Đồ án Nghiên cứu sản xuất vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus tăng cường phân hủy thức ăn thừa tạo phân bón lá

o. Các số liệu trích dẫn trong đồ án tốt nghiệp này là hoàn toàn trung thực. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đồ án của mình. TP Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 08 năm 2017 Sinh viên thực hiện Huỳnh Phương Thảo Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án này em đã nhận được nhiều sự quan tâm giúp đỡ của Thầy Cô, gia đình và bạn bè. Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gủi đến cô Nguyễn Thị Hai đã luôn tận tình quan tâm hướng dẫn và chỉ bảo em trong suốt quá trình học tập cho đến khi xây dựng đề cương và hoàn thành đồ án này. Em xin chân thành cám ơn quý Thầy Cô khoa Công nghệ sinh học- Thực phẩm - Môi trường đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt quá trình học tập tại đây. Em xin gửi lời cám ơn đến gia đình đã luôn đã chăm sóc,dạy dỗ và hỗ trợ em cũng như luôn bên cạnh và làm chỗ dựa tinh thần cho em. Em cũng xin gửi lời cám ơn đến tất cả các anh chị và bạn bè cùng thực hiện đề tài trong phòng thí nghiệm đã luôn quan tâm, giúp đỡ và chia sẻ với em khi thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Cuối cùng em xin gửi lời cám ơn đến quý Thầy Cô trong Hội đồng phản biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án này. Với điều kiện thời gian cũng như kinh nghiệm còn hạn chế của một sinh viên, đồ án này không thể tránh được những thiếu sót. Em rất mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của quý Thầy Cô để em có điều kiện bổ sung, nâng cao kiến thức của mình, nhằm phục vụ tốt hơn công tác thực tế sau này. Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến quý Thầy Cô. Em xin chân thành cám ơn! TP Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 08 năm 2017 Sinh viên thực hiện Huỳnh Phương Thảo Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG ............................................................................................................... vi DANH MỤC HÌNH ................................................................................................................ vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................................. vi MỞ ĐẦU ...................................................................................................................................1 1. Tính cấp thiết của đề tài.......................................................................................................1 2. Tình hình nghiên cứu ...........................................................................................................2 2.1. Tình hình nghiên cứu enzyme protease trong nước..................................................... 2 2.2. Tình hình nghiên cứu enzyme protease ngoài nước .................................................... 2 2.3. Tình hình nghiên cứu sử dụng Bacillus subtilis và Lactobacillus tạo phân bón vi sinh. ........................................................................................................................................... 4 2.4. Tình hình chất thải thực phẩm thừa. .............................................................................. 6 3. Mục đích nghiên cứu ...........................................................................................................7 4. Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................................8 4.1 - Phương pháp tổng hợp tài liệu ...................................................................................... 8 4.2 - Phương pháp thu thập và xử lí số liệu.......................................................................... 8 5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ......................................................................................8 6. Kết quả đạt được ..................................................................................................................8 7. Ý nghĩa đề tài ........................................................................................................................9 8. Kết cấu đồ án ........................................................................................................................9 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................. 10 1.1.Tổng quan về vi sinh vật dùng để phối trộn vào thức ăn thừa .................................. 10 1.1.1. Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus subtilis ................................................................... 10 1.1.2. Giới thiệu về vi khuẩn Lactobacillus........................................................................ 15 1.2. Tổng quan về enzyme.................................................................................................... 20 1.2.1. Enzyme protease ......................................................................................................... 20 1.2.2. Enzyme amylase .......................................................................................................... 24 1.2.3. Enzyme cellulase ......................................................................................................... 28 1.3.Tổng quan về phân bón .................................................................................................. 30 i Đồ án tốt nghiệp 1.3.1.Khái niệm ...................................................................................................................... 30 1.3.2. Phân loại ...................................................................................................................... 31 1.3.3. Thành phần dinh dưỡng ............................................................................................. 33 1.3.4. Ưu điểm của phân bón hữu cơ .................................................................................. 33 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP............................................................. 334 2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ........................................................................ 34 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu .................................................................................................. 34 2.1.2. Thời gian nghiên cứu ................................................................................................. 34 2.2. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................................ 34 2.2.1. Nguồn vi sinh vật ........................................................................................................ 34 2.2.2. Hóa chất và môi trường ............................................................................................. 35 2.3.Thiết bị và dụng cụ ......................................................................................................... 36 2.3.1. Thiết bị ......................................................................................................................... 36 2.3.2. Dụng cụ ........................................................................................................................ 36 2.4.1. Bố trí thí nghiệm chung.............................................................................................. 37 2.4.2. Bố trí thí nghiệm chi tiết ............................................................................................ 38 2.5. Phương pháp nghiên cứu............................................................................................... 52 2.5.1. Phương pháp tăng sinh .............................................................................................. 52 2.5.2. Phương pháp pha loãng mẫu .................................................................................... 52 2.5.3. Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc............................................................. 53 2.5.4. Phương pháp quan sát hình thái tế bào ................................................................... 54 2.5.5. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật .................................................... 55 2.5.6. Phương pháp đục lỗ thạch......................................................................................... 56 2.5.7. Phương pháp nghiên cứu khả năng phân giải tinh bột, protein, cellulose. ........ 57 2.5.8. Phương pháp xử lí số liệu .......................................................................................... 58 2.5.9. Xác định mật độ tế bào VSV ...................................................................................... 58 2.5.10. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn. .................................................................................................................... 59 2.5.11. Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn ....................................................................................................................... 60 ii Đồ án tốt nghiệp 2.5.12. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn. ....................................................................... 61 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 63 3.1. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân tinh bột sinh, cellulse và protein của các chủng BM13 và BDH ........................................................................................................... 63 3.1.1. Kết quả khảo sát khả năng phân giải tinh bột của các chủng vi khuẩn BM và BDH. ...................................................................................................................................... 65 3.1.2. Kết quả khảo sát khả năng phân giải protein của các chủng vi khuẩn BM và BDH. ...................................................................................................................................... 65 3.1.3. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân CMC của các chủng vi khuẩn BM và BDH. ...................................................................................................................................... 67 3.2. Kết quả khẳng định lại đặc điểm hình thái của chủng BDH4 ................................. 63 3.2.1. Kết quả nhuộm Gram ................................................................................................. 70 3.2.2. Kết quả nhuộm bào tử ................................................................................................ 70 3.3. Kết quả khẳng định lại đặc điểm hình thái của chủng L2 ........................................ 71 3.4. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của chủng Bacillus subtilis BDH4 với Lactobacillus L2 .................................................................................................................... 73 3.5. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme protease của 2 chủng Bacillus subtilis BDH4 với Lactobacillus L2 khi trộn chung với nhau ...................................................... 74 3.6. Khảo sát điều kiện nuôi cấy để nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis BDH4. 75 3.6.1. Thời gian nuôi cấy ...................................................................................................... 75 3.6.2. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng BDH4. .......................................................................................................................... 77 3.7. Khảo sát điều kiện nuôi cấy để nhân sinh khối vi khuẩn Lactobacillus L2. .......... 78 3.7.1. Thời gian nuôi cấy ...................................................................................................... 78 3.7.2. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn L2 ................................................................................................................. 80 3.8. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của chủng BDH4.................................................................................................................... 82 3.9. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của chủng L2 ........................................................................................................................ 827 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................................. 92 iii Đồ án tốt nghiệp 1. Kết luận .............................................................................................................................. 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................... 93 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT ...................................................................................................... 93 TÀI LIỆU TIẾNG ANH ....................................................................................................... 97 iv Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH BẢNG Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis (Theo Holt,1992) ........... 13 Bảng 2.1. Danh sách các chủng vi khuẩn BM và BDH được chọn để khảo sát ........... 34 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân tinh bột sinh amylase của các chủng vi khuẩn BM và BDH................................................................................................ 63 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân protein sinh enzyme protease của các chủng vi khuẩn BM và BDH ......................................................................................... 65 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân CMC sinh enzyme cellulase của các chủng vi khuẩn BM và BDH................................................................................................ 67 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BDH4 ...................................................................................................................................... 75 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng BDH4 ....................................................................................................... 77 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn L2 ................................................................................................................. 78 Bảng 3.7. Khảo sát pH ban đầu của môi trường đến sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn L2 ................................................................................................................................. 80 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của chủng BDH4............................................................................................. 82 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát môi trường nuôi cấy đến sự ST và khả năng sinh enzyme của chủng L2 ........................................................................................................... 87 v Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH HÌNH Hình 1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis.............................................................................. 11 Hình 1.2. Hình dạng tế bào của một số chủng vi khuẩn Lactobacillus .................... 17 Hình 2.1. Sơ đồ tổng quan bố trí các bước thí nghiệm ............................................... 37 Hình 2.2. Sơ đồ quy làm thuần các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BM và BDH 38 Hình 2.3. Sơ đồ quy trình làm thuần chủng Lactobacillus L2 ................................... 40 Hình 2.4. Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng sinh enzyme protease của các chủng BM và BDH ...................................................................................................................... 42 Hình 2.5. Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng sinh enzyme amylase của các chủng BM và BDH ...................................................................................................................... 44 Hình 2.6. Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng vi khuẩn BM và BDH ........................................................................................................... 46 Hình 2.7. Khảo sát tính đối kháng của hai chủng VSV được tuyển chọn dùng để phối trộn vào thức ăn thừa. .............................................................................................. 48 Hình 2.8. Khảo sát ảnh hưởng pH đến khả năng sinh enzyme protease của chủng Bacillus subtilis được tuyển chọn ................................................................................... 50 Hình 3.1. Vòng phân giải tinh bột của các chủng BM và BDH ............................... 64 Hình 3.2. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân tinh bột sinh enzyme amylase của các chủng vi khuẩn BM và BDH .................................................................................... 64 Hình 3.3. Khả năng thủy phân protein sinh enzyme protease cuả các chủng BM và BDH ................................................................................................................................... 65 Hình 3.4. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân protein sinh enzyme protease của 65 chủng vi khuẩn BM và BDH........................................................................................... 66 Hình 3.5. Vòng phân giải CMC của các chủng BM và BDH sau 48 giờ ................. 67 Hình 3.6. Vòng phân giải CMC của 6 chủng vi khuẩn BM và BDH sau 2 ngày nuôi cấy ................................................................................................................................... 68 Hình 3.7. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng Bacillus subtilis BDH4 nhuộm Gram trên kính hiển vi x100 .............................................................................. 70 vi Đồ án tốt nghiệp Hình 3.8 – Kết quả nhuộm bào tử chủng vi khuẩn BDH4 ......................................... 71 Hình 3.9. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng s L2 nhuộm Gram trên kính hiển vi x100 .............................................................................................................. 72 Hình 3.10. Khả năng đối kháng chủng Bacillus subtilis BDH4 với Lactobacillus L2 ................................................................................................................................... 73 Hình 3.11. Khả năng sinh enzyme protease khi trộn 2 chủng vi khuẩn BDH4 và L2 . ................................................................................................................................... 74 Hình 3.13. Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng BDH4 sau 36 giờ nuôi cấy................................................................................... 77 Hình 3.14. Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn L2 ............................................................................................................ 79 Hình 3.16. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy cho sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme amylase của chủng BDH4................................................................................. 83 Hình 3.17. Môi trường nuôi cấy chủng Bacillus subtilis BDH4 .............................. 83 Hình 3.18. Hình thái khuẩn lạc chủng BDH4 khi nuôi cấy trên từng loại môi trường ............................................................................................................................... 84 Hình 3.19. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme amylase của chủng vi khuẩn BDH4 ..................................................................................................... 85 Hình 3.20. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme protease của chủng vi khuẩn BHD4 ..................................................................................................... 86 Hình 3.21. Ảnh hưởng môi trưởng nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme protease của chủng L2 ....................................................................................... 88 Hình 3.22. Môi trường nuôi cấy chủng vi khuẩn Lactobacillus L2 .......................... 88 Hình 3.23. Hình thái khuẩn lạc chủng L2 khi được nuôi cấy trên 4 môi trường.... 89 Hình 3.24. Kết quả khảo sát khả năng sinh amylase của chủng L2 được nuôi cấy trên 4 loại môi trường....................................................................................................... 90 Hình 3.25. Kết quả khảo sát khả năng sinh protease của chủng L2 được nuôi cấy trên 4 loại môi trường....................................................................................................... 90 vii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Food and Agriculture Organization of FAO the United Nations MĐVSV Mật độ vi sinh vật NA Nutrient agar NB Nutient broth ĐKVPG Đường kính vòng phân giải VSV Vi sinh vật viii Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Xã hội ngày càng phát triển, những tiến bộ về khoa học và kĩ thuật làm cho cuộc sống con người có những thay đổi lớn. Ngành công nghiệp dịch vụ ăn uống mở rộng. Hàng ngày, một lượng lớn thức ăn thừa được thải bỏ từ các nhà hàng, khách sạn dịch vụ ăn uống. Việc gia tăng lượng thức ăn thừa đang là vấn nạn trên phạm vi toàn cầu (Syeda Azeem Unnisa, 2015). Ở Việt Nam, chỉ một lượng nhỏ thức ăn thừa được thu hồi để làm thức ăn chăn nuôi. Đa phần, thức ăn thừa được đổ bỏ theo rác sinh hoạt. Thức ăn thừa là nguồn rác thải thải giàu chất hữu cơ nên việc đổ thức ăn thừa theo rác thải thường tạo ra mùi hôi, là nơi trú ẩn của côn trùng và vi sinh vật có hại đến sức khỏe con người (Jayathilakan et al , 2012). Ngoài ra,việc phân hủy thức ăn thừa tại các bãi rác tạo ra một lượng không nhỏ CH4 và CO2 tác nhân gây hiệu ứng nhà kính. Vì vậy, Syeda Azeem Unnisa, (2015) cho rằng, việc xử lý thức ăn thừa tại các bãi rác là không tốt cho môi trường và kém bền vững. Các tác giả cho biết, sử dụng các vi khuẩn như Bacillus subtilis và Lactobacillus spp. để phân hủy thức ăn thừa trong điều kiện thiếu oxy, tạo phân bón dạng lỏng là một hướng đi đầy triển vọng vừa làm giảm ô nhiễm môi trường, vừa tạo được phân bón hữu cơ thay thế cho phân bón vô cơ trong sản xuất nông nghiệp. Trong số các chủng vi sinh vật được dùng để phối trộn vào thức ăn thừa để chế tạo phân bón vi sinh thì có hai chủng được biết đến nhiều là Bacillus subtilis và Lactobacillus (Ieshita et al. 2011, Syeda Azeem Unnisa, 2015). Tuy nhiên, ở Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn để phân hủy thức ăn thừa, tạo phân bón dạng lỏng. Xuất phát từ thực tế trên, nhóm sinh viên tiến hành thực hiện đề tài “ Nghiên cứu sản xuất vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus tăng cường phân hủy thức ăn thừa tạo phân bón lá”. 1 Đồ án tốt nghiệp 2. Tình hình nghiên cứu 2.1. Tình hình nghiên cứu enzyme protease trong nước Phạm Thị Ngọc Lan và cộng sự (2005), đã tuyển chọn từ 70 chủng vi khuẩn phân giải protein (phân lập từ ao nuôi tôm) hai chủng có hoạt tính protease mạnh là P42 và P62. Đã khảo sát điều kiện sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp protease của chúng. Kết quả cho thấy, trong môi trường Vinogradski dịch thể cả hai chủng vi khuẩn đều thích nghi với pH môi trường là 8.0, thời gian nuôi cấy 42 giờ ở nhiệt độ 300C. Chủng P42 thích hợp với nguồn carbon là rỉ đường còn chủng P62 là glucose và cả hai chủng vi khuẩn sinh trưởng phát triển cũng như sinh tổng hợp protease mạnh nhất với nguồn nitrogen là gelatine. (Phạm Thị Ngọc Lan và Nguyễn Công Minh, 2005) Nguyễn Văn Hiếu và ctv (2010), đã tuyển chọn và nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp protease kiềm của chủng B. subtilis HT24 phân lập ở Việt Nam. T9. Nguyễn Hiền Trang và ctv (2010), cũng tuyển chọn và nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh tổng hợp enzyme protease ngoại bào của vi khuẩn B.amyloliquefaciens. Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009. Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng Bacillus phân lập từ đất vườn sinh protease kiềm. 2.2. Tình hình nghiên cứu enzyme protease ngoài nước Protease chiếm khoảng 60% tổng số enzyme thương mại trên thế giới và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Trong công nghiệp sản xuất enzyme thường sử dụng vi sinh vật để sản xuất protease bởi chúng có thời gian sinh trưởng nhanh và chi phí thấp, đem lại lợi ích kinh tế cho việc thương mại hóa sản phẩm (Lưu Thị Nguyệt Minh, 2007). 2 Đồ án tốt nghiệp Naidu K.S và ctv (2005) xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động của protease là 550C ở pH 9 với tỷ lệ giống 4% (w/v) cấy trong môi trường có chứa cám gạo 1% sau 96 giờ. (Naidu K.S.B., Devi K.L, 2005). Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu khác nhau về hoạt tính enzyme protease của các chủng Bacillus, đặc biệt là Bacillus subtilis. (Đỗ Thị Bích Thủy, 2012). Tác giả Kumar và cộng sự (2010) đã cố định tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis vào các chất mang khác nhau, sau đó đem nuôi cấy để thu enzyme protease có hoạt độ cao nhất là 10,8 UI/ml trên chất mang gelatin (Kumar R. and Vats R, 2010). Yang và ctv (2000) đã nghiên cứu khả năng tách protein trong phế thải vỏ tôm, cua, tôm hùm của chủng vi khuẩn B. subtilis bằng cách lên men trong môi trường lỏng với các phế thải chưa xử lí. Tác giả cho thấy rằng hiệu quả tách protein của chủng này khá cao, nó tách protein khỏi vỏ tôm, cua, tôm hùm lần lượt là 88%, 67% và 83% trong điều kiện nuôi cấy ở 30oC, thời gian là 96 giờ (Yang J.K., Shih I.L., Tzeng Y.M., Wang S.L, 2000). Ghafoor và ctv (2008) cùng nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho sản xuất protease ngoại bào từ B. subtilis AG-1 và B. subtilis EAG-1. Kết quả pH môi trường tối ưu lần lượt là 7 và 7,2, nhiệt độ là 35oC và 37oC, thể tích ủ khoảng 1% (v/v). Thời gian nuôi cấy thích hợp từ 24 - 32 giờ cho cả hai chủng (Ghafoor A., Hasnain S, 2008). Das và ctv (2010) nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp để B. subtilis sản xuất protease với lượng lớn. Vi khuẩn Bacillus subtilis tăng trưởng tối ưu ở 37ºC trong 48 giờ ở pH 8,0 với nguồn carbon và nitơ thử nghiệm với tối ưu tăng trưởng trong dextrose và peptone tương ứng sản xuất protease tốt nhất, được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp. 3 Đồ án tốt nghiệp Hindhumathi và ctv (2011) đã xác định điều kiện tối ưu cho sinh tổng hợp protease ngoại bào của chủng vi khuẩn Bacillus GPA4. Trong môi trường nuôi cấy có bổ sung 0,1% casein, với nguồn carbon là glucose, nguồn nitrogen là bột đậu nành, pH 8,0, thời gian nuôi cấy 24-36 giờ, tốc độ lắc 100 vòng/phút ở nhiệt độ 30oC chủng vi khuẩn có khả năng sản xuất enzyme với hoạt độ protease mạnh nhất (Hindhumathi M., Vijayalakshmi S., Thankamani V, 2011). 2.3. Tình hình nghiên cứu sử dụng Bacillus subtilis và Lactobacillus tạo phân bón vi sinh. 2.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước. Phạm Văn Toản đã nghiên cứu áp dụng công nghệ mới nhằm mở rộng việc sản xuất, ứng dụng phân VSV cố định đạm và phân giải lân phục vụ phát triển nông nghiệp bền vững. (Phạm Văn Toản , 2002). Lê Thị Thanh Thủy đã chọn được chủng Bacillus velezensis (kí hiệu M), Bacillus subtilis (kí hiệu Ba51), chủng Bacillus polymyxa (kí hiệu B14) và chủng Lactobacillus farraginis (kí hiệu L15) được phân lập từ các vùng trồng ớt và các cây họ cà, các chế phẩm sinh học và sản phẩm lên men truyền thống trong việc tạo chế phẩm VSV hỗn hợp để nâng cao năng suất , chất lượng và hiệu quả trồng trọt của ớt cay và ớt ngọt thông qua việc ứng dụng chế phẩm làm tăng hiệu quả sử dụng dinh dưỡng và hạn chế bệnh héo rũ, thối quả cho cây trồng (Lê Thị Thanh Thủy, 2010). Nguyễn Văn Thao và ctv,đã sử dụng hỗn hợp các chế phẩn VSV gồm: CPVSV1 ( Penicillum sp, Aspergillus sp., Psendomonas sp., Saccharomyces sp, Bacillus sp, Streptomyces sp); CPVSV2 (Aspergillus oryzae, Bacillus subtilis; Bacillus mycodes; Streptomyces sp. F; Saccharomyces cerevisiae); CPVSV3(Bacillus subtilis, Streptomyces sp. F, Aspergillus oryzae, Kluyveromyces marxianus, Trichoderma spp) để sản xuất phân hữu cơ sinh học từ bã nấm và phân 4 Đồ án tốt nghiệp 2.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Rengathavasi và ctv (2011) đã phân lập được chủng Lactobacillus delbrueckii từ bánh dầu có khả năng phân giải dầu thô một cách tự nhiên và dùng bổ sung trong xử lý phân giải sinh học đồng thời phối trộn vào phân bón cho hiệu quả cao. Kengo Yamada và Hui-Lian Xu (2008) đã chứng minh được tác động có lợi trực tiếp của phân bón vi sinh chứa các vi sinh vật như Lactobacillus spp, nấm actinomycetes và nấm men cũng như tác động gián tiếp của các sản phẩm chuyển hóa 2.3.3. Tình hình sử dụng phân bón VSV ở Việt Nam Các nhóm VSV chính sử dụng làm phân bón sinh học bao gồm: VSV cố định nitơ, VSV phân giải hợp chất photpho khó tan, VSV tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật, VSV đối kháng VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng và VSV chuyển hoá chất hữu cơ. Theo số liệu của Hiệp hội Phân bón Việt Nam (FAV), nhu cầu phân bón ở Việt Nam hiện nay vào khoảng trên 10 triệu tấn các loại. Trong đó, Urea khoảng 2 triệu tấn, DAP khoảng 900.000 tấn, SA 850.000 tấn, Kali 950.000 tấn, phân Lân trên 1,8 triệu tấn, phân NPK khoảng 3,8 triệu tấn, ngoài ra còn có nhu cầu khoảng 400.000 - 500.000 tấn phân bón các loại là vi sinh, phân bón lá.Tuy nhiên, theo thông tin thực tế thì hiệu suất sử dụng phân bón hiện nay mới chỉ đạt 40-45% với phân đạm, 25-30% với phân lân và khoảng 55-60% với phân kali. Như vậy, nếu ước tính hiệu suất sử dụng các loại phân bón trung bình khoảng 45-50%, có nghĩa lượng ...tổng hợp enzyme, để tăng lượng enzyme trong môi trường cần lựa chọn nguồn C,N thích hợp. Đối với chủng Bacillus subtilis thì khi môi trường nuôi cấy tăng sinh có bổ sung thêm rỉ đường nồng độ 2% thì hiệu quả sinh tổng hợp protease sẽ là tốt nhất (Cohn, 1872), trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật thu enzyme protease cần phải có chất cảm ứng và các nguồn nitơ hữu cơ (Nakano và ctv, 1998). 1.2.1.5. Ứng dụng Protease từ vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp và dược phẩm như công nghiệp chế biến thực phẩm (chế biến cá, thịt, sữa, làm bánh mìhay sản 23 Đồ án tốt nghiệp xuất các thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein cho những người bị bệnh tiêu hóa do dạ dày, tụy tạng hoạt động không bình thường, thiếu enzyme (Nakano và ctv, 1998) Protease còn được ứng dụng rộng rãi trong thức ăn chăn nuôi dưới dạng phối trộn hoặc probiotic như: enzymebiosub của công ty vaxcin và sinh phẩm số 2, Baciflora for Shrimp, VIME.. 1.2.2. Enzyme amylase Amylase là enzyme xúc tác làm cho quá trình thủy phân tinh bột, glycogen và các polysaccharide tương tự diễn ra nhanh hơn, theo tính chất và tính đặc hiệu với liên kết glucoside, amylase được chia làm ba loại là α-amylase, β-amylase và glucoamylase (γ- amylase), tuy nhiên các chủng Bacillus thường chỉ có khả năng tổng hợp được α-amylase mà không tổng hợp được β-amylase và glucose amylase. Trong số khoảng 100 enzyme công nghiệp thì có hơn một nửa là có nguồn gốc từ nấm mốc và 1/3 từ vi khuẩn. Enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật được ưa chuộng hơn so với từ những nguồn khác vì chúng rẻ hơn, dễ kiểm soát, nguyên liệu dễ tìm và khả năng thu hồi và tinh sạch đơn giản hơn do chúng không chứa các hợp chất không mong muốn như phenol (ở thực vật) và chất ức chế enzyme (ở động vật) (Nguyễn Hoài Hương, 2015). Tuy nhiên trên thực tế thì phần lớn enzyme được sản xuất từ một số nhỏ chi như Aspergillus, Bacillus, Trichoderma, Saccharomyces 1.2.2.1. Lịch sử phát hiện Những nghiên cứu đầu tiên về enzyme amylase được bắt đầu vào những năm 1811-1814. Những nghiên cứu này do nhà bác học người Nga – viện sĩ K.S Kirhof thực hiện nhằm nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết dại mạch nảy mầm (malt) và nhận thấy rằng trong malt có chứa các chất phân giải tinh bột thành đường. Amylase thường được tìm thấy trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn. 24 Đồ án tốt nghiệp 1.2.2.2. Cấu tạo enzyme và cơ chế hoạt động α-amylase là enzyme xúc tác làm cho quá trình thủy phân liên kết α-1,4 glucozid nội mạch ở trong phân tử tinh bột được diễn ra có cơ chất là amylose. α-amylase cho ra sản phẩm thủy phân chủ yếu là maltose (khoảng 87%) và một ít glucose với cơ chất là amylopectin, α-amylase chỉ thủy phân liên kết 1,4 mà không thủy phân được liên kết 1,6 trong phân tử tinh bột. và theo Nguyễn Thị Trần Thụy thì trong họ Bacillus thường gặp rất nhiều chủng phát triển ở nhiệt độ không cao nhưng lại sinh ra α-amylase chịu nhiệt cao (Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2013). 1.2.2.3. Vi sinh vật tiết enzyme amylase Các vi sinh vật được sử dụng nhiều nhất trong việc sản xuất và thu enzyme amylase là nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Các chủng nấm mốc hay được sử dụng như: Aspergillus, Rhizopus. Các chủng nấm men hay được sử dụng như: Candida, Saccharomyces, Endomycospsis, Endomyces. Các chủng vi khuẩn hay được sử dụng như: Bacillus mesentericus, Bacillus subtilis, Bacillus lichenformis, Bacillus macecassavarum, Clostridium acetobutylium. Và các chủng vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh trưởng nhanh, phát triển tốt và ít bị nhiễm các vi sinh vật khác khi nuôi cấy chúng ở nhiệt độ cao. Bacillus subtilis là vi khuẩn ưa ấm sinh amylase mạnh được nghiên cứu sử dụng rộng rãi nhất. Theo Bùi Thị Phi, riêng ở Nhật, hằng năm sản xuất tới hàng chục nghìn tấn chế phẩm amylase và protease từ loài Bacillus subtilis này.(Bùi Thị Phi, 2007). 1.2.2.4. Đặc tính của enzyme amylase α-amylase phân giải các liên kết α-1,4 glucoside ở giữa chuỗi mạch polysaccharide, vì vậy cũng gọi là “endo-amylase” tạo thành các phân tử dextrin phân tử thấp.(Nguyễn Huỳnh Mai Nhi, 2015) 25 Đồ án tốt nghiệp α-amylase không chỉ thủy phân được hồ tinh bột mà nó còn có khả năng thủy phân được cả hạt tinh bột còn nguyên nhưng tốc độ lại rất chậm. Dưới tác dụng của amylase thì độ nhớt của dung dịch giảm mạnh do tinh bột đã bị α-amylase thủy phân thành các phân tử dextrin phân tử thấp, maltose, glucose. α-amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng. α-amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác. Tất cả enzyme α-amylase đều bị kìm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+ , Hg2+. Có một đặc điểm của enzyme từ vi khuẩn là enzyme α-amylase của vi khuẩn có hoạt lực dextrin hóa trội hơn hoạt lực đường hóa so với α-amylase của nấm mốc. Amylase của Bacillus subtilis phân giải tinh bột còn nguyên nhanh hơn 2-2,5 lần so với α-amylase của nấm mốc (Bùi Thị Phi, 2007) pH tối ưu của enzyme α-amylase thu được từ vi khuẩn là 5,8 – 6,0 và vùng hoạt động tốt là khoảng pH từ 5,8 – 7,0. α-amylase của vi khuẩn chịu nhiệt cao hơn rất nhiều so với enzyme này thu được từ nấm mốc ( khoảng 920C so với 700C ở nấm mốc) (Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2013). β-amylase xúc tác các phản ứng thủy phân các liên kết α-1,4 glucoside kể từ đầu không khử tạo thành chủ yếu là maltose và dextrin phân tử lớn. (Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2013). β-amylase không thủy phân hạt tinh bột mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột, β- amylase chỉ phổ biến ở loài thực vật (hạt đang nảy mầm) mà không có ở vi khuẩn (Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2013). Glucose amylase xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside bắt đầu từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide và tạo ra sản phẩm chủ yếu được tạo thành gồm glucose và dextrin (Nguyễn Huỳnh Mai Nhi, 2015). Loại enzyme này có tính chất acid thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng pH 3,5 – 5. 26 Đồ án tốt nghiệp 1.2.2.5. Sinh tổng hợp enzyme amylase và các yếu tố ảnh hưởng Amylase ở vi khuẩn được có thể được sinh ra trong quá trình phát triển tăng sinh khối của vi sinh vật hoặc chúng có thể được tích trữ dần trong quá trình sinh trưởng và phát triển của mình trong tế bào hay trong môi trường. Riêng đối với chủng Bacillus subtilis thì chỉ tìm thấy được amylase khi vi khuẩn đã hoặc đang kết thúc quá trình sinh trưởng vì amylase ngoại bào được tổng hợp ở tế bào đang chuyển qua thời kỳ tự phân (Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2013). + Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme amylase. Ảnh hưởng của nguồn carbon dinh dưỡng: các nguồn carbon và nguồn năng lượng dễ hấp thu có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp amylase. (Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2013) Môi trường nuôi cấy dùng để thu amylase từ vi khuẩn có thể dùng tinh bột, maltose, saccharosevà nếu như bổ sung CaCO3 làm tác nhân điều chỉnh pH và pepton thì α-amylase được tổng hợp gấp 2 lần vì trong thành phần môi trường có Ca2+ có tác dụng nâng cao khả năng tổng hợp α-amylase, làm ổn định enzyme có tác dụng bảo vệ enzyme này đối với protease (VASEP, 2015). Để tổng hợp α-amylase thì môi trường nuôi cấy vi sinh vật thu enzyme này cần có các dạng muối magie, phosphor, Kali , Mangan, kẽm nồng độ muối MnSO4 thích hợp để vi sinh vật tổng hợp α-amylase là 0,05%, thiếu muối thì α- amylase không được hình thành. Điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ và sự thông khí cũng ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật (Nakano và ctv 1998) 1.2.2.6. Ứng dụng của enzyme amylase Các amylase vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp bia (thay thế một phần đại mạch), công nghiệp nước chấm, công nghiệp sản xuất glucose, công nghiệp sản xuất bánh mỳ (nâng cao chất lượng bánh), 27 Đồ án tốt nghiệp công nghiệp chế biến rau quả, công nghiệp chế biến thức ăn chăn nuôi, công nghiệp giấy, công nghiệp sợi 1.2.3. Enzyme Cellulase Enzyme Cellulase là một phức hợp enzyme có tác dụng thủy phân cellulose thông qua phân cắt liên kết 1,4-D – glucoside trong cellulose tạo sản phẩm glucose cung cấp cho công nghiệp lên men. Nguồn thu cellulase lớn nhất hiện nay là vi sinh vật. Hệ cellulase gồm: + endo -(1,4) –β-D-glucanase (EC.3.2.1.4) + exo-(1,4)-β-D-glucanase (EC.3.2.1.91) + β-glucosidases (EC.3.2.1.21) Hoạt động phối trộn thủy phân cellulose thành glucose (Nguyễn Thị Cúc, 2014). 1.2.3.1. Cơ chế tác động của enzyme cellulase Cellulose là enzyme phức tạp xúc tác sự phân giải cellulose thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Gồm ba giai đoạn chủ yếu: Giai đoạn 1: dưới tác động của cellulose và các tác nhân của môi trường làm thay đổi tính chất lý hóa của cellulose, làm cho phân tử cellulose từ dạng tinh thể thành dạng hoạt động. Khi phân tử cellulose ở dạng hoạt động, các endocellulose dễ dàng tác động và phân giải chúng thành cellulose hòa tan (polysaccharide), cellotetrose, cellobiose, glucose, mà chủ yếu của giai đoạn này là tạo thành các cellulose hòa tan. Giai đoạn thứ 2: Cellulose biến đổi sau giai đoạn 1 bị phân giải các cellobiose (disaccharide) và cellotetrose dưới tác dụng của exocellulase. Giai đoạn cuối cùng: dưới tác dụng của cellobiose (β-1,4-glucosidase), các đoạn cellobiose bị thủy phân thành glucose, β-1,4-glucosidase là những enzyme rất đặc hiệu thủy phân cellobiose thành D-glucose. (Trần Đông Bách, 2008). 28 Đồ án tốt nghiệp 1.2.3.2. Phân loại và đặc điểm của enzyme cellulase Theo Wood và Mc.Cral (1979) enzyme cellulase được phân chia theo chức năng thành 3 nhóm: Exocellulase (exobiohydrolase; 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase). Endocellulase (endoglucanase; 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase). β-glucosidase (cellbiase; β-D-glucoside glucohydrolase). Hoạt tính của hệ enzyme cellulase đạt cao nhất khi nhiệt độ nằm trong khoảng từ 40- 600C, pH nằm tong khoảng 4 – 7. Cellulase bị ức chế bởi những sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose. Hg2+ ức chế hoàn toàn cellulose, trong khi các ion như Mn2+, Ag+, Cu2+ và Zn2+ chỉ ức chế nhẹ. Hoạt tính của chế phẩm cellulase bị mất hoàn toàn sau 10 – 15 phút ở 800C (Trần Đông Bách, 2008). Exocellulase được tổng hợp bởi Trichoderma reesei và đã được các nhà khoa học nghiên cứu rất kỹ. Chúng bao gồm hai loại: exocellulase kiểu I và exocellulase kiểu II. Exocellulase kiểu I chiếm 60% lượng protein có trong dịch nuôi cấy Trichoderma reesei. Chúng có phân tử lượng khoảng 66.000 Da, điểm đẳng điện là 4,4(PI =4,4). Loại enzyme này tác dụng cả lên cellulose vô định hình và cellulose kết tinh. Nhưng chúng lại không tác đến cellulose biến tính như carboxylmethyl cellulose (CMC) hay hydroxyethycellulose, cellohexaose β-nitrophenyl, β-glucoside hay β-glucan. Exocellulase kiểu I chứa khoảng 496 amino acid (Trần Đông Bách, 2008). Exocellulase kiểu II có phân tử lượng 53.000 Da, PI = 5,0. Chúng cũng không tác động lên CMC, chúng có khả năng tác động đến cellulose hòa tan và cả cellulose không hòa tan. Exocellulose kiểu II chưa khoảng 471 amino acid. Exocellulase của Cellulomonas fimi có một số tính chất khác biệt so với của Trichoderma reesei. Exocellulase của Cellomonas fimi có chứa 443 amino acid. Enzyme này có ba cầu nối disufide. Hai cầu nối disufide nằm trong trung tâm hoạt động còn một cầu nối nằm ngoài trung tâm hoạt động. 29 Đồ án tốt nghiệp Exocellulase của Clostridium thermocellum có phân tử lượng 68.000 – 75.000 Da. Endoglucanase có nhiều trong dịch nuôi cấy Trichoderma reesei. Các nhà khoa học chia chúng thành hai loại endoglucaase kiểu I và endogglucanase kiểu II. Endoglucanase kiểu I chứa 459 amino acid, phân tử lượng khoảng 48.121 Da. Edoglucanase kiểu II chứa 418 amino acid, phân tử lượng 42.200 Da. Các enzyme này có thể hoạt động ở nhiệt độ khá cao . Ngoài ea endoglucanase còn được tìm thấy ở Clostridium themocellum, Cellulomonas fimi và các vi sinh vật khác. Các endoglucanase của các vi sinh vật khác thường không khác biệt nhiều. β-glucosidase là nhóm enzyme khá phức tạp, chúng có khả năng hoạt động trong pH rất rộng (pH từ 4,4 – 8,4), phân tử lượng 50.000 – 98.000 Da, PI (isoeletric point) 8,4 và có thể hoạt động ở nhiệt độ cao. Β-glucosidase của Trichoderma reesei chứa đến 713 amino acid với phân tử lượng là 75.340 Da. Trong dịch chiết, chúng chiếm 1% so với tổng lượng protein thu được. β- glucosidase của Clostridium thermocellum được chia làm hai loại β-glucosidase A và β-glucosidase B. β-glucosidase A chứa khoảng 448 amino acid và có phân tử lượng 51.82 Da. Chúng hoạt động mạnh ở pH 6,0 – 6,5 và ở nhiệt độ 60oC. Chúng tham gia thủy phân cellobiose nhưng không thủy phân CMC (Trần Đông Bách, 2008). 1.3. Tổng quan về phân bón 1.3.1. Khái niệm Phân bón là những chất hoặc hợp chất có chứa một hay nhiều chất dinh dưỡng thiết yếu đối với cây trồng, giúp cây trồng sinh trưởng, phát triển tốt cho năng suất và chất lượng cao hoặc làm tăng độ phì nhiêu của đất. Trong phân bón có chứa nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của cây trồng. Thiếu phân cây sẽ không thể sinh trưởng, phát triển và cho năng suất, phẩm chất cao. Các loại phân bón hữu cơ và một số loại phân bón khai thác vô cơ đã được sử dụng trong nhiều thế kỷ, trong khi các loại phân bón hoá học tổng hợp vô cơ chỉ 30 Đồ án tốt nghiệp được phát triển mạnh từ thời cách mạng công nghiệp. Sự hiểu biết và sử dụng tốt các loại phân bón là những thành phần quan trọng của cuộc Cách mạng Nông nghiệp Anh (tiền công nghiệp) và cuộc cách mạng xanh (công nghiệp) ở thế kỷ 20 (Phan Phát, 2013). 1.3.2. Phân loại 1.3.2.1. Theo nguồn gốc a) Phân hữu cơ Là loại phân bao gồm phế phụ phẩm của cây trồng và gia súc ở các giai đoạn khác nhau của quá trình phân giải và được bón vào đất nhằm cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng và cải thiện tính chất đất. Phân hữu cơ bao gồm phế phụ phẩm của trồng trọt, lâm nghiệp, rác thải từ các ngành sản xuất như nghành sản xuất giấy, đường, bùn cống rãnh và phế phụ phẩm từ các ngành chế biến nông sản (Phan Phát, 2013. b) Phân vô cơ (phân khoáng, phân hóa học) Là loại phân bón được sản xuất theo qui trình công nghiệp. Trong quá trình sản xuất có sử dụng một số nguyên liệu tự nhiên hoặc tổng hợp. Tùy thuộc vào nguyên tố dinh dưỡng có chứa trong phân bón, phân hóa học có thể là phân đạm, lân, kali, canxi, lưu huỳnh Phân hóa học có thể là phân đơn (chứa 1 nguyên tố dinh dưỡng), phân đa nguyên tố (chứa 2 hoặc nhiều nguyên tố dinh dưỡng) (Phan Phát, 2013) c) Phân vi sinh Phân có chứa một hay nhiều loại vi sinh vật sống có ích, với mật độ phù hợp với tiêu chuẩn đã ban hành. Thông qua các hoạt động sống của chúng tạo nên các chất dinh dưỡng mà cây trồng có thể sử dụng được (N, P, K, S, Fe...) hay các hoạt chất sinh học, góp phần nâng cao năng suất, chất lượng nông sản. Phân vi sinh phải bảo đảm không gây ảnh hưởng xấu đến người, động vật, thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản (theo TCVN 6169-1996) (Phan Phát, 2013) 31 Đồ án tốt nghiệp 1.3.2.2. Theo chức năng a) Phân bón gốc Là các loại phân bón được bón trực tiếp vào đất để cung cấp chất dinh dưỡng cho cây trồng thông qua bộ rễ. b) Phân bón lá Là các hợp chất dinh dưỡng hòa tan trong nước được phun lên lá để cây hấp thụ, thông qua hệ thống khí khổng ở bề mặt lá. 1.3.2.3. Theo thành phần dinh dưỡng a) Phân bón đa lượng Phân có chứa trong thành phần từ 2 hoặc nhiều hơn các nguyên tố dinh dưỡng cần thiết cho cây trồng. b) Phân bón trung lượng Phân có chứa một loại chất dinh dưỡng trung lượng như: Mg, S, Ca,... Các loại chất dinh dưỡng này cây cần với một lượng trung bình nhưng rất cần thiết cho sự sinh trưởng, phát triển của cây trồng. c) Phân bón vi lượng Phân có chứa một yếu tố dinh dưỡng vi lượng như: Cu, Fe, Zn, Mo,... Các loại chất dinh dưỡng này cây trồng cần một lượng rất nhỏ nhưng nó lại ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng, phát triển cũng như chất lượng của nông sản phẩm. 1.3.2.4. Theo dạng a) Phân bón dạng rắn Các chất dinh dưỡng và chất mang của phân được để ở dạng rắn, dùng để bón gốc, bón lót 32 Đồ án tốt nghiệp b) Phân bón dạng lỏng Các chất dinh dưỡng dưới dạng hoà tan, sử dụng để phun vào lá, gốc 1.3.3. Thành phần dinh dưỡng Thành phần dinh dưỡng trong phân bón thường có: - Chất đa lượng: đạm (N), lân (P), kali (K) - Chất trung lượng: canxi (Ca), lưu Huỳnh (S), magiê (Mg),... - Chất vi lượng: sắt (Fe), kẽm (Zn), mangan (Mn), Bo (B), đồng (Cu), Clo (Cl), Molypden (Mo) theo (Glass và Anthony, 2003). 1.3.4. Ưu điểm của phân bón hữu cơ Phân hữu cơ nói chung có ưu điểm là chứa đầy đủ các nguyên tố dinh dưỡng đa, trung và vi lượng mà không một loại phân khoáng nào có được. Ngoài ra, phân hữu cơ cung cấp chất mùn làm kết cấu của đất tốt lên, tơi xốp hơn, bộ rễ phát triển mạnh, hạn chế mất nước trong quá trình bốc hơi từ mặt đất, chống được hạn, chống xói mòn (Bùi Huy Hiền,2014) Bón phân hữu cơ làm tăng năng suất cây trồng. Kết quả nghiên cứu khoa học trong rất nhiều năm của các viện, trường, cũng như kết quả điều tra kinh nghiệm của các hộ nông dân cho thấy, năng suất cây trồng và hiệu quả kinh tế cao, ổn định ở những nơi có bón tỷ lệ N hữu cơ và N vô cơ cân đối với tỷ lệ N tính từ hữu cơ chiếm khoảng 25-30% tổng nhu cầu của cây trồng. Ước tính do bón phân hữu cơ năng suất cây trồng đã tăng được 10-20%. Nếu tính riêng về thóc do bón phân hữu cơ (chủ yếu là phân chuồng) đã đạt khoảng 2,5-3,0 triệu tấn thóc/năm. (Bùi Huy Hiền, 2014). Bón phân hữu cơ còn làm giảm bớt lượng phân khoáng cần bón do phân hữu cơ có chứa các nguyên tố di dưỡng đa lượng, trung lượng và vi lượng. Kết quả nghiên cứu và điều tra cho thấy nếu bón 10 tấn phân chuồng/ha có thể giảm bớt được 40-50% lượng phân kali cần bón.heo Bùi Huy Hiền (2014). 33 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu Đề tài này được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường, trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. 2.1.2. Thời gian nghiên cứu Đề tài này được thực hiện từ tháng 2/2017 đến tháng 7/2017 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Nguồn vi sinh vật Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BM và BDH được phân lập bởi Hồng Sêch Hếnh (2015). Bảng 2.1. Danh sách các chủng vi khuẩn BM và BDH được chọn để khảo sát STT Chủng VSV 1 BM13 2 BDH1 3 BDH2 4 BDH3 5 BDH4 6 BDH5 - Chủng Lactobacillus L2 được phân lập từ bởi Nguyễn Đình Phương Vy (2015). 34 Đồ án tốt nghiệp 2.2.2. Hóa chất và môi trường 2.2.2.1. Hóa chất Cao thịt Pepton Lugol Cao nấm men Malachite Green 5% NaCl Casein CuSO4 20% Tinh bột tan K2HPO4 NaOH 1N Gelatin HCl 1N Glycerol TCA 10% Cồn Nước cất Thuốc thử Kovac’s Thuốc thử Methylred Thuốc thử Griess A, Griess B Glucose KH2PO4 Sodium acetat Mangiesium sulfate Manganese sulfate Amonium citrate Rỉ đường KI 2.2.2.2. Môi trường  Môi trường Nutrient Broth (NB)  Môi trường Nutrient Agar (NA).  Môi trường MRS  Môi trường thu enzyme.  Môi trường Casein  Môi trường CMC  Môi trường Starch agar. 35 Đồ án tốt nghiệp  Môi trường MRT  Môi trường HI  Môi trường LBS 2.3.Thiết bị và dụng cụ 2.3.1. Thiết bị - Tủ cấy vi sinh - Tủ lạnh - Tủ ấm - Bếp từ - Máy quang phổ - Nồi hấp - Autoclave - Bể điều nhiệt - Máy lắc - Máy ly tâm - Kính hiển vi - Cân phân tích - Thùng chụp hình đĩa petri 2.3.2. Dụng cụ - Ống nghiệm. - Đèn cồn - Đĩa petri - Dụng cụ đục lỗ thạch - Đũa thủy tinh - Bông thấm nước - Ống ly tâm - Bông không thấm - Giấy đo pH - Cốc thủy tinh các loại - Ống đong các loại - Chai thủy tinh - Pipette thủy tinh 1ml, 5 ml, 10 ml - Dây cấy vòng - Erlen 100 ml, 250ml - Dây cấy thẳng - Chai đun môi trường 200 ml, 500 ml - Que cấy trang - Micropipette 100µl, 1000µl 36 Đồ án tốt nghiệp 2.4. Bố trí thí nghiệm 2.4.1. Bố trí thí nghiệm chung VSV Hoạt hóa Chủng thuần Giữ giống khiết Nhuộm Gram Nhuộm bào tử Khảo sát khả năng sinh enzyme của các chủng Bacillus subtilis Chọn chủng vi khuẩn BDH4 Khảo sát tính đối kháng và khả năng sinh enzyme ngoại bào của hai chủng BDH4 và L2 được tuyển chọn Khảo sát thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng Khảo sát pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn BDH4 và L2 Khảo sát môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của hai chủng BDH4 và L2 Hì nh 2.1. Sơ đồ tổng quan bố trí các bước thí nghiệm 37 Đồ án tốt nghiệp 2.4.2. Bố trí thí nghiệm chi tiết 2.4.2.1. Làm thuần các chủng Bacillus subtilis BM và BDH Các chủng BM và BDH Tăng sinh trong môi trường NB Lắc 150 vòng/phút trong 24 – 48 giờ Tiến hành pha loãng đến dãy nồng độ 10-5, 10-6, 10-7 và cấy trang dịch lên môi trường NA Ủ nhiệt độ 370C trong 24 - 48 giờ Chọn khuẩn lạc rời rạc Định tính khả Nhuộm Nhuộm năng sinh enzyme gram bào tử ngoại bào Chủng thuần khiết Giữ giống trong eppendoff cùng glycerol 40% Hì nh 2.2. Sơ đồ quy trình làm thuần các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BM và BDH 38 Đồ án tốt nghiệp  Thuyết minh quy trình VSV được lấy từ các chủng được phân lập từ mẫu ruột cá, đã được định danh sơ bộ bằng các thử nghiệm sinh hóa đặc trưng và khảo sát pH thích hợp đến khả năng sinh enzyme protease của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BM và BDH tại phòng thí nghiệm Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM. VSV được giữ trong eppendorf , quấn kỹ bằng paraffin và được bảo quản lạnh sâu. Những ống eppendorf chứa vi khuẩn được tuyển chọn phải là những ống còn nguyên vẹn, không bị nứt, được bao bọc kỹ bởi paraffin và chủng vi khuẩn không bị chảy ra ngoài. Tiến hành tăng sinh trong bình môi trường NB (không chọn lọc) đã được hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút. Cho 1 ml chủng VSV trong eppendorf vào bình môi trường chứa 19 ml môi trường NB (không chọn lọc) vô trùng với tỉ lệ cấy giống 5% . Thí nghiệm thực hiện trong tủ cấy dưới ngọn lửa đèn côn trong điểu kiện vô trùng. Đem ủ và lắc ở 150 vòng/phút từ 24 – 48 giờ khi thấy môi trường chuyển sang đục và có sinh khối bám trên thành bình là có thể đưa vào thí nghiệm tiếp theo. Sau đó tiến hành đem đi pha loãng. Dùng micropipette hút 1 ml dịch tăng sinh để pha loãng đến nồng độ 10-5, 10-6, 10-7 dùng cho cấy trang sau đó. Tiến hành đỗ đĩa môi trường NA đã được hấp khử trùng, dùng micropipette hút 100 µl dịch đồng nhất vào đĩa môi trường NA và tiến hành cấy trang đến khi mặt thạch khô ráo hẳn. Mỗi nồng độ pha loãng được cấy ra 3 đĩa để đảm bảo kết quả. Ủ trong tủ ấm 37 0C trong 24 - 48 giờ cho đến khi khuẩn lạc đặc trưng của Bacillus subtilis bắt đầu mọc. Tiếp theo ta chọn khuẩn lạc rời rạc và đem quan sát hình thái bằng cách nhuộm gram và nhuộm bào tử. Sau khi xác định đó là chủng Bacillus subtilis thì từng chủng vi khuẩn được test định tính khả năng sinh enzyme protease trên môi trường đĩa thạch casein 1% ; khả năng sinh enzyme amylase trên môi trường đĩa thạch tinh bột 1%; khả năng 39 Đồ án tốt nghiệp sinh enzyme cellulase trên môi trường đĩa thạch CMC 1%, tiến hành giữ giống trong eppendorf trong glycerol 40 % những chủng có khả năng sinh enzyme mạnh để bảo quản . 2.4.2.2. Làm thuần chủng Lactobacillus L2 Chủng L2 Tăng sinh trong môi trường MRS broth Lắc 150 vòng/phút trong 24 – 48 giờ Tiến hành pha loãng đến dãy nồng độ 10-5, 10-6, 10-7 và cấy trang dịch lên môi trường MRS - agar Ủ nhiệt độ 370C trong 24 - 48 giờ Chọn khuẩn lạc rời rạc Chủng thuần khiết Khảo sát khả Nhuộm Nhuộm năng sinh acid gram bào tử lactid Giữ giống trong eppendorf cùng glycerol 40% Hì nh 2.3. Sơ đồ quy trình làm thuần chủng Lactobacillus L2 40 Đồ án tốt nghiệp  Thuyết minh quy trình Chủng Lactobacillus L2 được phân lập từ cơm mẻ đã được xác định có khả năng kháng tốt đối với VSV gây bệnh nhưng không kháng với Bacillus subtilis (Nguyễn Thị Phương Vy, 2015). Chủng VSV được giữ trong eppendorf được quấn kỹ bằng paraffin và được bảo quản lạnh sâu. Những ống eppendorf chứa vi khuẩn được tuyển chọn phải là những ống còn nguyên vẹn, không bị nứt, được bao bọc kỹ bởi paraffin và chủng vi khuẩn không bị chảy ra ngoài. Tiến hành tăng sinh trong bình môi trường MRS đã được hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút. Cho 1 ml chủng VSV trong eppendorf vào bình môi trường chứa 19 ml môi trường MRS vô trùng với tỉ lệ cấy giống 5% . Thí nghiệm thực hiện trong tủ cấy dưới ngọn lửa đèn cồn trong điều kiện vô trùng. Đem ủ và lắc ở 150 vòng/phút từ 24 – 48 giờ khi thấy có sinh khối bám trên thành bình là có thể đưa vào thí nghiệm tiếp theo. Sau đó tiến hành đem đi pha loãng. Dùng micropipette hút 1 ml dịch tăng sinh đem pha loãng đến nồng độ 10-5, 10-6, 10-7 dùng cho cấy trang sau đó Tiến hành đỗ đĩa môi trường MRS - agar đã được hấp khử trùng, dùng micropipette hút 100 µl dịch đồng nhất vào đĩa môi trường MRS - agar và tiến hành cấy trang đến khi mặt thạch khô ráo hẳn. Mỗi nồng độ pha loãng được cấy ra 3 đĩa để đảm bảo kết quả. Ủ trong tủ ấm 37 0C trong 24 - 48 giờ cho đến khi khuẩn lạc đặc trưng của Lactobacillus sp bắt đầu mọc. Tiếp theo ta chọn khuẩn lạc rời rạc và đem quan sát hình thái bằng cách nhuộm gram. Sau khi xác định đó là chủng Lactobacillus sp thì chủng vi khuẩn được định tính khả năng sinh acid lactid trên môi trường thạch MRS có chứa 5 g/l CaCO3, tiến hành giữ giống trong eppendorf với glycerol 40 % và tiến hành các thí nghiệm nhân sinh khối. 41 Đồ án tốt nghiệp 2.4.2.3. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn BM và BDH a) Khảo sát khả năng sinh enzyme protease Các chủng thuần khiết Tăng sinh trong môi trường NB pH 7, lắc 150 vòng/ phút trong 24 giờ Hút 1ml dịch nuôi cấy đi ly tâm 10000 vòng/ phút/ 15 phút thu dịch trong làm dịch enzyme thô Cặn Chuẩn bị môi trường NA bổ sung thêm cơ chất casein 1% Hút 0,1 ml dịch enzyme thô bơm vào lỗ thạch môi trường NA có bổ sung cơ chất casein 1% Đỗ đĩa Đục lỗ thạch Để yên và ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ và đo đường kính vòng phân giải Chọn đường kình vòng phân giải lớn nhất cho hoạt tính cho hoạt tính enzyme protease cao nhất Hì nh 2.4. Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng sinh enzyme protease của các chủng BM và BDH 42 Đồ án tốt nghiệp  Thuyết minh quy trình Từ kết quả phân lập đã được thực hiện bởi Hồng Sếnh Hếnh (2015) đã chọn ra 5 chủng có khả năng sinh enzyme cao nhất để đưa vào khảo sát : BM13, BDH1, BDH2, BDH3, BDH4, BDH5. Đầu tiên, những chủng vi khuẩn được chọn đưa vào thí nghiệm được giữ trong eppendorf với thể tích 1 ml sẽ được tăng sinh trong chai môi trường 100 ml với 19 ml môi trường NB vô trùng với, pH = 7. Với tỉ lệ cấy giống 5% các chai môi trường được lắc trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/ phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Sau 24 giờ nuôi cấy hút 1ml dịch tăng sinh của mỗi chủng vi khuẩn đem đi ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 15 phút .Chai môi trường không được cấy giống vi khuẩn sẽ được giữ lại làm mẫu đối chứng âm cho thử nghiệm này. Chuẩn bị môi trường NA bổ sung cơ chất casein 1% đem hấp khử trùng 1210C trong 15 phút. Sau khi hấp khử trùng chai môi trường được cho vào bể ủ 600C để môi trường hạ nhiệt xuống còn 600C thì tiến hành đỗ đĩa petri đã được hấp khử trùng, mỗi đĩa khoảng 15-20ml. Tiếp theo ta tiến hành đục lỗ thạch (đường kính 6 mm) thành các giếng. Dùng micropipette hút 0,1 ml dịch enzyme thô của các chủng vi khuẩn bơm vào các giếng thạch. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Để yên đĩa thạch và ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ rồi tiến hành đo đường kính vòng phân giải casein bằng cách nhỏ thuốc thử TCA 10% vào và quan sát vòng phân giải quanh giếng thạch. 43 Đồ án tốt nghiệp b) Khảo sát khả năng sinh enzyme amylase các của chủng BM và BDH Các chủng thuần khiết Tăng sinh trong môi trường NB pH = 7, lắc 150 vòng /phút trong 24 giờ Hút 1ml dịch nuôi cấy đi ly tâm 10000 vòng/ phút trong 15 phút thu dịch trong làm dịch Cặn enzyme thô Chuẩn bị môi trường NA bổ sung thêm cơ chất tinh bột 1% Hút 0,1 ml dịch enzyme thô bơm vào lỗ thạch môi trư ờ ng ĐNAỗ đĩa có b ổ sung Đcơục ch lỗấ tth tinhạch bột 1% Để yên và ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ và đo đường kính vòng phân giải Chọn đường kính vòng phân giải lớn nhất cho hoạt tính enzyme amylase cao nhất Hì nh 2.5. Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng sinh enzyme amylase của các chủng BM và BDH 44 Đồ án tốt nghiệp  Thuyết minh quy trình Theo nghiên cứu bởi Hồng Sếnh Hếnh (2015) đã đưa ra 5 chủng có triển vọng là : BM13, BDH1. BDH2, BDH3, BDH4, BDH5. Cả 5 chủng được đưa vào khảo sát để chọn ra chủng có khả năng cho sinh khối cao sinh enzyme amylase tốt nhất nhằm tăng cường phân hủy thức ăn thừa. Đầu tiên, những chủng vi khuẩn được chọn đưa vào thí nghiệm được giữ trong eppendort với thể tích 1 ml sẽ được tăng sinh trong chai môi trường 100 ml với 19 ml môi trường NB vô trùng với, pH = 7. Với tỉ lệ cấy giống 5% các chai môi trường được lắc trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/ phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Sau 24 giờ nuôi cấy hút 1ml dịch tăng sinh của mỗi chủng vi khuẩn đem đi ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút .Chai môi trường không được cấy giống vi khuẩn sẽ được giữ lại làm mẫu đối chứng âm cho thử nghiệm này. Chuẩn bị môi trường NA bổ sung cơ chất tinh bột 1% đem hấp khử trùng 1210C trong 15 phút. Sau khi hấp khử trùng chai môi...al content of biosolids and composted biosolids. Water Sci Technol. (2008);57:471–477. doi: 10.2166/wst.2008.019. Ouwehand, A.C., Kirjavainen, P.V., Shortt, C., and Salminen, S. (1999). “Probiotics: Mechanisms and established effects”. Int. Dairy J. 9: pp. 43-52. Sharpe, M.E., T.F. Fryer and D.G. Smith (1966). Identification of the lactic acid bacteria,. In: B.M. Gibbs and P.A. Skinner, (eds), Identification Methods for Microbiologist: Part A. Academic Press, London. pp. 69- 79. 100 Đồ án tốt nghiệp Stoknes, K.Scholwin, W Krzesiński, E Wojciechowska, Jasińska A. (2016). “Efficiency of a novel Food to waste to food system including anaerobic digestion of food waste and cultivation of vegetables on digestate in a bubbleinsulated greenhouse”, Waste Management , pp 466-476. Stuart, T., (2009). Waste: Uncovering the Global Food Scandal. W. W. Norton & Company, p. 480. Umsakul K, Dissara Y, Srimuang N. Chemical physical and microbiological changes during composting of the water hyacinth. Pak J Biol Sci. (2010);13:985– 992. doi: 10.3923/pjbs.2010.985.992. Quiroga, G., Castrillon, L., Fernandez-Nava, Y., Maranon, E., Negral, L., RodriguezIglesias, J., Ormaechea, P., (2014). “Effect of ultrasound pre-treatment in the ananerobic co-digestion of cattle manure with food waste and sludge”. Bioresour. Technol. 154:74-9. Rengathavasi Thavasia, Singaram Jayalakshmib, Ibrahim M. Bana (2011). “Application of biosurfactant produced from peanut oil cake by Lactobacillus delbrueckii in biodegradation of crude oil”. Bioresource Technology.102(3):3366- 3372. Rounsefell, B.D., O'Sullivan, C.A., Chinivasagam, N., Batstone, D., Clarke, W.P., (2013). “Fate of pathogen indicators in a domestic blend of food waste and wastewater through a two-stage anaerobic digestion system”. Water Sci. Technol. 67(2):366-73. Shin, S.G., Han, G., Lim, J., Lee, C., Hwang, S., (2010). “A comprehensive microbial insight into two-stage anaerobic digestion of food waste-recycling wastewater”. Water Res. 44: 4838-4849 101 Đồ án tốt nghiệp VermiCo, (2013). The Single Largest Producer of Vermicompost in the World. viewed 31 july 2014. From< producer-ofvermicompost-in-the-world/>. Yang J.K., Shih I.L., Tzeng Y.M., Wang S.L.(2000), “Production and purification of proteinase from a Bacillus subtilis that can deproteinize crustacean wasters”. Enzyme and Microbial Technology, (26), 406-413. Zeinhom EA, Elhadary R, Elashry A. Integrating GIS and MCDM to deal with landfill site selection. Int J Eng Technol. (2010);10:32–42. TÀI LIỆU INTERNET bon 102 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC PHỤ LỤC A. THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ MÔI TRƯỜNG KHẢO SÁT TRONG CÁC THÍ NGHIỆM A1. Thành phần môi trường tăng sinh Bacillis subtilis - Nutrient broth (NB) Peptone .......................................................................................5,0 g/l Meat Extract................................................................................3,0 g/l NaCl ....................................... . 10 g/l pH: 7,0 ± 0,2 A2. Thành phần môi trường tăng sinh Lactobacillus (MRS – broth) Glucose ..................................................................................... 20,0 g/l Peptone ..................................................................................... 10,0 g/l Meat Extract............................................................................. 10,0 g/l Yeast Extract...............................................................................5,0 g/l Sodium Acetate ..........................................................................5,0 g/l Dipotassium Phosphate .............................................................2,0 g/l Ammonium Citrate ....................................................................2,0 g/l Tween ® 80.................................................................................1,0 g/l Magnesium Sulfate ....................................................................0,1 g/l Manganese Sulfate .................................................................. 0,05 g/l A3. Thành phần môi trường Nutrient Agar (NA) Agar ..............................................................................................20 g/l Peptone ..................................................................................... 10,0 g/l Peptone ..................................................................................... 10,0 g/l Meat Extract............................................................................. 10,0 g/l NaCl .............................................................................................5,0 g/l 1 Đồ án tốt nghiệp A4. Thành phần môi trường khảo sát khả năng sinh acid lactic (Môi trường MRS bổ sung CaCO3). Glucose ..................................................................................... 20,0 g/l Peptone ..................................................................................... 10,0 g/l Meat Extract............................................................................. 10,0 g/l Yeast Extract...............................................................................5,0 g/l Sodium Acetate ..........................................................................5,0 g/l Dipotassium Phosphate .............................................................2,0 g/l Ammonium Citrate ....................................................................2,0 g/l Tween ® 80.................................................................................1,0 g/l Magnesium Sulfate ....................................................................0,1 g/l Manganese Sulfate .................................................................. 0,05 g/l CaCO3 .................................................................................... 10 g/l A5. Thành phân môi trường thử hoạt tính protease của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis ( NB + casein 1%). Peptone .................................................................................. 5,0 g/l Meat Extract.......................................................................... 3,0 g/l Casein .................................... . 10 g/l A6. Thành phân môi trường thử hoạt tính amylase của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BDH4 ( NB + tinh bột 1%). Peptone .................................................................................. 5,0 g/l Meat Extract.......................................................................... 3,0 g/l Tinh bột ................................. . .10 g/l A7. Thành phân môi trường thử hoạt tính cellulase của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BDH4 ( NB + CMC 1%). Peptone................................................................................ 5,0 g/l Meat Extract ....................................................................... 3,0 g/l 2 Đồ án tốt nghiệp CMC ................................... .. 10 g/l A8 – Thành phần môi trường thử hoạt tính protease của chủng Bacillus subtilis và Lactobacillus. Meat extract ......................................................................... 10,0 g Nước chiết thịt........................................................................ 5 ml Glucose ................................................................................ 0,05 g Gelatine ................................................................................ 10,0 g Peptone................................................................................... 0,1 g KH2PO4 ................................................................................ 1,5 g K2HPO4 ................................................................................ 1,5 g NaCl ....................................................................................... 3,0 g Agar ...................................................................................... 20,0 g Nước cất ........................................................................... 1000 ml A9. Thành phần môi trường khảo sát sự tăng sinh khối của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis – Môi trường NB + 1% Tinh bột (MT1) Peptone .......................................................................................5,0 g/l Meat Extract................................................................................3,0 g/l Tinh bột ................................ .. 10 g/l A10. Thành phần môi trường khảo sát sự tăng sinh khối của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis – Môi trường NB + 1% Glucose (MT2) Peptone .......................................................................................5,0 g/l Meat Extract................................................................................3,0 g/l Clucose ................................. .. 10 g/l A11. Thành phần môi trường khảo sát sự tăng sinh khối của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis – Theo tập đoàn ICFOOD (MT3) Peptone .................................................................................... 10,0 g/l Meat Extract.........................................................................20 - 40 g/l NaCl ...................................... .. 5 g/l K2HPO4 ................................................................................. 0,5 g/l 3 Đồ án tốt nghiệp KH2PO4 ................................................................................. 0,5 g/l MgSO4.7H20 ........................................................................ 0,5 g/l Mật rỉ đường (đường tổng 49%) ........................................ 40 g/l A12. Thành phần môi trường khảo sát sự tăng sinh khối của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis – NB + 2% rỉ đường (MT4) Peptone .......................................................................................5,0 g/l Meat Extract................................................................................3,0 g/l Rỉ đường ............................... .. 20 g/l A13. Thành phần môi trường khảo sát sự tăng sinh khối của chủng vi khuẩn Lactobacillus subtilis – Môi trường HJ ((Hogg and Jago. 1970. ) Tryptone ............................... .. 30,0 g/l Yeast extract ......................................................................... 10,0 g/l Beef extract ........................................................................... 2,0 g/l Lactose................................................................................... 5,0 g/l KH2PO4 ................................................................................ 5,0 g/l A14. Thành phần môi trường khảo sát sự tăng sinh khối của chủng vi khuẩn Lactobacillus subtilis – Môi trường MRT (Murata, 1970). D-(+)-glucose....................... .. 10,0 g/l Polypeptone .......................................................................... 10,0 g/l Beef extract ........................................................................... 3,0 g/l Sodium acetate .................................................................... 10,0 g/l Yeast extract ........................................................................ 5,0 g/l NaCl ....................................................................................... 1,0 g/l 4 Đồ án tốt nghiệp A15. Thành phần môi trường khảo sát sự tăng sinh khối của chủng vi khuẩn Lactobacillus subtilis – Môi trường LBS (Lactobacillus Selection ). Pancreatic Digest of Casein ................................................ 10,0 g Yeast Extract ......................................................................... 5,0 g/l Potassium Dihydrogen Phosphate ...................................... 6,0 g/l Ammonium Citrate .............................................................. 2,0 g/l Glucose ................................................................................20,0 g/l Tween 80 ............................................................................... 1,0 g/l Sodium Acetate Hydrate ...................................................25,0 g/l Magnesium Sulfate ..........................................................0,575 g/l Manganese Sulfate .............................................................0,12 g/l Ferrous Sulfate ..................................................................... 20,0 g Acid acetic.............................................................................. 1,3 ml 5 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B. KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU THỐNG KÊ B.1. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme amylase của các chủng Bacillus subtilis. KHẢ NĂNG SINH ENZYME AMYLASE The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values VSV 6 BDH1 BDH2 BDH3 BDH4 BDH5 BM13 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 KHẢ NĂNG SINH ENZYME AMYLASE The ANOVA Procedure Dependent Variable: VPG Source DF Sum of Mean F Pr > F Squares Square Value Model 5 39.77777778 7.95555556 5.51 0.0073 Error 12 17.33333333 1.44444444 Corrected 17 57.11111111 6 Đồ án tốt nghiệp Total R-Square Coeff Var Root MSE VPG Mean 0.696498 28.46488 1.201850 4.222222 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F VSV 5 39.77777778 7.95555556 5.51 0.0073 KHẢ NĂNG SINH ENZYME AMYLASE The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for VPG Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 1.444444 Critical Value of t 3.05454 Least Significant Difference 2.9974 7 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N VSV A 6.0000 3 BDH4 A A 5.6667 3 BM13 A B A 5.3333 3 BDH2 B A B A C 3.3333 3 BDH3 B C B C 2.6667 3 BDH5 C C 2.3333 3 BDH1 8 Đồ án tốt nghiệp B.2. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme protease của các chủng Bacillus subtilis KHA NANG SINH ENZYME PROTEASE The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values VSV 6 BDH1 BDH2 BDH3 BDH4 BDH5 BM13 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 KHA NANG SINH ENZYME PROTEASE The ANOVA Procedure Dependent Variable: VPG Source DF Sum of Mean F Pr > F Squares Square Value Model 5 175.1111111 35.0222222 12.12 0.0002 Error 12 34.6666667 2.8888889 Corrected 17 209.7777778 Total 9 Đồ án tốt nghiệp R- Coeff Root VPG Mean Square Var MSE 0.834746 19.12132 1.699673 8.888889 Source DF Anova SS Mean F Pr > F Square Value VSV 5 175.1111111 35.0222222 12.12 0.0002 KHA NANG SINH ENZYME PROTEASE The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for VPG Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 2.888889 Critical Value of t 3.05454 Least Significant Difference 4.239 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N VSV 10 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N VSV A 14.667 3 BDH4 B 10.000 3 BM13 B B 9.333 3 BDH3 B C B 8.000 3 BDH5 C B C B 6.667 3 BDH1 C C 4.667 3 BDH2 11 Đồ án tốt nghiệp B.3. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng Bacillus subtilis. KHA NANG SINH ENZYME CELLULASE The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values VSV 6 BDH1 BDH2 BDH3 BDH4 BDH5 BM13 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 KHA NANG SINH ENZYME CELLULASE The ANOVA Procedure Dependent Variable: VPG Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 15.11111111 3.02222222 1.70 0.2091 Error 12 21.33333333 1.77777778 Corrected Total 17 36.44444444 12 Đồ án tốt nghiệp R-Square Coeff Var Root MSE VPG Mean 0.414634 13.95349 1.333333 9.555556 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F VSV 5 15.11111111 3.02222222 1.70 0.2091 KHA NANG SINH ENZYME CELLULASE The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for VPG Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 1.777778 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 2.372 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N VSV A 11.333 3 BDH3 A 13 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N VSV B A 10.000 3 BDH4 B A B A 9.333 3 BDH5 B A B A 9.333 3 BDH2 B B 8.667 3 BDH1 B B 8.667 3 BM13 14 Đồ án tốt nghiệp B.4. Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng BDH4 THỜI GIAN NUỐI CẤY CHUNG BDH4 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values thoigian 7 0 12 24 36 48 60 72 Number of Observations Read 21 Number of Observations Used 21 THỜI GIAN NUỐI CẤY CHUNG BDH4 The ANOVA Procedure Dependent Variable: MDTB Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 6 26.66423434 4.44403906 562.60 <.0001 Error 14 0.11058673 0.00789905 Corrected Total 20 26.77482108 R-Square Coeff Var Root MSE MDTB Mean 0.995870 0.796221 0.088877 11.16231 15 Đồ án tốt nghiệp Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F thoigian 6 26.66423434 4.44403906 562.60 <.0001 THỜI GIAN NUỐI CẤY CHUNG BDH4 The ANOVA Procedure The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for MDTB Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 14 Error Mean Square 0.007899 Critical Value of t 2.97684 Least Significant Difference 0.216 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N thoigian A 12.03809 3 36 A B A 11.94899 3 24 16 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N thoigian B B C 11.81739 3 48 C C 11.69152 3 60 C C 11.60405 3 72 D 10.28968 3 12 E 8.74644 3 0 17 Đồ án tốt nghiệp B.5. Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của chủng L2 THỜI GIAN NUÔI CẦY CHUNG L2 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values thoigian 7 0 12 24 36 48 60 72 Number of Observations Read 21 Number of Observations Used 21 THỜI GIAN NUÔI CẦY CHUNG L2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: MDTB Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 6 0.03966396 0.00661066 1202.75 <.0001 Error 14 0.00007695 0.00000550 Corrected Total 20 0.03974090 R-Square Coeff Var Root MSE MDTB Mean 0.998064 0.225123 0.002344 1.041394 18 Đồ án tốt nghiệp Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F thoigian 6 0.03966396 0.00661066 1202.75 <.0001 THỜI GIAN NUÔI CẦY CHUNG L2 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for MDTB Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 14 Error Mean Square 5.496E-6 Critical Value of t 2.97684 Least Significant Difference 0.0057 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N thoigian A 1.081982 3 48 B 1.073515 3 60 19 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N thoigian C 1.063816 3 36 C C 1.062645 3 24 D 1.052474 3 72 E 1.003570 3 12 F 0.951759 3 0 20 Đồ án tốt nghiệp B.6. Kết quả khảo sát pH ban đầu môi trường nuối cấy đến sự sinh trưởng của chủng BDH4 sau 36 giờ. PH BAN ĐẦU ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA BDH4 SAU 36 GIỜ The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values pH 6 4 5 6 7 8 9 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 PH BAN ĐẦU ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA BDH4 SAU 36 GIỜ The ANOVA Procedure Dependent Variable: MDTB Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 8.23402304 1.64680461 42.15 <.0001 Error 12 0.46882104 0.03906842 Corrected Total 17 8.70284408 R-Square Coeff Var Root MSE MDTB Mean 0.946130 1.607781 0.197657 12.29380 21 Đồ án tốt nghiệp Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F pH 5 8.23402304 1.64680461 42.15 <.0001 PH BAN ĐẦU ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA BDH4 SAU 36 GIỜ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for MDTB Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.039068 Critical Value of t 3.05454 Least Significant Difference 0.493 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N pH A 12.8849 3 7 A A 12.8179 3 6 A B A 12.6683 3 8 22 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N pH B B 12.2890 3 9 B B 12.2138 3 5 C 10.8888 3 4 B.7. Kết quả khảo sát pH ban đầu môi trường nuối cấy đến sự sinh trưởng của chủng L2 sau 48 giờ. PH BAN DAU DEN SU SINH TRUONG CHUNG L2 SAU 48 GIỜ NUÔI CẤY The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values pH 6 10 5 6 7 8 9 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 23 Đồ án tốt nghiệp PH BAN DAU DEN SU SINH TRUONG CHUNG L2 SAU 48 GIỜ NUÔI CẤY The ANOVA Procedure Dependent Variable: MDTB Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 0.00222416 0.00044483 178.37 <.0001 Error 12 0.00002993 0.00000249 Corrected Total 17 0.00225409 R-Square Coeff Var Root MSE MDTB Mean 0.986724 0.147575 0.001579 1.070087 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F pH 5 0.00222416 0.00044483 178.37 <.0001 PH BAN DAU DEN SU SINH TRUONG CHUNG L2 SAU 48 GIỜ NUÔI CẤY The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for MDTB Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 2.494E-6 24 Đồ án tốt nghiệp Critical Value of t 3.05454 Least Significant Difference 0.0039 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N pH A 1.083593 3 6 A A 1.081817 3 5 B 1.073980 3 7 C 1.068038 3 8 D 1.060757 3 9 25 Đồ án tốt nghiệp B.8. Kết quả khảo sát môi trường nuối cấy thích đến sự tăng sinh khối của chủng BDH4 sau 36 giờ với pH 7 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY CHỦNG BDH4 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values Moitruong 5 MT1 MT2 MT3 MT4 MTCB Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY CHỦNG BDH4 The ANOVA Procedure Dependent Variable: MĐTB Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 0.00179111 0.00044778 6.62 0.0072 Error 10 0.00067635 0.00006763 Corrected Total 14 0.00246746 R-Square Coeff Var Root MSE MDTB Mean 0.725894 0.749020 0.008224 1.097971 26 Đồ án tốt nghiệp Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F Moitruong 4 0.00179111 0.00044778 6.62 0.0072 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY CHỦNG BDH4 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for MDTB Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.000068 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 0.0213 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Moitruong A 1.113894 3 MT3 A A 1.101932 3 MT4 A 27 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Moitruong B A 1.100074 3 MT2 B A B A 1.093371 3 MT1 B B 1.080586 3 MTCB B.8. Kết quả khảo sát môi trường nuối cấy thích đến sự tăng sinh khối của chủng L2 sau 48 giờ với pH 6 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY CHUNG L2 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values Moitruong 4 HI LBS MRS MRT Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12 28 Đồ án tốt nghiệp MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY CHUNG L2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: MDTB Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 0.00010859 0.00003620 14.92 0.0012 Error 8 0.00001941 0.00000243 Corrected Total 11 0.00012800 R-Square Coeff Var Root MSE MDTB Mean 0.848353 0.144633 0.001558 1.076966 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F Moitruong 3 0.00010859 0.00003620 14.92 0.0012 29 Đồ án tốt nghiệp MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY CHUNG L2 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for MDTB Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 2.426E-6 Critical Value of t 3.35539 Least Significant Difference 0.0043 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Moitruong A 1.080479 3 MRT A A 1.079296 3 LBS B 1.074870 3 MRS B B 1.073220 3 HI 30 Đồ án tốt nghiệp B.8. Kha nang sinh enzyme amylase của chủng BDH4 khi nuôi cấy trên 5 loại môi trường khác nhau. KHẢ NĂNG SINH ENZYME AMYLASE CHUNG BDH4 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values Moitruong 5 MT1 MT2 MT3 MT4 MTCB Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 KHẢ NĂNG SINH ENZYME AMYLASE CHUNG BDH4 The ANOVA Procedure Dependent Variable: VPG Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 156.2333333 39.0583333 55.80 <.0001 Error 10 7.0000000 0.7000000 Corrected Total 14 163.2333333 R-Square Coeff Var Root MSE VPG Mean 0.957117 8.256513 0.836660 10.13333 31 Đồ án tốt nghiệp Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F Moitruong 4 156.2333333 39.0583333 55.80 <.0001 KHẢ NĂNG SINH ENZYME AMYLASE CHUNG BDH4 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for VPG Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.7 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 2.165 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Moitruong A 12.6667 3 MT4 A A 12.5000 3 MT3 A 32 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Moitruong B A 11.6667 3 MTCB B B 9.8333 3 MT2 C 4.0000 3 MT1 B.9. Khả nang sinh enzyme protease của chủng BDH4 khi nuôi cấy trên 5 loại môi trường khác nhau ENZYME PROTEASE CHUNG BDH4 TRÊN 5 LOẠI MÔI TRƯỜNG The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values Moitruong 5 MT1 MT2 MT3 MT4 MTCB Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 33 Đồ án tốt nghiệp ENZYME PROTEASE CHUNG BDH4 TRÊN 5 LOẠI MÔI TRƯỜNG The ANOVA Procedure Dependent Variable: VPG Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 290.2666667 72.5666667 11.96 0.0008 Error 10 60.6666667 6.0666667 Corrected Total 14 350.9333333 R-Square Coeff Var Root MSE VPG Mean 0.827128 15.33025 2.463060 16.06667 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F Moitruong 4 290.2666667 72.5666667 11.96 0.0008 34 Đồ án tốt nghiệp ENZYME PROTEASE CHUNG BDH4 TRÊN 5 LOẠI MÔI TRƯỜNG The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for VPG Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 6.066667 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 6.3737 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Moitruong A 22.333 3 MT4 A A 20.333 3 MTCB B 13.333 3 MT1 B B 13.000 3 MT3 35 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Moitruong B B 11.333 3 MT2 B.10. Khả nang sinh enzyme protease của chủng L2 khi nuôi cấy trên 4 loại môi trường khác nhau. ENZYME PROTEASE CHỦNG L2 TRÊN 4 MOI TRUONG The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values Moitruong 4 HI LBS MRS MRT Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12 36 Đồ án tốt nghiệp ENZYME PROTEASE CHỦNG L2 TRÊN 4 MOI TRUONG The ANOVA Procedure Dependent Variable: VPG Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 446.5625000 148.8541667 6.74 0.0140 Error 8 176.6666667 22.0833333 Corrected Total 11 623.2291667 R-Square Coeff Var Root MSE VPG Mean 0.716530 40.71588 4.699291 11.54167 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F Moitruong 3 446.5625000 148.8541667 6.74 0.0140 37 Đồ án tốt nghiệp ENZYME PROTEASE CHỦNG L2 TRÊN 4 MOI TRUONG The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for VPG Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 22.08333 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 8.848 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Moitruong A 19.833 3 MRT A B A 14.333 3 MRS B B C 8.333 3 HI C C 3.667 3 LBS 38