Đồ án Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba l.) và khảo sát hoạt tính sinh học

kết quả nghiên cứu trong đồ án này là trung thực và chƣa từng đƣợc các tác giả khác công bố trong các nghiên cứu, đồ án nào. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ trong việc hoàn thành đồ án đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong đồ án đã đƣợc ghi rõ nguồn gốc. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong đồ án này. TP. HCM, ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thanh Loan i ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận đƣợc sự động viên và giúp đỡ rất lớn từ các cá nhân và tập thể. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giáo viên hƣớng dẫn ThS. Nguyễn Thị Thu Hƣơng, giảng viên Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, ngƣời đã tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện và hoàn thành đồ án tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Phòng thí nghiệm Trƣờng Đại học Công nghệ TP. HCM đã tạo mọi điều kiện cơ sở vật chất tốt cho tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các bạn trong nhóm sinh viên làm nghiên cứu khoa học đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã động viên giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn này. TP. HCM, ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thanh Loan ii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC MỤC LỤC ......................................................................................................................... i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT........................................................................................ v DANH MỤC BẢNG ....................................................................................................... vi DANH MỤC SƠ ĐỒ .....................................................................................................vii DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................... viii LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 4 1.1. Tổng quan về cây mồng tơi ................................................................................ 5 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại ................................................................................. 5 1.1.2. Đặc điểm và sinh thái .................................................................................... 6 1.1.3. Tình hình trồng trọt, tiêu thụ, kỹ thuật canh tác cây mồng tơi ở Việt Nam 7 1.1.3.1. Tình hình trồng trọt và tiêu thụ ................................................................ 7 1.1.3.2. Kỹ thuật canh tác ..................................................................................... 8 1.1.4. Thành phần hóa học.................................................................................... 10 1.1.5. Tính vị và công dụng ................................................................................... 11 1.2. Hợp chất Phenol, Flavonoid, Anthocyanin ..................................................... 12 1.2.1. Phenol ........................................................................................................... 12 1.2.1.1. Đại cƣơng về hợp chất phenol ................................................................ 12 1.2.1.2. Phân loại .................................................................................................. 13 1.2.1.3. Tính chất và chức năng .......................................................................... 14 1.2.2. Flavonoid ..................................................................................................... 15 1.2.2.1. Đại cƣơng về flavonoid .......................................................................... 15 1.2.2.2. Phân loại ................................................................................................. 15 1.2.2.3. Lý tính .................................................................................................... 16 1.2.2.4. Hóa tính .................................................................................................. 17 i ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.2.2.5. Hoạt tính sinh học .................................................................................. 18 1.2.3. Anthocyanin ................................................................................................. 21 1.2.3.1. Đại cương về anthocyanin ..................................................................... 21 1.2.3.2. Phân loại ................................................................................................ 23 1.2.3.3. Lý tính ..................................................................................................... 24 1.2.3.4. Hóa tính .................................................................................................. 24 1.2.3.5. Hoạt tính sinh học .................................................................................. 25 1.3. Các phƣơng pháp tách chiết hợp chất thứ cấp trong thực vật ..................... 26 1.3.1. Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng ........................................................................... 26 1.3.2. Kỹ thuật chiết lỏng – rắn ............................................................................. 28 1.3.2.1. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt ......................................................................... 28 1.3.2.2. Kỹ thuật chiết ngâm dầm ........................................................................ 28 1.3.2.3. Kỹ thuật chiết bằng máy chiết Soxhlet ................................................... 29 1.3.2.4. Kỹ thuật chiết bằng máy Kumagawa ...................................................... 30 1.3.2.5. Phƣơng pháp chƣng cất ........................................................................... 31 1.3.2.6. Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn ............................................................ 32 1.3.2.7. Kỹ thuật chiết pha rắn ............................................................................. 33 1.4. Tổng quan về khả năng kháng oxy hóa ........................................................... 34 1.4.1. Quá trình và nguyên nhân gây oxy hóa ..................................................... 34 1.4.2. Khả năng kháng oxy hóa của các hợp chất trong thực vật ....................... 35 1.5. Cơ sở khoa học của khả năng kháng khuẩn của các hợp chất trong thực vật .35 1.5.1. Định nghĩa .................................................................................................... 35 1.5.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất trong thực vật .............................. 36 1.6. Các chủng vi sinh vật thí nghiệm ..................................................................... 38 1.6.1. Salmonella .................................................................................................... 38 1.6.2. Staphylococcus aureus ................................................................................. 39 ii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.6.3. Escherichia Coli ........................................................................................... 40 1.6.4. Bacillus cereus .............................................................................................. 42 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........... Error! Bookmark not defined. 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................... 44 2.2. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 44 2.2.1. Nguồn mẫu ................................................................................................... 44 2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị ......................................................................................... 44 2.3. Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm ....................................................................... 44 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................. 45 2.4.1. Phương pháp xác định độ ẩm của mẫu ...................................................... 45 2.4.2. Phương pháp xác định tỉ lệ trọng lượng của mẫu ..................................... 46 2.4.3. Phương pháp tách chiết và thu nhận cao chiết .......................................... 46 2.4.4. Phương pháp định lượng polyphenol tổng số ............................................ 46 2.4.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa trên mô hình DPPH .... 47 2.4.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bằng kỹ thuật đục lỗ thạch ..48 2.4.7. Phương pháp xử lý số liệu........................................................................... 50 2.4.8. Phương pháp so sánh, đối chiếu ................................................................. 50 2.5. Bố trí thí nghiệm ................................................................................................ 50 2.5.1. Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm của mẫu quả mồng tơi ............................. 50 2.5.2. Thí nghiệm 2: Xác định tỉ lệ trọng lượng của mẫu ................................... 51 2.5.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi trích ly đến hàm lượng anthocyanin ............................................................................................................ 51 2.5.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi trích ly đến hàm lượng polyphenol tổng số .................................................................................................. 54 2.5.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi trích ly đến khả năng kháng oxy hóa ......................................................................................................... 55 iii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.5.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi trích ly đến khả năng kháng khuẩn ........................................................................................................... 55 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................. Error! Bookmark not defined. 3.1. Kết quả xác định độ ẩm và tỉ lệ trọng lƣợng của quả mồng tơi chín ........... 58 3.2. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của dung môi đến hàm lƣợng anthocyanin ... 58 3.3. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của dung môi đến hàm lƣợng polyphenol tổng số .60 3.4. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của dung môi đến khả năng kháng oxy hóa .63 3.5. Kết quả ảnh hƣởng của dung môi trích ly đến khả năng kháng khuẩn ...... 67 3.5.1. Hoạt tính kháng Bacillus cereus của các loại cao chiết ............................ 67 3.5.2. Hoạt tính kháng Salmonella của các loại cao chiết ................................... 67 3.5.3. Hoạt tính kháng E.coli của các loại cao chiết ............................................ 68 3.5.4. Hoạt tính kháng Staphylococcus aureus của các loại cao chiết ............... 69 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................ Error! Bookmark not defined. 4.1. Kết luận ................................................................................................................ 71 4.2. Kiến nghị.............................................................................................................. 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 72 PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 1 iv ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AG : acid gallic BVTV : bảo vệ thực vật db : nguyên liệu DMSO : Dimethyl Sulfoxide DPPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl IC50 : The half maximal inhibitory concentration NA : Nutrient Agar NB : Nutrient Broth OD : Optical Density TN : thí nghiệm v ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại khoa học cây mồng tơi .................................................................... 5 Bảng 1.2. Thành phần hóa học của cây mồng tơi .......................................................... 10 Bảng 1.3. Những nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn (Cowan, 1990) .. 37 Bảng 1.4. Phân loại khoa học chủng vi khuẩn Salmonella............................................ 38 Bảng 1.5. Phân loại khoc học chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus ......................... 39 Bảng 1.6. Phân loại khoa học chủng vi khuẩn E.Coli ................................................... 40 Bảng 1.7. Phân loại khoa học chủng vi khuẩn Bacillus cereus ..................................... 42 Bảng 3.1. Tỉ lệ trọng lƣợng phần sử dụng và độ ẩm quả mồng tơi chín ....................... 58 Bảng 3.2. Kết quả đƣờng chuẩn acid gallic ................................................................... 60 Bảng 3.3. Kết quả hàm lƣợng polyphenol tổng trong 4 loại dung môi trích ly quả mồng tơi chín ............................................................................................................................ 61 Bảng 3.4. Phần trăm ức chế của cao quả mồng tơi chín ở các dung môi trích ly khác nhau ( các mẫu tự theo sau các giá trị trong cùng một cột khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức 1%). ................................................................................ 65 Bảng 3.5. Phƣơng trình đƣờng chuẩn và giá trị IC50 của nghiệm thức ......................... 65 Bảng 3.6. Kết quả kháng Bacillus cereus của 4 loại cao chiết ...................................... 67 Bảng 3.7. Kết quả kháng Salmonella của 4 loại cao chiết............................................. 67 Bảng 3.8. Kết quả kháng E.coli của 4 loại cao chiết ..................................................... 68 Bảng 3.9. Kết quả kháng Staphylococcus aureus của 4 loại cao chiết .......................... 69 vi ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát .......................................................................... 50 Sơ đồ 2.2. Quy trình trích ly và thu hồi cao quả mồng tơi ............................................ 53 Sơ đồ 2.3. Quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết quả mồng tơi chín ........................................................................................................................................ 56 Sơ đồ 3.1. Hiệu suất thu hồi cao chiết từ quả mồng tơi chín vối các dung môi khác nhau ................................................................................................................................ 59 Sơ đồ 3.2. So sánh hàm lƣợng polyphenol tổng của cao chiết quả mồng tơi chín ở các dung môi trích ly khác nhau ........................................................................................... 62 Sơ đồ 3.3. Biểu đồ so sánh giá trị IC50 của vitamin C và cao chiết ở các dung môi trích ly khác nhau. .................................................................................................................. 66 Sơ đồ 3.4. Tổng quát về hoạt tính kháng khuẩn của cao quả mồng tơi chín từ các loại dung môi khác nhau trên cả 4 chủng vi khuẩn. .............................................................. 70 vii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cây mồng tơi ................................................................................................... 6 Hình 1.2. Quả mồng tơi ................................................................................................... 6 Hình 1.3. Anthocyanin .................................................................................................. 11 Hình 1.4. Một số hợp chất phenol ................................................................................. 13 Hình 1.5. Một số Eucoflavonoid ................................................................................... 15 Hình 1.6. Cấu trúc cơ bản của aglucon của anthocyanin .............................................. 21 Hình 1.7. Cấu trúc của 6 loại phổ biến trong nhóm anthocyanin .................................. 22 Hình 1.8. Cấu trúc của một số anthocyanin tự nhiên. Các anthocyanin tƣơng ứng luôn đƣợc glycosyl hóa ở nhóm hydroxy C3 ....................................................................... 23 Hình 1.9. Sự phụ thuộc cấu trúc anthocyanin vào pH ................................................... 25 Hình 1.10. Kỹ thuật chiết lỏng  lỏng ........................................................................... 27 Hình 1.11. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt ............................................................................. 28 Hình 1.12. Kỹ thuật chiết ngâm dầm ............................................................................. 29 Hình 1.13. Bộ chiết Soxhlet .......................................................................................... 30 Hình 1.14. Máy chiết Kumagawa .................................................................................. 31 Hình 1.15. Bộ lôi cuốn hơi nƣớc ................................................................................... 31 Hình 1.16. Sơ đồ hệ thống chiết siêu tới hạn ................................................................ 32 Hình 1.17. Cột chiết pha rắn .......................................................................................... 33 Hình 1.18. Cơ chế kháng khuẩn .................................................................................... 36 Hình 1.19. Vi khuẩn Salmonella ................................................................................... 39 Hình 1.20. Vi khuẩn Staphylococcus aureus ................................................................ 40 Hình 1.21. Vi khuẩn Escherichia Coli .......................................................................... 41 Hình 1.22. Vi khuẩn Bacillus cereus ............................................................................. 42 Hình 2.1. Quả mồng tơi chín ......................................................................................... 44 Hình 2.2. Kỹ thuật đục lỗ thạch có bổ sung kháng sinh đối chứng ............................... 49 Hình 2.3. Hỗn hợp quả mồng tơi giã nhỏ và dung môi sau khi lắc ............................... 53 viii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.1. Dịch chiết quả mồng tơi chín ở các dung môi trích ly khác nhau ................. 58 Hình 3.2. Cao chiết quả mồng tơi chín ở các dung môi trích ly khác nhau .................. 59 Hình 3.3. Dung dịch đƣờng chuẩn acid gallic ............................................................... 60 Hình 3.4. Đƣờng chuẩn acid gallic ................................................................................ 61 Hình 3.5. Đƣờng chuẩn vitamin C ................................................................................ 63 Hình 3.6. Phản ứng của DPPH và chất chuẩn vitmin C ................................................ 63 Hình 3.7. Đƣờng chuẩn của cao chiết ethanol 30%, 50%, 70%, nƣớc cất (theo thứ tự từ trên xuống dƣới, từ trái sang phải).64 Hình 3.8. Phản ứng của DPPH và cao chiết......64 ix ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Từ rất xa xƣa, ngƣời ta đã biết sử dụng các chất màu tự nhiên từ thực vật để tạo màu cho thực phẩm. Trong công nghiệp thực phẩm, các chất nhuộm màu có nguồn gốc tự nhiên chỉ chiếm 6% trong tổng số các chất đƣợc sử dụng để tạo màu. Ngoài việc chiết xuất các sắc tố này trong tự nhiên, ngƣời ta có thể tổng hợp hóa học, sử dụng các chất tạo màu nhân tạo. Tuy nhiên, nếu lạm dụng nhiều phụ gia là các chất màu tổng hợp nhân tạo vào trong thực phẩm sẽ gây ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe con ngƣời. Vì thế việc nghiên cứu ứng dụng chất màu tự nhiên trong chế biến thực phẩm có ý nghĩa rất quan trọng, vừa tạo màu sắc tự nhiên, đặc trƣng của sản phẩm, vừa tăng giá trị cảm quan và đặc biệt là an toàn cho sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Cây mồng tơi là loại rau xanh ngắn ngày, có thể trồng nhiều vụ trong năm, quen thuộc với ngƣời Việt Nam trong các bữa ăn hàng ngày. Và do kỹ thuật trồng cây khá dễ, dễ chăm bón, dễ tìm mua hạt giống hay cây giống nên nhiều gia đình có thể tự trồng rau mồng tơi tại nhà. Tuy nhiên, chúng ta chỉ thu hoạch và sử dụng lá, phần quả đƣợc phơi khô làm giống, để rơi rụng hoặc bị cắt bỏ. Quả mồng tơi chín có chứa hợp chất anthocyanin có nhiều hoạt tính sinh học quý nhƣ khả năng chống oxy hóa cao nên đƣợc sử dụng để chống lão hóa, hoặc chống oxy hóa các sản phẩm thực phẩm, chống viêm, chống các tia phóng xạ, hạn chế sự suy giảm sức đề kháng, sự phát triển của các tế bào ung thƣ Dù vậy, các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính của quả mồng tơi chín có thể ứng dụng trong thực phẩm và y học nhƣng vẫn còn rất hạn chế ở Việt Nam. Việc nghiên cứu sản xuất và bổ sung các hợp chất màu đƣợc tách từ thiên nhiên vào thực phẩm, hạn chế sử dụng phụ gia tổng hợp gây hại cho con ngƣời luôn đƣợc xã hội quan tâm. Các hợp chất màu trong rau quả đƣợc chia làm bốn nhóm chính: Chlorophylls, Carotenoids, Flavonoids, Betalains. Mỗi màu sắc đặc trƣng cho một loại rau quả và chứa một vài chất có hoạt tính sinh học. Tuy nhiên, màu sắc này lại không 1 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP bền theo thời gian và dễ bị ảnh hƣởng bởi những tác động bên ngoài nhƣ: nhiệt độ, pH, ánh sáng... Từ những nguyên nhân trên, đề tài “Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (Basella alba L.) và khảo sát hoạt tính sinh học” đƣợc thực hiện, tạo tiền đề khoa học cho các nghiên cứu tạo màu thực phẩm cũng nhƣ trong lĩnh vực y dƣợc mang lại nhiều giá trị thực tiễn. 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 2.1. Các nghiên cứu trong nƣớc - Luận văn tốt nghiệp “Anthocyanin – nghiên cứu tách chiết từ cây mồng tơi Basella ruba L. Và khảo sát khả năng chống oxy hóa, nhận diện hàn the trong thực phẩm” Ngô Trần Hữu Nghĩa (2014). Đề tài sử dụng dịch chiết từ quả mồng tơi. - Luận văn thạc sĩ khoa học “Nghiên cứu tách chiết caroten từ một số loại rau xanh và ứng dụng phối màu” Nguyễn Vũ Thái Hòa (2011). Trong đó, caroten đƣợc tách chiết trong rau mồng tơi. 2.2. Các nghiên cứu ngoài nƣớc - Kumar, S. Sravan, P. Manoj, and P. Giridhar. "A method for red-violet pigments extraction from fruits of Malabar spinach (Basella rubra) with enhanced antioxidant potential under fermentation." Journal of food science and technology 52.5 (2015): 3037-3043. Đánh giá khả năng kháng oxy hóa của quả mồng tơi lên quá trình lên men. - Nirmala, A., S. Saroja, and G. Gayathri Devi. "Antidiabetic Activity of Basella rubra and its Relationship with the Antioxidant Property." (2011). Vai trò của rau mồng tơi trong điều trị bệnh tiểu đƣờng. 3. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định độ ẩm, tỉ lệ trọng lƣợng của quả mồng tơi chín. 2 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Khảo sát hàm lƣợng anthocyanin từ quả mồng tơi chín ở các nồng độ dung môi khác nhau. - Xác định hàm lƣợng polyphenol trong cao chiết quả mồng tơi chín. - Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa và khả năng kháng khuẩn của cao chiết quả mồng tơi chín làm tiền đề cho việc nghiên cứu ứng dụng tạo màu trong thực phẩm. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Nhiệm vụ 1: Nghiên cứu về cơ sở khoa học, tổng quan tài liệu vấn đề nghiên cứu, làm cơ sở cho các nhiệm vụ tiếp theo. - Nhiệm vụ 2: Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm, thông qua các phƣơng pháp xác định, khảo sát, phân tích. - Nhiệm vụ 3: Xác định độ ẩm, tỉ lệ trọng lƣợng của quả mồng tơi chín. - Nhiệm vụ 4: Thu nhận dịch chiết quả mồng tơi chín bằng kỹ thuật chiết ngâm dầm trong etanol 30%, 50%, 70% và trong nƣớc cất, đánh giá hàm lƣợng anthocyanin từ cao chiết. - Nhiệm vụ 5: Xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số từ cao chiết quả mồng tơi chín. - Nhiệm vụ 6: Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa trên mô hình DPPH. - Nhiệm vụ 7: Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết quả mồng tơi chín. 5. Phƣơng pháp nghiên cứu - Phƣơng pháp nghiên cứu thu thập tài liệu: Các tài liệu về cây mồng tơi, thành phần hóa học của lá và quả mồng tơi chín, các phƣơng pháp xác định hàm lƣợng các hợp chất thứ cấp, mô hình đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa, phƣơng pháp đục lỗ thạch, sinh vật thí nghiệm. - Phƣơng pháp làm thí nghiệm: Tiến hành làm các thí nghiệm nhằm giải quyết các nhiệm vụ nghiên cứu. 3 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Phƣơng pháp xử lý số liệu bằng Excel và SAS. Các số liệu thu đƣợc sẽ đƣợc xử lý nhằm đƣa ra kết luận cho đề tài. 6. Kết quả đạt đƣợc của đề tài - Xác định đƣợc độ ẩm, tỉ lệ trọng lƣợng của quả mồng tơi chín. - Thu nhận đƣợc các loại dịch chiết quả mồng tơi chín bằng kỹ thuật chiết ngâm dầm trong etanol 30%, 50%, 70% và trong nƣớc cất. - Đánh giá đƣợc hàm lƣợng anthocyanin từ cao chiết cao chiết. - Định lƣợng đƣợc polyphenol tổng của các loại cao chiết. - Tìm ra giá trị IC50, so sánh khả năng kháng oxy hóa và khả năng kháng khuẩn một số loài vi sinh vật của các loại cao chiết. 7. Kết cấu đồ án tốt nghiệp - Mở đầu - Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu, cơ sở khoa học của đề tài - Chƣơng 2: Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu - Chƣơng 3: Kết quả và thảo luận - Chƣơng 4: Kết luận và kiến nghị - Tài liệu tham khảo 4 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về cây mồng tơi 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại Cây mồng tơi hay mùng tơi, tầm tơi, tên tiếng anh: Red vine spinach, Creeping spinach, Climbing spinach, Indian spinach, Asian Spinach, có tên khoa học: Basella alba L. là một cây dây leo, thuộc họ Mồng tơi (Basellaceae).[41] Loài này đƣợc tìm thấy [31] ở Châu Á nhiệt đới và Châu Phi, và đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ một loại rau ăn lá. Chi Mồng tơi (Basella) có nguồn gốc ở các nƣớc Nam Á, lan tỏa và mọc hoang ở nhiều nƣớc Châu Á nhiệt đới và đƣợc trồng ở Châu Á, Châu Phi, Nam Mỹ và còn phát triển đến vùng ôn đới thuộc Châu Á và Châu Âu. Phân bố phổ biến ở Châu Phi, quần đảo Ăngti, Brazil và Châu Á (Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan, Lào, Campuchia và Việt Nam). Ở Việt Nam, cây mọc hoang và đƣợc trồng khắp nơi. Thƣờng gặp ở ven rừng, trên đất ẩm, trong các đất trồng trọt từ vùng thấp tới vùng cao. Tại Châu Phi nhiệt đới, nó phổ biến nhất trong khu vực ấm áp, ẩm ƣớt và hiếm thấy ở các khu vực khô hoặc lạnh lẽo của châu lục này.[41] Bảng 1.1. Phân loại khoa học cây mồng tơi Phân loại khoa học Giới (regnum) Plantae (không phân hạng) Angiospermae (không phân hạng) Eudicots Bộ (ordo) Caryophyllales Họ (familia) Basellaceae Chi (genus) Basella Loài (species) Basella alba Danh pháp Basella alba L. 5 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Hình 1.1. Cây mồng tơi Hình 1.2. Quả mồng tơi 1.1.2. Đặc điểm và sinh thái Cây mồng tơi là cây thuộc loại dây leo quấn, có lá và đọt non ăn đƣợc, sống 1 năm hay 2 năm, thân dạng dây leo mập và nhớt, nhẳn bóng có màu xanh hay tím. Cây mồng tơi mọc nhanh, dây có thể dài đến 10 m. Rễ chùm mọc sâu trong đất, thích hợp trồng trên đất tơi xốp. Lá dày hình tim hoặc hình trứng, mọc xen, đơn, nguyên, có cuống, màu xanh, mọng nƣớc. Cụm hoa hình bông mọc ở kẽ lá, màu trắng hay tím đỏ 6 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU nhạt. Quả mọng, nhỏ, hình cầu hoặc trứng, dài khoảng 5 – 6 mm, màu xanh, khi chín chuyển màu tím đen. Cây đƣợc trồng ở phần lớn các vùng nhiệt đới để lấy lá và ngọn làm rau ăn và quả mọng có khi đƣợc dùng để nhuộm màu thực phẩm.[41] Theo Read (1936), trong rau mồng tơi có vitamin A3, vitamin B3, vitamin C, chất saponin, chất nhầy, chất sắt và canxi. Cây mồng tơi có chứa một số phenolic phytochemicals và có tính chất chống oxy hóa. Giống nhƣ hầu hết các loại rau khác, cây mồng tơi có nhiều vitamin A , vitamin C , sắt , và canxi, có lƣợng calo thấp nhƣng có hàm lƣợng protein khá cao. Chất nhầy mọng nƣớc là một nguồn cung cấp giàu chất [31], [45] xơ hòa tan. Mồng tơi phát triển tốt dƣới ánh mặt trời đầy đủ trong điều kiện khí hậu nóng ẩm và ở các khu vực có độ cao thấp hơn 500 mét so với mực nƣớc biển. Cây có nguồn gốc ở các nƣớc châu Á nhiệt đới.[40] Cây phát triển tốt nhất ở đất cát chứa nhiều chất hữu cơ có độ pH dao động từ 5,5 đến 8,0.[31] Ở Việt Nam, mồng tơi đƣợc gieo trồng chủ yếu trong vụ xuân và thu hoạch suốt vụ hè thu. Gieo trồng từ đầu tháng 3 đến tháng 5, thu hoạch từ tháng 5 đến tháng 9, nhiệt độ thích hợp 25  30°C. Tuy nhiên ở các tỉnh phía Nam có thể trồng quanh năm.[32] Có 3 loại giống mồng tơi phổ biến trong sản xuất nhƣ mồng tơi trắng có phiến lá nhỏ, thân mảnh, thân và lá có màu xanh nhạt; mồng tơi tía có phiến lá nhỏ, thân và gân lá có màu tím đỏ và mồng tơi lá to nhập từ Trung Quốc, lá dày, màu xanh đậm, phiến lá to, thân mập, thƣờng đƣợc trồng dày để dễ cắt tỉa cành non, ít nhớt và cho năng suất cao.[33] 1.1.3. Tình hình trồng trọt, tiêu thụ, kỹ thuật canh tác cây mồng tơi ở Việt Nam 1.1.3.1. Tình hình trồng trọt và tiêu thụ Ở Việt Nam, cây mồng tơi chủ yếu mọc hoang và đƣơc trồng khá phổ biến. Trong chƣơng trình phát triển sản xuất rau an toàn trên địa bàn tỉnh Bà Rịa- Vũng Tàu, giúp ngƣời dân nâng cao hiệu quả sản xuất, đảm bảo sản phẩm an toàn phục 7 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU vụ nhu cầu xã hội, rau mồng tơi đƣợc trồng phổ biến ở các vùng chuyên canh rau trên địa bàn tỉnh, đây là loại rau dễ trồng, thời gian sinh trƣởng ngắn có thể trồng nhiều lứa trong năm, nhu cầu tiêu dùng cao, do vậy tiêu thụ dễ dàng. Để so sánh rau mồng tơi sản xuất theo tập quán của nông dân với sản xuất theo chuẩn VietGAP, Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ thực vật triển khai mô hình tại vùng chuyên canh rau ở k...oại dung môi hữu cơ, việc chiết đƣợc thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lƣợng nhỏ thể tích dung môi, chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổi sang chiết với dung môi có tính phân cực cao hơn. Dung dịch của các lần chiết đƣợc gom chung lại, làm khan nƣớc với các chất làm khan nhƣ Na2SO4, MgSO4, CaSO4, đuổi dung môi ta thu đƣợc cao chiết. Hình 1.10. Kỹ thuật chiết lỏng  lỏng 27 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.3.2. Kỹ thuật chiết lỏng – rắn 1.3.2.1. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng khá phổ biến vì không đòi hỏi thiết bị tốn kém, phức tạp. Nguyên tắc: Dung môi chảy rất chậm qua khối nguyên liệu đựng trong bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, hình trụ đứng, dƣới đáy là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra, một bình chứa đặt bên dƣới để hứng dung dịch chiết, phía trên cao của bình ngấm kiệt là bình lóng chứa dung môi tinh khiết.[4] Trong suốt quá trình không khuấy trộn. Nguyên liệu luôn đƣợc tiếp xúc với dung môi, vận tốc dung môi chảy vào bình chứa nguyên liệu bằng vận tốc dung môi chảy ra , tạo ra sự chênh lệch nồng độ hoạt chất cao nên có thể chiết kiệt đƣợc hoạt chất.[36] Ƣu điểm: dịch chiết đƣợc chiết kiệt, dung dịch chiết đậm đặc.[36] Hình 1.11. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt 1.3.2.2. Kỹ thuật chiết ngâm dầm Nguyên tắc: Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp nguyên liệu đã đƣợc cắt nhỏ trong thời gian nhất định để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên, sau đó dung dịch chiết đƣợc lọc ngang qua 28 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU một tờ giấy lọc; thu hồi dung môi sẽ đƣợc cao chiết. Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây. Có thể gia tăng hiệu quả chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngoài). Quy tắc chiết là chiết nhiều lần, mỗi lần một lƣợng ít dung môi. Dung môi sau khi đƣợc thu hồi, đƣợc làm khan nƣớc bằng các chất làm khan và đƣợc tiếp tục sử dụng để chiết lần sau.[4] Hình 1.12. Kỹ thuật chiết ngâm dầm 1.3.2.3. Kỹ thuật chiết bằng máy chiết Soxhlet Nguyên tắc: Nguyên liệu đƣợc cho vào một túi vải rồi đặt vào ngăn chiết. Dung môi tinh khiết đƣợc cho vào bình cầu và đun hồi lƣu. Dung môi bốc hơi lên đƣợc ngƣng tụ xuống ngăn chiết và khi tràn sẽ chảy qua ống xi phông xuống bình cầu bên dƣới, mang theo các chất hòa tan từ dƣợc liệu. Ở bình cất, chất tan đƣợc giữ lại, dung môi bốc hơi lên ngƣng tụ xuống bình chiết và đi qua lớp nguyên liệu để hòa tan các chất tan còn lại. Tiếp tục cho đến khi nguyên liệu đƣợc chiết kiệt.[36] Các hợp chất đƣợc hút xuống bình cầu và nằm lại tại đó, chỉ có dung môi tinh khiết là đƣợc bốc hơi bay lên để tiếp tục quá trình chiết. Tiếp tục đến khi chiết kiệt chất trong bột cây (dung môi eter dầu hỏa chỉ chiết kiệt những chất kém phân cực nào có thể tan đƣợc trong eter dầu hỏa nóng). 29 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách tắt máy để nguội và mở hệ thống chỗ nút mài, rút lấy một giọt dung môi và thử trên mặt kiếng, nếu thấy không còn vết gì trên kiếng là đã chiết kiệt. Sau khi hoàn tất, lấy dung môi chiết ra khỏi bình cầu, đuổi dung môi, thu đƣợc cao chiết.[4] Ƣu điểm: quá trình chiết liên tục, ít tốn dung môi hơn các phƣơng pháp trên, dịch chiết không cần phải lọc. Nhƣợc điểm: các chất không bền với nhiệt độ sôi sẽ bị phá hủy, không thể khuấy trộn. Hình 1.13. Bộ chiết Soxhlet 1.3.2.4. Kỹ thuật chiết bằng máy Kumagawa Sử dụng máy chiết Kumagawa với thiết bị, nguyên tắc giống nhƣ máy chiết Soxhlet, chỉ khác ở túi đựng bột cây đƣợc đặt gần nguồn nhiệt hơn. Có thể cải biến kỹ thuật này với dụng cụ thủy tinh đơn giản có thể dễ dàng tìm thấy trong phòng thí nghiệm: bình cầu (ngâm bột cây trực tiếp trong bình này) và ống ngƣng hơi. Sau một thời gian đun cần thiết, dung dịch chiết đƣợc rót ra và lọc ngang giấy lọc. Dung môi đƣợc cho vào bình cầu và tiếp tục chiết vài lần nhƣ thế đến khi chiết kiệt.[4] 30 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Hình 1.14. Máy chiết Kumagawa 1.3.2.5. Phương pháp chưng cất Nguyên tắc: Khi đun sôi một hỗn hợp lỏng, chất nào có nhiệt độ thấp hơn sẽ chuyển thành hơi sớm hơn và nhiều hơn. Khi gặp lạnh, hơi sẽ ngành tụ thành dạng lỏng chứa chủ yếu là chất có nhiệt độ sôi thấp hơn. Quá trình đó gọi là sự chƣng cất. Hình 1.15. Bộ lôi cuốn hơi nƣớc Sự lôi cuốn hơi nƣớc thƣờng đƣợc thực hiện trên cây tƣơi mới thu hái về. Mẫu cây đƣợc cắt nhuyễn, đƣợc đặt vào bình cầu, cho nƣớc cất vào bình sao cho phần thể tích mẫu cây và nƣớc chỉ chiếm tối đa 2/3 thể tích bình cầu. Lấp hệ thống và cắm bếp điện đun nóng. 31 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Nƣớc trong bình cầu khi bị đun nóng sẽ bốc thành hơi bay lên, hơi nƣớc bay lên mang theo tinh dầu, hơi này bị ống ngƣng hơi làm lạnh, ngƣng tụ trở lại thể lỏng, rớt xuống ống gạn. Trong ống gạn, dung dịch tách thành 2 lớp gồm lớp nƣớc và lớp tinh [4] dầu. 1.3.2.6. Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn Nguyên tắc: Đối với một chất thông thƣờng, dƣới mỗi điều kiện nhất định chúng sẽ tồn tại ở một trạng thái nào đó trong 3 trạng thái rắn, lỏng hoặc khí. Nếu nén chất khí tới một áp suất đủ cao, chất khí sẽ hóa lỏng. Tuy nhiên, có một giá trị áp suất mà ở đó, nếu nâng dần nhiệt độ lên thì chất lỏng cũng không thể trở về trạng thái khí, mà rơi vào một vùng trạng thái đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới hạn (supercritical). Vật chất ở trạng thái này mang nhiều đặc tính của cả chất khí và chất lỏng, nghĩa là dung môi đó mang tính trung gian giữa khí và lỏng. Hình 1.16. Sơ đồ hệ thống chiết siêu tới hạn Vì vậy khi CO2 đƣợc đƣa lên nhiệt độ, áp suất cao hơn nhiệt độ tới hạn (31 ), áp suất tới hạn (73,8 bar), CO2 sẽ chuyển sang trạng thái siêu tới hạn. Tại trạng thái này, CO2 có khả năng hòa tan rất tốt các đối tƣợng cần tách ra khỏi mẫu ở cả 3 dạng rắn, lỏng, khí. Sau quá trình chiết, để thu hồi sản phẩm chỉ cần giảm áp suất thấp hơn áp suất tới hạn thì CO2 chuyển sang dạng khí ra ngoài còn sản phẩm đƣợc tháo ra ở bình hứng. 32 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trích ly bằng phƣơng pháp CO2 siêu tới hạn cho các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học cao. Kỹ thuật này sử dụng CO2 ở áp suất cao và nhiệt độ vừa phải để trích ly nên các hợp chất có hoạt tính sinh học cao sẽ không bị phân hủy. Sự thay đổi áp suất và nhiệt độ sẽ làm thay đổi tính chọn lọc các chất hòa tan, nhờ đó có thể phân đoạn sản phẩm ly trích ở các nồng độ cao thấp khác nhau. CO2 sau khi trích sẽ hoàn toàn tách ra ở dạng khí sau khi giảm áp nên sản phẩm có thể đƣợc coi là 100% sạch không dung môi độc hại, đem lại giá trị sử dụng và giá trị thƣơng mại cao cho sản phẩm trích ly.[38] 1.3.2.7. Kỹ thuật chiết pha rắn Nguyên tắc: Chiết pha rắn (hay chiết rắn – lỏng) là quá trình phân bố các chất tan giữa hai pha lỏng và rắn. Trong đó, chất tan ban đầu ở trong pha lỏng (nƣớc hoặc dung môi hữu cơ), chất để hấp thụ chất tan ở dạng rắn (dạng hạt, nhỏ và xốp) gọi là pha rắn. Pha rắn (còn đƣợc gọi là pha tĩnh) thƣờng là các hạt silica gel xốp trung tính, hạt oxit nhôm, silica gel trung tính đã đƣợc ankyl hoá nhóm –OH bằng các gốc hydrocarbon mạch thẳng C2, C4, C8, C18, hay nhân phenyl, các polyme hữu cơ, các loại nhựa hoặc than hoạt tính Các hạt này đƣợc nhồi vào cột chiết nhỏ (thƣờng là cột có kích thƣớc 5 x 1 cm) hoặc nén ở dạng đĩa dày 1 – 2 mm với đƣờng kính 3 – 4 cm (đĩa chiết). Hình 1.17. Cột chiết pha rắn 33 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Pha lỏng là pha chứa chất cần phân tích, chúng có thể là dung môi hữu cơ, dung dịch đệm Khi cho pha lỏng đi qua cột chiết (hoặc đĩa chiết), pha rắn tƣơng tác với chất phân tích và giữ một nhóm (hoặc một số nhóm) của chất phân tích lại trên pha rắn, các chất còn lại đi ra khỏi cột cùng với dung môi hòa tan mẫu. Quá trình rửa giải (giải hấp) chất phân tích đƣợc thực hiện bằng một dung môi thích [45] hợp. 1.4. Tổng quan về khả năng kháng oxy hóa 1.4.1. Quá trình và nguyên nhân gây oxy hóa Một gốc tự do có thể đƣợc định nghĩa là một nguyên tử không trọn vẹn, có chứa một điện tử vòng ngoài chƣa ghép đôi (số điện tử là số lẻ) nên không bền vững, phải kết hợp với một nguyên tử khác để có số điện tử chẵn và trở nên bền vững. Sự hiện diện của một electron không kết đôi dẫn đến các tính chất thông thƣờng nhất đƣợc chia sẻ bởi hầu hết các gốc tự do (tạo ra một nguyên tử không trọng vẹn khác, tiếp tục kết hợp với một nguyên tử khác rồi trở thành nguyên tử không trọn vẹn, ...). Nhiều gốc tự do không ổn định kéo theo một điện tử của phân tử khác về phía nó và có phản ứng hóa học rất cao. Chúng có thể cho hoặc nhận một điện tử từ phân tử khác, do đó tạo ra những phân tử bị oxy hóa.[10], [20] Các phân tử bị oxy hóa sẽ mất đi chức năng vốn có của nó, là tác nhân oxy hóa cho các phân tử cạnh nó, tấn công các đại phân tử quan trọng dẫn đến tổn thƣơng tế bào và phá vỡ cân bằng nội môi. Quá trình oxy hóa sẽ tạo ra các thay đổi bất lợi tích tụ dần dần trong cơ thể, biểu hiện dƣới dạng các chứng bệnh cụ thể ở từng độ tuổi nhất định. Ung thƣ và xơ vữa động mạch là hai nguyên nhân chính gây tử vong do các gốc tự do, đƣợc tạo ra bên trong cơ thể trong quá trình trao đổi chất hoặc đƣợc đƣa vào từ bên ngoài do ô nhiễm môi trƣờng, khói thuốc lá, tia bức xạ, virus, vi khuẩn,....[11] Các gốc tự do có hoạt tính mạnh nhƣ hydroxyl (OH), ion sắt 2+ (Fe O), Cu(OH)2, có hoạt tính trung bình và yếu bao gồm peroxyl (ROO), hydrogen [7] H2O2, singlet oxy (O1), nitric oxide (NO),.. 34 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Các gốc tự do tạo ra do quá trình sinh dƣỡng sẽ đƣợc kiểm soát bởi các chất chống oxy hóa – một phân tử ổn định cho đi một điện tử cho gốc tự do và làm chậm hoặc ngăn cản gây hại tế bào.[17] Các hợp chất chống oxy hóa tạo nhƣ glutathione, ubiquinol, vitamin E (αtocopherol), vitamin C (ascorbic acid), βcarotene, enzyme superoxide dismutase, ngoài ra cơ thể còn có các tế bào có khả năng chồng lại các yếu tố oxy hóa ngoại lai nhƣ neutrophill, monocyte, Bcell...[21] 1.4.2. Khả năng kháng oxy hóa của các hợp chất trong thực vật Chất chống oxy hóa đƣợc sử dụng rộng rãi trong thực phẩm và y dƣợc. Nhiều hợp chất chống oxy hóa tự nhiên trong thực vật có tiềm năng đã đƣợc nghiên cứu nhƣ cà chua, rau bina, các loại quả mộng, cam, quýt, olive, trà,... vì chúng có chứa các hợp chất phenolic.[7], [24] Các hydrogen phenolic (AH) thể hiện khả năng kháng oxy hóa mạnh. Chúng tác động trực tiếp lên các gốc tự do đƣợc sinh ra trong cơ thể, đƣa các gốc tự do về trạng thái bền, làm cho quá trình oxy hóa bị loại bỏ thông qua các phản ứng sau: RO2* + AH  ROOH + A* (1) RO* + AH  ROH + A* (2) RO2* + A*  ROOA (3) RO* + A*  ROA (4) Các chất A* tạo ra trong các phản ứng (1) (2) khác với các gốc RO2*, RO* vì chúng không có khả năng lấy các ion H+ từ các acid béo không no hay các hợp chất trong cơ thể nên không tạo ra các gốc tự do mới để tiếp tục khởi động quá trình oxy hóa. Các sản phẩm tạo ra trong phản ứng (3) (4) là những sản phẩm khá bền và kết quả là chuỗi phản ứng của các gốc tự do sẽ kết thúc sớm hơn.[7] 1.5. Cơ sở khoa học của khả năng kháng khuẩn của các hợp chất trong thực vật 1.5.1. Định nghĩa 35 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật (kháng khuẩn thực vật) là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có khả năng tiêu diệt hay kìm hãm, ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng khuẩn thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở một nồng độ thường rất nhỏ.[11] 1.5.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất trong thực vật Hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật (kháng khuẩn thực vật) là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có khả năng tiêu diệt hay kìm hãm, ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng khuẩn thƣờng có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở một nồng độ thƣờng rất nhỏ. Hình 1.18. Cơ chế kháng khuẩn Cao chiết từ các loại thực vật có thể biểu hiện hoạt tính kháng lại các chủng vi khuẩn ở các mức độ khác nhau nhờ sự can thiệp vào các lớp đôi phospholipid của màng tế bào gây hậu quả làm gia tăng độ thấm, tổn hại các thành phần tế bào, phá hủy các enzyme tham gia vào việc hình thành năng lƣợng tế bào, tổng hợp các thành phần cấu trúc, và đồng thời phá hủy hoặc làm bất hoạt các vật liệu di truyền. Nói chung, cơ chế tác động của hợp chất kháng khuẩn tự nhiên có liên quan đến sự rối loạn, phá vỡ màng tế bào chất, làm gián đoạn mất ổn định lực chuyển động của proton (PMF), dòng điện tử, sự vận chuyển tích cực, và đông tụ các thành phần của tế bào (Kotzekidou và ctv, 2008) cụ thể ở bảng 1.3. 36 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Bảng 1.3. Những nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn (Cowan, 1990) Nhóm Phân Ví dụ Cơ chế Phenolnhóm Catechol Phá vỡ màng sinh chất đơn Epicatechin Phá vỡ vách tế bào Phenolic Cinnamic acid  Liên kết bám dính, tạo phức hợp acid Quinone Hypericin với thành tế bào, làm bất hoạt Flavonoid Chrysin enzymeLiên kết bám dính  Tạo phức hợp với thành tế bào Khử hoạt tính enzyme Phenolic Flavone Abyssinone Ức chế phiên mã ngƣợc HIV Flavonol  Bám dính Protein Bám dính Adhesin Ức chế enzyme Phá vỡ màng sinh chất Tạo phức hợp với thành tế bào Tannin Ellagitannin Phá vỡ vách tế bào Tạo phức kim loại-ion Coumarin Warfarin Tƣơng tác với DNA nhân thực (hoạt tính kháng vius) Terpenoid  Capsaicin Phá vỡ vách tế bào Tinh dầu Alkaloid  Berberine Xen vào thành tế bào hoặc DNA Piperine  Mannose Khóa sự kết hợp của virus hoặc Lectin (agglutinin) hấp phụ Polypeptide Falxatin Hình thành cầu Disulfide  8s-heptadeca-  2(Z),9(Z)- Polyacetylen diene-4,6- diyne-1,8-diol 37 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Các hợp chất flavonoid tổng hợp bởi cây trồng để phản ứng lại sự nhiễm khuẩn và có tác dụng kháng khuẩn đối với nhiều loài vi sinh vật. Hoạt tính kháng khuẩn của flavonoid là do khả năng tạo phức với các protein tan ngoại bào, tạo phức với thành tế bào vi khuẩn, và ức chế transpeptidase làm cho mucopeptide – yếu tố đảm bảo cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp đƣợc. Các flavonoid càng ƣa béo càng có khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật. Các phenolics là làm thay đổi màng tế bào chất, gián đoạn lực đẩy proton và làm kết tủa các chất trong tế bào. Tầm quan trọng của sự có mặt nhóm hydroxyl trong các hợp chất phenolic đã đƣợc chứng minh, phenolics tác động lên các enzyme nhƣ ATPases nằm trong màng tế bào chất và đƣợc bao quanh bởi các phân tử lipid. Các phân tử lipophilic hydrocacbon có thể tích tụ trong lớp lipid kép và làm ảnh hƣởng đến tƣơng tác lipid – protein; ngoài ra có thể có sự tƣơng tác trực tiếp của các hợp chất lipophilic với phần kỵ nƣớc của protein (Burt’s, 2004).[12], [16] 1.6. Các chủng vi sinh vật thí nghiệm 1.6.1. Salmonella Bảng 1.4. Phân loại khoa học chủng vi khuẩn Salmonella Vực (domain) Bacteria Liên giới (superregnum) Bacteria Giới (regnum) Bacteria Ngành (phylum) Proteobacteria Lớp (class) Gammaproteobacteria Bộ (ordo) Enterobacteriales Họ (familia) Enterobacteriaceae Chi (genus) Salmonnella 38 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Hình 1.19. Vi khuẩn Salmonella Samonella là một ví dụ kinh điển về ngộ độc thực phẩm. Đây là một loại trực khuẩn gram âm, kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử, di động bằng tiên mao. Salmonella không lên men lactose (trừ S. arizona) và sucrose nhƣng lên men đƣợc dulcitol, mannitol và glocose. Chúng kém chịu nhiệt nhƣng chịu đƣợc một số hóa chất: brilliant green, sodium lauryl sulfate, selenite Để có thể gây ngộ độc, số lƣợng Salmonella phải lên đến cả triệu tế bào trong 1 g thực phẩm. Có 3 dạng bệnh thực sự do Salmonella gây ra: sốt thƣơng hàn do S.typhi, nhiễm trùng máu do S.cholera-suis, rối loại tiêu hóa do S.typhirium và S.enteritidis. Các triệu chứng do Salmonella gây ra chủ yếu là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn xuất hiện sau 12 – 36 giờ sau khi tiêu thụ thực phẩm nhiễm Salmonella. Các triệu chứng thƣờng kéo dài 2 – 7 ngày.[3] 1.6.2. Staphylococcus aureus Bảng 1.5. Phân loại khoc học chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus Giới (regnum) Bacteria Ngành (phylum) Firmicutes Lớp (class) Bacilli Bộ (ordo) Bacillales Họ (familia) Staphylococcusaceae Chi (genus) Staphylococcus 39 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Hình 1.20. Vi khuẩn Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus là cầu khuẩn gram dƣơng, hiếu khí, thƣờng kết dạng chùm có mặt phổ biến ở khắp nơi thƣờng thấy trên da, xoang mũi và tóc Staphylococcus aureus sản sinh ra một loại độc tố đƣờng ruột enterotoxin bền nhiệt, không bị phân huỷ ở 1000C trong 30 phút. Khi ăn phải thực phẩm có chứa độc tố này, sau 4 – 6 giờ ủ bệnh sẽ bộc phát nên các triệu chứng lâm sàng nhƣ tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 – 8 giờ.[3] Staphylococcus aureus cho phản ứng đông huyết tƣơng dƣơng tính do chúng tiết ra enzyme coagulase. Đây đƣợc xem là tính chất đặc trƣng của S. aureus, là tiêu chuẩn để phân biệt Staphylococcus aureus với các tụ cầu khác. Có hai dạng coagulase: coagulase cố định (bound coagulase) gắn vào thành tế bào và coagulase tự do (free coagulase) đƣợc phóng thích khỏi thành tế bào. Ngoài ra, chúng còn cho phản ứng DNAse, phosphatase dƣơng tính, có khả năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng Staphylococcus aureus đều nhạy với Novobicine, có khả năng tăng trƣởng trong môi trƣờng chứa đến 15% muối NaCl. 1.6.3. Escherichia Coli Bảng 1.6. Phân loại khoa học chủng vi khuẩn E.Coli 40 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Vực (domain) Bacteria Ngành (phylum) Proteobacteria Lớp (class) Gammaproteobacteria Bộ (ordo) Enterobacteriales Họ (familia) Enterobacteriaceae Chi (genus) Escherichia Loài (species) E. Coli Hình 1.21. Vi khuẩn Escherichia Coli E.Coli là trực khuẩn gram âm, kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử, khá phổ biến trong tự nhiên đặc biệt trong đƣờng tiêu hóa của con ngƣời và động vật. Hầu hết các dòng E.Coli tồn tại một cách tự nhiên và không gây hại trong đƣờng tiêu hóa, chúng còn đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định đƣờng tiêu hóa. Tuy nhiên, tồn tại ít nhất 4 dòng sau đây có thể gây bệnh cho ngƣời và cho động vật: - Enteropathogenic E.Coli (EPEC) - Enterotocigenic E.Coli (ETEC) - Enteroinvasive E.Coli (EIEC) - Enterohaemorrhagic E.Coli (EHEC) hoặc Verocytoxin E.Coli (VTEC) hay E.Coli O157:H7 41 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Nhƣ vậy, có thể đƣợc phân lập đƣợc dễ dàng ở khắp nơi trong môi trƣờng sống, phân hoặc nƣớc thải. Vi sinh vật này có thể tồn tại rất lâu trong môi trƣờng. Với sự phân bố rộng rãi nhƣ vậy nên E.Coli cũng đƣợc dễ dàng phân lập từ các mẫu thực phẩm bị nhiễm nguyên liệu hay thông qua nguồn nƣớc. Khi các dòng E.coli gây bệnh xâm nhập vào con ngƣời qua con đƣờng tiêu hóa gây ra các bệnh rối loạn đƣờng tiêu hóa, các biểu hiện lâm sàn có thể biểu hiện từ nhẹ đến rất nặng, có thể đe dọa mạng sống của con ngƣời tùy thuộc vào liều lƣợng, dòng gây nhiễm và mức độ đáp ứng của từng ngƣời.[3] 1.6.4. Bacillus cereus Bảng 1.7. Phân loại khoa học chủng vi khuẩn Bacillus cereus Giới (regnum) Bacteria Ngành (phylum) Firmicutes Lớp (class) Bacilli Bộ (ordo) Bacillales Họ (familia) Bacillaceae Chi (genus) Bacillus Loài (species) B. cereus Hình 1.22. Vi khuẩn Bacillus cereus 42 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Bacillus cereus là trực khuẩn gram dƣơng, sinh bào tử, là vi sinh vật hiếu khí tuyệt đối, tăng trƣởng đƣợc trong nhiệt độ từ 5 - 50 , tối ƣu ở nhiệt độ 35 - 40 , pH dao động từ 4,5 – 9,3, dễ sinh bào tử và bảo tử phát triển rất dễ dàng. Bacillus cereus tiết ra 2 loại độc tố chính là diarhaea toxin gây tiêu chảy và emetic toxin gây nôn mửa. Các triệu chứng ngộ độc do bacillus cereus gây ra là đau bụng, tiêu chảy, không sốt bắt đầu khoảng 4 – 16 giờ sau khi tiêu thụ thực phẩm và kéo dài trong 12 – 24 giờ.[3] 43 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 4 năm 2017 đến tháng 7 năm 2017 tại phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh. 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Nguồn mẫu Quả mồng tơi chín đƣợc hái tại số 13, đƣờng 642, ấp Phƣớc Hƣng, xã Phƣớc Thạnh, huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh. Quả mồng tơi chín đƣợc hái lúc 9  11 giờ sáng, chọn quả chín già có lớp vỏ ngoài căng bóng, có màu tím đen đặc trƣng. Hình 2.23. Quả mồng tơi chín 2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị Vi khuẩn chỉ thị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là 4 chủng vi khuẩn đƣợc cung cấp bởi Viện Sinh học Nhiệt đới TP. Hồ Chí Minh bao gồm: - Vi khuẩn Salmonella - Vi khuẩn Enterotoxigenic E. Coli - Vi khuẩn Staphylococcus arueus - Vi khuẩn Bacillus cereus 2.3. Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 44 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Dụng cụ Hóa chất - Bể điều nhiệt - Thuốc thử DPPH (1,1-diphenyl-2- - Bếp đun cách thủy picrylhydrazyl) (Đức) - Bình hút ẩm - Thuốc thử Foline – Ciocalteu - Cân phân tích (3H2O.P2O5.13WO3.5MoO3.10H2O) - Cối giã - Acid gallic (C6H2(OH)3COOH) (Trung - Cốc thủy tinh Quốc) - Máy quang phổ UV – Vis - Dung dịch Na2CO3 bão hòa 2000 - Dung dịch HCl 1N - Máy lắc - Etanol 30%, 50%, 70%, nƣớc cất - Máy ly tâm - Methanol - Tủ ủ 37 - Vitamin C - Tủ sấy 50 - DMSO (dimethylsulfoxid) (Trung Quốc) - Pepton - Meat extract - NaCl - Môi trƣờng NA (Nutrient Agar) 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp xác định độ ẩm của mẫu Nguyên tắc: Dùng nhiệt làm bay hơi hết hơi nƣớc trong mẫu cho đến khi thu đƣợc khối lƣợng không đổi. Cân trọng lƣợng mẫu trƣớc và sau khi sấy khô, từ sự hao hụt khối lƣợng tính ra phần trăm ẩm có trong mẫu. Công thức xác định độ ẩm: Độ ẩm (%) = Trong đó: 45 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP M : khối lƣợng cốc (g) M1 : khối lƣợng cốc và mẫu trƣớc khi sấy (g) M2 : khối lƣợng cốc và mẫu sau khi sấy (g) 2.4.2. Phương pháp xác định tỉ lệ trọng lượng của mẫu Nguyên tắc: Xác định tỉ lệ trọng lƣợng phần sử dụng so với tổng trọng lƣợng mồng tơi. Công thức xác định tỉ lệ trong lƣợng: Phần sử dụng (%) = Trong đó: M1 : tổng trọng lƣợng (g) M2 : trọng lƣợng phần sử dụng (g) 2.4.3. Phương pháp tách chiết và thu nhận cao chiết Mẫu thực vật được tách chiết bởi nhiều loại dung môi khác nhau bằng phương pháp chiết ngâm ở nhiệt độ thường và thu nhận cao chiết bằng cách cho bay hơi, loại bỏ lượng dung môi của dịch chiết bằng các thiết bị cô thích hợp. Nguyên tắc phương pháp chiết ngâm: Mẫu thực vật được ngâm trong dung môi (w/v) trong khoảng thời gian nhất định để các chất tan trong mẫu hòa tan vào dung môi, đây là quá trình di chuyển vật chất trong hệ hai pha rắn – lỏng gồm 3 giai đoạn: thâm nhập dung môi vào mẫu, hoà tan các chất trong mẫu, khuếch tán các chất tan. Tiến hành: Ngâm một lượng bột mẫu vào dung môi (tỷ lệ 1:1 (w/v)) trong một bình kín để ở nhiệt độ phòng. Mẫu được ngâm và lắc trong thời gian xác định, sau đó đem đi lọc, ly tâm, ép bã lấy dịch chiết. Phần dịch chiết được cô đặc, thu hồi cao bằng phương pháp cô cách thủy. Các loại cao thu hồi được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4C. 2.4.4. Phương pháp định lượng polyphenol tổng số 46 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Nguyên tắc: Hàm lƣợng phenolic đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Folin  Ciocalteau. Đây là phƣơng pháp đo màu dựa vào phản ứng oxy hóa khử giữa các hợp chất polyphenol với thuốc thử Folin  Ciocalteau (hỗn hợp của phosphomolybdat và phosphotungstat). Ở môi trƣờng kiềm, thuốc thử sẽ oxy hóa các hợp chất polyphenol và sinh ra các acid heteroply có màu xanh lam có độ hấp thu ánh sáng ở bƣớc sóng  = 765 nm. Tổng hàm lƣợng polyphenol sẽ đƣợc tính bằng cách quy về lƣợng tƣơng đƣơng với chất chuẩn acid gallic, kết quả đƣợc biểu diễn bằng số mg acid gallic tƣơng đƣơng trên 1g mẫu [22] khô (mg GAE/g db). Công thức tính hàm lƣợng polyphenol tổng số: P = Trong đó: P : hàm lƣợng polyphenol (mg GAE/g db) y : nồng độ polyphenol trong mẫu xác định từ đƣờng chuẩn (mg/ml) V : thể tích dịch chiết sau khi trích ly (ml) m : khối lƣợng mẫu sử dụng cho quá trình tách chiết (g) 2.4.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa trên mô hình DPPH Khả năng kháng oxy hóa đƣợc xác định bằng phƣơng pháp ức chế gốc tự do DPPH (Michael Antolovich, 2002). DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) là gốc tự do có màu tím giống màu của KMnO4, không tan trong nƣớc, nhƣng tan trong ethanol, methanol. Dung dịch DPPH có độ hấp thu cực đại tại bƣớc sóng  = 517 nm, và sản phẩm khử của nó là 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazin (DPPH-H). DPPH là hợp chất có màu tím đƣợc phát hiện ở bƣớc sóng 517 nm. Cơ chế của hoạt động quét gốc tự do DPPH là sự ghép đôi hydro và đình chỉ quá trình oxy hóa bằng sự chuyển các gốc tự do sang trạng thái ổn định hơn.[4] Khi các điện tử lẻ của các 47 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP gốc tự do DPPH kết hợp với hydro từ chất chống oxy hóa thì sẽ hình thành nên DPPH– H lúc này màu sắc chuyển từ màu tím sang màu vàng. Sự biến đổi màu này tƣơng ứng với lƣợng electron kết hợp với DPPH (Prakash et al., 2000).[1] Nhƣ vậy, khi có mặt của chất chống oxy hóa nó sẽ khử gốc tự do DPPH và làm cho dung dịch bị giảm màu sắc, do đó độ hấp thụ của dung dịch sẽ giảm đi.[4] Công thức xác định phần trăm ức chế: %I = Trong đó: ADPPH : giá trị OD517nm của dung dịch DPPH ban đầu pha trong methanol (ADPPH = 0,708) ATN : giá trị OD517nm của dung dịch chuẩn (hoặc dung dịch mẫu). Đánh giá khả năng kháng oxy hóa thông qua giá trị IC50. IC50 là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát. IC50 đƣợc định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do. Mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 càng thấp. Để xác định giá trị IC50, tiến hành khảo sát hoạt tính của mẫu ở nhiều nồng độ khác nhau. Đối với những mẫu có hoạt tính biến thiên tuyến tính theo nồng độ, ta dựng đƣờng thẳng y = ax + b qua tất cả các điểm (với y là phần trăm ức chế, x là nồng độ). Đối với những mẫu có hoạt tính phi tuyến tính theo nồng độ, một cách gần đúng, chúng ta chọn 2 nồng độ ức chế trên và dƣới 50% và cũng tiến hành vẽ đƣờng thẳng y = ax + b. Sau khi dựng đƣợc đƣờng thẳng y = ax + b với 2 hệ số a và b đã biết. Thay y = 50% vào phƣơng trình ta sẽ tính đƣợc giá trị x, đó chính là giá trị IC50. Giá trị IC50 đƣợc tính dựa trên đƣờng chuẩn y = ax + b theo công thức: x = 2.4.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bằng kỹ thuật đục lỗ thạch 48 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Nguyên tắc: Dịch cao chiết ở các lỗ sẽ khuếch tán vào môi trƣờng thạch và tác động lên các chủng khuẩn chỉ thị. Nếu cao chiết có khả năng ức chế các chủng vi khuẩn thì sẽ xuất hiện quầng trong bao quanh các lỗ thạch (vòng ức chế). Từ đó, đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết bằng cách đo đƣờng kính vòng ức chế (mm). Tiến hành: - Các chủng vi khuẩn được hoạt hóa từ ống giống gốc trong môi trường lỏng NB, lắc qua đêm. Cấy trang 100 µl dịch khuẩn (mật độ tế bào tương đương 106 cfu/ml) lên bề mặt đĩa petri có chứa môi trường NA đặc và tiến hành đục lỗ với đường kính d = 6 mm sao cho mỗi giếng cách nhau khoảng 2-3 cm. - Chuẩn bị dịch cao chiết bằng cách hòa tan lượng cao chiết trong Dimethyl Sulfoxide (DMSO) 10% theo nồng độ yêu cầu 100 mg/ml. Bổ sung 100 µl dịch cao chiết vào các lỗ đã đục trên đĩa petri và giữ các đĩa ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ để dịch cao được khuyếch tán đều vào môi trường thạch. Sau đó, ủ các đĩa vào tủ ấm 37 trong 24 giờ và tiến hành đọc kết bằng cách đo giá trị đường kính vòng ức chế (mm) trên đĩa thạch. Đối chứng là dung dịch kháng sinh Amoxicillin. Hình 24.2. Kỹ thuật đục lỗ thạch có bổ sung kháng sinh đối chứng 49 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.4.7. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu thực nghiệm đƣợc xử lí thống kê theo phƣơng pháp thống kê sinh học, sử dụng công cụ phân tích số liệu (data analysis) của Microsofl Excel 2010. Dùng phần mềm SAS để đánh giá kết quả, so sánh giá trị trung bình giữa các thí nghiệm. 2.4.8. Phương pháp so sánh, đối chiếu Từ kết quả thực nghiệm đạt đƣợc, tiến hành so sánh với cơ sở khoa học liên quan cũng nhƣ đối chiếu với kết quả của các công trình nghiên cứu khác nhằm đƣa ra kết luận của đề tài. 2.5. Bố trí thí nghiệm Mẫu quả mồng tơi Xử lý mẫu Xác định độ ẩm Trích ly và thu nhận Xác định tỉ lệ trọng lƣợng cao chiết Cao chiết quả mồng tơi của các loại dung môi khác nhau Định lƣợng Đánh giá hoạt tính Đánh giá hoạt tính polyphenol tổng số kháng oxy hóa kháng khuẩn Sơ đồ 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 2.5.1. Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm của mẫu quả mồng tơi Sấy chén sứ sạch ở 105 cho đến khối lƣợng không đổi. Để nguội trong bình hút ẩm và cân khối lƣợng chính xác đến 0,0001g. 50 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Cho vào cốc khoảng 5g mẫu. Cân cốc chứa mẫu bằng cân phân tích với độ chính xác nhƣ trên. Cho cốc chứa mẫu vào tủ sấy ở 105 , dùng nhiệt độ cao để tách ẩm ra khỏi nguyên liệu mẫu, sấy cho đến khi khối lƣợng không đổi, thƣờng tối thiểu là 6 giờ. Sau khi sấy, làm nguội trong bình hút ẩm 15...ất thu hồi cũng nhƣ các hoạt tính sinh học của cao chiết. Nghiên cứu quy trình tinh sạch và định danh các hợp chất trong quả mồng tơi chín nhƣ anthocyanin và một số các hợp chất khác. Nghiên cứu khả năng kháng nấm từ quả mồng tơi chín. 71 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu Tiếng Việt [1] Đái Thị Xuân Trang và cộng sự (2012) – Khảo sát hiệu quả hạ đường huyết và chống oxy hóa của cao chiết cây nhàu (Morinda Citrifolia L.) ở chuột bệnh tiểu đường. Tạp chí Khoa học 2012:23b 115-124. [2] Huỳnh Thị Kim Cúc, Phạm Châu Quỳnh, Nguyễn Thị Lan, và cộng sự (2004), “Xác định hàm lượng anthocyanin trong một số nguyên liệu rau quả bằng phương pháp pH vi sai”, Tạp Chí Khoa Học và Công Nghệ, Đại Học Đà Nẵng, 3 (7), 47- 54. [3] Phạm Minh Nhựt (2014). Các phương pháp phân tích vi sinh, Trƣờng Đại học Công nghệ TP. HCM, TP Hồ Chí Minh. [4] Nguyễn Phi Kim Phụng (2007). Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia TP.HCM, TP. Hồ Chí Minh. [5] Nguyễn Tiến Toàn, Nguyễn Xuân Duy (2014) – Hoạt tính chống oxy hóa và ức chế enzyme polyphenoloxydase của một số loài thực vật ăn được ở Việt Nam. Tạp chí khoa học và phát triển 2013, tập số 11, số 3:364-372. [6] Nguyễn Thị Hoàng Lan, Bùi Quang Thuật, Lê Danh Tuyên, Nguyễn Thị Ngọc Duyên (2015) – Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu Tía tô. Tạp chí khoa học và phát triển 2015, tập số 13, số 2:245-240. [7] Trần Thị Kim Ngân (2015). “Nghiên cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy hóa của lá sen nelumbo nucifera”, Đồ án tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Công nghệ TP. HCM, TP. Hồ Chí Minh. [8] Trần Tiến Trung (2015). “Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mần từ gạo nương đỏ Tây Nguyên ở hai điều kiện ủ khác nhau”, Đồ án tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Công nghệ TP.HCM, TP. Hồ Chí Minh.  Tài liệu Tiếng Anh 72 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [9] A. C. Ovando, M. L. Pacheco-Hernández, M. E. Páez-Hernández, et al. (2009),“Chemical studies of anthocyanins: A review”, Food Chemistry, 113,859- 871. [10] A. Dreiseitel, P. S. G. Korte, A. Oehme, et al. (2009), “Berry anthocyanins and their aglycons inhibit monoamine oxidases A and B”, Pharmacol Res, 59 (5), 306- 311. [11] Asolini FC, Tedesco AM, Ferraz C, Alencar SM, Carpes ST (2006). Antioxidant and antibacterial activities of phenolic compounds in extracts of plants used as tea. Braz J Food Technol. 2006;9(6):209-15. [12] Brown JE, Rice-Evan CA. Luteolin-rich Artichoke extract protects low density lipoprotein from oxidation in vitro. Free Radic Res. 1998;29:247–255. [13] C. F. Timberlake, P. Bridle (1982), “Distribution of Anthocyanins in Food Plants”, In Pericles Markakis, editor, Anthocyanins as Food Colors, Academic Press. [14] Cheeseman KH, Slater TF. An introduction to free radicals chemistry. Br Med Bull. 1993;49:481–93. [15] Ebadi M. Antioxidants and free radicals in health and disease: An introduction to reactive oxygen species, oxidative injury, neuronal cell death and therapy in neurodegenerative diseases. Arizona: Prominent Press; 2001. [16] Essential oils: their antibacterial properties and potential applications foods a review, Int. J. Food Microbiol. 94, p.223-253. [17] Furuta S, Nishiba Y, Suda I. Fluorometric assay for screening antioxidative activities of vegetables. J Food Sci. 1997;62:526–8. [18] G. C. Cretu, G. E. Morlock (1 March 2014), “Analysis of anthocyanins in powdered berry extracts by planar chromatography linked with bioassay and mass spectrometry”, Food Chemistry, 146,104-112. 73 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [19] Ghosh, Dilip, and Tetsuya Konishi. "Anthocyanins and anthocyanin-rich extracts: role in diabetes and eye function." Asia Pacific journal of clinical nutrition 16.2 (2007): 200-208. [20] Griffin Shane G s. Grant ie, Julie L Markham and David The role N. (1999), of structure and molecular properties of terpenoids in determining their antimicrobial activity, Flavour Fragr, J., 14.322-332 [21] Halliwell B. How to characterize an antioxidant- An update. Biochem Soc Symp. 1995;61:73–101. [22] Lin JK, Lin CH, Ling YC, Lin-Shian SY, Juan IM. Survey of catechins, gallic acid and methylxantines in green, oolong, puerh and black teas. J Agric Food Chem. 1998;46:3635–42. [23] P. Bridle, C. F. Timberlake (1996), “Anthocyanins as natural food colors-selected aspects”, Food Chemistry, 58,103-109. [24] Rock CL, Jacob RA, Bowen PE. Update o biological characteristics of the antioxidant micronutrients- Vitamin C, Vitamin E and the carotenoids. J Am Diet Assoc. 1996;96:693–702. [25] Shi HL, Noguchi N, Niki N. Comparative study on dynamics of antioxidative action of α- tocopheryl hydroquinone, ubiquinol and α- tocopherol, against lipid peroxidation. Free Radic Biol Med. 1999;27:334–46. [26] Singleton VL, Orthofer R, Lamuela-Raventos RM. (1999) Analysis of total phenol and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent. Method Enzymol 299: 152-78. [27] T. Fossen, M. Andersen (2000), “Anthocyanins from tubers and shoots of the purple potato, Solanum tuberosum”, J. Ilort Sci. Biotech, 75,360-363. [28] Wang H, Cao G, Prior RL. Total antioxidant capacity of fruits. J Agric Food Chem. 1996;44:701–5. 74 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [29] X. Wu (2005), “Identification and characterization of anthocyanins by HPLCƢ ESI-MS/MS in common foods in the United States: Vegetables, nuts, and grains”, J Agric Food Chem, 53 (8), 3101-3113. [30] Z. Xu, L. R. Howard (2012), “Analysis Methods of Anthocvanins”, Analysis of Antioxidant-RichPhytochemicals, 5,945-978.  Tài liệu Internet [31] [32] https://en.wikipedia.org/wiki/Basella_alba [33] thung-xop.html [34] [35] hoat- tinh-sinh-hoc-cac-phuong-phap-chiet-suat-va-ung-dung.htm?page=7 [36] https://vi.scribd.com/document/329935999/T%E1%BB%95ng-Quan- V%E1%BB%81-Chi%E1%BA%BFt-Xu%E1%BA%A5t- D%C6%B0%E1%BB%A3c-Li%E1%BB%87u [37] https://www.2lua.vn/article/cach-trong-rau-mong-toi-hieu-qua-2198.html [38] co2- sieu-toi-han-nang-gia-tri-qua-gac.html [39] [40] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4519477/ [41] [42] https://sites.google.com/site/raurungvietnam/rau-day-leo/rau-mong-toi [43] 20141124153524856.htm 75 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [44] /brvt/extAssetPublisher/content/1558018/san-xuat-rau-mong-toi-theo-chuan- vietgap-can-khuyen-cao-mo-rong [45] ran-566/ [46] 76 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘ ẨM VÀ PHẦN QUẢ MỒNG TƠI SỬ DỤNG. A.1. Kết quả M (g) M1 (g) M2 (g) Độ ẩm (%) Độ lệch chuẩn 1 19,2250 24,2370 19,9009 86,51 2 34,2040 39,2160 34,9048 86,02 0,29 3 20,3600 25,4260 21,0740 85,91 Tỉ lệ trong lƣợng M1 (g) M2 (g) Độ lệch chuẩn (%) 1 40,2770 16,0180 39,77 0,53 2 39,7260 16,2218 40,83 A.2. Hình ảnh 1 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HIỆU SUẤT THU HỒI CAO CHIẾT QUẢ MỒNG TƠI CHÍN BASELLA ALBA L. TỪ CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU. B.1. Kết quả đánh giá Hiệu suất (%) Ethanol 30% Ethanol 50% Ethanol 70% Nƣớc cất 1 2,486 2,423 2,679 2,588 2 2,161 2,200 2,320 2,146 B.2. Kết quả xử lý số liệu HIEU SUAT THU HOI DICH CHIET 01:15 Friday, July 7, 2017 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values dungmoi 4 m30 m50 m70 mnuoc Number of Observations Read 8 Number of Observations Used 8 HIEU SUAT THU HOI DICH CHIET 01:15 Friday, July 7, 2017 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: HS Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 0.04449637 0.01483212 0.26 0.8499 Error 4 0.22623950 0.05655988 Corrected Total 7 0.27073587 R-Square Coeff Var Root MSE HS Mean 0.164353 10.01203 0.237823 2.375375 2 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F dungmoi 3 0.04449637 0.01483212 0.26 0.8499 HIEU SUAT THU HOI DICH CHIET 01:15 Friday, July 7, 2017 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for HS NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 0.05656 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 0.6603 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N dungmoi A 2.4995 2 m70 A A 2.3670 2 mnuoc A A 2.3235 2 m30 A A 2.3115 2 m50 HIEU SUAT THU HOI DICH CHIET 01:15 Friday, July 7, 2017 4 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for HS NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. 3 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 0.05656 Critical Value of t 4.60409 Least Significant Difference 1.095 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N dungmoi A 2.4995 2 m70 A A 2.3670 2 mnuoc A A 2.3235 2 m30 A A 2.3115 2 m50 PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA DUNG MÔI ĐẾN HÀM LƢỢNG POLYPHENOL TỔNG C.1. Hàm lƣơng polyphenol tổng Loại cao OD P mg GAE/ Độ lệch chiết gdb chuẩn Ethanol 0,310 108,11 30% 0,302 104,63 7,87 0,360 129,85 Ethanol 0,292 87,04 50% 0,261 75,34 3,51 0,284 84,02 Ethanol 0,284 87,06 70% 0,301 93,71 2,89 0,276 83,92 Nƣớc cất 0,302 94,10 0,299 92,93 0,79 0,295 91,36 C.2. Kết quả xử lý số liệu HAM LUONG POLYPHENOL TONG SO 1 21:46 Thursday, July 6, 2017 4 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values dungmoi 4 m30 m50 m70 mnuoc Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12 HAM LUONG POLYPHENOL TONG SO 2 21:46 Thursday, July 6, 2017 The ANOVA Procedure Dependent Variable: PP Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 1749.011692 583.003897 9.31 0.0055 Error 8 501.135600 62.641950 Corrected Total 11 2250.147292 R-Square Coeff Var Root MSE PP Mean 0.777288 8.389587 7.914667 94.33917 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F dungmoi 3 1749.011692 583.003897 9.31 0.0055 HAM LUONG POLYPHENOL TONG SO 3 21:46 Thursday, July 6, 2017 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for PP 5 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 62.64195 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 14.902 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N dungmoi A 114.197 3 m30 B 92.797 3 mnuoc B B 88.230 3 m70 B B 82.133 3 m50 HAM LUONG POLYPHENOL TONG SO 4 21:46 Thursday, July 6, 2017 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for PP NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 62.64195 Critical Value of t 3.35539 Least Significant Difference 21.684 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N dungmoi 6 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP A 114.197 3 m30 A B A 92.797 3 mnuoc B B 88.230 3 m70 B B 82.133 3 m50 PHỤ LỤC D: KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA DUNG MÔI ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA D.1. Khả năng kháng oxy hóa OD % I Độ lệch chuẩn 0,119 0,115 83,19 83,76 0,29 0,272 0,229 61,68 67,66 3,04 Ethanol 30% 0,330 0,345 53,39 51,27 1,06 0,440 0,439 37,85 37,99 0,07 0,497 0,511 29,80 27,82 0,99 0,132 0,174 81,36 75,42 2,97 0,236 0,261 61,14 58,66 0,72 Ethanol 50% 0,393 0,331 44,49 53,25 4,38 0,473 0,461 33,19 34,89 0,85 0,521 0,529 26,41 25,28 0,57 0,103 0,07 85,45 90,11 2,33 0,151 0,138 68,67 73,15 1,33 Ethanol 70% 0,288 0,297 59,32 58,05 0,64 0,365 0,352 42,44 49,28 1,99 0,483 0,472 38,37 34,33 1,17 0,161 0,123 77,26 82,63 2,69 0,253 0,259 64,27 63,42 0,43 Nƣớc cất 0,314 0,355 55,65 49,86 2,90 0,399 0,40 43,75 43,50 0,13 0,471 0,489 33,47 36,93 0,99 0,03 0,043 95,76 93,93 0,53 0,253 0,235 64,27 66,81 0,88 Vitamin C 0,393 0,369 44,49 47,88 1,01 0,495 0,536 30,08 24,29 1,79 0,603 0,591 14,89 16,57 0,43 7 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP D.2. Kết quả xử lý xố liệu VITAMIN C 01:18 Friday, July 9, 2017 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values nongdo 5 12.5 125 25 50 75 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 VITAMIN C 01:18 Friday, July 9, 2017 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: II Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 12023.18993 3005.79748 891.80 <.0001 Error 10 33.70487 3.37049 Corrected Total 14 12056.89480 R-Square Coeff Var Root MSE II Mean 0.997205 3.703628 1.835889 49.57000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F nongdo 4 12023.18993 3005.79748 891.80 <.0001 VITAMIN C 01:18 Friday, July 9, 2017 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for II 8 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 3.370487 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 3.34 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 94.917 3 125 B 65.067 3 75 C 45.923 3 50 D 26.550 3 25 E 15.393 3 12.5 VITAMIN C 01:18 Friday, July 9, 2017 4 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for II NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 3.370487 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 4.7507 Means with the same letter are not significantly different. 9 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP t Grouping Mean N nongdo A 94.917 3 125 B 65.067 3 75 C 45.923 3 50 D 26.550 3 25 E 15.393 3 12.5 DUNG MOI ETHANOL 30 01:59 Friday, July 9, 2017 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values nongdo 5 12.5 125 25 50 75 Number of Observations Read 10 Number of Observations Used 10 DUNG MOI ETHANOL 30 01:59 Friday, July 9, 2017 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: II Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 3751.665240 937.916310 205.12 <.0001 Error 5 22.862850 4.572570 Corrected Total 9 3774.528090 R-Square Coeff Var Root MSE II Mean 0.993943 4.002090 2.138357 53.43100 10 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F nongdo 4 3751.665240 937.916310 205.12 <.0001 DUNG MOI ETHANOL 30 01:59 Friday, July 9, 2017 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for II NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 5 Error Mean Square 4.57257 Critical Value of t 2.57058 Least Significant Difference 5.4968 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 83.475 2 125 B 64.620 2 75 C 52.330 2 50 D 37.920 2 25 E 28.810 2 12.5 DUNG MOI ETHANOL 30 01:59 Friday, July 9, 2017 4 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for II NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. 11 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 5 Error Mean Square 4.57257 Critical Value of t 4.03214 Least Significant Difference 8.6222 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 83.475 2 125 B 64.620 2 75 C 52.330 2 50 D 37.920 2 25 E 28.810 2 12.5 DUNG MOI ETHANOL 50 01:51 Friday, July 9, 2017 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values nongdo 5 12.5 125 25 50 75 Number of Observations Read 10 Number of Observations Used 10 DUNG MOI ETHANOL 50 01:51 Friday, July 9, 2017 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: II Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 3483.436440 870.859110 71.18 0.0001 Error 5 61.169250 12.233850 12 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Corrected Total 9 3544.605690 R-Square Coeff Var Root MSE II Mean 0.982743 7.079059 3.497692 49.40900 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F nongdo 4 3483.436440 870.859110 71.18 0.0001 DUNG MOI ETHANOL 50 01:51 Friday, July 9, 2017 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for II NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 5 Error Mean Square 12.23385 Critical Value of t 2.57058 Least Significant Difference 8.9911 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 78.390 2 125 B 59.900 2 75 C 48.870 2 50 D 34.040 2 25 D D 25.845 2 12.5 DUNG MOI ETHANOL 50 01:51 Friday, July 9, 2017 4 13 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for II NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 5 Error Mean Square 12.23385 Critical Value of t 4.03214 Least Significant Difference 14.103 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 78.390 2 125 B 59.900 2 75 B B 48.870 2 50 C 34.040 2 25 C C 25.845 2 12.5 DUNG MOI ETHANOL 70 01:37 Friday, July 9, 2017 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values nongdo 5 12.5 125 25 50 75 Number of Observations Read 10 Number of Observations Used 10 DUNG MOI ETHANOL 70 01:37 Friday, July 9, 2017 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: II 14 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 3303.426760 825.856690 77.54 0.0001 Error 5 53.253050 10.650610 Corrected Total 9 3356.679810 R-Square Coeff Var Root MSE II Mean 0.984135 5.446747 3.263527 59.91700 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F nongdo 4 3303.426760 825.856690 77.54 0.0001 DUNG MOI ETHANOL 70 01:37 Friday, July 9, 2017 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for II NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 5 Error Mean Square 10.65061 Critical Value of t 2.57058 Least Significant Difference 8.3892 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 87.780 2 125 B 70.910 2 75 15 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP C 58.685 2 50 D 45.860 2 25 E 36.350 2 12.5 DUNG MOI ETHANOL 70 01:37 Friday, July 9, 2017 4 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for II NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 5 Error Mean Square 10.65061 Critical Value of t 4.03214 Least Significant Difference 13.159 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 87.780 2 125 B 70.910 2 75 B C B 58.685 2 50 C C D 45.860 2 25 D D 36.350 2 12.5 DUNG MOI NUOC CAT 02:07 Friday, July 9, 2017 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values nongdo 5 12.5 125 25 50 75 16 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Number of Observations Read 10 Number of Observations Used 10 DUNG MOI NUOC CAT 02:07 Friday, July 9, 2017 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: II Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 2453.860640 613.465160 81.67 <.0001 Error 5 37.558800 7.511760 Corrected Total 9 2491.419440 R-Square Coeff Var Root MSE II Mean 0.984925 4.976503 2.740759 55.07400 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F nongdo 4 2453.860640 613.465160 81.67 <.0001 DUNG MOI NUOC CAT 02:07 Friday, July 9, 2017 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for II NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 5 Error Mean Square 7.51176 Critical Value of t 2.57058 Least Significant Difference 7.0453 17 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 79.945 2 125 B 63.845 2 75 C 52.755 2 50 D 43.625 2 25 E 35.200 2 12.5 DUNG MOI NUOC CAT 02:07 Friday, July 9, 2017 4 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for II NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 5 Error Mean Square 7.51176 Critical Value of t 4.03214 Least Significant Difference 11.051 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 79.945 2 125 B 63.845 2 75 C 52.755 2 50 C D C 43.625 2 25 D D 35.200 2 12.5 18 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC E: KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA DUNG MÔI ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN E.1. Môi trƣờng NA NB 3 g meat extract 3 g meat extract 5 g pepton 5 g pepton 5 g NaCl 5 g NaCl 15 g agar 1000 ml nƣớc cất 1000 ml nƣớc cất pH 7,4 ± 0,2 pH 7,4 ± 0,2 E.2. Bacillus cereus Đƣờng kính vòng kháng Ethanol Ethanol Ethanol Nƣớc Kháng khuẩn (mm) 30% 50% 70% cất sinh 1 0 0 13 0 22 2 0 0 13,5 0 25 3 0 0 12,5 0 19 Độ lệch chuẩn 0 0 0,289 0 1,732 19 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HOAT TINH KHANG BACILLUS CEREUS 1 11:31 Thursday, July 9, 2017 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values BACILLUS 2 70 khangsin Number of Observations Read 6 Number of Observations Used 6 HOAT TINH KHANG BACILLUS CEREUS 2 11:31 Thursday, July 9, 2017 The ANOVA Procedure Dependent Variable: DK Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 1 121.5000000 121.5000000 26.27 0.0069 Error 4 18.5000000 4.6250000 Corrected Total 5 140.0000000 R-Square Coeff Var Root MSE DK Mean 0.867857 12.28904 2.150581 17.50000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F BACILLUS 1 121.5000000 121.5000000 26.27 0.0069 HOAT TINH KHANG BACILLUS CEREUS 3 11:31 Thursday, July 9, 2017 20 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DK NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 4.625 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 4.8753 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N BACILLUS A 22.000 3 khangsin B 13.000 3 70 HOAT TINH KHANG BACILLUS CEREUS 4 11:31 Thursday, July 9, 2017 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DK NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 4.625 Critical Value of t 4.60409 Least Significant Difference 8.0845 Means with the same letter are not significantly different. 21 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP t Grouping Mean N BACILLUS A 22.000 3 khangsin B 13.000 3 70 E.3. Salmonella Đƣờng kính vòng kháng Ethanol Ethanol Ethanol Nƣớc Kháng khuẩn (mm) 30% 50% 70% cất sinh 1 0 9 11,5 0 15 2 0 10 11 0 17 3 0 10 14 0 18 Độ lệch chuẩn 0 0,333 1,072 0 0,882 HOAT TINH KHANG SALMONELLA 1 11:46 Thursday, July 9, 2017 The ANOVA Procedure Class Level Information 22 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Class Levels Values SAL 3 50 70 khangsin Number of Observations Read 9 Number of Observations Used 9 HOAT TINH KHANG SALMONELLA 2 11:46 Thursday, July 9, 2017 The ANOVA Procedure Dependent Variable: DK Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 75.50000000 37.75000000 21.57 0.0018 Error 6 10.50000000 1.75000000 Corrected Total 8 86.00000000 R-Square Coeff Var Root MSE DK Mean 0.877907 10.30812 1.322876 12.83333 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F SAL 2 75.50000000 37.75000000 21.57 0.0018 HOAT TINH KHANG SALMONELLA 3 11:46 Thursday, July 9, 2017 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DK NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. 23 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 1.75 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 2.643 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N SAL A 16.667 3 khangsin B 12.167 3 70 B B 9.667 3 50 HOAT TINH KHANG SALMONELLA 4 11:46 Thursday, July 9, 2017 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DK NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 1.75 Critical Value of t 3.70743 Least Significant Difference 4.0045 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N SAL A 16.667 3 khangsin B 12.167 3 70 B B 9.667 3 50 24 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP E.4. E.coli Đƣờng kính vòng kháng Ethanol Ethanol Ethanol Nƣớc Kháng khuẩn (mm) 30% 50% 70% cất sinh 1 11 10 13 0 21 2 11 10 12 0 20 3 11 10 12 0 25 Độ lệch chuẩn 0 0 0,333 0 1,528 HOAT TINH KHANG ECOLI 11:53 Thursday, July 9, 2017 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values E 4 30 50 70 khangsin Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12 25 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HOAT TINH KHANG ECOLI 11:53 Thursday, July 9, 2017 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: DK Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 275.0000000 91.6666667 50.00 <.0001 Error 8 14.6666667 1.8333333 Corrected Total 11 289.6666667 R-Square Coeff Var Root MSE DK Mean 0.949367 9.787998 1.354006 13.83333 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F E 3 275.0000000 91.6666667 50.00 <.0001 HOAT TINH KHANG ECOLI 11:53 Thursday, July 9, 2017 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DK NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 1.833333 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 2.5494 Means with the same letter are not significantly different. 26 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP t Grouping Mean N E A 22.000 3 khangsin B 12.333 3 70 B B 11.000 3 30 B B 10.000 3 50 HOAT TINH KHANG ECOLI 11:53 Thursday, July 9, 2017 4 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DK NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 1.833333 Critical Value of t 3.35539 Least Significant Difference 3.7095 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N E A 22.000 3 khangsin B 12.333 3 70 B B 11.000 3 30 B B 10.000 3 50 E.5. Staphylococcus aureus Đƣờng kính vòng kháng Ethanol Ethanol Ethanol Nƣớc Kháng khuẩn (mm) 30% 50% 70% cất sinh 1 12 12 13 12 20 27 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2 13 12 14 13 24 3 13,5 11 14 12 25 Độ lệch chuẩn 0,441 0,333 0,333 0,333 1,528 HOAT TINH KHANG STAPHYLOCOCCUS AUREUS 1 11:59 Thursday, July 9, 2017 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values SA 5 30 50 70 khangsin nc Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 HOAT TINH KHANG STAPHYLOCOCCUS AUREUS 2 11:59 Thursday, July 9, 2017 28 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP The ANOVA Procedure Dependent Variable: DK Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 264.7333333 66.1833333 38.55 <.0001 Error 10 17.1666667 1.7166667 Corrected Total 14 281.9000000 R-Square Coeff Var Root MSE DK Mean 0.939104 8.913036 1.310216 14.70000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F SA 4 264.7333333 66.1833333 38.55 <.0001 HOAT TINH KHANG STAPHYLOCOCCUS AUREUS 3 11:59 Thursday, July 9, 2017 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DK NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 1.716667 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 2.3836 Means with the same letter are not significantly different. 29 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP t Grouping Mean N SA A 23.000 3 khangsin B 13.667 3 70 B B 12.833 3 30 B B 12.333 3 nc B B 11.667 3 50 HOAT TINH KHANG STAPHYLOCOCCUS AUREUS 4 11:59 Thursday, July 9, 2017 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DK NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 1.716667 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 3.3904 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N SA A 23.000 3 khangsin B 13.667 3 70 B B 12.833 3 30 B B 12.333 3 nc B B 11.667 3 50 30