Đồ án Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính trên mô hình in vitro

ung thực và chưa từng được các tác giả khác công bố trong các nghiên, đồ án nào Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ trong việc hoàn thành luận án đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong đồ đã được ghi rõ nguồn gốc. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong đồ án này. TP.HCM, ngày tháng năm 2016 Sinh viên LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự động viên và giúp đỡ rất lớn từ cá nhân và tập thể. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn ThS. Nguyễn Thị Thu Hương, giảng viên Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, người đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Phòng thí nghiệm Trường Đại học Công nghệ TP. HCM đã tạo mọi điều kiện cơ sở vật chất tốt cho tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các bạn trong nhóm sinh viên làm nghiên cứu khoa học đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã động viên giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn này. TP.HCM, ngày tháng năm 2016 Sinh viên thực hiện Huỳnh Kim Khánh ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC MỤC LỤC .................................................................................................................. 1 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................ 4 DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. 5 DANH MỤC SƠ ĐỒ ................................................................................................. 6 DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... 7 MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 9 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................ 14 1.1. Tổng quan về cây củ đậu ........................................................................... 14 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại ....................................................................... 14 1.1.2. Đặc điểm và sinh thái .......................................................................... 15 1.1.3. Tình hình trồng trọt, tiêu thụ và kỹ thuật canh tác cây củ đậu ở Việt Nam.. .............................................................................................................. 16 1.1.4. Thành phần hóa học ............................................................................ 21 1.1.5. Tính vị và công dụng ........................................................................... 21 1.2. Hợp chất Phenol, Flavonoid và Rotenone ............................................... 22 1.2.1. Phenol ................................................................................................... 22 1.2.2. Flavonoid .............................................................................................. 25 1.2.3. Rotenone ............................................................................................... 30 1.3. Các phương pháp tách chiết hợp chất thứ cấp trong thực vật ............. 33 1.3.1. Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng .................................................................... 33 1.3.2. Kỹ thuật chiết rắn – lỏng ..................................................................... 35 1.4. Phương pháp đánh giá độc tính và xác định giá trị LC50 ...................... 41 1.5. Phương pháp xác định khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh .. 45 1 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.6. Sinh vật thí nghiệm .................................................................................... 47 1.6.1. Động vật giáp xác - Artemia Nauplii .................................................. 47 1.6.2. Các chủng vi sinh vật thí nghiệm ........................................................ 49 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................. 56 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................ 56 2.2. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 56 2.3. Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm ............................................................... 56 2.3.1. Dụng cụ ................................................................................................ 56 2.3.2. Hóa chất ............................................................................................... 57 2.4. Phương pháp .............................................................................................. 57 2.5. Nội dung thí nghiệm .................................................................................. 58 2.5.1. Phương pháp tách chiết và thu cao chiết ........................................... 59 2.5.2. Phương pháp định tính một số hợp chất thứ cấp trong lá cây củ đậu .............................................................................................................. 62 2.5.3. Phương pháp định lượng một số hợp chất thứ cấp trong lá củ đậu . 63 2.5.4. Phương pháp đánh giá độc tính .......................................................... 66 2.5.5. Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn ................................ 68 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 73 3.1. Thu nhận cao chiết từ lá củ đậu bằng các phương pháp và dung môi khác nhau.............................................................................................................. 73 3.2. Định tính một số hợp chất thứ cấp trong lá củ đậu ................................ 74 3.2.1. Định tính flavonoid .............................................................................. 74 3.2.2. Định tính rotenone ............................................................................... 75 2 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.3. Định lượng một số hợp chất thứ cấp và chất khô trong các loại cao chiết.. ..................................................................................................................... 76 3.3.1. Hàm lượng chất khô ............................................................................ 76 3.3.2. Định lượng polyphenol tổng số ........................................................... 76 3.3.3. Định lượng Flavonoid tổng số ............................................................ 80 3.4. Khảo sát độc tính ....................................................................................... 84 3.5. Thử hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết ................................. 86 3.5.1. Hoạt tính kháng Enterotoxigenic E.Coli của các loại cao chiết ....... 86 3.5.2. Hoạt tính kháng Listeria monocytogenes của các loại cao chiết ...... 88 3.5.3. Hoạt tính kháng Pseudomonas aeruginosa của các loại cao chiết ... 89 3.5.4. Không có hoạt tính kháng một số vi sinh vật của các loại cao chiết . 90 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................... 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 95 PHỤ LỤC 3 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AG: Acid Gallic BVTV: Bảo vệ thực vật db: vật liệu ĐC: Đối chứng DMSO: Dimethyl sulfoxide LC50: Lethal concentration NA: Nutrient Agar NB: Nutrient Broth NĐ: Nồng độ OD: Optical density HTHC: Hợp chất thứ cấp 4 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC BẢNG Bảng 1. 1. Hiệu quả tác động của Nicotin Sulphat (trong dung dịch 1% saponin) đối với ruồi giấm ............................................................................................................. 42 Bảng 1. 2. Phân tích nguồn biến lượng..................................................................... 43 Bảng 2. 1. Bố trí thí nghiệm thử độc tính trên Artemia Nauplii ............................... 67 Bảng 3. 1. Kết quả định tính một số hợp chất thứ cấp trong cao chiết và lá củ đậu 75 Bảng 3. 2. Kết quả hàm lượng chất khô của các loại cao chiết ................................ 76 Bảng 3. 3. Kết quả đường chuẩn Acid Gallic ........................................................... 77 Bảng 3. 4. Kết quả hàm lượng polyphenol tổng trong 4 loại cao chiết lá củ đậu .... 78 Bảng 3. 5. Bảng kết quả đường chuẩn Rutin ............................................................ 81 Bảng 3. 6. Bảng kết quả hàm lượng flavonoid tổng số trong 4 loại cao chiết ......... 82 Bảng 3. 7. Kết quả các đường chuẩn và LC50 tương ứng của 4 loại cao chiết ......... 84 Bảng 3. 8. Nồng độ LC50 (mg/L) của 4 loại cao chiết .............................................. 86 Bảng 3. 9. Kết quả kháng Enterotoxigenic E.Coli của 4 loại cao chiết .................... 87 Bảng 3. 10. Kết quả kháng Listeria monocytogenes của các loại cao chiết ............. 88 Bảng 3. 11. Kết quả kháng Pseudomonas aeruginosa của 4 loại cao chiết .............. 89 Bảng 3. 12. Kết quả kháng một số loại vi sinh vật của 4 loại cao chiết ................... 91 5 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2. 1. Nội dung thí nghiệm ............................................................................... 58 Sơ đồ 2. 2. Quá trình tách chiết và thu cao chiết từ lá củ đậu .................................. 59 Sơ đồ 2. 3. Quy trình định lượng polyphenol tổng ................................................... 65 Sơ đồ 2. 4. Quy trình đánh giả khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá củ đậu ....... 69 6 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH Hình 1. 1. Cây củ đậu ............................................................................................... 14 Hình 1. 2. Thương lái thu mua củ đậu ngay tại đồng ruộng..................................... 17 Hình 1. 3. Cây củ đậu được trồng theo luống .......................................................... 19 Hình 1. 4. Củ đậu đến thời gian thu hoạch ............................................................... 20 Hình 1. 5. Tephrosin ................................................................................................. 21 Hình 1. 6. Rotenone .................................................................................................. 21 Hình 1. 7. Củ đậu tốt cho sức khỏe .......................................................................... 22 Hình 1. 8. Một số món ăn được chế biến từ củ đậu.................................................. 22 Hình 1. 9. Một số hợp chất phenol ........................................................................... 24 Hình 1. 10. Một số Eucoflavonoid ........................................................................... 25 Hình 1. 11. Công thức cấu tạo và cấu trúc 3D của rotenone .................................... 31 Hình 1. 12. Chuỗi truyền điện tử và cơ chế tác động của rotenone trong ty thể ...... 32 Hình 1. 13. Rotenone ngăn cản sự truyền điện tử đến CoQ ..................................... 32 Hình 1. 14. Chiết 2 lớp chất lỏng ............................................................................. 34 Hình 1. 15. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt ....................................................................... 35 Hình 1. 16. Bộ chiết Soxhlet .................................................................................... 37 Hình 1. 17. Máy chiết Kumagawa ............................................................................ 38 Hình 1. 18. Bộ lôi cuốn hơi nước ............................................................................. 38 Hình 1. 19. Sơ đồ hệ thống chiết siêu tới hạn .......................................................... 39 Hình 1. 20. Cột chiết pha rắn .................................................................................... 40 Hình 1. 21. Ấu trùng và trứng Artemia Nauplii ....................................................... 48 Hình 1. 22. Vi khuẩn Salmonella ............................................................................. 50 Hình 1. 23. Vi khuẩn Staphylococcus aureus ........................................................... 51 Hình 1. 24. Listeria monocytogenes ......................................................................... 52 Hình 1. 25. Vi khuẩn Escherichia coli ...................................................................... 53 Hình 1. 26. Pseudomonas aeruginosa ....................................................................... 54 Hình 2. 1. Lá cây củ đậu ........................................................................................... 56 7 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 2. 2. Phương pháp ngâm dầm .......................................................................... 60 Hình 2. 3. Phương pháp chiết Soxhlet ...................................................................... 61 Hình 2. 4. Ngâm lá với chloroform và dịch chiết sau khi cô trên kính đồng hồ ...... 63 Hình 2. 5. Các loại cao chiết trên kính đồng hồ ....................................................... 63 Hình 2. 6. Bố trí thí nghiệm thử độc tính trên ấu trùng Artemia Nauplii ................. 68 Hình 3. 1. 4 loại cao chiết ......................................................................................... 73 Hình 3. 2. Cao chiết chuyển từ nâu sang vàng sau khi cho 1% NaOH/etanol 96o ... 74 Hình 3. 3. Dịch chiết có màu tím khi nhỏ 1 giọt H2SO4đđ và thêm vài hạt natri nitrit ................................................................................................................................... 75 Hình 3. 4. Cao chiết có màu tím khi nhỏ 1 giọt H2SO4đđ và thêm vài hạt natri nitrit ................................................................................................................................... 75 Hình 3. 5. Dung dịch dựng đường chuẩn Acid Gallic .............................................. 77 Hình 3. 6. Màu nâu vàng sang xanh lam của cao chiết sau khi ủ ở 40oC ................ 77 Hình 3. 7. Đường chuẩn Acid Gallic ........................................................................ 78 Hình 3. 8. Sự chênh lệch hàm lượng polyphenol tổng số của 4 loại cao chiết ........ 78 Hình 3. 9. Dung dịch Rutin chuẩn ............................................................................ 81 Hình 3. 10. Đo hàm lượng flavonoid tổng số của cao chiết ..................................... 81 Hình 3. 11. Đường chuẩn Rutin ............................................................................... 82 Hình 3. 12. Sự chênh lệch hàm lượng flavonoid tổng số của 4 loại cao chiết ......... 82 Hình 3. 13. Đường chuẩn của cao chiết A................................................................ 84 Hình 3. 14. Đường chuẩn của cao chiết C ................................................................ 85 Hình 3. 15. So sánh LC50 của 4 loại cao chiết .......................................................... 85 Hình 3. 17. Vòng kháng Enterotoxigenic E.Coli của 4 loại cao chiết ..................... 87 Hình 3. 18. Vòng kháng Listeria monocytogenes của 4 loại cao chiết .................... 88 Hình 3. 19. Vòng kháng Pseudomonas aeruginosa 4 loại cao chiết ......................... 89 Hình 3. 20. Kết quả không kháng Salmonella của 4 loại cao chiết .......................... 90 Hình 3. 21. Kết quả không kháng Staphylococcus aureus của 4 loại cao chiết ...... 91 8 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Từ xa xưa, nông dân ở nhiều nước trên thế giới đã biết sử dụng một số loài thực vật chứa chất độc để trừ một số loại côn trùng gây hại trên cây trồng và gia súc bằng cách phun lên cây hay dùng nước chiết để tắm cho gia súc. Trên thế giới có khoảng 2000 loài cây có chất độc, trong đó có 10 – 12 loài cây được dùng phổ biến. Thuốc thảo mộc diệt trừ côn trùng bằng con đường tiếp xúc và vị độc phổ tác động thường không rộng. Một số loài còn có khả năng diệt cả nhện hại cây. Sau khi sâm nhập, thuốc nhanh chóng tác động đến hệ thần kinh, gây tê liệt và làm chết côn trùng. Cây củ đậu là loại rau củ ngắn ngày, có thể trồng nhiều vụ trong năm, quen thuộc với con người Việt Nam và diện tích trồng trọt rất lớn do mang đến nhiều hiệu quả kinh tế cao. Tuy nhiên, nông dân chỉ thu hoạch và sử dụng củ (rễ phình to), cắt bỏ tất cả phần thân trên gồm thân, lá, hạt. Hạt và lá củ đậu có một số thành phần hóa học tương tự nhau, rất độc, gây ngộ độc và có thể dẫn đến tử vong cho con người nếu vô tình ăn phải hoặc cố ý ăn với liều lượng lớn. Dù vậy, các nghiên cứu về thành phần hóa học và độc tính bên trong hạt và lá củ đậu có thể ứng dụng trong trừ sâu, bệnh hại thực vật vẫn còn rất hạn chế ở nước ta. Việc nghiên cứu sản xuất và bổ sung các chất độc được tách chiết từ thiên nhiên vào thuốc bảo vệ thực vật, hạn chế việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học gây hại cho con người và môi trường luôn được quan tâm. Những hợp chất trừ sâu thảo mộc thông dụng như rotenone và rotenoit, arteminisinin, azadirachtinHiện diện trong một số bộ phận của một số loài cây. Hàm lượng chất độc phụ thuộc loài cây, bộ phận cây, điều kiện sống và thời gian thu hái chúng. Nói chung, các chất này dễ bị phân huỷ dưới tác động của oxy hoá, ánh sáng (đặc biệt là các tia cực tím), ẩm độ, nhiệt độ và pH môi trường nên chúng ít gây độc cho môi sinh môi trường.[7] Sau khi thu hoạch nhiều vụ mùa củ đậu trong năm, nông dân thải bỏ số lượng lớn lá và hạt nhưng chỉ có một số ít nhà nông biết sử dụng hạt củ đậu ngâm nước để 9 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP bảo vệ cây trồng còn rất thủ công và đơn giản. Bên cạnh đó, các công trình nghiên cứu về lá củ đậu cũng như những thành phần độc tính có giá trị của nó rất ít. Do vậy, đề tài “Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính trên mô hình in vitro” được thực hiện, tạo tiền đề khoa học cho các nghiên cứu tạo chế phẩm ứng dụng trong bảo vệ thực vật mang lại nhiều giá trị thực tiễn. 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 2.1. Các nghiên cứu trong nước - Chuyên đề tốt nghiệp “Thử hiệu lực của một số thuốc trừ sâu có nguồn gốc thảo mộc đối với sâu hại chính trên lúa và trên rau cải trong vụ mùa năm 2013 tại xã Thanh An – huyện Điện Biên – tỉnh Điện Biên” Đỗ Đức Anh. Đề tài sử dụng chế phẩm được tách chiết từ hạt củ đậu. - Luận văn thạc sĩ nông nghiệp “Nghiên cứu tác dụng diệt ve kí sinh trên cho và bò của chế phẩm thuốc mỡ từ cây thuốc cá” Nguyễn Thanh Hải (2007). Trong đó, độc tính chủ yếu trong chế phẩm là rotenone tương tự như chất độc bên trong lá củ đậu. - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp “Đặc điểm dịch tễ bệnh ve chó ở hai huyện, thị của tỉnh Thái Nguyên, thử nghiệm thảo dược trong trị ve cho chó” Cù Xuân Đức (2011). Thảo dược của đề tài được dùng cho thử nghiệm là hạt củ đậu. - Luận án phó Tiến sĩ “ Nghiên cứu sử dụng một số loại cây có hoạt tính độc để làm thuốc trừ sâu ở phía Bắc Việt Nam” Nguyễn Duy Trang (2016). Trong đó, đề tài có nghiên cứu về hiệu lực trừ sâu của hạt củ đậu. 2.2. Các nghiên cứu ngoài nước - Sahu Rc, Hameed SF (1983), “Assessment of the rotenoids of Indian yam bean seeds”. Đánh giá rotenoid chiết xuất từ hạt củ đậu trừ các loài sâu, bướm. - Sahu RC, Hameed SF (1989), “Effect of Pachyrrhizus erosus urban seed extracts against tobacco caterpillar, Spodoptera litura F Tobacco Res 15(1):17-20”. Sự ảnh hưởng của hạt củ đậu đối với sâu. 3. Mục tiêu nghiên cứu 10 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Xác định được hàm lượng các chất polyphenol, flavonoid trong cao chiết lá củ đậu. - Đánh giá độc tính và khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá củ đậu làm tiền đề cho việc nghiên cứu ứng dụng làm dược liệu bổ sung vào BVTV. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Nhiệm vụ 1: Nghiên cứu về cơ sở khoa học, tổng quan tài liệu vấn đề nghiên cứu, làm cơ sở cho các nhiệm vụ tiếp theo. - Nhiệm vụ 2: Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm, thông qua các phương pháp xác định, khảo sát, phân tích. - Nhiệm vụ 3: Thu nhận cao chiết lá củ đậu bằng 2 phương pháp ngâm dầm và chiết Soxhlet trong etanol 90o và acetone. - Nhiệm vụ 4: Định tính sơ bộ một số thành phần hóa học chính có trong cao chiết lá củ đậu. - Nhiệm vụ 5: Xác định hàm lượng polyphenol tổng số, flavonoid tổng số từ cao chiết lá củ đậu. - Nhiệm vụ 6: Đánh giá độc tính thông qua giá trị LC50 (nồng độ gây chết trung bình) của cao chiết lá củ đậu, đánh giá khả năng kháng khuẩn trên mô hình in vitro. 5. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp nghiên cứu thu thập tài liệu: Các tài liệu về cây củ đậu, thành phần hóa học của lá và hạt củ đậu, các phương pháp xác định hàm lượng các hợp chất thứ cấp, mô hình đánh giá độc tính, phương pháp đục lỗ thạch, sinh vật thí nghiệm. - Phương pháp làm thí nghiệm: Tiến hành làm các thí nghiệm nhằm giải quyết các nhiệm vụ nghiên cứu. - Phương pháp xử lý số liệu bằng Excel và SAS. Các số liệu thu được sẽ được xử lý nhằm đưa ra kết luận cho đề tài. 11 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 6. Kết quả đạt được của đề tài - Thu nhận được các loại cao chiết lá củ đậu bằng 2 phương pháp ngâm dầm và chiết Soxhlet trong 2 loại dung môi etanol 90o và acetone. - Định tính được sự có mặt của flavonoid, rotenone có sự hiện diện học trong cao chiết lá củ đậu. - Định lượng được: polyphenol tổng số, flavonoid tổng số của các loại cao chiết. - Tìm ra giá trị LC50, so sánh độc tính giữa các loại cao chiết và khả năng kháng một số loại vi sinh vật của các loại cao chiết. 7. Kết cấu đồ án tốt nghiệp - Mở đầu - Chương 1: Tổng quan tài liệu, cơ sở khoa học của đề tài - Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - Chương 3: Kết quả và thảo luận - Chương 4: Kiến nghị - Tài liệu tham khảo 12 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 13 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về cây củ đậu 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại Cây củ đậu hay củ sắn, sắn nước (theo cách gọi miền Nam, danh pháp hai phần: Pachyrhizus erosus) là một cây dây leo. Loài này được Carl von Linné miêu tả khoa học đầu tiên. Tên gọi cây gần như chủ yếu nói về củ của nó.[16] Chi Củ đậu (Pachyrhizus) là một chi nhỏ gồm khoảng 5 – 6 loài dây leo có rể phình to thành củ có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Châu Mỹ. Sau khi người Châu Âu khám phá ra Châu Mỹ một số loài quan trọng trong chi này được giới thiệu sang Châu Phi, Châu Á và Châu Úc. Loài Củ đậu hay củ sắn dây (Pachyrhizus erosus) có nguồn gốc từ Mexico và Trung Mỹ. Người Tây Ban Nha đưa dây củ sắn từ Mexico vào Philippines vào thế kỷ thứ 18 và từ đó cây củ đậu được lan truyền đến các khu vực khác của Đông Nam Á và Trung Quốc. Hiện nay, Cây củ đậu được trồng nhiều ở Châu Mỹ, Trung Quốc và Đông Nam Á. Ở Việt Nam, Cây củ đậu được người Pháp nhập vào đầu thế kỷ 20 và được trồng nhiều ở các tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long và Miền Đông Nam Bộ, ở Miền Bắc gọi là Cây củ đậu. Hình 1. 1. Cây củ đậu 14 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phân loại khoa học Giới (regnum) Plantae Bộ (ordo) Fabales Họ (familia) Fabaceae Phân họ (subfamilia) Faboideae Tông (tribus) Phaseoleae Phân tông (subtribus) Glycininae Chi (genus) Pachyrhizus Loài (species) P. erosus Danh pháp Pachyrhizus erosus 1.1.2. Đặc điểm và sinh thái Cây củ đậu có thể cao 4 – 5 m nếu có giàn. Lá kép gồm 3 chét hình tam giác rộng, mỏng. Hoa màu tím nhạt; ở Việt Nam thường ra vào tháng 4, tháng 5; hoa khá lớn, mọc thành chùm dài ở kẽ lá. Quả hơi có lông, không cuống, dài 12 cm, được ngăn vách nhiều rãnh ngang, thường chứa từ 4 – 9 hạt. Củ do rễ phình to mà thành, có thể dài tới 2 m và nặng đến 20 kg. Vỏ củ có màu vàng và mỏng như giấy còn ruột có màu trắng kem hơi giống ruột khoa tây hay quả lê. Củ đậu có chứa tinh bột 2,4%, 4,51% đường toàn bộ (glucose). Nó có chứa 86 – 90% nước; nó có một ít protein (1,46%) nhưng không có các chất béo. Trái với củ, phần còn lại của cây củ đậu rất độc; hạt có chứa độc tố rotenone, dùng để diệt côn trùng và thuốc cá, diệt rệp rau và rệp thuốc lá. Lá có chứa các chất độc đối với cá và động vật nhai lại (trừ ngựa). Củ đậu nên được bảo quản ở nơi khô ráo, nhiệt độ khoảng 12°C tới 16°C (53°F tới 60°F); nhiệt độ thấp hơn làm hư củ. Củ đậu tươi nếu được cất giữ ở nhiệt độ thích hợp có thể để lâu một hoặc hai tháng. Cây củ đậu được trồng ở châu Mỹ, Trung Quốc và Đông Nam Á, nơi củ đậu sống được chế biến thành nhiều món ăn đa dạng, phong phú. Tại Việt Nam, cây củ đậu được trồng khắp nơi vùng đồng bằng cũng như miền núi để lấy rễ củ ăn, hạt dùng làm thuốc, nhưng ít dùng vì có độc. Mùa thu hoạch hạt: tháng 11 – 12.[17] 15 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.1.3. Tình hình trồng trọt, tiêu thụ và kỹ thuật canh tác cây củ đậu ở Việt Nam 1.1.3.1. Tình hình trồng trọt và tiêu thụ Ở Việt Nam, Cây củ đậu được được trồng nhiều ở các tỉnh Miền Bắc, Đồng bằng Sông Cửu Long và Miền Đông Nam Bộ. Tại huyện Kim Thành, tỉnh Hải Dương, nơi có điều kiện tự nhiên thuận lợi cho phát triển nông nghiệp. Trong cơ cấu sản xuất nông nghiệp của huyện, các loại rau, củ, quả hiện là cây trồng ưu tiên hàng đầu, đặc biệt là cây củ đậu. Cây củ đậu có quy trình canh tác đơn giản, cho năng suất và hiệu quả kinh tế cao. Theo điều tra khảo sát tại 4 xã thuộc huyện Kim Thành, tổng diện tích trồng củ đậu đạt trên 347 ha, chiếm 37,5% diện tích gieo trồng vụ đông với bình quân 3,7 sào/hộ. Giống chủ yếu được cung cấp bởi hệ thống đại lý cung ứng thường là giống của các tỉnh miền Nam. Thời gian trồng chính vụ và trái vụ chênh lệch nhau không nhiều (khoảng 30 ngày) cho năng suất, chất lượng không cao. Sau khi áp dụng sản xuất theo quy trình VietGAP cho năng suất cao, đạt hiệu quả kinh tế lớn hơn so với củ đậu không thực hiện theo VietGAP. Năng suất chính vụ đạt trên 3.000 kg/sào, trái vụ đạt trên 1.800 kg/sào, do tiết kiệm được chi phí phân bón, thuốc bảo vệ thực vật, mỗi sào trồng củ đậu theo VietGAP cho lợi nhuận lớn hơn từ 400 – 500 ngàn đồng, qua đó tăng thu nhập trên 13 triệu đồng/ha/vụ.[18] Tại Đông Triều, tỉnh Quảng Ninh. Hiện nay, toàn huyện có gần 200 ha trồng củ đậu, tập trung ở các xã Tân Việt, Bình Khê, An Sinh, Tràng An, Đức Chính Trong đó, xã Tân Việt là địa phương có diện tích trồng củ đậu nhiều nhất huyện với hơn 72 ha. Được đưa vào trồng ở đồng đất địa phương từ năm 1997, đến nay cả 4 thôn trong xã, bà con nông dân đều tham gia mô hình này. Vụ mùa năm nay, cả xã Tân Việt gieo trồng 164 ha lúa và rau màu, thì củ đậu chiếm hơn 72 ha với gần 600 hộ nông dân tham gia. So với vụ mùa năm trước, diện tích cây củ đậu tăng gần 10 ha. 16 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1. 2. Thương lái thu mua củ đậu ngay tại đồng ruộng Theo đánh giá của địa phương, mỗi ha củ đậu cho thu nhập bình quân 150 triệu đồng, năng suất cao gấp 3 – 4 lần so với cấy lúa. Ngoài ra, cây củ đậu cũng được xã Tân Việt chọn đăng ký sản phẩm trong chương trình “Mỗi xã, thị trấn một sản phẩm nông nghiệp đặc trưng của huyện”. Theo bà con nông dân ở đây cho biết, mỗi sào củ đậu sau khi trừ chi phí, người nông dân thu lãi trung bình 4 – 5 triệu đồng.[19] Vụ mùa năm 2011, người dân ở thôn Mịn To, xã Trù Hựu (Lục Ngạn – Bắc Giang) đã có nguồn thu bạc tỷ từ củ đậu. Cả thôn Mịn To có 42 hộ trồng cây củ đậu với tổng diện tích lên đến gần chục ha. Những hộ trồng diện tích nhiều từ 4 sào trở lên có đến hàng chục hộ. Do điều kiện thời tiết thuận lợi, cộng với việc người dân đã áp dụng tốt kiến thức khoa học kỹ thuật và kinh nghiệm vào sản xuất, nên cây củ đậu sinh trưởng phát triển tốt cho năng suất cao đạt bình quân hơn 3 tấn/sào. Ngoài việc bán buôn cho tiểu thương vào tận ruộng thu mua, nhiều bà con nơi đây còn thu hoạch dần và mang đi bán lẻ ở các chợ trong huyện được giá 4 nghìn đồng/kg. Trước kia, chỉ có vài hộ dân trong thôn Mịn To đưa cây củ đậu về trồng với diện tích nhỏ lẻ. Nhưng từ năm 2007, thấy việc trồng cây củ đậu không khó lại cho hiệu quả kinh tế cao nên nhân dân đã học tập nhau cùng mua giống về trồng. Theo đó diện tích cây củ đậu ngày càng được mở rộng, đến nay đã có gần chục ha.[20] Năm 2011, Phòng Nông nghiệp và PTNT huyện Yên Thế, tỉnh Bắc Giang phối hợp với UBND xã Đồng Kỳ xây dựng cánh đồng mẫu củ đậu, diện tích 21,3 ha tại thôn Ngò 1. Mỗi hộ tham gia được hỗ trợ hơn 100 nghìn đồng/sào và hướng dẫn kỹ 17 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP thuật trồng, chăm sóc. Vụ đầu tiên, năng suất đạt 56 tấn/ha, giá tại ruộng bình quân 3 nghìn đồng/kg, một ha củ đậu người dân có thể thu lãi gần 100 triệu đồng/vụ. Nhờ mang lại hiệu quả kinh tế cao nên xã chủ trương mở rộng diện tích. Hiện xã Đồng Kỳ trồng hơn 70 ha củ đậu.[21] Ngoài ra còn một số tỉnh trồng cây củ đậu với diện tích lớn và đạt hiệu quả kinh tế cao như thị xã Long Khánh tỉnh Đồng Nai, tỉnh Vĩnh Long, tỉnh Thái Bình 1.1.3.2. Kỹ thuật trồng trọt Thâm canh cây củ đậu vụ thu đông đã và đang được nhiều địa phương quan tâm và phát triển trong sản xuất bởi giá trị mang lại của cây trồng này (trừ chi phí thu lãi trung bình từ 10 – 15 triệu đồng/sào, cá biệt có vụ thu lãi trên 20 triệu đồng/sào). Trong khi đó trồng củ đậu không đòi hỏi phải tốn nhiều công chăm sóc cũng như BVTV...Tuy nhiên, để có được năng suất và chất lượng cao cho củ đậu thương phẩm, nhiều nông dân các vùng sản xuất vẫn còn chưa có nhiều kinh nghiệm.  Giống: Hiện tại có 2 giống Chiêm xanh Thái Bình và Chiêm lá nhỏ miền Nam có khả năng chịu được thời tiết khô hạn hoặc ngập úng cũng như lạnh giá.  Lượng hạt cần cho 1 sào (360 m2) khoảng 3,5 – 4,2 kg hạt...i. Sau một thời gian đun cần thiết, dung dịch chiết được rót ra và lọc ngang giấy lọc. Dung môi được cho vào bình cầu và tiếp tục chiết vài lần như thế đến khi chiết kiệt.[6] Hình 1. 17. Máy chiết Kumagawa 1.3.2.5. Phương pháp chưng cất Khi đun sôi một hỗn hợp lỏng, chất nào có nhiệt độ thấp hơn sẽ chuyển thành hơi sớm hơn và nhiều hơn. Khi gặp lạnh, hơi sẽ ngành tụ thành dạng lỏng chứa chủ yếu là chất có nhiệt độ sôi thấp hơn. Quá trình đó gọi là sự chưng cất. Hình 1. 18. Bộ lôi cuốn hơi nước 38 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Thực hành: Sự lôi cuốn hơi nước thường được thực hiện trên cây tươi mới thu hái về. Mẫu cây được cắt nhuyễn, được đặt vào bình cầu, cho nước cất vào bình sao cho phần thể tích mẫu cây và nước chỉ chiếm tối đa 2/3 thể tích bình cầu. Lấp hệ thống và cắm bếp điện đun nóng. Nước trong bình cầu khi bị đun nóng sẽ bốc thành hơi bay lên, hơi nước bay lên mang theo tinh dầu, hơi này bị ống ngưng hơi làm lạnh, ngưng tụ trở lại thể lỏng, rớt xuống ống gạn. Trong ống gạn, dung dịch tách thành 2 lớp gồm lớp nước và lớp tinh dầu.[6] 1.3.2.6. Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn Nguyên lý của phương pháp siêu tới hạn: Đối với một chất thông thường, dưới mỗi điều kiện nhất định chúng sẽ tồn tại ở một trạng thái nào đó trong 3 trạng thái rắn, lỏng hoặc khí. Nếu nén chất khí tới một áp suất đủ cao, chất khí sẽ hóa lỏng. Tuy nhiên, có một giá trị áp suất mà ở đó, nếu nâng dần nhiệt độ lên thì chất lỏng cũng không thể trở về trạng thái khí, mà rơi vào một vùng trạng thái đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới hạn (supercritical). Vật chất ở trạng thái này mang nhiều đặc tính của cả chất khí và chất lỏng, nghĩa là dung môi đó mang tính trung gian giữa khí và lỏng. Hình 1. 19. Sơ đồ hệ thống chiết siêu tới hạn o Vì vậy khi CO2 được đưa lên nhiệt độ, áp suất cao hơn nhiệt độ tới hạn (31 C), áp suất tới hạn (73,8 bar), CO2 sẽ chuyển sang trạng thái siêu tới hạn. Tại trạng thái này, CO2 có khả năng hòa tan rất tốt các đối tượng cần tách ra khỏi mẫu ở cả 3 dạng rắn, lỏng, khí. Sau quá trình chiết, để thu hồi sản phẩm chỉ cần 39 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP giảm áp suất thấp hơn áp suất tới hạn thì CO2 chuyển sang dạng khí ra ngoài còn sản phẩm được tháo ra ở bình hứng.[28] 1.3.2.7. Kỹ thuật chiết pha rắn Chiết pha rắn (hay chiết rắn – lỏng) là quá trình phân bố các chất tan giữa hai pha lỏng và rắn. Trong đó, chất tan ban đầu ở trong pha lỏng (nước hoặc dung môi hữu cơ), chất để hấp thụ chất tan ở dạng rắn (dạng hạt, nhỏ và xốp) gọi là pha rắn. Pha rắn (còn được gọi là pha tĩnh) thường là các hạt silica gel xốp trung tính, hạt oxit nhôm, silica gel trung tính đã được ankyl hoá nhóm –OH bằng các gốc hydrocarbon mạch thẳng -C2, -C4, -C8, -C18, hay nhân phenyl, các polyme hữu cơ, các loại nhựa hoặc than hoạt tính Các hạt này được nhồi vào cột chiết nhỏ (thường là cột có kích thước 5 x 1 cm) hoặc nén ở dạng đĩa dày 1 – 2 mm với đường kính 3 – 4 cm (đĩa chiết). Hình 1. 20. Cột chiết pha rắn Pha lỏng là pha chứa chất cần phân tích, chúng có thể là dung môi hữu cơ, dung dịch đệm Khi cho pha lỏng đi qua cột chiết (hoặc đĩa chiết), pha rắn tương tác với chất phân tích và giữ một nhóm (hoặc một số nhóm) của chất phân tích lại trên pha rắn, các chất còn lại đi ra khỏi cột cùng với dung môi hòa tan mẫu. Quá trình rửa giải (giải hấp) chất phân tích được thực hiện bằng một dung môi thích hợp.[29] 40 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.4. Phương pháp đánh giá độc tính và xác định giá trị LC50 Khảo sát một đường thẳng rõ ràng là dễ hơn khảo sát một đường cong. Hơn nữa, các sự tính toán, loại suy hoặc suy diễn dựa trên đường thẳng bao giờ cũng thuận tiện, nhanh chóng và chính xác hơn là thực hiện điều đó trên các đường cong. Do vậy mà trong nghiên cứu khoa học người ta thường tìm cách tuyến tính hóa các đường cong gặp phải. Ở đây như chúng ta đã thấy, bản chất của “giải tích Probit” chính là vấn đề tuyến tính hóa đường cong Sigmoid.[2] Từ đó chúng ta cũng có thể áp dụng giải tích Probit để xử lí số liệu nghiên cứu của chúng ta nhất thiết phải tuân theo luật phân phối chuẩn (còn gọi là phân phối bình thường, phân phối hình chuông hay phân phối Gauss). Ở phân phối này, trị trung bình bao giờ cũng chiếm tỉ lệ (tần số hay mật độ) cao nhất, càng xa trị trung bình, hay nói một cách nôm na là “thái quá”, thì chiếm tỉ lệ càng ít đi. Điều này thường hay gặp trong thế giới tự nhiên, đến nỗi chúng ta cảm thấy điều đó là hết sức “bình thường”. Chẳng hạn, trong một quần thể nào đó bao giờ cá thể có kích thước trung bình cũng chiếm đa số, càng thái quá (kích thước quá lớn hay quá nhỏ) thì chiếm tỉ lệ càng ít đi. Tương tự như vậy khi xét tới các khía cạnh khác như tình trạng sức khỏe, sức sống, sức chịu đựng của quần thể. Trong những trường hợp mà số liệu nghiên cứu của chúng ta không tuân theo luật phân phối bình thường, thì nhất thiết phải tiến hành “bình thường hóa” các số liệu đó bằng cách lấy căn bậc hai, căn bậc ba, lấy logaritcho số liệu nghiên cứu, nghĩa là thay các “x” bằng các “đại diện cho x”, điều này chúng tôi đã trình bày chi tiết ở chương “ thiết lập mô hình toán học”. Chẳng hạn, khi tác động chất độc vào quần thể sinh vậy như côn trùng, nấm, vi khuẩn, chuột, chim, thú, tôm, cáthì nồng độ hay liều lượng chất độc không phản ánh đúng bản chất sức chịu đựng của quần thể (biểu hiện ở tỉ lệ chết). Thực nghiệm cho thấy rằng trong đa số các trường hợp, logarit thập phân của nồng độ hay liều lượng của chất độc mới phản ánh đúng bản chất sức chịu đựng của quần thế sinh vật, nghĩa là logarit thập phân của nồng độ hay liều lượng độc chất mới đúng là thước đo dùng để đo sức chịu đựng của quần thể sinh vật, nói một cách khác, thang đo sức chịu đựng của quần thể sinh vật tương ứng với 41 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP thang logarit nồng độ hay liều lượng độc chất. Như vậy, sức chịu đựng của quần thể sinh vật phân bố bình thường qua “lăng kính” logarit nồng độ hay liều lượng độc chất. Tương tự như vậy, khi tác động vào quần thể sinh vật các loại chất kích thích, các loại hormon, pheromon, các loại vitamin, các loại huyết thanh, các loại thuốc kháng sinhthì trong đa số các trường hợp, mức độ phản ứng hay đáp ứng của quần thể sinh vật (biểu hiện ở tỉ lệ đáp ứng, tỉ lệ được cứu sống hay bình phục) cũng phân bố bình thường qua “lăng kính” logarit nồng độ hay liều lượng các chất tác động vào quần thể sinh vật đó.[2] Về phương diện lý thuyết cũng như về mặt thực hành, dù sao chúng ta cũng phải luôn luôn “cảnh giác” một điều là, mặc dù thang “logarit” được sử dụng rất phổ biến và có hiệu quả trong việc “bình thường hóa” số liệu nghiên cứu, chúng ta cũng đừng bao giờ tuyệt đối hóa thang “logarit”, mà phải luôn luôn thận trọng là, trong những trường hợp cụ thể có thể sử dụng các thang khác, chẳng hạn như thang “căn bậc hai”, thang “căn bậc ba”để “bình thường hóa” số liệu nghiên cứu tốt hơn là sử dụng thang “logarit”. Để có thể đưa ra các kết luận một cách khách quan, tiến hành “phân tích biến lượng” cho mô hình toán học đã được thiết lập.[2] Dưới đây là một số ví dụ minh họa. Ví dụ 1: Xác định hiệu quả tác động của chất độc vào quần thể sinh vật. Bảng 1. 1. Hiệu quả tác động của Nicotin Sulphat (trong dung dịch 1% saponin) đối với ruồi giấm Nicotin Sulphat Số ruồi Số tử vong % tử vong log10 (nồng độ Probit g/200cc x100) X Y 0.6 150 97 64.7 1.78 5.38 0.8 150 120 80.0 1.90 5.82 1.1 150 133 88.7 2.04 6.17 1.4 150 137 91.3 2.15 6.36 1.3 150 145 96.7 2.25 6.85 Tổng 10.12 30.58 Trung bình 2.02 6.12 42 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Xét mô hình toán học dạng Y = a + bX. Tiến hành thiết lập “hệ bình thường” (xem mục “Thiết lập mô hình toán học”) và giải hệ ta được a = 0.2916 và b = 2.8826. Như vậy, mô hình toán học cho trường hợp này có thể là Y = 0.2916 + 2.8826X Bây giờ chúng ta cần thẩm định lại xem là mô hình này có thích hợp hay không bằng cách phân tích nguồn biến lượng của mô hình như sau: - SS (tổng) = ∑(Y – 푌̅)2 = ∑Y2 – (∑Y)2/n = (5.38)2 ++ (6.85)2 – (30.58)2/5 = 1.20992 - SS (mô hình) = ∑(Y – 푌̅)2 = b∑(X – 푋̅)(Y – 푌̅) = b[∑XY – (∑X)( ∑Y)/n] = 2.8826[62.4048 – (10.12)(30.58)/5] = 1.18004 - SS (sai lệch) = ∑(Y – Y)2 = ∑(Y – 푌̅)2 – ∑(Y – 푌̅)2 = 1.20992 – 1.18094 = 0.02898 Bảng 1. 2. Phân tích nguồn biến lượng Nguồn biến lượng Độ tự do Tổng các bình phương Biến lượng Mô hình 1 1.18094 1.18094 Sai lệch 3 0.02898 0.00966 Tổng 4 1.20992 F = 1.18094 / 0.00966 = 122.25 ; P < 0.005 |푅| = 1.18094 / 1.20992 = 0.9879 43 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Từ kết quả trắc nghiệm F chúng ta thấy rằng, khả năng không tương thích của mô hình toán học đã được thiết lập trong thực tế là rất nhỏ (P < 0.005), do đó, mô hình toán học này là có thể chấp nhận được. Từ mộ hình toán học này chúng ta có thể tính được các ? 50% tử vong → Probit Y = 5, khi đó: 5 = 0.2916 + 2.8826X Hay X = (5 – 0.2916)/2.8826 = 1.63 2 Vì rằng X = log10(nồng độ . 10 ) Do đó: nồng độ = 10X/102 1.63 2 Hay LD50 = 10 /10 = 0.43 g/200ml Tương tự: 90% tử vong → Probit Y = 6.28, khi đó: 6.28 = 0.2916 + 2.8826X Hay X = (6.28 – 0.2916)/2.8826 = 2.08 Từ đó 2.08 2 LD90 = 10 /10 = 1.20 g/200ml Liều gây chết trung bình (được viết tắt là LD50, LC50 hay LCt50) của một chất là một liều cần thiết giết chết phân nửa số cá thể được dùng làm thí nghiệm trong một thời gian thí nghiệm. Thí nghiệm này được J.W. Trevan đưa ra năm 1927. Loại thuốc có trị số LC50 càng thấp là thuốc có độ độc cấp tính càng cao. Ứng dụng trong một số lĩnh vực như: - Môi trường: Để đánh giá mức độ độc của các chất trong không khí và nước. - Nông nghiệp: biểu thị độ độc cấp tính của một loại thuốc BVTV đối với động vật máu nóng. 44 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.5. Phương pháp xác định khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh 1.5.1. Cơ chế kháng vi sinh vật Hình 1.21 Cơ chế kháng khuẩn Các phenolics là làm thay đổi màng tế bào chất, gián đoạn lực đẩy proton và làm kết tủa các chất trong tế bào. Tầm quan trọng của sự có mặt nhóm hydroxyl trong các hợp chất phenolic đã được chứng minh, phenolics tác động lên các enzyme như ATPases nằm trong màng tế bào chất và được bao quanh bởi các phân tử lipid. Các phân tử lipophilic hydrocacbon có thể tích tụ trong lớp lipid kép và làm ảnh hưởng đến tương tác lipid – protein; ngoài ra có thể có sự tương tác trực tiếp của các hợp chất lipophilic với phần kỵ nước của protein.[13,14] 1.5.2. Xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch 1.5.2.1. Đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn khảo sát Các hỗn hợp vi khuẩn khảo sát được tăng sinh trong môi trường phù hợp. Mật độ vi khuẩn sử dụng trong thử nghiệm này là 107 cfu/ml. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Mật độ vi khuẩn chỉ thị sử dụng là 106 cfu/ml. Các chủng vi khuẩn khảo sát sau khi tăng sinh trên môi trường TSB được pha loãng, xác định mật độ và tiến hành pha loãng để có được mật độ 107 cfu/ml. Sau đó 45 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 100 µl dịch này được cấy trang trên môi trường phù hợp. Đem ủ ở nhiệt độ 300C trong 24 giờ. Xác định mật độ các chủng vi khuẩn chỉ thị rồi tiến hành cấy trang 100 µl trên môi trường phù hợp. Chờ cho đĩa thạch thật khô, sử dụng một ống trụ đường kính 5 mm đục 3 lỗ trên mỗi đĩa thạch. Đối với các đĩa thạch chứa vi khuẩn khảo sát sau khi nuôi cấy, chọn những vùng vi khuẩn phát triển dầy đặc, tiến hành đục các khối thạch chứa sinh khối vi khuẩn. Dùng kẹp vô trùng gắp từng khối thạch đặt vào trong các giếng trên đĩa đã trang các chủng vi khuẩn chỉ thị. Đem ủ ở nhiệt độ 300C trong 24 giờ. Sau thời gian 24 giờ, đo các vòng kháng khuẩn xung quanh các giếng thạch.[5] 1.5.2.2. Đánh giá khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy vi khuẩn khảo sát sau ly tâm Các hỗn hợp vi khuẩn khảo sát được nuôi cấy trong môi trường thích hợp. Mật độ vi khuẩn sử dụng trong thử nghiệm này là 107 cfu/ml. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Mật độ vi khuẩn chỉ thị sử dụng lần lượt là 106 cfu/ml. Các chủng vi khuẩn khảo sát được nuôi trong môi trường thích hợp trên tủ ấm lắc trong 24 giờ. Sau đó, pha loãng, xác định mật độ và tiến hành pha loãng để có được mật độ 107 cfu/ml. Cấy chuyển 100 µl vào bình tam giác chứa môi trường thích hợp và nuôi cấy trong tủ ấm lắc nhiệt độ 300C trong 24 giờ. Đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị sau khi xác định mật độ, tiếng hành cấy trang 100 µl trên môi trường thích hợp. Chờ cho đĩa khô, dùng một ống trụ đường kính 5 mm đục 3 lỗ trên mỗi đĩa thạch. Hút 100 µl dịch nổi sau khi ly tâm cho vào các lỗ thạch sau khi đục. Sau đó, đem ủ ở nhiệt độ 300C trong 24 giờ. Sau 24 giờ đo các vòng kháng khuẩn xung quanh lỗ thạch.[5] Đánh giá khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn khảo sát thông qua khả năng tạo vòng tròng kháng khuẩn với vi khuẩn chỉ thị. Một đơn vị hoạt tính kháng khuẩn được định nghĩa như một đơn vị hoạt tính AU (Arbitrary unit). Một AU là một đơn vị diện tích của vùng ức chế trên mỗi đơn vị thể tích, trong trường hợp này là mm2/ml. Hoạt tính kháng khuẩn được tính theo công thức sau (Usmiati à Marwat, 2009): 46 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 퐿푧−퐿푠 Hoạt tính kháng khuẩn (mm2/ml) = 푉 Trong đó: Lz: diện tích vòng kháng khuẩn, bao gồm cả diện tích lỗ (mm2) Ls: diện tích lỗ (mm2) V: thể tích mẫu cho vào (ml) 1.5.3. Xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp đo độ đục Các chủng vi khuẩn được đánh giá khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp đo độ đục được thực hiện như sau: Tiến hành tăng sinh các chủng vi khuẩn khảo sát trong erlen chứa 10 ml môi trường phù hợp ở 300C trong 24 giờ, sau đó tiến hành ly tâm để loại bỏ sinh khối, thu lấy dịch trong. Chuẩn bị các ống nghiệm mỗi ống chứa 2 ml TSB vô trùng. Hút 2 ml dịch sau ly tâm cho vào ống chứa 2 ml môi trường TSB. Hút 200 µl vi khuẩn chỉ thị đã tăng sinh trong môi trường TSB trong 24 giờ và chỉnh về mật độ 107 cfu/ml cho vào ống nghiệm đã chứa sẵn dịch sau ly tâm vi khuẩn và môi trường TSB. Tiến hành 0 ủ ở 37 C trong 24 giờ và đo OD600nm để xác định tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị.[5] Đánh giá phần trăm tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị được tính theo công thức sau (Schillinger và Lucke, 1989; Nguyễn Hoài Hương và ctv, 2012): 푂퐷 % tỷ lệ ức chế = (1 – 푇푁) x100% 푂퐷퐷퐶 1.6. Sinh vật thí nghiệm 1.6.1. Động vật giáp xác - Artemia Nauplii 1.6.1.1. Đặc điểm sinh học Artemia Nauplii là tên khoa học của một loài giáp xác có tính rộng muối (từ vài phần ngàn đến 250‰). Chúng thường sống ở biển tự nhiên hoặc được nuôi trong ruộng muối. Artemia ăn lọc không có tính chọn lựa, thức ăn chủ yếu là các hạt lơ lững trong nước và các sinh vật cỡ như tảo và vi khuẩn. Với chu trình biến thái ngắn, sau 10 – 15 ngày chúng có thể đạt giai đoạn trưởng thành và tham gia sinh sản, tùy theo điều kiện môi trường Artemia có sự sinh trưởng và sinh sản khác nhau, có dòng đơn tính, dòng lưỡng tính, đẻ con hay đẻ trứng. 47 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Khi nồng độ muối cao hơn 70‰ và dinh dưỡng kém, nhiệt độ cao thì Artemia có xu hướng đẻ trứng bào xác. Ấu trùng Artemia vừa mới đẻ hay mới nở có kích thước 400 - 500 µm, con trưởng thành dài không quá 20 mm. Trong quá trình phát triển Artemia trải qua 15 lần lột xác, sau mỗi lần thay đổi cả về hình dạng lẫn kích thước. Artemia có thể sinh sản lần đầu sau 8 ngày phát triển, thường là sau 12 – 15 ngày. Mỗi lần đẻ khoảng 300 trứng hoặc con, với chu kỳ đẻ 4 ngày/lần. Trong điều kiện tốt Artemia sống được vài tháng (6 tháng).[30] Hình 1. 21. Ấu trùng và trứng Artemia Nauplii 1.6.1.2. Trứng bào xác Cấu trúc gồm 2 phần vỏ trứng và phần phôi. Vỏ trứng gồm 3 lớp: lớp chlorin, lớp màng ngoài bì và lớp màng phôi. - Lớp chlorin cứng, màu nâu nhạt đến nâu đen. Lớp này có vai trò bảo vệ phôi khỏi bị tác động cơ học và phóng xạ. Khi bị oxy hóa bởi thuốc tẩy, lớp này sẽ bị phá hủy. - Lớp màng ngoài bì có tác dụng bảo vệ phôi không bị các phân tử lớn hơn phân tử CO2 xâm nhập vào. - Màng phôi là một lớp trong suốt và cách biệt với phôi bởi màng nội bì. Màng này sẽ biến thành màng nở trong quá trình trứng nở. 48 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phôi là một phôi vị đồng nhất. Phôi sẽ ngừng trao đổi chất khi hàm lượng nước trong trứng dưới 10%. Khi hàm lượng nước trên 10% phôi sẽ bắt đầu hoạt động và trong điều kiện có oxy sẽ làm phá vỡ hệ enzym chuyên biệt trong trứng bào xác.[30] 1.6.1.3. Phương pháp sử dụng trứng bào xác Sự phát triển của trứng bào xác: sau khi ấp trứng từ 1 – 2 giờ, trứng sẽ hút nước. Sau 12 – 15 giờ vỏ trứng vỡ ra, xuất hiện tiền ấu trùng nằm trong màng nở. Khi màng nở vỡ ra. Ấu trùng sẽ bơi tự do trong nước. Các thông số môi trường về điều kiện nở trứng Artemia: - Nhiệt độ: thích hợp là 25 – 30oC. Dưới 25oC trứng chậm nở. Trên 35oC trứng ngừng trao đổi chất. - Độ mặn: Độ mặn 5 – 35‰ sẽ cho tỉ lệ nở và hiệu xuất cao hơn. Ấu trùng cũng chứa nhiều năng lượng hơn. - pH: thích hợp 8 – 8,5. - Oxy: Hàm lượng Oxy³ 2 mg/l. Do đó nên điều chỉnh tốc độ sục khí cho thích hợp. - Mật độ trứng ấp: Mật độ trứng ấp không nên quá 5 gr/l - Ánh sáng: Cường độ chiếu sáng trên mặt nước 2000 lux thì thích hợp nhất.[30] 1.6.2. Các chủng vi sinh vật thí nghiệm 1.6.2.1. SALMONELLA Về phân loại khoa học Vực (domain) Bacteria Liên giới(superregnum) Bacteria Giới (regnum) Bacteria Ngành (phylum) Proteobacteria Lớp (class) Gammaproteobacteria Bộ (ordo) Enterobacteriales Họ (familia) Enterobacteriaceae Chi (genus) Salmonella 49 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1. 22. Vi khuẩn Salmonella Samonella là một ví dụ kinh điển về ngộ độc thực phẩm. Đây là một loại trực khuẩn gram âm, kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử, di động bằng tiên mao. Salmonella không lên men lactose (trừ S. arizona) và sucrose nhưng lên men được dulcitol, mannitol và glocose. Chúng kém chịu nhiệt nhưng chịu được một số hóa chất: brilliant green, sodium lauryl sulfate, selenite Để có thể gây ngộ độc, số lượng Salmonella phải lên đến cả triệu tế bào trong 1 g thực phẩm. Có 3 dạng bệnh thực sự do Salmonella gây ra: sốt thương hàn do S.typhi, nhiễm trùng máu do S.cholera-suis, rối loại tiêu hóa do S.typhirium và S.enteritidis. Các triệu chứng do Salmonella gây ra chủ yếu là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn xuất hiện sau 12 – 36 giờ sau khi tiêu thụ thực phẩm nhiễm Salmonella. Các triệu chứng thường kéo dài 2 – 7 ngày.[5] 1.6.2.2. Staphylococcus aureus Phân loại khoa học Giới (regnum) Bacteria Ngành (phylum) Firmicutes Lớp (class) Bacilli Bộ (ordo) Bacillales Họ (familia) Staphylococcaceae Chi (genus) Staphylococcus 50 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1. 23. Vi khuẩn Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus là cầu khuẩn gram dương, hiếu khí, thường kết dạng chùm có mặt phổ biến ở khắp nơi thường thấy trên da, xoang mũi và tóc Staphylococcus aureus sản sinh ra một loại độc tố đường ruột enterotoxin bền nhiệt, không bị phân huỷ ở 1000C trong 30 phút. Khi ăn phải thực phẩm có chứa độc tố này, sau 4 – 6 giờ ủ bệnh sẽ bộc phát nên các triệu chứng lâm sàng như tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 – 8 giờ.[5] Staphylococcus aureus cho phản ứng đông huyết tương dương tính do chúng tiết ra enzyme coagulase. Đây được xem là tính chất đặc trưng của S. aureus, là tiêu chuẩn để phân biệt Staphylococcus aureus với các tụ cầu khác. 1.6.2.3. Listeria monocytogenes Theo George M. Garrity, Julia A.Bell và Timothy G.Lilburn, phân loại học của Listeria spp. Trong giới vi sinh vật như sau: Giới (regnum) Bacteria Ngành (phylum) Firmicutes Lớp (class) Bacilli Bộ (ordo) Bacillales Họ (familia) Listeriaceae Chi (genus) Listeria 51 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1. 24. Listeria monocytogenes Trong những năm gần đây, Listeria monocytogenes nổi lên như một tác nhân gây bệnh ở trẻ em, phụ nữ mang thai hay người già trong những năm gần đây. Đây là một loại trực khuẩn gram dương, ngắn, nhỏ không sinh bào tử, thường có kiểu chuyển động xoay tròn quanh trục thân thành từng đợt rất đặc trưng trong tiêu bản giọt treo. Listeria monocytogenes thuộc loại ưa lạnh, có thể phát triển ở nhiệt độ thấp đến 2,50C và cao đến 440C. Cách thức gây bệnh của Listeria monocytogenes hoàn toàn khác với các loài vi khuẩn gây bệnh khác. Các loài vi sinh vật gây bệnh khác chỉ gây bệnh khi con người hấp thu đủ liều lượng, sau thời gian ủ bệnh là có các triệu chứng lâm sàng biểu hiện. Ngược lại ở Listeria monocytogenes thì chỉ hiện diện với một sớ lượng nhỏ trong thực phẩm, khi được đưa vào cơ thể, chúng tồn tại và chờ cơ hội. Khi có điều kiện thuận lợi, chúng nhân lên xâm nhiễm và các mô sâu và gây bệnh. Các triệu chứng xuất hiện từ đường tiêu hóa như tiêu chảy, sốt nhẹ. Sau đó, chúng xâm nhiễm vào các đại thực.[5] 52 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.6.2.4. Escherichia Coli Phân loại khoa học Vực (domain) Bacteria Ngành (phylum) Proteobacteria Lớp (class) Gamma Proteobacteria Bộ (ordo) Enterobacteriales Họ (familia) Enterobacteriaceae Chi (genus) Escherichia Loài (species) E. Coli Hình 1. 25. Vi khuẩn Escherichia coli E.Coli là trực khuẩn gram âm, kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử, khá phổ biến trong tự nhiên đặc biệt trong đường tiêu hóa của con người và động vật. Hầu hết các dòng E.Coli tồn tại một cách tự nhiên và không gây hại trong đường tiêu hóa, chúng còn đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định đường tiêu hóa. Tuy nhiên, tồn tại ít nhất 4 dòng sau đây có thể gây bệnh cho người và cho động vật: - Enteropathogenic E.Coli (EPEC) - Enterotocigenic E.Coli (ETEC) - Enteroinvasive E.Coli (EIEC) - Enterohaemorrhagic E.Coli (EHEC) hoặc Verocytoxin E.Coli (VTEC) hay E.Coli O157:H& Như vậy, có thể được phân lập được dễ dàng ở khắp nơi trong môi trường sống, phân hoặc nước thải. Vi sinh vật này có thể tồn tại rất lâu trong môi trường. Với sự phân bố rộng rãi như vậy nên E.Coli cũng được dễ dàng phân lập từ các mẫu thực phẩm bị nhiễm nguyên liệu hay thông qua nguồn nước. 53 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Khi các dòng E.coli gây bệnh xâm nhập vào con người qua con đường tiêu hóa gây ra các bệnh rối loạn đường tiêu hóa, các biểu hiện lâm sàn có thể biểu hiện từ nhẹ đến rất nặng, có thể đe dọa mạng sống của con người tùy thuộc vào liều lượng, dòng gây nhiễm và mức độ đáp ứng của từng người.[5] 1.6.2.5. Pseudomonas aeruginosa - Phân loại Giới (regnum) Bacteria Ngành (phylum) Proteobacteria Lớp (class) Gamma Proteobacteria Bộ (ordo) Pseudomonadales Họ (familia) Pseudomonadaceae Chi (genus) Pseudomonas Loài (species) Pseudomonas aeruginosa Hình 1. 26. Pseudomonas aeruginosa Là trực khuẩn gram âm, di động, không sinh bào tử, đứng một mình hay thành đôi hoặc thành các chuỗi ngắn. Hình thể có thể thay đổi trong phase ổn định. Có khả năng tiết ra nhiều loại sắc tố bao gồm: pyocyanin, fluorescein, pyoverdin. Thường gây bệnh nhiễm khuẩn tai, mắt, vết thương, vết bỏng, đường tiểu, đường hô hấp. Chúng cũng gây nhiễm khuẩn huyết và viêm màng não.[5] 54 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 55 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ tháng 3 năm 2016 đến tháng 7 năm 2016 tại trung tâm thí nghiệm Công nghệ sinh học trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh. 2.2. Vật liệu nghiên cứu - Lá sắn thu hái tại thị xã Long Khánh, tỉnh Đồng Nai. - Lá sắn thu hái lúc 9 – 10 giờ sáng, lá trưởng thành. Hình 2. 1. Lá cây củ đậu 2.3. Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 2.3.1. Dụng cụ - Bộ chiết Soxhlet - Bộ lôi cuốn hơi nước - Bể điều nhiệt - Bếp đun cách thủy - Cân phân tích - Máy quang phổ UV – Vis 2000, máy lắc - Bộ sục khí 56 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Pipet, micropipet, ống nhỏ giọt, đũa thủy tinh, que cấy trang - Tủ ủ 37oC, tủ sấy 101oC, bình hút ẩm - Ống nghiệm sạch, erlen - Cốc thủy tinh, ly nhựa trong - Kính đồng hồ - Đĩa petri sạch 2.3.2. Hóa chất - Thuốc thử Folin – Ciocateau của hãng Sigma; Dung dịch Na2CO3 bão hòa - Dung dịch AlCl3 2%; nước cất - 1% NaOH/etanol 96o - Etanol 96o, 90o, 70o; acetone - Chloroform, axit sunfuric đặc, natri nitrit - Muối biển 2.4. Phương pháp Đề tài sử dụng các phương pháp nghiên cứu sau: - Phương pháp nghiên cứu lý thuyết: thu thập, chọn lọc và nghiên cứu các tài liệu liên quan đến cơ sở của đề tài như: tổng quan về cây củ đậu và các hợp chất thứ cấp có trong lá, phương pháp tách chiết, phương pháp đánh giá độc tính, kháng khuẩn, sinh vật thử nghiệm - Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm: tiến hành triển khai các nội dung thí nghiệm, thiết kế, bố trí các nghiệm thức (xem sơ đồ), theo dõi và ghi nhận kết quả các thí nghiệm. - Phương pháp xử lý số liệu: dùng các phần mềm SAS, excel để tiến hành phân tích kết quả nghiên cứu, nhằm đưa ra kết luận cho các nội dung và các thí nghiệm nghiên cứu. - Phương pháp so sánh, đối chiếu: từ kết qủa thực nghiệm đạt được sẽ tiến hành so sánh với cơ sở khoa học liên quan cũng như đối chiếu với kết quả của các công trình nghiên cứu khác nhằm đưa ra kết luận cho đề tài. 57 2.5. Acetone Dung môi tách Thu nhận cao chiết từ lá củ o chiết Etanol 90 N Thu nhận cao chiết từ lá củ ộ đậu bằng các phương pháp i dung đậu bằng các phương pháp và dung môi khác nhau Phương pháp tách Ngâm dầm chiết thí nghi Chiết Soxhlet Flavonoid ệ Flavonoid m Định tính một số HCTC Định tính một số HCTC Đ Rotenone Ồ ÁN T Nội dungNội dung nghiên nghiên cứu Ố 58 Polyphenol tổng cứu Polyphenol tổng T NGHI Định lượng một số HCTC Flavonoid tổng Ệ Pseudomonas P Hàm lượng chất Hàm lượng chất aeruginosa khô Staphylococcus aureus Thử độc tính ArtemiaArtemia NaupliiNauplii Listeria monocytogenes Salmonella Kháng khuẩn Enterotoxigenic E.Coli Sơ đồ 2. 1. Nội dung thí nghiệm ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.5.1. Phương pháp tách chiết và thu cao chiết 2.5.1.1. Sơ đồ quy trình Lá sắn phơi trong bóng râm Nghiền nhỏ Ngâm dầm Chiết soxhlet to phòng, 50 – 80oC, 8h 24h Etanol 90o Acetone Etanol 90o Acetone Thu dịch chiết Lọc Cô dịch chiết loại dung môi Cao chiết Sơ đồ 2. 2. Quá trình tách chiết và thu cao chiết từ lá củ đậu 59 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.5.1.2. Thuyết minh quy trình  Nguyên liệu Lá củ đậu được thu hái vào khoảng 9 – 10 giờ sáng. Lựa chọn những lá xanh và loại bỏ những lá vàng héo, rửa sạch, phơi khô trong bóng râm. Sử dụng 100 g lá củ đậu cho quá trình tách chiết.  Nghiền Sử dụng cối sứ nghiền nhỏ lá củ đậu. Quá trình nghiền sẽ phá vỡ tế bào lá, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tách chiết.  Tách chiết Chiết các hợp chất có trong lá củ dậu nhờ dung môi etanol 90o và acetone, sử dụng hai phương pháp là ngâm dầm và chiết với bộ Soxhlet, nhằm khảo sát dung môi và phương pháp nào phù hợp với từng đối tượng lá củ đậu. Cách thực hiện : - Ngâm dầm Cân 100 g lá củ đậu sau khi nghiền nhỏ và 300 ml dung môi cho vào erlen 1000 ml, sử dụng hai loại dung môi là etanol 90o và acetone, đậy kín miệng và bọc vải đen xung quanh bình erlen. Quá trình chiết được diễn ra trong thời gian 24 giờ, trên máy lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ phòng. Hình 2. 2. Phương pháp ngâm dầm 60 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Chiết Soxhlet Cân 100 g lá củ đậu sau khi nghiền nhỏ vào một túi vải mỏng và lấp vào hệ thống chiết Soxhlet, bình cầu chứa 300 ml lần lượt các dung môi etanol 90o và acetone. Phải đảm bảo hệ thống được lắp đặt kín, luôn có nước ở ống sinh hàn. Quá trình chiết được diễn ra trong thời gian 8 giờ, nhiệt độ của quá trình chiết phụ thuộc vào nhiệt độ bay hơi của dung môi, đối với etanol 90o là 80oC và acetone là 56oC. Hình 2. 3. Phương pháp chiết Soxhlet  Lọc Để thu hồi dịch chiết cần phải qua khâu lọc thô để loại cặn lá lẫn trong dịch chiết, sử dụng giấy lọc và máy hút chân không để lọc nhanh dịch chiết, thu dịch trong để chuẩn bị quá trình loại dung môi.  Cô dịch chiết Nhằm thu hồi dung môi etanol 90o, acetone để tái sử dụng và thu cao chiết cho thí nghiệm. Sử dụng bộ lôi cuốn hơi nước để tách dung môi ra khỏi dịch chiết ở nhiệt độ 50 – 80oC, cô đến khi dịch chiết còn thể tích là V = 50 ml. Thu được cao chiết dạng lỏng và đậm đặc. 61 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.5.2. Phương pháp định tính một số hợp chất thứ cấp trong lá cây củ đậu 2.5.2.1. Flavonoid  Nguyên tắc Flavonoid thường tan trong etanol và nhóm OH trong flavonoid thường tạo phức với AlCl3, NaOH, KOH,cho màu vàng.  Dụng cụ và hóa chất: - Ống nghiệm sạch - 1% NaOH/etanol 96o  Tiến hành: Nhỏ khoảng 2 ml mẫu vào 6 ml 1% NaOH/etanol 96o, dung dịch sẽ có màu vàng đến cam đỏ. Nếu là flavon, isoflavon, isoflavanon, flavanon, chalcon, leucoantocanidin sẽ có màu vàng. Flavonol cho màu từ vàng đến cam. Auron cho màu đỏ đến đỏ tím.[6] 2.5.2.2. Rotenone  Dụng cụ và hóa chất - Kính đồng hồ - Chloroform, axit sunfuric đặc, natri nitrit  Tiến hành Định tính rotenone trong bên trong lá bằng phương pháp Durham Howard Ngâm 0,5 g lá cây củ đậu nghiền nhỏ với 5 ml chloroform khoảng 30 phút, lọc. Phần lọc được cô khi trên kính đồng hồ, thêm 2 giọt axit sunfuric đặc sẽ xuất hiện màu vàng nâu và nâu tím sau khi thêm 1 vài hạt natri nitrit.[7] 62 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 2. 4. Ngâm lá với chloroform và dịch chiết sau khi cô trên kính đồng hồ Định tính rotenone trong cao chiết lá cây củ đậu Hút 5 ml cao chiết và cô khi trên kính đồng hồ, thêm 2 giọt axit sunfuric đặc sẽ xuất hiện màu nâu tím và ngả màu vàng nâu sau khi thêm 1 vài hạt natri nitrit. Hình 2. 5. Các loại cao chiết trên kính đồng hồ 2.5.3. Phương pháp định lượng một số hợp chất thứ cấp trong lá củ đậu 2.5.3.1. Xác định hàm lượng chất khô bằng phương pháp cân và sấy  Nguyên tắc: Xác định hàm lượng...flavonoid tổng số là 16,64 mgRE/g db trong cao chiết A giảm mạnh và tăng nhẹ so với cao chiết D có hàm lượng flavonoid 16,51 mg RE/mg chất khô và lượng flavonoid tổng số thấp nhất là 14,93 mgRE/g db có trong cao chiết B.  So sánh với cơ sở khoa học Sự chênh lệch của hàm lượng flavonoid tổng số là do ảnh hưởng bởi dung môi và phương pháp tách chiết giống như hàm lượng polyphenol tổng số, phụ thuộc vào độ phân cực của dung môi và phương pháp tách chiết liên tục, nhiệt độ tách chiết và độ tinh khiết của dung môi Theo Nguyễn Phi Kim Phụng (2007), flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật. Hiệu quả tốt nhất vẫn là dung môi etanol 90o và phương pháp tách chiết Soxhlet. Tùy theo mục đích chiết, sử dụng mà ta có thể lựa chọn đối tượng thí nghiệm sao cho phù hợp, nếu muốn chiết flavonoid có độ phân cực cao nên sử dụng dung môi etanol 90o và phương pháp chiết Soxhlet. Ngược lại, nếu muốn chiết flavonoid có độ phân cực thấp nên sử dụng dụng dung môi acetone và phương pháp chiết Soxhlet.  So sánh với các tài liệu nghiên cứu khác So sánh kết quả hàm lượng flavonoid tổng số cao nhất của lá củ đậu là 52,91 mgRE/g db với kết quả hàm flavonoid tổng số của một số loại cây như Bìm bìm, Đinh lăng, Diếp cá, Kim tiền thảo và rau Đắng được nghiên cứu trong luận văn tốt nghiệp “Xây dựng quy trình phân tích tổng flavonoid từ một số cao dược liệu bằng phương pháp UV – VIS” (Lưu Thúy Diễm, 2013). Trong báo cáo này, hàm lượng flavonoid tổng số tính theo chất chuẩn Rutin là Bìm bìm 0,455 mgRE/g db, Đinh lăng 0,6498 mgRE/g db, Diếp cá 0,5355 mgRE/g db, Kim tiền thảo 0,8384 mgRE/g db và rau đắng 0,5106 mgRE/g db là rất nhỏ so với hàm lượng flavonoid tổng số trong lá củ đậu, lý do có sự chệnh lệch như vậy có thể là do bản chất lá củ đậu to hơn các loại thực vật trên và sử dụng bộ phận khác nhau để thí nghiệm.[1] 83 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Flavonoid có khả năng kháng khuẩn do chúng có khả năng tạo phức với các protein ngoại bào và thành tế bào vi khuẩn. Flavonoid càng ưa béo càng có khả năng phá vỡ màng tế bào. Và một số loại flavonoid mang độc tính như rotenone trong lá củ đậu [32]. Vì vậy, chỉ tiêu này khá quan trọng trong nghiên cứu đánh giá khả năng kháng khuẩn và độc tính của cao chiết. 3.4. Khảo sát độc tính  Thí nghiệm - Kết quả khảo sát số ấu trùng Artemia Nauplii sống và chết theo từng nồng độ của từng loại cao chiết. - Mỗi thí nghiệm lập lại 3 lần.  Kết quả Bảng 3. 7. Kết quả các đường chuẩn và LC50 tương ứng của 4 loại cao chiết Loại cao chiết Phương trình đường chuẩn LC50 y = 1.5045x + 10.068 A 0,04% R2 = 0.9573 y = 1.6067x + 9.8907 B 0,09% R2 = 0.8879 y = 1.0237x + 8.8299 C 0,02% R2 = 0.9255 y = 1.9234x + 11.154 D 0,06% R2 = 0.9772 Đường chuẩn của cao chiết A 5.6 y = 1.5045x + 10.068 5.5 R² = 0.9573 5.4 5.3 5.2 5.1 5 Giá trị Giá Probit 4.9 4.8 4.7 4.6 -3.6 -3.5 -3.4 -3.3 -3.2 -3.1 -3 log10(NĐ) Hình 3. 13. Đường chuẩn của cao chiết A 84 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đường chuẩn của cao chiết C 5.8 y = 1.0237x + 8.8299 5.7 R² = 0.9255 5.6 5.5 5.4 Giá trị Giá pronit 5.3 5.2 5.1 -3.6 -3.5 -3.4 -3.3 -3.2 -3.1 -3 Log10(NĐ) Hình 3. 14. Đường chuẩn của cao chiết C  Nhận xét: Từ bảng kết quả 3.7 đã liệt kê các nồng độ gây chết trung bình, kí hiệu là LC50 (Lethal concentration) của 4 loại cao chiết A, B, C, D lần lượt 0,04%, 0,09%, 0,02%, 0,06% tương đương với 8 µl , 18 µl, 4 µl, 12 µl cao chiết trong 20 ml nước biển. Lập biểu đồ đường để tạo cơ sở so sánh LC50 giữa các loại cao chiết. Biểu đồ so sánh LC50 của 4 loại cao chiết 0.12% 0.10% 0.09% 0.08% 0.06% 0.06% 0.04% 0.04% 0.02% 0.02% 0.00% C A D B Hình 3. 15. So sánh LC50 của 4 loại cao chiết Từ hình 3.15 nhận thấy cao chiết C có nồng độ gây chết trung bình LC50 thấp nhất là 0,02%, cao hơn là cao chiết A với 0,04%, cao chiết D với 0,06% và cao nhất là cao chiết B với 0,09%. LC50 tỉ lệ nghịch với độ độc của cao chiết, nồng độ càng 85 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP nhỏ thì cao chiết có độc tính càng mạnh. Suy ra, cao chiết C có độc tính mạnh nhất và cao chiết B có độc tính thấp nhất trong 4 loại cao chiết. Bảng 3. 8. Nồng độ LC50 (mg/L) của 4 loại cao chiết Loại cao chiết A B C D LC50 (mg/L) 10,4 25,2 22,2 23,4 Tuy nhiên, kết quả với nồng độ % trên khi được quy về nồng độ (mg/L) dựa vào hàm lượng chất khô của từng loại cao chiết lại có sự khác biệt, cao chiết A có độc tính mạnh nhất với nồng độ 10,4 (mg/L), độc tính của 3 loại cao chiết còn lại được xếp theo thứ tự giảm dần là C, D, B tương ứng 22,2; 23,4; 25,2 (mg/L). Lí do của sự khác biệt này là do sự khác biệt về hàm lượng chất khô trong từng loại cao chiết. Vì vậy, để góp phần đánh giá nồng độ LC50 được khả quan hơn, kết quả được quy về nồng độ (mg/L).  So sánh với cơ sở khoa học Các flavonoid mang độc tính trong cây củ đậu là rotenone, tephrosinVà acetone là dung môi hòa tan tốt rotenone, etanol ít hòa tan[27]. Do đó, cao chiết sử dụng dung môi acetone kết hợp phương pháp chiết bằng Soxhlet có khả năng chiết kiệt các hợp chất mang độc tính trong lá củ đậu. Kết quả này góp phần rất quan trọng cho mục đích tách chiết các hợp chất mang độc tính trong lá củ đậu, ứng dụng làm dược liệu bổ sung vào thuốc trừ sâu. 3.5. Thử hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết 3.5.1. Hoạt tính kháng Enterotoxigenic E.Coli của các loại cao chiết  Kết quả Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết được thể hiện trong bảng 3.10 qua đường kính vùng ức chế. 86 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3. 16. Vòng kháng Enterotoxigenic E.Coli của 4 loại cao chiết Bảng 3. 9. Kết quả kháng Enterotoxigenic E.Coli của 4 loại cao chiết Các loại cao chiết Nồng độ vi khuẩn Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) A 10,33c ± 0,58 B 15ab ± 2 C 106 10,67c ± 1,53 D 12,33bc ± 0,58 Kháng sinh ĐC 16a ± 0  Nhận xét: Dựa theo kết quả đưa ra trong bảng 3.2, cho thấy rằng loại cao chiết B có khả năng ức chế tốt Enterotoxigenic E.coli, 3 loại cao chiết còn lại A, C và D khá tốt với vi khuẩn Enterotoxigenic E.coli thường thấy trong các bệnh nhân tiêu chảy cấp. Đường kính vòng kháng khuẩn Enterotoxigenic E.coli của cao chiết A là 10,33 mm, cao chiết B là 15 mm, của cao chiết C là 10,67 mm và D là 12,33 mm.  So sánh với đối chứng So với vòng kháng khuẩn của kháng sinh đối chứng 16mm, vòng kháng khuẩn của cả 4 loại cao chiết đều nhỏ hơn. Tuy nhiên, vòng kháng khuẩn của cao chiết B chỉ nhỏ hơn vòng kháng khuẩn của kháng sinh đối chứng 1mm và ức chế mạnh.  So sánh với các tài liệu nghiên cứu khác 87 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Kết quả vòng kháng khuẩn cao nhất là cao chiết lá củ đậu là B với 15mm, kết quả này so với kết quả của tinh dầu tách chiết từ lá Tía tô kháng E.coli được công bố trên Tạp chí khoa học và phát triển 2015, tập số 13, số 2:245-250/J.ci. & Devel.2015, Vol 31, No. 2: 245-250 là 5,26 mm lớn hơn rất nhiều[3]. Vì vậy, cao chiết kháng mạnh đối với vi khuẩn Gram (-). 3.5.2. Hoạt tính kháng Listeria monocytogenes của các loại cao chiết  Kết quả Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết được thể hiện trong bảng 3.11 qua đường kính vùng ức chế. Hình 3. 17. Vòng kháng Listeria monocytogenes của 4 loại cao chiết Bảng 3. 10. Kết quả kháng Listeria monocytogenes của các loại cao chiết Các loại cao chiết Nồng độ vi khuẩn Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) A 11,33c ± 1,53 B 11,67bc ± 0,58 C 106 13,17ab ± 0,29 D 12bc ± 1 Kháng sinh ĐC 14,5a ± 0 88 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Nhận xét: Dựa theo kết quả đưa ra trong bảng 3.3, cho thấy rằng 4 loại cao chiết A, B, C và D đều tốt với vi khuẩn Listeria monocytogenes thường thấy trong các thực phẩm dễ nhiềm như sữa, phomat mềm, patekhông được bảo quản đúng cách gây các bệnh tiêu chảy, sốt, nôn ói ở người. Đường kính vòng kháng khuẩn Listeria monocytogenes của cao chiết A là 11,33 mm, cao chiết B là 11,67 mm, của cao chiết C là 13,17 mm và D là 12 mm.  So sánh với đối chứng So với vòng kháng khuẩn của kháng sinh đối chứng 14,5 mm, vòng kháng khuẩn của tất cả 4 loại đều nhỏ hơn nhưng cao chiết C chỉ nhỏ hơn vòng kháng khuẩn của kháng sinh đối chứng khoảng 1,3 mm. Như vậy, cả 4 loại cao chiết kháng vi khuẩn Gram (+) ở mức tốt. 3.5.3. Hoạt tính kháng Pseudomonas aeruginosa của các loại cao chiết Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết được thể hiện trong bảng 3.12 qua đường kính vùng ức chế. Hình 3. 18. Vòng kháng Pseudomonas aeruginosa 4 loại cao chiết Bảng 3. 11. Kết quả kháng Pseudomonas aeruginosa của 4 loại cao chiết Các loại cao chiết Nồng độ vi khuẩn Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) A 11,33b ± 0,58 B 11,5c ± 1,32 C 106 8,67c ± 0,58 D 10,33b ± 0,58 Kháng sinh ĐC 15a ± 0 89 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Nhận xét: Dựa theo kết quả đưa ra trong bảng 3.4, cho thấy rằng 3 loại cao chiết A, B, C và D đều tốt với vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa – trực khuẩn Gram âm điển hình thường thấy trong các bệnh lý về da (trực khuẩn mủ xanh). Đường kính vòng kháng khuẩn Pseudomonas aeruginosa của cao chiết A là 11,33 mm, cao chiết B là 11,5 mm, của cao chiết C là thấp nhất 8,67 mm và D là 10,33 mm.  So sánh với đối chứng So với vòng kháng khuẩn của kháng sinh đối chứng là 15 mm, vòng kháng khuẩn của tất cả 4 loại đều nhỏ hơn rất nhiều nhưng vẫn được xếp vào loại tốt với vi khuẩn này.  So sánh với các tài liệu nghiên cứu khác So sánh cao chiết có vòng kháng lớn nhất là B với 11,5 mm với kết quả của tinh dầu tách chiết từ lá Tía tô kháng Pseudomonas aeruginosa được công bố trên Tạp chí khoa học và phát triển 2015, tập số 13, số 2:245-250/J.ci. & Devel.2015, Vol 31, No. 2: 245-250 là không hình thành vòng kháng, cao chiết vẫn nhạy cảm với Pseudomonas aeruginosa[3]. Như vậy, cả 4 loại cao chiết kháng vi khuẩn Gram (-) ở mức tốt đến rất tốt. 3.5.4. Không có hoạt tính kháng một số vi sinh vật của các loại cao chiết - Salmonella Hình 3. 19. Kết quả không kháng Salmonella của 4 loại cao chiết 90 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Staphylococcus aureus Hình 3. 20. Kết quả không kháng Staphylococcus aureus của 4 loại cao chiết Bảng 3. 12. Kết quả kháng một số loại vi sinh vật của 4 loại cao chiết Cao chiết A B C D Vi sinh vật Enterotoxigenic E.Coli + ++ + + Listeria monocytogenes + + + + Pseudomonas aeruginosa + + + + Salmonella - - - - Staphylococcus aureus - - - - Ghi chú: (-) không tốt (+) tốt (++) rất tốt (+++) cực tốt Kết luận: Tất cả các loại cao chiết đều kháng vi khuẩn Gam (-) tốt hơn Gam (+). Cao chiết B sử dụng dung môi là acetone và phương pháp tách chiết ngâm dầm có khả năng ức chế vi sinh vật vì được tách chiết ở nhiệt độ phòng và không tiếp xúc với ánh sáng nên một số các hợp chất polyphenol, flavonoidcó khả năng kháng khuẩn và không bị mất hoạt tính, có thể bên trong lá củ đậu các hợp chất thứ cấp có khả năng ức chế vi sinh vật có độ phân cực thấp chiếm tỉ lệ cao hơn và dung môi acetone hòa tan hầu hết các hợp chất có độ phân cực thấp. Cùng phương pháp ngâm dầm, cao chiết D có khả năng ức chế vi sinh vật khá tốt. Cao chiết C và A có khả năng ức chế vi sinh vật ở mức độ tốt như nhau nhưng A có phần tốt hơn C. Như phần định lượng polyphenol tổng số, cao chiết C có hàm lượng polyphenol tổng cao gấp 3 – 4 lần các cao chiết còn lại nhưng chưa hẳn chứa nhiều hàm lượng polyphenol, flavonoid có hoạt tính kháng khuẩn cao, bền, nên có 91 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP khả năng ức chế vi sinh vật thấp hơn B, D và do cao chiết chịu sự ảnh hưởng trực tiếp bởi nhiệt độ chiết cao 70 – 80oC, một số loại polyphenol dễ bị mất hoạt tính và trong quá trình chiết dịch chiết phải tiếp xúc với các loại ánh sáng trắng và màu dẫn đến một số hợp chất thứ cấp bị quang hóa, oxy hóa. Tuy nhiên, khả năng kháng vi sinh vật của 2 loại cao chiết C và A vẫn được xem là tốt. 92 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Qua thời gian thực hiện đề tài, kết quả nghiên cứu thu được như sau: - Tách chiết và thu được 4 loại cao chiết lá củ đậu theo các dung môi và các phương pháp khác nhau kí hiệu như sau:  A: cao chiết lá củ đậu sử dụng dung môi acetone và phương pháp chiết Soxhlet.  B: cao chiết lá củ đậu sử dụng dung môi acetone và phương pháp ngâm dầm.  C: cao chiết lá củ đậu sử dụng dung môi etanol 90o và phương pháp chiết Soxhlet.  D: cao chiết lá củ đậu sử dụng dung môi etanol 90o và phương pháp ngâm dầm. - Định tính được trong lá củ đậu có các hợp chất thứ cấp như flavonoid, rotenone. - Xác định được hàm lượng chất khô bên trong lá củ đậu theo từng dung môi và phương pháp khác nhau, tùy theo mục đích nghiên cứu mà lựa chọn thích hợp. - Xác định được hàm lượng polyphenol tổng số trong 4 loại cao chiết. Cao chiết A là 323,27 mg GE/g db, cao chiết B là 279,53 mg GE/g db, cao chiết C là 785,25 mg GE/g db, cao chiết D là 293,8 mg GE/g db. Nếu muốn tách chiết hàm lượng polyphenol cao nên sử dụng dung môi etanol 90o và phương pháp chiết Soxhlet. - Đã xác định được hàm lượng flavonoid tổng số trong 4 loại cao chiết. Cao chiết A 16,64 mgRE/g db, cao chiết B là 14,93 mgRE/g db, cao chiết C là 52,91 mgRE/g db, cao chiết D là 16,51 mgRE/g db. Nếu muốn tách chiết hàm lượng flavonoid cao nên sử dụng dung môi etanol 90o và phương pháp chiết Soxhlet. - Đánh giá được độc tính trong từng loại cao chiết lá cây củ đậu bằng mô hình in vitro trên Artermia Nauplli. Tính toán được nồng độ gây chết trung bình 93 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LC50 (mg/L) của từng loại cao chiết: cao chiết A là 10,4 (mg/L), cao chiết B là 25,2 (mg/L), cao chiết C là 22,2 (mg/L) và cao chiết D là 23,4 (mg/L), phục vụ cho các nghiên cứu về độc chất sau này. - Đánh được khả năng kháng khuẩn của 4 loại cao chiết là tốt với vi khuẩn Gram (-). 4.2. Kiến nghị Do giới hạn về mặt thời gian, điều kiện trang thiết bị cũng như điều kiện kinh tế nên thí nghiệm vẫn chưa hoàn chỉnh. Đề hoàn thiện đề tài, người thực hiện đề tài có một số kiến nghị như sau: - Nghiên cứu quy trình trích ly và tinh sạch các hợp chất mang độc tính trong lá cây củ đậu như rotenone. - Nghiên cứu thêm về khả năng chống oxi hóa và các tác dụng khác của các chất có trong polyphenol, flavonoid lá củ đậu. - Thử độc tính trên các loại sâu bệnh để tạo dược liệu mang độc tính bổ sung vào thuốc BVTV. - Nghiên cứu khả năng kháng nấm, mốc từ lá củ đậu. Ý nghĩa khoa học: - Xác định thành phần hóa học , định lượng polypohenol tổng, flavonoid tổng số, đánh giá độc tính và kháng khuẩn trên cùng một loại nguyên liệu mà chưa có một nghiên cứu nào trước đây thực hiện. - Tính toán được LC50, ứng dụng trong BVTV. Ý nghĩa thực tiễn - Ứng dụng trong viêc tạo sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học, không ảnh hưởng đến môi trường và sức khỏe con người. - Tận dụng phế phẩm của nhà nông 94 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Lưu Thúy Diễm (2013).“Xây dựng quy trình phân tích tổng flavonoid từ một số cao dược liệu bằng phương pháp UV – VIS”, luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ,Cần Thơ. [2] Nguyễn Ngọc Kiểng. 1992. Một số phương pháp cần nghiên cứu khoa học, Nhà xuất bản Tp. HCM. [3] Nguyễn Thị Hoàng Lan, Bùi Quang Thuật, Lê Danh Tuyên, Nguyễn Thị Ngọc Duyên (2015) – Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu Tía tô. Tạp chí khoa học và phát triển 2015, tập số 13, số 2:245-240. [4] Nguyễn Thị Kim Ngân (2015). “Nghiên cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy hóa của lá sen nelumbo nucifera”, Đồ án tốt nghiệp, Trường Đại học Công nghệ TP. HCM, TP. Hồ Chí Minh. [5] Phạm Minh Nhựt. 2014. Các phương pháp phân tích vi sinh, Trường Đại học Công nghệ TP. HCM, TP Hồ Chí Minh. [6] Nguyễn Phi Kim Phụng. 2007. Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia TP.HCM, TP. Hồ Chí Minh [7]Trần Kim Qui (1993). “Nghiên cứu điều chế thuốc trừ sâu thảo mộc”, Trường Đại học Tổng hợp TP.HCM, TP.Hồ Chí Minh. [8] Nguyễn Tiến Thắng (2015). “Nghiên cứu trích ly tinh dầu của các loại bưởi ở miền Nam Việt Nam và thử hoạt tính kháng khuẩn, bước đầu ứng dụng để sản xuất kem trị mụn từ tinh dầu bưởi ”, Đồ án tốt nghiệp, Trường Đại học Công nghệ TP. HCM, TP. Hồ Chí Minh. [9] Nguyễn Tiến Toàn, Nguyễn Xuân Duy (2014) – Hoạt tính chống oxy hóa và ức chế enzyme polyphenoloxydase của một số loài thực vật ăn được ở Việt Nam. Tạp chí khoa học và phát triển 2013, tập số 11, số 3:364-372. [10] Nguyễn Tiến Toàn, Nguyễn Xuân Duy (2014) - Ảnh hưởng của điều kiện tách chiết đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của cây Diệp hạ châu 95 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP (Phyllathus amarus) trồng tại Phú Yên. Tạp chí khoa học và phát triển 2014, tập số 12, số 3:412-421. [11] Lê Quốc Tuấn – Độc chất học môi trường, trường Đại học Nông lâm TP.HCM, TP.Hồ Chí Minh. [12] Đỗ Thị Tuyến – Huỳnh Văn Thành – Nguyễn Thị Thu Hương (2014), “ Thực hành công nghệ sản xuất sinh phẩm”, Trường Đại học Công nghệ TP.HCM, TP. Hồ Chí Minh. Tài liệu Tiếng Anh [13] Burt s, 2004. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications foods a review, Int. J. Food Microbiol. 94, p.223-253. [14] Griffin Shane G s. Grant ie, Julie L Markham and David The role N. (1999), of structure and molecular properties of terpenoids in determining their antimicrobial activity, Flavour Fragr, J., 14.322-332 [15] Singleton [1’] Singleton VL, Orthofer R, Lamuela-Raventos RM. (1999) Analysis of total phenol and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent. Method Enzymol 299: 152-78. Tài liệu Internet [16]https://vi.wikipedia.org/wiki/C%C3%A2y_c%E1%BB%A7_%C4%91%E1%B A%ADu [17] [18] [19] dan-dong-trieu-2209347/ [20] [21] [22] %BB%86MN%C3%82NGCAON%C4%82NGSU%E1%BA%A4T,CH%E1%BA% A4TL%C6%AF%E1%BB%A2NGC%E1%BB%A6%C4%90%C3%82UTHU%C4 %90%C3%94NG.aspx 96 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [23] [24] [25] hoat-tinh-sinh-hoc-cac-phuong-phap-chiet-suat-va-ung-dung.htm?page=7 [26] [27] https://en.wikipedia.org/wiki/Rotenone [28] co2-sieu-toi-han-nang-gia-tri-qua-gac.html [29] ran-566/ [30] [31] [32] https://issuu.com/thao1994/docs/h___p_ch___t_kh__ng_khu___n_t____th [33] https://vi.wikipedia.org/wiki/Rotenon 97 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC 1. Định lượng một số hợp chất thứ cấp và chất khô trong các loại cao chiết 1.1. Hàm lượng chất khô Cao chiết A B C D BĐ (g) 32.791 48.569 36.895 34.847 L1 (g) 32.822 48.603 37.008 34.886 L2 (g) 32.817 48.599 37.006 34.886 L3 (g) 32.817 48.597 37.006 34.886 1.2. Hàm lượng polyphenol tổng số x mg Hàm lượng polyphenol tổng mg GE/g vật Loại cao chiết OD GE liệu Độ lệch chuẩn 0.244 2.34 304.2 0.265 2.58 335.4 A 0.262 2.54 330.2 16.72 0.221 2.08 291.2 0.237 2.26 316.4 B 0.182 1.65 231 43.88 0.157 1.37 760.35 0.155 1.34 743.7 C 0.173 1.54 854.7 59.86 0.191 1.75 341.25 0.174 1.56 304.2 D 0.143 1.21 235.95 53.41 The SAS System 13:45 Thursday, August 16, 2016 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values HLPOLYPHENOLTS 4 A B C D Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12 The SAS System 13:45 Thursday, August 16, 2016 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of 1 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 537455.0823 179151.6941 82.93 <.0001 Error 8 17282.5733 2160.3217 Corrected Total 11 554737.6556 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.968846 11.04775 46.47926 420.7125 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F HLPOLYPHENOLTS 3 537455.0823 179151.6941 82.93 <.0001 The SAS System 13:45 Thursday, August 16, 2016 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 2160.322 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 87.513 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N HLPOLYPHENOLTS A 786.25 3 C B 323.27 3 A B B 293.80 3 D B B 279.53 3 B 1.3. Hàm lượng flavonoid tổng số Loại cao Hàm lượng flavonoid tổng mg RE/g vật chiết OD x mg RE liệu Độ lệch chuẩn 0.674 0.63 16.38 0.685 0.64 16.64 A 0.687 0.65 16.9 0.26 B 0.569 0.53 14.84 0.43 2 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 0.554 0.52 14.56 0.581 0.55 15.4 0.528 0.5 55.5 0.501 0.47 52.17 C 0.495 0.46 51.06 2.31 0.494 0.46 17.94 0.458 0.43 16.77 D 0.403 0.38 14.82 1.58 The SAS System 02:18 Friday, August 17, 2016 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values HLFLAVONOIDTS 4 A B C D Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12 The SAS System 02:18 Friday, August 17, 2016 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 3066.086700 1022.028900 506.34 <.0001 Error 8 16.147867 2.018483 Corrected Total 11 3082.234567 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.994761 5.627038 1.420733 25.24833 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F HLFLAVONOIDTS 3 3066.086700 1022.028900 506.34 <.0001 The SAS System 02:18 Friday, August 17, 2016 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y 3 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 2.018483 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 2.675 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N HLFLAVONOIDTS A 52.910 3 C B 16.640 3 A B B 16.510 3 D B B 14.933 3 B 4 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2. Khảo sát độc tính  Cao chiết A Nồng độ cao chiết 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 % Đối chứng 30 28 28 29 30 30 29 Mẫu TN 1 18 9 12 14 19 4 7 Mẫu TN 2 22 18 11 10 11 13 8 Mẫu TN 3 15 11 11 11 6 13 10 Số con chết 11.67 15.33 16.67 17.33 18 20 20.67 % chết 38.9 51.1 55.57 57.77 60 66.67 68.9 Log10[NĐ%] - 3.52 - 3.4 - 3.3 - 3.22 - 3.15 - 3.1 - 3.05 Probit 4.7181 5.0276 5.1408 5.1968 5.2533 5.4316 5.4930 Đường chuẩn 5.6 y = 1.5045x + 10.068 5.5 R² = 0.9573 5.4 5.3 5.2 5.1 5 Giá trị Giá Probit 4.9 4.8 4.7 4.6 -3.6 -3.5 -3.4 -3.3 -3.2 -3.1 -3 log10(NĐ) Số con chết = Đối chứng – (Mẫu TN 1 + Mẫu TN 2 + Mẫu TN 3)/3 % chết = (Số con chết.100)/30 => Giá trị Probit Tra bảng Probit tỉ lệ chết 50% = 5.0000 Log10(X) = (5 – 10.068)/1,5045 => X = -3,37  LC50 = 0,04% 5 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Cao chiết B Nồng độ cao chiết 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 % Đối chứng 29 29 30 27 29 28 30 Mẫu TN 1 18 15 9 11 4 3 3 Mẫu TN 2 19 14 11 9 7 8 3 Mẫu TN 3 18 8 14 6 4 5 5 Số con chết 10.67 16.67 18.67 18.33 24 22.67 26.33 %chết 35.57 55.57 62.23 61.1 80 75.57 87.77 Log10[NĐ] -3.3 -3 -2.82 -2.7 -2.6 -2.52 -2.46 Probit 4.6308 5.1408 5.3107 5.2819 5.8416 5.6935 6.1650 Đường chuẩn 7 y = 1.6067x + 9.8907 6 R² = 0.8879 5 4 3 Giá trị Giá Probit 2 1 0 -3.5 -3 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 log10(NĐ) Số con chết = Đối chứng – (Mẫu TN 1 + Mẫu TN 2 + Mẫu TN 3)/3 % chết = (Số con chết.100)/30 => Giá trị Probit Tra bảng Probit tỉ lệ chết 50% = 5,0000 Log10(X) = (5 – 9,8907)/1,6067 = -3,04  LC50 = 0,09% 6 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Cao chiết C Nồng độ cao chiết 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 % Đối chứng 29 30 28 30 30 29 29 Mẫu TN 1 14 6 9 10 8 5 5 Mẫu TN 2 15 16 10 7 10 7 8 Mẫu TN 3 3 11 6 11 8 7 4 Số con chết 18.33 19 19.67 20.67 21.33 22.67 23.33 %chết 61.1 63.33 65.57 68.9 71.1 75.57 77.77 Log10[NĐ] -3.52 -3.4 -3.3 -3.22 -3.15 -3.1 -3.05 Probit 5.2819 5.3398 5.4016 5.493 5.5563 5.6935 5.7655 Đường chuẩn 5.8 y = 1.0237x + 8.8299 5.7 R² = 0.9255 5.6 5.5 5.4 Giá trị Giá pronit 5.3 5.2 5.1 -3.6 -3.5 -3.4 -3.3 -3.2 -3.1 -3 Log10(NĐ) Số con chết = Đối chứng – (Mẫu TN 1 + Mẫu TN 2 + Mẫu TN 3)/3 % chết = (Số con chết.100)/30 => Giá trị Probit Tra bảng Probit tỉ lệ chết 50% = 5,0000 Log10(X) = (5 – 8,8299)/1,0237 = - 3,74  LC50 = 0,02% 7 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Cao chiết D Nồng độ cao chiết 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 % Đối chứng 28 29 28 27 29 29 30 Mẫu TN 1 19 9 4 2 5 4 2 Mẫu TN 2 12 6 5 1 2 2 2 Mẫu TN 3 14 13 7 3 3 1 1 Số con chết 13 19.67 22.67 25 25.67 26.67 28.33 %chết 43.33 65.57 75.57 83.33 85.57 88.9 94.43 Log10[NĐ] -3.3 -3 -2.82 -2.7 -2.6 -2.52 -2.46 Probit 4.8313 5.4016 5.6935 5.9661 6.0626 6.2212 6.5893 Đường chuẩn 7 y = 1.9234x + 11.154 6 R² = 0.9772 5 4 3 Giá trị Giá Probit 2 1 0 -3.5 -3 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 log10(NĐ) Số con chết = Đối chứng – (Mẫu TN 1 + Mẫu TN 2 + Mẫu TN 3)/3 % chết = (Số con chết.100)/30 => Giá trị Probit Tra bảng Probit tỉ lệ chết 50% = 5,0000 Log10(X) = (5 – 11,154)/1.9234 = -3,2  LC50 = 0,06% 8 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Bảng giá trị Probit 9 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 10 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 11 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 12 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3. Kháng khuẩn 3.1. Môi trường  NB - 1,5g cao thịt - 1,5 g cao nấm men - 5 g pepton - 5 g NaCl - 1000 ml nước cất - pH 7,4 ± 0,2.  NA - 1,5 g cao thịt - 1,5 g cao nấm men - 5 g pepton - 5 g NaCl - 15 g agar - 1000 ml nước cất - pH 7,4 ± 0,2 13 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.2. Enterotoxigenic E.Coli Đường kính vòng kháng khuẩn A B C D E L1 (mm) 10 13 11 13 16 L2 (mm) 10 15 9 12 16 L3 (mm) 11 17 12 12 16 Độ lệch chuẩn 0.58 2 1.53 0.58 0 The SAS System 01:00 Friday, August 18, 2016 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values KKETEC 5 A B C D E Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 The SAS System 01:00 Friday, August 18, 2016 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 77.73333333 19.43333333 13.88 0.0004 Error 10 14.00000000 1.40000000 Corrected Total 14 91.73333333 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.847384 9.195979 1.183216 12.86667 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F KKETEC 4 77.73333333 19.43333333 13.88 0.0004 The SAS System 01:00 Friday, August 18, 2016 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. 14 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 1.4 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 2.1526 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N KKETEC A 16.0000 3 E A A 15.0000 3 B B 12.3333 3 D B B 10.6667 3 C B B 10.3333 3 A 3.3. Listeria monocytogenes Đường kính vòng kháng khuẩn A B C D E L1 (mm) 13 12 13 13 14.5 L2 (mm) 10 12 13 12 14.5 L3 (mm) 11 11 13.5 11 14.5 Độ lệch chuẩn 1.53 0.58 0.29 1 0 The SAS System 01:07 Friday, August 18, 2016 1 15 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values KKLIS 5 A B C D E Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 The SAS System 01:07 Friday, August 18, 2016 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 20.23333333 5.05833333 6.74 0.0067 Error 10 7.50000000 0.75000000 Corrected Total 14 27.73333333 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.729567 6.909777 0.866025 12.53333 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F KKLIS 4 20.23333333 5.05833333 6.74 0.0067 The SAS System 01:07 Friday, August 18, 2016 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.75 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 1.5755 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N KKLIS 16 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP A 14.5000 3 E A B A 13.1667 3 C B B C 12.0000 3 D B C B C 11.6667 3 B C C 11.3333 3 A 17 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.4. Pseudomonas aeruginosa Đường kính vòng kháng khuẩn A B C D E L1 (mm) 11 11 9 10 15 L2 (mm) 11 10.5 8 10 15 L3 (mm) 12 13 9 11 15 Độ lệch chuẩn 0.58 1.32 0.58 0.58 0 The SAS System 01:07 Friday, August 18, 2016 5 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values KKPSEU 5 A B C D E Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 The SAS System 01:07 Friday, August 18, 2016 6 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 64.73333333 16.18333333 29.42 <.0001 Error 10 5.50000000 0.55000000 Corrected Total 14 70.23333333 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.921690 6.524515 0.741620 11.36667 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F KKPSEU 4 64.73333333 16.18333333 29.42 <.0001 The SAS System 01:07 Friday, August 18, 2016 7 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. 18 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.55 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 1.3492 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N KKPSEU A 15.0000 3 E B 11.5000 3 B B B 11.3333 3 A B B 10.3333 3 D C 8.6667 3 C 19