Đồ án Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng ức chế nấm mốc sinh aflatoxin

của Tiến sĩ Nguyễn Hoài Hương khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi trường của trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Những kết quả này hoàn toàn không sao chép từ các nghiên cứu khoa học khác dưới bất kì hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án này đều hoàn toàn trung thực. Tôi xin chịu trách nhiệm toàn bộ về đồ án của mình. Tp.HCM, ngày 09 tháng 08 năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Trần Yến Tiên Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành được đồ án “Phân lập và định danh vi khuẩn lactic có khả năng ức chế nấm mốc sinh Aflatoxin” trong suốt quá trình học tập, rèn luyện và trau dồi kiến thức. Cũng không ít lần gặp khó khăn trắc trở nhưng nhờ sự hướng dẫn tận tình của Cô Nguyễn Hoài Hương nay em đã hoàn thành được đồ án của mình. Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ tận tình của Cô Nguyễn Hoài Hương. Khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM. Chính nhờ Cô đã truyền tải kiến thức và những kỹ năng để em đạt được thành quả trong đồ án mà em thực hiện hôm nay. Chân thành gửi lời cám ơn sâu sắc đến các Thầy cô giảng viên và Ban lãnh đạo Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM đã tạo điều kiện cho em tìm hiểu tài liệu để hoàn thành được đồ án tốt nghiệp đúng thời gian quy định. Dù hoàn thành được đồ án nhưng cũng khó tránh khỏi những sai sót nhất định do khả năng hiểu biết hạn hẹp và thông tin tài liệu không mấy khả quan để phục vụ quá trình thực hiện đồ án. Kính mong có sự góp ý và hướng dẫn tận tình của các thầy cô để em học hỏi thêm những kinh nghiệm, tích lũy cho quá trình học tập rèn luyện và chuẩn bị hành trang bước sang một môi trường làm việc mới sau này. Kính chúc Cô Nguyễn Hoài Hương và các Thầy cô giảng viên, Ban lãnh đạo Khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM sức khỏe, thành công và may mắn. Em xin chân thành cảm ơn! TP.HCM, ngày 09 tháng 08 năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Trần Yến Tiên Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................... 4 DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................ 5 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH .............................. 7 MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 10 1. Tính cấp thiết đề tài ......................................................................................... 10 2. Tình hình nghiên cứu .................................................................................... 11 3. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 12 4. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 12 5. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 12 5.1. Phương pháp luận ......................................................................................... 12 5.2. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................. 13 6. Kết cấu đồ án ................................................................................................. 13 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................... 14 1.1. Tổng quan về nấm ......................................................................................... 14 1.1.1. Giới thiệu chung ................................................................................... 14 1.1.2. Độc tố nấm ............................................................................................ 15 1.1.3. Tác hại của nấm .................................................................................... 17 1.1.4. Một số chủng nấm gây độc trong thực phẩm ....................................... 18 1.1.5. Một số phương pháp khử nhiễm độc tố ................................................ 19 1.2. Tổng quan về vi khuẩn lactic ....................................................................... 21 1.2.1. Giới thiệu vi khuẩn lactic ...................................................................... 21 1.2.2. Phân loại ............................................................................................... 22 1.2.3. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn lactic. ............................................... 23 1.2.4. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa .................................................................. 25 1.2.5. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic .............................................. 26 1.2.6. Quá trình trao đổi chất ......................................................................... 28 1.2.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic ............................................................................. 31 1.2.8. Ứng dụng của vi khuẩn lactic ............................................................... 32 1 Đồ án tốt nghiệp 1.2.9. Hoạt tính sinh học ................................................................................. 33 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 38 2.1. Địa điểm nghiên cứu ..................................................................................... 38 2.2. Thời gian thực hiện ....................................................................................... 38 2.3. Vật liệu ........................................................................................................... 38 2.3.1. Nguồn phân lập ..................................................................................... 38 2.3.2. Thiết bị và dụng cụ................................................................................ 38 2.3.3. Hóa chất ................................................................................................ 38 2.3.4. Giống nấm ............................................................................................. 40 2.4. Phương pháp luận ......................................................................................... 40 2.5. Phương pháp thí nghiệm .............................................................................. 43 2.5.1. Thu thập mẫu ........................................................................................ 43 2.5.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic ................................................. 43 2.5.3. Khảo sát hình thái, sinh lý, sinh hoá. ................................................... 45 2.6. Khảo sát khả năng tăng trưởng và lên men lactic. .................................... 49 2.7. Khảo sát khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic bằng phương pháp in vitro. ......................................................................................................... 49 2.7.1. Khảo sát khả năng đối kháng nấm trực tiếp theo phương pháp in vitro. 49 2.7.2. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào ........................................... 53 2.8. Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic trong bảo quản hạt. 55 2.8.1. Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 102/12g hạt: 55 2.8.2. Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 101/12g hạt: 57 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ....................................................... 60 3.1. Kết quả khảo sát hình thái, sinh lý, snh hoá. .............................................. 60 3.1.1. Thử nghiệm Catalase ............................................................................ 61 3.1.2. Nhuộm Gram ......................................................................................... 62 3.1.3. Nhuộm bào tử ........................................................................................ 63 3.1.4. Khả năng lên men đường và khả năng sinh khí .................................... 64 3.1.5. Thử nghiệm khả năng di động bằng phương pháp thạch mềm. ........... 66 2 Đồ án tốt nghiệp 3.2. Khảo sát khả năng tăng trưởng và lên men lactic. .................................... 71 3.3. Khảo sát khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic bằng phương phap in vitro. ........................................................................................................ 73 3.3.1. Khảo sát khả năng kháng nấm trực tiếp của chủng vi khuẩn lactic. .... 73 3.3.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào. ........................................................ 76 3.4. Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 102/12g hạt: ... 78 3.5. Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 101/12g hạt: ... 87 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................... 94 4.1 Kết luận ........................................................................................................... 94 4.2 Kiến nghị ......................................................................................................... 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 95 PHỤ LỤC ................................................................................................................. 1 3 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT LAB lactic acid bacteria /Lactobacillales VK Vi khuẩn MRS de Man, Rogosa and Sharpe PDA Potato Detrose Agar ĐC Đối chứng TN Thí nghiệm. 4 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh trưởng của các chi vi khuẩn lactic ......................... 25 Bảng 1.2. Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998) ............................................................................... 34 Bảng 1.3. Các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic có tính kháng sinh. (Holzapfel và cộng sự, 1995) .................................................................................... 35 Bảng 1.4 Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB. (Holzapfel và cộng sự, 1995) .................................................................................... 37 Bảng 2.1: Kí hiệu các nguồn phân lập ...................................................................... 43 Bảng 3.1: Bảng kí hiệu các chủng vi khuẩn phân lập............................................... 61 Bảng 3.2 Trình bày hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các vi khuẩn phân lập. ............................................................................................................................. 67 Bảng 3.3. Trình bày tóm tắt về các chủng phân lập có đặc điểm đặc trưng cho vi khuẩn lên men lactic. ................................................................................................. 70 Bảng 3.4: Bảng xử lý số liệu khả năng sinh acid và giá trị OD của 11 chủng vi ..... 71 khuẩn phân lập. ......................................................................................................... 71 Bảng 3.5: Phân nhóm các chủng vi khuẩn lactic ...................................................... 72 Bảng 3.6 .Thống kê số liệu phần trăm tỉ lệ ức chế của 11 chủng vi khuẩn phân lập được với 2 chủng nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. .................... 74 Bảng 3.7. Kết quả khả năng sinh enzyme của các chủng vi khuẩn .......................... 76 Bảng 3.8. Khả năng kháng nấm CĐP1 của Canh trường nuôi cấy các chủng vi khuẩn ứng dụng trên đậu phộng với mật độ nhiễm 102 bào tử/g đậu phộng. ........... 78 Bảng 3.9. Khả năng kháng nấm CĐP2 của Canh trường nuôi cấy các chủng vi khuẩn ứng dụng trên đậu phộng với mật độ nhiễm 102 bào tử/g đậu phộng. ........... 82 Bảng 3.10. Khả năng kháng nấm CĐP1 của Canh trường nuôi cấy các chủng vi khuẩn ứng dụng trên đậu phộng với mật độ nhiễm 101 bào tử/g đậu phộng. ........... 87 Bảng 3.11. Khả năng kháng nấm CĐP2 của Canh trường nuôi cấy các chủng vi khuẩn ứng dụng trên đậu phộng với mật độ nhiễm 101 bào tử/g đậu phộng. ........... 89 5 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.12. Thời gian bắt đầu xuất hiện tơ nấm (ngày) của 11 chủng vi khuẩn với mật độ cảm nhiễm 101bt/g đậu phộng và 102bt/g đậu phộng. ................................... 90 Bảng 3.13. So sánh khả năng tăng trưởng, lên men lactic, kháng nấm in vitro và in vivo của các chủng vi khuẩn phân lập. ..................................................................... 91 6 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1: Một số vi khuẩn lactic điển hình .............................................................. 24 Hình 1.2. Sơ đồ các con đường lên men lactose của vi khuẩn lactic ....................... 29 Hình 2.1 Sơ đồ phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn lactic ................................... 42 Hình 2.2: Cách pha loãng mẫu ................................................................................. 44 Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. ................................................................. 50 Hình 2.4: Mô tả cách đo đường kính vòng ức chế của phương pháp vạch 2 đường vi khuẩn ......................................................................................................................... 52 Hình 2.5: Sơ đồ thí nghiệm khả năng sinh enzyme của các chủng LAB. ................ 53 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic ........................................................... 60 Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic trên môi trường có chứa chất chỉ thị 61 Hình 3.3: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn (Từ trái qua phải): Thử nghiệm âm tính của chủng vi khuẩn KC1A, Đối chứng âm là nước cất, thử nghiệm dương tính đối với Bacillus spp. .................................................................................................. 62 Hình 3.4 Kết quả nhuộm gram của chủng vi khuẩn: A. Vi khuẩn Bacillus subtilis bắt màu tím. B. Vi khuẩn E.coli bắt màu hồng. C. Vi khuẩn phân lập ................... 63 Hình 3.5 Kết quả nhuộm bào tử của chủng vi khuẩn. A. Vi khuẩn Bacillus subtilis sinh bào tử. B. Vi khuẩn E.coli không sinh bào tử. C. Vi khuẩn phân lập không sinh bào tử ......................................................................................................................... 64 Hình 3.6. Thử nghiệm lên men đường. Ống 1: Vi khuẩn không lên men đường. Ống 2: Vi khuẩn lên men đường có sinh khí. Ống 3: Vi khuẩn lên men đường nhưng không sinh khí . ......................................................................................................... 65 Hình 3.7 Vi khuẩn lactic phân lập được có khả năng lên men đường. .................... 66 Sau thử nghiệm lên men đường, thu được kết quả cho thấy trong số 11 chủng phân lập thì có 10 chủng là vi khuẩn lên men đồng hình, 1 chủng còn lại là lên men dị hình. Các chủng phân lập từ Kim chi đều lên men đồng hình sinh acid lactic, còn với các chủng phân lập từ Nem chua có duy nhất 1 chủng là lên men dị hình, 4 7 Đồ án tốt nghiệp chủng còn lại đều lên men đồng hình. Chủng lên men dị hình đó thường mang lại cho Nem chua nhiều giá trị cảm quan hơn do hình thành sản phẩm phụ ngoài acid lactic. ......................................................................................................................... 66 Hình 3.8. Kiểm tra tính di động của vi khuẩn. Ống a: Vi khuẩn có khả năng di động. Ống b: Vi khuẩn không có khả năng di động. Ống c: Vi khuẩn phân lập được không có khả năng di động. ...................................................................................... 67 Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn %Acid tổng và sinh khối của 11 chủng vi khuẩn sau 24h nuôi cấy. .................................................................................................................... 72 Hình 3.10. Khả năng đối kháng nấm CĐP2 của chủng vi khuẩn phân lập. ............. 74 Hình 3.11. Khả năng đối kháng nấm CĐP1 của chủng vi khuẩn phân lập .............. 74 Hình 3.12. Biểu đồ thể hiện phần trăm tỉ lệ ức chế nấm của các chủng vi khuẩn. .. 75 Hình 3.13. Khả năng đối kháng CĐP1 của NC412 sau 3 ngày. ............................... 75 Hình 3.14. Khả năng đối kháng CĐP2 của KC1A sau 3 ngày. ................................ 75 Hình 3.15. Khả năng đối kháng CĐP1 của KC242 sau 3 ngày. ............................... 76 Hình 3.16. Khả năng phân giải Tinh bột của chủng vi khuẩn KC13 ...................... 77 Hình 3.17. Khả năng phân giải Protein của chủng vi khuẩn KC1B ........................ 77 Hình 3.18. Khả năng phân giải Chitin của chủng vi khuẩn KC1A ......................... 77 Hình 3.19 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7. Từ trên xuống: ĐC (-) – Đối chứng nước cất, ĐC (+) – Đối chứng Carbezim, Chủng VK KC211, Chủng VK KC1A. ........... 79 Hình 3.20 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7. Từ trên xuống: Chủng VK KC1B, KC13, KC106, KC242. ......................................................................................................... 80 Hình 3.21 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7. Từ trên xuống: Chủng VK NC2, NC12, NC172, NC412. ......................................................................................................... 81 Hình 3.22 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7, ngày 13, ngày 19. Từ trên xuống: ĐC (-) – 8 Đồ án tốt nghiệp Đối chứng nước cất, ĐC (+) – Đối chứng Carbezim, Chủng VK KC211, Chủng VK KC1A. ....................................................................................................................... 83 Hình 3.23 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7, ngày 13, ngày 19. Từ trên xuống: Chủng VK KC1B, KC13, KC106, KC242. .......................................................................... 84 Hình 3.24 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7, ngày 13, ngày 19. Từ trên xuống: Chủng VK NC2, NC12, NC172, NC412. ............................................................................. 85 Hình 3.25. Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày (Từ trái sang: ngày 1, 2, 3, 4, 6 và 12 ngày. Từ trên xuống: ĐC (-) – Đối chứng nước cất, ĐC (+) – Đối chứng Carbezim, Chủng VK KC1A và chủng NC412. ....................................................... 92 Hình 3.26. Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày (Từ trái sang: ngày 1, 2, 3, 4, 6 và 12 ngày. Từ trên xuống: ĐC (-) – Đối chứng nước cất, ĐC (+) – Đối chứng Carbezim, Chủng VK KC1A và chủng NC412. ....................................................... 93 9 Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết đề tài Song song với sự phát triển về kinh tế, chính trị và xã hội thì bên cạnh đó lĩnh vực Công nghệ sinh học cũng đang dần phát triển ngày càng rộng mở. Ngày nay con người ta đã ứng dụng các thành tựu khoa học công nghệ vào trong cuộc sống, áp dụng trên tất cả các loại hình từ công nghiệp, nông nghiệp, an ninh quốc phòng cho đến giải trí, v.v... Công nghệ sinh học chính là kết quả của các quá trình nghiên cứu khoa học công nghệ. Các nhà khoa học, các nhà nghiên cứu, ứng dụng các kiến thức từ các tài liệu trên toàn Thế Giới và áp dụng các biện pháp kỹ thuật để cho ra đời các giống cây trồng, vật nuôi, vi sinh vật có tính năng ưu việt hơn các loại giống hiện có. Bên cạnh đó còn có thể tạo ra những loại thức ăn mới, nghiên cứu ra các loại thuốc, chất xét nghiệm bệnh, những mầm móng mới có giá trị phục vụ đời sống, phát triển kinh tế - xã hội và bảo vệ môi trường. Đặc biệt hơn là áp dụng trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm. Các nghiên cứu Công nghệ sinh học cho ra đời các loại vi sinh vật dùng trong chế biến và bảo quản thực phẩm, điều tiết các loại vi khuẩn, nấm mốc có trong thực phẩm. Hạn chế mầm bệnh và sự lây lan đến môi trường sống. Xã hội ngày càng phát triển nên con người luôn phải chạy theo sự phát triển đó. Cuộc sống của họ trở nên bận rộn hơn, họ bắt đầu “sống vội” hơn. Thay vì sử dụng các thực phẩm xanh, sạch thì con người lại chọn những thực phẩm chế biến sẵn mà không biết hầu hết chúng đều được bảo quản bằng chất hóa học. Bản thân thực phẩm cũng có thể chứa các mầm bệnh là nguyên nhân trực tiếp gây ra các dịch bệnh hiện nay. Mặc dù áp dụng tiến bộ kỹ thuật trong công nghệ và quy phạm vệ sinh an toàn thực phẩm (GMP, HACCP), nhưng nguy cơ nhiễm các vi sinh vật gây bệnh trong quá trình chế biến thực phẩm ngày càng gia tăng (Theo Besselink, et al., 2008). Chính vì thế, các cơ sở sản xuất thực phẩm phải dùng đến các chất bảo quản hóa học. Mặc dù, nếu chúng được sử dụng với liều lượng cho phép nhưng các chất 10 Đồ án tốt nghiệp phụ gia này vẫn gây ra các tác dụng không mong muốn cho người tiêu dùng. Nhưng còn có rất nhiều trường hợp, do lợi nhuận, các nhà sản xuất còn sử dụng các loại hóa chất bị nghiêm cấm để có thể tăng hương vị sản phẩm hoặc kéo dài được hạn sử dụng hơn. Có thể nói: Hiện nay con người dường như đang sống cùng hóa chất và sức khỏe con người đang đứng trước bờ vực thẳm. Theo đó tôi đã dựa trên những nghiên cứu, những tài liệu mà các thầy cô cung cấp, và tìm hiểu thêm trên các trang thông tin khoa học để thực hiện đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic ức chế nấm mốc sinh Aflatoxin”. Loại vi khuẩn này có khả năng kháng lại các loại nấm mốc dùng trong chế biến và bảo quản thực phẩm. Đảm bảo thực phẩm đạt chất lượng dinh dưỡng hợp lý, nâng cao chất lượng sản phẩm nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao trên thị trường nội địa lẫn quốc tế. Do đó, tôi đã thực hiện đề tài này nhằm phục vụ quá trình làm đồ án tốt nghiệp cũng như là tìm tòi, học hỏi, tích lũy các kinh nghiệm thực tiễn trong quá trình tham khảo, nghiên cứu các ứng dụng của khuẩn lên men lactic cùng với các phương pháp xử lý nguyên liệu và chế biến hợp lý nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm, tạo ra sự đồng nhất của sản phẩm sau khi lên men, kéo dài thời gian bảo quản góp phần vào việc đáp ứng nhu cầu sử dụng đa dạng sản phẩm và đảm bảo hợp vệ sinh cho người sử dụng. 2. Tình hình nghiên cứu Phân lập và định danh vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng nấm chống bệnh than (Asma Saleh Elmabrok et al,2012) Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic mới phân lập (Nora LAREF*, Bettache GUESSAS, 2013) Phân lập và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sản sinh hợp chất kháng khuẩn của Lactobacillus plantarum (Lê Ngọc Thùy Trang và cộng sự, 2014) Phân lập, định danh và xác định các chủng Lactobacillus có tiềm năng Probiotic từ người (Hoàng Quốc Khánh và cộng sự) 11 Đồ án tốt nghiệp Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic dùng trong chế biến và bảo quản thưc ăn thô xanh và phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại (Đào Thị Lương và các cộng sự, 2010) Nghiên cứu đặc điểm và vai trò của Lactobacillus acidophilus trong chế biến Probiotic (Trần Thị Ái Liên, 2011) Ngoài ra còn có nhiều công trình nghiên cứu khác về vi khuẩn lactic trong và ngoài nước 3. Mục tiêu nghiên cứu Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng nấm mốc gây nhiễm độc trên thực phẩm. 4. Nội dung nghiên cứu - Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống như kim chi và nem chua. - Khảo sát khả năng tăng trưởng và lên men lactic của các chủng phân lập. - Khảo sát khả năng đối kháng nấm sinh aflatoxin in vitro. - Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của cac chủng phân lập. - Khảo sát khả năng kháng nấm in vivo qua thí nghiệm bảo quản đậu phộng. 5. Phương pháp nghiên cứu 5.1. Phương pháp luận - Lựa chọn nguồn phân lập là các loại thực phẩm lên men truyền thống như kim chi, nem chua, vì các nguồn này chứa các vi khuẩn sống và có tiềm năng kháng nấm cao. - Phân lập vi khuẩn lên men lactic bằng môi trường chuyên biệt có bổ sung NaN3 và khăng định khả năng sinh acid bằng chỉ thị, dựa vào khoá phân loại của Bergey’s Manual (Theo Benson Lab Manual, 2001) và định danh sơ bộ vi khuẩn lên men lactic. - Tuyển choṇ các chủng vi khuẩn phân lập qua khảo sát sinh khối và acid tổng tạo thành. 12 Đồ án tốt nghiệp - Tuyển choṇ các chủng vi khuẩn phân lập kháng nấm in vitro của các chủng phân lập áp dụng phương pháp đối kháng trực tiếp (cấy 2 đường vi khuẩn). - Tuyển choṇ các chủng vi khuẩn phân lập qua kháng nấm in vivo qua thí nghiệm bảo quản đậu phộng. 5.2. Phương pháp xử lý số liệu - Sử dụng phần mềm excel để vẽ đồ thị - Sử dụng phần mềm SAS 9.4 để xử lý số liệu 6. Kết cấu đồ án Mở đầu Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án. Chương 3: Kết quả và biện luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề tài thực hiện được và đưa ra những biện luận cho kết quả thu được. Kết luận và kiến nghị – nội dung chương tóm lại những kết quả mà đề tài đạt được và đề nghị cho những hướng cải thiện thêm trong đề tài. 13 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về nấm 1.1.1. Giới thiệu chung Giới Nấm (tên khoa học: Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn dị dưỡng có thành tế bào bằng chitin. Phần lớn nấm phát triển dưới dạng các sợi đa bào được gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium), một số nấm khác lại phát triển dưới dạng đơn bào. Quá trình sinh sản (hữu tính hoặc vô tính) của nấm thường qua bào tử, được tạo ra trên những cấu trúc đặc biệt hay quả thể. Một số loài lại mất khả năng tạo nên những cấu trúc sinh sản đặc biệt và nhân lên qua hình thức sinh sản sinh dưỡng. Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc, nấm men và nấm lớn (nấm quả thể). Giới Nấm là nhóm sinh vật đơn ngành (monophyletic) mà có nguồn gốc hoàn toàn khác biệt với những sinh vật có hình thái tương tự như nấm nhầy (myxomycetes) hay mốc nước (oomycetes). Nấm có mối quan hệ gần với động vật hơn thực vật, cho dù thế thì môn học về nấm, hay nấm học, lại thường được xếp vào thành một nhánh của thực vật học. Trên Trái Đất, đa phần các nấm đều không thể nhìn thấy được bằng mắt thường, chúng sống phần lớn ở trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc ký sinh trên cơ thể động, thực vật và nấm khác. Vi nấm đóng một vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy các vật chất hữu cơ và không thể thiếu được trong chu trình chuyển hóa và trao đổi vật chất. Một số loài nấm có thể nhận thấy được khi ở dạng quả thể, như nấm lớn và nấm mốc. Nấm được ứng dụng rất rộng rãi trong đời sống lẫn sản xuất. Nhiều loài được sử dụng trong công nghệ thực phẩm, sử dụng làm thức ăn hoặc trong quá trình lên men. Nấm còn được dùng để sản xuất chất kháng sinh, hoóc môn trong y học và nhiều loại enzyme. Tuy vậy, nhiều loại nấm lại có chứa các chất hoạt động sinh học được gọi là mycotoxin như ancaloit và polyketit-là những chất độc đối với động vật lẫn con người. Một số loại nấm được sử dụng để kích thích hoặc dùng trong các nghi lễ truyền thống với vai trò tác động lên trí tuệ và hành vi của con người. Vài loại nấm có thể gây ra các 14 Đồ án tốt nghiệp chứng bệnh cho con người và động vật, cũng như bệnh dịch cho cây trồng, mùa màng và có thể gây tác động lớn lên an ninh lương thực và kinh tế. Nấm mốc (hay còn gọi là vi nấm) là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản, là tế bào không có diệp lục tố, thường sinh sản thông qua bào tử hoặc sống dị dưỡng (hoại sinh, kí sinh, cộng sinh), quá trình sinh sản có thể là vô tính nhay hữu tính.Vách tế bào chủ yếu là chitin, có hoặc không có cenllulose và một số thành phần khác có hàm lượng thấp. Nấm mốc thường thường phát triển dưới dạng sợi đa bào gọi là sợi nấm (hyphae) tạo hệ sợi (mycelium). Có 2 loại sợi: Sợi nấm dinh dưỡng: nằm trong lớp môi trường, làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng cho toàn bộ hệ nấm. Sợi nấm khí sinh: thường nhô ra môi trường, giữ vai trò sinh sản (tạo bào tử). 1.1.2. Độc tố nấm 1.1.2.1. Các loại độc tố do nấm tiết ra Độc tố nấm mốc (mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa đạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối với động vật có vú, cá, gia cầm và con người. Theo Nguyễn Thị Hiền (2009) hiện nay có khoảng 300 loài độc tố được phát hiện và nghiên cứu. Tuy nhiên chỉ có khoảng 20 loài độc tố có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng và liên quan đến an toàn thực phẩm. Được tạo bởi năm chi nấm là Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaría và Claviceps, chúng bao gồm: - Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2), ochratoxin A, stermatocystin, acid cyclopianxoic. - Các độc tố của Penicillium: Pautulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A và axit cyclopianzoic toxin, fumonisin, moniliformin, diacetocyscirpenon. - Các độc tố của Fusarium: deoxynivalenon, nivalenon, zearalenon, T-2 toxin. - Các độc tố của Alternaria: Acid tenuazoic, alternarion, methyl ether alternarion. - Các độc tố của Claviceps: Các alkaloid của nấm cựa gà Một số độc tố gây hội chứng chảy máu, triệu chứng ngưng kết hồng cầu hay hiện tượng tiêu máu rất nguy hiểm thường gặp ở động vật và n...us, chế phẩm EM có vai trò cải tạo đất và không gây ô nhiễm, ức chế một số vk gây bệnh trên các loài thuỷ hải sản. Ngoài ra còn được ứng dụng trong bảo quản hạt giống do sự phát triển của nấm mốc như: bắp, đậu phộng,. 1.2.9. Hoạt tính sinh học Các vi khuẩn lactic (LAB) có thể sản xuất một số chất kháng sinh như acid lactic và reuterin, ngoài ra còn có các acid hữu cơ, peroxit hydro, bacteriocin kháng khuẩn và các loại peptide kháng nấm. LAB đã được biết đến trong nhiều năm và đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất của một loạt các thực phẩm lên men. Lợi ích sức khỏe của LAB được biết là ảnh hưởng tích cực nhất định trong đường tiêu hóa của con người (Cogan và cộng sự năm 1995, Hafidh và cộng sự, 2010). 1.2.9.1. Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic Giống Lactobacillus đã được nghiên cứu là có hoạt tính kháng nấm khi đánh giá bằng khảo nghiệm thạch lớp phủ chống lại loạt các nấm hư hỏng. Hoạt động kháng nấm của L.coryniformis cornyformis subsp ổn định khi bị nung nóng ở nhiệt độ cao và độ pH 3-4,5 (Magnusson và Schnurer, 2001). Hầu hết các nghiên cứu khả năng kháng nấm của LAB là do việc sản xuất một loại protein kháng nấm hoặc hợp chất proteinaceous và một số các LAB như L.Plantarum và L.Sanfrancisco đặc biệt sản xuất acid hữu cơ với các đặc tính kháng nấm (Corsetti và cộng sự năm 1998; Lavermicocca và cộng sự, 2003.). Hiện nay, hợp chất bảo quản sinh học (biopreservative) duy nhất - nisin có thể được thêm vào thực phẩm sản phẩm của vi khuẩn acid lactic (Theo Gardiner và cộng sự, 2000; Corcoran và cộng sự, 2004.) 33 Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.2. Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998) Hợp chất được xác định Nguồn sản xuất 4-hydroxy-phenyllacticacid Lactobacillus plantarum 3-phenyllacticacid 21B 3-hydroxydecanoicacid Lactobacillus plantarum 3-hydroxydodecanoicacid MILAB14 3-hydroxytetradecanoicacid 3-hydroxy-5-cis – dodecenoicacid Cyclo(Gly-Leu) methylhydantoin Lactobacillus plantarum mevalonolactone VTTE-78076 Caproic-, propionic-, buturic-, acetic-, Lactibacillus formicand n- valeric acid. sanfranciscensis CB1 Roy và cộng sự đã phân lập được 2100 khuẩn lạc lactic từ phô mai cũ và sữa trâu sống, đã cho thấy hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI và phân lập nhiều nhất vi khuẩn Lactococcus subsp CHD-28.3 có hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI, A.flavus NCIM 555, A.parasiticus NCIM 898 và Fusarium sp.. Nấm Aspergillus IARI được xem là chất cảm ứng cho chủng lactic này (Roy và cộng sự, 1996). Chi Lactobacillus thường được phân lập và nghiên cứu nhiều nhất. Các chủng kháng nấm được phân lập từ các sản phẩm khác nhau như bột nhào chua (Corsetti và cộng sự, 1996), xúc xích (Coloretti và cộng sự, 2007), thức ăn ủ chua (Magnusson và Schnurer, 2001), phô mai và sữa (Roy và cộng sự, 1996). Vi khuẩn lactic có khả năng sản xuất một lượng lớn các sản phẩm có tính acid và các hợp tố khác với hoạt tính kháng nấm mạnh. Đa số các chất kháng nấm được xác định đều có trọng lượng phân tử thấp bao gồm acid hữu cơ, H2O2, hợp chất proteinaceous, acid béo hydroxyl, 34 Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.3. Các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic có tính kháng sinh. (Holzapfel và cộng sự, 1995) Sản phẩm Các sinh vật chính Acid hữu cơ Acid lactic Vi khuẩn gram âm, 1 vài loài nấm Acid acetic Nấm men, nấm, vi khuẩn gây thối rữa H2O2 Sinh vật gây bệnh đặc biệt trong thức ăn giàu protein Hệ thống Vi khuẩn gây bệnh lactoperosidase với (sữa và các sản phẩm H2O2 làm từ sữa) Enzyme Isozyme Vi khuẩn gram dương Reuterin(3-OH-propionaldehyde) Nấm mốc, nấm men Diacetyl Vi khuẩn gram âm Acid béo Các loại vi khuẩn khác nhau Nisin Một số loài vi khuẩn lactic, vi khuẩn gram dương, các thể nội Bacteriocin bào tử 1 số loại khác Vi khuẩn gram dương Ngoài sự ức chế tăng trưởng thực tế của nấm, LAB cũng có thể ức chế sản phẩm đặc biệt của độc tố nấm mốc (Theo Gourama và Bullerman, 1997) hoặc làm bất động độc tố thông qua liên kết với bề mặt của chúng (Theo El-Nezami và cộng sự, 2004). Các hợp chất kháng nấm và phương thức hoạt động: Chất ức chế tăng trưởng nấm có tầm quan trọng cả trong việc kiểm soát tác nhân gây bệnh của con người và 35 Đồ án tốt nghiệp động vật, và trong công tác phòng chống nấm mọc trong thực phẩm và các vật liệu khác. Các phương thức hoạt động của kháng sinh chống nấm hiện nay là rất quan trọng cho sự ức chế nấm. Nhiều chất trong số các chất này được dành riêng cho sử dụng lâm sàng nhưng một số đang được sử dụng trong sự kiểm soát của nấm gây bệnh thực vật. Thuốc kháng sinh được xác định là chất được sản xuất bởi các vi sinh vật có tác dụng diệt hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật khác ở nồng độ thấp. 1.2.9.2. Khả năng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn lactic LAB cũng ức chế sự phát triển của ci sinh vật có hại gây thối rửa thong qua các sản phẩm chuyển hoá như hydrogen peroxide, carbon dioxide, diacetyl và đặc biệt là bacteriocin. - Bacteriocin: Bacteriocin là protein có hoạt tính sinh học do vi khuẩn tiết ra, có thể tiêu diệt hoặc ức chế sự tăng trưởng của các vi khuẩn khác có quan hệ họ hàng với chúng (Theo Hikmate Abriouel, 2007). Bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn, được sản sinh ra bởi nhiều nhóm vi khuẩn đa dạng, có thể khác nhau bởi phương thức và phổ hoạt động, phân tử lượng, đặc điểm sinh hóa và nguồn gốc gene (Theo Klaenhamme, 1993). Ưu điểm của bacteriocin là có hoạt tính kháng khuẩn cao ngay cả khi ở nồng độ rất thấp. Tuy nhiên, bacteriocin thường có phổ kháng khuẩn hẹp hơn kháng sinh. Khác với chất kháng sinh, bacteriocin thường được dùng trong thực phẩm và không có ảnh hưởng độc lên tế bào nhân chuẩn còn chất kháng sinh chỉ được dùng trong y tế và có ảnh hưởng độc lên tế bào nhân chuẩn. Trên thế giới bacteriocin được sản xuất bằng công nghệ lên men vi sinh bởi vi khuẩn lactis. Bacteriocin còn có một số hạn chế như: ít được biết đến hơn chất bảo quản hoá học. Bị thoái biến nhanh chóng bởi các enzyme phân giải protein. Bacteriocin được ứng dụng: Bổ sung bacteriocin tinh chế hay bán tinh chế như là các chất bảo quản thực phẩm, dùng màng polyethylen hoạt tính bacteriocin cho đóng gói thực phẩm. 36 Đồ án tốt nghiệp - Sản phẩm chuyển hoá của LAB sử dụng để chống lại các vi sinh vật gây thối rữa và chức năng hoá có thể ức chế vi sinh vật của chúng được tóm tắt như sau: Bảng 1.4 Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB. (Holzapfel và cộng sự, 1995) Sản phẩm Các sinh vật ảnh hưởng Acid lactic Vi khuẩn gram âm, 1 vài loài nấm Acid acetic Nấm men, nấm, vi khuẩn gây thối rửa Sinh vật gây bệnh, đặc biệt trong thức ăn H2O2 giàu protein Vi khuẩn gây bệnh (sữa và các sản phẩm Hệ thống lactoperoxidase với H O 2 2 làm từ sữa) Lysozyme Vi khuẩn gram dương Reuterin (3-OH- propoonaldehyde) Nấm mốc, nấm men Diacetyl Vi khuẩn gram âm Acid béo Các loại vi khuẩn khác nhau 37 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm nghiên cứu Phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại học Công nghệ TP HCM. 2.2. Thời gian thực hiện Đề tài được thực hiện từ ngày 15/2/2017 đến ngày 15/7/2017 2.3. Vật liệu 2.3.1. Nguồn phân lập - Nem chua: thu mua ở cơ sở sản xuất nem lai vung Nguyễn Bình, Đồng Tháp. - Kim chi: mua từ Công ty cổ phần Kim&Kim, Tân Bình, TpHCM. - Giống nấm: Chủng nấm Aspergillus sp.CĐP1 và Aspergillus sp.CĐP2, từ phòng thí nghiệm vi sinh Trường ĐH Công Nghệ TpHCM. 2.3.2. Thiết bị và dụng cụ - Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 genesis (USA) - Máy đo pH Horiba (Nhật Bản) - Autoclave (Memmmert – Đức) - Kính hiển vi quang học Olympus – Nhật Bản - Cân phân tích, cân kỹ thuật - Tủ cấy vô trùng, tủ ấm (Memmmert – Đức), tủ sấy (Memmmert – Đức) - Lò vi sóng (Microwave) - Pipetman 100 – 1000 µl - Bếp điện - Bông thấm nước, bông không thấm nước - Giấy lọc, lame, lamelle - Các dụng cụ thí nghiệm: becher, erlen, que cấy, đèn cồn, bình định mức, ống đong, pipet,.... 2.3.3. Hóa chất - Các hóa chất dùng để pha các loại thuốc nhuộm, thuốc thử, chất chỉ thị màu: 38 Đồ án tốt nghiệp • Crystal violet • Ethanol 95% • Ammonoxalat • Iod • KI • Thuốc nhuộm Safranin • Chất chỉ thị màu Bromoresol green • Malachite green • Methylene blue • Ethanol • Phenolphthalein • NaOH • H2O2 - Các hóa chất dùng để pha môi trường MRS Broth. Đây là môi trường tổng hợp đặc hiệu cho việc nuôi cấy vi khuẩn lactic, tên đầy đủ là: de Man, Rogosa and Sharpe (Robinson, 2007) • Peptone 10g • Meat extract 10g • Yeast extract 5g • D- Glucose 20g • Natri acetate 5g • Diamoni citrate 2g • MgSO4.7H2O 0,1g • MnSO4.4H2O 0,05g • K2HPO4 2g • Tween 80 1ml • Nước cất 1000ml Điều chỉnh pH = 6.5 ± 0.2 tại 25oC. Khử trùng ở 121 oC trong 15 phút. 39 Đồ án tốt nghiệp - Các hóa chất dùng để pha môi trường MRS Agar (de Man, Rogosa and Sharpe (Robinson, 2007)) • Peptone 10g • Meat extract 10g • Yeast extract 5g • D- Glucose 20g • Natri acetate 5g • Diamoni citrate 2g • MgSO4.7H2O 0,1g • MnSO4.4H2O 0,05g • K2HPO4 2g • Tween 80 1ml • Nước cất 1000ml • Agar 20g Điều chỉnh pH = 6.5 ± 0.2 tại 25oC. Khử trùng ở 121oC trong 15 phút - Các hóa chất pha môi trường PDA (Potato Detrose Agar) nuôi cấy nấm mốc. - Các hóa chất pha môi trường Casein, Gelatin, Chitin, Tinh bột. 2.3.4. Giống nấm Các loại nấm CĐP1, CĐP2 do phòng thí nghiệm vi sinh thuộc khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại học Công nghệ TP.HCM cung cấp. 2.4. Phương pháp luận Để thực hiện được đề tài tôi chọn các nguồn vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống chứa vi khuẩn sống phân lập ra các chủng vi khuẩn lactic và thông qua các kiểm tra sinh lý, sinh hóa, so sánh với khóa phân loại của Bergey để phân loại, định danh chúng đến cấp giống. Lựa chọn nguồn phân lập là các loại thực phẩm lên men truyền thống như kim chi, nem chua, vì các nguồn này chứa các vi khuẩn sống và có tiềm năng kháng nấm cao. 40 Đồ án tốt nghiệp Phân lập vi khuẩn lên men lactic bằng môi trường chuyên biệt có bổ sung NaN3 và khẳng định khả năng sinh acid bằng chỉ thị màu, dựa vào khoá phân loại của Bergey’s Manual (Theo Benson Lab Manual, 2001) và định danh sơ bộ vi khuẩn lên men lactic. Tuyển choṇ các chủng vi khuẩn phân lập qua khảo sát sinh khối và acid tổng tạo thành. Tuyển choṇ các chủng vi khuẩn phân lập kháng nấm in vitro của các chủng phân lập áp dụng phương pháp đối kháng trực tiếp (cấy 2 đường vi khuẩn). Tuyển choṇ các chủng vi khuẩn phân lập qua kháng nấm in vivo qua thí nghiệm bảo quản đậu phộng.. . 41 Đồ án tốt nghiệp Kim chi Nem chua Tăng sinh trong MRS Broth MRS có bổ sung 0,02% NaN3 để ức chế vi khuẩn hiếu khí Cấy truyền sang MRS Agar bắt buộc Kiểm tra chủng thuần khiết trên MRS Agar có chứ chất chỉ thị Bromogresol gre egreen Phân lập giống thuần khiết Khảo sát hình thái, Khảo sát khả năng Khảo sát kháng Khảo sát kháng sinh lý, sinh hóa tăng trưởng và lên nấm in vitro nấm in vivo men lactic - Phương pháp kháng trực - Nhuộm Gram. tiếp cấy 2 đường vi khuẩn - Nhuộm bào tử. - Sinh enzyme ngoại bào - Catalase. - Khả năng lên men đường. - Khả năng di động. Chủng chọn lọc Hình 2.1 Sơ đồ phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn lactic 42 Đồ án tốt nghiệp 2.5. Phương pháp thí nghiệm 2.5.1. Thu thập mẫu Mẫu là những sản phẩm lên men truyền thống có chứa vi sinh vật sống được dùng làm nguồn phân lập vi khuẩn lactic gồm: kim chi, nem chua. Bảng 2.1: Kí hiệu các nguồn phân lập Sản phẩm Kí hiệu các nguồn phân lập Kim chi KC Nem chua NC 2.5.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic 2.5.2.1. Tăng sinh Mục đích: Làm cho các vi khuẩn có trong mẫu phát triển lại bình thường do chúng có thể bị suy yếu hoặc bị ức chế trong quá trình bảo quản mẫu. Trong đó các vi khuẩn lactic có khả năng phát triển nhiều hơn vì ta đã sử dụng môi trường chọn lọc đối với vi khuẩn lactic. Đồng thời đây cũng là bước đầu giúp ta thu được lượng sinh khối để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Tiến hành: Môi trường dùng để tăng sinh là môi trường MRS Broth có bổ 1210C sung 0.02% NaN3, hút 10ml cho vào mỗi ống nghiệm đem hấp khử trùng ở trong 15 phút. Với các mẫu là dạng rắn như: cơm mẻ, nem chua, dưa cải chua: Nghiền nhỏ 2g rồi cho vào ống nghiệm chứa MRS Broth. Quấn màng PVC (màng bọc thực phẩm) quanh nắp ống nghiệm cho kín rồi đem ủ ở 37oC trong 24 giờ. 43 Đồ án tốt nghiệp 2.5.2.2. Phân lập Mục đích: Tách các khuẩn lạc rời rạc khác nhau, giúp chọn lựa được các chủng vi khuẩn đồng nhất. Tiến hành: Các mẫu sau khi tăng sinh đem pha loãng tới độ pha loãng là 10 -9. Sử dụng môi trường phân lập là môi trường MRS bổ sung 2% agar. Các mẫu sau khi tăng sinh sẽ được đem pha loãng bằng nước muối vô trùng, mỗi ống chứa 9ml. + Hút 1 ml mẫu vào ống nước muối vô trùng thứ nhất có độ pha loãng 10 -1. + Hút 1 ml hỗn hợp nước muối và mẫu ở ống thứ nhất cho vào ống thứ hai có độ pha loãng 10-2. - Tiếp tục thao tác tương tự để có độ pha loãng là 10-9. Hình 2.2: Cách pha loãng mẫu Lấy các ống nghiệm có độ pha loãng từ 10-5 ÷ 10-9, mỗi ống lấy 0,1ml cho lên bề mặt thạch chứa trong đĩa petri. Tương ứng với mỗi độ pha loãng sẽ thực hiện trên hai đĩa petri. Dùng que trang, trang điều canh trường với điều kiện không làm rách bề mặt thạch và trang thật đều nhằm tách khuẩn lạc riêng lẻ. Ghi độ pha loãng tương ứng lên nắp đĩa petri đưa vào nuôi trong tủ ấm ở 37oC trong 24 giờ, các khuẩn lạc riêng lẻ vào các ống thạch nghiêng đã được chuẩn bị sẵn. Nuôi vi khuẩn đã được cấy chuyền sang ống thạch nghiêng trong tủ ấm ở nhiệt độ 35 – 37oC, thời gian từ 24 giờ, bảo quản ống giống ở nhiệt độ 4oC. 44 Đồ án tốt nghiệp 2.5.2.3. Kiểm tra chủng thuần khiết. Sau khi cấy chuyền nhiều lần sang môi trường MRS Agar, các chủng được phân lập tiếp tục cấy chuyền sang môi trường MRS Agar có bổ sung 0.018g/l chất chỉ thị màu Bromocresol green khi đó nếu vi khuẩn sinh acid sẽ làm giảm pH và môi trường sẽ chuyển từ xanh dương sang vàng nhằm tăng khả năng chọn lọc được các chủng vi khuẩn lactic. 2.5.3. Khảo sát hình thái, sinh lý, sinh hoá. 2.5.3.1. Nhuộm Gram Mục đích: Giúp ta phân loại được 2 nhóm lớn: Vi khuẩn Gram dương (Gram-positive) bắt màu tím và Vi khuẩn Gram âm (Gram-negative) bắt màu hồng. Ngoài ra nhuộm Gram cho phép ta quan sát rõ hình thái tế bào hơn so với soi vi khuẩn sống. Tiến hành: Sử dụng phương pháp Hucker cải tiến - Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa miếng lame, làm khô trong không khí. - Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần. - Nhuộm bằng dung dịch Crystal violet trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. - Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, tẩy cồn 960 trong 20 giây, sau đó rửa lại bằng nước cất rồi thấm khô. - Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 30 giây, rửa nước, để khô trong không khí. - Soi kính: dùng vật kính dầu 100x. Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ. 2.5.3.2. Thử Catalase Mục đích: Kiểm tra khả năng phân hủy H2O2 tạo ra O2 của vi sinh vật nhờ sản sinh enzyme catalase. 45 Đồ án tốt nghiệp Các chủng vi khuẩn thu được sau bước nhuộm gram được tiến hành thử nghiệm Catalase. Trong thí nghiệm này, chỉ có những chủng vi khuẩn cho catalase âm tính là có khả năng là vi khuẩn lactic. Tiến hành: - Chuẩn bị dung dịch H2O2 nồng độ 3-10%, nhỏ một giọt lên phiến kính. - Dùng đầu que cấy lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hoá (24 giờ) hòa vào 1 giọt H2O2 trên phiến kính. Kết quả: Nếu thấy sủi bọt là dương tính, không sủi bọt là âm tính. Có thể nhỏ trực tiếp dung dịch H2O2 lên khuẩn lạc trên thạch đĩa cũng cho kết quả tương tự. 2.5.3.3. Nhuộm bào tử Mục đích: Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử (dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipid). Đầu tiên xử lý để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và acid. Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh. Tẩy màu tế bào chất của tế bào và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đó tế bào chất của bào tử và tế bào chất của tế bào bắt màu phân biệt. Trong đó bào tử sẽ có màu xanh và tế bào có màu hồng. Các vi khuẩn Gram dương thu được từ bước nhuộm Gram sẽ tiếp tục kiểm tra khả năng sinh bào tử. Sử dụng sinh khối vi khuẩn khi đã già (khoảng 7 ngày) để nhuộm bào tử. Từ kết quả thu được ta loại bỏ các chủng có bào tử, do LAB là vi khuẩn Gram dương không sinh bào tử. Tiến hành: dùng phương pháp Schaeffer-Fulton - Nuôi cấy vi khuẩn ở 37oC, 5 – 7 ngày. - Làm vết bôi và cố định tế bào trên lame như đối với nhuộm Gram. - Nhuộm bằng dung dịch malachite green trong 10 phút, đặt trên 1 cốc nước đang đun sôi, rửa nước, thấm khô. - Nhuộm lại bằng dung dịch Safranine trong 30-90 giây, rửa nước, thấm khô. - Soi kính: dùng vật kính dầu 100x Kết quả: Bào tử có màu lục, tế bào sinh dưỡng có màu đỏ. 46 Đồ án tốt nghiệp 2.5.3.4. Thử nghiệm khả năng sinh acid Mục đích: Kiểm tra khả năng sinh acid của vi khuẩn trong quá trình trao đổi chất của chúng. Trong thí nghiệm này các chủng cho kết quả không sinh bào tử thu được từ các bước trên sẽ được kiểm tra với môi trường Phenol Red Lactose Broth nhưng thay thế chất chỉ thị Phenol red thành Bromocresol green. Các chủng phân lập là vi khuẩn lactic khi chúng tạo acid lactic và làm đổi màu chất chỉ thị từ màu xanh dương xuống màu vàng. Tiến hành: - Chuẩn bị môi trường Bromocresol green lactose broth sau đó phân phối vào các ống nghiệm, mỗi ống 5ml môi trường. - Sau đó cấy sinh khối VK vào mỗi ống nghiệm - Ủ ở 370C trong 1-3 ngày. Kết quả: - Nếu có acid lactic sẽ làm giảm pH dung dịch sẽ chuyển sang màu vàng. 2.5.3.5. Thử nghiệm khả năng di động Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật trong môi trường thạch mềm MRS Agar với (0,5 – 0,7% agar). Vì vi khuẩn lactic không có khả năng di động, chỉ mọc theo đường cấy thẳng đứng trong ống chứa môi trường thạch mềm và không làm đục môi trường xung quanh nên trong thử nghiệm này, ta loại bỏ được các vi khuẩn di động không phải là vi khuẩn lactic, chúng sẽ mọc lan ra khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh. Tiến hành: - Dùng que cấy có đầu nhọn cấy vi khuẩn theo kiểu chích sâu vào môi trường thạch bán lỏng. - Đặt ống nghiệm thẳng đứng, ủ ở 370C và quan sát sau 1-3 ngày, có khi lâu hơn. 47 Đồ án tốt nghiệp Kết quả: Vi khuẩn mọc lan rộng quanh vết cấy tức là chúng có khả năng di động. Vi khuẩn chỉ mọc theo vết cấy tức là chúng không có khả năng di động. 2.5.3.6. Thử nghiệm khả năng lên men đường và khả năng sinh khí Mục đích: kiểm tra xem vi sinh vật có khả năng lên men các loại đường nào. Các loại đường được sử dụng là: glucose, lactose, saccharose và xylose. Kết quả từ thí nghiệm này giúp ta định danh đến cấp giống các chủng vi khuẩn lactic phân lập được dựa theo khóa phân loại của Bergey. Sử dụng Bromocresol green làm chỉ thị màu. Tiến hành: - Môi trường MRS broth với lượng đường glucose lần lượt thay thế bằng các loại đường cần kiểm tra. - Phân môi trường vào các ống nghiệm, mỗi ống 10ml Đặt vào mỗi ống nghiệm 1 ống nhỏ (ống Durham) lộn ngược đầu để hứng khí CO2 sinh ra nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường. Khử trùng trong 15 phút ở 1210C. Đường xylose, và saccharose cần khử trùng riêng rồi mới bổ sung vào môi trường. - Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá vào các ống nghiệm, đặt ở 37 0C, theo dõi hiện tượng sinh acid sau 1-3 ngày. Trường hợp dùng nút bông cần quấn bằng màng PVC (màng bọc thực phẩm) để bịt kín miệng ống nghiệm. Kết quả: - Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường (sinh acid) chất chỉ thị Bromocresol green sẽ chuyển màu vàng. - Nếu có bọt khí bên trong ống durham thì chủng vi khuẩn đó lên men có sinh khí - Đối với những ống nghiệm không có bọt khí trong (ống durham) thì ta cần kiểm tra lại bằng cách đốt đỏ que cấy và đặt sát bề mặt môi trường, nếu thấy có bọt khí nổi lên thì chủng vi khuẩn đó cũng lên men có sinh khí. 48 Đồ án tốt nghiệp 2.6. Khảo sát khả năng tăng trưởng và lên men lactic. Mục đích: Xác định hàm lượng acid tổng bằng phương pháp quy về acid lactic để xác định hàm lượng acid lactic sinh ra từ các chủng vi khuẩn lactic thử nghiệm nhằm chọn ra chủng vi khuẩn lactic mạnh nhất để kháng nấm. Hàm lượng acid trong dịch lên men có thể định lượng bằng dung dịch kiềm chuẩn nhờ có sự đổi màu của dung dịch thuốc thử Phenolphatalein. Tiến hành: Định lượng acid lactic bằng dung dịch NaOH 0.1N với chất chỉ thị Phenolphtalein 1% . Cho vào bình tam giác 10ml dịch lên men vi khuẩn, thêm 3-5 giọt Phenolphtalein và chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0.1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt. Sử dụng máy đo pH để chuẩn độ đến khi pH đạt 8.0 và ghi nhận kết quả. Kết quả: Hàm lượng acid tổng được quy về acid lactic theo công thức: × . × × % Acid lactic= × VNaOH 0 1 90 100 Trong đó: 1000 10 VNaOH: Thể tích NaOH 0.1 N chuẩn độ được 10: Số ml dịch Dx được đem đi chuẩn độ 0.1: Nồng độ NaOH dùng để chuẩn độ 1000: Hệ số chuyển đổi ra gam 90: Mỗi ml NaOH chuẩn độ tương đương với 90 mg acid lactic trong dịch Dx 2.7. Khảo sát khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic bằng phương pháp in vitro. 2.7.1. Khảo sát khả năng đối kháng nấm trực tiếp theo phương pháp in vitro. Để xác định khả năng đối kháng nấm của các vi khuẩn có lợi thì ta sẽ sử dụng phương pháp đối kháng trực tiếp (Dual Culture Two Line Culture Method) trên môi trường rắn theo mô tả của Brunner và cộng sự (2005): Đầu tiên, ta cấy khoanh thạch của nấm chỉ thị (đường kính 7mm) và đặt vào tâm đĩa petri có môi trường thạch đã chuẩn bị, sau đó ủ 24h cho nấm phát triển. Tiếp theo, ta 49 Đồ án tốt nghiệp tiến hành cấy 2 vạch vi khuẩn chỉ thị vào đĩa và đặt cách ngoài mép đĩa 1,5cm (2 vạch chủng vi khuẩn phải nằm đối diện nhau qua tâm đĩa trên cùng một đường kính). Cuối cùng, ủ các đĩa thạch trong 72h, nhiệt độ phòng. Sau đó, xác định tỉ lệ ức chế.  Quy trình thí nghiệm Hoạt hóa chủng nấm mốc trên Hoạt hóa chủng vi khuẩn môi trường PDB LAB trên môi trường MRS- Tăng sinh chủng nấm mốc trên môi trường PDB Tăng sinh chủng vi khuẩn LAB trên môi trường MRS- Cấy vào đĩa chứa môi b th trường PDA Đặt thạch nấm Đặt thạch nấm Lặp lại Ria 2 ĐC âm 3 lần đường VK Ủ 72h ở 370C Đo đường kính ức chế nấm Tỷ lệ ức chế nấm bệnh Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. 50 Đồ án tốt nghiệp  Thuyết minh quy trình: - Mục đích: Khảo sát khả năng kháng các chủng nấm mốc của 11 chủng vi khuẩn vừa phân lập theo phương pháp vạch 2 đường vi khuẩn. - Tiến hành: . Chuẩn bị môi trường vi khuẩn: • Hoạt hóa 11 chủng vi khuẩn vừa phân lập: hoạt hóa trong môi trường MRS broth ở 370C trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi trường MRS broth ở 370C 24h. . Chuẩn bị chủng nấm để đối kháng: • Hoạt hóa chủng nấm mốc có sẵn trong phòng thí nghiệm: hoạt hóa trong môi trường PDB ở 370C trong. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi trường PDB ở 370C trong 24h. • Cấy điểm vào đĩa petri chứa môi trường PDA và ủ 72h ở nhiệt độ phòng. . Chuẩn bị môi trường khảo sát đối kháng: • Môi trường MRS cải tiến được hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Sau đó, phối vào đĩa petri đã được hấp khử trùng, mỗi đĩa 15ml. • Khi thạch đã đông, ta tiến hành đục thạch ở đĩa nấm mốc rồi đặt vào tâm các đĩa. Mỗi đĩa lặp lại 3 lần. Sau đó, ủ 24h ở nhiệt độ phòng. • Sau 24h, ta tiến hành cấy 2 vạch vi khuẩn cách ngoài mép đĩa 1,5cm (2 vạch chủng vi khuẩn phải nằm đối diện nhau qua tâm đĩa trên cùng một đường kính) cần thử đối kháng vào. Mẫu đối chứng chỉ cấy nấm vào tâm đĩa, không cấy 2 vạch vi khuẩn lên. Tiếp tục ủ 72h ở nhiệt độ phòng. • Quan sát, đọc kết quả đối kháng dựa vào sự phát triển của nấm sau 3 ngày. 51 Đồ án tốt nghiệp • Ta tiến hành đo tỉ lệ ức chế theo hình và công thức phần trăm: Hình 2.4: Mô tả cách đo đường kính vòng ức chế của phương pháp vạch 2 đường vi khuẩn Trong đó: Dđc: đường kính (cm) đĩa nấm đối chứng Dtn: đường kính (cm) đĩa thí nghiệm Số liệu được xử lí bằng phần mền SAS 9.4 52 Đồ án tốt nghiệp 2.7.2. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào  Quy trình thí nghiệm Đĩa petri chứa Chủng vi môi trường thử khuẩn LAB Hút Tăng sinh trong môi Đục thạch 0.1 trường MRS-broth ml Ủ 370C 48h Thuốc thử Đo đường kính vòng Hình 2.5: Sơ đồ thí nghiệm khả năng sinh enzyme của các chủng LAB. a) Enzyme protease  Thuyết minh quy trình: - Nguyên tắc: Thí nghiệm theo phương pháp của Egorow NX (1976), dựa vào khả năng khuếch tán của các enzyme được bơm vào lỗ thạch, phân giải protein của các chủng VSV bằng cách đo kích thước vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc. - Tiến hành: + Chuẩn bị dịch enzyme, tiến hành tăng sinh các chủng vi khuẩn trong môi trường MRS-broth ủ ở 370C trong 24 giờ. + Hút 0,1 ml dịch tăng sinh cho vào các lỗ thạch đã đục sẵn. 53 Đồ án tốt nghiệp + Ủ ở nhiệt độ phòng 48 giờ, quan sát vòng phân giải. + Nếu xảy ra hiện tượng phân giải protein thì sẽ hình thành vòng phân giải trong suốt xung quanh giếng thạch khi cho TCA 10% vào và ngược lại thì không. + Khả năng phân giải protein được đánh giá qua hiệu số (D-d) mm. D-d càng lớn thì khả năng phân giải protein càng cao. Trong đó : D : là đường kính vòng phân giải (mm) d : là đường kính giếng thạch (mm) b) Enzyme amylase  Thuyết minh quy trình: - Nguyên tắc: Thí nghiệm theo phương pháp của Egorow NX (1976), dựa vào khả năng khuếch tán của các enzyme được bơm vào lỗ thạch, phân giải amylase của các chủng VSV bằng cách đo kích thước vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc. - Tiến hành: + Chuẩn bị dịch enzyme, tiến hành tăng sinh các chủng vi khuẩn trong môi trường MRS-broth ủ ở 370C trong 24 giờ. + Hút 0,1 ml dịch tăng sinh cho vào các lỗ thạch đã đục sẵn. + Ủ ở nhiệt độ phòng 48 giờ, quan sát vòng phân giải. + Nếu xảy ra hiện tượng phân giải amylase thì sẽ hình thành vòng phân giải trong suốt xung quanh giếng thạch khi cho Lugol vào và ngược lại thì không. + Khả năng phân giải protein được đánh giá qua hiệu số (D-d) mm. D-d càng lớn thì khả năng phân giải protein càng cao. Trong đó : D: là đường kính vòng phân giải (mm) d: là đường kính giếng thạch (mm) c) Enzyme chitinnase  Thuyết minh quy trình: 54 Đồ án tốt nghiệp - Nguyên tắc: Thí nghiệm theo phương pháp của Egorow NX (1976), dựa vào khả năng khuếch tán của các enzyme được bơm vào lỗ thạch, phân giải chitinnase của các chủng VSV bằng cách đo kích thước vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc. - Tiến hành: + Chuẩn bị dịch enzyme, tiến hành tăng sinh các chủng vi khuẩn trong môi trường MRS-broth ủ ở 370C trong 24 giờ. + Hút 0,1 ml dịch tăng sinh cho vào các lỗ thạch đã đục sẵn. + Ủ ở nhiệt độ phòng 48 giờ, quan sát vòng phân giải. + Nếu xảy ra hiện tượng phân giải chitinnase thì sẽ hình thành vòng phân giải trong suốt xung quanh giếng thạch khi cho Lugol vào và ngược lại thì không. + Khả năng phân giải chitin được đánh giá qua hiệu số (D-d) mm. D-d càng lớn thì khả năng phân giải chitin càng cao. Trong đó: D: là đường kính vòng phân giải (mm) d: là đường kính giếng thạch (mm) 2.8. Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic trong bảo quản hạt. 2.8.1. Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 102bào tử/g đậu phộng: 55 Đồ án tốt nghiệp Hạt đậu phộng Khử trùng bề mặt bằng cồn 700 Tráng nước cất Để ráo Ngâm trong dịch nuôi cấy VK trong 30 phút Để ráo ở nhiệt độ phòng Cho 12g hạt Huyền phù nấm mốc mật Chai thủy tinh 100ml vô trùng độ 102/12g Bảo quản ở nhiệt độ phòng Theo dõi theo thời gian Hạt đậu phộng sau khi được sàng lọc, loại bỏ các hạt nứt, bể hay héo, được ngâm trong cồn 70° để khử trùng bề mặt và rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 lần. Sau đó để ráo. Cứ mỗi 12g đậu phộng, sẽ được ngâm trong 50ml dung dịch nuôi cấy VK được chuẩn bị như sau: 56 Đồ án tốt nghiệp Đối chứng 1 50ml nước cất Đối chứng 2 50ml cardabenzim 0.4% Thí nghiệm 1 50ml dịch nuôi cấy vi khuẩn Hạt đậu phộng sau khi ngâm được để khô ở nhiệt độ phòng, kế đến phối vào các chai thuỷ tinh vô trùng và được cảm nhiễm 0,1ml huyền phù nấm mốc mật độ 102. Theo dõi từng ngày ở nhiệt độ thường. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. 2.8.2. Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 101bào tử/g đậu phộng: 57 Đồ án tốt nghiệp Hạt đậu phộng Khử trùng bề mặt bằng cồn 700 Tráng nước cất Để ráo Ngâm trong dịch nuôi cấy VK trong 30 phút Để ráo ở nhiệt độ phòng Cho 12g hạt Huyền phù nấm mốc mật Chai thủy tinh 100ml vô trùng độ 101/12g Bảo quản ở nhiệt độ phòng Theo dõi theo thời gian Hạt đậu phộng sau khi được sàng lọc, loại bỏ các hạt nứt, bể hay héo, được ngâm trong cồn 70° để khử trùng bề mặt và rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 lần. Sau đó để ráo. Cứ mỗi 12g đậu phộng, sẽ được ngâm trong 50ml dung dịch nuôi cấy VK được chuẩn bị như sau: 58 Đồ án tốt nghiệp Đối chứng 1 50ml nước cất Đối chứng 2 50ml cardabenzim 0.4% Thí nghiệm 1 50ml dịch nuôi cấy vi khuẩn Hạt đậu phộng sau khi ngâm được để khô ở nhiệt độ phòng, kế đến phối vào các...ẩn. Ống a: Vi khuẩn có khả năng di động. Ống b: Vi khuẩn không có khả năng di động. Ống c: Vi khuẩn phân lập được không có khả năng di động. Bảng 3.2 Trình bày hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các vi khuẩn phân lập. Kí hiệu Quan sát hình thái Mô tả hình Quan sát nhuộm Gram Mô tả chủng khuẩn lạc thái khuẩn hình thái phân lập lạc tế bào KC211 Khuẩn lạc Vi khuẩn to,tròn không hình que đều, có tâm ngắn sáng ,màu trắng đục 67 Đồ án tốt nghiệp KC1A Khuẩn lạc Vi khuẩn tròn, nhỏ,lồi, hình que rìa đều, trắng ngắn đục. KC1B Khuẩn lạc Vi khuẩn tròn đều, to hình que ,lồi, rìa đều, ngắn trắng đục. KC106 Khuẩn lạc Vi khuẩn tròn, to, rìa hình cầu đều, trắng nhỏ đục KC242 Khuẩn lạc Vi khuẩn vừa, tròn đều, hình que lồi, rìa đều. ngắn 68 Đồ án tốt nghiệp KC13 Khuẩn lạc Vi khuẩn tròn đều, nhỏ hình que ,lồi, rìa đều, nhỏ nhẵn bóng, trắng đục NC2 Khuẩn lạc Vi khuẩn vừa, tròn, hình que trắng đục, lồi, nhỏ. mép gợn sóng NC12 Khuẩn lạc Vi khuẩn vừa,không hình que tròn, trắng dài đục, lồi, mép có răng cưa, tâm đen. NC15 Khuẩn lạc Vi khuẩn vừa, trắng hình que đục, lồi,bầu, ngắn rìa đều. NC172 Khuẩn lạc Vi khuẩn vừa, trắng hình que đục, lồi, có nhỏ tâm đen, không tròn đều, mép hơi gợn sóng. 69 Đồ án tốt nghiệp NC412 Khuẩn lạc Vi khuẩn tròn đều, nhỏ, hình que lồi, trắng đục, ngắn rìa đều. Bảng 3.3. Trình bày tóm tắt về các chủng phân lập có đặc điểm đặc trưng cho vi khuẩn lên men lactic. Catalas Gram Sinh Sin Di Lên Lên Lên Lên Sin e acid h động men men men men h bào Sacch Xylo Lactos Glu khí tử arose se e cose KC21 - + + - - + + + + - 1 KC1A - + + - - + + + + - KC1B - + + - - + + + + - KC10 - + + - - + + + + - 6 KC24 - + + - - + + + + - 2 KC13 - + + - - + + + + - NC2 - + + - - + + + + - NC12 - + + - - + + + + - NC15 - + + - - + + + + - NC17 - + + - - + + + + - 2 NC41 - + + - - + + + + + 2 70 Đồ án tốt nghiệp 3.2. Khảo sát khả năng tăng trưởng và lên men lactic. Các vi khuẩn vừa phân lập thuộc nhóm vi khuẩn len men lactic, khả năng lên men lactic được thể hiện qua sinh khối tạo thành (độ đục đo ở bước sóng 600nm) và acid tổng trong dịch nuôi cấy. Để thử nghiệm môi trường khảo sát kháng nấm tốt, người thực hiện đã tiến hành thử nghiệm xác định hàm lượng acid tổng và lượng sinh khối để tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có lượng sinh khối lớn, acid lactic cao, có hoạt tính kháng nấm tốt. Kết quả hàm lượng % acid lactic của 11 chủng vi khuẩn lactic được nuôi cấy trong môi trường MRS broth ở 370C trong 24 giờ. Bảng 3.4: Bảng xử lý số liệu khả năng sinh acid và giá trị OD của 11 chủng vi khuẩn phân lập. Chủng %Acid tổng TB OD hiệu chỉnh TB A A KC1A 3.94 ±0.03 7.59 ±0.16 KC1B 3.88AB±0.04 6.32C±0.07 KC13 2.33F±0.06 6.98B±0.1 B E KC106 3.87 ±0.04 2.24 ±0.02 KC211 2.94E ±0.02 7.12B±0.05 KC242 1.26I±0.02 3.2D±0.27 J E NC2 0.97 ±0.01 2.07 ±0.05 NC12 1.42H±0.03 6.26C±0.07 G D NC15 1.75 ±0.05 2.93 ±0.05 NC172 3.58D±0.07 7.8A±0.1 NC412 3.72C±0.04 7.55A±0.5 (Kết quả được so sánh theo cột sau khi xử lý ANOVA với độ tin cậy 95%) 71 Đồ án tốt nghiệp 4.5 9 4 8 3.5 7 3 6 nh ng chỉ tổ 2.5 5 u u 2 4 hiệ Acid % 1.5 3 OD 1 2 0.5 1 0 0 KC1A KC1B KC13 KC106 KC211 KC242 NC2 NC12 NC15 NC172 NC412 ACID OD Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn %Acid tổng và sinh khối của 11 chủng vi khuẩn sau 24h nuôi cấy. Sau khi xử lý ANOVA (phân tích phương sai) với độ tin cậy là 95%, người thực hiện đề tài phân các chủng vi khuẩn lactic phân lập được thành 4 nhóm dựa theo các bảng 3.4 và hình 3.11 Bảng 3.5: Phân nhóm các chủng vi khuẩn lactic Chủng vừa sinh Chủng sinh acid Chủng sinh acid Chủng vừa sinh acid mạnh vừa có mạnh nhưng có yếu nhưng có sinh acid yếu vừa có sinh khối mạnh sinh khối yếu khối mạnh sinh khối yếu KC1A KC106 NC12 KC242 KC1B KC13 NC2 KC211 NC15 NC172 NC412 72 Đồ án tốt nghiệp 3.3. Khảo sát khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic bằng phương phap in vitro. 3.3.1. Khảo sát khả năng kháng nấm trực tiếp của chủng vi khuẩn lactic. Theo một số nghiên cứu gần đây cho biết vi khuẩn lactic có khả năng kháng nấm nhờ sản xuất 1 số chất như acid hữu cơ và reuterin, các peptide, các enyzme để ức chế sự tăng trưởng của nấm hư hỏng trong các sản phẩm thực phẩm và thức ăn. Nhằm mục đích tuyển chọn ra các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm tốt thì người thực hiện đề tài đã chọn ra phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và kết quả đạt được cũng phần nào nói lên được khả năng ức chế nấm bệnh của vi khuẩn lactic phân lập. Khả năng đối kháng nấm của vi khuẩn lactic sau 3 ngày thể hiện khác nhau và được trình bày đại diện qua chủng mạnh nhất qua các hình. Khả năng đối kháng được xác định dựa trên đường kính vòng ức chế của vi khuẩn đối với nấm mốc so với đối chứng và được trình bày trên hình và bảng dưới. 73 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.10. Khả năng đối kháng nấm CĐP2 của chủng vi khuẩn phân lập. Hình 3.11. Khả năng đối kháng nấm CĐP1 của chủng vi khuẩn phân lập Bảng 3.6 .Thống kê số liệu phần trăm tỉ lệ ức chế của 11 chủng vi khuẩn phân lập được với 2 chủng nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. Vi khuẩn CĐP1 CĐP2 KC1A 42.581B±1.117 39.394A±1.389 F F KC1B 19.355 ±1.118 23.333 ±1.893 KC13 44.516AB±1.118 30.909CD±1.818 AB DE KC106 43.871 ±1.676 27.879 ±1.389 KC211 23.872E±1.118 34.545B±1.819 KC242 29.033D±1.117 41.818A±1.818 NC2 36.194C±0.968 28.485DE±1.05 NC12 35.484C±1.117 26.667EF±1.05 C BC NC15 35.484 ±1.117 33.333 ±1.389 NC172 36.129C±0.968 4.849G±1.05 NC412 45.807A±0.968 33.03BC±1.05 (Kết quả được so sánh theo cột sau khi xử lý ANOVA với độ tin cậy 95%) 74 Đồ án tốt nghiệp 50 45 40 35 30 25 CĐP1 20 CĐP2 15 10 5 0 KC1A KC1B KC13 KC106 KC211 KC242 NC2 NC12 NC15 NC172 NC412 Hình 3.12. Biểu đồ thể hiện phần trăm tỉ lệ ức chế nấm của các chủng vi khuẩn. Chủng có khả năng đối kháng nấm CĐP1 mạnh nhất: NC412. Hình 3.13. Khả năng đối kháng CĐP1 của NC412 sau 3 ngày. Các chủng có khả năng đối kháng nấm CĐP2 mạnh nhất: KC242 và KC1A. Hình 3.14. Khả năng đối kháng CĐP2 của KC1A sau 3 ngày. 75 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.15. Khả năng đối kháng CĐP1 của KC242 sau 3 ngày. Sau khi xử lý ANOVA với độ tin cậy là 99%, thì người thực hiện đề tài dựa theo hình 3.12 và bảng 3.5 đã lựa chọn các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm: − Chủng nấm CĐP1:  Μạnh nhất: NC412 (45.807%)  Yếu nhất: KC1B (19.355%) − Chủng nấm CĐP2:  Mạnh nhất: KC1A (39.394%), KC242 (41.818%)  Yếu nhất: NC172 (4.849%) 3.3.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào. Bảng 3.7. Kết quả khả năng sinh enzyme của các chủng vi khuẩn Đường kính vòng phân giải (D-d) mm trên môi trường tương ứng. Amylase Protease Chitinase KC1A 0 0 0,63±0,16 KC1B 0 0,66±0,08 0 KC211 0 0,275±0,04 0 KC13 1,7±0,087 0 0 KC106 0 0,53±0,05 0 KC242 0 0,275±0,04 1,3±0,18 NC2 0 0 0 NC12 0 0 0,98±0,23 NC15 0 0 0 NC172 0 0 0 76 Đồ án tốt nghiệp NC412 0 0,5±0,07 0 Hình 3.16. Khả năng phân giải Tinh bột của chủng vi khuẩn KC13 Hình 3.17. Khả năng phân giải Protein của chủng vi khuẩn KC1B Hình 3.18. Khả năng phân giải Chitin của chủng vi khuẩn KC1A 77 Đồ án tốt nghiệp Sau khi khảo sát khả năng đối kháng nấm và khả năng sinh enzyme ngoại bào của 11 chủng vi khuẩn, người thực hiện đề tài nhận thấy các chủng có khả năng kháng nấm mạnh nhất đa số đều có khả năng sinh enzyme nhằm phân giải các môi trường khác nhau điển hình như đối với chủng KC1A có tỉ lệ ức chế nấm CĐP1 mạnh nhất đồng thời có thể sinh enzyme protease phân giải cơ chất trên môi trường Gelatin. Như vậy, có thể giả định rằng khả năng sinh enzyme của vi khuẩn cũng ảnh hưởng phần nào đến việc ức chế nấm của vi khuẩn. Ta suy ra rằng khả năng kháng nấm còn phụ thuộc vào các yếu tố khác có thể là hợp chất thứ cấp của vi khuẩn. 3.4. Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 102 bào tử/g đậu phộng: Để khảo sát khả năng kháng nấm in vivo, người thực hiện đề tài đã lựa chọn mô hình bảo quản hạt đậu phộng trong canh trường nuôi cấy của vi khuẩn lactic. Sử dụng 11 chủng vi khuẩn đã phân lập được để ứng dụng bảo quản. Mẫu Thành phần Đối chứng âm ( ĐC -) Nước cất Đối chứng dương ( ĐC +) Carbenzim 0.4% Thí nghiệm Canh trường nuôi cấy Bảng 3.8. Khả năng kháng nấm CĐP1 của Canh trường nuôi cấy các chủng vi khuẩn ứng dụng trên đậu phộng với mật độ nhiễm 102 bào tử/g đậu phộng. Ngày 1 2 3 7 Lần 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 ĐC(-) - - - + + + + + + + + + ĐC(+) - - - - - - - - - - - - KC211 - - - + - - + + + + + + KC1A - - - - - - - - - + + + KC1B - - - + + + + + + + + + KC13 - - - + + + + + + + + + KC106 - - - + + + + + + + + + KC242 - - - + + + + + + + + + NC2 - - - + + + + + + + + + NC12 - - - - - - + + + + + + NC15 - - - + + + + + + + + + NC172 - - - + + + + + + + + + 78 Đồ án tốt nghiệp NC412 - - - + + + + + + + + + Chú thích: - : không nhiễm +: bị nhiễm Ngày đầu tiên, tất cả các chai đều chưa có hiện tượng mọc nấm. Ngày thứ 2, những tơ nấm nhỏ li ti bắt đầu mọc trong các bình đối chứng (nước cất) và các bình của 8 chủng vi khuẩn, ngoài ra thì đã có 1 bình của chủng KC211 đã xuất hiện tơ nấm. Các bình còn lại chưa có hiện tượng mọc nấm. Ngày thứ 3, thì 2 bình còn lại của chủng KC211 đã có tơ nấm phát triển song song với tơ nấm thì bào tử cũng đã xuất hiện, theo đó thì có tất cả các bình của chủng NC12 đều có sự phát triển của nấm. Các bình còn lại chưa có hiện tượng mọc nấm. Ngày 7, ngoài các chai của đối chứng (carbezim) ra thì các chai của chủng vi khuẩn KC1A đã bị nhiễm nấm. Hình 3.19 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7. Từ trên xuống: ĐC (-) – Đối chứng nước cất, ĐC (+) – Đối chứng Carbezim, Chủng VK KC211, Chủng VK KC1A. 79 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.20 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7. Từ trên xuống: Chủng VK KC1B, KC13, KC106, KC242. 80 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.21 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7. Từ trên xuống: Chủng VK NC2, NC12, NC172, NC412. 81 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.9. Khả năng kháng nấm CĐP2 của Canh trường nuôi cấy các chủng vi khuẩn ứng dụng trên đậu phộng với mật độ nhiễm 102 bào tử/g đậu phộng. Ngày 1 2 3 7 13 19 Lần 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 ĐC(-) - - - + + + + + + + + + + + + + + + ĐC(+) - - - - - - - - - - - - + + + + + + KC211 - - - - + + + + + + + + + + + + + + KC1A - - - - - - - - - + + - + + - + + + KC1B - - - + + + + + + + + + + + + + + + KC13 - - - + + + + + + + + + + + + + + + KC106 - - - + + + + + + + + + + + + + + + KC242 - - - + + + + + + + + + + + + + + + NC2 - - - + + + + + + + + + + + + + + + NC12 - - - + + + + + + + + + + + + + + + NC15 - - - + + + + + + + + + + + + + + + NC172 - - - + + + + + + + + + + + + + + + NC412 - - - + + + + + + + + + + + + + + + Chú thích: - : không nhiễm +: bị nhiễm Ngày đầu tiên, tất cả các chai đều chưa có hiện tượng mọc nấm. Ngày thứ 2, những tơ nấm nhỏ li ti bắt đầu mọc trong các bình đối chứng (nước cất) và các bình của 8 chủng vi khuẩn, ngoài ra thì đã có 1 bình của chủng KC211 đã xuất hiện tơ nấm. Các bình còn lại chưa có hiện tượng mọc nấm. Ngày thứ 3, thì 2 bình còn lại của chủng KC211 đã có tơ nấm phát triển song song với tơ nấm thì bào tử cũng đã xuất hiện, theo đó thì có tất cả các bình của chủng NC12 đều có sự phát triển của nấm. Các bình còn lại chưa có hiện tượng mọc nấm. Ngày 7, đã có 2 chai của chủng KC1A đã bị nhiễm nấm, còn với đối chứng dương(carbezim) thì vẫn chưa có dấu hiệu bị nhiễm. Ngày 13, tất cả các chai mẫu đối chứng đã bị nhiễm nấm, song song đó thì chỉ còn duy nhất 1 chai của chủng KC1A vẫn chưa có dấu hiệu nhiễm nào. Ngày 19, 1 chai còn lại của chủng KC1A đã lên nấm. 82 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.22 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7, ngày 13, ngày 19. Từ trên xuống: ĐC (-) – Đối chứng nước cất, ĐC (+) – Đối chứng Carbezim, Chủng VK KC211, Chủng VK KC1A. 83 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.23 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7, ngày 13, ngày 19. Từ trên xuống: Chủng VK KC1B, KC13, KC106, KC242. 84 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.24 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7, ngày 13, ngày 19. Từ trên xuống: Chủng VK NC2, NC12, NC172, NC412. 85 Đồ án tốt nghiệp Kết quả từ bảng 3.8 và 3.9 cho thấy, chủng vi khuẩn KC1A có thời gian bảo quản lâu hơn các chủng còn lại. Số ngày cao nhất lên đến 19 ngày đối với chủng nấm CĐP2 và 7 ngày đối với chủng nấm CĐP1. Có sự tương quan giữa thí nghiệm đối kháng in vitro và in vivo. 86 Đồ án tốt nghiệp 3.5. Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 101 bào tử/g đậu phộng: Để khảo sát khả năng kháng nấm in vivo, người thực hiện đề tài đã lựa chọn mô hình bảo quản hạt đậu phộng trong canh trường nuôi cấy của vi khuẩn lactic. Sử dụng 11 chủng vi khuẩn đã phân lập được để ứng dụng bảo quản. Mẫu Thành phần Đối chứng âm ( ĐC -) Nước cất Đối chứng dương ( ĐC +) Carbenzim 0.4% Thí nghiệm Canh trường nuôi cấy Bảng 3.10. Khả năng kháng nấm CĐP1 của Canh trường nuôi cấy các chủng vi khuẩn ứng dụng trên đậu phộng với mật độ nhiễm 101 bào tử/g đậu phộng. Ngày 1 2 3 4 6 12 Lần 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 ĐC(-) - - - + + + + + + + + + + + + + + + ĐC(+) - - - - - - - - - - - - + + + + + + KC211 - - - - - - - - - + + + + + + + + + KC1A - - - - - - - - - + + + + + + + + + KC1B - - - - - - - - - + + + + + + + + + KC13 - - - - - - - - - + - - + + - + + - KC106 - - - - - - + + + + + + + + + + + + KC242 - - - - - - - - - + + + + + + + + + NC2 - - - + + + + + + + + + + + + + + + NC12 - - - - - - + + + + + + + + + + + + NC15 - - - - - - - - - + + + + + + + + + NC172 - - - - - - - - - + - - + - - + - - NC412 - - - - - - - - - + + + + + + + + + Chú thích: - : không nhiễm +: bị nhiễm Ngày đầu tiên, tất cả các chai đều chưa có hiện tượng mọc nấm. Ngày thứ 2, những tơ nấm nhỏ li ti bắt đầu mọc trong các bình đối chứng (nước cất) và các 3 bình của chủng vi khuẩn NC2. Các bình còn lại chưa có hiện tượng mọc nấm. 87 Đồ án tốt nghiệp Ngày thứ 3, thì tất cả các bình của chủng NC12 và KC106 đã có tơ nấm phát triển. Các bình còn lại chưa có hiện tượng mọc nấm. Ngày 4, đã có 3 chai của các chủng KC211, KC1A, KC1B, KC242, NC15, NC412 đã có dấu hiệu nhiễm nấm và 1 chai của 2 chủng KC13 và NC172 cũng đã xuất hiện tơ nấm. Hiện còn lại các chai đối chứng dương là chưa bị nhiễm nấm. Ngày 6, tất cả các chai mẫu đối chứng dương đều đã bị nhiễm nấm, thêm 1 chai của chủng KC13 đã mọc nấm. Hiện nay còn lại 1 chai của chủng KC13 và 2 chai của chủng NC172. Ngày 12, các chai vẫn chưa có dấu hiệu mọc nấm. 88 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.11. Khả năng kháng nấm CĐP2 của Canh trường nuôi cấy các chủng vi khuẩn ứng dụng trên đậu phộng với mật độ nhiễm 101 bào tử/g đậu phộng. Ngày 1 2 3 4 6 12 Lần 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 ĐC(-) - - - + + + + + + + + + + + + + + + ĐC(+) - - - - - - - - - - - - + + + + + + KC211 - - - - - - + + + + + + + + + + + + KC1A - - - - - - - - - - + + - + + - + + KC1B - - - - - - - - - - + + - + + - + + KC13 - - - - - - - - - + + + + + + + + + KC106 - - - - - - + + + + + + + + + + + + KC242 - - - - - - - - - + + + + + + + + + NC2 - - - + + + + + + + + + + + + + + + NC12 - - - - - - + + + + + + + + + + + + NC15 - - - - - - - - - + + + + + + + + + NC172 - - - - - - - - - + - - + + - + + - NC412 - - - - - - - - - + + + + + + + + + Chú thích: - : không nhiễm +: bị nhiễm Ngày đầu tiên, tất cả các chai đều chưa có hiện tượng mọc nấm. Ngày thứ 2, những tơ nấm nhỏ li ti bắt đầu mọc trong các bình đối chứng (nước cất) và các 3 bình của chủng vi khuẩn NC2. Các bình còn lại chưa có hiện tượng mọc nấm. Ngày thứ 3, thì tất cả các bình của chủng NC12 và KC106 đã có tơ nấm phát triển. Các bình còn lại chưa có hiện tượng mọc nấm. Ngày 4, đã có 3 chai của các chủng KC211, KC242, NC15, NC412, 2 chai của 2 chủng KC1A và KC1B và 1 chai của chủng NC172 đã có dấu hiệu nhiễm nấm. Hiện còn lại 3 chai của đối chứng dương chưa bị nhiễm. Ngày 6, tất cả các chai mẫu đối chứng dương đã bị nhiễm nấm, song song đó thì có 1 chai của chủng NC172 đã dấu hiệu nhiễm. Ngày 12, hiện các chai còn lại của 3 chủng KC1A, KC1B và NC172 vẫn chưa lên nấm. 89 Đồ án tốt nghiệp Kết quả từ bảng 3.10 và 3.11 cho thấy, các chủng vi khuẩn KC1A, KC1B, KC13 và NC172 có thời gian bảo quản lâu hơn các chủng còn lại. Trong đó, đối với chủng nấm CDP1 thì 2 chủng KC13, NC172 có số ngày bảo quản cao nhất lên đến 12 ngày còn đối với chủng nấm CĐP2 thì 3 chủng KC1A, KC1B và NC172 có số ngày cũng là 12 ngày giống với chủng nấm CĐP1. Có sự tương quan giữa thí nghiệm đối kháng in vitro và in vivo điển hình là chủng KC1A. Nhìn chung thì các chủng có khả năng kháng nấm yếu ở thí nghiệm in vitro đều có thể bảo quản hạt được lâu hơn với mật độ cảm nhiễm là 101 bào tử/ g đậu phộng. Bảng 3.12. Thời gian bắt đầu xuất hiện tơ nấm (ngày) của 11 chủng vi khuẩn với mật độ cảm nhiễm 101bt/g đậu phộng và 102bt/g đậu phộng. Mật độ cảm nhiễm 102bt/g Mật độ cảm nhiễm 101bt/g Chủng đậu phộng đậu phộng CĐP1 CĐP2 CĐP1 CĐP2 KC1A 7 7 4 4 KC1B 2 2 4 4 KC13 2 2 4 4 KC106 2 2 3 3 KC211 2 2 4 3 KC242 2 2 4 4 NC2 2 2 2 2 NC12 3 2 3 3 NC15 2 2 4 4 NC172 2 2 4 4 NC412 2 2 4 4 90 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.13. So sánh khả năng tăng trưởng, lên men lactic, kháng nấm in vitro và in vivo của các chủng vi khuẩn phân lập. Chủng KC KC KC KC KC KC NC NC NC NC NC 1A 1B 13 106 211 242 2 12 15 172 412 OD600nm 7.59 6.32 6.98 3.87 7.12 3.2 2.07 6.26 2.93 7.8 7.55 %Acid 3.94 3.88 2.33 2.24 2.94 1.26 0.97 1.42 1.76 3.58 3.72 lactic CĐP1 42.6 19.4 44.5 43.9 23.9 29 36.2 35.5 35.5 36.1 45.8 CĐP2 39.4 23.3 30.9 27.9 34.5 41.8 28.5 26.7 33 4.8 33 Ngày tơ 4 4 4 3 4 4 2 3 4 4 4 nấm xuất hiện (CĐP1) Ngày tơ 4 4 4 3 3 4 2 3 4 4 4 nấm xuất hiện (CĐP2) 91 Đồ án tốt nghiệp Dịch nuôi cấy vi khuẩn với mật độ cảm nhiễm 101 bào tử/g đậu phộng đối với nấm CDP1. Hình 3.25. Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày (Từ trái sang: ngày 1, 2, 3, 4, 6 và 12 ngày. Từ trên xuống: ĐC (-) – Đối chứng nước cất, ĐC (+) – Đối chứng Carbezim, Chủng VK KC1A và chủng NC412. 92 Đồ án tốt nghiệp Dịch nuôi cấy vi khuẩn với mật độ cảm nhiễm 101 bào tử/g đậu phộng đối với nấm CDP2 Hình 3.26. Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày (Từ trái sang: ngày 1, 2, 3, 4, 6 và 12 ngày. Từ trên xuống: ĐC (-) – Đối chứng nước cất, ĐC (+) – Đối chứng Carbezim, Chủng VK KC1A và chủng NC412. Sau các thử nghiệm khảo sát người thực hiện nhận thấy chủng vi khuẩn phân lập KC1A và NC412 có tiềm năng ức chế nấm sinh Aflatoxin cao nhất. 93 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kim chi phân lập được 6 chủng và từ nem chua phân lập được 5 chủng vi khuẩn vi khuẩn lên men lactic, trong đó 10 chủng vi khuẩn lên men lactic hình que và 1 chủng hình cầu, 10 chủng lên men đồng hình và 1 chủng lên men dị hình với khả năng lên men sinh acid lactic và tăng trưởng khác nhau. Khả năng kháng nấm in vitro của 11 chủng được xác định bằng phương pháp đối kháng trực tiếp bằng cách ria 2 đường vi khuẩn, cả 11 chủng đều thể hiện khả năng đối kháng nấm Aspergillus spp. sinh aflatoxin, trong đó chủng NC412 kháng nấm Aspergillus sp. CĐP1 mạnh nhất; chủng KC242 và KC1A kháng nấm Aspergillus sp. CĐP2 mạnh nhất. Các chủng có khả năng kháng nấm mạnh nhất đa số đều có khả năng sinh enzyme như chủng KC1A và NC412 có thể sinh enzyme protease, chủng KC242 sinh enzyme protease và chitinase. Trong số các chủng phân lập, chủng KC1A và NC412 phân lập từ kim chi và nem chua thể hiện khả năng kháng nấm và số ngày bảo quản đậu phộng cao nhất, ngoài ra còn thể hiện khả năng tăng trưởng, lên men lactic cũng như nồng độ acid lactic sau 24 giờ nuôi cấy trong môi trường MRS lỏng tốt nhất. 4.2 Kiến nghị Tiếp tục phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng nấm cao từ thực phẩm lên men truyền thống. Mở rộng thêm các chủng nấm chỉ thị Ứng dụng bảo quản trên nhiều loại hạt khác nhau. 94 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt: 1. Đậu Ngọc Hào, Lê Thị Ngọc Diệp (2003). Nấm mốc và độc tố aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi. NXB nông nghiệp. 2. Hoàng Quốc Khánh và cộng sự. Phân lập, định danh và xác định các chủng Lactobacillus có tiềm năng Probiotic từ người. Viện Sinh Học Nhiệt Đới. 3. Lưu Đại Kim Phượng (2016) “Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng nấm mốc sinh Aflatoxin Aspergillus spp.”. Trường Đại học Công nghệ TP.HCM. 4. Lê Ngô Vũ Phượng (2016) “Thử nghiệm các phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. đối với một số nấm mốc Aspergillus spp. sinh aflatoxin”. Trường Đại học Công nghệ TP.HCM. 5. Trần Lê Bích Trâm( 2016) “Khảo sát khả năng kháng nấm của hợp chất thứ cấp vi khuẩn lactic và ứng dụng trong bảo quản hạt đậu phộng”. Trường Đại học Công nghệ TP.HCM. 6. Nguyễn Thị Hiền, Phan Thị Kim, Trương Thị Hòa, Lê Thị Lan Chi, Vi sinh vật nhiễm tạp trong lương thực - thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội, 2009. 7. Nguyễn Lân Dũng, 2003, Vi sinh vật học, NXB nông nghiệp. Tài liệu Tiếng Anh: 8. Holzapfel, W. H., R. Geisen, and U. Schillinger. 1995. Biological preservation of foods with reference to protective cultures, bacteriocins and food- grade enzymes. 9. Scott, P.M. 1984. Effects of food processing on mycotoxins. J. Food Prot., 47(6): 489 10. Magnusson, J. and J. Schnurer. 2001. Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis strain Si3 produces a broad-spectrum proteinaceous antifungal compound. Appl Environ Microbiol 67(1):1-5 95 Đồ án tốt nghiệp 11. Corsetti, A., M. Gobbetti, J. Rossi, and P. Damiani. 1998. Antimould activity of sourdough lactic acid bacteria: identification of a mixture of organic acids produced by Lactobacillus sanfrancisco CB1. Applied Microbiology and Biotechnology 50(2):253-256. 12. Roy, U., V. K. Batish, S. Grover, and S. Neelakantan. 1996. Production of antifungal substance by Lactococcus lactis subsp. lactis CHD-28.3. International Journal of Food Microbiology 32(1-2):27-34 13. Corsetti, A., M. Gobbetti, and E. Smacchi. 1996. Antibacterial activity of sourdough lactic acid bacteria: isolation of a bacteriocin-like inhibitory substance from Lactobacillus sanfrancisco C57. Food Microbiology 13(6):447-456. 14. De Man, J.C., Rogosa, M. & Sharpe, M.E. (1960). A medium for the cultivation of Lactobacilli. Journal of Applied Bacteriology, 23, 130-135 Tài liệu Internet: https://vi.wikipedia.org/wiki/Nấm 96 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC PHỤ LỤC A Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các chủng vi khuẩn. Chủng vi Thử nghiệm khả năng di Thử nghiệm lên men đường khuẩn động KC211 KC1A KC1B 1 Đồ án tốt nghiệp KC106 KC242 KC13 2 Đồ án tốt nghiệp NC2 NC12 NC15 3 Đồ án tốt nghiệp NC172 NC412 4 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B Xử lý số liệu theo phần mềm SAS 9.4 Tỉ lệ ức chế nấm CĐP1 của 11 chủng vi khuẩn. Class Level Information Class Levels Values CHUNG 11 KC106 KC13 KC1A KC1B KC211 KC242 NC12 NC15 NC172 NC2 NC412 Number of Observations Read 33 Number of Observations Used 33 Dependent Variable: TYLEUCCHE Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 10 2242.614819 224.261482 171.79 <.0001 Error 22 28.719273 1.305422 Corrected Total 32 2271.334093 R-Square Coeff Var Root MSE TYLEUCCHE Mean 0.987356 3.219878 1.142550 35.48427 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F CHUNG 10 2242.614819 224.261482 171.79 <.0001 Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 22 Error Mean Square 1.305422 Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Critical Range 2.630 2.743 2.818 2.873 2.915 2.949 2.977 3.000 3.020 3.037 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N CHUNG A 45.8070 3 NC412 5 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N CHUNG A B A 44.5163 3 KC13 B A B A 43.8713 3 KC106 B B 42.5810 3 KC1A C 36.1293 3 NC172 C C 35.4840 3 NC15 C C 35.4840 3 NC12 C C 34.1940 3 NC2 D 29.0330 3 KC242 E 23.8717 3 KC211 F 19.3553 3 KC1B Tỉ lệ ức chế nấm CĐP2 của 11 chủng vi khuẩn. Class Level Information Class Levels Values CHUNG 11 KC106 KC13 KC1A KC1B KC211 KC242 NC12 NC15 NC172 NC2 NC412 Number of Observations Read 33 Number of Observations Used 33 Dependent Variable: TYLEUCCHE 6 Đồ án tốt nghiệp Source DF Sum of Mean Square F Value Pr > F Squares Model 10 2884.83465 288.483465 133.94 <.000 2 1 Error 22 47.383748 2.153807 Corrected 32 2932.21840 Total 0 R-Square Coeff Var Root MSE TYLEUCCHE Mea n 0.983840 4.978819 1.467585 29.47658 Source D Anova SS Mean F Value Pr > F F Square CHUN 10 2884.83465 288.48346 133.94 <.0001 G 2 5 Alpha 0.01 Error Degrees of 22 Freedom Error Mean Square 2.153807 Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Critical Range 3.378 3.523 3.619 3.690 3.744 3.788 3.824 3.854 3.879 3.901 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N CHUNG A 41.818 3 KC242 A A 39.394 3 KC1A B 34.545 3 KC211 B 7 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N CHUNG C B 33.333 3 NC15 C B C B 33.030 3 NC412 C C D 30.909 3 KC13 D E D 28.485 3 NC2 E D E D 27.879 3 KC106 E E F 26.667 3 NC12 F F 23.333 3 KC1B G 4.849 3 NC172 Od hieu chinh của 11 chủng vi khuẩn The SAS System 00:00 Wednesday, October 15, 2014 9 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values CHUNG 11 KC106 KC13 KC1A KC1B KC211 KC242 NC12 NC15 NC172 NC2 NC412 Number of Observations Read 33 Number of Observations Used 33 8 Đồ án tốt nghiệp The SAS System 00:00 Wednesday, October 15, 2014 10 The ANOVA Procedure Dependent Variable: OD_HIEUCHINH Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 10 162.6080663 16.2608066 457.88 <.0001 Error 22 0.7812907 0.0355132 Corrected Total 32 163.3893570 R-Square Coeff Var Root MSE OD_HIEUCHINH Mean 0.995218 3.451437 0.188449 5.460030 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F CHUNG 10 162.6080663 16.2608066 457.88 <.0001 The SAS System 00:00 Wednesday, October 15, 2014 11 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for OD_HIEUCHINH NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 22 Error Mean Square 0.035513 Critical Value of t 2.07387 Least Significant Difference 0.3191 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N CHUNG A 7.8030 3 NC172 A A 7.5860 3 KC1A A A 7.5537 3 NC412 B 7.1173 3 KC211 B 9 Đồ án tốt nghiệp B 6.9807 3 KC13 C 6.3150 3 KC1B C C 6.2647 3 NC12 D 3.2013 3 KC242 D D 2.9293 3 NC15 E 2.2433 3 KC106 E E 2.0660 3 NC2 %Acid tổng của 11 chủng vi khuẩn. The SAS System 00:00 Wednesday, October 15, 2014 13 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values CHUNG 11 KC106 KC13 KC1A KC1B KC211 KC242 NC12 NC15 NC172 NC2 NC412 Number of Observations Read 33 Number of Observations Used 33 The ANOVA Procedure Dependent Variable: ACID_TONG Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 10 41.87202424 4.18720242 2662.38 <.0001 Error 22 0.03460000 0.00157273 Corrected Total 32 41.90662424 R-Square Coeff Var Root MSE ACID_TONG Mean 0.999174 1.471609 0.039658 2.694848 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F CHUNG 10 41.87202424 4.18720242 2662.38 <.0001 10 Đồ án tốt nghiệp The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for ACID_TONG NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 22 Error Mean Square 0.001573 Critical Value of t 2.07387 Least Significant Difference 0.0672 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N CHUNG A 3.94333 3 KC1A A B A 3.88333 3 KC1B B B 3.87000 3 KC106 C 3.71667 3 NC412 D 3.57667 3 NC172 E 2.94000 3 KC211 F 2.32667 3 KC13 G 1.74667 3 NC15 H 1.41667 3 NC12 I 1.25667 3 KC242 J 0.96667 3 NC2 11 Đồ án tốt nghiệp Phụ lục C Hình ảnh đối kháng nấm bệnh Aspergillus sp. của đại diện một số chủng vi khuẩn lactic bằng phương pháp đối kháng in vitro Chủng NC15 đối kháng nấm – Từ trên xuống: CĐP1, CĐP2 Chủng KC13 đối kháng nấm – Từ trên xuống: CĐP1, CĐP2 Chủng NC12 đối kháng nấm – Từ trên xuống: CĐP1, CĐP2 12