Đồ án Phân lập và tuyển chọn lactobacillus sp từ thực vật ủ chua có tiềm năng sản xuất probiotic

ác số liệu, kết quả nêu trong đồ án này đều trung thực và bắt nguồn từ thực tiễn nghiên cứu. Các tài liệu tham khảo đều có nguồn gốc xác thực. Ngƣời thực hiện Trần Quang Huy Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Hoàng Quốc Khánh, ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn,chia sẻ những khó khăn và chỉnh sửa đồ án cho em trong thời gian em thực hiện đồ án tại viện sinh học nhiệt đới TP Hồ Chí Minh. Xin gửi lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Hoài Hƣơng, ngƣời đã động viên và giúp em có thêm động lực để hoàn thành đồ án này. Xin cảm ơn thầy Ngô Đức Duy, đã nhiệt tình hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong quá trình định danh bằng sinh học phân tử. Xin cảm ơn các anh, chị và các đồng nghiệp tại viện sinh học nhiệt đới đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đồ án. Xin cảm ơn viện sinh học nhiệt đới TP Hồ Chí Minh, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em thực hiện các thí nghiệm để hoàn thành đồ án này. Xin cảm ơn trƣờng ĐH Công nghệ TP Hồ Chí Minh nói chung và các thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm và Môi Trƣờng nói riêng đã tận tình dạy dỗ, cung cấp các kiến thức vững vàng cho em trong bốn năm học tập tại trƣờng. Cuối cùng xin cảm ơn ba mẹ đã sinh ra con và cho con điều kiện để học tập để trở thành ngƣời nhƣ hôm nay. Xin chân thành cảm ơn! Ngƣời thực hiện Trần Quang Huy Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC Phiếu giao đề tài ĐATN. Lời cam đoan. Lời cảm ơn. Mục lục. Danh mục các từ viết tắt. Danh mục các bảng. Danh mục biểu đồ, đồ thị, sơ đồ, hình ảnh. MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3 1.1 Tổng quan về rau quả lên men .......................................................................... 3 1.2 Tổng quan về probiotic ..................................................................................... 4 1.3 Lịch sử nghiên cứu về probiotic ........................................................................ 7 1.4 Các vi sinh vật probiotic thƣờng gặp ................................................................ 9 1.4.1 Chi Lactibacillus ........................................................................................ 9 1.4.2 Chi Bifidobacterium ................................................................................. 10 1.4.3 Chi Sacharomyces .................................................................................... 10 1.4.4 Chi Bacillus .............................................................................................. 11 1.5 Hƣớng dẫn lựa chọn các chủng probiotic ....................................................... 13 1.5.1 Chi, loài và chủng probiotic ..................................................................... 14 1.5.2 Các thử nghiệm invitro để sàng lọc chủng có tiềm năng probiotic ......... 14 I Đồ án tốt nghiệp 1.5.3 Nguồn phân lập probiotic ......................................................................... 15 1.5.4 Probiotic an toàn ...................................................................................... 15 1.6 Vi khuẩn lactic ................................................................................................ 17 1.6.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic ................................................................... 17 1.6.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, phân loại...................................................... 17 1.6.3 Chi Lactobacillus ..................................................................................... 18 1.6.4 Quá trình lên men lactic ........................................................................... 22 CHƢƠNG 2.VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 24 2.1 Vật liệu ............................................................................................................ 24 2.1.1 Nguyên liệu .............................................................................................. 24 2.1.2 Hóa chất ................................................................................................... 24 2.1.3 Thiết bị và dụng cụ ................................................................................... 24 2.1.4 Môi trƣờng nuôi cấy ................................................................................. 25 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................. 27 2.2.1 Phƣơng pháp phân lập và tuyển chọn ...................................................... 27 2.2.2 Phƣơng pháp quan sát hình thái khuẩn lạc ............................................... 27 2.2.3 Phƣơng pháp xác định khả năng sinh acid lactic ..................................... 27 2.2.4 Phƣơng pháp nhuộm Gram ...................................................................... 27 2.2.5 Phƣơng pháp khảo sát khả năng di động ................................................. 28 2.2.6 Phƣơng pháp xác định kiểu hô hấp .......................................................... 28 2.2.7 Phƣơng pháp thử nghiệm hoạt tính catalase ............................................ 29 2.2.8 Phƣơng pháp xác định hoạt tính protease ................................................ 29 II Đồ án tốt nghiệp 2.2.9 Phƣơng pháp xác định hoạt tính amylase ................................................ 30 2.2.10 Phƣơng pháp xác định khả năng kháng khuẩn....................................... 30 2.2.11 Phƣơng pháp định danh bằng sinh học phân tử ..................................... 31 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .............................................................. 33 3.1 Phân lập LAB từ nguồn thực vật ủ chua ......................................................... 33 3.2 Đặc điểm sinh học của 2 chủng LAB đƣợc tuyển chọn .................................. 36 3.2.1 Đặc điểm hình thái của 2 chủng CP1 và MC3. ........................................ 36 3.2.2 Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 2 chủng CP1 và MC3. ..................... 37 3.3 Phổ kháng khuẩn của hai chủng lactic nghiên cứu ......................................... 40 3.4 Định danh chủng Lactobacillus CP1và Lactobacillus MC3 bằng sinh học phân tử ................................................................................................................... 42 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 45 4.1 Kết luận ........................................................................................................... 45 4.2 Kiến nghị ......................................................................................................... 45 Tài liệu tham khảo Phụ lục III Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VK Vi khuẩn DC Đối chứng G- Gram âm G+ Gram dƣơng KS Kháng sinh LAB Lactic Acid Bacteria (Vi khuẩn lactic) MT Môi trƣờng MRS De Man - Rogosa – Sharpe ST Sinh trƣởng VSV Vi sinh vật IV Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Các vi sinh vật có tiềm năng probiotic ........................................................... 12 Bảng 1.3 Phân loại Lactobacillus dựa vào sản phẩm .................................................... 19 Bảng 3.1. Kết quả hình thái khuẩn lạc của 11 chủng đƣợc phân lập.............................. 32 Bảng 3.2. Kết quả xác định hình thái tế bào ................................................................... 34 Bảng 3.3. Tổng hợp các đặc điểm sinh lý sinh hóa của hai chủng nghiên cứu ......... 38-39 Bảng 3.4. Kết quả thử phổ kháng khuẩn của hai chủng Lactobacillus CP1 và Lactobacillus MC3 .......................................................................................................... 41 V Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1 Kim Chi và một số loại rau củ lên men truyền thống ....................................... 4 Hình 1.2. Hƣớng dẫn lựa chọn chủng probiotic của FAO & WHO ............................... 16 Hình 1.3 Quá trình lên men lactic .................................................................................. 22 Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của một số mẫu sau khi làm thuần ................................. 33 Hình 3.2. Định tính aicid lactic bằng thuốc thử Uphemen ............................................. 35 Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc (A) và hình thái tế bào (B) của chủng CP1 nhuộm Gram trên kính hiển vi x100 ........................................................................................... 36 Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc (A) và hình thái tế bào (B) của chủng MC3 nhuộm Gram trên kính hiển vi x100 ........................................................................................... 36 Hình 3.5 Cây phát sinh loài của hai chủng Lactobacillus CP1 và Lactobacillus MC3 và các loài có liên quan .......................................................................................... 43 . VI Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Ngày nay, cùng với sự phát triển của nền kinh tế xã hội, khi chất lƣợng cuộc sống không ngừng đƣợc nâng cao, vấn đề chăm sóc sức khỏe con ngƣời ngày càng đƣợc chú trọng. Do vậy, việc tạo ra các chế phẩm sinh học nhằm cải thiện và tăng cƣờng sức khỏe con ngƣời đƣợc tạo ra ngày càng nhiều. Một trong những chế phẩm sinh học đó chính là probiotic, chúng đƣợc tạo ra từ việc ứng dụng vi sinh vật có lợi bổ sung vào hệ tiêu hóa của con ngƣời. Việc sử dụng vi sinh vật probiotic thực tế đã mang lại nhiều ảnh hƣởng tích cực đối với sức khỏe con ngƣời, thông qua các đặc tính probiotic vốn có của chúng. Điển hình là điều trị các chứng bệnh rối loạn đƣờng tiêu hóa, khắc phục một số hạn chế do việc điều trị kháng sinh dài ngày, giúp đồng hóa lactose trong sữa uống đối với các bệnh nhân không có khả năng dung nạp lactose trong sữa. Bên cạnh đó, chúng còn có khả năng ảnh hƣởng đến hoạt tính biến dƣỡng nhƣ đồng hóa cholesterol, tạo ra các vitamin và giải phóng các enzyme có lợi giúp cho việc tiêu hóa thức ăn dễ dàng hơn, hấp thu các chất dinh dƣỡng cần thiết, khử các chất có khả năng gây ung thƣ và các hợp chất độc hại, kích thích điều hòa hệ miễn dịch, tăng khả năng đề kháng cho cơ thể vật chủ,... Những chủng vi sinh vật probiotic thƣờng đƣợc nghiên cứu và ứng dụng chủ yếu là vi khuẩn lactic (LAB), nhờ chúng có các đặc tính ƣu việt phù hợp cho việc sử dụng tạo chế phẩm probiotic cho ngƣời cũng nhƣ vật nuôi. Những đặc tính đó là: khả năng sống sót và phát triển tốt trong điều kiện bất lợi ở đƣờng tiêu hóa của ngƣời nhƣ acid mật, pH thấp, kháng sinh,... Đồng thời, chúng còn có khả năng sản sinh nhiều hoạt chất kháng khuẩn nhƣ acid lactic, bacteriocin, H2O2, diacetyl, tạo môi trƣờng bất lợi, từ đó ức chế vi sinh vật gây bệnh và thiết lập sự cân bằng hệ vi sinh vật đƣờng ruột. Bên cạnh đó, chúng còn có khả năng sản sinh nhiều enzyme thúc đẩy quá trình tiêu hóa hấp thu các chất của cơ thể vật chủ. Trang 1 Đồ án tốt nghiệp Xuất phát từ lí do trên nên ngƣời thực hiện đã chọn đề tài “ Phân lập và tuyển chọn Lactobacillus. sp từ nguồn thực vật ủ chua, tiềm năng sản xuất probiotic”. 2. Mục tiêu của đề tài: Phân lập và khảo sát các đặc tính probiotic của các chủng vi khuẩn phân lập từ các nguồn thực vật ủ chua. 3. Nhiệm vụ của đề tài: Phân lập đƣợc ít nhất 01 chủng Lactobacillus Tìm hiểu các đặc tính sinh lý, sinh hoá của chủng phân lập đƣợc. Khảo sát phổ kháng khuẩn của chủng Lactobacillus phân lập đƣợc với các VSV gây bệnh đƣờng ruột ở ngƣời.. Phân loại chủng nghiên cứu đến loài bằng sinh học phân tử. 4.Đối tƣợng nghiên cứu: các chủng Lactobacillus.sp đƣợc phân lập từ rau , củ lên men trong khu vực thành phố Hồ Chí Minh. Trang 2 Đồ án tốt nghiệp 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về rau quả lên men Lên men thực phẩm là một trong những công nghệ bảo quản thực phẩm đƣợc con ngƣời phát minh ra từ rất sớm, những ngƣời ở vùng ven biển của Châu Á đƣợc cho là đã lên men rau quả trƣớc khi phát triển nền nông nghiệp cây trồng. Lên men sữa ở Trung Đông xuất hiện sau khi thuần hoa vật nuôi. Bia ở Ai Cập và rƣợu gạo ở Đông Bắc Á đƣợc cho là xuất hiện vào 4000 năm trƣớc công nguyên. Ngƣời ta đã cho rằng dƣa chuột là nguyên liệu đầu tiên đƣợc lên men, sau đó là các sản phẩm khác nhƣ kim chi, bắp cảivà cho đến ngày nay đã và đang có rất nhiều các sản phẩm lên men với sự đa dạng về chủng loại. Thực phẩm lên men đƣợc phân loại dựa vào sản phẩm của quá trình lên men chẳng hạn nhƣ cồn ( rƣợu, bia), acid hữu cơ bao gồm acid lactic và acid axetic (trong rau củ lên men), cacbondioxide (CO2) ( trong bánh mì), các acid amin và các peptide từ protein. Trong các sản phẩm lên men thì rau, củ, quả lên men nhƣ kim chi, cà pháo, bắp cải là những sản phẩm có từ lâu đời và mang đặc trƣng bản sắc dân tộc của từng vùng miền và từng quốc gia. Quá trình lên men có thể giúp bảo quản rau quả lâu hơn 1 năm mà không cần sử dụng bất kì một phƣơng pháp bảo quản nào khác. Trong rau, củ, quả hoặc nƣớc ép rau củ có chƣa rất nhiều dinh dƣỡng giúp cho các vi sinh vật bao gồm cả các loại gây hƣ hỏng nhƣ Pseudomonas, Erwinia, Enterobacter, nấm men và nấm mốc có thể phát triển đƣợc. Các vi sinh vật gây hƣ hỏng khi phát triển tới số lƣợng từ 104-106 cfu/g. Tuy nhiên có thể ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinh vật gây hƣ hỏng này bằng phƣơng pháp lên men. Rau quả sau khi lên men sẽ có vị chua là do các acid hữu cơ đƣợc tiết ra bởi các vi khuẩn lên men đƣờng trong rau quả, đặc biệt là các vi khuẩn thuộc nhóm lactic. Trang 3 Đồ án tốt nghiệp Vi khuẩn lactic tồn tại trong rau quả hoặc nƣớc ép trái cây với số lƣợng rất thấp từ 102-103 cfu/g. Trong quá trình lên men, các acid hữu cơ sẽ tạo vị chua và làm giảm pH của môi trƣờng, từ đó ức chế hoạt động của các vi sinh vật gây hƣ hỏng, riêng vi khuẩn lactic không chịu ảnh hƣởng của việc giảm pH này là do nhóm vi khuẩn này có khả năng sống sót trong điều kiện acid cao hơn so với các loại vi sinh vật khác, nên sự phát triển của chúng sẽ chiếm ƣu thế hơn. Ngoài hƣơng vị đặc trƣng, các sản phẩm rau quả lên men còn đƣợc chứng minh là có tác động tốt đến sức khỏe nhƣ giúp tiêu hóa tốt và phòng bệnh đƣờng ruột. Đặc biệt vi khuẩn lactic còn tạo nên hệ vi khuẩn có ích cho đƣờng tiêu hóa. Rau quả muối chua tuy không phải là thuốc thuần túy nhƣng làm thức ăn rất tốt cho ngƣời bị bênh béo phì, tiểu đƣờng vì nó ít glucid và ít sinh năng lƣợng. Chính vì những tác động có lợi ,gần gũi với con ngƣời và có hệ vi sinh vật đa dạng nên rau, củ, quả lên men là một trong những nguồn nguyên liệu đƣợc các nhà khoa học quan tâm nhằm phân lập các dòng vi sinh vật có lợi đối với sức khỏe của con ngƣời và vật nuôi, từ đó sản xuất các chế phẩm probiotic. Hình 1.1 Kim Chi và một số loại rau củ lên men truyền thống 1.2 Tổng quan về probiotic Ruột ngƣời đƣợc định cƣ bởi một loạt các loài vi khuẩn, mang tầm quan trọng trong chức năng trao đổi chất cũng nhƣ chức năng miễn dịch, tất cả đều dẫn đến những ảnh hƣởng rõ rệt đến tình trạng dinh dƣỡng và sức khoẻ của vật chủ [19]. Trang 4 Đồ án tốt nghiệp Các probiotics đƣợc định nghĩa là "các vi sinh vật sống, khi tiêu hóa với một số lƣợng nhất định có lợi cho sức khoẻ ngoài dinh dƣỡng cơ bản”[6],[ 32]. Ngoài ra, probiotic còn đƣợc biết đến là vi sinh vật sống tự nhiên có ít hoặc không gây bệnh, nhƣng có chức năng quan trọng đối với sức khỏe, tình trạng chung của vật chủ và đƣợc chú trọng để sử dụng làm thuốc [10],[ 25]. Probiotics ban đầu đƣợc sử dụng để tác động đến sức khoẻ con ngƣời thông qua sự thay đổi hệ vi sinh đƣờng ruột. Hiện nay, các probiotic và những ảnh hƣởng của chúng đối với sức khoẻ con ngƣời đã đƣợc chứng minh bằng cách kết hợp chúng vào các loại thực phẩm truyền thống nhƣ chế phẩm nuôi vi sinh đơn hoặc hỗn hợp, tức là sản xuất các thực phẩm chức năng / dinh dƣỡng hoặc chế phẩm dƣợc để có đƣợc nhiều lợi ích về sức khoẻ [25]. Tác động của probiotic đến sức khoẻ con ngƣời đƣợc khẳng định và xác định rõ trong việc phòng ngừa và điều trị các bệnh khác nhau nhƣ nhiễm trùng đƣờng tiêu hóa cấp tính hoặc mãn tính (tiêu chảy, không tiêu hóa lactose, bệnh viêm ruột [7], các triệu chứng dị ứng [16],[ 30], ung thƣ [18] và AIDS (hội chứng suy giảm miễn dịch)[8], hô hấp và nhiễm trùng đƣờng tiết niệu. Chế độ ăn uống phù hợp, bao gồm các loại thực phẩm dinh dƣỡng / thực phẩm chức năng / thực phẩm bổ sung với probiotic, prebiotic và synbioitcs, với những lợi ích về dinh dƣỡng và điều trị là kết quả của một hệ thống tiêu hóa (Gastro Integinal) hoạt động tốt, tác động đến sinh lý của con ngƣời, từ đó tác động đến sức khỏe. Trong những thập kỷ qua, ngành công nghiệp thực phẩm đã đƣợc cách mạng hoá hƣớng tới sản xuất thực phẩm chức năng do nhận thức ngày càng cao của ngƣời tiêu dùng về vai trò tích cực của thực phẩm và sức khoẻ [26]. Một số lợi ích có đƣợc là do sự phát triển và hoạt động của vi khuẩn trong quá trình sản xuất thức ăn và một số do sự phát triển và hoạt động của một số loài vi khuẩn lactic trong đƣờng ruột sau khi ăn các thực phẩm có chứa chúng (Ali, 2010).(Trích tài liệu [32]). Để hệ thống miễn dịch và đƣờng tiêu hóa của con ngƣời hoạt động tốt, đòi hỏi phải có sự hiện diện đa dạng và số lƣợng lớn của các vi sinh vật. Hệ vi sinh cộng Trang 5 Đồ án tốt nghiệp sinh cƣ trú và duy trì sự cân bằng trong hệ thống đƣờng tiêu hóa con ngƣời, bất kì sự thay đổi nào về số lƣợng hoặc thành phần của hệ vi sinh điều ảnh hƣởng trực tiếp đến sức khỏe của vật chủ. Ví dụ khi sử dụng kháng sinh làm giảm số lƣợng của một số vi khuẩn, các mầm bệnh có cơ hội để phát triển và gây nhiễm trùng. Phƣơng pháp thay thế hệ vi sinh đƣờng ruột bằng các vi khuẩn có lợi đã khai sinh ra lĩnh vực khoa học chuyên nghiên cứu về probiotic. Probiotics đƣợc định nghĩa là 'Các vi sinh vật sống mà khi đƣợc bổ sung với số lƣợng thích hợp sẽ đem lại lợi ích cho sức khoẻ của vật chủ” [13]. Probiotic đang dần dần đóng vai trò quan trọng trong chức năng miễn dịch, hô hấp và giảm các bệnh truyền nhiễm ở con ngƣời. Vi khuẩn lactic acid (LAB) là các vi sinh vật thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ probiotic và có những lợi ích nhất định trong ứng dụng công nghiệp và y tế [32]. Thuật ngữ "probiotic" có nguồn gốc từ từ Hy Lạp "probios" có nghĩa là "cho sự sống" (trái ngƣợc với "antibiotic", có nghĩa là "chống lại sự sống") [22]. Trong nhiều thế kỷ, LAB đã đƣợc sử dụng để bảo quản thực phẩm cho ngƣời tiêu dùng. LAB là một nhóm lớn các vi sinh vật thuộc Gram âm, hiếu khí hoặc vi hiếu khí, không sinh bào tử, lên men và sinh acid, thƣờng có trong ruột của ngƣời và các động vật khác, rau sống, thịt và các sản phẩm từ thịt, ngũ cốc [9]. LAB và Bifidobacteria đƣợc sử dụng nhƣ là probiotic. Nhƣng một số loại nấm men và bacilli cũng đƣợc sử dụng trong sản xuất probiotic. Ngày nay có rất nhiều sản phẩm probiotic đang có mặt trên thị trƣờng nhƣ kem probiotic, probiotic uống,v.v. Để đƣợc sử dụng làm probiotic, các vi sinh vật phải tồn tại đƣợc trong đƣờng tiêu hóa, bằng cách kháng acid và mật, ngoài ra chúng còn phải có khả năng nhân nhanh số lƣợng. Việc sử dụng các sản phẩm probiotic giúp duy trì sự cân bằng hệ vi sinh trong đƣờng ruột từ đó giúp ngăn ngừa các bệnh nhƣ đái tháo đƣờng type 2, rối loạn chuyển hóa, gan nhiễm mỡ và bệnh mạch vành. [32] Trang 6 Đồ án tốt nghiệp Lợi ích của các thực phẩm lên men có đƣợc là do sự phát triển của các vi khuẩn trong suốt quá trình sản xuất. Vai trò của vi khuẩn probiotic trong việc lên men sữa là để hổ trợ: bảo quản sữa bằng cách tạo ra acid lactic và các hợp chất kháng khuẩn, tạo hƣơng vị (ví dụ acetaldehyde trong sữa chua và phô mai) và cung cấp một số chất hữu cơ khác (nhƣ polysaccharide ngoại bào) mà ngƣời tiêu dùng mong muốn, cải thiện giá trị dinh dƣỡng của thực phẩm, ví dụ nhƣ giải phóng các acid amin tự do hoặc tổng hợp các vitamin và cung cấp các chất đặc biệt có khả năng điều trị hoặc phòng ngừa ung thƣ, cũng nhƣ kiểm soát nồng độ cholesterol [27]. Các lợi ích của việc tiêu thụ các sản phẩm sữa lên men có đƣợc chủ yếu là do sự thay đổi theo hƣớng có lợi của hệ sinh thái trong đƣờng tiêu hóa. Trên khắp thế giới, có khoảng 20 dòng probiotic, trong đó chủ yếu là các Lactobacilli nhƣ: Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. reuterii và các loài khác, Bifidobacteria, các bào tử vi khuẩn sinh acid lactic nhƣ Lactospore, nấm men nhƣ Saccharomyces boulardii, đƣợc sử dụng trong thực phẩm bổ sung, thực phẩm chức năng hoặc thực phẩm chính [23]. Các dòng probiotic khác nhƣ Pediococcus, cùng với các vi khuẩn lactic khác nhƣ Leuconostoc và Lactobacillus đƣợc sử dụng để lên men bắp cải, làm kim chi. Một số dòng Pediococcus sản xuất ra diacetyl tạo hƣơng vị cho bơ, một số loại rƣợu vang và bia. P. pentosaceus, P. acidilactici, P. damnosus, P. claussenii, P.inopinatus, P. parvulus, P. stilesii, P. ethanolidurans and P. cellicola là các chủng thuộc Pediococcus đƣợc sử dụng làm probiotic. Trong Enterococci, Enterococuus faecalis và Enterococcus faecium là những loài chính đƣợc sử dụng làm probiotic. 1.3 Lịch sử nghiên cứu về probiotic Thuật ngữ probiotic có nghĩa là “ cho sự sống” hiện đang đƣợc sử dụng để chỉ các vi khuẩn có lợi đến sức khỏe của con ngƣời và động vật. Các sản phẩm sữa lên Trang 7 Đồ án tốt nghiệp men đƣợc con ngƣời sử dụng từ thời Vedic ( Ấn Độ cổ), những khái niệm khoa học về probiotic đƣợc phát triển vào khoảng năm 1900, khi Henry Tissier, một bác sĩ nhi khoa ngƣời Pháp đã nhận xét sự hiện diện với số lƣợng rất ít các vi khuẩn có hình thái chữ Y trong phân của trẻ em bị tiêu chảy. Những vi khuẩn này ngƣợc lại có rất nhiều ở trẻ em khỏe mạnh [32]. Ông ta đặt tên cho vi khuẩn này là Bacillus bifidus communis và sau này đƣợc đổi tên thành chi Bifidobacterium. Khái niệm probiotic đƣợc báo cáo lần đầu tiên bởi nhà khoa học Nga và đoạt giải Nobel, Elie Metchnikoff vào năm 1907 , ngƣời đã cho rằng tuổi thọ và sức khỏe của ngƣời Bungari là kết quả của việc tiêu thụ sữa lên men, và đề xuất rằng việc sử dụng sữa lên men sẽ cung cấp cho ruột các vi khuẩn lactic, làm giảm độ pH của đƣờng ruột sẽ ức chế các vi khuẩn gây hại [29]. Ông cũng chỉ ra rằng tiêu thụ Lactobacillli giúp kiểm soát nội độc tố sinh ra bởi các loại thành phần khác trong hệ sinh thái ruột [24] Thuật ngữ probiotic ban đầu đƣợc đề xuất nhƣ một từ trái ngƣợc với kháng sinh, và đƣợc dùng để mô tả sự hổ trợ tăng trƣởng cho các vi sinh vật bởi Lilley and Stillwell vào năm 1965 [21],[32]. Fuller sau đó miêu tả probiotic là “các vi sinh vật sống đƣợc bổ sung vào thức ăn có tác động có lợi đến động vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng vi sinh đƣờng ruột” [14]. Định nghĩa về probiotic đã đƣợc làm rõ hơn nữa vào năm 1998 là "các vi sinh vật sống, khi tiêu hóa với một số lƣợng nhất định, có ảnh hƣởng đến sức khoẻ ngoài dinh dƣỡng cơ bản”[15]. Tiến sĩ Minoru Shirota năm 1930 đã phân lập Lactobacillus casei Shirota (LcS) với các tính chất probiotic và đƣa ra thị trƣờng thức uống sữa lên men có chứa probiotic ( Yakult) này trong hơn bảy thập kỷ để cải thiện sức khoẻ đƣờng ruột [20]. Các công trình nghiên cứu của Tissier và Metchnikoff là tiền đề trong việc sử dụng vi khuẩn probiotic. Từ đó có rất nhiều các nghiên cứu về vai trò probiotic của LAB và ứng dụng các tế bào sống . Những quan sát của Tissier và Metchnikoff thu hút đƣợc nhiều sự chú ý và đƣợc thƣơng mại hóa. Tuy nhiên, không phải kết quả lúc nào cũng đƣợc nhƣ mong đợi, Trang 8 Đồ án tốt nghiệp và hầu hết các quan sát này điều trở thành giai thoại. Do đó, khái niệm probiotic đƣợc coi là không có cơ sở khoa học và ít đƣợc quan tâm trong nhiều thập kỉ với một số nghiên cứu về chất thay thế cho chất tăng trƣởng sử dụng cho động vật. Tuy nhiên trong 20 năm qua, nghiên cứu về probiotic đã có những bƣớc tiến đáng kể và chú trọng vào việc lựa chọn,mô tả cụ thể các môi trƣờng nuôi cấy probiotic, chứng minh các lợi ích của chúng đối với sức khỏe, và đảm bảo sự sống sót của các loại vi khuẩn này khi ở trong dạ dày-ruột [32]. Các chủng trong chi Lactobacillus và Bifidobacterium đƣợc sử dụng chủ yếu, nhƣng không phải là duy nhất, số lƣợng các probiotic và các sản phẩm chứa probiotic luôn không ngừng gia tăng. 1.4 Các vi sinh vật probiotic thƣờng gặp Vi sinh vật đƣợc sử dụng làm probiotic gồm nhiều nhóm khác nhau nhƣ VK, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc. Tuy nhiên, vì những đặc tính ƣu việt của LAB phù hợp với việc tạo chế phẩm probiotic cho ngƣời cũng nhƣ vật nuôi nên thành phần của hầu hết các chế phẩm probiotic hiện nay chủ yếu là các chủng LAB. Một số nhóm vi sinh vật probiotic thƣờng gặp 1.4.1 Chi Lactibacillus Chi Lactobacillus bao gồm các chủng thuộc Gram âm, hiếu khí bắt buộc hoặc vi hiếu khí, tế bào hình que. Chúng là một phần chủ yếu trong nhóm vi khuẩn lactic (LAB) (bao gồm Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus và Leuconostoc) có thể chuyển đổi đƣờng hexose thành acid lactic rồi tiết ra môi trƣờng để ức chế sự phát triển của vi sinh vật có hại. Trong cơ thể ngƣời, Lactobacilli thƣờng đƣợc tìm thấy trong cơ quan sinh dục, đƣờng tiêu hóa, và một số nơi khác cùng với Bifidobacterium. Trình tự gen hoàn chỉnh của một số chủng Lactobacillus thƣờng gặp đã đƣợc công bố nhƣ: Lactobacillus plantarum, L. johnsonii, L. acidophilus, L. sakei, L. bulgaricus, L. salivarius. Trang 9 Đồ án tốt nghiệp Một vài chủng Lactobacilli đƣợc sử dụng để sản xuất yogurt, phô mai, nƣớc tƣơng, kim chi, rƣợu và một số thực phẩm lên men khác. Trong tất cả các trƣờng hợp trên, đƣờng sẽ đƣợc chuyển hóa thành acid lactic, tạo thành môi trƣờng ức chế các vi sinh vật gây hƣ hỏng và cho phép bảo quản thực phẩm. Các loài Lactobacilli thƣờng đƣợc chọn là probiotic vì chúng biểu hiện nhiều đặc tính quan trọng nhƣ: khả năng chịu acid và mật cao, khả năng bám dính vào bề mặt ruột, chống lại pH thấp, dịch dạ dày, ức chế các vi khuẩn gây bệnh, kháng kháng sinh, sản xuất exopolysaccharides và loại bỏ cholesterol [28]. 1.4.2 Chi Bifidobacterium Chi Bifidobacterium thuộc Gram âm, không di động, hô hấp hiếu khí.Chúng sống cộng sinh trong đƣờng tiêu hóa và âm đạo của động vật có vú bao gồm cả con ngƣời.Các dòng thuộc chi Bifidobacterium đƣợc sử dụng làm probiotic vì sự đa dạng trong cơ chế kháng muối mật của chúng, điều này là rất quan trọng vì để thể hiện đƣợc đặc tính có lợi thì trƣớc tiên vi sinh vật phải tồn tại đƣợc trong dịch sinh học này. Một vài chủng thuộc chi Bifidobacteria đƣợc coi là các probiotic quan trọng bao gồm: Bifidobacterium infantis, B. adolescentis, B. animalis subsp animalis, B. animalis subsp lactis, B. bifidum, B. longum, B. breve. Bifidobacterium cùng với các probiotic khác đã đƣợc chứng minh là có khả năng chữa táo bón, tiêu chảy du lịch, tiêu chảy liên quan đến kháng sinh, giảm hoạt động của bệnh viêm đại tràng và viêm loét đại tràng, cũng nhƣ điều trị viêm ruột hoại tử ở trẻ sơ sinh, giảm sự phát triển của bệnh eczema, dị ứng thực phẩm, giảm cholesterol [28]. 1.4.3 Chi Sacharomyces Các chủng thuộc chi Saccharomyces bao các các chủng nấm nhƣ: Saccharomyces cerevisiae ( sử dụng cho làm rƣợu, bánh mì, bia), Saccharomyces bayanus ( đƣợc sử dụng để làm rƣợu), và Saccharomyces boulardii đƣợc sử dụng để tạo chế phẩm Trang 10 Đồ án tốt nghiệp probiotic dƣới dạng đông khô để điều trị bệnh tiêu chảy, trong khi vẫn đảm bảo an toàn tuyệt đối [28]. Saccharomyces boulardii: đƣợc dùng nhƣ probiotic từ năm 1950. Là thành phần chính của một số chế phẩm probiotic nhƣ ultralevure (Pháp), florastor, bioflora (Pháp). Tác động hiệu quả trong điều trị tiêu chảy nhiễm trùng cấp. Ngừa tiêu chảy do kháng sinh và trị liệu phối hợp trong nhiễm trùng H. pylori, S. boulardii tác động thông qua cơ chế [1] 1. Tiết enzyme proteinase làm giảm độc tố do Clostridium difficile, sản sinh phosphatase làm bất hoạt các nội độc tố do E. coli tiết ra. 2. Tăng lƣợng kháng thể IgA, tăng các men lactase, sucrase, maltase, và N- aminopeptidase, tăng hấp thu ở ngƣời tiêu chảy, duy trì các acid béo chuỗi ngắn cần thiết cho cho việc hấp thu nƣớc và chất điện giải. Ngoài ra, chúng còn tác dụng giảm viêm ở đƣờng ruột do kích thích tế bàoT. 1.4.4 Chi Bacillus 1.4.4.1 Bacillus subtilis Bacillus subtilis là vi khuẩn ứng dụng làm probiotic từ rất sớm. Chúng đƣợc sử dụng qua đƣờng uống để phòng và chữa các rối loạn tiêu hóa nhƣ tiêu chảy sau khi dùng kháng sinh. Bacillus subtilis có tác dụng hồi phục hệ vi sinh vật tự nhiên trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời sau khi dùng kháng sinh kéo dài. Các chế phẩm B. subtilis đƣợc bán ở hầu hết các nƣớc Châu Âu, mặc dù ngƣời ta còn chƣa biết nhiều về cơ chế tác dụng của chúng. Bào tử của B.subtilis có thể vƣợt qua rào chắn đƣờng tiêu hóa, một phần bào tử nảy mầm trong ruột non và sinh sôi trong đƣờng ruột. Một số tác dụng lâm sàng của B. subtilis đã đƣợc biết nhƣ làm tác nhân kích thích miễn dịch trong một số bệnh [1] . Trang 11 Đồ án tốt nghiệp 1.4.4.2 Bacillus clausii Thuộc giống Bacillus, Gram dƣơng, không di động, nuôi cấy dễ dàng với các môi trƣờng dinh dƣỡng thông dụng, có khả năng sinh bào tử giúp vi khuẩn tồn tại trong điều kiện khắc nghiệt. Bào tử của B.clausii có thể qua dạ dày với tỷ lệ sống sót cao, có thể sống đƣợc trong môi trƣờng dịch vị với pH = 2 ít nhất l2 giờ. Chúng đề kháng rất tốt với nhiều loại kháng sinh. Vì thế, có thể dùng chung trong thời gian điều trị kháng sinh. Khi vào ruột non, bào tử B. clausii sẽ nảy mầm thành dạng sinh trƣởng (ST) và tiếp tục sinh sôi nảy nở trong ruột. Nhờ đó lấp đầy lại đƣợc khoản