn lactic bằng phương pháp nuơi cấy trên đĩa 96 giếng, từ đĩ phân loại nhĩm vi khuẩn lactic cĩ khả năng tạo màng sinh học mạnh để chọn làm tác nhân gây sâu răng. - Tách chiết DNA của các chủng vi khuẩn lactic nghi ngờ cĩ khả năng gây sâu răng, thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi 27F và 1492R. - Gửi mẫu giải trình tự DNA tại cơng ty Nam Khoa - Dựa vào hình thái kết hợp với kết quả thử nghiệm sinh hĩa trước đĩ để định danh chính xác các chủng này. - Thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của Lactobacillus spp. được thực hiện bằng phương pháp đồng nuơi cấy vi khuẩn lactic và Lactobacillus spp. trong mơi trường LBM trên đĩa giếng 96. Màng sinh học trong các giếng sẽ được nhuộm bằng Crystal violet, và định lượng bằng phương pháp đo mức độ hấp thụ màu tím ở bước sĩng 570 nm. 6. Các kết quả đạt được - Từ 60 mẫu thu răng miệng đã chọn lọc ra được 30 chủng vi khuẩn lactic. - Chọn lọc được 3 chủng lactic cĩ khả năng tạo màng sinh học mạnh. - Kết quả định danh 3 chủng 1B, 12R2, 30B2 đều thuộc lồi L. fermentum. - Chọn ra được 11 chủng vi khuẩn lactic cĩ khả năng ức chế ít nhất 1 trong 4 vi khuẩn gây sâu răng được khảo sát (3 chủng L. fermentum phân lập được và nấm Candida albicans) 7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp Chương 1: Tổng quan Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 13 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. SÂU RĂNG 1.1.1. Bệnh học 1.1.1.1. Định nghĩa Sâu răng là hiện tượng các tổ chức cứng của răng (men, ngà và cement) bị tổn thương, đặc trưng bởi sự khử khống ở men răng, ngà răng tạo thành các lỗ sâu và khơng hồn nguyên được. Cĩ nhiều định nghĩa về bệnh sâu răng, dựa trên những nghiên cứu và nhận xét khác nhau về nguyên nhân cũng như tiến trình của bệnh, sâu răng cĩ thể được định nghĩa như sau: - Bệnh sâu răng là một quá trình động, diễn ra trong mảng bám vi khuẩn dính trên mặt răng, đưa đến mất cân bằng giữa mơ răng với chất dịch xung quanh và theo thời gian, hậu quả là sự mất khống của mơ răng [17]. - Là bệnh nhiễm trùng của mơ răng biểu hiện đặc trưng bởi các giai đoạn mất và tái khống xen kẽ nhau [18]. 1.1.1.2. Lịch sử Sâu răng là một bệnh phổ biến trên tồn thế giới, xảy ra ở mọi lứa tuổi, giới tính, dân tộc. Bệnh đã cĩ từ rất lâu đời, nhưng chỉ thực sự nghiêm trọng khi đồ ngọt trở thành thứ khơng thể thiếu trong chế độ ăn uống của con người. Trong các bệnh thường gặp ở trẻ em, sâu răng đứng thứ hai sau bệnh hen suyễn [19]. Suốt một thể kỷ qua người ta tin rằng mọi quần xã vi sinh vật cĩ trong miệng đều cĩ thể gây sâu răng và việc chữa trị duy nhất đĩ là đánh răng – loại bỏ các mảng bám vi khuẩn. Trong thế chiến thức I, II và chiến tranh Triều Tiên, lý do bị từ chối đi nghĩa vụ quân sự nhiều nhất đĩ là sâu răng. Cuối thế kỷ 19, với dự đốn : nếu một người sống đủ lâu thì sau này chắc chắn sẽ khơng cịn răng, người ta đã phân ra nhánh mới riêng biệt trong nền y học lúc bấy giờ - nha khoa, với mức đầu tư 34 tỷ đơ la (năm 1990). Tới những năm cuối thế kỷ 20 thì bệnh sâu răng cĩ thể kiểm sốt và phịng ngừa. Gần 50% trẻ nhỏ khơng bị sâu răng và tỷ lệ súng răng ở người cao tuổi giảm từ 50% xuống cịn 20% [20]. 14 Đồ án tốt nghiệp Dù khơng nguy hiểm đến tính mạng nhưng sự khĩ chịu khi sâu răng và chi phí cho việc chữa trị/phịng ngừa là khơng hề nhỏ (đứng thứ 3 sau tim mạch và ung thư). 1.1.1.3. Dấu hiệu và triệu chứng Dấu hiệu sớm nhất của bệnh là sự xuất hiện các đốm phấn trắng trên bề mặt răng, đây là vùng men răng đang bị khử khống [21]. Khi các thương tổn tiếp tục diễn ra thì lúc này vùng men sẽ chuyển sang màu nâu và bắt đầu lõm xuống, gọi là lỗ sâu. Ở giai đoạn đốm trắng, men răng vẫn cĩ thể tái khống hĩa bởi các ion Ca2+ cĩ trong nước bọt. Ở giai đoạn hình thành lỗ sâu thì men răng hồn tồn khơng cĩ khả năng tái khống hĩa nhưng quá trình khử khống vẫn cĩ thể bị dừng lại [22]. Hình 1.1. Đốm trắng – dấu hiệu đầu tiên của sự khử khống ở men răng Khi cả men răng và ngà răng đồng thời bị khử khống thì lỗ sâu càng dễ nhìn thấy bằng mắt thường, và khơng cứng chắc như trước. Lúc này tủy răng và mạch máu cĩ thể bị hở ra, chịu tác động bởi lực bên ngồi nhiều hơn, dẫn đến các cảm giác đau nhĩi khi nhai hoặc tiếp xúc với đồ ăn nĩng/lạnh và kể cả ngọt. 15 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2. Giai đoạn tổn thương nghiêm trọng do quá trình khử khống. Răng sâu cịn là một trong những nguyên nhân gây hơi miệng. Trường hợp xấu hơn là nhiễm trùng lan sang vùng mơ mềm (nướu). Biến chứng cĩ thể xảy ra là nghẽn mạch hang xoang, viêm họng Ludwig, đe dọa đến tính mạng của người bệnh. 1.1.1.4. Nguyên nhân Cần cĩ bốn yếu tố chính đồng thời xuất hiện để gây nên triệu chứng sâu răng: men răng hoặc ngà răng, vi khuẩn gây sâu răng, nguồn carbohydrates (thường là sucrose) và thời gian [23]. Mức độ sâu răng thì lại phụ thuộc vào hình dáng của răng, thĩi quen vệ sinh răng miệng, thành phần nước bọt, Sự sâu răng cĩ thể xảy ra ở bất kỳ nơi nào trên răng. Sâu răng là do sự xuất hiện và phát triển của mảng bám (màng sinh học) trên răng. Các vi khuẩn trong mảng bám sinh acid khi cĩ sự hiện diện của các nguồn carbohydrates khác nhau như sucrose, fructose và glucose. 16 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3. Mơ tả lý thuyết nguyên nhâu gây sâu răng 1.1.1.4.1. Vi khuẩn Khoang miệng của người chứa vơ số vi khuẩn, nhưng chỉ một số ít trong đĩ cĩ khả năng gây sâu răng, đáng nĩi đến nhất là Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus và một số lồi trong chi Lactobacillus. Đặc tính để quyết định rằng vi khuẩn cĩ khả năng gây sâu răng hay khơng bao gồm: khả năng tạo nên màng sinh học trên bề mặt răng, sinh ra một lượng acid lactic cao khi lên men đư...hất dinh dưỡng và tín hiệu giữa các tế bào [76]. 38 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.18. Mơ tả mạng lưới EPS ngoại bào và các lực tương tác giữa các polysaccharides. A, mạng lưới chính gồm các thành phần polysaccharides, protein và DNA phân bố giữa các tế bào một cách khơng đồng nhất, tạo nên các vùng cĩ tính chất vật lý khác nhau. B, các lực tương tác hĩa lý và sực dày đặc của polysaccharides quyết định độ ổn định của EPS [77]. EPS sẽ bao phủ tế bào vi khuẩn, nhưng vẫn tạo điều kiện cho các tế bào trao đổi tín hiệu sinh hĩa cũng như trao đổi gen với nhau. EPS chính là chìa khĩa quan trọng cho việc sự hình thành, phát triển của màng sinh học. EPS cịn cĩ chức năng giữ cho các enzyme ngoại bào gần với tế bào, giúp hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn ổn định hơn [78]. 39 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.19. Mạng lưới EPS cùng tế bào vi khuẩn trong màng sinh học, hình thành dưới đáy một chai thủy tinh được chụp dưới kính hiển vi điện tử [79] 1.3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng lên sự hình thành màng sinh học 1.3.3.1. Lơng roi, tiêm mao của vi sinh vật Chức năng chính của lơng roi trong sự hình thành màng sinh học là giúp cho vi sinh vật di chuyển trong mơi trường nước tốt hơn, tạo nên những tương tác ban đầu giữa bề mặt và tế bào. Thí nghiệm của De Flaun, De Weger và cộng sự, đã chứng minh nếu khơng cĩ lơng roi thì khả năng xâm nhiễm của Pseudomonas fluorescens lên rễ cây khoai tây, lúa mì sẽ giảm và làm giảm độ bám dính tế bào của P. aeruginosa và P. fluorescens lên bề mặt polystyrene. Tương tự, nghiên cứu trên các chủng Vibrio cholerae và Escherichia coli đột biến thiếu lơng roi đã cho thấy khơng cĩ sự hình thành màng sinh học như ở các dạng hoang dại của chúng vẫn thực hiện trên bề mặt nhựa polyvinylchloride (PVC) [74]. 1.3.3.2. Sự cảm ứng mật độ tế bào Tín hiệu giữa các tế bào (Quorum sensing) với nhau gần đây đã được chứng minh là đĩng vai trị quan trọng trong sự bám dính cũng như quyết định thời điểm bước vào giai đoạn phân tán. Mặc dù phức tạp nhưng màng sinh học này cĩ tổ chức rất cao. 40 Đồ án tốt nghiệp Davies và cộng sự đã xác định được 2 hệ thống tín hiệu ngoại bào khác nhau ở lồi P. aeruginosa cĩ liên quan đến sự hình thành màng sinh học, đĩ là lasR - lasI và rhlR - rhlI. Ở mật độ tế bào đủ lớn, các tín hiệu này đạt đến nồng độ cần thiết để kích hoạt các gen liên quan đến sự hình thành màng sinh học khác nhau. Họ nhận thấy ác dạng đột biến của chúng khơng thể tạo ra cả 2 tín hiệu thì sẽ hình thành một kiểu tổng hợp màng khác chặt chẽ hơn nhiều so với kiểu gốc [80]. Các tín hiệu tế bào trong màng sinh học của 1 hệ vi khuẩn đa dạng sẽ khác nhiều so với màng sinh học chỉ chứa duy nhất 1 lồi hoặc 1 chi vi khuẩn. Những tín hiệu này bao gồm các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn, các phân tử acyl - homoserine lactone, vật chất di truyền như DNA hay RNA, v.v sẽ làm thay đổi trạng thái của các tế bào vi khuẩn lân cận [81]. 1.3.3.3. Tính chất bề mặt giá thể Đây là yếu tố quyết định đến việc hấp thụ chất hữu cơ và bám dính của tế bào, vì thế các lồi thường chỉ hình thành màng sinh học trên một số bề mặt với tính chất nhất định. Characklis và cộng sự đã ghi nhận khả năng neo bám vi sinh vật sẽ tăng khi chúng tiếp xúc với các mặt giá thể cĩ độ nhám [82]. Tính chất hĩa lý của bề mặt vật liệu cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đến tốc độ và khả năng neo bám của tế bào lên bề mặt. Ngồi ra, một nghiên cứu cho thấy các vi sinh vật neo bám vào các bề mặt kị nước, khơng phân cực (Teflon, nhựa) nhanh hơn và tốt hơn so với bề mặt ưa nước (thủy tinh, kim loại) [83]. Bên cạnh đĩ, diện tích bề mặt là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của màng sinh học. Theo nguyên tắc, diện tích bề mặt càng lớn càng làm tăng khả năng tiếp xúc với tế bào, qua đĩ tạo điều kiện cho việc bám dính lên bề mặt giá thể. Các hệ thống ống dẫn khác với hầu hết các mơi trường tự nhiên (ao hồ, sơng ) là thường cĩ một diện tích bề mặt khá lớn tạo điều kiện cho việc tiếp xúc giữa tế bào vi khuẩn và bề mặt. 41 Đồ án tốt nghiệp 1.3.3.4. Yếu tố mơi trường Các đặc trưng hĩa lý của mơi trường như nhiệt độ, pH, mức độ dinh dưỡng, nồng độ các ion, đĩng một vai trị quan trọng ảnh hưởng đến tốc độ gắn kết của vi sinh vật lên bề mặt. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng khả năng bám dính của vi sinh vật và sự hình thành màng sinh vật cũng chịu ảnh hưởng của nhịp điệu mùa ở các lưu vực nước khác nhau Chủ yếu là do ảnh hưởng của nhiệt độ nước lên khả năng sinh trưởng của vi sinh vật. Fletcher và cộng sự cũng đã thấy rằng nồng độ của một số cation (Na+ , Ca2+, Fe3+) ảnh hưởng đến khả năng bám dính của chủng Pseudomonas fluorescens lên bề mặt thủy tinh, bằng cách làm giảm lực tương tác giữa các tế bào vi khuẩn với bề mặt kính. Nghiên cứu của Cowan và cộng sự cho thấy sự gia tăng nồng độ chất dinh dưỡng tỷ lệ thuận với số lượng gắn kết của các tế bào vi khuẩn lên bề mặt [84]. 1.3.4. Tính chất của màng sinh học Màng sinh học cĩ thể là cả một quần thể vi khuẩn cùng nhau sinh trường và phát triển, quan hệ hợp tác hay cạnh tranh đều cĩ thể diễn ra trong màng, phụ thuộc vào những lồi cĩ mặt trong đĩ [85]. Tính kỵ nước cĩ một phần ảnh hưởng đến khả năng tạo màng sinh học của vi khuẩn. Vì nếu tế bào cĩ tính kỵ nước thì lực tác động của các phân tử ngoại bào hoặc các tế bào khác lên chúng sẽ giảm đáng kể [75]. Một số vi khuẩn khơng cĩ khả năng bám trực tiếp lên một bề mặt nào đĩ, nhưng lại cĩ khả năng liên kết với mạng lưới cơ chất ngoại bào hoặc với tế bào vi khuẩn khác. Những vi khuẩn khơng cĩ khả năng di động sẽ kéo theo hạn chế về khả năng bám dính [75]. Dù cùng lồi nhưng nếu sinh trưởng trong màng sinh học thì vi khuẩn sẽ cĩ một số đặc tính khác biệt rõ ràng hơn so với dạng phù du. Một nghiên cứu đã cho thấy trong một số trường hợp khả năng kháng các chất diệt khuẩn, chất kháng sinh của vi khuẩn trong màng sinh học cao hơn gấp 1000 lần so với dạng phù du [86]. 42 Đồ án tốt nghiệp Mức độ hình thành màng sinh học phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: mật độ vi khuẩn, hàm lượng chất dinh dưỡng, độ bão hịa, pH, thành phần dinh dưỡng trong mơi trường, độ tĩnh và hệ gen của vi khuẩn [87]. Mơi trường nội bào trong cấu trúc màng sinh học cung cấp phương tiện trao đổi dinh dưỡng và chuyển hĩa chất hiệu quả thơng qua các pha dung dịch lớn, tăng cường khả năng hấp thụ dinh dưỡng cũng như loại bỏ những sản phẩm trao đổi chất cĩ nguy cơ độc hại [88]. Các vi khuẩn trong mạng lưới màng sinh học thường bao gồm nhiều quần thể vi khuẩn khác nhau. Chúng là kết quả của mối liên hệ giữa các lồi sinh vật đồng trao đổi chất. Mối liên kết chặt chẽ này tạo điều kiện thuận lợi cho sự trao đổi, loại bỏ và phân phối các sản phẩm trao đổi chất trung gian giữa các lồi. 1.3.5. Phân bố 1.3.5.1. Trong tự nhiên Màng sinh học cĩ ở khắp nơi trong mọi cơ thể sống. Ngồi ra màng sinh học cịn cĩ thể hình thành trong cả những mơi trường cực kỳ khắc nghiệt: dưới dịng chảy mạnh, nhiệt độ cao trong suối nước nĩng, mơi trường độ kiềm/acid cao, các hồ đơng lạnh. Ta cĩ thể dễ dàng tìm thấy màng sinh học cĩ thể trên các tảng đá, sỏi ở những con sơng. Màng sinh học cũng nằm trong chuỗi thức ăn của động vật dưới nước. Màng sinh học hình thành trên hoặc trong thân cây thì lại gĩp phần gây bệnh cho cây, ngoại trừ trường hợp màng sinh học của vi khuẩn Rhizobium (vi khuẩn nốt rễ) ở cây họ đậu. Một số bệnh ở cây trồng do sự hình thành màng sinh học: Citrus Canker (bệnh thối quả ở chi cam chanh); Pierce (nho héo lá); bệnh đốm trắng cà chua, ớt [89]. Màng sinh học cịn được tìm thấy bên trong các đường ống nước, đặc biệt là ống nước thải, gây tắc nghẽn và ăn mịn. Trường hợp xuất hiện trong đường ống dẫn nước lạnh/nĩng thì sẽ giảm khả năng truyền nhiệt đáng kể [90]. Màng sinh học xuất hiện trên vỏ của các con tàu sẽ hỗ trợ cho sự neo bám của các sinh vật khác và bùn đất. Điều này kiến cho vận tốc di chuyển của tàu giảm đi 43 Đồ án tốt nghiệp một phần đáng kể, bên cạnh đĩ cịn phát sinh khoảng chi phí vệ sinh đáy tàu (cạo bỏ sinh vật biển). Hình 1.20. Vi sinh vật, bùn đất bám dưới đáy tàu thơng qua sự hình thành màng sinh học Hình 1.21. Vi khuẩn chịu nhiệt hình thành màng sinh học dày khoảng 20 mm trong hồ nước nĩng Mickey, Oregon [91]. 44 Đồ án tốt nghiệp 1.3.5.2. Trong cơ thể sống 1.3.5.2.1. Đường ruột Trong cơ thể người, màng sinh học được tìm thấy nhiều nhất trong đường ruột, một trong những mơi trường ẩm ướt nhưng ấm áp, cực kỳ thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn. Một nghiên cứu gần đây đã cho rằng hệ miễn dịch trong cơ thể chúng ta đang hỗ trợ cho vi khuẩn trong ruột già tạo mảng bám. Từ phát hiện này người ta đã đưa ra một số giả thuyết về chức năng của ruột thừa. Trong ruột thừa chứa một lượng lớn mảng bám vi khuẩn, vì thế khi ruột già bị tổn thương, hệ vi sinh vật trong ruột đang mất cân bằng thì vi khuẩn trong ruột thừa cĩ thể giúp hồi phục lại hệ vi khuẩn trong đường ruột [92]. 1.3.5.2.2. Khoang miệng Khi xuất hiện trong khoang miệng, màng sinh học được gọi là mảng bám răng. Chúng hình thành ở mọi nơi trong khoang miệng kể cả trên răng giả. Phần nước chiếm khoảng 80 – 90% trong mảng bám, trong khi 70% phần khơ là vi khuẩn, cịn lại là các hợp chất polysaccharides và glycoproteins [93]. Các yếu tố sinh thái trong khoang miệng gĩp phần thúc đẩy sự hình thành của mảng bám răng. Phổ pH bình thường trong miệng là 6 – 7, trong khi màng sinh học được hình thành trong phổ pH 6.7 – 8.3 [94]. Và ngồi vai trị như là một chất đệm, nước bọt cịn chứa một số yếu tố dinh dưỡng như acid amin, protein và glycoprotein. Chế độ ăn uống chỉ đĩng một vai trị nhỏ trong việc cung cấp điều cư trú của vi khuẩn [95]. Sự oxy hĩa-khử của vi khuẩn hiếu khí đã gĩp phần cho lượng oxy trong khoang miệng ở trạng thái bán ổn định, tạo điều kiện cho tồn quần thể vi khuẩn tồn tại. 1.3.6. Giả thuyết về cơ chế bảo vệ răng miệng của probiotic và LAB nĩi chung Vi khuẩn probiotic bảo vệ răng miệng thơng qua việc cạnh tranh chất dinh dưỡng, các yếu tố tăng trưởng và vị trí neo bám với các vi sinh vật gây bệnh khác. Ngồi ra chúng cĩ thể tiết ra các bacteriocin hoặc các hợp chất kháng khuẩn như acid, H2O2. 45 Đồ án tốt nghiệp Để thực hiện được các khả năng trên thì việc đầu tiên là phải đưa vi khuẩn probiotic vào trong khoang miệng, chủ yếu thơng qua việc tiêu thụ các sản phẩm probiotic. Năm 2009, Stamatovavà cộng sự đã chứng minh được rằng các sản phẩm probiotic khi được tiền xử lý với lysozymes sẽ làm tăng khả năng và thời gian neo bám của vi khuẩn probiotic trong răng miệng [96]. Cơ chế neo bám của probiotic dựa vào đặc tính kỵ nước và điện tích trên bề mặt giá thể. Vi khuẩn probiotic cĩ tác động trực tiếp lên các tế bào khác và mơi trường xung quanh chúng. Các cơ chế kháng này được chia như sau: - Tác động trực tiếp lên tế bào vi khuẩn khác - Kích hoạt và điều chỉnh hệ thống miễn dịch của vật chủ [97] Vi sinh vật probiotic cĩ thể cĩ khả năng quy nạp phản ứng miễn dịch khoang miệng (the activation of oral immune inductive sites) thơng qua ảnh hưởng lên lympho bào B. Như khi cho chuột sử dụng L. plantarum ATCC 14917 và L. fermentum YIT 0159, chúng sẽ kích thích sự đồng hĩa P3PH - thymidine trong tế bào lách ở chuột. Ngồi ra, L. plantarum ATCC 14917 và L. fermentum YIT 0159 cũng cĩ thể tăng cường bổ thể và kháng huyết thanh ở thỏ. Điều này chứng tỏ chúng kích thích hoạt động trên lympho bào B của tế bào lách [98]. - Chúng ức chế vi khuẩn khác thơng qua khả năng sinh hydrogen peroxide, bacteriocins, và một số acid hữu cơ, carbon peroxide, diacetyl [99]. 46 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.22. Cơ chế tác động của Lactobacillus spp. lên những vi khuẩn trong khoang miệng [100]. 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 1.4.1. Ngồi nước Nhiều năm qua, đã cĩ nhiều nghiên cứu in vivo và in vitro nhằm tìm ra tác động của vi khuẩn lactic trong khoang miệng. Các nhà khoa học cũng mong muốn khi vi khuẩn lactic được sử dụng dưới dạng probiotic sẽ cĩ khả năng tồn tại một thời gian nhất định trong nước bọt. Năm 2006, Haukioja và cộng sự đã tìm được một số chủng probiotic cĩ khả năng này [12], khiến cho việc ứng dụng vi khuẩn lactic nĩi chung và probiotic nĩi riêng để bảo vệ răng miệng trở nên khả quan hơn. Bussher và cộng sự đã xác định được rằng L. acidophilus và L. casei cĩ trong sữa chua đã làm giảm tỷ lệ của các Lactobacillus spp. khác và Streptococcus mutans trong nước bọt và mảng bám răng của các đối tượng nghiên cứu xuống sau một tuần sử dụng [13]. Ahola và cộng sự cũng khảo sát tương tự nhưng trong sản phẩm lên men pho – mát, LGG và Lactobacillus rhamnosus LC 705 cĩ trong pho – mát cĩ thể giảm được tỷ lệ sâu răng ở trẻ nhỏ [14]. 47 Đồ án tốt nghiệp Hallstrom và cs cũng đã chứng minh được việc sử dụng chủng probiotic L. reuteri ATCC 55730 và ATCC PTA 5289 khơng gĩp phần hình thành mảng bám trong khoang miệng [101]. Hầu hết các nghiên cứu lâm sàng của probiotic trong việc bảo vệ răng miệng đều thơng qua việc định lượng tổng vi khuẩn mutans streptococci (MS) trong khoang miệng. Các thành quả nghiên cứu trong những năm gần đây được tổng hợp ở bảng 1.3. Bảng 1.3. Tổng hợp các nghiên cứu khảo sát một số chủng probiotic trong việc bảo vệ răng miệng (d, ngày; w, tuần; m, tháng;, giảm;  , khơng thay đổi; -, âm tính) [102]. Độ tuổi Tổng Thời Tình – số đối MS gian trạng Tác giả Chủng probiotic tượng trong nghiên sâu nghiên khoang cứu răng cứu miệng Nase và cs, 2001 L. rhamnosus GG 1–6, 7 m   594 Ahola và cs, Lactobacillus spp. 18–35, 3 w  - 2002 74 Nikawa và cs, L. reuteri ATCC 55730 2 w 20, 40  - 2004 Montalto và cs, Lactobacillus spp. 23–37, 45 d  - 2004 35 Caglar và cs, Bifidobacterium 21–24, 2005 animalis ssp. lactis DN- 2 w  - 21 173010 Caglar và cs, L. reuteri ATCC 55730 21–25, 2 w  - 2006 120 Caglar và cs, L. reuteri ATCC 55730 21–24, 3 w  - 2007 80 Caglar và cs, Bifidobacterium lactis 20–24, 10 d  - 2008 BB-12 40 Caglar và cs, L. reuteri ATCC 55730, 2009 L. reuteri ATCC PTA 10 d 20, 20  - 5289 48 Đồ án tốt nghiệp Cildir và cs, Bifidobacterium 12–16, 2009 animalis ssp. lactis DN- 2 w  - 24 173010 Stecksen-Blicks L. rhamnosus LB21 1–5, 21 m   và cs, 2009 174 Lexner và cs, L. rhamnosus LB21 12–15, 2 w  - 2010 20 Singh và cs, L. acidophilus La5 12–14, 2011 Bifidobacterium lactis 10 d  - 40 Bb-12 Jindal và cs, L. rhamnosus, 2011 Bifidobacterium 7–14, 14 d  - longum, Saccharomyces 150 cerevisae Marttinen và cs, L. rhamnosus GG, L. 20–30, 2012 reuteri SD2112, L. 2 w  - 13 reuteri PTA 5289 Chuang và cs, L. paracasei GMNL- 33 20–26, 2 w  - 2011 70 Cildir và cs, L. reuteri ATCC PTA 4–12, 2012 5289, L. reuteri DSM 25 d  - 19 17938 Petersson và cs, L. rhamnosus LB21 58–84, 15 m   2011 160 Taipale và cs, Bifidobacterium 2 tháng 2012 animalis BB-12 tuổi đến 15 m   2 tuổi, 106 Juneja và L. rhamnosus hct 70 12-15, 9 w  - Kakade, 2012 40 Sudhir và cs, L. acidophilus 10-12, 3 w  - 2012 40 Năm 2001, Nase và cs chứng minh được rằng L. rhamnosus GG cĩ thể làm giảm tỷ lệ sâu răng ở trẻ nhỏ. Đến năm 2007, Hatakka và cs cũng đã xác định được việc sử dụng L. rhamnosus GG ở người lớn tuổi sẽ giảm được tỷ lệ nấm Candida albicans cĩ trong nước bọt [102]. 49 Đồ án tốt nghiệp 1.4.2. Trong nước Tại Việt Nam, hiện tại chỉ cĩ duy nhất TS. Nguyễn Thị Mai Phương (Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam) là đang tập trung nghiên cứu về vấn đề bảo vệ răng miệng, nhưng chủ yếu là các hợp chất thứ cấp ức chế Streptococcus mutans như: Alpha-mangostin ức chế sự hình thành biofilm của vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans UA159; Ethyl acetate extract from (Rhodomyrtus tomentosa (Aliton) Hassk) leaves inhibits acid production and biofilm formation by Streptcocccus mutans; H2O2 inhibits NADH oxidase activity purified from streptococcus mutans,... [15] [16]. 50 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian bắt đầu nghiên cứu: ngày 14 tháng 2 năm 2017 đến ngày 20 tháng 7 năm 2017. Địa điểm tiến hành nghiên cứu: Phịng thí nghiệm lầu 7 trường Đại học Cơng nghệ thành phố Hồ Chí Minh (475A Điện Biên Phủ, P.25, Q.Bình Thạnh, TP.HCM); Phịng vi sinh ứng dụng lầu 1, Viện Sinh Học Nhiệt Đới (9/621 xa lộ Hà Nội, phường Linh Trung, quận Thủ Đức, TP.HCM) 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Dụng cụ và thiết bị - Ống nghiệm - Tủ lắc điều nhiệt - Bình tách chiết - Tủ ủ - Erlen 250ml - Máy ly tâm - Đía petri - Máy votex - Đĩa nuơi cấy 96 giếng - Máy Elisa - Cân phân tích - Kính hiển vi quang học - Nồi hấp khử trùng Autoclave - Máy PCR (Sprint Thermo Cycler) - Tủ lạnh, tủ lạnh sâu -80oC - Máy điện di. - Tủ sấy 2.2.2. Giống vi khuẩn Chủng nấm Candida albicans được lấy từ bộ sưu tập giống của phịng vi sinh ứng dụng lầu 1 viện Sinh học Nhiệt đới. 2.2.3. Hĩa chất 2.2.3.1. Mơi trường tăng sinh nuơi cấy 51 Đồ án tốt nghiệp Thành phần mơi trường Lactobacillus Selection (LBS) - dùng phân lập, định lượng Lactobacillus spp. từ mẫu phân và khoang miệng. Bảng 2.1. Thành phần mơi trường LBS (g/l) Tryptone type I 10.0 Tween 80 1.0 Yeast Extract 5.0 CH3COONa.H2O 25.0 KH2PO4 6.0 MgSO4 0.575 (NH4)3C6H5O7 2.0 MnSO4 0.12 Dextrose 20.0 FeSO4 0.034 Glacial acid acetic 1.32 ml Agar 20.0 pH 5.5 ± 0.2 Thành phần mơi trường deMan, Rogosa and Sharpe (MRS) - dùng nuơi cấy mọi lồi trong chi Lactobacillus: Bảng 2.2. Thành phần mơi trường MRS (g/l) Peptone 10.0 Tween 80 1.0 Yeast Extract 5.0 CH3COONa.H2O 5.0 K2HPO4 6.0 MgSO4 0.1 (NH4)3C6H5O7 2.0 MnSO4 0.05 Dextrose 20.0 Agar 20.0 Meat extract 10.0 pH 6.5 ± 0.2 2.2.3.2. Mơi trường thử khả năng kháng sự hình thành màng sinh học Bảng 2.3. Thành phần mơi trường tạo màng sinh học của Lactobacillus spp. – Lactobacillus biofilm medium (LBM) Peptone 5.0 Tween 80 0.5 Yeast Extract 2.5 CH3COONa.H2O 2.5 K2HPO4 3.0 MgSO4 0.05 (NH4)3C6H5O7 1.0 MnSO4 0.025 52 Đồ án tốt nghiệp Dextrose 10.0 CaCl2 0.1 Meat extract 5.0 pH 7.0.2 2.2.3.3. Một số mơi trường khác Bảng 2.4. Thành phần mơi trường thử khả năng lên men các nguồn carbohydrates khác nhau (g/l) Peptone 10.0 Meat extract 1.0 NaCl 5.0 Carbohydrates 10.0 Bromocresol purple (5.2 vàng – 6.8 tím) 0.17 pH 7.0.2 2.2.3.4. Các hĩa chất dùng trong sinh học phân tử - Đệm CTAB: Tris-Cl 0.2M pH 7.5, NaCl 2M, EDTA 0.05M, CTAB 2% - P:C:I (25:24:1): Polyphenol - Chloroform - Isoamyl alcohol - Isopropanol - Ethanol 70% - 6X Loading dye - TAE (Tris-acetate-EDTA) 1X - Agarose - Cặp mồi phản ứng PCR: Tên mồi 27F 1492R µg/OD260 28 33 Khối lượng phân 6149 5785 tử (µg/umole) OD260 10.20 10 Nồng độ (µM) 100 100 53 Đồ án tốt nghiệp AGAGTTTGATCCTGG GGTTACCTTGTTACGA Trình tự (5’ – 3’) CTCAG CTT 2.2.4. Các phần mềm sử dụng - Dựng đồ thị, chuyển đổi đơn vị, thống kê, sắp xếp các kết quả số liệu thơ bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2007. - Dùng phần mềm SAS University Edition để xếp hạng các yếu tố theo phương pháp Ducan, xác định độ tin cậy thí nghiệm, độ lệch chuẩn. - Phần mềm sinh học phân tử MEGA 7.0 dùng để đọc kết quả giải trình tự DNA, dựng cây phát sinh lồi. 54 Đồ án tốt nghiệp 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu Thu mẫu nước bọt, mảng bám răng Cấy trang trên mơi trường LBS Khuẩn lạc đặc trưng: trịn, lồi, mịn; trắng sữa/trong suốt Catalase (-) Hình thái Gram Di động Sinh bào tử Coccus/bacillus (+) (-) (-) Giữ giống trong thạch Vi khuẩn lactic nghiêng, glycerol lạnh đơng Định lượng khả năng tạo màng sinh học Vi khu ẩn lactic Vi khuẩn lactic khơng tạo màng tạo màng Khảo sát khả năng ức chế màng sinh học Đồng nuơi cấy Tách DNA Định lượng khả năng tạo Định lượng màng sinh học màng sinh Phản ứng PCR học. Vi khuẩn lactic cĩ khả năng ức chế sự tạo màng sinh học Giải trình tự DNA Định danh 55 Đồ án tốt nghiệp 2.3.2. Thu mẫu 2.3.2.1. Dụng cụ thu mẫu Tăm bơng vơ trùng, ống nghiệm chứa 2ml nước muối sinh lý, eppendorf vơ trùng, ống nhổ nước bọt. 2.3.2.2. Điều kiện đối tượng lấy mẫu - Khơng sử dụng phương pháp tẩy trắng răng cách đây 6 tháng - Khơng đang điều trị cĩ bệnh liên quan đến răng miệng - Khơng đang dùng thuốc kháng sinh (do bị cảm hoặc đang điều trị các bệnh nhiễm trùng, viêm) - Khơng hoạt động mạnh, đánh răng hay dùng bữa trước giờ lấy mẫu 2 tiếng. 2.3.2.3. Khảo sát tình trạng răng miệng đối tượng thu mẫu Dựa trên tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế thế giới năm 1997, các đối tượng thu mẫu sẽ được kiểm tra răng miệng để thu về 3 chỉ tiêu: số răng sâu (decayed teeth - DT), số răng thiếu (missing teeth - MT), số răng trám (filled teeth –FT). Tổng ba chỉ số trên sẽ chính là chỉ số sâu răng đại diện (decayed, missing, filled teeth index – DMFT) [103]. 2.3.2.4. Thời gian thu mẫu: - Buổi sáng khi các đối tượng thu mẫu vừa mới tỉnh giấc. 2.3.2.5. Phương pháp lấy mẫu nước bọt, mảng bám Mẫu nước bọt: đặt đầu nhọn ống hút vào eppendorf. Dùng lưỡi và má để dồn tất cả nước bọt trong miệng về phía đầu lưỡi. Ngậm mơi chặt vào đầu ống hút rồi từ từ thổi nước bọt vào trong. Lặp lại thao tác 2 – 3 lần, hoặc cho đến khi lượng mẫu đạt 2/3 eppendorf. 56 Đồ án tốt nghiệp Hình 2.1. Mơ tả phương pháp thu mẫu nước bọt 1, ống hút; 2, eppendorf vơ trùng Mẫu mảng bám: dùng bơng tăm chà phần chân răng và mặt nhai (hàm dưới và hàm trên). Cho đầu tăm bơng lấy mẫu ngâm vào nước muối sinh lý đựng trong ống nghiệm. Giữ đứng ống nghiệm và đưa về phịng thí nghiệm, bảo quản lạnh ở 10oC đợi đến khi xét nghiệm. 57 Đồ án tốt nghiệp Hình 2.2. Một số vị trí lấy mẫu mảng bám răng. 2.3.3. Tăng sinh 2.3.3.1. Cấy trang mẫu Vortex các mẫu trong 30s rồi pha lỗng bằng nước muối sinh lý ra nồng độ 10- 2 . Đối với các mẫu nhìn bằng mắt thường thấy khơng đục thì khơng cần pha lỗng. Cấy trang các nồng độ pha lỗng và cả mẫu chưa pha lỗng lên đĩa thạch mơi trường chọn lọc LBS. Sau khi ủ các đĩa thạch LBS ở 37oC trong 48h. Chọn 1 - 2 khuẩn lạc đặc trưng, cĩ ít nhất một đặc điểm khác nhau về kích thước hoặc màu sắc. Khuẩn lạc đặc trưng của Lactobacillus spp. trịn lồi, mịn, lấp lánh, màu trắng đục [50]. Tiến hành cấy ria khuẩn lạc đã chọn ra mơi trường thạch MRS và ủ ở 37oC trong 24h. 58 Đồ án tốt nghiệp 2.3.4. Chọn lọc vi khuẩn lactic Tiến hành xác định hình thái tế bào, nhuộm Gram, thử catalase, khả năng di động, khả năng sinh bào tử. Chọn ra những chủng cầu/trực khuẩn, Gram dương, catalase âm tính, khơng cĩ khả năng di động và khơng sinh bào tử [50]. 2.3.5. Bảo quản Giống thạch nghiêng: Cấy ria giống từ đĩa thạch sang 5 ống giống thạch nghiêng MRS. Ủ ở 37oC trong 24h. Khi thấy đường sinh khối mọc đều dày đặc thì bảo quản ở 10oC để sử dụng cho các khảo sát sau. Thời gian bảo quản 1 – 2 tháng. Giống lạnh đơng: hút 500 µl dịch nuơi cấy 24h (mơi trường MRS) của các chủng vào trong eppendorf 1.5ml vơ trùng. Tiếp tục cho vào 500 µl glycerol 40% (v/v). Votex trong 5 giây. Bảo quản ở -80oC. Thời gian bảo quản 1 – 2 năm. 2.3.6. Chọn lọc các chủng cĩ khả năng tạo màng sinh học mạnh Tăng sinh các chủng vi khuẩn lactic đã được sàng lọc sơ bộ trong mơi trường o lỏng MRS ở 37 C trong 24h. Điều chỉnh OD600 của dịch tăng sinh các chủng về gần bằng 0.8. Cấy 5% giống vào ống nghiệm MRS lỏng. Để định lượng màng sinh học tạo thành, xác định màng sinh học hình thành trong đĩa 96 giếng (Biofilm Quantification in 96-Well Microtitre Plate) đã được thực hiện. Từ mỗi ống nghiệm chứa 5% giống trên, hút ra 200 µl dịch bơm vào 3 giếng nuơi cấy trên đĩa 96 (tương ứng với 3 lần lặp lại). Sau khi ủ đĩa 96 ở 37oC trong 24h, lật ngược đĩa giếng và giũ mạnh để loại bỏ dịch nuơi cấy. Tiến hành rửa trơi các tế bào phù du bằng cách ngâm ngập đĩa 96 trong nước và giũ mạnh nước ra ngồi, thao rửa lặp lại 2 lần. Mang các đĩa 96 sấy ở 80oC trong 15 phút để cố định màng sinh học. Nhuộm màng sinh học hình thành trong giếng bằng 200 µl dung dịch Crystal violet (CV) 0.1% trong 15 phút. Nhẹ nhàng loại bỏ thuốc nhuộm bằng cách ngâm ngập đĩa 96 trong nước và lấy khăn thấm hút nước trong giếng ra. Cho các đĩa 96 vào tủ sấy 40oC trong 20 – 30 phút để nước trong giếng bốc hơi hồn tồn. Tiếp tục, cho vào các giếng 220 µl dung dịch acid acetic 33% để hịa tan màu tím của CV, lắc đĩa 59 Đồ án tốt nghiệp với tốc độ 80 rpm ở nhiệt độ phịng trong 15 phút. Chuyển dịch acid acetic này sang một đĩa 96 mới và mang đi đo OD570. Dùng phương pháp trắc nghiệm phân hạng Ducan để chọn ra những chủng cĩ khả năng tạo màng sinh học mạnh nhất. Khuẩn tạo màng sinh học mạnh sẽ được phân vào biofilm group (BG). Những chủng cịn lại sẽ được phân vào nhĩm non-biofilm group (NBG). Các ống giống cũng sẽ được ủ nghiêng 30o để tăng vùng hình thành màng sinh học. Sau mốc thời gian ủ thì tiến hành đảo 2 - 3 lần, kế đĩ quan sát đánh giá độ bền của màng sinh học bám trên thành ống để khẳng định khả năng tạo màng. Hình 2.3. Dùng lực chảy của dịch mơi trường để tác động lên màng sinh học. 2.3.7. Định danh các chủng BG 2.3.7.1. Tách chiết DNA 2.3.7.1.1. Phá màng tế bào vi khuẩn Hút dịch tăng sinh của các chủng vào từng ống eppendorf riêng lẻ và ly tâm với tốc độ 10.000 rpm trong 15 phút. Sau khi đổ bỏ dịch nổi, tiếp tục hút dịch tăng sinh 60 Đồ án tốt nghiệp cịn lại vào ống eppendorf cũ và ly tâm. Lặp thao tác này cho đến khi hết 10ml dịch tăng sinh hoặc khối lượng tế bào thu được trong eppendorf khoảng 0.2 gram. Sau khi lượng tế bào đạt yêu cầu thì cho vào eppendorf 1000 µl dung dịch CTAB, lắc mạnh hoặc vortex để đánh tan khối tế bào dưới đáy eppendorf tạo dạng huyền phù. Sau khi ủ các ống eppendorf ở bể điều nhiệt 60oC trong 1 giờ, thì tiến hành ly tâm với tốc độ 13.000 rpm trong 15 phút. Nhẹ nhàng hút 800 µl dịch nổi sang một ống eppendorf mới. 2.3.7.1.2. Loại bỏ protein Bổ sung 800 µl dung dịch Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol – 25:24:1 v/v (P:C:I) vào dịch nổi trong eppendorf lúc nãy. Vortex 5s và để ổn định trong ngăn lạnh đơng của tủ lạnh trong 2 phút. Kế đĩ ly tâm lạnh 4oC với tốc độ 14.000 rpm trong 10 phút. Sau khi ly tâm, hỗn hợp sẽ tách thành 3 lớp, cẩn thận hút dịch nổi trên cùng cho vào eppendorf mới, tránh hút phải màng liên pha protein. Lưu ý ghi nhận thể tích dịch nổi hút được của từng mẫu 2.3.7.1.3. Tủa DNA Bổ sung vào dịch nổi mới hút dung dịch Isopropanol với tỷ lệ 1:1 (v/v). Ủ mẫu ở -80oC trong 30 phút. Ly tâm lạnh mẫu ở 4oC với tốc độ 14.000 rpm trong 15 phút., bỏ dịch thu tủa màu trắng đục (tủa DNA). Rửa tủa DNA bằng cách bổ sung vào 1ml dung dịch ethanol 70% , ly tâm lạnh mẫu ở 4oC với tốc độ 14.000 rpm trong 15 phút. Sau khi ly tâm, cho các eppendorf vào tủ sấy để bay hơi hồn tồn nước và ethanol. Cuối cùng bổ sung khoảng 50 µl nước sinh học phân tử vào tủa DNA, bảo quản mẫu ở nhiệt độ 10oC. Điện di mẫu để kiểm tra sự cĩ mặt của DNA. 61 Đồ án tốt nghiệp Hình 2.4. Mơ tả giai đoạn loại bỏ protein và tủa DNA 2.3.7.2. Khuếch đại DNA bằng phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) Cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR là 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3') và 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'), cặp mồi phổ rộng đặc trưng cho vi khuẩn. Thành phần phản ứng PCR 16S rRNA gồm cĩ: 1 µl 27F và 1 µl 1492R (10 pmol/µl), 12.5 µl nước sinh học phân tử, 9.5 µl master mix (Bioline, Anh) và 1 µl mẫu DNA. Tổng thể tích phản ứng là 25 µl. Thơng số của chu trình phản ứng PCR 16S rRNA được thể hiện như trong hình 2.5. 62 Đồ án tốt nghiệp Hình 2.5. Chu trình phản ứng PCR 16S rRNA 2.3.7.3. Điện di kiểm tra sản phẩm ly trích DNA, sản phẩm PCR trên gel 1% agarose 1 gram bột agarose hịa vào 100ml dung dịch đệm Tris-acetate-EDTA (TAE), gia nhiệt để agarose tan hồn tồn. Sau khi nhiệt độ gel xuống cịn 50-55oC thì tiến hành đổ gel và lắp lược 8 giếng vào khuơn điện di. Khi miếng gel đặc lại hồn tồn thì cho vào buồng điện di chứa đệm TAE sao cho dung dịch cao hơn mặt gel 3 - 5 mm. Tiến hành trộn sản phẩm ly trích DNA/PCR vào dịch Loading dye (6X) theo tỷ lệ 5 : 1 (v/v, µl). Nạp hỗn hợp vào trong các giếng. Tiến hành điện đi mẫu với điện thế 90 V trong khoảng 20 - 30 phút. Sau khi điện di, miếng gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide trong 15 phút, rửa lại bằng nước trong 2 phút. Cuối cùng quan sát vệt DNA xuất hiện trên gel dưới ánh sáng UV. 2.3.7.4. Giải trình tự DNA và định danh Mẫu sản phẩm PCR kèm theo mồi xuơi 27F được gửi đến cơng ty Nam Khoa Biotek để thực hiện giải trình tự một chiều. Kết quả gửi về từ cơng ty sẽ được đọc bằng phần mềm MEGA 7.0 ( Chọn vùng trình tự ổn định và so sánh với ngân hàng BLAST của NCBI 63 Đồ án tốt nghiệp (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) để tìm ra các chủng tương đồng. Kết quả chấp nhận khi mức tương đồng trình tự đạt trên 98%. Dựa vào cây phát sinh lồi kết hợp với hình thái, khả năng sinh hĩa của các chủng để định danh ở mức cấp lồi. 2.3.8. Khảo sát khả năng ức chế màng sinh học của NBG Dịch tăng sinh của cả BG và NBG sau 24h sẽ được đưa về cùng mật độ thơng qua việc điều chỉnh thơng số OD600 gần bằng 0.8. Thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của Lactobacillus spp. được thực hiện bằng phương pháp đồng nuơi cấy trong mơi trường LBM trên đĩa giếng 96 (như mơ tả ở mục 2.3.6.). Cứ mỗi chủng NBG sẽ được thử nghiệm đối kháng với 1 chủng BG với 2 tỷ lệ giống 1BG : 1NBG và 1BG : 2NBG. Mơ tả thí nghiệm được trình bày như bảng ...xác định là Lactobacillus fermentum 1B, L. fermentum 12R2 và L. fermentum 30B2. Tỷ lệ L. fermentum phân lập được trong thí nghiệm này khơng thể phản ánh được tỷ lệ đối tượng cĩ L. fermentum trong khoang miệng. Vì ở quá trình phân lập vi khuẩn lactic, nhĩm thực hiện đồ án khơng phân lập ra hết tồn bộ khuẩn lạc trên mơi trường chọn lọc. Hai mươi bảy chủng vi khuẩn lactic cịn lại xếp vào nhĩm NBG và được khảo sát khả năng ức chế tạo màng sinh học của 3 chủng thuộc nhĩm BG và nấm Candida albicans (một đối tượng gây bệnh khoang miệng cũng cĩ khả năng tạo màng sinh học). Từ đĩ, 10 chủng được tuyển chọn cĩ khả năng ức chế màng sinh học của 4 chủng chỉ thị lên đến 50%. Tuy nhiên khơng cĩ chủng NBG nào đồng thời kháng cả 4 chủng chỉ thị. Các trường hợp kháng được 3 chủng BG gồm: 16B kháng 3 chủng L. fermentum 1B, L. fermentum 12R2, L. fermentum 30B2 ở tỷ lệ 1:1; 21R2, 21B2, 23B2 kháng L. fermentum 12R2, L. fermentum 30B2, Candida albicans ở tỷ lệ 1:2. 82 Đồ án tốt nghiệp Rõ ràng, Lactobacillus spp. đĩng vai trị quan trọng trong hệ sinh thái trong khoang miệng dù là tích cực hay tiêu cực. Kết quả này hứa hẹn cĩ thể sử dụng những chủng vi khuẩn lên men lactic tích cực ức chế sự tạo màng sinh học của các Lactobacillus spp. gây sâu răng. 4.2. Kiến nghị Cần khảo sát khả năng ứng dụng của 10 chủng vi khuẩn lactic này trong việc tạo dịng sản phẩm probiotic hoặc prebiotic ngăn chặn tốc độ sâu răng ở những người đã và đang bị sâu răng. Mở rộng phạm vi khảo sát sang các hợp chất thứ cấp ở thực vật hoặc vi sinh vật cĩ khả năng ức chế màng sinh học của vi khuẩn. Nghiên cứu rõ hơn về cơ chế kháng màng sinh học của các vi khuẩn lactic. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành màng sinh học ở vi khuẩn nhằm đưa ra mơi trường tạo màng tối ưu nhất, phục vụ cho các thí nghiệm thử khả năng kháng màng sau này. 83 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] G. o. s. Australia, South Australia’s oral health plan, 2010, pp. 1-26.. [2] G. R. P. A. Van Houte J, "Ecology of human oral lactobacilli.," in Infect Immun. , 1972, p. 6(5):723–729. [3] M. M. H. W. Sigurjons H, "Cariogenic bacteria in a longitudinal study of approximal caries.," in Caries Res, 1995, p. 29(1):42–45. [4] B. S. S. L. B. J. e. a. Beighton D, "A multi-country comparison of caries-associated microflora in de-mographically diverse children.," in Community Dent Health, 2004, p. 21(1):96–101. [5] M. F. M. S. V. P. H. W. Matee MI, "Mutans streptococci and lactobacilli in breast-fed children with rampant caries," in Caries Res, 1992, p. 26(3):183–187. [6] D. G. L. f. t. d. a. s. i. c. Nancy J, "Lactobacilli from the dentin and saliva in children," in J Clin Pediat Dent. , 1992, p. 16(2):107–111. [7] O. V. G. B. Schüpbach P, "Human root caries microbiota of a limited number of root caries lesions.," in Caries Res, 1996, p. 30(1):52–64. [8] P. M. H. D. L. C. K. K. Willcox MD, "Coaggregation of oral lactobacilli with streptococci from the oral cavity.," in Oral Microbiol Immunol, 1993, p. 8(5):319– 321. [9] A. S. S. C. Filoche SK, "Biofilm growth of Lactobacillus species is promoted by Actinomyces species and Streptococcus mutans.," in Oral Microbiol Immunol, 2004, p. 19(5):322–326. [10] J. D. E. S.-C. M. a. R. M. Behnsen, "Probiotics: properties, examples, and specific applications.," in Cold Spring Harb Perspect Med, 2013. [11] S. a. K. M. Twetman, "Probiotics for caries prevention and control.," in Adv Dent Res, 2012, p. 24: 98–102. [12] A. L. V. &. T. J. HAUKIOJA, " Probiotic bacteria affect the composition of salivary pellicle and streptococcal adhesion in vitro," Oral Microbiol Immunol, pp. 23, 336- 43. , 2008. 84 Đồ án tốt nghiệp [13] M. A. v. d. M. H. Busscher HJ, "In vitro adhesion to enamel and in vivo colonization of tooth surfaces by lactobacilli from a bio-yoghurt.," in Caries Res., 1999, p. 33(5):403–404. [14] Y.-K. H. S. T. e. a. Ahola AJ, "Short-term con-sumption of probiotic-containing cheese and its effect on dental caries risk factors Arch Oral," in Biol, 2002, p. 47(11):799–804. [15] V. H. B. P. T. L. H. H. P. H. T. T. N. Nguyễn Thị Mai Phương, "ALPHA- MANGOSTIN ỨC CHẾ SỰ HÌNH THÀNH BIOFILM CỦA VI KHUẨN GÂY SÂU RĂNG STREPTOCOCCUS MUTANS UA159," in TẠP CHÍ SINH HỌC , 2013, pp. 35(3se): 100-105. [16] I. o. B. (IBT), "Vietnam Academy of Science and Technology (VAST)," Institute of Biotechnology (IBT), 11 Monday April 2016 . [Online]. Available: https://www.ibt.ac.vn/en/index.php/19lab-members/1527-dr-nguyen-thi-mai- phuong. [Accessed 30 Wednesday December 2015 ]. [17] F. O. Thylstrup A, "Clinical appearance of dental fluorosis in permanent teeth in relation to histologic changes.," Community Dent Oral Epidemiol, 1978 . [18] N. W. J. J. M. H. R. A. D. W. L. M. Silverstone, in Dental caries, Aetiology, Pathology and Prevention. 1st ed. , London, Macmillan Pres, 1981, p. 26–27. [19] P. J. Rees J, ABC of asthma. 3 rd ed, London: BMJ Publishing Group, 1995. [20] History of Dentistry: Ancient Origins, American Dental Association website, January 9, 2007. [21] R. S. King, "An incipient carious lesion is the initial stage of structural damage to the enamel, usually caused by a bacterial infection that produces tooth-dissolving acid.," A Closer Look at Teeth May Mean More Fillings, 28 November 2011. [22] C. Johnson, Biology of the Human Dentition, 2007. [23] S. J. Southam JC, "2. Dental Caries," in Oral pathology (2nd ed.), Oxford Univ. Press, 1993. [24] H. JM, "The microbiology of dental caries," in Dent Update, May 1982, pp. 199–200, 202–4, 206–8. [25] J. Douglass, Y. Li and N. Tinanoff, "Association of mutans streptococci between caregivers and their children.," in Pediatric Dentistry, Sep–Oct 2008, p. 375–87. 85 Đồ án tốt nghiệp [26] D. C, " What is the critical pH and why does a tooth dissolve in acid?," in J Can Dent Assoc, December 2003, p. 69 (11): 722–4. [27] M. JR, "Demineralization and remineralization of root surface caries," in Gerodontology, 1986, p. 5 (1): 25–31. [28] R. M. D. L. K. I. Mast P, "Understanding MIH: definition, epidemiology, differential diagnosis and new treatment guidelines," Eur J Paediatr Dent (Review), p. 14 (3): 204–8, Sep 2013. [29] Z. M. A. A. L. H. Rashid M, "Oral manifestations of celiac disease: a clinical guide for dentists," in J Can Dent Assoc, 2011, p. 77: b39. [30] C. G. G. F. G. P. Giuca MR, "Oral signs in the diagnosis of celiac disease: review of the literature," in Minerva Stomatol (Review), 2010, p. 59 (1–2): 33–43. [31] B. D. D. C. A. J. B. Neville, in Oral & Maxillofacial Pathology 2nd edition, 2002, p. 347. [32] D. A, J. Jeevarathan, M. Muthu, R. Prabhu V and Chamundeswari, "Effect of Fluoride Varnish on Streptococcus mutans Count in Saliva of Caries Free Children Using Dentocult SM Strip Mutans Test: A Randomized Controlled Triple Blind Study," in International Journal of Clinical Pediatric Dentistry, 2008-01-01, p. 1 (1): 1–9. [33] R. Le Geros, "Calcium Phosphates in Oral Biology and Medicine," Karger, San Francisco , California ., 1991. [34] M. Y. R. &. P. A. Kay, "Crystal structure of hydroxyapatite," in Nature , 1964, p. 1050–1052. [35] K. &. Y. R. Sudarsanan, "Significant precision in crystal structural details: holly springs hydroxyapatite.," in Acta Cryst, 1969, p. 1534–1543. [36] J. C. M. &. C. K. D. Hughes, "Structural variations in natural F, OH, and Cl apatites.," in Am. Mineral, 1989, p. 870–876. [37] Y. L. K. T. A. O. E. F. K. K. S. Hayakawa, "Preparation of Nanometer-scale Rod Array of Hydroxyapatite Crystal," in Acta Biomaterialia, 2009, pp. 2152-2160. [38] L. W. A. Z. Valery V. Tuchin, "Tissue Anisotropy," in Optical Polarization in Biomedical Applications, 206, pp. 14-15. [39] H. Warshawsky, "The teeth," in Cell and Tissue Biology: A Textbook of Histology (L. Weiss) 6th edn, 1988, p. 595–640. 86 Đồ án tốt nghiệp [40] A. P. P. Santos, B. H. Oliveira and P. Nadanovsky, "Effects of low and standard fluoride toothpastes on caries and fluorosis: systematic review and meta-analysis," in Caries Research, 2013-01-01, p. 47 (5): 382–390. [41] B. J. P. L. N. S. I. O. a. F. E. D. Jorn A. Aas, "Defining the Normal Bacterial Flora of the Oral Cavity," J Clin Microbiol, p. 43(11): 5721–5732., Nov 2005 . [42] J. M. J. A. B. a. A. K. Albandar, "Destructive periodontal disease in adults 30 years of age and older in the United States 1988-1994," J. Periodontol, pp. 70:13-29, 1999. [43] L. Sherwood, J. Willey and C. Woolverton, in Prescott's Microbiology (9th ed.), New York, McGraw Hill., 2013, p. 713–721. [44] V. L. Sutter, "Anaerobes as normal oral flora," in Reviews of infectious diseases, 1984, p. 6 Suppl 1: S62–S66. [45] M. A. G. E. Cui L, " The human mycobiome in health and disease," in Genome Med, July 2013, p. 5 (7): 63. [46] R. B. L. R.J, "Dental plaque formation.," in Microbes Infect., 2000, p. 2:1599–1607. [47] F. R., "What happened to the streptococci: overview of taxonomic and nomenclature changes.," in Clin Microbiol Rev., 2002, p. 15:613–630. [48] R. R.R., " How has genomics altered our view of caries microbiology?," in Caries Res. , 2008, p. 42:319–327. [49] H. H. M. A. Y. X. A. S. Z. W. G. C. J. I. C. J. K. T. e. a. Z, "Expanding the biotechnology potential of lactobacilli through comparative genomics," Nat Communications. In press, 2014. [50] P. G. G. J. D. K. N. L. W. R. F. S. K.-H. W. W. (. Hammes W.P. and Hertel C. Editors: Vos, "Lactobacillus," in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Volume 3: The Firmicutes, 2009, pp. 465 - 511. [51] V. N. C. R. O. C. D. M. T. A. H. O. J. I. Holgerson PL, "Oral microbial profile discriminates breast-fed from formula-fed infants," J Pediatr Gastroenterol Nutr, p. 56(2):127–136, 2013. [52] G. H. J. G. Carlsson J, "Lactobacilli and streptococci in the mouth of children," Caries Res, p. 9(5):333–339, 1975. [53] B. S. T. A. R. G. B. D. Marchant S, "The predominant microflora of nursing caries lesions," Caries Res, p. 35(6):397–406, 2001. 87 Đồ án tốt nghiệp [54] P. P. K. P. Foster JS, "Effects of antimicrobial agents on oral biofilms in a saliva- conditioned flowcell," Biofilms, p. 5–12., 2004. [55] H. J. X. J. W. Y. L. K. Z. K. G. Q. L. X. Z. Y. C. L. e. a. Xu X, "Oral cavity contains distinct niches with dynamic microbial communities," Environ Microbiol, p. 17(3):699–710, 2015. [56] H. S. M. P. L. K. W. L. G. D. H. C. I. J. Segata N, "Composition of the adult digestive tract bacterial microbiome based on seven mouth surfaces, tonsils, throat and stool samples," Genome Biol, p. 13(6):R42, 2012. [57] C. S. P. S. Y. L. S. A. P.W. Caufield, "Oral Lactobacilli and Dental Caries," A Model for Niche Adaptation in Humans, p. 110S–118S, Sep 2015. [58] H. G. Z. E. S. H. R. J. Martin R, "Diversity of the Lactobacillus group in breast milk and vagina of healthy women and potential role in the colonization of the infant gut.," J Appl Microbiol., p. 103(6):2638–2644, 2007. [59] W. J. &. S. S. A. Loesche, "The predominant cultivable flora of carious plaque and carious dentine," Caries Res 7, p. 201–216, 1973. [60] J. Van Houte, "Bacterial specificity in the etiology of dental caries," Int Dent J, pp. 30, 305–326., 1980. [61] S. J. B. S. C. B. F. S. &. S. R. Botha, "Lactobacillus species associated with active caries lesions.," J Dent Assoc Sth, pp. 53, 3–6., 1998. [62] A. S. S. C. S. P. C. P. Li Y, "Characterizing diversity of Lactobacilli associated with severe early childhood caries: a study protocol," Adv Microbiol, p. 5:9–20, 2015. [63] T. S. M.-s. T. V. W. Sarxelin M., "Probiotic and other functional microbes: From markets to mechanisms," Microbiol, p. 16:204–211, 2005. [64] v. G.-S. G. D. M. K. S. v. d. M. M. D. L. Kralj S, "Glucan synthesis in the genus Lactobacillus: isolation and characterization of glucansucrase genes, enzymes and glucan products from six different strains.," in Microbiology, 2004, p. 50(Pt 11):3681– 3690.. [65] R. A. B. R. D. J. C. J. J. G. G. C. G. J. Aoudia N., "Biofilms of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus fermentum: Effect on stress responses, antagonistic effects on pathogen growth and immunomodulatory properties.," Food Microbiol., p. 53:51–59, 2016. 88 Đồ án tốt nghiệp [66] Z. M. A. F. V.-J. R. R. M. Macías-Rodríguez ME, "BCS87 expresses mucus- and mucin-binding proteins on the cell surface.," J Appl Microbiol, p. 107:1866–1874, 2009. [67] P. M. H. D. L. C. K. K. Willcox MD, "Coaggregation of oral lactobacilli with streptococci from the oral cavity.," in Oral Microbiol Immunol, 1993, p. 8(5):319– 321. [68] P. J. I. C. J. T. J. M. T. G. Emiliano J. Quinto, "Probiotic Lactic Acid Bacteria: A Review," Food and Nutrition Sciences, pp. 5, 1765-1775, 2014. [69] J. H. M. a. I. Stamatova, "Lactic Acid Bacteria in Oral Health," pp. 403 - 421, 18 July 2016. [70] S. I. Meurman JH, "Probiotics: Contributions to oral health," Oral Dis, p. 13:443–451, 2007. [71] Biology libretexts, [Online]. Available: https://bio.libretexts.org/. [Accessed 30 Dec 2016]. [72] S. A. N. B. P. D. S. S. K. Diane McDougald, "Should we stay or should we go: mechanisms and ecological consequences for biofilm dispersal," NATURE REVIEWS | MICROBIOLOGY, pp. 39-50, 28 November 2011. [73] H. H. H. D. N. T. Staudt C, "Volumetric measurements of bacterial cells and extracellular polymeric substance glycoconjugates in biofilms," Biotechnol. Bioeng, p. 88 (5): 585–92, 2004. [74] C. J. Donlan RM, " Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms," Clin. Microbiol. Rev., p. 15 (2): 167–93, 2002. [75] D. RM, "Biofilms: Microbial Life on Surfaces," Emerging Infectious Diseases., p. 8 (9): 881–890, 2002. [76] P. Stoodley, D. deBeer and Z. Lewandowski, "Liquid Flow in Biofilm Systems," Appl Environ Microbiol, p. 60 (8): 2711–2716, August 1994. [77] ,. R. M. C. K. W. B. R. M. J. W. H.-C. F. Christian Mayer, "The role of intermolecular interactions: studies on model systems for bacterial biofilms," International Journal of Biological Macromolecules, p. 3–16, 1999. [78] W. a. Flemming, in Nat. Rev. Microbiol, pp. 8, 623-633. 89 Đồ án tốt nghiệp [79] A. F. P. J. W. Mark Keen, "The clinical significance of nasal irrigation bottle contamination," 2010. [80] P. M. R. P. J. P. I. B. H. C. J. W. G. E. P. Davies D. G., "The involvement of cell-to- cell signals in the Science,development of a bacterial biofilm," Science, pp. 295-298., 1998. [81] K. P. Watnick P., "Biofilm, city of microbes," Journal of Bacteriology, pp. 182(10), pp. 2675-2679, 2000. [82] C. W. G., "Biofilm processes," Biofilms, pp. 195-231., 1990. [83] R. H. H. M. A. K. Z. A. J. B. Bendinger B., "Physicochemical cell surface and adhesive properties of coryneform bacteria related to the presence and chain length of mycolic acids," in Applied, 1993, pp. 59, pp. 3973-3977. [84] J. W. U. S. P. S. S. A. R. &. S. K. Hans-Curt Flemming, "Biofilms: an emergent form of bacterial life," Nature Reviews Microbiology, p. 563–575, 11 August 2016. [85] C. D. Nadell, J. B. Xavier and K. R. Foster, "The sociobiology of biofilms," in FEMS Microbiology Reviews, 1 January 2009, p. 33 (1): 206–224. [86] C. J. Stewart PS, "Antibiotic resistance of bacteria in biofilms," Lancet, p. 358 (9276): 135–8, July 2001. [87] E. J. R. K. E. P. a. R. P. Kristi L. Frank, "In Vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus lugdunensis Clinical Isolates," ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, p. 888–895, Mar 2007. [88] D. A. W., "Microbial exopolymer secretion in ocean environment:," Oceanography and Marine, pp. 73-153, 1990. [89] B. B. O. S. S. A. L. B. Andersen PC, "Influence of xylem fluid chemistry on planktonic growth, biofilm formation and aggregation of Xylella fastidiosa," FEMS Microbiology Letters, p. 274 (2): 210–7, September 2007. [90] W. Characklis, M. Nevimons and B. Picologlou, "Influence of Fouling Biofilms on Heat Transfer," Heat Transfer Engineering, p. 3: 23–37, 1981. [91] "Wikipedia," 11 July 2017. [Online]. Available: https://en.wikipedia.org/wiki/Biofilm. [Accessed 04 08 2009]. 90 Đồ án tốt nghiệp [92] R. Bollinger, A. Barbas, E. Bush, S. Lin and W. Parker, "Biofilms in the large bowel suggest an apparent function of the human vermiform appendix," The Journal of Theoretical Biology, p. 249 (4): 826–831, 24 June 2007. [93] D. J. B. P D Marsh, "Dental plaque as a biofilm," Journal of Industrial Microbiology Volume 15, p. 169, 1995. [94] S. P. &. W. R. T. Humphrey, " A review of saliva: normal composition, flow, and function," The Journal of prosthetic dentistry, pp. 85(2), 162–69., 2001. [95] M. A. D. D. Marsh PD, "Dental plaque biofilms: communities, conflict, and control," Periodontology 2000, pp. 55(1), 16–35., 2011. [96] K. K. V. S. M. J. Stamatova I, "In vitro evaluation of yoghurt starter lactobacilli and Lactobacillus rhamnosus GG adhesion to saliva-coated surfaces.," Oral Microbiol Immunol 2009, p. 24:218–223., 2009. [97] Y. T. M. M. Kato I, "Macrophage activation by Lactobacillus casei in mice," Micr Immunol , p. 27: 611–618, 1983. [98] A. H. S. S. Meurman JH, "Recovery of Lactobacillus strain GG (ATCC 53103) from saliva of healthy volunteers after consumption of yoghurt prepared with the bacterium," Microb Ecol Health Dis, p. 7: 295–298., 1994. [99] J. N. D. C. G. S. Silva M, "Antimicrobial substance from a human Lactobacillus strain.," Antimicrob Agents Chemother, p. 31: 1231–1233, 1987. [100] G. Y. J. A. V. D. M. H. C. G. G. B. K. R. &. B. H. J. REID, "Microbiota restoration: natural and supplemented recovery of human microbial communities.," Nat Rev Microbiol, pp. 9, 27-38. , 2011. [101] H. L. S. Y.-L. T. D. G. HALLSTROM, "Effect of probiotic lozenges on inflammatory reactions and oral biofilm during experimental gingivitis.," Acta Odontol Scand., 7 Jan 2013. [102] P. Hasslưf, "Use of probiotics in the oral cavity," Probiotic Lactobacilli in the context of dental caries as a biofilm-mediated disease , pp. 13 - 17, 2013. [103] "Oral health surveys - basic methods," in World Health Organization 4th edition, 1997. [104] e. a. Tran Van Truong, National oral health survey of Vietnam 2001, Hanoi, Vietnam: Medical Publishing House, 2002, 2002. 91 Đồ án tốt nghiệp [105] T. Le, "Người Lao Động," 24 2 2003. [Online]. Available: khoe/tren-90-nguoi-viet-nam-bi-benh-rang-mieng-49913.htm. [106] M. a. W. Rogosa, "J. Bacteriol," 1951. [107] T. S. R. Sudhir K. Shuklaa, "An Improved Crystal Violet Assay for Biofilm Quantification in 96-Well Microtitre Plate". [108] G. A. O'Toole, "Microtiter Dish Biofilm Formation Assay," Journal of Visualized Experiments, 30 Jan 2011. [109] Y. Z. &. X. J. Li X, "Quantitative variation of biofilms among strains in natural populations of Candida albicans," in Microbiology,, 2003, p. 353. [110] Z. W. T. H. W. a. Q. Y. Wu, "A simplified method for chromosome DNA preparation from filamentous Fungi.," Mycosystema 20, p. 575–577, 2001. [111] B. S. P. D. L. D. Weisberg WG, " 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study," in J Bacteriol, 1991, p. 173: 697–703. [112] S. N. a. N. M., "The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees.," in Molecular Biology and Evolution , 1987, pp. 4:406-425.. [113] F. J., "onfidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap.," in Evolution, 1985, pp. 39:783-791. [114] N. M. a. K. S. Tamura K., "Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method.," in Proceedings of the National Academy of Sciences , 2004, pp. 101:11030-11035. [115] G. H. J. G. Carlsson J, "Lactobacilli and streptococci in the mouth of children.," in Caries Res, 1975, pp. 9(5):333-9.. [116] J. K. a. Y. Q. X. Zhang, "Isolation and characterization of a Lactobacillus fermentum temperate bacteriophage from Chinese yogurt," The Society for Applied Microbiology, Journal of Applied Microbiology, p. 857–863, 2006. [117] B. A. P. A. P. Z. MATTHEW D. COLLINS, "Deoxyribonucleic Acid Homology Studies of Lactobacillus casei,Lactobacillus paracasei sp. nov., subsp. paracasei and subsp. tolerans, and Lactobacillus rhamnosus sp. nov., comb. nov.," INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY Vol. 39, No. 2 , pp. 105-108 , April 1989. 92 Đồ án tốt nghiệp [118] P. V. U. S. W. H. Joanna Koort, "Lactobacillus curvatus subsp. melibiosus is a later synonym of Lactobacillus sakei subsp. carnosus," International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, pp. 54, 1621–1626, 2004. [119] J. A. E. F. A. M. D. COLLINS, "Lactobacillus oris sp. nov. from the Human Oral Cavity," INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY Vol. 38, No. 1 , pp. 116-118 , Jan 1988. [120] D. M. WHEATER, "The Characteristics of Lactobacillus plantarum, L. helveticus and L. casei," J. gen. Microbial, pp. 12, 133-139, 1955. [121] A. C. W. Ratih Dewanti, "Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli 0157:H7," International Journal of Food Microbiology 26, pp. 147- 164 , 1995. [122] D. C. V. B. K. K. Z. J. Elleni Michu, "Biofilm formation on stainless steel by Staphylococcus epidermidis in milk and influence of glucose and sodium chloride on the development of ica-mediated biofilms," in International Dairy Journal, Volume 21, Issue 3, March 2011, pp. 179-184. [123] S. S. K. S. a. M. J. F. M. A. Patrauchan, "Calcium influences cellular and extracellular product formation during biofilm-associated growth of a marine Pseudoalteromonas sp.," in Microbiology, 2005, pp. 151, 2885–2897. [124] S. A. M. E. B. V. L. L. a. R. S. S. Maria I Rockenbach, "Salivary flow rate, pH, and concentrations of calcium, phosphate, and sIgA in Brazilian pregnant and non- pregnant women," Head Face Med, p. 44, 28 Nov 2006. [125] D. T. Z. M. e. a. Rozkiewicz D, "Oral Candida albicans carriage in healthy preschool and school children.," in Adv Med Sci., 2006, p. 51:187–90. [126] H. S. S. N. N. T. H. U. H. Kubota, " Biofilm formation by lactic acid bacteria and resistance to environmental stress.," J. Biosci. Bioeng, pp. 106, 381–386., 2008.. [127] H. Silk, "Diseases of the mouth," in Primary care, March 2014, p. 75–90. [128] H. O. H. M. Y. B. Yimin Cai, "Lactobacillus paralimentarius sp. nov., isolated from sourdough," International Journal of Systematic Bacteriology, pp. 49, 1451-1455 , 1999. [129] P. H. F. J. A. S. E. A. M.-S. S. S. C. S. C. B. R. Leverett DH, "Caries risk assessment in a longitudinal discrimination study.," J Dent Res., p. 72(2):538–543, 1993. 93 Đồ án tốt nghiệp [130] R. A. C.-V. C. D. S. D. C. e. a. C. C. C. Ribeiro, "The effect of iron on Streptococcus mutans biofilm and on enamel demineralization," in Brazilian Oral Research, vol. 26, no. 4, 2012, p. 300–305. [131] S. a. K. M. Twetman, "Probiotics for caries," Adv Dent Res, p. 24: 98–102, 2012. [132] S. I. W., "Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky," Microbiology, pp. 147, pp. 3-9., 2001. [133] T. T. Hằng, "PHÂN LẬP, NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CĨ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG SINH HỌC Ở VIỆT NAM," 2011. [134] D. T. Truyền, "Hiệu quả các biện pháp chăm sĩc răng miệng cho," Y Học Thực Hành, pp. 48-50, 2004. [135] e. a. Dickson, " A novel species-specific PCR assay for identifying Lactobacillus fermentum," J Med Microbiol 54, pp. 299-303, 2005. [136] P. J. a. P. Sharma, "Probiotics and Their Efficacy in Improving Oral Health: A Review," Journal of Applied Pharmaceutical Science Vol. 2, pp. pp. 151-163, November 2012. 94 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC BẢNG Trình tự DNA của L. fermentum 1B đem so sánh với ngân hàng gen: ATGGTGCTTGCACCTGATTGATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGG TGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAGCGGGGGACAACATTTGGA AACAGATGCTAATACCGCATAACAACGTTGTTCGCATGAACAACGCTTA AAAAATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTATCT TGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGGGATGATGCATAGCCAAGTTGA CAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGG GAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGC AACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTA AAGAATAACACGTATGACAGTAACTGTTCATACTTTGACGGTATTTAAC CAAAATGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAACCTCGGTAATACGTACGT GGCAAGGGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAGTGCAGGCGGTTT TCTAACTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGA AACTGGATAACTTGAGTGCAG Trình tự DNA của L. fermentum 12R2 đem so sánh với ngân hàng gen: TGGTGCTTGCACCTGATTGATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGT GAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAGCGGGGGACAACATTTGGAA ACAGATGCTAATACCGCATAACAACGTTGTTCGCATGAACAACGCTTAA AAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTT GTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCAAGTTGAG AGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGGG AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCA ACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAA AGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAACC AAAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGT GGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAGTGCAGGCGGTTT 1 Đồ án tốt nghiệp TCTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGA AACTGGATAACTTGAGTGCAGA Trình tự DNA của L. fermentum 30B2 đem so sánh với ngân hàng gen: GATGGTGCTTGCACCTGATTGATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGG GTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAGCGGGGGACAACATTTGG AAACAGATGCTAATACCGCATAACAACGTTGTTCGCATGAACAACGCTT AAAAAATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTATC TTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCAAGTTG ACAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACG GGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAG CAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTT AAGGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATACTTTGACGGTATTTAA CCAAAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTACG TGGCAAGGGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAGTGCAGGCGGTT TTCTAACTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGG AAACTGGATAACTTGAGT 2 Đồ án tốt nghiệp Kết quả khảo sát khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của các NBG lên L. fermentum 1B: Tỷ lệ 1:1 Tỷ lệ 1:2 Tỷ lệ 1:1 Tỷ lệ 1:2 1R2 1.24 ± 2.14 2.04 ± 3.51 18B2 4.85 ± 3.71 0 2R2 2.92 ± 4.04 0.1 ± 0.17 20R 4.08 ± 3.51 0.04 ± 0.07 4R2 0.5 ± 0.54 5.57 ± 5.38 21R2 2.46 ± 1.86 0.25 ± 0.44 5R1 2.2 ± 2.85 8.34 ± 2.25 21B2 6.03 ± 1.6 1.52 ± 2.03 5B1 3.8 ± 5.04 10.2 ± 3.57 23R 0.4 ± 0.69 0.28 ± 0.48 7R2 7.92 ± 8.23 1.57 ± 1.5 23B1 10.09 ± 9.88 16.53 ± 7.57 7B2 2.39 ± 2.7 3.59 ± 0.42 23B2 4.91 ± 5.03 13.7 ± 5.71 8R2 5.6 ± 3.02 18.14 ± 6.18 26R1 7.14 ± 2.49 12.16 ± 3.06 8B 70.03 ± 10.5 2.77 ± 1.21 26R2 0.77 ± 0.74 2.28 ± 2.6 9B1 7.49 ± 7.07 8.61 ± 7.5 27R 4.66 ± 1.89 16.62 ± 18.45 10B2 3.89 ± 1.43 10.76 ± 3.67 27B2 20.89 ± 24.93 0 11B2 6.03 ± 6.08 0.93 ± 1.6 30R2 7.72 ± 3.02 0.17 ± 0.3 12R1 7.86 ± 5.21 0.61 ± 1.05 30B1 0.23 ± 0.29 0.62 ± 1.07 16B 72.36 ± 5.76 71.44 ± 3.68 3 Đồ án tốt nghiệp Kết quả khảo sát khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của các NBG lên L. fermentum 12R2: Tỷ lệ 1:1 Tỷ lệ 1:2 Tỷ lệ 1:1 Tỷ lệ 1:2 1R2 0 0 18B2 0 1.92 ± 3.33 2R2 0 0 20R 0 3.41 ± 5.9 4R2 0 42.84 ± 12.43 21R2 0.65 ± 1.12 34.02 ± 22.1 5R1 31.11 ± 29.01 51.73 ± 12.79 21B2 0 61.04 ± 11.55 5B1 0 0 23R 0 0 7R2 35.08 ± 22.4 59.19 ± 3.96 23B1 34.67 ± 14.03 71.41 ± 10.03 7B2 55.09 ± 19.71 68.34 ± 7.82 23B2 22.12 ± 20.53 69.68 ± 13.01 8R2 0 25.22 ± 30.77 26R1 77.38 ± 6.63 78.17 ± 3.28 8B 0 0.17 ± 0.3 26R2 1.25 ± 2.17 10.36 ± 17.95 9B1 35.47 ± 5.67 32.82 ± 27.99 27R 0 0 10B2 59.28 ± 12.91 49.55 ± 33.48 27B2 2.48 ± 4.3 0 11B2 0 0 30R2 0 0 12R1 0 0.72 ± 1.25 30B1 0 41.33 ± 9.05 16B 46.36 ± 12.42 59.04 ± 8.95 4 Đồ án tốt nghiệp Kết quả khảo sát khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của các NBG lên L. fermentum 30B2: Tỷ lệ 1:1 Tỷ lệ 1:2 Tỷ lệ 1:1 Tỷ lệ 1:2 1R2 0 0 18B2 28.41 ± 9.65 0 2R2 0 0 20R 0 0 4R2 0 0 21R2 54.06 ± 4.9 54.45 ± 6.49 5R1 0 0 21B2 63.15 ± 3.6 60.34 ± 4.17 5B1 0 0 23R 12.22 ± 5.51 0 7R2 0 0 23B1 61.48 ± 4.64 46.89 ± 7.19 7B2 0 10.71 ± 18.55 23B2 57.01 ± 1.02 40.08 ± 19.86 8R2 0 0 26R1 0 0 8B 0 0 26R2 0 0 9B1 0 0 27R 0 0 10B2 1.02 ± 1.77 0 27B2 0 0 11B2 0 0 30R2 0 0 12R1 0 0 30B1 0 0 16B 65.39 ± 9.31 0 5 Đồ án tốt nghiệp Kết quả khảo sát khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của các NBG lên Candida albicans: Tỷ lệ 1:1 Tỷ lệ 1:2 Tỷ lệ 1:1 Tỷ lệ 1:2 1R2 0 0 18B2 0 0 2R2 0 0 20R 0 0 4R2 0 0 21R2 2.06 ± 1.9 51 ± 7.91 5R1 0 0 21B2 0 48.37 ± 4.34 5B1 0 0 23R 0 0 7R2 0 0 23B1 0 11.73 ± 10.41 7B2 0 0 23B2 1.4 ± 2.42 54.13 ± 3.89 8R2 35.39 ± 5.68 65.83 ± 9.28 26R1 0 0.61 ± 1.05 8B 0 25.82 ± 14.95 26R2 0 0 9B1 0 0 27R 0 0 10B2 54.75 ± 47.41 0 27B2 0 0 11B2 0 0 30R2 3.02 ± 5.23 0 12R1 0 0 30B1 0 0 16B 0 0 6 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC HÌNH ẢNH Kết quả phân nhĩm khả năng hình thành màng sinh học của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được 7 Đồ án tốt nghiệp KẾT QUẢ KHÁNG MÀNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG ĐÁNG CHÚ Ý Chủng 16B kháng màng L. fermentum 1B Chủng 26R1 kháng màng L. fermentum 12R2 Chủng 21B2 kháng màng L. fermentum 30B2 Chủng 8R2 kháng màng C. albicans 8 Đồ án tốt nghiệp CÁC ĐĨA THÍ NGHIỆM 96 SAU KHI NHUỘM MÀNG BẰNG CV (thí nghiệm kháng màng L. fermentum 1B) (thí nghiệm kháng màng L. fermentum 12R2) (thí nghiệm kháng màng L. fermentum 30B2) 9 Đồ án tốt nghiệp (thí nghiệm kháng màng C. albicans) Thí nghiệm thử khả năng lên men các nguồn carbohydrate của chủng 1B, 12R2, 30B2 10