Đồ án Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn bacillus để phân giải protein gây dị ứng trong khô dầu đậu nành với phương pháp lên men bán rắn

công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Phạm Huỳnh Ninh Bộ môn Dinh dưỡng và Thức ăn chăn nuôi, Phân viện chăn nuôi Nam Bộ (IASVN). Những kết quả có được trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt nghiệp của người khác dưới bất kì hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án này là hoàn toàn trung thực. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đồ án của mình. TP.HCM, ngày 16 tháng 7 năm 2017 Sinh viên thực hiện Lê Huỳnh Hoài Thương 1 Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp, em xin gởi lời tri ân chân thành đến TS. Phạm Huỳnh Ninh đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt thời gian xây dựng đề cương và hoàn thành đồ án. Em xin cám ơn anh Lê Quang Trí và Vũ Minh đã động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện. Đồng thời, em cũng gởi lời cám ơn đến quý Thầy, Cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian dài học tập. Với những kiến thức mà em đã tiếp thu được không chỉ giúp cho em thực hiện đồ án tốt nghiệp mà còn là nền tảng kiến thức cho công việc sau này. Em xin gởi lời cám ơn sâu sắc đến gia đình đã luôn chăm sóc, tạo điều kiện cho em đến trường theo đuổi ước mơ và là chỗ dựa vững chắc không chỉ về tinh thần mà cả vật chất cho em trong suốt những năm qua. Em cũng xin gởi lời cám ơn chân thành đễn các bạn cùng thực hiện đề tài trong phòng thí nghiệm CNSH – Phân viện chăn nuôi Nam Bộ - những người luôn động viên, sát cánh và giúp đỡ hết mình để em hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp này. Cuối cùng, em xin cám ơn các Thầy Cô trong hội đồng phản biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án này. Em xin gửi đến quí Thầy Cô lời chúc sức khỏe. TP.HCM, ngày 16 tháng 7 năm 2017 Sinh viên thực hiện Lê Huỳnh Hoài Thương 2 Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC ......................................................................................................................... i DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................... iii DANH MỤC ĐỒ THỊ ..................................................................................................... iv DANH MỤC HÌNH ......................................................................................................... v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................................... vi MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 4 1.1 Tổng quan về nghiên cứu sản xuất khô dầu đậu nành ........................................ 4 1.1.1 Lên men khô dầu đậu nành để giảm thiểu chất gây dị ứng ......................... 4 1.1.2 Vấn đề sử dụng khô dầu nành lên men ........................................................ 5 1.2 Tổng quan về Bacillus ........................................................................................ 6 1.2.1 Vi khuẩn Bacillus ......................................................................................... 6 1.2.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis ............................................................................ 8 1.3 Tổng quan về protease ...................................................................................... 11 1.3.1 Khái niệm ................................................................................................... 11 1.3.2 Phân loại .................................................................................................... 11 1.3.3 Hoạt tính protease ở đậu nành ................................................................... 12 1.4 Giới thiệu về lên men bán rắn .......................................................................... 13 1.4.1 Những vấn đề cơ bản của lên men bán rắn ................................................ 13 1.4.2 Những ưu điểm của lên men bán rắn ......................................................... 13 1.4.3 Sự tạp nhiễm trong lên men bán rắn .......................................................... 14 1.4.4 Các giai đoạn của lên men bán rắn ............................................................ 15 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................................................... 17 2.1 Vật liệu ............................................................................................................. 17 2.1.1 Nguyên vật liệu .......................................................................................... 17 2.1.2 Thiết bị và dụng cụ .................................................................................... 17 i Đồ án tốt nghiệp 2.2 Môi trường nghiên cứu ..................................................................................... 17 2.2.1 Môi trường phân lập và giữ giống Bacillus ............................................... 17 2.2.2 Môi trường khảo sát hoạt tính protease của các chủng vi khuẩn ............... 18 2.2.3 Hóa chất SDS-PAGE ................................................................................. 19 2.3 Các phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 19 2.3.1 Phương pháp phân lập, giữ giống vi khuẩn Bacillus ................................. 19 2.3.2 Phương pháp định danh ............................................................................. 22 2.3.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính protease .................................................. 27 2.3.4 Khảo sát các điều kiện thích hợp cho lên men khô dầu đậu nành ............. 31 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 40 3.1 Phân lập và định danh các chủng Bacillus ....................................................... 40 3.2 Khảo sát hoạt tính protease của vi khuẩn ......................................................... 42 3.2.1 Xác định dựa trên vòng phân giải .............................................................. 42 3.2.2 Xác định dựa trên cơ chất khô dầu đậu nành ............................................. 44 3.3 Khảo sát các điều kiện lên men ........................................................................ 46 3.3.1 Khảo sát độ ẩm thích hợp cho lên men ...................................................... 46 3.3.2 Khảo sát nhiệt độ thích hợp cho lên men ................................................... 48 3.3.3 Khảo sát độ dày thích hợp cho lên men cơ chất ........................................ 50 3.3.4 Khảo sát thời gian lên men thích hợp ........................................................ 51 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................. 54 4.1 Kết luận ............................................................................................................. 54 4.2 Kiến nghị .......................................................................................................... 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 55 PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 1 ii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học và axít amin của khô dầu đậu nành tách vỏ Mỹ ............ 5 Bảng 1.2. Đặc điểm sinh hóa của chủng Bacillus subtilis ............................................. 9 Bảng 2.1. Trình tự bổ sung hóa chất để xây dựng đường chuẩn Tyrosine ................... 29 Bảng 2.2. Các bước xác định hoạt tính enzyme protease ............................................. 30 Bảng 3.1. Kết quả các thử nghiệm sinh hóa .................................................................. 41 Bảng 3.2. Kết quả vòng phân giải gelatin ..................................................................... 42 Bảng 3.3. Hoạt tính enzyme protease (U/g) .................................................................. 44 Bảng 3.4. Kết quả tăng trưởng vi sinh vật qua các khung giờ ở các mức độ ẩm khác nhau ............................................................................................................................... 46 Bảng 3.5. Kết quả tăng trưởng vi sinh vật qua các khung giờ ở các mức nhiệt độ khác nhau ............................................................................................................................... 48 Bảng 3.6. Kết quả tăng trưởng vi sinh vật qua các khung giờ ở các mức độ dày khác nhau ............................................................................................................................... 50 Bảng 3.7. Kết quả tăng trưởng vi sinh vật qua các khung giờ khác nhau ..................... 52 iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1. Biểu thị đường kính vòng phân giải gelatin ................................................ 43 Đồ thị 3.2. Biểu thị hoạt tính enzyme sau các mốc thời gian ....................................... 44 Đồ thị 3.3. Biểu thị sự tăng trưởng vi sinh vật qua các mốc thời gian ở các mức độ ẩm khác nhau....................................................................................................................... 47 Đồ thị 3.4. Biểu thị sự tăng trưởng vi sinh vật qua các mốc thời gian ở các nhiệt độ khác nhau ............................................................................................................................... 49 Đồ thị 3.5. Biểu thị sự tăng trưởng vi sinh vật qua các mốc thời gian ở các độ dày khác nhau ............................................................................................................................... 51 Đồ thị 3.6. Biểu thị sự tăng trưởng vi sinh vật qua các mốc thời gian khác nhau ........ 53 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 3.1. Khuẩn lạc vi khuẩn phân lập từ chế phẩm Natto ......................................... 40 Hình 3.2. Hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi .......................................................... 40 Hình 3.3. Đường kính vòng phân giải gelatin ............................................................... 42 Hình 3.4. Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu khô dầu nành lên men ở các mức độ ẩm khác nhau....................................................................................................................... 47 Hình 3.5. Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu khô dầu nành lên men ở các mức nhiệt độ khác nhau ................................................................................................................. 49 Hình 3.6. Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu khô dầu nành lên men ở các mức độ dày khác nhau....................................................................................................................... 51 Hình 3.7. Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu khô dầu nành lên men ở các mức thời gian khác nhau ............................................................................................................... 53 v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ctv cộng tác viên IU đơn vị quốc tế rpm vòng/phút SCA Simmon Citrate Agar SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis Std Thang chuẩn Đc Đối chứng vi Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU ❖ Đặt vấn đề Khô dầu đậu nành, sản phẩm của quá trình tách chiết dầu từ hạt đậu nành, chủ yếu được sử dụng để chế biến thức ăn chăn nuôi gà và heo, chiếm khoảng 74% tổng sản lượng (Chen và ctv, 2010). Khô dầu đậu nành thường được sử dụng với tỷ lệ khoảng 10- 20% trong khẩu cho heo và gà. Đây là nguồn cung cấp protein rất tốt cho vật nuôi do có hàm lượng các axít amin không thay thế cao. Tuy nhiên, việc sử dụng khô dầu đậu nành trong khẩu phần thức ăn cho gia súc, gia cầm non (hệ tiêu hóa chưa hoàn thiện) bị hạn chế, hiệu quả không cao do khô dầu đậu nành chứa một số protein gây dị ứng. Hai protein gây dị ứng chủ yếu trong đậu nành là glycinin (globulin 11S) và β- conglycinin (globulin 7S). Chúng chiếm hơn 50% tổng lượng protein trong hạt đậu nành (Samoto và ctv, 2007). Glycinin là một protein với cấu trúc gồm 5 tiểu đơn vị mà mỗi một tiểu đơn vị gồm một chuỗi polypeptide mang tính axít (khối lượng phân tử 35-40 kDa) và một chuỗi polypeptide mang tính bazơ (22 kDa) liên kết với nhau bằng liên kết disulfua (Helm và ctv, 2000; Beardslee và ctv, 2000; Hou và ctv, 2004; Golubovic và ctv, 2005). Tổng lượng glycinin khoảng 20-70mg/g khô dầu đậu nành và chiếm đến 40% tổng khối lượng protein trong đậu nành (van Eys và ctv, 2004; Sun và ctv, 2008). Glycinin có khả năng bền nhiệt và kháng hầu hết các enzyme trong hệ tiêu hóa do có liên kết disulfua khá bền (Kuipers và ctv, 2007). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, glycinin gây dị ứng cho người và vật nuôi non do có khả năng gắn globulin miễn dịch E (IgE) vào chuỗi axít polypeptide của mình. Nó làm tăng hàm lượng kháng thể glycinin-IgE trong huyết thanh và đây là nguyên nhân gây dị ứng (Sun và ctv, 2007). Mặt dù khá nhiều nghiên cứu cho thấy glycinin liên quan đến các triệu chứng của dị ứng như biến đổi hình dáng nhung mao, đảo lộn chức năng miễn dịch, tăng trưởng chậm và tiêu chảy. 1 Đồ án tốt nghiệp Tuy nhiên, cơ chế tác động của glycinin như thế nào hiện vẫn chưa được sáng tỏ. Một vài nghiên cứu đề nghị rằng các tế bào phì hay dưỡng bào (mast cells) có liên quan trực tiếp đến tính nhạy cảm của vật nuôi đối với protein glycinin. Các dưỡng bào này nằm trong các lông tơ của ruột non để thực hiện chức năng nhu động và các quy trình đáp ứng miễn dịch (Schneider và ctv, 2002). Các dưỡng bào này đóng vai trò chủ đạo trong các phản ứng nhạy cảm của cơ thể vật nuôi hay con người đối với phức hợp glycinin- IgE thông qua một chuỗi các hoạt động như kích thích sản xuất một lượng lớn histamine hay các cytokine miễn dịch (van Wijk và ctv, 2007). Tóm lại, glycinin trong khô dầu đậu nành gây kích ứng miễn dịch ở động vật con, làm tăng hàm lượng globulin miễn dịch (IgE, IgG), giải phóng histamine, làm tăng nhu động và sự bài tiết nước của ruột non, dẫn đến tăng tỷ lệ heo con bị tiêu chảy, giảm năng suất (Li và ctv, 1991; Zhao và ctv, 2008; Sun và ctv, 2008; Hao và ctv, 2009). Trong khi đó β-conglycinin là phân tử protein chứa 3 tiểu đơn vị khác nhau α (72 kDa), α’ (72 kDa) và β (53 kDa) (Doyle và ctv, 1986). Khô dầu đậu nành chứa khoảng 3-40 mg/g β-conglycinin (van Eys và ctv, 2004). β-conglycinin có khả năng kháng lại các enzyme thủy phân so với các protein khác trong đậu nành. Các tiểu đơn vị của β- conglycinin có thể kết tạo khối trong ruột non, giấu vị trí hoạt động (bám) đối với enzyme nên nó khó bị tiêu hóa trong hệ tiêu hóa (Kuipers và ctv, 2007). Tương tự như glycinin, β-conglycinin cũng làm giảm sinh trưởng ở heo con thông qua việc làm tăng hàm lượng globulin miễn dịch (IgE) trong huyết thanh, phá hủy tính toàn vẹn của ruột non, làm giảm khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng (Hao và ctv, 2009; Zhao và ctv, 2010). Tóm lại, tuy khô dầu đậu nành là nguồn protein rất tốt cho vật nuôi nhưng nó cũng chứa nhiều chất gây dị ứng. Các chất này gây kích ứng miễn dịch, tiêu chảy, ức chế enzyme tiêu hóa, giảm tỷ lệ tiêu hóa, do đó làm giảm tăng trọng và năng suất của vật nuôi, đặc biệt là vật nuôi giai đoạn non. Việc loại bỏ các chất có ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe của vật nuôi là một đòi hỏi của thực tế sản xuất nhằm nâng cao giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu, góp phần giảm chi phí thức ăn. 2 Đồ án tốt nghiệp Từ những nhân định trên tôi thực hiện đề tài: “NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN BACILLUS ĐỂ PHÂN GIẢI PROTEIN GÂY DỊ ỨNG TRONG KHÔ DẦU ĐẬU NÀNH VỚI PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BÁN RẮN”. ❖ Mục tiêu, phạm vi đề tài Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn thuộc giống Bacillus có khả năng ngoại tiết protease cao và ứng dụng chủng vi khuẩn này để lên men bán rắn nhằm loại bỏ các protein gây dị ứng trong khô dầu đậu nành (glycinin, beta-conglycinin). ❖ Ý nghĩa đề tài Phân lập được chủng vi khuẩn có đặc tính tốt trong sản sinh protease chuyển hóa protein đậu nành, ứng dụng trong lên men khô dầu đậu nành, phục vụ trong chăn nuôi, tiết giảm chi phí ❖ Địa điểm nghiên cứu Phân viện chăn nuôi Nam Bộ, khu phố Hiệp Thắng, phường Bình Thắng, Dĩ An, Bình Dương. ❖ Thời gian nghiên cứu Từ ngày 17/4/2017 đến 16/7/2017 3 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về nghiên cứu sản xuất khô dầu đậu nành 1.1.1 Lên men khô dầu đậu nành để giảm thiểu chất gây dị ứng Có khá nhiều phương pháp để giảm thiểu tác động hay phân hủy các chất trong khô dầu đậu nành. Trong đó, phương pháp lên men vi sinh vật (với Bacillus, Aspergillus và Lactobacillus) nhằm loại bỏ các chất gây dị ứng trong đậu nành đã được nghiên cứu và ứng dụng trong thực tiễn sản xuất trên thế giới. Trong quá trình lên men, vi sinh vật phân hủy carbohydrate của khô dầu nành và sử dụng chúng để phát triển. Việc giảm lượng vật chất khô và tăng mật độ vi sinh làm tăng lượng protein trong khô dầu đậu nành. Thêm vào đó, các vi sinh vật dùng cho quá trình lên men còn có khả năng tiết ra môi trường amylase, protease, cellulase có khả năng phân hủy các protein, gây dị ứng và tăng tính dễ tiêu hóa của các chất dinh dưỡng trong khô dầu đậu nành. Chen và ctv (2010) cũng đã tiến hành lên men bán rắn khô dầu đậu nành với Aspergillus oryzae và lên men kết hợp Aspergillus oryzae với Lactobacillus casei. Cả 2 phương pháp lên men đều cho thấy kết quả tốt trong việc tăng cường tính hữu dụng của protein với hàm lượng trichloroacetic cao, khả năng tiêu hóa protein in vitro cao. Lên men bán rắn khô dầu đậu nành sử dụng vi khuẩn thuộc giống Bacillus cũng giúp loại bỏ các chất kháng dinh dưỡng, tăng cường các hoạt chất chống oxy hóa, tăng tỷ lệ tiêu hóa ở heo (Wongputtisin và ctv, 2007; Feng và ctv, 2007a; Hu và ctv, 2010). Phương pháp lên men sử dụng Bacillus subtilis tỏ ra có nhiều lợi thế hơn so với lên men bằng Aspergillus oryzae trong việc loại bỏ các protein gây dị ứng và cải thiện chất lượng thành phần các axít amin (Frias và ctv, 2007). Bào tử hay tế bào của vi khuẩn Bacillus trong khô dầu đậu nành lên men còn được xem như nguồn cung cấp probiotic, có lợi cho sức khỏe đường ruột của vật nuôi. 4 Đồ án tốt nghiệp Phương pháp lên men sử dụng vi khuẩn Bacillus, Lactobacillus tỏ ra có nhiều lợi thế hơn so với lên men với nấm mốc do sản phẩm có lượng protein hòa tan cao hơn, khả năng phân giải các protein gây dị ứng tốt hơn, sinh trưởng nhanh hơn (Mukherjee và ctv, 2016). Bảng 1.1. Thành phần hóa học và axít amin của khô dầu đậu nành tách vỏ Mỹ Stt Thành phần % vật chất Stt Thành phần % vật chất khô khô 1 Đạm thô 47,8 12 Leucin 3,57 2 Xơ thô 3,1 13 Valin 2,26 3 Béo 1,5 14 Histidine 1,22 4 Khoáng tổng số 6,4 15 Phenylalanin 2,33 5 Lysin 2,99 16 Tyrosin 0,4 6 Methionin 0,68 17 Glycin 1,99 7 Cystein 0,73 18 Serin 2,32 8 Threonine 1,85 19 Prolin 2,34 9 Tryptophan 0,65 20 Alanin 2,02 10 Arginin 3,43 21 Aspartic axít 5,42 11 Isoluecin 2,1 22 Glutamic 8,58 1.1.2 Vấn đề sử dụng khô dầu nành lên men Khá nhiều nghiên cứu ở ngoài nước đã tiến hành lên men khô dầu đậu nành bằng vi sinh vật nhằm loại bỏ các chất gây dị ứng và đã sử dụng sản phẩm sau lên men cho nhiều đối tượng vật nuôi. Khô dầu đậu nành lên men chứng tỏ có thể giúp tăng cường hoạt động của enzyme tiêu hóa và tăng tỷ lệ tiêu hóa protein, cải thiện tăng trọng và sức khỏe đường ruột, giảm tỷ lệ tiêu chảy ở heo và gà, đặt biệt là heo con và gà con (Mathivanan và ctv, 2006; Cho và ctv, 2007; Feng và ctv, 2007b; Liu và ctv, 2007; Song và ctv, 2010; Cervantes-Pahm và Stein, 2010; Xu và ctv, 2012; Zhang và ctv, 2013; Kim và ctv, 2014). Nghiên cứu của Gebru và ctv (2010) cho thấy, khi sử dụng 5% khô dầu đậu nành lên men bằng Bacillus subtilis trong khẩu phần của heo con, lượng thức ăn ăn vào và tăng trọng tương đương với heo cho ăn khẩu phần có bổ sung 100 mg/kg kháng 5 Đồ án tốt nghiệp sinh cholotetracycline và cao hơn heo ở khẩu phần không sử dụng kháng sinh. Tuy nhiên, hầu như không có bất kỳ nghiên cứu nào liên quan đến việc sản xuất chế phẩm khô dầu đậu nành lên men dùng cho chăn nuôi và có rất ít các nghiên cứu sử dụng sản phẩm khô dầu đậu nành lên men giàu protein này cho chăn nuôi ở nước ta được công bố. Hiện tại, có ít nhất 5 loại sản phẩm khô dầu đậu nành lên men đã được nhập khẩu và phân phối đại trà tại Việt Nam (Soytide của công ty CJ-Hàn Quốc; P-up 50 và EPS 500 của Thái Lan; Supersoy và Dabomb-P của công ty Suchiang-Đài Loan) với giá bán từ 19.000-21.000 đ/kg, so với giá khô dầu đậu nành (không lên men) chỉ khoảng 10.000- 11.000 đ/kg. Chúng ta thấy rằng giá bán của khô dầu đậu nành gần như tăng gấp đôi sau khi lên men. Hiện tại có khá nhiều nhà máy chế biến thức ăn chăn nuôi tại Việt Nam đã sử dụng khô dầu đậu nành lên men trong thức ăn cho heo con như thức ăn Delice B của Proconco, Comfeed651 của công ty Japfa, S1 primary diets của công ty spotlight và viên sữa H-10 của công ty RTD. Với 3,9 triệu nái trong đàn lợn của Việt Nam, thì mỗi tháng lượng tiêu thụ khô dầu nành lên men là rất lớn, khoảng 20 ngàn tấn/tháng (> 200 ngàn tấn/năm). Như vậy, nếu chúng ta có thể sản xuất khô dầu nành lên men từ 3 triệu tấn nguyên liệu này và cung cấp cho thị trường trong nước thì giá trị thặng dư sẽ rất lớn. Đề tài thành công đồng nghĩa với việc khô dầu đậu nành lên men sẽ được sản xuất tại Việt Nam với giá cả cạnh tranh hơn sản phẩm ngoại nhập do tiết kiệm được chi phí nhập khẩu và vận chuyển, đồng thời giảm lệ thuộc vào công nghệ của nước ngoài. 1.2 Tổng quan về Bacillus 1.2.1 Vi khuẩn Bacillus Theo khóa phân loại của Bergey, Bacillus thuộc: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli 6 Đồ án tốt nghiệp Bộ: Bacilliales Họ: Bacilliaceae Chi: Bacillus Vi khuẩn thuộc chi Bacillus là nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất và rơm rạ, cỏ khô. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện của chúng rất hiếm. Vi khuẩn thuộc chi Bacillus là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram (+), kích thước 0,5 – 0,8µm x 1,5 – 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn thường có 8 – 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích thước từ 0,8 – 1,8µm. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng axít, có khả năng chịu nhiệt (ở 100oC trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất, chất sát trùng. Các loài vi khuẩn này lên men các loại đường như: glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose và arabinose. Nhiệt độ tối ưu là 37oC, pH thích hợp khoảng 7,0 – 7,4. Vi khuẩn Bacillus đã được ứng dụng rất nhiều trong thực tế sản xuất từ lên men sản xuất các sản phẩm truyền thống phục vụ cho con người (đậu natto, nước mắm, cá hộp) đến lên men sản xuất các sản phẩm trong lĩnh vực y dược, da giày, chăn nuôi. Một ứng dụng khác của vi khuẩn thuộc Bacillus là thành phần của thuốc trừ sâu sinh học. Chủng vi khuẩn thường được sử dụng trong các sản phẩm dạng này là Bacillus thuringiensis. Enzym protease tách chiết từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus (chủ yếu từ Bacillus subtilis và Bacillus licheniformis) được sử dụng rộng rải trong bột giặt, kem đánh răng, giày da. Một số các protease mạnh nhất được sản xuất từ Bacillus licheniformis, B. subtilis, B.amyloliquefaciens và B. mojavensis. Việc sản xuất protease của vi sinh thường chịu tác động bởi sự biến động nguồn carbon và nitơ, sự thay đổi trong tỷ lệ C/N, sự hiện 7 Đồ án tốt nghiệp diện của một số loại đường dễ dàng chuyển hóa, chẳng hạn như glucose. Một số yếu tố vật lý như nhiệt độ, pH cũng có ảnh hưởng đến sản xuất protease 1.2.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis 1.2.2.1 Lịch sử phát hiện Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion Erenberg và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”. Gần 30 năm sau, Casimir Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium”. Năm 1872, Ferdimand Cohn xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là Bacillus subtilis. Năm 1941, Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu, chúng được dùng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Năm 1949 – 1957, Henry và cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Gần đây, Bacillus subtilis đã được nghiên cứu, sử dụng rộng rãi trên thế giới. Từ đó, thuật ngữ “Subtilis therapy” ra đời. Bacillus subtilis được sử dụng ngày càng phổ biến và được xem như sinh vật phòng và trị các bệnh về rối loạn đường tiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, tiêu chảyNgày nay, Bacillus subtilis đã và đang được nghiên cứu rộng rãi với nhiều tiềm năng và ứng dụng hiệu quả trong chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trường 1.2.2.2 Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất và rơm rạ, cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thường trong đất trồng trọt có khoảng 106 – 107 CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện của chúng rất hiếm. Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất như bột mì (trong bột mì vi khuẩn Bacillus subtilis chiếm 75 – 79% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo, 8 Đồ án tốt nghiệp trong các thực phẩm như mắm, tương, chao Bacillus subtilis đóng vai trò đáng kể về mặt có lợi cũng như mặt gây hại trong quá trình biến đổi sinh học. 1.2.2.3 Đặc điểm hình thái Bacillus subtilis là trực khuẩn Gram dương, hai đầu tròn, kích thước nhỏ 3 – 5 x 0,6 µm, tế bào thường nối với nhau thành chuỗi hoặc đứng riêng rẽ, có khả năng di động, gồm 8 – 12 lông, có bào tử hình elip nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng, kích thước 0,8 – 1,8 µm. Vị tró của bào tử trong tế bào sinh dưỡng không theo bất cứ một nguyên tắc chặt chẽ nào, có thể lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không chính tâm. Bacillus subtilis là khả năng tạo bào tử trong những điều kiện nhất định, mỗi tế bào sinh dưỡng sinh ra một bào tử. Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử trong chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi. Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hóa học cơ bản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành phần và có thêm một số thành phần mới. Bacillus subtilis phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ... 1.2.2.4 Đặc điểm sinh hóa Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát triển trong môi trường thiếu oxi, phát triển tối ưu ở nhiệt độ 37oC, pH 7 – 7,4, tối ưu ở pH 7,2, Vi khuẩn lên men không sinh khí các loại đường: Glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose, arabinose và một số hoạt tính khác được liệt kê trong bảng sau Bảng1.2. Đặc điểm sinh hóa của chủng Bacillus subtilis Phản ứng Kết quả Hoạt tính catalase + Sinh indol - 9 Đồ án tốt nghiệp MR + VP + Sử dụng citrate + Khử nitrate + Tan chảy Gelatine + Di động + Phân giải tinh bột + Arabinose + Xylose + Saccharose + Mannitol + Glucose + Lactose - Maltose + 1.2.2.5 Đặc điểm nuôi cấy Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên vẫn phát triển được trong môi trường thiếu oxy. Nhiệt độ tối ưu là 37oC, pH thích hợp khoảng 7,0 – 7,4. Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển hầu hết trên các môi trường dinh dưỡng cơ bản: Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm, sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu. 10 Đồ án tốt nghiệp Trên môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB): vi khuẩn phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn, kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan khi lắc đều. Trên môi trường giá đậu – peptone: khuẩn lạc dạng tròn lồi, nhẵn bóng, đôi khi lan rộng, rìa răng cưa không đều, đường kính 3 – 4 cm sau 72 giờ nuôi cấy. Nhu cầu dinh dưỡng: chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số nguyên tố vi lượng khác. Vi khuẩn phát triển tốt trong môi trường cung cấp đủ nguồn carbon (như glucose) và nitơ (như peptone). 1.3 Tổng quan về protease 1.3.1 Khái niệm Protease hay peptide hydrolase là những enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptide (-O-NH-) trong phân tử protein và các polypeptide. Sản phẩm của quá trình thủy phân này có thể là acid amine, các polypeptide chuỗi ngắn. Nhiều enzyme protease còn có thể xúc tác phản ứng thủy phân liên kết ester, liên kết amide và phản ứng chuyển vị gốc acid amin. 1.3.2 Phân loại Các nhà khoa học đã phân loại protease của vi sinh vật thành 4 nhóm sau: Protease serin: là những protease có chứa nhóm (-OH) của serin trong trung tâm hoạt động. Các protease serin thường hoạt động ở pH kiềm và có tính đặc hiệu tương đối rộng. Protease thiol: là những protease có chứa nhóm thiol (-SH) của axít amin cystein trong trung tâm hoạt động. Nhóm (-SH) có khả năng phản ứng cao, tham gia nhiều biến đổi hóa học như: axít hóa, phosphoryl hóa, oxy hóa... Các protease thiol thường hoạt động mạnh ở pH trung tính và có tính đặc hiệu rộng. Protease axít: là những protease chứa nhóm (-COOH) trong trung tâm hoạt động. Các nhóm (-COOH) thuộc mặt bên của asparagin hoặc axít glutamic hay ở đầu Carbon 11 Đồ ...kg nguyên liệu là (0,1-0,6)/ (0,6 – 1) = 1,25 Vậy cần 1,25 lít nước cho vào 1kg nguyên liệu.(Bùi Thị Nhung, 2013) 2.3.4.7 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc • Nguyên tắc Đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem mỗi khuẩn lạc hình thành từ một tế bào duy nhất. 34 Đồ án tốt nghiệp • Các tiến hành Chuẩn bị dung dịch pha loãng: Cân 1 g khô dầu nành lên men vào 9ml nước muối sinh lý được nồng độ pha loãng 10-1, sau đó hút 1ml dung dịch có nồng độ pha loãng 10- 1 cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý được nồng độ pha loãng 10-2, tiếp tục pha loãng để được các độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5, 10-6. Chuẩn bị môi trường thạch đĩa: LB được vô trùng cẩn thận Cấy và dàn đều dung dịch pha loãng Dùng pipet man hút 0,1 ml dịch huyền phù từ các độ pha loãng 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 cho vào đĩa petri, mỗi nồng độ pha loãng cấy 1 đĩa. Dùng que gạt vô trùng, gạt mẫu thật đều trên mặt thạch để tách riêng lẻ từng tế bào. Ghi và nắp đĩa petri các thông tin: Nồng độ pha loãng, ngày cấy mẫu. Ủ ở nhiệt độ 37oC trong tủ ủ Sau 24 giờ, đếm số khuẩn lạc trong mỗi đĩa. Ghi nhận các độ pha loãng có khuẩn lạc từ 25 đến 250 khuẩn lạc/đĩa • Cách tính kết quả Mật độ (CFU/g) = Ai x Di/V Trong đó: Ai: số khuẩn lạc trung bình/đĩa Di: độ pha loãng V: dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml) 2.3.4.8 Phương pháp chạy điện di SDS-PAGE • Nguyên tắc 35 Đồ án tốt nghiệp Gel polyacrylamide là gel được tạo thành do sự polymer hóa các phân tử acrylamide và N, N’-methylene-bis-acrylamide. Quá trình polymer hóa được xúc tác bởi hệ thống amoniumpersulfate (APS), N,N,N’,N’-tetramethylenediamine (TEMED. Sự di chuyển của các phân tử trên gel phụ thuộc vào điện trường và kích thước lỗ gel. Khả năng phân tách cũng như giới hạn trọng lượng phân tử của các phân tử sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và bis-acrylamide: nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, choo phép phân tách các phân tử sinh học có kích thước lớn và ngược lại. SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) là một kĩ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS, đây là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kĩ thuật này protein được xử lí với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfide là β-mercaptoethanol hay dithiothreitol (DTT). Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều được tích điện âm. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi qua một lỗ gel có kích thước nhất định. Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương và các phân tử tích điện dương sẽ di chuyển về cực âm của điện trường. Để xác định phân tử lượng của một protein, người ta thường so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã biết. Để đưa các protein trong mẫu về cùng một vách xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di trên gel không liên tục (discountinous gel). Trong phương pháp này gel gồm 2 lớp: 36 Đồ án tốt nghiệp Lớp gel gom (stacking gel) (lớp trên): các protein mẫu được dồn lại và tạo một lớp băng mỏng. Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dưới): tạo ra các băng protein có trọng lượng phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu. Hai lớp gel này được phân biệt nay bởi dung dịch đệm, nồng độ acrylamide và vị trí. Kĩ thuật SDS-PAGE có thể xác định được những phân tử protein có trọng lượng phân tử từ 10000-200000 Daltons. Những phân tử protein có trọng lượng lớn hơn 200000 Daltons thường được xác định trên gel có nồng độ acrylamide ít hơn 2,5% Ngoài kĩ thuật SDS-PAGE là phương pháp điện di trong điều kiện làm biến tính protein (denaturing condition), người ta còn dùng một số kĩ thuật điện di trên gel polyacrylamide khác nhằm phân tích protein trong điều kiện không biến tính (Nondenaturing condition) không có sự hiện diện của SDS hoặc để khắc phục một số vấn đề về SDS gây ra môt số ảnh hưởng đến đặc tính protein như tạo liên kết (cross- linked) giữa các protein với nhau. Một số protein không có sự tỉ lệ giữa điện tích và khối lượng với những protein khác người ta sử dụng kĩ thuật điện di tập trung điểm đẳng điện. (Isoelectric focusing gel electrophoresis). (Nguyễn Hoài Hương, 2016) ❖ Cách thực hiện • Tạo SDS gel 12,5% và gel gom 4,5% 1.Tạo running gel với thành phần như các bảng trên 2.Thêm 1 ml nước cất trên đầu gel 3.Đợi cho đến khi gel hóa rắn 4.Đổ nước ra 5.Tạo stacking gel, đặt lược vào 37 Đồ án tốt nghiệp 6.Tạo stacking gel, đợi đến khi gel hóa rắn 7.Rửa, lấy lược ra • Chuẩn bị mẫu 1. Thêm loading buffer vào mẫu 2. Luộc 5 phút Loading buffer: dung dịch BPB (bromophenol blue) o 4x đệm nạp mẫu (10 ml): 1 M Tris-HCl pH 6.8 2ml SDS 0.8 Glycerol 4 ml β-mercaptoethanol 4ml 10% Bromophenol blue 10µl Thêm nước đến 10 ml • Chạy SDS PAGE 1.Đặt gel vào hệ thống 2.Đổ running solition vào (1X) 3.Kết nối nguồn điện (120-150 V) • Running solution: 30.2g Tris Base, 144g glycine, 10g SDS cho 1 lít. Đây là dung dịch 10X. Pha loãng 10 lần trước khi sử dụng cho chạy SDS PAGE, giữ ở nhiệt độ phòng. • Nhuộm Gel 1.Ngâm gel trong dung dịch cố định (fixation solution) 10 phút (sau khi chạy) 2.Tạo dung dịch nhuộm CBB bằng các trộn cùng thể tích dun dịch A và B. 3.Ngâm gel trong dịch nhuộm 30 phút. 38 Đồ án tốt nghiệp 4.Rửa Dung dịch cố định Gel; Thêm 500 ml ethanol 95% (v/v) vào 300 ml nước cất. Thêm 100 ml thuốc thử acetic acide và điều chỉnh tổng thể tích đến 1000 ml với nước. Cuối cùng nồng độn là 50% (v/v) ethanol trong nước với 10% acetic acid. Pha CBB R-250 (Coommassie Blue R-250) •Gel được chuẩn bị trong 50% MeOH, 10% HoAC, 40% H2O từ 30 phút đến qua đêm •Nhuộm gel trong dung dịch trên, với 0,25% Coommassive Blue R-250, trong 2- 4 giờ, đến khi gel có màu xanh đồng nhất. Bước nhuộm hoàn tất khi gel không còn nhìn thấy trong dung dịch nhuộm. Trước khi hoàn tất nhuộm, gel sẽ xuất hiện một vùng sáng so với dung dịch nhuộm. •Dung dịch giải nhuộm từ 4 – 24 giờ trong 5% MeOH, 7.5% HoAC, 87.5% H2O. Các dải sẽ bắt đầu xuất hiện trong 1-2 giờ. Giải nhuộm đến khi nền sạch. •Giữ gel trong 7% HoAC. Tách protein từ khô dầu nành lên men: 40 mg bột được tách trong 1 ml đệm tách (0.03 mol L-1 Tris-HCl pH 8.0 chứa 0.01 mol L-1 β-mercaptoethanol). Mẫu để ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ, lắc 10 phút 1 lần. Các mẫu được li tâm khoảng 20 phút ở 11 x 103g ở nhiệt độ phòng.[40] 2.3.4.9 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu Các thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần. Kết quả được trình bày bằng giá trị trung bình ± sai số được tính bằng phần mềm Microsoft excel 2013. Sử dụng phần mềm SAS để phân tích thống kê số liệu thí nghiệm và đánh giá sự khác biệt giữa các mẫu. 39 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập và định danh các chủng Bacillus Chúng tôi đã mua mẫu Nattto của Nhật Bản ở cửa tiệm bán hàng hóa thực phẩm của Nhật Bản tại 15A8 Lê Thánh Tôn, Quận 1, Thành phố Hồ Chí Minh để sử dụng trong phân lập vi khuẩn Bacillus. Sau khi phân lập cho thấy: Vi khuẩn Bacillus trong Natto cho khuẩn lạc đồng đều về mặt hình thái. Khuẩn lạc có hình răng cưa ở rìa, màu trắng đục, bề mặt thô, lan trên bề mặt thạch, có hiện tượng bám chặt vào bề mặt môi trường. Hình 3.1. Khuẩn lạc vi khuẩn Hình 3.2. Hình dạng vi khuẩn dưới phân lập từ chế phẩm Natto kính hiển vi Kết quả nhuộm Gram cho thấy các chủng vi khuẩn đều có Gram dương. Tương tự như các chủng phân lập từ chế phẩm Natto của Bùi Thị Nhung (2013), thu nhận được kết quả các chủng đều có Gram dương. Hơn nữa, cũng theo Bùi Thị Nhung (2013), tế bào vi khuẩn có hình que, ngắn nhỏ, xếp đơn hoặc đôi, bắt màu tím giống với chủng vi khuẩn phân lập được khi quan sát dưới kính hiển vi. 40 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1.Kết quả thử nghiệm sinh hóa Chủng Các phản ứng sinh hóa phân NaCl Catalase Gelatine Starch Citrate VP lập 6,5% Natto + + + + + + + BI1 + + + + + + + BI2 + + + + + + + BI3 + + + + + + + BI4 + + + + + + + MN1 + + + + + + + MN2 + + + + + + + Su + + + + + + + Li + + + + + + + Yoi + + + + + + + Ba + + + + + + + Ghi chú: (+) phản ứng dương tính, (-) phản ứng âm tính Các chủng vi khuẩn được kiểm tra ở các chỉ tiêu về khả năng sinh Catalase, phân giải gelatine, Tinh bột, thử nghiệm citrate, VP và khả năng phát triển trong môi trường muối 6,5%. Đối với thí nghiệm Catalase, tất cả 11 chủng vi khuẩn đều cho kết quả dương tính do có sủi bọt khí. Thí nghiệm về khả năng phân giải gelatine được thí nghiệm cùng với thí nghiệm định tính protease tạo vòng phân giải, các chủng vi khuẩn cũng cho kết quả dương tính. Thí nghiệm phân giải tinh bột cho kết quả dương tính vì khi cho dung dich thuốc thử lugol vào đĩa thạch hiện lên vòng phân giải xung quanh giếng thạch. Thí nghiệm Citrate, môi trường từ xanh lá cây chuyển sang màu xanh dương chứng tỏ có sự sử dụng citrate như là nguồn C duy nhất nên cũng cho kết quả dương tính. Thí nghiệm 41 Đồ án tốt nghiệp VP cho thấy khả năng tạo thành acetoin của vi khuẩn khác nhau nên ống nghiệm chứa các chủng sẽ có màu đỏ khác nhau khi cho cùng một thể tích thuốc thử vào dịch nuôi cấy vi khuẩn – vi khuẩn có khả năng sinh acetoin càng cao thì màu đỏ càng đậm. Các chủng vi khuẩn cũng phát triển trong môi trường có nồng độ muối 6,5% NaCl. Theo khóa phân loại Bergey (2004) và các kết quả khảo sát đặc tính sinh học của mẫu phân lập từ natto kết luận mẫu phân lập được thuộc chi Bacillus 3.2 Khảo sát hoạt tính protease của vi khuẩn 3.2.1 Xác định dựa trên vòng phân giải Để đáng giá sơ bộ khả năng sinh protease của các chủng vi khuẩn Bacillus, tác giả đã tiến hành tuyển chọn các mẫu vi khuẩn có hoạt tính protease theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.3.1. Hình3.3. Đường kính vòng phân giải gelatine Bảng 3.2. Đường kính vòng phân giải Gelatine Chủng Đường kính vòng phân giải (mm) BI1 21,67a ± 1,86 42 Đồ án tốt nghiệp BI2 19,83bc ± 0.98 BI3 21,17ab ± 1,33 BI4 18,67cd ± 0,82 MN1 20,67ab ± 1,03 MN2 21,5a ± 1,38 Li 20bc ± 1,41 Yoi 18,17de ± 1,17 Ba 20,33ab ± 0,82 Su 17,17de ± 0,41 Na 21,67a ± 0,82 25 20 15 10 5 Đường Đường kính vòng phân giải (mm) 0 BI1 BI2 BI3 BI4 MN1 MN2 Li Yoi Ba Su Na Chủng vi khuẩn Bacillus Đồ thị 3.1. Đường kính vòng phân giải gelatine của chủng Bacillus Qua đồ thị kết hợp với xử lí thống kê cho thấy có các chủng có khả năng sinh hoạt tính protease phân giải gelatin trong môi trường. Trên đĩa thạch vòng phân giải cho thấy các chủng cho đường tính vòng phân giải lớn nhất là BI1, BI3, MN2 và Na. Trong khi đó, chủng cho vòng phân giải thấp nhất là 2 chủng Su và Ba. Theo như Bùi Thị Nhung 43 Đồ án tốt nghiệp (2013), các chủng Natto phân lập từ chế phẩm Natto sẽ cho đường kính vòng phân giải từ 2,1 cm đến 2,6 cm, mà ở đây chủng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm Natto cho kết quả là 22 mm. Từ đó có thể thấy chủng Na được phân lập cho kết quả đường kính vòng phân giải không quá lớn. 4 chủng vi khuẩn được chọn là BI1, BI3, MN2, Na được chọn để lên men bán rắn kiểm tra họat lực protease trên khô dầu đậu nành. 3.2.2 Xác định dựa trên cơ chất khô dầu đậu nành Bảng 3.3. Hoạt tính enzyme protease (U/g) Chủng 27h 40h 48h BI1 0,3426b±0,194 0,7819b±0,5743 1,5759b±0,4058 BI3 0,1894bc±0,1463 0,6489bc±0,6307 1,056bc±0,1677 MN2 0,0564c±0,0389 0,8464c±0,0419 0,2055c±0,1636 Natto 1,056a±0,3083 1,2051a±0,5599 2,6117a±0,4984 3 2.5 2 1.5 1 0.5 Hoạt tính Hoạt proteasetính (U/g) 0 0 giờ 24 giờ 40 giờ 48 giờ Thời gian BI1 BI3 MN2 Na Đồ thị 3.2. Hoạt tính enzyme sau các mốc thời gian Sau các mốc thời gian, các chủng Bacillus được chọn đều cho thấy hoạt lực enzyme có xu hướng tăng dần. Tuy nhiên có chủng MN2 giảm khi ở mốc 48 giờ. Nhìn 44 Đồ án tốt nghiệp chung ta có thể thấy đứng đầu là chủng Na sau đó là các chủng BI1, BI3 và MN2 là thấp nhất. Theo như Bùi Thị Nhung (2013), khả năng sinh tổng hợp proease của vi khuẩn cao nhất sau 48 giờ. Vào thời điểm này vi sinh vật đang ở thời kì đầu của pha tích tụ sản phẩm trao đổi chất, lượng enzyme sinh ra là cao nhất . Trước thời điểm trên thì vi sinh vật ở thời kì sinh trưởng chủ yếu tổng hợp protein và xây dựng tế bào nên tích tụ sản phẩm trao đổi chất rất ít. Tương tự, theo như Saba Imtiaz và cộng sự (2013), sau 24 giờ nuôi cấy, số lượng protease sản sinh là 59,0 U/g và tăng lên trong giai đoạn nuôi cấy và đạt lớn nhất sau 48 giờ nuôi cấy (75,0 U/g). Chủng được chọn là Na với khả năng sinh protease cao nhất so với 3 chủng còn lại. Kết quả giải trình tự gen 16S TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACA GCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGAC GGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGG AAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAA AAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGT TGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGG GTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGC AGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCG CGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAAC AAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAG CCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGC So sánh với trình tự 16S-rARN của loài vi khuẩn đã được định danh trong ngân hàng gen BLAST SEARCH. Kết quả này cho phép kết luận mẫu phân lập là Bacillus subtilis và được ghi nhận là chủng Na. 45 Đồ án tốt nghiệp Bacillus subtilis rất phổ biến trong tự nhiên như đất, rom, cỏ, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành khác nhau, đặc biệt là trong công nghiệp sản xuất enzyme do có thể tạo ra được nhiều loại enzyme như amylase, protease, lipase, cellulase, xylanase.. 3.3 Khảo sát các điều kiện lên men 3.3.1 Khảo sát độ ẩm thích hợp cho lên men Bảng 3.4. Kết quả tăng trưởng vi sinh vật qua các khung giờ ở các mức độ ẩm khác nhau 0h 24h 48h 72h 30% 1,92x106 5,80x107 1.08x108 4,05x108 40% 1,33x107 7,36x108 9,25x108 6,24 x108 50% 1,20x107 1.95x108 3,10x108 4,38 x108 60% 1,1x107 7,16x108 4,35x108 2,92 x108 70% 1,05x107 4,22x108 3,78x108 2,80 x108 46 Đồ án tốt nghiệp Khảo sát độ ẩm thích hợp 10 8 6 LogN 4 2 0 0h 24h 48h 72h Thời gian 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 Đồ thị 3.3. Sự tăng trưởng vi sinh vật qua các mốc thời gian ở các mức độ ẩm khác nhau Hình 3.4. Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu khô dầu nành lên men ở các mức độ ẩm khác nhau Mức độ tăng trưởng vi sinh vật ở các mức độ ẩm khác nhau là khác nhau. Nhìn chung các chủng vi sinh vật đều tăng lên về số lượng riêng ở mức độ ẩm 70%, mật độ giảm sau các mốc thời gian. Các mức độ ẩm ở các mốc thời gian cho số lượng khuẩn lạc khác nhau. Theo Saba Imtiaz và cộng sự (2013), tỉ lệ 1:1 (w/v) cơ chất và nước là 47 Đồ án tốt nghiệp thích hợp nhất cho sản xuất enzyme. Tương tự Sumaya Ali Hmood và cộng sự (2016) đã cho thấy độ ẩm tốt nhất để lên men cơ chất là tỉ lệ 1:1 (w/v). Tuy nhiên, ta có thể thấy trong thí nghiệm đã chứng minh mức độ ẩm thích hợp là 40% với các số liệu đã cho thấy mức độ tăng trưởng ở mức độ ẩm này thích hợp nhất. Theo Bùi Thị Nhung (2013), khi nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường bán rắn, độ ẩm môi trường có vai trò hết sức quan trọng nếu độ ấm thấp quá sẽ không đủ nước để vi sinh vật phát triển, còn khi độ ẩm quá lớn sẽ giảm độ xốp, ảnh hưởng tới quá trình trao đổi chất giữa thể rắn và thể khí. Theo Saba Imtiaz và cộng sự (2013), độ ẩm có thể do số lượng pha loãng ít gây thiếu để đáp ứng nhu cầu độ ẩm của vi sinh vật. Tăng độ pha loãng, điều kiện trở nên thích hợp cho phát triển vi khuẩn và sản sinh enzyme. Hơn nữa tăng mức độ ẩm kết quả là hình thành của chất nhày và điều kiện trở nên kị khí, không thích hợp cho sự phát triển sinh vật và do đó sản sinh enzyme bị giảm xuống. 3.3.2 Khảo sát nhiệt độ thích hợp cho lên men Bảng 3.5. Kết quả tăng trưởng vi sinh vật qua các khung giờ ở các mức nhiệt độ khác nhau Nhiệt độ 0h 24h 48h 72h 30oC 8.63x105 5.58 x108 1.67 x108 <105 37oC 2.53 x106 2.38 x109 3.71 x109 2.18 x109 45oC 4.50 x105 <105 <105 <105 50oC 1.12 x105 6.10 x107 <105 <105 48 Đồ án tốt nghiệp Nhiệt độ thích hợp 12 10 8 6 LogN 4 2 0 0h 24h 48h 72h Thời gian 30 37 45 50 Đồ thị 3.4. Sự tăng trưởng vi sinh vật qua các mốc thời gian ở các nhiệt độ khác nhau Hình 3.5. Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu khô dầu nành lên men ở các mức nhiệt độ khác nhau Từ kết quả điện di SDS-PAGE và kiểm tra mật độ vi sinh vật ta có thể thấy ở nhiệt độ 37oC vi sinh vật phát triển tốt hơn so với các mức nhiệt độ còn lại. Theo Theo Saba Imtiaz và cộng sự (2013), có sự gia tăng trong sản sinh protease kiềm khi nhiệt 49 Đồ án tốt nghiệp độ nuôi cấy được tăng từ 30 đến 37oC điểm mà sự sản sinh enzyme lớn nhất. Trên 37oC và lên đến 50oC có sự suy giảm trong tổng hợp sinh học protein kiềm bởi B. subtilis. Nhiệt độ cao hơn được tìm thấy có vài tác động đối nghịch với hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn. Enzyme bị biến tính bằng cách mất khả năng xúc tác do sự kéo dài và phá vỡ liên kết Hidro yếu trong cấu trúc enzyme bởi sự tăng nhiệt độ (Conn và cộng sự, 1987). Hầu hết vi khuẩn cho sự sinh trưởng tốt nhất và sản sinh protease ở khoảng nhiệt độ 30 đến 40oC (Joo và cộng sự, 2002).Nhiệt độ 37oC là thích hợp cho sự tăng trưởng và phát triển của vi sinh vật 3.3.3 Khảo sát độ dày thích hợp cho lên men cơ chất Bảng 3.5. Kết quả tăng trưởng vi sinh vật qua các khung giờ ở các mức độ dày khác nhau Độ dày 0h 24h 48h 72h 5 8 9 1 cm 2.15 x10 8.35 x10 3.31 x10 4.27x108 6 9 9 3 cm 1.83 x10 1.06 x10 5.56 x10 1.04 x109 6 8 8 5 cm 2.08 x10 6.03 x10 7.28 x10 2.90 x108 6 8 9 7 cm 1.84 x10 3.05 x10 1.39 x10 1.17 x108 Từ kết quả trên ta có thể thấy ở các mức độ dày, vi sinh vật phát triển và phân giải protein ở các mức độ khác nhau. Khả năng phát triển thấp nhất là ở mức độ dày 7 cm và cao nhất là 3 cm. Trong đó vi sinh vật phát triển mạnh nhất trong khoảng giai đoạn 24 đến 48 giờ nhưng lại suy giảm ở lúc 72 giờ một cách nhanh chóng (từ 5.56x109 xuống còn 1,04x109 cfu/g với độ dày là 3 cm). Ở các độ dày khác cũng tương tự với độ dày là 3 cm. 50 Đồ án tốt nghiệp Độ dày thích hợp 12 10 8 Log Log N 6 4 2 0 0h 24h 48h 72h 1cm 3cm 5cm 7cm Đồ thị 3.5. Sự tăng trưởng vi sinh vật qua các mốc thời gian ở các độ dày khác nhau Hình 3.6 Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu khô dầu nành lên men ở các mức độ dày khác nhau Từ hình chạy điện di thì đa phần protein đã được phân cắt thành nhiều phân tử nhỏ so với mẫu đối chứng và các độ dày khác. Độ dày thích hợp cho lên men cơ chất là 3 cm. Vi sinh vật đã phân giải protein thành các phân tử nhỏ hơn có kích thước khoảng 20 kDa. 3.3.4 Khảo sát thời gian lên men thích hợp 51 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.6. Kết quả tăng trưởng vi sinh vật qua các khung giờ khác nhau Thời gian 0h 24h 48h 72h Số lượng khuẩn lạc 7 9 9 9 1.22x10 1.77x10 5.12x10 3.92x10 (cfu/g) Từ kết quả kiểm tra mật độ vi sinh vật cho thấy vi sinh vật tăng trưởng nhiều nhất là sau 48 giờ sau đó giảm xuống ở mức 72 giờ. Tuy nhiên kết quả điện di cho thấy, mẫu khô dầu đậu nành lên men sau 72 giờ tốt hơn so với mẫu 48 giờ. Thời gian lên men thích hợp 12 10 8 6 LogN 4 2 0 0h 24h 48h 72h Thời gian Đồ thị 3.6. Sự tăng trưởng vi sinh vật qua các mốc thời gian khác nhau Theo như Theo Saba Imtiaz và cộng sự (2013), thời gian ủ liên hệ trực tiếp với sự sản sinh enzyme và các quá trình tổng hợp khác một mứ độ nhất định. Sau đó, sự sản sinh enzyme bắt đầu giảm xuống có thể quy cho sự suy giảm cung cấp dinh dưỡng đến vi sinh vật (Romeo và cộng sự, 1998). Các loài Bacillus được biết đến với sản sinh số lượng lớn nhất protease trong pha cân bằng hoặc sau pha tăng trưởng (Atalo và Gashe, 1993; Sharipova và cộng sự, 2000). Tuy nhiên, vài sự tổng hợp protease Bacilli 52 Đồ án tốt nghiệp trong suốt pha tăng trưởng, nhưng nó hầu như phụ thuộc vào thành phần môi trường và các yếu tố khác. Cũng như báo cáo là Bacillus sp. Sản sinh protease kiềm lớn nhất sau 48 ủ trong môi trường kiềm (Fujiwara và Yamamota, 1987). Hình 3.7 Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu khô dầu nành lên men ở các mức thời gian khác nhau Vào thời điểm 48 giờ đang ở kì đầu của pha tích tụ trao đổi chất, lượng enzyme sinh ra là lớn nhất. Trước thời điểm trên thì vi sinh vật ở thời kì sinh trưởng, chủ yếu tổng hợp protein và xây dựng tế bào nên tích tụ sản phẩm trao đổi chất rất ít. Sau 48 giờ trở đi thì lượng enzyme giảm đáng kể do tế bào bắt đầu tự phân và một số sản phẩm trao đổi chất trở thành nguồn sinh dinh dưỡng cho vi sinh vật. Do vậy sau khoảng thời gian 48 giờ, protease bắt đầu có tác động đến cơ chất lên men.Thời gian lên men thích hợp là 72 giờ. 53 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 1. Đã phân lập và tuyển chọn được chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao, phân giải các protein gây dị ứng trong khô dầu đậu nành 2. Tiến hành lên men bán rắn khô dầu đậu nành để phân giải glycinin và β- conglycinin với điều kiện lên men thích hợp là độ ẩm 40%, nhiệt độ là 37oC, độ dày cơ chất là 3 cm và thời gian lên men là 72 giờ. 4.2 Kiến nghị - Hoàn thiện quy trình sản xuất khô dầu nành lên men. - Tiến hành kiểm tra độ an toàn của sản phẩm lên men. - Định lượng hàm lượng glycinin và β-conglycinin còn lại sau khi lên men 54 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO ❖ Tài liệu trong nước 1. Bùi Thị Nhung (2013). Nghiên cứu tạo chế phẩm protease từ Bacillus có trong Natto Nhật Bản hướng tới thực phẩm chức năng. Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm TP.Hồ Chí Minh 2. Đỗ Thị Thu Nga (2011), Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của một số chủng Bacillus, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư Phạm Tp. HCM, tr. 30 – 36. 3. Đỗ Trần Ngoan (2007). Nghiên cứu tổng hợp protease kiềm tính bằng phương pháp lên men bởi tế bào vi khuẩn Bac.subtilis cố định, Luận văn Thạc sĩ Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách khoa Tp. Hồ Chí Minh, Tr. 4 – 16. 4. Đồng Thị Thanh Thu (2003), Sinh hóa ứng dụng, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh, tr.8 – 13. 5. Lê Thị Bích Phượng, Võ Thị Hạnh, Trần Thạnh Phong, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân, Lê Thị Hương (2012). “Phân lập và tuyển chọn một số chủng Bacillus sinh tổng hợp nattokinase”. Tạp chí Sinh học, 34, (3se). Tr 99 – 104. 6. Lê Thị Huyền (2016), Sử dụng enzyme protease từ Bacillus spp.để thủy phân protein bánh dầu làm chế phẩm sinh học, 7. Nguyễn Hoài Hương (2016), Thực hành Công nghệ enzyme, Đại học Công nghệ Tp. HCM 8. Nguyễn Thùy Dương (20120. Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng cellulase ở một số chủng Bacillus phân lập từ đất vườn, Luận văn Thạc sĩ Sinh học. Trường Đại học Sư phạm TP. HCM, tr. 33 – 38. 9. Phạm Minh Nhựt (2016). Các phương pháp phân tích vi sinh, Đại học Công nghệ Tp.HCM. 10. Trần Ngọc Hùng (2010), Nghiên cứu tạo chế phẩm protease từ Bacillus subtilis sử dụng trong chế biến thức ăn gia cầm, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, tr. 36 – 42. 11. Trần Thanh Thủy (1999), Hướng dẫn thực hành sinh hóa vi sinh vật, Nxb Giáo dục, tr. 45 – 56, 97 – 102. 12. Trần Thị Bích Quyên (2012), Nghiên cứu và tuyển chọn một số chủng Bacillus làm probiotic trong chăn nuôi, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh, tr. 33 – 43. 13. Võ Thị Xuyến (2006), Bước đầu nghiên cứu tạo chế phẩm cellulase từ một số chủng vi sinh vật và khả năng thủy phân cellulose, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Tp. Hồ Chí Minh. ❖ Tài liệu nước ngoài 55 Đồ án tốt nghiệp 14. Anderson RL, Wolf WJ, 1995. Compositional changes in trypsin inhibitors, phytic acid, saponins and isoflavones related to soybean processing. The Journal of Nutrition 125:581S-588S. 15. Beardslee TA, Zeece MG, Sarath G, Markwell JP (2000). Soybean glycinin G1 acidic chain shares IgE epitopes with peanut allergen Arah 3. International archives of allergy and immunology 123(4): 299-307. 16. Carević M, Banjanac K, Ćorović M, Jakovetić S, Milivojević A, Vukašinović- Sekulić M, Bezbradica D, 2016. Selection of lactic acid bacteria strain for simultaneous productionof α- and β-galactosidases. Scientific paper, Zastita Materijala 57: 265 – 273. 17. Cervantes-Pahm SK, Stein HH, 2010. Ileal digestibility of amino acids in conventional, fermented, and enzyme-treated soybean meal and in soy protein isolate, fish meal, and casein fed to weanling pigs. J Anim Sci 88: 2674-2683. 18. Chen CC, Shih YC, Chiou PWS, Yu B, 2010. Evaluating nutritional quality of single stage- and two stage-fermented soybean meal. Asian-Aust. J Anim Sci 23: 598-606. 19. Cho JH, Min BJ, Chen YJ, Yoo JS, Wang Q, Kim JD, Kim IH, 2007. Evaluation of FSP (Fermented soy protein) to replace soybean meal in weaned pigs: Growth performance, blood urea nitrogen and total protein concentrations in serum and nutrient digestibility. Asian-Aust. J Anim Sci 20: 1874-1879. 20. Choct M, Annison G, 1992. Anti-nutritive effect of wheat pentosans in broiler chickens: Roles of viscosity and gut microflora. British Poultry Science 33: 821-834. 21. CruzR, BastistelaJC, Wosiacki G, 1981. Microbial α-galactosidase for soybean processing.J.Food Sci. 46: 1196-1200. 22. Dey PM and Pridham JB, 1972. BioChemistry of α-galactosidase. Adv Enzymol 36:911-930. 23. Doyle JJ, Schuler MA, Godette WD, Zenger V, Beachy RN, SlightomJL, 1986. The glycosylated seed storage proteins of Glycine max and Phaseolus vulgaris. Structural homologies of genes and proteins. J Biol Chem261:9228- 9238. 24. Du XY, Mao CQ, Gao XY, Cui ML, He GQ, 2012. Screening of lactic acid bacteriafor producing α-galactosidase from Chinese traditional fermented foods. Advance Journal of Food Science and Technology 4(6): 372-376. 25. Feng J, Liu X, Xu ZR, Liu YY, Lu YP, 2007a. Effects of Aspergillus oryzae 3.042 fermented soybean meal on growth performance and plasma biochemical parameters in broilers. Anim Feed Sci Technol 134: 235-242. 56 Đồ án tốt nghiệp 26. Feng J, Liu X, Xu ZR, Wang YZ, Liu JX, 2007b. Effects of fermented soybean meal on digestive enzyme activitiesand intestinal morphology in broilers. Poultry Science 86:1149-1154. 27. Frias J, Song YS, Martínez-Villaluenga C, De Mejia EG, Vidal-Valverde C, 2007. Immunoreactivity and amino acid content of fermented soybean products. Journal of agricultural and food chemistry 56(1): 99-105. 28. Fuller R, 1992. History and development of probiotics. In: Probiotics - The Scientific Basis. Chapman and Hall, London, England 1-8. 29. Gao YL, Wang CS, Zhu QH, Qian GY, 2013. Optimization of solid-state fermentation with Lactobacillus brevis and Aspergillus oryzae for trypsin inhibitor degradation in soybean meal. Journal of Integrative Agriculture 12(5): 869-876. 30. Gebru E, Lee JS, Son JC, Yang SY, Shin SA, Kim B, Park SC,2010. Effect of probiotic-, bacteriophage-, or organic acid-supplemented feeds or fermented soybean meal on the growth performance, acute-phase response, and bacterial shedding of grower pigs challenged with Salmonella enterica serotype Typhimurium. Journal of animal science 88(12): 3880-3886. 31. Golubovic M, van Hateren SH, Ottens M, Witkamp GJ, van der Wielen LAM, 2005. Novel method for the production of pure glycinin from soybeans. J Agric Food Chem 53:5265-9. 32. Guan J, Yang G, Yin H, Jia F, Wang F, 2014. Particle size for improvement of peptide production in mixed-culture solid-state fermentation of soybean meal and the corresponding kinetics. American Journal of Agriculture and Forestry 2(1): 1-6. 33. Hao Y, Zhan Z, Guo P, Piao X, Li D, 2009. Soybean β-conglycinin-induced gut hypersensitivity reaction in a piglet model. Archives of Animal Nutrition: 63(3), 188-202 34. Helm RM, Cockrell G, Connaughton C, Sampson HA, Bannon GA, Beilinson V, Burks AW, 2000. A soybean G2 glycinin allergen. 2. Epitope mapping and three dimensional modeling. International archives of allergy and immunology 123(3): 213-219. 35. Hou DH, Chang SKC, 2004. Structural characteristics of purified glycinin from soybeans stored under various conditions. J Agric Food Chem 52:3792- 800. 36. Hu Y, Ge C, Yuan W, Zhu R, Zhang W, Du L, Xue J, 2010. Characterization of fermented black soybean natto inoculated with Bacillus natto during fermentation. Journal of the Science of Food and Agriculture 90(7): 1194- 1202. 37. Imtiaz S, Mukhtar H, ul-Haq I, 2013. of alkaline protease by Bacillus subtilis using solid state fermentation. Afr J Mic Res 7:1558-1568. 57 Đồ án tốt nghiệp 38. Khan MA, Ahmad N, Zafar UA, Nasir IA, Qadir MA, 2011. Isolation and screening of alkaline protease producing bacteria and physio-chemical characterization of the enzyme. Afr. J. Biotech., 10(33): 6203-6212. 39. Kim SW, Heugten EV, Ji F, Lee CH, Mateo RD, 2014. Fermented soybean meal as a vegetable protein source for nursery pigs: I. Effects on growth performance of nursery pigs. J Anim Sci 88:214-224. 40. Ksenija Taski-Ajidukovic, Vuk Djordjevic, Milos Vidic, Mika Vujakovic (2010), Subunit composition of seed storage protein in high-protein soybean genotypes 41.