Đồ án Phân lập bacillus subtilis từ ruột cá

nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh. Những kết quả có được trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt nghiệp của người khác dưới bất kỳ hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án tốt nghiệp này là hoàn toàn trung thực. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đồ án của mình. TP. HCM, ngày 19 tháng 08 năm 2016 Sinh viên thực hiện Hồng Sếch Hếnh ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án này em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Hai đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt thời gian xây dựng đề cương, thực hiện và hoàn thành đồ án này. Em xin cám ơn đến thầy Huỳnh Văn Thành đã giúp đỡ, hỗ trợ tạo điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình em thực hiện đồ án. Em xin gửi lời cảm ơn đến quý Thầy, Cô khoa công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường đã tận tình chỉ bảo truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập để vận dụng kiến thức nền tảng ấy vào thực hiện đồ án này. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình đã chăm sóc, dạy dỗ và làm chỗ dựa tinh thần động viên, hỗ trợ kinh tế cho em trong suốt những năm qua và trong quá trình thực hiện đồ án này. Em cũng xin cám ơn đến các bạn cùng thực hiện đề tài trong phòng thí nghiệm đã quan tâm, hỗ trợ em làm đồ án tốt nghiệp này. Cuối cùng em xin cám ơn các Thầy Cô trong Hội đồng phản biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án này. Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến quý Thầy Cô. Tp Hồ Chí Minh, 19 tháng 8 năm 2016 Sinh viên thực hiện Hồng Sếch Hếnh ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... 1 LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. 2 MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài .................................................................................. 1 2. Tình hình nghiên cứu ........................................................................................ 2 2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ........................................................ 2 2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ........................................................ 3 3. Mục đích nghiên cứu ........................................................................................... 3 4. Nhiệm vụ nghiên cứu ......................................................................................... 3 5. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 3 6. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ....................................................................... 4 7. Ý nghĩa đề tài khoa học ...................................................................................... 4 8. Các kết quả đạt được của đề tài .......................................................................... 4 9. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp ............................................................................... 5 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 6 1. Đại cương về Bacillus subtilis ........................................................................ 6 1.1.Lịch sử phát hiện .................................................................................. 6 1.2.Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis ....... 6 1.2.1.Đặc điểm phân loại ............................................................................ 6 1.2.2.Phân bố .............................................................................................. 7 1.3.Đặc điểm hình thái [36] ........................................................................ 7 1.4.Đặc điểm phân lập, nuôi cấy ................................................................ 7 1.4.1.Đặc điểm phân lập. ............................................................................ 7 1.4.2.Đặc điểm sinh hóa ............................................................................. 8 1.5.Đặc điểm tế bào và khả năng sinh bào tử ............................................. 9 1.5.1.Đặc điểm tế bào ................................................................................. 9 1.5.2.Cấu tạo bào tử .................................................................................. 10 1.6.Tính đối kháng và khả năng sinh bacteriocin ..................................... 11 1.7.Ứng dụng của Bacillus trong sản xuất và đời sống [9] ...................... 11 i ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.8.Giới thiệu enzyme amylase và protease của tế bào ............................ 12 1.8.1.Enzyme amylase [12] ...................................................................... 12 1.8.2.Enzyme protease .............................................................................. 15 1.9.Một số enzyme ở cá ............................................................................ 19 1.10.1.Thành phần cá, phụ phế phẩm cá .................................................. 20 1.10.2.Tình hình đánh bắt, sản xuất ở Việt Nam ...................................... 21 1.11.Phân bón có nguồn gốc từ cá ............................................................ 23 CHƯƠNG 2: VÂṬ LIÊỤ VÀ PHƯƠNG PHÁ P NGHIÊN CỨ U ............................ 24 2.1.Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ............................................................ 24 2.1.1.Địa điểm nghiên cứu: ....................................................................... 24 2.1.2.Thời gian nghiên cứu ....................................................................... 24 2.2.Vật liệu nghiên cứu: ........................................................................................ 24 2.2.3.Thiết bị và dụng cụ .......................................................................... 25 2.3.Bố trí thí nghiệm ............................................................................................. 26 2.3.1.Bố trí thí nghiệm chung ................................................................... 26 2.3.2.Bố trí thí nghiệm chi tiết .................................................................. 26 2.4.Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 30 2.4.1.Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu ................................................ 30 2.4.2.Phương pháp tăng sinh .................................................................... 30 2.4.3.Phương pháp pha loãng mẫu ........................................................... 30 2.4.4.Phương pháp phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải protein [14] 31 2.4.5.Phương pháp định tính khả năng sinh protease của 8 chủng vi khuẩn phân lập được. ........................................................................................... 31 2.4.6.Kiểm tra độ thuần khiết của giống : ................................................ 32 2.4.8.Phương pháp cấy chuyền [38] ......................................................... 32 2.4.9.Phương pháp bảo quản lạnh sâu : .................................................... 32 2.4.10.Các phương pháp xác định đặc điểm hình thái ............................. 33 2.4.11.Các thử nghiệm sinh hóa đối với các chủng vi khuẩn phân lập nghi ngờ là Bacillus subtilis. ............................................................................. 34 ii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.4.12.Phương pháp đục lỗ thạch ............................................................. 37 2.4.13.Phương pháp nghiên cứu khả năng phân giải tinh bột, protein. .... 38 2.4.14.Phương pháp xử lý số liệu thống kê .............................................. 38 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 39 3.1.Kết quả phân lập và lựa chọn các chủng có khả năng là Bacillus subtilis ...... 39 3.2.Kết quả thử nghiệm sinh hóa .......................................................................... 42 3.2.1.Kết quả test catalase......................................................................... 42 3.2.2.Nhuộm gram .................................................................................... 42 3.2.3.Nhuộm bào tử .................................................................................. 44 3.2.4.Kết quả thử nghiệm Citrate ............................................................. 45 3.2.5.Kết quả thử nghiệm Nitrate ............................................................. 46 3.2.6.Thử nghiệm MR - VP ...................................................................... 47 3.2.7.Thử nghiệm indole ........................................................................... 49 3.2.8.Thử nghiệm di động ......................................................................... 50 3.2.9.Thử nghiệm lên men Carbohydrate ................................................. 51 3.2.10.Khảo sát khả năng sinh enzyme protease và amylase ngoại bào của các chủng vi khuẩn đề tài phân lập được .................................................. 52 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 58 4.1.Kết luận ........................................................................................................... 58 4.2.Đề nghị ............................................................................................................ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 59 iii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC BẢNG Bảng 1. 1 Kết quả định danh Bacillus subtiblis .......................................................... 9 Bảng 1. 2 Phân loại protease theo Barret, 1984 ........................................................ 18 Bảng 1. 3 Thành phần khối lượng cá tra và một số loài cá khác .............................. 22 Bảng 3. 1 Đặc điểm hình thái cụ thể của 8 chủng vi khuẩn đồ án phân lập được. ... 39 Bảng 3. 2 Kết quả định tính enzyme ngoại bào amylase và protease của 8 chủng vi khuẩn phân lập được. ................................................................................................ 53 Bảng 3. 3 Kết quả định danh sơ bộ bằng test sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập từ ruột cá. ............................................................................................................. 55 iv ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH Hình 1. 1 Tế bào Bacillus subtilis ............................................................................... 6 Hình 1. 2 Sản lượng khai thác và nuôi trồng thủy sản của Việt Nam từ 1995 - 2015 ................................................................................................................................... 22 Hình 2. 1 Sơ đồ bố trí các bước thí nghiệm .............................................................. 26 Hình 2. 2 Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis có trong ruột cá ....... 27 Hình 2. 3 Quy trình dịnh danh sơ bộ các chủng phân lập được ................................ 29 Hình 3. 1 Kết quả thử nghiệm catalase ..................................................................... 42 Hình 3. 2 Hình thái tế bào các chủng vi khuẩn phân lập khi nhuộm Gram .............. 44 Hình 3. 3 Kết quả nhuộm soi bào tử của chủng phân lập được ................................ 45 Hình 3. 4.Thử nghiệm Citrate đối với các chủng phân lập được .............................. 46 Hình 3.5 Kết quả khảo sát khả năng khử nitrate của chủng vi khuẩn phân lập được. ................................................................................................................................... 47 Hình 3. 6 Hình ảnh test Methyl red của các chủng phân lập được. .......................... 48 Hình 3.7 Kết quả phản ứng VP của 8 chủng vi khuẩn phân lập được ...................... 49 Hình 3. 8 Phản ứng test indol ở các chủng được phân lập ........................................ 50 Hình 3. 9 Khả năng di động của 8 chủng phân lập được .......................................... 51 Hình 3. 10 Hình ảnh đặc trưng của môi trường trong khảo sát khả năng lên men đường ......................................................................................................................... 52 Hình 3. 11 Khảo sát định tính protease trên Casein agar với thuốc thử là TCA 10 % ................................................................................................................................... 54 Hình 3. 12 Kết quả test định tính enzyme amylase của các chủng vi khuẩn phân lập được. .......................................................................................................................... 55 v ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT NA Nutrient agar NB Nutient broth MR Methyl red VP Voges Progkauer Food and Agriculture Organization of FAO the United Nations TCA Trichloroacetic acid vi ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ngành chế biến thủy sản của nước ta sản lượng ngày càng tăng, mang lại nguồn lợi lớn cho quốc gia, song bên cạnh đó, việc chế biến thủy sản không sử dụng hết toàn bộ các phần của chúng mà để lại nguồn phụ phế phẩm rất lớn, nếu không được xử lý sẽ lãng phí và gây ô nhiễm môi trường do quá trình phân giải các protein, lipidtheo Trần Duy 2014, hiện nay trên toàn cầu có khoảng 70 triệu tấn thủy sản đang được chế biến ở dạng phi lê, đông lạnh, đóng hộp hoặc ngâm tẩm. Trong năm 2011, sản lượng cá ngừ toàn cầu đạt 4,6 triệu tấn, tuy nhiên sản phẩm cá ngừ đóng hộp chỉ có gần 2 triệu tấn [32], điều này có nghĩa là lượng phụ phẩm cá ngừ thải ra từ công nghiệp chế biến cá ngừ này lên đến hơn 2 triệu tấn. Việc đánh bắt, chế biến thủy sản xuất khẩu luôn đi kèm theo một lượng phụ phế phẩm khá lớn, theo thống kê của Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO) lượng phụ phế phẩm bao gồm: đầu, xương, da, vây, vẩy, thịt vụn và nội tạng cá thải ra trong quá trình chế biến đồ hộp chiếm từ 30 – 65 %, trong sản xuất cá phi lê, cá khô, cá muối, cá xông khói lượng phụ phế phẩm thải ra chiếm từ 50 – 75 %. Sản xuất chế biến cá lấy phi lê, dùng đóng hộp thường chỉ lấy phần cơ, các phụ phế phẩm sản xuất cá ngừ đóng hộp có thế chiếm khoảng 65 % lượng nguyên liệu ban đầu, trong ngành sản xuất thịt cá ngừ cho thấy các phế phẩm, phụ phẩm chiếm khoảng 50 % tổng nguyên liệu ban đầu, đối với cá basa thì phụ phế phẩm trong chế biến cá phi lê gồm đầu, xương, mỡ, da, nội tạng, thịt vụn và chúng chiếm khoảng 65 – 70 % lượng nguyên liệu ban đầu [19]. Phụ phế phẩm trong sản xuất chế biến thủy sản cá có thành phần là các chất hữu cơ giàu Nitơ, nếu sử dụng không đúng mục đích và xử lý không tốt chúng dễ bị phân hủy thành các chất gây ô nhiễm không khí (các protein khi bị vi sinh vật phân giải sẽ hình thành H2S, NH3) và nhiều chất khác gây ô nhiễm cả nguồn đất, nguồn nước, ảnh hưởng nghiêm trọng đến đời sống, sức khỏe con người và môi trường, chính vì vậy cần có giải pháp khắc phục vần đề trên. Tìm ra được các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải protein là một giải pháp hữu hiệu, an toàn, tận dụng hiệu quả nguồn phụ phế phẩm từ ngành công nghiệp chế biến thủy sản nói chung và chế biến cá nói riêng, từ đó có cách tận dụng hiệu quả. Trong ruột cá có hiện diện vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease phân giải tốt protein cá, đặc biệt là các chủng Bacillus [19]. Nhiều chủng Bacillus đã được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, sản xuất enzyme, probiotic. Và cả trong sản xuất phân bón vi sinh phân giải lân, silicat, ức chế vi sinh vật gây bệnh, phân giải cellulose (Lê Thị Hồng Nhung, 2015). 1 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Các chủng vi sinh vật này có sẵn trong môi trường và cả ruột cá, (Rahul Krishnan, 2014), chúng tự phát triển hỗ trợ tiêu hóa cho cá khi còn sống và cùng các loài khác tiết enzyme phân giải cá khi cá chết đi. Trong điều kiện tự nhiên chúng sinh trưởng được nhưng cần thời gian dài nhưng chúng sẽ phát triển nhanh chóng, tối ưu nếu như được tăng sinh hoạt hóa giống từ chủng thuần khiết, lúc này các chủng vi sinh vật này cho sản phẩm enzyme nhiều và tốt hơn, rút ngắn được thời gian xử lý phân giải nguồn phụ phế phẩm cá và cho ra sản phẩm tốt hơn, hiệu quả lên men tốt hơn. Sản xuất nông nghiệp hữu cơ là một phương pháp canh tác tiến bộ, chứa đựng trong đó là hàm lượng khoa học công nghệ và tính nhân văn cao (Lê Văn Hưng, 2001). Tính nhân văn cao ở chỗ là tất cả các công đoạn trong sản xuất nông nghiệp hữu cơ đều hướng đến sự an toàn cho con người, vật nuôi và môi trường sinh thái xung quanh, hướng đến một hành tinh xanh và sạch [5]. Việt Nam là một nước có dân số sản xuất nông nghiệp lớn, diện tích đất sản xuất nông nghiệp lớn. Theo thống kê năm 2013, tổng diện tích đất nông nghiệp là 262.805 km2 (chiếm tới 79,4 %) bao gồm đất sản xuất nông nghiệp là 101.511 km2, đất lâm nghiệp là 153.731 km2, đất nuôi trồng thuỷ sản là 7.120 km2 [7]. Vì vậy nhu cầu phân bón cho sản xuất nông nghiệp lớn. Mặt khác sử dụng phân bón hóa học không có lợi cho đất, phân bón hóa học làm giảm pH của đất, chúng được hấp thụ nhanh, bón lượng lớn và ít các chất dinh dưỡng, cây hấp thụ không hết làm ô nhiễm môi trường đất. Từ những cơ sở trên, đề tài “phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ ruột cá” được thực hiện để tận dụng hiệu quả và an toàn nguồn tài nguyên này là cần thiết. 2. Tình hình nghiên cứu 2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước Bacillus subtilis được nghiên cứu khá rộng rãi trong nước nhằm sử dụng cho mục đích sản xuất probiotic, thu nhận enzyme Một số công trình nghiên cứu như phân lập và ứng dụng Bacillus subtilis tiết các loại protease như: Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009. Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng Bacillus phân lập từ đất vườn sinh protease kiềm. Bùi Thị Phi, 2007. Phân lập, khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis và tìm hiểu khả năng sinh enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn để sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học. 2 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nghiên cứu tận dụng cá phế liệu để sản xuất dịch cao đạm dùng trong thức ăn nuôi tôm, cá của Đặng Thị Mộng Quyên và Trần Thị Xô, 2006. Nghiên cứu khảo sát khả năng thủy phân protein phụ phẩm cá tra bằng enzyme protease từ Bacillus subtilis S5 của Nguyễn Thị Nếp, 2005. 2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Syeda Azeem Unnisa sản xuất phân bón từ thức ăn thừa có bổ sung đường nâu. Mrunmaya Kumar Panda cùng cộng sự đã nghiên cứu phân lập Bacillus sp ưa nhiệt từ suối nước nóng có hoạt tính protease cao. Cũng đã có một số công trình nghiên cứu phân lập Bacillus subtilis từ ruột cá như của Jamal K.H. Al Faragi và Sundus A.A. Alsaphar, 2012 hay của Rahul Krishnan phân lập từ cá nước ngọt, 2014. 3. Mục đích nghiên cứu Phân lập được chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng sinh enzyme protease mạnh từ ruột cá. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập và chọn lọc được chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng sinh enzyme protease mạnh từ ruột cá. Định danh sơ bộ bằng các test sinh hóa. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh enzyme của chủng vi khuẩn phân lập được. 5. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp tổng hợp tài liệu: + Thu thập, tìm hiểu các tài liệu tham khảo, sách, giáo trình và internet liên quan đến đề tài. + Tổng hợp, lựa chọn các tài liệu liên quan đến mục tiêu của đề tài. - Phương pháp nghiên cứu: + Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease và tuyển chọn các chủng có khả năng sinh enzyme mạnh nhất từ nguồn ruột cá. 3 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP + Thực hiện một số khảo sát về hình thái, thử nghiệm sinh hóa đặc trưng cho các chủng Bacillus subtilis để tuyển chọn chủng mong muốn, loại các vi sinh vật có nguy cơ gây bệnh. + Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng sinh enzyme protease phân hủy protein từ các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn. + Khảo sát khả năng thủy phân protein từ phụ phế phẩm cá từ chủng phân lập được. - Phương pháp thu thập và xử lý số liệu: + Ghi nhận số liệu trực tiếp từ các thí nghiệm bố trí khảo sát. + Xử lý số liệu bằng phần mềm Statistical Analysis System (SAS). 6. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu - Đối tượng: Nghiên cứu thử nghiệm trên các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải protein từ nguồn ruột cá thu thập từ chợ. - Phạm vi giới hạn đề tài: Vi khuẩn Bacillus subtilis phân giải protein có nguồn gốc từ cá. 7. Ý nghĩa đề tài khoa học - Ý nghĩa khoa học: Phân lập được chủng vi khuẩn B.subtilis có khả năng phân giải protein đạt hiệu quả cao, góp phần xác định một số đặc điểm về hình thái tế bào và hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn nhóm B.subtilis, xác định được điều kiện yếu tố pH tố nhất đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn phân lập được. - Ý nghĩa thực tiễn: Dựa trên kết quả thí nghiệm nghiên cứu thu được để góp phần tìm ra chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease mạnh ứng dụng để tạo ra các sản phẩm phân bón tận dụng phụ phế phẩm từ cá và bảo vệ môi trường. 8. Các kết quả đạt được của đề tài - Phân lập được 8 chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease phân giải protein từ cá, từ kết quả phân lập sau khi định danh sơ bộ bằng các phản ứng test sinh hóa đặc trưng của Bacillus subtilis thì trùng khớp. 4 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -Kết quả khả năng tổng hợp enzyme protease được thực hiện cho các chủng vi khuẩn phân lập được trên môi trường nhân tạo giàu protein làm cơ sở để sản xuất chế phẩm phân bón từ nguồn phụ phế phẩm cá. -Bước đầu ứng dụng vi khuẩn phân lập tuyển chọn được vào xử lý thủy phân protein từ phụ phế phẩm cá. 9. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp - Phần Mở đầu. - Chương 1: Tổng quan tài liệu - nội dung chương đề cập đến các nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu. -Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - nội dung chương đề cập đến các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án. -Chương 3: Kết quả và thảo luận - nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biện chứng cho kết quả thu được. -Phần Kết luận và đề nghị: nội dung tóm lại những kết quả mà đề tài đạt được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài. 5 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Đại cương về Bacillus subtilis 1.1. Lịch sử phát hiện Bacillus subtilis lần đầu tiên được phát hiện năm 1835 và được đặt tên là “vibrio subtilis” bởi nhà khoa học là Christian Gottfried Ehrenberg. Vào năm 1972 nó được đổi tên thành Bacillus subtilis bởi Ferdinand Cohn. Ngày nay, vi khuẩn này đã được sử dụng rất rộng rãi trong y học, chăn nuôi và thực phẩm (Lý Kim Hữu, 2005) 1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis 1.2.1. Đặc điểm phân loại Theo phân loại của Bergey (1994) Bacillus subtilis thuộc: Lãnh giới: Bacteria Giới: Monera Ngành: Firrmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacilales Họ: Baccilaceae Chi: Bacillus Loài: Bacillus subtilis Hình 1. 1 Tế bào Bacillus subtilis (Nguồn: 6 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.2.2. Phân bố Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí túy nghi [21], chúng phân bố rộng khắp mọi nơi trong tự nhiên, chúng được tìm thấy trong các tầng trên của đất, đường tiêu hóa của động vật nhai lại và của con người [36], Bacillus subtilis thường được tìm thấy nhiều ở cỏ khô nên chúng cũng còn được gọi là trực khuẩn cỏ khô. Phần lớn chúng cư trú trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu cfu/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm. Nước và bùn cửa sông cũng như ở nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus subtilis (trích Bùi Thị Phi, 2007). Trong ruột cá cũng có sự tồn tại của chủng loài vi khuẩn này [19], [40]. Bacillus subtilis là một trực khuẩn có lợi trong hệ vi khuẩn đường ruột, chúng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật có hại đối với đường tiêu hóa [11]. 1.3. Đặc điểm hình thái [36] Bacillus subtilis là trực khuẩn gram dương, hai đầu tròn, phản ứng catalase dương tính, chúng có khả năng tạo bào tử để tồn tại trong môi trường khắc nghiệt. B.subtilis có các roi giúp chúng di chuyển, vì vậy chúng có khả năng di chuyển nhanh chóng trong chất lỏng. Kích thước tế bào của chúng khoảng 0,5 - 0,8 µm × 1,8 - 3 µm [37]. Khi gặp điều kiện bất lợi, Bacillus subtilis sẽ hình thành bào tử để vượt qua điều kiện bất lợi, nếu gặp điều kiện thuận lợi bào tử Bacillus subtilis sẽ nảy mầm và phát triển như một tế bào mới với chu kỳ sống mới. Bào tử B.subtilis có hình bầu dục, kích thước khoảng 0,6 - 0,9 µm. Phân bố không theo quy tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. 1.4. Đặc điểm phân lập, nuôi cấy 1.4.1. Đặc điểm phân lập. Bacillus subtilis phát triển tốt nhất trong điều kiện có oxy và nhiệt độ thích hợp của chúng là 36 – 50 0C, tối đa khoảng 60 0C (trích Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009), nhiệt độ tối thích cho loài vi khuẩn này sinh trưởng là 37 0C (Bùi Thị Phi, 2007). Trong điều kiện thiếu oxy loài vi khuẩn này vẫn có khả năng tồn tại, phát triển yếu nhờ khả năng lên men các nguồn carbonhydrate của chúng. Độ pH: pH tối ưu của Bacillus subtilis là trong khoảng 7 - 7,4. Khi nuôi cấy trên môi trường đĩa thạch, khuẩn lạc B.subtilis khô, không màu hoặc màu xám trắng, có dạng tròn, không đều hay phân tán, rìa răng cưa không đều, mép nhăn, tâm có màu sẫm, sau 1 - 4 ngày thì bề mặt khuẩn lạc trờ nên nhăn nheo và khô, màu hơi nâu. 7 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Trên môi trường lỏng NB thì B.subtilis phát triển mạnh làm đục môi trường, song song đó vi khuẩn kết màng phía trên bề mặt môi trường nuôi cấy. 1.4.2. Đặc điểm sinh hóa Bacillus subtilis có một số test sinh hóa đặc trưng sau: Lên men nhưng không sinh hơi các loại đường Glucose, Maltose, Mannitol, Sucrose, Xylose, Arabinose. Indol (-), VP (+), Nitrate (+), H2S (-), NH3 (+), Catalase (+), Amylase (+), Casein (+), Citrate (+), có khả năng di động và hiếu khí. 8 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 1. 1 Kết quả định danh Bacillus subtiblis Phản ứng sinh hóa Kết quả Catalase + Indol - MR + VP + Citrate + Nitrate + Gelatin + Di động + Amylase + Arabinose + Xylose + Saccharose + Mannitol + Glucose + Lactose - Maltose + (Theo Holt, 1992) (trích bởi Lý Kim Hữu, 2005) 1.5. Đặc điểm tế bào và khả năng sinh bào tử 1.5.1. Đặc điểm tế bào Tế bào Bacillus subtilis hình que, là tế bào gram dương, chúng có khả năng sinh ra bào tử để tồn tại qua thời điểm khó khăn, điều kiện môi trường khắc nghiệt như nhiệt độ tăng cao, môi trường dinh dưỡng cạn kiệt, khô hạn. Thành phần hóa học chủ yếu của vách tế bào là lớp peptidoglycan dày mang diện tích dương đóng vai trò là duy trì cấu trúc của vách tế bào. 9 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.5.2. Cấu tạo bào tử Bacillus subtilis sinh bào tử, chiều ngang bào tử không vượt quá chiều ngang của tế bào vi khuẩn nên không làm thay đổi hình thái tế bào mang bào tử [11]. Bào tử là một cấu trúc hình thành do sự biến đổi của tế bào sinh dưỡng trong một giai đoạn nào đó của quá trình sinh trưởng của vi khuẩn như điều kiện môi trường không thuận lợi, tế bào phát triển đến một giai đoạn nhất định. Hai chủng vi khuẩn gram dương có khả năng tạo bào tử là Bacillus và Clostridium. Bào tử vi khuẩn là một cấu trúc rất phức tạp [38], bào tử có nhiều lớp màng bao bọc, lớp ngoài cùng gọi là lớp màng khá mỏng và đó là lớp vỏ của tế bào mẹ, ngay dưới đó là lớp áo bào tử, lớp áo bào tử gồm nhiều lớp protein mỏng và không có tính thấm, lớp áo bào tử này đảm bảo tính kháng của bào tử. Vỏ của bào tử gồm nhiều lớp peptidoglycan chiếm một thể tích khá lớn, ít cầu nối nội peptide và ít liên kết chéo. Trong cùng của bào tử là lõi bào tử được vách bào tử bao bọc có cấu trúc như một tế bào bình thường nhưng đang trong tình trạng bất hoạt [38]. 1.5.2.1. Đặc điểm của bào tử Bào tử ở Bacillus subtilis không phải là hình thức sinh sản như ở nấm mà chúng là dạng cấu trúc đặc biệt có tính kháng chuyên biệt giúp chủng loài tồn tại qua giai đoạn điều kiện sống bất lợi. Bào tử không chỉ có khả năng lưu tồn tốt trong những điều kiện khó khăn của môi trường sống mà chúng còn có khả năng sống rất lâu (bào tử trong xác sinh vật cổ đại 1000 năm hoặc dưới đáy băng hà 3000 năm hoặc trong quặng mỏ 250 triệu năm đến nay vẫn còn sống) [11]. Nhiệt độ 100 0C, bào tử của một số loài Bacillus có thể chịu đựng được từ 2,5 - 20 giờ. Ngoài việc chịu được nhiệt độ khô cao, bào tử có thể chịu được khô hạn cũng như tác động của nhiều loại hóa chất cũng như các loại tia sáng [11]. Quá trình hình thành bào tử: các tế bào sinh bào tử trong những điều kiện thiếu thức ăn hoặc có tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại sẽ bắt đầu thực hiện quá trình hình thành bào tử. Trong bào tử nước liên kết chiếm đến 40 % và chứa nhiều ion Ca2+. Sự nảy mầm của bào tử 10 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Quá trình chuyển từ trạng thái nghỉ sang tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn được gọi là quá trình nảy mầm của bào tử. Quá trình này gồm 3 giai đoạn là: hoạt hóa, nảy mầm và sinh trưởng [11]. Khả năng tạo bào tử: theo Bùi Thị Phi, 2007 thì một trong những đặc điểm quan trọng nhất của Baciluss subtilis là khả năng sinh bào tử trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis hình thành bào tử theo chu kỳ sống hay khi gặp điều kiện bất lợi [11]. Theo Bùi Thị Phi, 2007 sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn và mất đến 8 giờ để hoàn tất. 1.5.2.2. Sự ...anh sơ bộ các chủng phân lập được Thuyết minh quy trình Các chủng vi khuẩn sau khi được phân lập thuần nhất và giữ giống xong sẽ được đem đi test các thử nghiệm sinh hóa đặc trưng cho chủng Bacillus subtilis như các phương pháp : nhuộm Gram, nhuộm bào tử, thử nghiệm Catalase, thử nghiệm Protease, thử nghiệm Amylase, thử nghiệm Nitrate, thử nghiệm Citrate, thử 29 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP nghiệm lên men Carbohydrate, thử nghiệm indole, thử nghiệm Urease, thử nghiệm MR-VP, thử nghiệm di độngTiến hành quan sát và ghi nhận hình dạng tế bào dưới kính hiển vi và chọn các chủng gram dương, có khả năng sinh bào tử, thử nghiệm Catalase, protease dương tính, chọn các chủng có kết quả thử nghiệm sinh hóa trùng khớp với thử nhiệm sinh hóa với Bacillus subtilis. 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu Thu mẫu vào sáng sớm, trời mát và khô ráo. Mẫu thu phải tươi và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm sau khi thu được. Xử lý mẫu : nhằm thu được các chủng vi sinh vật chỉ nằm trong đường ruột cá, mẫu ruột cá sau khi thu nhận về phòng thí nghiệm được rửa nhiều lần bằng nước muối sinh lý vô trùng cho sạch rồi dùng gòn vô trùng thấm khô. Đồng nhất và cấy trang đến khô mặt thạch để có thể thu được các khuẩn lạc riêng rẽ. 2.4.2. Phương pháp tăng sinh Phương pháp này nhằm giúp cho vi khuẩn hồi phục khả năng sinh trưởng để phát triển bình thường trong môi trường nuôi cấy tiếp theo giúp làm ổn định giống và nâng cao tính chính xác của các thí nghiệm. Môi trường NB (không chọn lọc) được sử dụng để làm môi trường tăng sinh. Môi trường này được hấp khử trùng ở 121 0C trong 15 phút ở 1 atm. Thực hiện thao tác trong điều kiện vô trùng, lấy 1 ít sinh khối của chủng vi khuẩn thử nghiệm bằng cách hút 1ml mẫu hay dùng que cấy ria lấy 1 khuẩn lạc riêng rẽ cho vào chai môi trường NB, ủ và lắc ở 150 vòng/ phút trong 24 giờ trước khi đưa vào thí nghiệm chính. 2.4.3. Phương pháp pha loãng mẫu Mục đích : làm giảm mật độ vi khuẩn có mặt trong dịch tăng sinh mẫu hay dịch đồng nhất mẫu giúp cho việc phân lập riêng rẽ từng khuẩn lạc tế bào được dễ dàng hơn. Nguyên tắc: pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhất trong phương pháp phân tích vi sinh nhưng rất quan trọng, việc pha loãng mẫu ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả thí nghiệm, khi mẫu được pha loãng đến nồng độ thích hợp sẽ thuận lợi cho người phân tích vi sinh đọc kết quả hay thực hiện các phân tích định lượng một cách dễ dàng nhất có thể Phương pháp này chỉ dùng trong trường hợp vi sinh vật phân bố nhiều trong mẫu và để định lượng vi sinh vật trong mẫu thí nghiệm [14]. Dung dịch pha loãng là nước muối sinh lý [15]. 30 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Chuẩn bị sẵn dung dịch nước muối sinh lý 0,9 % và phối vào chính xác 9 ml vào mỗi ống nghiệm có nút đậy rồi đem hấp khử trùng. Dùng micropipette hút 1 ml dung dịch cần pha loãng cho vào ống nước muối sinh lý vô trùng để pha loãng đã chuẩn bị và tiến hành thao tác pha loãng đến một dãy nồng độ nhất định thích hợp. Dung dịch gốc nồng độ sẽ được ghi nhận là 100, ống nước muối sinh lý đã hút 1 ml dung dịch cần pha loãng vào sẽ là ống có nồng độ pha loãng là 10-1, pha loãng tiếp sẽ là 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6. 2.4.4. Phương pháp phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải protein [14] Phương pháp phân lập vi sinh vật thuần khiết Mục đích : phân tách riêng các chủng vi khuẩn có trong dịch mẫu tăng sinh giúp cho việc chọn lọc các chủng vi khuẩn đồng nhất được dễ dàng và hiệu quả. Sử dụng môi trường NA, hấp khử trùng rồi tiến hành đổ đĩa như sau : hấp môi trường ở 121 0C, 1 atm trong 15 phút, sau khi hấp khử trùng xong để môi trường hạ nhiệt độ đến khoảng 55 – 60 0C thì tiến hành đổ môi trường vào đĩa petri đã được hấp khử trùng, mỗi đĩa đổ khoảng 15 – 20 ml môi trường (thực hiện thao tác tuân thủ nghiêm túc yêu cầu vô trùng). Các bước phân lập : Dùng micropipette và đầu tip vô trùng hút 0,1 ml dịch pha loãng ở các nồng độ 10-4, 10-5, 10-6 cho vào các đĩa thạch NA đã được đổ trước đó. Mỗi nồng độ thực hiện 3 đĩa. Tiến hành cấy trang trang đều mặt thạch đến khi khô ráo. Cho các đĩa đã cấy trang vào tủ ấm 37 0C và ủ trong 24 – 48 giờ. Đọc kết quả sau 24 - 48 giờ nuôi cấy, quan sát hình thái khuẩn lạc riêng rẽ và tuyển chọn ra những chủng vi khuẩn có hình thái giống chủng Bacillus subtilis nhất và cấy ria làm thuần qua nhiều lần cấy ria từ khuẩn lạc riêng rẽ bằng cách cấy ria nhiều lần trên môi trường NA. Khi các chủng vi khuẩn trên đĩa thạch có hình thái và kích thước đồng nhất và giống khuẩn lạc ban đầu thì việc làm thuần được xem là thành công. Bước chọn mẫu và làm thuần quyết định đến khả năng thành công của thử nghiệm, nghiên cứu. 2.4.5. Phương pháp định tính khả năng sinh protease của 8 chủng vi khuẩn phân lập được. Cấy điểm vi khuẩn phân lập được lên môi trường đĩa thạch casein 1 % và ủ ở 37 0C và ủ trong 24 – 48 giờ khảo sát định tính khả năng sinh enzyme protease của chủng phân lập được. Quan sát ghi nhận kết quả. Các khuẩn lạc có khả năng phân giải casein sẽ hình thành vòng trong suốt trên môi trường đĩa thạch Casein khi cho thêm vài giọt TCA (Tricholoacetic acid) vào. 31 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Yêu cầu các thao tác phải thực hiện nghiêm túc các yêu cầu về thao tác vô trùng. 2.4.6. Kiểm tra độ thuần khiết của giống : Quan sát sự sinh trưởng của vi sinh vật trên môi trường thạch : Nếu vết cấy có bề mặt và màu sắc đồng nhất thì giống mới phân lập thuần chủng, ngược lại thì giống không thuần chủng, cần phải loại bỏ vì không sử dụng được kết quả này. Kiểm tra độ thuần khiết của các khuẩn lạc : Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường thạch, sau đó tách các khuẩn lạc này ra hòa tan và pha loãng đến nồng độ thích hợp trong nước cất vô trùng. Nhỏ một giọt dịch lên đĩa petri có môi trường NA rồi tiến hành cấy trang đến khi khô. Ủ các đĩa petri này ở 37 0C và ủ trong 24 – 48 giờ, quan sát các khuẩn lạc riêng rẽ, sự thuần khiết của khuẩn lạc thể hiện sự thuần khiết của giống [38]. 2.4.7. Phương pháp bảo quản và giữ giống Bacillus subtilis Nguyên tắc : − Phải đảm bảo tốt điều kiện trong quá trình bảo quản để không làm thay đổi đặc tính, phẩm chất ban đầu của giống. − Làm chậm quá trình trao đổi chất và hô hấp của vi sinh vật và đồng thời cũng ngăn cản quá trình sinh sản của chúng. Mục đích : − Giữ và bảo quản các chủng phân lập dược nhằm đảm bảo nguồn giống để thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo có liên quan đến chủng vi khuẩn đã phân lập. 2.4.8. Phương pháp cấy chuyền [38] Phương pháp cấy chuyền này thực hiện trên môi trường thạch NA mới và định kỳ 1 - 2 tháng cấy chuyền một lần. Ưu điểm: phương pháp này có thể thực hiện áp dụng cho mọi loài vi sinh vật, ngoài ra phương pháp này còn đơn giản, dễ thực hiện. Khuyết điểm : phương pháp này có thời gian bảo quản ngắn, hao phí môi trường, công sức và thời gian cho công việc. Nếu không duy trì được điều kiện tối ưu thì khả năng chủng giống sẽ thay đổi phẩm chất ban đầu mà rất khó xác định được nguyên nhân trong quá trình cấy chuyền 2.4.9. Phương pháp bảo quản lạnh sâu : 32 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Để khắc phục nhược điểm của phương pháp bảo quản giống bằng cấy chuyền qua môi trường mới thì giống vi khuẩn được người giữ giống giử trong điều kiện lạnh sâu. Phương pháp bảo quản này có thể giữ giống vi khuẩn trong thời gian khá dài (từ 3 - 5 tháng, nếu giữ ở -70 0C có thể bảo quản mẫu đến 10 năm mới cần cấy chuyền). Cấy tăng sinh chủng thuần khiết vào chai môi trường NB vô trùng, lắc 150 vòng/ phút/ trong 24 giờ. Sau đó hút 1 ml dịch tăng sinh cho vào eppendoff để đem đi ly tâm ở 10000 vòng/ 15 phút. Hút bỏ dịch lỏng và thu cặn chứa sinh khối vi khuẩn. Hút 0,15 ml glycerol 40 % và 0,85 ml môi trường NB cho vào eppendoff lắc đều và tiến hành bảo quản giống ở tủ lạnh sâu (Glycerol là chất làm giảm nhiệt độ đóng băng và thời gian tan chảy, chúng bao phủ bề mặt tế bào và ngăn cản quá trình hình thành các tinh thể đá gây tổn thương màng tế bào vi khuẩn và các vi sinh vật khác [39]). 2.4.10. Các phương pháp xác định đặc điểm hình thái 2.4.10.1. Quan sát hình thái khuẩn lạc Đối với chủng Bacillus subtilis có khả năng phân giải protein được phân lập tuyển chọn trong ruột cá sau khi cấy trang và cấy ria làm thuần nhiều lần sẽ có hình thái khuẩn lạc riêng rẽ đặc trưng cho chủng loài. Quan sát và mô tả đặc điểm của chủng vi khuẩn phân lập được. 2.4.10.2. Quan sát hình thái tế bào Nhuộm Gram Các chủng nghi ngờ là Bacillus subtilis sau khi được làm thuần bằng phương pháp cấy chuyền nhiều lần được quan sát hình thái vi thể bằng phương pháp nhuộm gram để xác định từng chủng vi khuẩn này thuộc nhóm Gram dương hay Gram âm. Chúng được tăng sinh trong môi trường NB trong 18 - 24 giờ, lắc 150 vòng/ phút ở điều kiện nhiệt độ phòng. Kỹ thuật nhuộm Gram [15] − Làm tiêu bản : dùng que cấy lấy sinh khối làm vết bôi trên lame. Vết bôi sẽ được cố định trên ngọn lửa đèn cồn. − Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm Crystal violet trong 30 giây. − Rửa nước. − Nhuộm lugol trong 1 phút. − Rửa nước. − Tẩy cồn 960 trong 20 - 30 giây, để nghiêng tiêu bản và nhỏ từng giọt cồn cho đến khi tan hết màu. − Rửa nước. 33 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP − Nhuộm bổ sung Fushin hoặc Safranin từ 10 - 30 giây. − Rửa nước. − Để khô và quan sát dưới kính hiển vi. Phương pháp nhuộm bào tử Các chủng vi khuẩn phân lập được được nhuộm bào tử để xác định khả năng sinh bào tử của chúng, nếu chúng có khả năng sinh bào tử chứng tỏ chúng có thể là Bacillus subtilis và ngược lại thì không. Cấy ria vi khuẩn nghi ngờ từ đĩa khuẩn lạc thuần nhất sang đĩa môi trường NA mới và tiến hành đem ủ ở 37 0C trong 4 - 5 ngày với mục đích cho vi khuẩn sinh bào tử. Dùng que cấy vòng vô trùng lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc riêng lẻ để làm vết bôi trên lame. Cố định vết bôi bằng ngọn lửa đèn cồn. Đặt một cốc nước lên bếp từ và đun từ từ đến khi đạt khoảng 80 0C nhằm tăng độ hấp thụ Malachite Green của bào tử rồi đặt một tấm giấy lọc lên miệng cốc. Đặt lame có vết bôi lên trên tấm giấy lọc và đặt thêm 1 tấm giấy lọc nữa lên vết bôi, nhỏ từ từ Malachite Green 5 % lên phía trên vết bôi và luôn giữ cho chúng không bị khô trong vòng 5 phút nhuộm. Rửa vết bôi bằng nước cất khoảng 30 giây. Nhuộm bổ sung với thuốc nhuộm Fushin trong khoảng 60 - 90 giây rồi rửa lại bằng nước cất. Thấm khô và quan sát dưới vật kính 100x cùng dầu soi kính. 2.4.11. Các thử nghiệm sinh hóa đối với các chủng vi khuẩn phân lập nghi ngờ là Bacillus subtilis. 2.4.11.1. Thử nghiệm catalase Dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần nhất của từng chủng vi khuẩn nghi ngờ lên lame , nhỏ 1 giọt H2O2 30 % lên sinh khối vi sinh vật trên lame. Quan sát hiện tượng và ghi nhận kết quả sủi bọt khí. 2.4.11.2. Thử nghiệm khả năng di động. Sử dụng môi trường NA 0,5 % agar. Đun tan môi trường rồi phối vào ống nghiệm sao cho chiều sâu thạch khoảng 4 cm rồi làm nút đậy kín và đem đi hấp khử trùng. Để môi trường nguội và đặc lại thì tiến hành cấy đâm sâu vi khuẩn vào ống 34 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP thạch mềm bằng que cấy thẳng, cấy đâm sâu không chạm đáy, không chạm thành ống nghiệm và sâu khoảng 2/3 chiều sâu thạch. Thao tác tuân thủ nghiêm túc yêu cầu vô trùng, ủ ống nghiệm đã cấy đâm sâu ở nhiệt độ 37 0C trong 48 giờ và quan sát khả năng di động làm đục môi trường của chủng vi khuẩn thử nghiệm. 2.4.11.3. Thử nghiệm indol Tăng sinh giống trong môi trường NB để ổn định giống cho thử nghiệm, sau khi tăng sinh xong giống vi khuẩn sẽ được cấy chuyền qua môi trường đĩa thạch NA và ủ trong tủ ấm 37 0C trong 24 giờ lấy khuẩn lạc thuần. Cấy sinh khối chủng vi khuẩn phân lập được cần test indol vào môi trường NB, ủ 37 0C trong 48 giờ. Nhỏ vài giọt ether vào kéo indol lên rồi nhẹ nhàng nhỏ tiếp vài giọt thuốc thử Kovac’s vào ống dịch nuôi cấy, để yên và chờ sau vài phút. Không lắc ống nghiệm để theo dõi quan sát ghi nhận kết quả có hay không có vòng đỏ cánh sen trên bề mặt môi trường. 2.4.11.4. Thử nghiệm VP Tăng sinh giống trong môi trường NB để ổn định giống cho thử nghiệm, sau khi tăng sinh xong giống vi khuẩn sẽ được cấy chuyền qua môi trường đĩa thạch NA và ủ trong tủ ấm 37 0C trong 24 giờ lấy khuẩn lạc thuần. Dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ các khuẩn lạc riêng rẽ của các chủng phân lập được cấy vào môi trường MR - VP đã hấp khử trùng 121 0C, 1 atm trong 15 phút. Ủ môi trường nuôi cấy trong tủ ấm 37 0C trong 2 - 5 ngày. Nhỏ 3 giọt α - napthol vào rồi tiếp tục nhỏ thêm 1 giọt KOH 40 %, lắc nhẹ và đọc kết quả màu, đọc kết quả sau 20 phút và chậm nhất là 4 giờ [14]. 2.4.11.5. Thử nghiệm Nitrate Tăng sinh giống trong môi trường NB để ổn định giống cho thử nghiệm, sau khi tăng sinh xong giống vi khuẩn sẽ được cấy chuyền qua môi trường đĩa thạch NA và ủ trong tủ ấm 37 0C trong 24 giờ lấy khuẩn lạc thuần. Dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối vi khuẩn cần test định danh cấy vào môi trường Nitrate Broth đã hấp khử trùng. Ủ môi trường nuôi cấy trong tủ ấm 37 0C sau 48 giờ. Nhỏ thuốc thử Griess A và Griess B lần lượt vào môi trường nuôi cấy và quan sát sự thay đổi màu sắc. Nếu không thấy sự hóa hồng của môi trường cần phải tiếp tục thêm viên kẽm vào để xác định khả năng sử dụng nitrate của các chủng thử nghiệm. 35 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.4.11.6. Thử nghiệm MR Tăng sinh giống trong môi trường NB để ổn định giống cho thử nghiệm, sau khi tăng sinh xong giống vi khuẩn sẽ được cấy chuyền qua môi trường đĩa thạch NA và ủ trong tủ ấm 37 0C trong 24 giờ lấy khuẩn lạc thuần. Dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ các khuẩn lạc riêng rẽ của các chủng phân lập được cấy vào môi trường MR - VP đã hấp khử trùng 121 0C, 1 atm trong 15 phút. Ủ môi trường nuôi cấy trong tủ ấm 37 0C trong 2 - 5 ngày. Nhỏ 1 giọt thuốc thử Methyl red vào dịch nuôi cấy và quan sát sự xuất hiện màu đỏ của môi trường ngay sau đó, ghi nhận kết quả 2.4.11.7. Thử nghiệm lên men Carbohydrate Tăng sinh giống trong môi trường NB để ổn định giống cho thử nghiệm, sau khi tăng sinh xong giống vi khuẩn sẽ được cấy chuyền qua môi trường đĩa thạch NA và ủ trong tủ ấm 37 0C trong 24 giờ lấy khuẩn lạc thuần. Pha môi trường Carbohydrate Agar như trong thành phần môi trường có bổ sung phenol red và đem hấp khử trùng ở 121 0C đối với các nguồn carbonhydrate như Lactose, Saccharose, Maltose và 118 0C với nguồn carbohydrate như Glucose, Mannitol trong 15 phút. Môi trường được dựng làm thạch nghiêng đứng có màu vàng cam. Cấy đâm sâu 2/3 ống thạch nghiêng (không chạm thành và đáy ống nghiệm) đối với phần sâu và ria với phần nghiêng. Ủ ở nhiệt 37 0C trong 2 ngày trong tủ ấm đối với phần đâm sâu và cấy ria đối với phần nghiêng. Quan sát ghi nhận kết quả thí nghiệm. 2.4.11.8. Thử nghiệm Citrate Tăng sinh giống trong môi trường NB để ổn định giống cho thử nghiệm, sau khi tăng sinh xong giống vi khuẩn sẽ được cấy chuyền qua môi trường đĩa thạch NA và ủ trong tủ ấm 37 0C trong 24 giờ lấy khuẩn lạc thuần. Cân và đun tan môi trường Simmon Citrate Agar, phối môi trường vào các ống nghiệm, làm nút đậy và tiến hành hấp khử trùng. Hấp khử trùng xong thì tiến hành làm thạch nghiêng. Cấy ria chủng vi khuẩn khảo sát lên môi trường và ủ ở nhiệt 37 0C trong 2 ngày trong tủ ấm. 36 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Quan sát và ghi nhận kết quả thay đổi màu của chủng vi khuẩn khảo sát. 2.4.12. Phương pháp đục lỗ thạch Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp đục lỗ thạch của Egorow NX (1976), dựa vào khả năng khuếch tán của các enzyme được bơm vào lỗ thạch [14]. Phương pháp này được thực hiện theo các bước sau: Pha môi trường chứa 1 % casein, 1,7 % agar, 1000ml nước cất; chuẩn bị đầu tuýp 1000µl, 100 µl, eppendorf đem hấp vô trùng ở 121 0C, 1atm trong 15 phút. Chuẩn bị dịch enzyme: tiến hành tăng sinh chủng vi khuẩn cần khảo sát trong môi trường NB, lắc 150 vòng/ phút/ 24 giờ rồi tiếp tục cấy giống qua môi trường thu enzyme NB có bổ sung 2 % mật rỉ đường, môi trường bổ sung 2 % mật rỉ đường là môi trường tối ưu thu enzyme [37] và điều chỉnh pH về nồng độ lần lượt là 3, 4, 5, 6, 7, 8. Nuôi cấy vi khuẩn trong dịch thu enzyme ở 37 0C trong 24 giờ và lắc 150 vòng/ phút. Hút 1 ml dịch nuôi cây thu enzyme vào eppendoff và tiến hành làm lạnh để tránh làm bất hoạt enzyme do tăng nhiệt độ khi ly tâm 10000 vòng/ phút/ 15 phút. Môi trường Casein agar 1 % được điều chỉnh pH về nồng độ lần lượt là 4, 5, 6, 7, 8 và hấp khử trùng. Để môi trường giảm nhiệt độ xuống khoảng 60 0C thì tiến hành đổ đĩa. Đợi môi trường đông đặc thì dùng dụng cụ đụ lỗ thạch đục lỗ trên mặt thạch. Hút 0,1 ml dịch enzyme thô sau ly tâm cho vào lỗ thạch Casein đã điều chỉnh nồng độ pH và đã đục lỗ. Ủ nhiệt độ phòng trong 48 giờ rồi nhỏ Tricholoacetic acid vào quan sát và đo vòng trong suốt chính là vòng phân giải casein. Nếu chủng vi khuẩn thử nghiệm có kết quả sinh protease dương tính khi nhỏ Tricholoacetic acid vào đĩa thạch sẽ xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch. Nếu chủng vi khuẩn không có khả năng sinh protease sẽ không hình thành vòng trong suốt khi nhỏ Tricholoacetic acid vào đĩa thạch. Khả năng phân giải protein được đánh giá qua hiệu số (D - d) mm. D - d có hiệu số càng lớn thì khả năng sinh enzyme càng cao D: đường kính vòng phân giải lớn (mm) d: đường kính vòng đục lỗ hay đường kính khuẩn lạc tế bào (mm). 37 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.4.13. Phương pháp nghiên cứu khả năng phân giải tinh bột, protein. Khả năng phân giải tinh bột, protein của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được xác định bằng phương pháp đục lỗ thạch định tính hoạt lực phân giải của 8 chủng vi khuẩn phân lập được từ đề tài này. Cách tiến hành là nuôi cấy vi khuẩn cần test hoạt tính enzyme trong môi trường NB và sau đó là lấy sinh khối vi khuẩn cấy điểm lên môi trường thạch Starch agar và casein agar bằng phương pháp cấy điểm hoặc đục lỗ thạch. 2.4.14. Phương pháp xử lý số liệu thống kê Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft excel 2013. Các biểu đồ được xử lý bằng phần mềm Microsoft excel 2013. Các số liệu thô được xử lý bằng phần mềm SAS 9.1. 38 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập và lựa chọn các chủng có khả năng là Bacillus subtilis Mẫu ruột cá được thu nhận và rửa sạch, đồng nhất và cấy trang trên môi trường NA, sau 24 – 48 giờ nuôi cấy trong điều kiện 37 0C thu được 8 chủng vi khuẩn có hình thái đặc điểm khuẩn lạc giống với Bacillus subtilis đặc trưng như khuẩn lạc tròn, nhăn, rìa nhăn, bề mặt sau 3 đến 4 ngày nuôi ủ chuyển sang khô, nhăn và sậm màu lại. Tuy 8 chủng vi khuẩn đều có những đặc điểm chung nhưng xét cụ thể từng chủng thì giữa chúng vẫn còn tồn tại những điểm đặc trưng khác biệt về hình thái. Dưới đây là bảng 3.1 thể hiện cụ thể đặc điểm hình thái của mỗi chủng mà đồ án phân lập được kể cả những đặc điểm chung và riêng biệt để phân biệt chúng với nhau. Bảng 3. 1 Đặc điểm hình thái cụ thể của 8 chủng vi khuẩn đồ án phân lập được. Tên chủng Hình ảnh Hình thái khuẩn lạc Khuẩn lạc lớn, nhăn nheo, không cân đối, màu hơi trong suốt, bờ răng cưa đều, tâm và BDH1 rìa khuẩn lạc nhô cao. Khuẩn lạc phát triển nhanh chóng 39 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP BDH2 Khuẩn lạc tròn đều, bề mặt nhăn, bờ răng cưa đều, màu trắng đục, khô và có tâm sậm màu hơn. Khuẩn lạc bám chặt bề mặt thạch, phát triển đồng tâm, phát triển nhanh chóng sau 2 ngày nuôi cấy BDH3 Khuẩn lạc không cân đối, nhăn, bờ răng cưa đều, răng cưa nhỏ màu trắng đục, mỏng và lan rộng khắp mặt thạch nhanh chóng BDH4 Khuẩn lạc không cân đối, lớn, bờ răng cưa đều, nhăn, màu trắng xám, rìa khuẩn lạc nhô cao 40 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Khuẩn lạc không cân đối, nhăn nhiều, rìa khuẩn lạc nhô cao và lõm giữa tâm nhăn, bờ đều và BDH5 nhô cao, màu trắng xám. Khuẩn lạc không đối xứng, rìa nhăn nhiều, màu vàng xám và có lõm ở giữa, khuẩn lạc phát BDH6 triển nhanh chóng. Khuẩn lạc tròn cân đối, bờ đều, rìa răng cưa, màu nâu vàng, phát triển đến ngày thứ tư trở BDH7 nên lồi, bề mặt hơi khô Khuẩn lạc không cân đối, rìa răng cưa không đều nhăn BDH8 nhiều, màu trắng xám. Phát triển nhanh chóng sau ngày thứ 2. 41 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Dựa vào sự khác biệt và đặc trưng trên để làm cơ sở cho công tác kiểm tra độ ổn định và chính xác của giống trước và sau khi giữ giống. Các khuẩn lạc rời rạc có đặc điểm như bảng 3.1 được nghi ngờ là Bacillus subtilis này được cấy ria nhiều lần để làm thuần và bảo quản giữ giống trong eppendoff chứa glycerol 40 % giữ ở -4 0C để sử dụng cho các mục đích nghiên cứu tiếp theo. 3.2. Kết quả thử nghiệm sinh hóa 3.2.1. Kết quả test catalase Thử nghiệm được thực hiện bằng cách nhỏ dịch H2O2 30 % vào vết sinh khối vi khuẩn trên lame ghi nhận được kết quả là sinh khối ở chủng BDH1, BDH2, BDH3, BDH4, BDH5, BDH6, BDH7, BDH8 sủi bọt khí khi vừa tiếp xúc với H2O2 30 %. Điều này chứng tỏ rằng các chủng vi khuẩn BDH1, BDH2, BDH3, BDH4, BDH5, BDH6, BDH7, BDH8 được chọn lựa đưa vào test hoạt tính catalase đều có tiết ra enzyme phân giải H2O2 hình thành bọt khí. Hiện tượng ghi nhận kết quả dương tính của thử nghiệm catalase, từ kết quả thử nghiệm này sẽ được lưu làm cơ sở cho việc khẳng định Bacillus subtilis. Hình 3. 1 Kết quả thử nghiệm catalase 3.2.2. Nhuộm gram Nhuộm gram vi khuẩn cho kết quả cả 8 chủng vi khuẩn đều là gram dương, kết quả này làm cơ sở để quyết định tiếp tục thực hiện các thử nghiệm khẳng định Bacillus subtilis sau đó hay dừng lại. Trong phân lập Bacillus subtilis nên chọn thử nghiệm này làm trước vì là bước thử nghiệm sinh hóa cơ bản và đơn giản để phân biệt được khác biệt giữa vi khuẩn gram âm và gram dương cho kết quả nhanh chóng và chính xác, kết quả nhuộm soi khi quan sát trên kính hiển vi với vật kính 100x có dầu soi cho quan sát được hình thái vi thể của chủng vi sinh vật đang nghiên cứu 42 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP đều là hình que, bắt màu tím của Gentian violet mà không có khả năng bắt màu hồng của Fushin khi nuôi cấy được 18 giờ trong môi trường NB. Kết quả này cho thấy 8 chủng vi khuẩn mà đề tài này phân lập được có vách peptidoglycan dày, bắt màu tốt với Gentian violet và iod nên quá trình tẩy màu bằng cồn không tẩy được hết màu tím khỏi lớp peptidoglycan của chúng nên chúng không thể tiếp tục bắt màu hồng của dung dịch thuốc nhuộm Fushin trong khi mẫu đối chứng âm là vi khuẩn E.coli lại bắt màu hồng. Kết quả còn cho thấy rằng 8 chủng vi khuẩn phân lập được có hình thái vi thể khác nhau: kích thước và hình dạng khác nhau chứng tỏ các chủng này có khác nhau và có khả năng là Bacillus subtilis. Dựa vào kết quả này để ghi nhận lại góp phần vào quá trình khẳng định chủng vi khuẩn phân lập có phải Bacillus subtilis của đồ án. BDH1 BDH2 BDH3 BDH4 BDH5 BDH6 43 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP BDH7 BDH8 Hình 3. 2 Hình thái tế bào các chủng vi khuẩn phân lập khi nhuộm Gram 3.2.3. Nhuộm bào tử Các tế bào của vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử khi môi trường dinh dưỡng cạn kiệt sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường đĩa thạch. Kết quả soi dưới kính hiển vi sau khi nhuộm bào tử với thuốc nhuộm Malachite Green 5 % được quan sát và ghi nhận dưới kính hiển vi mức phóng đại 100x có soi dầu cho thấy 8 chủng vi khuẩn phân lập được có bào tử bắt màu được với malachite green có màu xanh và những tế bào chưa có bào tử sẽ bắt được màu với fushin có màu hồng. Qua việc soi thấy bào tử bắt được màu của Malachite green 5 % cho thấy rằng 8 chủng vi khuẩn này có khả năng sinh ra bào tử khi điều kiện môi trường cạn kiệt dinh dưỡng, đây là cơ sở khẳng định những chủng này có khả năng tồn tại trong môi trường khắc nghiệt và phù hợp với đặc điểm của Bacillus subtilis. Theo ghi nhận thì thời gian nuôi cấy càng kéo dài thì bào tử hình thành càng nhiều và các tế bào của các chủng vi khuẩn có xu hướng ngắn dần đi. Nguyên nhân của việc hình thành bào tử là do trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật sử dụng thành phần dinh dưỡng trong môi trường và hình thành một số sản phẩm bất lợi nên kích thích tế bào hình thành bào tử. “Theo Banwart (2000), trong tất cả các loài không phải tất cả các tế bào đều hình thành bào tử dù ở trong bất kỳ điều kiện nào. Theo Nguyễn Lân Dũng (1983) với các phương pháp nhuộm màu thông thường bào tử không bị bắt màu hoặc chỉ bắt màu rất nhạt. Để nhuộm bào tử phải dùng các dung dịch thuốc nhuộm đậm đặc (Malachite green hoặc xanh methylen) và vừa nhuộm vừa đun nóng.” [14]. 44 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP BDH1 BDH2 BDH3 BDH4 BDH5 BDH6 BDH7 BDH8 Hình 3. 3 Kết quả nhuộm soi bào tử của chủng phân lập được 3.2.4. Kết quả thử nghiệm Citrate Thử nghiệm citrate thực hiện trên môi trường Simmon Citrate cho kết quả dương tính. Màu của môi trường thạch nghiêng sau khi cấy vi khuẩn vào đổi sang màu xanh dương sau 48 giờ nuôi cấy, tuy nhiên khả năng sử dụng của các chủng 45 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP khá khác nhau, 1 số chủng phát triển mạnh làm môi trường biến đổi màu sắc nhiều, ngược lại có một số chủng như BDH2, BDH7 phải đợi thời gian ủ dài hơn mới làm kiềm hóa được thạch nghiêng biến đổi màu chất chỉ thị trong môi trường sang màu xanh dương dương tính. Điều này chứng tỏ rằng 8 chủng thử nghiệm có khả năng sử duṇ g Citrate như là nguồn Carbon duy nhất nhưng mức độ sử dụng khác nhau nhưng vẫn sử duṇ g được muối ammonium như là nguồn đaṃ duy nhất và sinh ra NH3 làm kiềm hóa môi trường. Kết quả thử nghiệm thể hiện qua hình 3.4 dưới đây. Hình 3. 4.Thử nghiệm Citrate đối với các chủng phân lập được 3.2.5. Kết quả thử nghiệm Nitrate Thử nghiệm này thực hiện trên môi trường Nitrate broth cho kết quả dương tính. Sau 48 giờ nuôi cấy vi khuẩn phát triển hình thành sinh khối làm đục môi trường nuôi cấy. Dịch nuôi cấy đổi sang màu đỏ hồng khi thêm thuốc thử vào, cường độ màu khác nhau giữa các chủng thử nghiệm. 46 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Việc test Nitrate cho kết quả dịch nuôi cấy có màu đỏ khi cho thuốc thử vào cho thấy có sư ̣ khử tạo ra sản phẩm là nitrite, ammonia, nitơ phân tử , hydroxylamine hay nitric oxide. Sư ̣ hình thành sản phẩm cuối cùng phu ̣ thuôc̣ vào từ ng loaị vi sinh vâṭ và điều kiêṇ môi trường. Một điều nữa là hầu hết các vi sinh vâṭ hiếu khí khử đươc̣ nitrate là các sinh vâṭ hiếu khí tù y nghi, chỉ thưc̣ hiêṇ quá trình khử nitrate trong điều kiêṇ không có oxy phân tử như Bacillus subtilis, đây càng góp phần chứng minh vi khuẩn phân lập được có khả năng là Bacillus subtilis. Kết quả thử nghiệm thể hiện ở hình 3.5 Hình 3.5 Kết quả khảo sát khả năng khử nitrate của chủng vi khuẩn phân lập được. 3.2.6. Thử nghiệm MR - VP 3.2.6.1. Thử nghiệm Methyl red (MR): Dịch nuôi cấy vi khuẩn là môi trường tổng hợp MR - VP broth được ủ 37 0C trong 2 ngày rồi nhỏ thuốc thử Methyl red vào cho ra kết quả là môi trường chuyển sang màu đỏ - đây là kết quả dương tính cho thử nghiệm này chứng tỏ vi khuẩn trong thử nghiệm lên men Glucose và lưu giữ các sản phẩm mang tính acid hạ pH môi trường khiến cho chỉ thị màu Methyl red chuyển sang màu đỏ [15]. 47 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Kết quả dương tính này góp phần cùng thử nghiệm khác chứng minh các chủng đây có thể là Bacillus subtilis vì chúng có khả năng lên men đường và giữ được các sản phẩm acid cho kết quả dương tính. Hình 3.6 cho thấy kết quả thử nghiệm Methyl red của thử nghiệm Hình 3. 6 Hình ảnh test Methyl red của các chủng phân lập được. 3.2.6.2. Thử nghiệm Voges Proskauer (VP) Canh trường MR - VP được sử dụng để tăng sinh vi khuẩn trong thử nghiệm này sau khi nuôi ủ 5 ngày được lấy ra nhỏ α - naphtol 5 % trong cồn và dung dic̣ h KOH 40 % với tỷ lê ̣3 : 1 vào cho ra kết quả là môi trường chuyển sang màu đỏ sau 20 đến 45 phút từ khi nhỏ thuốc thử vào và lắc nhẹ. Môi trường này chuyển sang màu đỏ cho thấy là có acetoin được tạo thành, và lúc nhỏ α - naphtol 5 % và KOH 40 % vào sẽ tạo ra môi trường kiềm mạnh hình thành phức chất màu đỏ hồng là diacetyl. Phản ứng này là phản ứng của nhóm vi khuẩn VP + mà Bacillus subtilis có phản ứng VP +. Dưới đây là hình ảnh kết quả phản ứng VP của các chủng phân lập được 48 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP (-) Hình 3.7 Kết quả phản ứng VP của 8 chủng vi khuẩn phân lập được 3.2.7. Thử nghiệm indole Kết quả thử nghiệm sau 1 ngày nuôi cấy trên dịch NB khi nhỏ ether vào rồi nhỏ tiếp thuốc thử Kovac’s vào không hình thành vòng màu hồng cánh sen trên bề mặt dịch nuôi cấy, bề mặt dịch có màu vàng của thuốc thử Kovac’s cho thấy vi khuẩn phân lập không có khả năng tiết enzyme tryptophanase thủ y phân tryptophan taọ ra sản phẩm là Indole nên không có sự hình thành màu hồng cánh sen trên bề mặt canh trường sau khi thử nghiệm Kết quả âm tính này trùng khớp với đặc điểm sinh hóa của Bacillus subtilis. Hình 3.8 dưới đây chính là kết quả của thử nghiệm 49 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3. 8 Phản ứng test indol ở các chủng được phân lập 3.2.8. Thử nghiệm di động Các chủng vi khuẩn khảo sát đều có khả năng di động khi thực nghiệm khi cấy trong môi trường thạch mềm NA 0,5 % bằng cấy đâm sâu có vi khuẩn mọc lan ra đường cấy và làm đục môi trường. Các đường cấy mọc hơi xoắn quanh trục cấy. điều này khẳng định được rằng các chủng phân lập được có khả năng di động 50 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3. 9 Khả năng di động của 8 chủng phân lập được 3.2.9. Thử nghiệm lên men Carbohydrate Kết quả thử nghiệm lên men Carbohydrate 8 chủng vi khuẩn có khả năng phát triển làm đục môi trường thạch nghiêng có cơ chất tương ứng, chúng làm môi trường kiềm hóa phía trên mặt nghiêng làm cho chỉ thị Phe