Đồ án Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho chăn nuôi heo, gà quy mô pilot

ết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Các tài liệu tham khảo trích dẫn đều có nguồn gốc xác thực Sinh viên thực hiện Trần Lệ Quyên LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp tốt nghiệp ở Phân Viện Chăn Nuôi Nam Bộ, được sự hướng dẫn tận tình của các Thầy Cô, các anh chị và các bạn, em đã hoàn thành tốt đồ án này. Em xin chân thành gửi lời cám ơn đến: Em xin kính dâng lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến Ba Mẹ cùng tất cả những người thân trong gia đình đã nuôi em khuôn lớn nên người và tận tâm lo lắng, tạo mọi điều kiện cho em được học tập và hoàn thành đồ án tốt nghiệp . Ngôi trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, nơi em đã gắn bó suốt bốn năm qua, giúp em có thể tiếp cận được những điều bổ ích, những kinh nghiệm trong cuộc sống. Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, các Thầy Cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh đã trang bị cho em những kiến thức cơ bản, làm nền móng để em thực hiện đề tài và làm tốt công việc sau này. TS. Phạm Huỳnh Ninh, Phó bộ môn Dinh Dưỡng và Thức Ăn Chăn nuôi, Phân Viện Chăn Nuôi Nam Bộ, Thầy đã tạo điều kiện cho em được làm đề tài tại đây, nhiệt tình hướng dẫn và hỗ trợ cho em trong quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp Chị Lê Hoàng Bảo Vi, anh Vũ Minh, anh Lê Quang Trí phòng Dinh Dưỡng và Thức Ăn Chăn nuôi, Phân Viện Chăn Nuôi Nam Bộ đã tận tình chỉ bảo, giảng dạy và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án Cô Nguyễn Hoài Hương, phòng vi sinh, khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình nhận đề tài MỤC LỤC MỤC LỤC ........................................................................................................................ i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................................... iv DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................................ v DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................................ vii LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3 1.1 Đại cương về probiotic .............................................................................................................3 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu probiotic ..................................................................................................3 1.1.2 Định nghĩa probiotic .................................................................................................................4 1.1.3 Các VSV probiotic thường gặp ..............................................................................................4 1.1.4 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic ..............................................................7 1.1.5 Cơ chế tác động của Probiotic................................................................................................8 1.1.6 Vai trò của probiotic đối với vật nuôi ...............................................................................11 1.1.7 Probiotic từ bào tử ...................................................................................................................12 1.1.8 Tình hình nghiên cứu và sử dụng Probiotic trên thế giới và Việt Nam ....................13 1.2 Đại cương về vi khuẩn Bacillus ...........................................................................................18 1.2.1 Đặc điểm sinh học của Bacillus ...........................................................................................18 1.2.2 Bào tử Bacillus .........................................................................................................................22 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .......................................................... 25 2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài............ .........25 2.2 Vật liệu ........................................................................................................................25 2.2.1 Chủng vi sinh vật:................... ......................... 25 2.2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ.. ...................... ....25 2.3 Môi trường nghiên cứu .. 26 2.4 Các phương pháp nghiên cứu (theo sơ đồ bố trí TN tổng quát)........... 30 2.5 Phương pháp nhuộm Gram ....... 31 i 2.6 Phương pháp nhuộm bào tử theo Schaeffer và Fulton......................... ............ .32 2.7 Xác định mật độ TB bằng phương pháp đếm khuẩn lạc ..... ..32 2.7.1 Xác định mật độ TB bằng phương pháp đo mật độ quang ................... ...33 2.7.2 Lập đường cong tăng trưởng........... .......................... ...........34 2.7.3 Khảo sát sự tạo thành bào tử.... ........................... ..........35 2.8 Khảo sát các đặc điểm probiotic ............ ......35 2.8.1 Khảo sát khả năng chịu axit dạ dày ........................ 35 2.8.2 Khảo sát khả năng chịu muối mật ......................... ..36 2.8.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào . .......................... ..37 2.8.4 Khảo sát khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp đường vuông góc Cross Streak ....................................... .40 2.8.5 Khảo sát môi trường tạo bào tử ........................... .40 2.8.6 Khảo sát các phương pháp tạo bào tử nhiều nhất....................... .41 2.8.7 Sản xuất bào tử dạng pilot ............................ .42 2.8.8 Phân tích thống kê dữ liệu ............................ .44 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................... .45 3.1 Khảo sát các đặc điểm probiotic ............ ..45 3.1.1 Khả năng chịu axit dạ dày ................... ..45 3.1.2 Khả năng chịu muối mật ............................ 46 3.1.3 Khả năng sinh enzyme ngoại bào ( amylase, protease, cellulase) ................. .48 3.1.4 Khả năng đối kháng kháng với vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp đường vuông góc Cross Streak. .................... 51 3.2 Đặc tính sinh học và phân loại chủng đã tuyển chọn ....... ..53 3.2.1 Đặc tính hình thái của chủng Sub và Yoi ........................ ..53 3.2.2 Tổng hợp một số đặc tính probiotic của chủng Sub và Yoi ................... ..54 3.3 Thiết lập đường cong tăng trưởng chủng Sub ......... .54 3.3.1 Thiết lập đường chuẩn ............................. ...54 ii 3.3.2 Thiết lập đường cong tăng trưởng .......................... .56 3.4 Thiết lập đường cong tăng trưởng chủng Yoi ......... .56 3.4.1 Thiết lập đường chuẩn ................................. ...56 3.4.2 Thiết lập đường cong tăng trưởng .......................... .58 3.5 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành bào tử của các chủng Sub và Yoi.. ..................... 58 3.6 Kết quả khảo sát các điều kiện tạo bào tử tốt nhất ....... ..59 3.7 Sản xuất bào tử quy mô pilot ............. ...61 3.7.1 Kết quả khảo sát thời gian thích hợp để đạt sinh khối cao nhất với quy mô pilot..... ................................. ..61 3.7.2 Tiến hành tạo bào tử...... .............................. ....62 3.8 Tạo chế phẩm .................. ..64 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ ....65 4.1 Kết luận...... .65 4.2 Kiến nghị. ................... 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................ 66 PHỤ LỤC.......... 74 Phụ lục I: Bảng biểu ..74 Phụ lục II: Hình ảnh ................................ ..85 iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT KL Khuẩn lạc MT Môi trường N Mật độ tế bào TB Tế bào TN Thí nghiệm VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật iv DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Tóm tắt một số thông tin của một vài sản phẩm probiotic có mặt trên thị trường............................................................................................. ........... ....................17 Bảng 1.2. Các đặc điểm khác nhau của tế bào sinh dưỡng và bào tử... ............... .........23 Bảng 3.1. Tỷ lệ sống sót của 11 chủng vi khuẩn vi khuẩn trong môi trường pH thấp........................................................ .................. ......................................................45 Bảng 3.2. Tỷ lệ sống sót của 11 chủng vi khuẩn trong môi trường muối mật 2%........................................... ........................ ..............................................................47 Bảng 3.3. Hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng Bacillus.......... ............... ..........49 Bảng 3.4. Hoạt tính đối kháng của các chủng Bacillus với vi khuẩn kiểm định ...... ....51 Bảng 3.5. Tổng hợp một số đặc tính probiotic của chủng Sub và Yoi... ................... ...54 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát đường chuẩn chủng Sub...... ....................................... .......55 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát đường chuẩn chủng Yoi...... ................................. .............57 Bảng 3.8. Tỷ lệ hình thành bào tử ở các khoảng thời gian khác nhau với quy mô pilot............................................. ....................................... ...........................................63 Bảng 5.1. Số lượng khuẩn lạc và mật độ tế bào vi khuẩn sống sót trong môi trường pH thấp................ ........................................ ........................................................................74 Bảng 5.2. Số lượng khuẩn lạc và mật độ tế bào vi khuẩn sống sót trong môi trường muối mật 2%................................................ ....................................... ..........................75 Bảng 5.3. Số liệu đường chuẩn của chủng Sub............... ........................................ ......76 Bảng 5.4. Kết quả phân tích sự tuyến tính giữa giá trị OD và log N của chủng Sub................................................................................... ..............................................77 Bảng 5.5. Số liệu đường cong tăng trưởng chủng Sub.......... .................................. .....78 Bảng 5.6. Số liệu đường chuẩn chủng Yoi.............. ..................................... ................79 Bảng 5.7. Kết quả phân tích sự tuyến tính giữa giá trị OD và log N của chủng Yoi.................................... ............................................. ................................................80 Bảng 5.8. Số liệu đường cong tăng trưởng chủng Yoi................. .................... ............81 v Bảng 5.9. Số liệu khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành tế bào và bào tử của các chủng Sub......................................... .................................... ............82 Bảng 5.10. Số liệu khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành tế bào và bào tử của các chủng Yoi............................... .............................. ............................82 Bảng 5.11. Tỷ lệ hình thành bào tử qua 7 môi trường của 2 chủng Sub và Yoi. ......... .83 Bảng 5.12. Mật độ bào tử của các phương pháp tạo bào tử tốt ở các khoảng thời gian khảo sát khác nhau........................ ................................................... .............................83 Bảng 5.13. Tỷ lệ hình thành bào tử theo thời gian của các phương pháp khác nhau .......................................................................... .............................................................84 Bảng 5.14. Kết quả khảo sát thời gian thích hợp để đạt sinh khối cao nhất với quy mô pilot............. .................................................................................................................. 85 Bảng 5.15. Kết quả khảo sát mật độ bào tử theo thời gian với quy mô piot.. ............ ...86 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cơ chế tác động chung của probiotic đối với động vật ..................... ..9 Hình 1.2. Các cấu trúc chính của bào tử B. Subtilis... ........................................ ...........23 Hình 1.3. Chu trình hình thành bào tử và nảy mầm trở lại của Bacilllus...... .............. .24 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát............................................................. .....30 Hình 3.1. Vòng phân giải gelatin (protease), tinh bột (amylase), cellulose (cellulase) của các chủng Bacillus .............................. ........50 Hình 3.2. Hoạt tính đối kháng với VK kiểm định của các chủng Bacillu ............... .52 Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và bào tử của chủng Sub .................... 53 Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và bào tử của chủng Yoi ................... .53 Hình 3.5. Đường tương quan giữa giá trị OD và Log N chủng Sub . .......................... 55 Hình 3.6. Đường cong tăng trưởng chủng Sub theo thời gian .................................... ..56 Hình 3.7. Đường tương quan giữa giá trị OD và Log N chủng Yoi . .......................... .57 Hình 3.8. Đường cong tăng trưởng chủng Yoi theo thời gian .................................. 58 Hình 3.9. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự hình thành bào tử của chủng Sub và Yoi ..................................................................... 59 Hình 3.10. Tỷ lệ hình thành bào tử bằng các phương pháp khác nhau theo thời gian của chủng Bacillus subtilis .. ...................................................................... .60 Hình 3.11. Mật độ tế bào với quy mô pilot của chủng Bacillus subtilis ..................... ..61 Hình 5.1. Máy ly tâm Avanti JXN Series .................................................................... .87 Hình 5.2. Chế phẩm thử nghiệm bào tử Bacillus subtilis ......................................... 87 Hình 5.3. Hệ thống lên men 5 L ........................................................... .88 vii LỜI MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài Khí hậu Việt Nam nóng ẩm theo mùa, thời tiết thay đổi thường xuyên, nhiệt độ không ổn định là môi trường lí tưởng để vi khuẩn gây bệnh bùng phát ở các chuồng trại chăn nuôi. Ngành chăn nuôi gặp rất nhiều vấn đề về bệnh tật xuất phát từ đường ruột và hệ tiêu hóa. Theo thống kê hằng năm, tỷ lệ gia súc và gia cầm chết do mắc bệnh đường ruột lớn nhất so với nguyên nhân gây bênh khác. Không chỉ vậy, trong chăn nuôi còn tồn tại các vấn đề khác như lạm dụng kháng sinh và chất tăng trọng gây tác hại đối với người sử dụng, lãng phí thức ăn do vật nuôi không hấp thụ hết thức ăn, dinh dưỡng. Vì vậy, để giải quyết được những vấn đề trên đồng thời có thể nâng cao năng suất hiệu quả kinh tế cho bà con nông dân, Probiotic là một giải pháp hiệu quả nhất hiện nay. Các tác dụng cơ bản của probiotic là tăng cường khả năng miễn dịch, chống lại vi khuẩn gây bệnh bằng cách cạnh tranh vị trí bám dính và dinh dưỡng của vi khuẩn có hại trong hệ tiêu hóa. Một lượng lớn các sản phẩm probiotic được sản xuất hay nhập khẩu, phân phối và sử dụng trong chăn nuôi. Các chế phẩm này chủ yếu chứa các vi khuẩn sống thuộc các giống Bacillus, Lactobacillus, Enteroccocus, nấm men. Số lượng và chủng loại chế phẩm probiotic ứng dụng trong chăn nuôi tại Việt Nam hiện nay rất đa dạng. Tuy nhiên, không phải chế phẩm nào cũng đạt chuẩn và phù hợp với môi trường, khí hậu, điều kiện chăn nuôi Việt Nam. Một chế phẩm probiotic đạt hiệu quả ở một quốc gia nông nghiệp tiên tiến nhưng có thể hoàn toàn không hiệu quả ở một quốc gia nông nghiệp đang phát triển như Việt Nam. Nguyên nhân lớn nhất xuất phát từ hệ sinh thái vi sinh từng nơi. Hiện nay, trong công nghiệp chế biến thức ăn dạng viên thì nguyên liệu thức ăn sẽ được xử lý ở nhiệt độ từ 70 - 80oC, có khi lên đến 90oC nhằm kiểm soát nguy cơ về nhiễm khuẩn, ví dụ như Salmonella (Jones và cộng sự, 2004; Doyle và cộng sự, 2006) 1 cũng như để hồ hóa tinh bột. Quá trình xử lý nhiệt làm giảm đáng kể số lượng vi sinh vật probiotic trong chế phẩm (chứa các tế bào sinh dưỡng). Vì vậy để đảm bảo cung cấp đủ lượng vi sinh vật probiotic trong thức ăn viên thì cần phải chọn ra một chủng vi khuẩn có hoạt tính probiotic và có khả năng chịu được nhiệt độ cao. Bào tử vi khuẩn probiotic thuộc chi Bacillus được xem là một giải pháp thích hợp cho vấn đề sử dụng trong thức ăn ép viên cho chăn nuôi gia súc và gia cầm. Bào tử Bacillus khá bền nhiệt, tính kháng axit cao hơn so với tế bào sinh dưỡng. Các nghiên cứu gần đây cho thấy bào tử Bacillus nảy mầm và phát triển trong hệ tiêu hóa của vật nuôi khoảng 70 - 90%. Ở Việt Nam, hiện có rất ít các nghiên cứu về việc sử dụng bào tử của các chủng Bacillus bổ sung vào thức ăn cho động vật, hoặc là chưa được quan tâm thực hiện hoặc đã thực hiện nhưng không công bố, nếu có cũng rất hạn chế về số lượng các nghiên cứu. Từ hiện trạng nghiên cứu và sản xuất probiotic như trên cho thấy, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chứa bào tử Bacillus ở quy mô pilot là một yêu cầu cấp thiết nhằm tiến tới sản xuất ở quy mô công nghiệp, đáp ứng yêu cầu ngày càng cao của ngành chăn nuôi an toàn và góp phần hạn chế nhập khẩu, chủ động nguồn sản phẩm và làm giảm giá thành sản phẩm. Đây là cơ sở cho việc thực hiện khóa luận “ Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho chăn nuôi heo, gà quy mô pilot”. Mục đích đề tài Sản xuất chế phẩm probiotic chứa bào tử vi khuẩn Bacillus với quy mô pilot Nhiệm vụ của đề tài  Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus có đặc tính probiotic tốt  Khảo sát điều kiện tạo bào tử trong điều kiện lên men lỏng  Sản xuất bào tử Bacillus dạng pilot (5 lít )  Tạo chế phẩm Probiotic 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương về probiotic 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu probiotic Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry Tisser (1900), một bác sỹ người Pháp đã quan sát và thấy rằng phân của những đứa trẻ mắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ khỏe mạnh [53]. Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff - người Nga, đạt giải Nobel – đã chứng minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dăc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này được ông báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” – The Prolongation of life (1908) [53]. Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic [37]. Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota phân lập các vi khuẩn lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh [38]. Cùng năm đó, các nhà nghiên cứu Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm bệnh táo bón thường xuyên. Các nhà khoa học đại học Havard phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất ra được [37]. Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên men – đặt tên là “Yakult” từ sữa được cho là hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health) được sản xuất. Khái niệm chung probiotics được chấp nhận ở Châu Á trong nhiều năm khi các sản phẩm lên men từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu những năm của thập niên 80 [38]. 3 Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc Lactobacillus được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới như những nguồn thực phẩm chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như vật nuôi. 1.1.2 Định nghĩa probiotic Theo ngôn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”. Thuật ngữ probiotic được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 để chỉ “những vi sinh vật và những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật ruột” [26]. Từ đó đến nay thuật ngữ probiotic đã được cả thế giới sử dụng để chỉ những chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích khi được đưa vào cơ thể động vật thông qua thức ăn hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ. Kể từ khi xuất hiện, khái niệm probiotic vẫn chưa có một định nghĩa thống nhất. Tuy nhiên, hiện có hai định nghĩa được cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của probiotic và được sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học: (i) probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợi cho vật chủ” [26]; (ii) theo tổ chức Y tế thế giới (2001), probiotic là “các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số lượng đủ sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ”. 1.1.3 Các VSV probiotic thường gặp Chế phẩm probiotic là một tập hợp các chủng VSV có ích. Đó là các TB sống của các chủng VSV, sống hợp sinh và sản sinh ra một số hợp chất sinh học có tác dụng đến đời sống cây trồng, vật nuôi, cải thiện MT, đồng thời cũng có tác dụng dương tính đối với sức khỏe con người khi đưa chế phẩm này vào đường ruột [12]. Chế phẩm probiotic thường gồm các nhóm VSV sau: Các nhóm VSV cơ bản:  Nhóm VK lactic [17]: Đây là nhóm VK thân thuộc với con người từ ngàn xưa. Trong tự nhiên, chúng phân bố rất rộng rãi, thường gặp nhiều trong các sản phẩm muối chua như dưa chua, cà 4 muối, mắm chua, sữa chuaNgoài khả năng sinh axit lactic do lên men đồng hình và dị hình, VK lactic còn có thể sinh hàng loạt chất có hoạt tính kháng sinh được gọi chung là bacterioxin gồm nizin, diplocoxin, acidofilin, lactoxindin, lactolin, brevin,Các chất này được dùng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm, trong chăn nuôi với vai trò là chất kích thích sinh trưởng, ứng dụng trong việc phòng và trị các bệnh đường tiêu hóa cho người và vật nuôi. Các chế phẩm probiotic được biết đến nhiều nhất với các chủng VK lactic sau: L. acidophilus, L. casei, L. plantarum, L. bulgaricus, L. kefir, L. delbruckii, L. sporogenes, Bifidobacterium, Bifidus bacteria, S. faecalis[24]. Các chế phẩm probiotic có thể sử dụng 1 chủng VSV như chế phẩm Antibio của Hàn Quốc (100% là L. acidophilus) hay Biosubtyl của Đà Lạt (100% là bào tử B. subtilis) hoặc kết hợp nhiều chủng VSV như chế phẩm Emina thuộc Viện Sinh học Nông nghiệp Hà Nội (ngoài VK lactic còn có VK Bacillus, VK quang dưỡng khử H2S và nấm men..) [17]. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng: các VK lactic có một vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa và hấp thu thức ăn của vật chủ. Nhờ khả năng sản sinh ra axit lactic, axit pyruvic, tổng hợp vitamin nhóm B, sản sinh enzymenên có tác dụng ức chế VSV đường ruột, cải thiện tăng trưởng và sức đề kháng của vật chủ  Nhóm VK Bacillus Các VK Bacillus là nhóm trực khuẩn sinh bào tử, sống hiếu khí tùy tiện nhưng trong điều kiện hiếu khí hoạt động mạnh hơn. Chúng phân bố phổ biến trong tự nhiên. Một số loài của giống này còn thấy trong khoang miệng, trong đường ruột của người và động vật. Tất cả các loài Bacillus đều có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ như protein, tinh bột, cellulose nhờ khả năng sinh enzyme ngoại bào khá mạnh như: amylase, cellulase, protease [17]. 5 Ngoài các enzyme trên, các VK này còn có khả năng sinh bacterioxin-chất có hoạt tính kháng sinh có khả năng ức chế một số VSV gây bệnh đường ruột đặc biệt là E. coli, đồng thời giúp kích thích tiêu hóa và tăng trọng ở vật nuôi. Trong chế phẩm probiotic, người ta thường sử dụng các chủng thuộc giống Bacillus sau: B. subtilis, B. mesentericus, B. megathericum, B. licheniformis, B. clausii,[8, 17]. Các chủng này rất có ích, không gây bệnh cho người và vật nuôi.  Nấm men Saccharomyces: Nhóm này được con người biết đến từ rất lâu và được sử dụng trong nghề làm bánh mì, nấu rượu, làm bia, ủ rượu vangTrong thành phần của TB nấm men rất giàu protein, vitamin nhóm B và khoáng chất nên thường được bổ sung vào chế phẩm probiotic để làm giàu sinh khối TB [17]. Chúng còn hấp thu và bài thải độc tố ra ngoài, tham gia chuyển hóa glucose thành axit pyruvic là cơ chất cho các VSV có lợi hoạt động và sinh sản [14, 20]. Ngoài ra, TB nấm men có trong chế phẩm còn tạo mùi thơm, giúp cải thiện mùi cho MT và nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn cho vật nuôi. Để sản xuất probiotic, người ta thường dùng các chủng sau: S. cerevisiae, S. carlsbergensis, S. vini hoặc S. pombe [13], đặc biệt là S. boulardii. S. boulardii có tác động hiệu quả trong điều trị tiêu chảy nhiễm trùng cấp, ngừa tiêu chảy do kháng sinh và trị liệu phối hợp trong nhiễm trùng H. pylori [10].  Nấm mốc: Điển hình là Asp. oryzae, Asp. niger. Trong chế phẩm probiotic, chúng có vai trò sản sinh các enzym amylase, protease, cellulase,nhằm tăng cường khả năng tiêu hóa thức ăn của con người và vật nuôi, đồng thời cũng có thể được bổ sung vào chế phẩm để hỗ trợ quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ do thức ăn thừa hay phân do vật nuôi bài tiết ra [17]. Ngoài ra, còn một số nhóm VSV khác cũng được bổ sung vào chế phẩm probiotic giúp cải thiện MT nước nuôi trồng thủy sản, tăng khả năng làm sạch ao hồ, 6 giảm hoặc mất mùi hôi thối do H2S như: VK nitrat (Nitrobacter và Nitrosomonas), VK quang dưỡng khử H2S, VK tía có lưu huỳnh và VK tía không chứa lưu huỳnh (Rhodobacter sp., Rhodospirillum, Rhodopseudomonas viridis, Rhodopseudomonas palustris) [17] 1.1.4 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật probiotic với tiêu chuẩn đầu tiên là phải an toàn cho quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng sống sót ở điều kiện khắc nghiệt trong đường tiêu hóa vật chủ. Các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chủ yếu sau: - Khả năng tồn tại trong môi trường axit dạ dày: Các nhà khoa học đã chứng minh, các probiotic phải trải qua các quá trình tiêu hóa khắc nghiệt hơn 90 phút trước khi được giải phóng từ dạ dày vào ruột. Tuy nhiên, các quá trình tiêu hóa có thời gian xảy ra lâu hơn nên VSV probiotic phải chịu được áp lực của dạ dày với pH thấp đến khoảng 1,5. Do đó, các chủng được sử dụng làm probiotic phải chịu được pH thấp ít nhất 90 phút, tiếp đến chúng phải gắn vào biểu mô ruột và phát triển được trong ruột trước khi phát huy vai trò đối với vật chủ. Vì vậy, đây là yếu tố cần thiết để tạo sự thích nghi ban đầu, là một trong những tiêu chí quan trọng khi sàng lọc, tuyển chọn các chủng probiotic [10]. - Khả năng chịu muối mật: Muối mật được coi là chất kháng khuẩn trong đường tiêu hóa, bảo vệ ruột khỏi sự xâm nhập của các VSV gây bệnh. Do vậy, khi thức ăn cùng với VSV probiotic từ dạ dày chuyển xuống vùng ruột, tại đây, chúng sẽ chịu tác động của muối mật. Khả năng sống sót của các chủng VSV sau tác dụng của muối mật là một trong những đặc tính quan trọng của VSV được sử dụng làm probiotic [10, 21, 23]. Thông thường, muối mật trong dịch tiêu hoá của động vật dao động 1 – 3 % [50]. Để tồn tại 7 và phát triển, các chủng probiotic phải có khả năng tồn tại và phát triển với nồng độ muối mật ≥ 2% - Khả năng sinh enzyme ngoại bào: Một số chủng probiotic (Nấm men, Bacillus và Lactobacillus) có khả năng sinh enzym tiêu hoá như: amylase, cenlulase và protease, lipase và phytase có vai trò làm tăng khả năng tiêu hoá thức ăn và hấp thu chất dinh dưỡng của vật chủ - Hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh: Lựa chọn được các chủng có khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn là đặc tính quan trọng nhất trong phát triển probiotic. Các chủng probiotic cần có hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh như E. coli, Salmonella và Staphylococcus aureus. Hoạt tính kháng khuẩn của chúng có thể theo nhiều cơ chế khác nhau như: + Sản sinh ra các chất Bacteriocin. + Làm giảm độ pH bởi tạo ra axit lactic. + Tạo ra H2O2. + Làm giảm độc tố theo các cơ chế khác nhau. + Khả năng làm giảm sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh trên bề mặt. + Cạnh tranh dinh dưỡng với các vi khuẩn gây bệnh. - Khả năng sinh enzyme ngoại bào: 1.1.5 Cơ chế tác động của Probiotic Đã có nhiều nghiên cứu giải thích cơ chế tác động của probiotic, song vẫn còn nhiều ý kiến khác nhau. Sau đây là tóm tắt những kiểu tác động của probiotic được nhiều nhà khoa học chấp nhận [9, 24, 26]. Cơ chế tác động của probiotic được tóm tắt như sau [9, 27] 8 Cải thiện sức khỏe và năng suất Cải thiện sự cân bằng Giảm thiểu sự sản sinh hệ VK dạ dày – ruột nhóm amin độc hại Tăng độ hữu dụng của chất dinh dưỡng Cải thiện sự hấp thu Phân giải các chất dinh dưỡng như protein, Cạnh tranh với Vi sinh vật có lợi Tổng hợp VK gây bệnh vitamin đường ruột Sản xuất axit hữu cơ Sản xuất kháng Ức chế sự phát sinh triển của VK gây Làm giảm pH bệnh Kích thích miễn dịch Trung hòa các độc tố đường ruột Hình 1.1 Cơ chế tác động chung của probiotic đối với động vật - Probiotic giúp duy trì hệ VSV có lợi trong đường ruột bằng hoạt động đối kháng với VSV gây bệnh [28]. Đối kháng là hiện tượng một loài VSV bằng cách này hay cách khác ức chế hoặc tiêu diệt sự ST và phát triển của một loài VSV khác. Một số nhà khoa học cho 9 rằng, cơ chế tác động đối kháng xảy ra khi nguồn thức ăn cạn kiệt do sự phát triển nhanh chóng của một vài loại VSV và tạo điều kiện bất lợi cho sự phát triển của VSV khác Hoạt động đối kháng với VSV gây bệnh bao gồm:  Cạnh tranh về vị trí bám dính trên nhung mao ruột để tranh giành chất dinh dưỡng và khối lượng các chất được sinh ra. Khi VSV gây bệnh bị cạnh tranh, thiếu chất dinh dưỡng nên không thể sinh trưởng và phát triển được. Từ đó có thể ức chế hoặc tiêu diệt VSV gây bệnh, thiết lập lại sự cân bằng hệ VSV đường ruột. Phương pháp sử dụng probiotic để loại trừ các VK có hại bằng quá trình cạnh tranh tốt hơn... tím – iot bị giữ lại bên trong tế bào  màu tím Cách tiến hành - Làm tiêu bản:  Dùng que cấy lấy sinh khối làm vết bôi trên lame  Hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn - Nhuộm tiêu bản:  Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm Crystal Violet trong 30 giây  Rửa nước  Nhuộm lugol trong 1 phút  Rửa nước  Tẩy cồn 960 trong 20 – 30 giây, để ngiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến khi tan hết màu.  Rửa nước  Nhuộm bổ sung Fuchsin hoặc Safranin từ 10 – 30 giây  Rửa nước  Thấm khô  Quan sát [16] 31 2.6 Phương pháp nhuộm bào tử theo Schaeffer và Fulton Nguyên tắc Dựa trên cấu trúc đặc biệt của bào tử: dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipit. Trước hết xử lí để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và axit. - Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và TB bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh. - Tẩy màu tế bào chất TB đi và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm bổ sung. Nhờ đó tế bào chất của bào tử và tế bào chất TB bắt màu phân biệt. Cách tiến hành - Dùng dây cấy vòng vô trùng lấy sinh khối vi khuẩn cần xác định làm vết bôi trên lame - Đặt 1 cốc nước trên bếp từ và đun sôi. Sau đó đặt lên trên miệng cốc một miếng giấy lọc - Cho dung dịch Malachite Green 5% vào vết bôi và đặt lame có sinh khối của vi khuẩn lên miếng giấy lọc trên cốc và để trong thời gian 5 phút - Sau đó, rửa vết bôi bằng nước trong khoảng thời gian 30 giây - Nhuộm bổ sung với thuốc nhuộm Fuchsin trong khoảng 60 – 90 giây - Rửa lại bằng nước cất rồi thấm khô - Quan sát dưới kính viển vi Đọc kết quả - Bào tử  màu xanh - Tế bào sinh dưỡng  màu đỏ [11, 16] 2.7 Xác định mật độ TB bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Nguyên tắc Đếm số KL mọc trên MT từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem mỗi KL được hình thành từ một TB duy nhất 32 Cách tiến hành - Chuẩn bị dung dịch pha loãng: Dùng pipetman hút 1ml dịch nuôi cấy đưa sang ống nghiệm có 9ml NaCl 0,85%, ta được độ pha loãng 10-1, tiếp tục pha loãng để được các độ pha loãng 10-2,10-3, 10-4, 10-5, 10-6. - Chuẩn bị MT thạch đĩa: MT1 được vô trùng cẩn thận. - Cấy và dàn đều dịch pha loãng.  Dùng pipetman lấy 0,1ml dịch huyền phù từ các độ pha loãng 10-4, 10-5, 10-6 cho vào mỗi đĩa Petri, mỗi độ pha loãng cấy 2 đĩa.  Dùng que trang trang mẫu thật đều trên mặt thạch để tách riêng rẽ từng TB. Ghi vào nắp hộp Petri các thông tin: nồng độ pha loãng, ngày cấy, chủng cấy mẫu. - Lật ngược các đĩa Petri vừa cấy, cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 37oC. - Sau 24 giờ, đếm số KL trong mỗi đĩa. Ghi nhận các độ pha loãng có số KL từ 25 đến 250 KL/đĩa [16, 22, 25, 28] Cách tính kết quả: Số lượng tế bào VK trong 1ml dịch nuôi cấy được tính theo công thức: 푁 X (CFU/ml) = n1V푓1 + + 푛푖V푓푖 Trong đó: X: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc) trong 1ml mẫu N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn (trong khoảng 25 – 250 khuẩn lạc) n: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường f: độ pha loãng tương ứng 2.7.1 Xác định mật độ TB bằng phương pháp đo mật độ quang Nguyên tắc: Cơ sở của phương pháp này là tính chất hấp phụ hoặc làm lệch một phần ánh sáng của các dung dịch có vật chất lơ lửng. VSV trong MT nuôi cấy có thể hấp thu 33 hoặc phân tán ánh sáng làm cho ánh sáng truyền suốt bị giảm. Do đó, số lượng ánh sáng được hấp thu hoặc phân tán có mối tương quan thuận với số lượng VSV trong dịch nuôi cấy. Độ đục này chính là giá trị OD (Optical Density) đo được ở bước sóng 600nm (OD600nm) trên máy quang phổ (dựa trên sự tương quan tuyến tính giữa OD600nm và mật độ TB (cfu /ml) [12, 25] Cách tiến hành 2.7.1.1 Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ TB (đường chuẩn) - Pha loãng huyền phù chứa chủng Bacillus cần xác định thành các huyền phù khác nhau có độ đục đo ở OD600nm đạt các giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. Xác định giá trị thực tế OD600nm của các huyền phù vừa được pha, ghi nhận số đo thực tế - Dùng phương pháp đếm KL, xác định mật độ TB (cfu/ml) của các huyền phù này. - Tính giá trị log N (cfu /ml) cho mỗi giá trị mật độ tương ứng với mỗi giá trị độ đục. Vẽ đường chuẩn biểu diễn của log N (cfu/ml) (trục tung) theo OD600nm (trục hoành). Xác định khoảng tuyến tính giữa log N (cfu /ml) và OD600nm - Dùng phần mền Microsoft office Excel 2010 để phân tích sự tuyến tính giữa log N (cfu /ml) - giá trị OD600nm và dựng đường chuẩn bằng công cụ Insert Charts 2.7.1.2 Xác định mật độ TB theo độ đục và OD600nm - Sau khi nuôi cấy VK trong MT lỏng với các điều kiện phù hợp, lấy dịch sau nuôi cấy đo OD600nm (dịch nuôi cấy VK cần được pha loãng trước khi đo OD600nm). - Từ giá trị OD600nm đo được, dựa vào đường chuẩn suy ra số lượng TB (cfu /ml) của mẫu và nhân với độ pha loãng. 2.7.2 Lập đường cong tăng trưởng Chủng vi khuẩn Bacillus thử nghiệm được tăng sinh trong 50ml môi trường LB ở 37oC, 24 giờ 34 Cấy 1 lượng dịch vi khuẩn Bacillus thử nghiệm đã huyền phù vào erlen chứa 450ml môi trường LB sao cho OD xấp xỉ khoảng 0,1 - 0,5; đem nuôi cấy lắc 150 vòng/phút ở 37oC Xác định đường cong tăng trưởng: đo OD dịch nuôi cấy lắc sau mỗi 2 giờ nuôi cấy, ghi nhận sự phát triển của vi khuẩn 2.7.3 Khảo sát sự tạo thành bào tử Kiểm tra mật độ bào tử bằng phương pháp xử lý nhiệt ở 80oC trong vòng 15 phút trong bể điều nhiệt. Pha loãng và cấy trang ở các độ pha loãng thích hợp 2.8 Khảo sát các đặc điểm probiotic 2.8.1 Khảo sát khả năng chịu axit dạ dày Nguyên tắc: Dạ dày của gia súc có pH thấp (1 – 3) là nơi có ảnh hưởng mạnh đến khả năng sống sót của các chủng VSV được sử dụng làm probiotic trong chăn nuôi. Dựa vào khả năng chịu pH thấp (1 - 3) của dạ dày và tồn tại sau thời gian tiêu hóa ở dạ dày (1 - 3 giờ) làm cơ sở để tuyển chọn các chủng probiotic [15, 23] Cách tiến hành: - Chuẩn bị giống: Các chủng Bacillus nghiên cứu được tăng sinh trong MT1 (không bổ sung agar) trong 24 giờ ở 37oC - Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 5ml MT1 có pH=2 được điều chỉnh bằng HCl 1N. Thí nghiệm lặp lại 3 lần - Chuyển dịch huyền vào ống nghiệm đã chuẩn bị - Ủ mẫu ở 37oC. Tại các thời điểm 0, 60, 180 phút tiến hành pha loãng mẫu bằng cách cấy trang theo mục 3.4.3 - Ủ mẫu sau khi trang ở 37oC, 24 giờ. Đếm số KL mọc trên đĩa và tính tỷ lệ sống sót của TB sau các khoảng thời gian khác nhau Kiểm tra kết quả 35 - Tính tỷ lệ TB sống sót (%) 푁 푖 × 100 푁표 Trong đó: Ni: mật độ TB sau thời điểm i (i là 60 và 180 phút) No: mật độ TB ở thời điểm 0 phút - Căn cứ vào tỷ lệ TB sống sót ở pH 2 và thời gian khác nhau để chọn chủng Bacillus 2.8.2 Khảo sát khả năng chịu muối mật Nguyên tắc: Các chủng VSV probiotic khi qua ruột non sẽ chịu tác động của muối mật trong đường ruột. Dựa trên khả năng sống sót của các chủng Bacillus sau tác động của muối mật trong đường ruột làm cơ sở để tuyển chọn các chủng probiotic. [15, 23] Cách tiến hành: - Chuẩn bị giống: Các chủng Bacillus nghiên cứu được tăng sinh trong MT1 (không bổ sung agar) trong 24 giờ ở 37oC - Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 5ml MT1 có bổ sung 2% muối mật. Thí nghiệm lặp lại 3 lần - Chuyển dịch huyền vào ống nghiệm đã chuẩn bị - Ủ mẫu ở 37oC. Tại các thời điểm 0, 60, 180 phút tiến hành pha loãng mẫu bằng cách cấy trang theo mục 3.4.3 - Ủ mẫu sau khi trang ở 37oC, 24 giờ. Đếm số KL mọc trên đĩa và tính tỷ lệ sống sót của TB sau các khoảng thời gian khác nhau Kiểm tra kết quả - Tính tỷ lệ TB sống sót (%) 푁 푖 × 100 푁표 36 Trong đó: Ni: mật độ TB sau thời điểm i (i là 60 và 180 phút) No: mật độ TB ở thời điểm 0 phút - Căn cứ vào tỷ lệ TB sống sót ở muối mất 2% và thời gian khác nhau để chọn chủng Bacillus 2.8.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào 2.8.3.1 Xác định hoạt tính protease bằng cách đo đường kính vòng thủy phân Nguyên tắc: Xác định chủng Bacillus có khả năng sinh enzyme protease thủy phân gelatin. Enzyme tác động với cơ chất trong MT thạch, cơ chất bị phân hủy tạo thành vòng trong suốt xung quanh lỗ khoan. Độ lớn MT trong suốt phản ánh hoạt tính của enzyme [11, 16, 24] Cách tiến hành: - Nuôi VK trong MT9 (không bổ sung agar) như đã trình bày ở mục 3.3, lắc 150 vòng/phút, 37oC - Sau 24 giờ, lấy dịch nuôi cấy ly tâm 5000v/p, 15phút, thu dịch nổi, sau đó lọc qua màng cellulose hoặc phi lọc để loại bỏ hoàn toàn tế bào còn sót lại. - Đổ môi trường thạch đĩa có chứa 1% gelatin vào đĩa petri. Chờ môi trường nguội đông lại dùng khuyên đục lỗ (đường kính d=0,7cm), đục 3 lỗ trên môi trường thạch tạo thành các giếng - Dùng pipetMan hút 20μl dịch cho vào mỗi lỗ thạch, để yên và ủ ở 37oC. Sau 24 giờ, dùng thuốc nhuộm lugol đo vòng kháng khuẩn. Nếu VK sinh protease sẽ tạo vòng trong suốt quanh lỗ thạch. Đánh giá khả năng tạo thành enzym để tuyển chọn những giống có hoạt tính enzym cao: 37 - Lật sấp đĩa petri dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D), và đo đường kính của giếng (d). Đánh giá khả năng hình thành enzym: Tỷ lệ D-d càng lớn thì khả năng sinh enzym càng nhiều 2.8.3.2 Xác định hoạt tính amylase bằng cách đo đường kính vòng thủy phân [19] Nguyên tắc: Xác định chủng Bacillus có khả năng sinh hệ enzyme amylase thủy phân tinh bột thành glucose. Enzyme tác động với cơ chất trong MT thạch, cơ chất bị phân hủy tạo thành vòng trong suốt xung quanh lỗ khoan. Độ lớn MT trong suốt phản ánh hoạt tính của enzyme Cách tiến hành: - Nuôi VK trong MT8 (không bổ sung agar) như đã trình bày ở mục 3.3, lắc 150 vòng/phút, 37oC - Sau 24 giờ, lấy dịch nuôi cấy ly tâm 5000v/p, 15phút, thu dịch nổi, sau đó lọc qua màng cellulose hoặc phi lọc để loại bỏ hoàn toàn tế bào còn sót lại. - Đổ môi trường thạch đĩa có chứa 1% tinh bột tan vào đĩa petri. Chờ môi trường nguội đông lại dùng khuyên đục lỗ (đường kính d=0,7cm), đục 3 lỗ trên môi trường thạch tạo thành các giếng - Dùng pipetMan hút 20μl dịch cho vào mỗi lỗ thạch, để yên và ủ ở 37oC. Sau 24 giờ, dùng thuốc nhuộm lugol đo vòng kháng khuẩn. Nếu VK sinh amylase sẽ tạo vòng trong suốt quanh lỗ thạch Đánh giá khả năng tạo thành enzym để tuyển chọn những giống có hoạt tính enzym cao: - Lật sấp đĩa petri dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D), và đo đường kính của giếng (d). Đánh giá khả năng hình thành enzym: Tỷ lệ D-d càng lớn thì khả năng sinh enzym càng nhiều 38 2.8.3.3 Xác định hoạt tính cellulase bằng cách đo đường kính vòng thủy phân [11] Nguyên tắc: Enzyme tác động với cơ chất trong MT thạch, cơ chất bị phân hủy tạo thành vòng trong suốt xung quanh lỗ khoan. Độ lớn MT trong suốt phản ánh hoạt tính của enzyme Cách tiến hành: - Nuôi VK trong MT10 (không bổ sung agar) như đã trình bày ở mục 3.3, lắc 150 vòng/phút, 37oC - Sau 24 giờ, lấy dịch nuôi cấy ly tâm 5000v/p, 15phút, thu dịch nổi, sau đó lọc qua màng cellulose hoặc phi lọc để loại bỏ hoàn toàn tế bào còn sót lại. - Đổ môi trường thạch đĩa có chứa 1% CMC vào đĩa petri. Chờ môi trường nguội đông lại dùng khuyên đục lỗ (đường kính d=0,7cm), đục 3 lỗ trên môi trường thạch tạo thành các giếng - Dùng pipetMan hút 20μl dịch cho vào mỗi lỗ thạch, để yên và ủ ở 37oC. Sau 24 giờ, dùng thuốc nhuộm lugol đo vòng kháng khuẩn. Nếu VK sinh cellulase sẽ tạo vòng trong suốt quanh lỗ thạch Đánh giá khả năng tạo thành enzym để tuyển chọn những giống có hoạt tính enzym cao: - Lật sấp đĩa petri dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D), và đo đường kính của giếng (d). Đánh giá khả năng hình thành enzym: Tỷ lệ D-d càng lớn thì khả năng sinh enzym càng nhiều 39 2.8.4 Khảo sát khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp đường vuông góc Cross Streak Nguyên tắc: Dựa vào sự khuếch tán của chất ức chế trong dịch nuôi cấy VK vào MT thạch, những nơi nào có chất ức chế khuếch tán thì nơi đó VSV kiểm định không sinh trưởng được và tạo thành đường vô khuẩn Cách tiến hành - Chuẩn bị giống: Các chủng Bacillus nghiên cứu và các chủng vi sinh vật gây bệnh được tăng sinh trong MT1 (không bổ sung agar) trong 24 giờ ở 37oC. - Sau 24 giờ tăng sinh các chủng Bacillus nghiên cứu, dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối và cấy chủng VK dọc theo một đường ngang trên đĩa thạch LA, ủ 37oC - Sau 24 giờ ủ, tiến hành cấy vi khuẩn gây bệnh đã được tăng sinh trước đó theo các vạch thẳng góc với vạch vi khuẩn đã mọc. Ủ 37oC, 24 giờ. - Đo khoảng cách giữa mép của vạch vi khuẩn với chỗ vi sinh vật gây bệnh bắt đầu sinh trưởng 2.8.5 Khảo sát môi trường tạo bào tử - Chuẩn bị giống: Các chủng Bacillus nghiên cứu được tăng sinh trong MT1 (không bổ sung agar) trong 24 giờ ở 37oC - Chuẩn bị môi trường tạo bào tử: MT1 đến MT8. MT1 (môi trường LB) đây là môi trường cơ bản cho tất cả các chủng Bacillus để sinh trưởng và phát triển tốt. [60] MT2 được sử dụng để khảo sát tạo mật độ bào tử Bacillus subtilis R14 với mật độ đạt được 108 cfu/ml. [32] MT3 cho mật độ tế bào Bacillus subtilis 7,5 × 109 cfu/ml, mật độ bào tử: 3,6 × 109 cfu/ml, hiệu suất hình thành bào tử 48%. Trong khi đó MT4 cho mật độ TB 40 Bacillus subtilis: 6,2 × 109 cfu/ml, mật độ bào tử: 4,8 × 109 cfu/ml, hiệu suất hình thành bào tử 77% [51] MT5 mật độ TB Bacillus subtilis EA-CB0575 đạt được 2,01 × 109 cfu/ml, mật độ bào tử 1,87 × 109 cfu/ml, hiệu suất hình thành bào tử 93,2% [45] Chủng Bacillis EA-CB0575 khảo sát trên MT6 cho mật độ bào tử là 1,4 × 109 cfu/ml, hiệu suất hình thành bào tử là 94% [35] Vitamin cần thiết cho sự hình thành bào tử. Vì vậy MT7 sử dụng môi trường NA kết hợp với B. complas để tạo môi trường kích thích tạo bào tử [49] - Sau 24 giờ tăng sinh các chủng Bacillus nghiên cứu được cấy chuyển vào 8 môi trường khác nhau. Ủ 37oC, 150 rpm - Lấy mẫu kiểm tra: kiểm tra mật độ tế bào sau 24 giờ bằng cách đo OD và mật độ bào tử sau 72 giờ nuôi cấy 2.8.6 Khảo sát các phương pháp tạo bào tử nhiều nhất - Chọn chủng có hoạt tính probiotic tốt nhất khảo sát điều kiện tạo bào tử tốt nhất - Các điều kiện khảo sát: cô đặc, nuôi cấy môi trường nghèo dinh dưỡng, nâng pH, tăng nhiệt độ nuôi cấy Cách tiến hành - Chuẩn bị giống: Chủng Bacillus tốt nhất được tăng sinh trong MT1 (không bổ sung agar) trong 24 giờ ở 37oC - Chuẩn bị môi trường: LB, nước muối sinh lý, môi trường tối ưu tạo bào tử - Sau 24 giờ tăng sinh cấy chuyển chủng vào bình erlen có chứa 450ml môi trường LB - Sau 24 giờ nuôi cấy thì bắt đầu xử lý các điều kiện tạo bào tử nhiều nhất: 41  Cô đặc: Bình erlen có chứa 450ml môi trường tối ưu tạo bào tử được ly tâm ở 5000 vòng/phút, 5 phút. Sau đó sinh khối ly tâm có chứa một lượng nhỏ môi trường LB được nuôi cấy lắc ở 150rpm  Nuôi cấy môi trường nghèo dinh dưỡng: Bình erlen có chứa 450ml môi trường tối ưu tạo bào tử được ly tâm ở 5000 vòng/phút, 5 phút. Sau đó sinh khối ly tâm được nuôi cấy tiếp trong môi trường nước muối sinh lý, lắc ở 150rpm  pH: Bình erlen có chứa 450ml môi trường tối ưu tạo bào tử được nâng pH = 9, 10, 11 bằng NaOH 10N, lắc ở 150rpm  Nhiệt độ: Chuyển bình erlen có chứa 450ml môi trường tối ưu tạo bào tử vào điều kiện nuôi cấy là 45oC, lắc ở 150rpm. - Lấy mẫu kiểm tra mật độ tế bào và mật độ bào tử sau các khoảng thời gian khác nhau: Kiểm tra kết quả: - Hiệu suất hình thành bào tử (%) 푀ậ푡 độ 푏à표 푡ử 푔푖ờ 푖 푛 × 100 푀ậ푡 độ 푡ế 푏à표 푖표 Trong đó: in: là mật độ bào tử tại các thời điểm khảo sát (cfu/ml) io: mật độ tế bào nhiều nhất (cfu/ml) 2.8.7 Sản xuất bào tử quy mô pilot Từ các kết quả đã khảo sát ở trên đề xuất quy trình lên men trong môi trường lỏng để thu bào tử của chủng Bacillus với mẻ 3,5 L (trong bồn lên men 5 L thuộc Biostat, Sartorius, Đức ) 2.8.7.1 Khảo sát thời gian thích hợp để đạt sinh khối cao nhất Vì thời gian có hạn nên không thể khảo sát hết các yếu tố cần thiết, nên: 42 - Thừa kế thông số về tốc độ khuấy, oxy hòa tan (pO2) từ các nghiên cứu khác (Fabrízio Siquer Boniolo và cộng sự, 2012; Trần Hữu Tâm, 2014; S. M. S. Monteiro và cộng sự, 2014). - pH: thừa kế thông số về pH như khảo sát ở các thí nghiệm trên - Xác định thời gian có mật độ tế bào cao nhất: 4 giờ lấy mẫu pha loãng và cấy trang trên môi trường LB rắn 2.8.7.2 Tiến hành tạo bào tử - Sau khi có thời gian tối ưu cho mật độ tế bào nhiều nhất, bắt đầu chỉnh pH từ pH 7 lên 9 để tạo điều kiện bất lợi giúp cho quá trình hình thành bào tử - Theo nghiên cứu của Fabrízio Siquer Boniolo và cộng sự (2012) thì tiếp tục khuấy và sục khí để hình thành bào tử. Mặt khác theo Sarrafzadeh và Navarro (2006) thấy rằng sự gián đoạn cung cấp oxy ảnh hưởng đến việc hình thành bào tử 2.8.7.3 Sản xuất chế phẩm Sử dụng kết quả của mục 2.8.7.1 và 2.8.7.2 Cách tiến hành Chuẩn bị giống: Tăng sinh chủng Bacillus trong bình erlen chứa 350 ml môi trường LB ở 37oC, 150rpm Sau 24 giờ tăng sinh, cấy chuyển sang bồn lên men có chứa 3150ml môi trường tạo bào tử tối ưu. - Thời gian lấy mẫu: 4 giờ lấy mẫu 1 lần. Sau 24 giờ bắt đầu xử lý pH từ pH 7 lên pH 9 bằng NaOH và tiếp tục 4 giờ lấy mẫu 1 lần. - Kiểm tra bào tử: xử lý nhiệt ở 80oC, 15 phút bằng bể điều nhiệt. Sau đó tiến hành cấy trang và pha loãng ở độ pha loãng phù hợp - Thu bào tử: ly tâm ở 5000 vòng/phút, 10 phút - Sấy: Bào tử sau ly tâm được trộn với bột mì đã được hấp tiệt trùng ở 121oC, 15 phút, 1 atm và đem sấy ở nhiệt độ 40oC đến khi khô 43 - Tạo chế phẩm: sau khi bào tử khô được nghiền mịn, bổ sung các chất mang và đóng gói. 2.8.8 Phân tích thống kê dữ liệu Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel, trong bộ Microsoft Office phiên bản 2010 44 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát các đặc điểm probiotic Căn cứ vào các tiêu chuẩn chọn chủng VSV làm probiotic, tiến hành sàng lọc và tuyển chọn chủng Bacillus đáp ứng yêu cầu tạo chế phẩm probiotic 3.1.1 Khả năng chịu axit dạ dày Khả năng sống sót của các chủng Bacillus sau tác dụng của pH thấp ở dạ dày là một trong những đặc tính quan trọng của chủng VSV được chọn làm probiotic. Do vậy, tiến hành khảo sát khả năng chịu pH thấp của chúng ở pH 2 tại các thời điểm 0, 60, 180 phút (tương ứng với thời gian thức ăn lưu lại tại dạ dày). Đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch, từ đó tính tỷ lệ tế bào sống sót (%) của các chủng VK khảo sát với các khoảng thời gian khác nhau (mục 1.4.7.1). Bảng 3.1 Tỷ lệ sống sót của 11 chủng vi khuẩn trong môi trường pH thấp Tỷ lệ tế bào sống sót ở pH 2 qua các Kí hiệu STT khoảng thời gian (%) chủng 0 phút 60 phút 180 phút 1 BI1 100 158,97 27,32 2 BI2 100 30,35 10,58 3 BI3 100 25,61 12,56 4 BI4 100 16,50 10,43 5 MN1 100 25,83 9,87 6 MN2 100 51,75 11,32 7 Sub 100 84,73 43,45 8 Yoi 100 115,80 48,44 9 Liche 100 0 0 10 Natto 100 0 0 45 11 BA 100 0 0 Số liệu ở bảng trên cho thấy rằng dưới tác động của pH thấp (pH 2), hầu hết các chủng khảo sát đều có xu hướng giảm tỷ lệ sống sót khi kéo dài thời gian xử lý (0 phút đến 180 phút). Trong 11 chủng thử nghiệm chỉ có 8 chủng (BI1, BI2, BI3, BI4, MN1, MN2, Sub, Yoi) có khả năng tồn tại ở điều kiện pH thấp cụ thể như sau: Sau 60 phút khảo sát thì cả 3 chủng Liche, Natto, BA đều không sống sót được trong môi trường pH 2 (0%). Trong khi đó sau 180 phút khảo sát của 8 chủng còn lại, tỷ lệ tế bào sống sót cao nhất thu được từ chủng Yoi (48,4%), kế đến là Sub (43,4%), BI1, BI3, MN2, BI2, BI4, và thấp nhất là MN1 (9,1%). Trong đó chủng BI1 sau 60 phút có sự phát triển trong môi trường pH 2, điều này cho thấy chủng BI1 thích nghi tốt trong điều kiện này, tuy nhiên sau 180 phút thì tỷ lệ sống sót của chủng giảm mạnh. Mặt khác, so sánh với các nghiên cứu của nhóm tác giả Hồ Trung Thông và Hồ Lê Huỳnh Châu (2009) về khả năng chịu pH thấp của các chủng probiotic: sau 180 phút khảo sát ở pH 2, tỷ lệ TB sống sót của 4 chủng LA5, LA6, LA7 và LA11 lần lượt là 53,56%, 28,42%, 23,23% và 27,81% [21]. Đồng thời, nghiên cứu của Trần Thị Bích Quyên (2012) cho thấy tỷ lệ sống sót trong điều kiện pH 2 của 4 chủng Q1, Q16, Q22 và Q29 lần lượt là 42,52%, 42,38%, 45,93% và 38,94% [18]. Từ đây có thể thấy khả năng chịu pH thấp của 8 chủng là tương đối thấp so với các nghiên cứu đã đề cập ở trên. Tóm lại, qua 180 phút khảo sát thì chủng Sub và Yoi có tỷ lệ sống sót cao nhất (48,4%, 43,4%) tương đồng với khá nhiều tác giả 3.1.2 Khả năng chịu muối mật Trong hệ tiêu hóa, sau khi trải qua điều kiện khắc nghiệt với pH thấp ở dạ dày, các VSV probiotic lại phải tiếp xúc với muối mật trong đường ruột. Muối mật được coi là chất kháng khuẩn trong đường tiêu hóa, bảo vệ ruột khỏi sự xâm nhập của các VSV gây bệnh. 46 Havenaar và cộng sự (1992) đã chỉ ra rằng, probiotic chỉ phát huy tác dụng có lợi lên vật chủ khi chúng định cư và tồn tại trong ruột non để từ đó hình thành KL, tăng khả năng kết dính trong đường ruột. Như vậy, dựa trên khả năng sống sót của các chủng Bacillus sau tác dụng của muối mật trong đường ruột làm tiêu chí quan trọng để sàng lọc các chủng VSV probiotic. Ở ruột non, nơi dịch mật toàn phần tiết ra có thể có nồng độ cao nhất khoảng 2%. Vì vậy tiến hành khảo sát khả năng chịu muối mật của các chủng Bacillus ở nồng độ muối mật 2% tại các thời điểm 0, 60, 180 phút (tương ứng với hời gian thức ăn lưu lại tại ruột non của người và động vật (Charteris và cộng sự, 1998) Bảng 3.2 Tỷ lệ sống sót của 11 chủng vi khuẩn trong môi trường muối mật 2% STT Chủng Tỷ lệ tế bào sống sót ở muối mật 2% qua các khoảng thời gian (%) 0 phút 60 phút 180 phút 1 BI1 100 89,12 16,25 2 BI2 100 83,86 39,52 3 BI3 100 33,21 7,56 4 BI4 100 21,25 11,17 5 MN1 100 128,79 45,26 6 MN2 100 19,58 7,20 7 Sub 100 269,79 64,44 8 Yoi 100 169,32 27,74 9 Liche 100 35,52 17,94 10 Natto 100 49,08 20,05 11 BA 100 41,34 31,94 Bảng số liệu cho thấy, cả 11 chủng đều có khả năng chịu muối mật 2%. Tuy nhiên tỷ lệ sống sót giảm dần theo thời gian như sau: Sau 180 phút, tỷ lệ sống sót cao 47 nhất thu được từ chủng Sub (64,44%), kế đến là MN1 (45,26%), BI2, BA, Yoi, Natto, Liche, BI1, BI4, BI3, và thấp nhất là MN2 (7,20%). Mặt khác, so sánh với nghiên cứu của Trần Thị Bích Quyên về khả năng chịu muối mật của các chủng probiotic thấy được 4 chủng Q1, Q16, Q29, Q22 đều có tỷ lệ sống sót cao từ 75,51% - 105,85%, trong đó chủng Q22 đạt tỷ lệ sống sót cao nhất 105,85% [18]. Ba chủng còn lại có tỷ lệ sống sót ở thời điểm 4 giờ giảm so với thời điểm 1 giờ khảo sát Tóm lại, sau 180 phút khảo sát thì chủng Sub cho tỷ lệ tế bào sống sót tốt nhất với 64,44% 3.1.3 Khả năng sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase) Như chúng ta đã biết, thành phần chủ yếu trong thức ăn chăn nuôi là protein (bột cá, bột xương, bột đậu nành), xơ thô và tinh bột Tuy nhiên, sự phân tiết các enzyme tiêu hóa ở dạ dày và ruột non của động vật còn thấp nên khả năng tiêu hóa thức ăn còn hạn chế và dễ dẫn đến tiêu chảy. Vì vậy, khả năng sinh các enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase) của các chủng probiotic có vai trò hỗ trợ tiêu hóa thức ăn, chuyển hóa các chất khó tiêu thành chất dễ tiêu, giúp heo con tăng trọng Vì vậy, 11 chủng Bacillus đang khảo sát được tiến hành xát định khả năng sinh enzyme ngoại bào theo phương pháp ở mục 1.4.7.3 48 Bảng 3.3 Hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng Bacillus STT Kí hiệu Đường kính vòng phân giải, D-d (mm) chủng Protease Amylase Cellulase 1 BI1 15,00 ± 0,00 14,66 ± 0,47 15,67 ± 0,47 2 BI2 13,33 ± 0,47 14,66 ± 0,47 15,67 ± 0,47 3 BI3 13,00 ± 0,82 13,33 ± 0,47 13,00 ± 0,00 4 BI4 16,67 ± 0,47 13,67 ± 0,47 16,33 ± 0,47 5 MN1 14,33 ± 0,47 11,33 ± 2,36 - 6 MN2 9,33 ± 0,94 15,67 ± 1,25 - 7 Sub 15,67 ± 0,47 8,33 ± 0,94 15,00 ± 0,00 8 Yoi 15,00 ± 0,82 13,00 ± 0,00 14,67 ± 0,47 9 Liche 18,33 ± 0,94 13,33 ± 0,47 15,00 ± 0,00 10 Natto 6,67 ± 0,47 8,33 ± 0,47 - 11 BA 15,67 ± 0,47 14,67 ± 0,47 14,67 ± 0,47 Liche BI4 Sub Liche – Protease BI4 – Protease Sub – Protease 49 BA BI1 MN2 BI1 – Amylase MN2 – Amylase BA – Amylase BI4 BI1 BI2 BI4 – Cellulase BI1 – Cellulase BI2 – Cellulase Hình 3.1 Vòng phân giải gelatin (protease), tinh bột (amylase), cellulose (cellulase) của các chủng Bacillus Kết quả khảo sát phía trên cho thấy rằng hầu hết các chủng Bacillus khảo sát đều có khả năng sinh cả 3 loại enzyme ngoại bào. Có thể đây là một đặc tính nổi bật của các loài Bacillus để chúng thích nghi và tồn tại với điều kiện môi trường sống phức tạp. Trong đó, chủng Liche, BI4, BA và Sub có hoạt tính protease tương đối mạnh (15 – 19 mm) so với các chủng còn lại, chủng MN2, BI1, BI2, BA hoạt tính amylase tương đối mạnh (14 – 15 mm) so với các chủng còn lại, còn hoạt tính cellulase cũng biểu hiện tương đối mạnh ở các chủng BI4, BI1, BI2, Sub, Liche (14 – 17 mm) Tóm lại, hoạt tính protease của chủng Liche là tốt nhất với 18,33 ± 0,94 mm. Hoạt tính amylase của chủng MN2 là tốt nhất với 15,67 ± 1,25mm. Hoạt tính cellulase của chủng BI4 là tốt nhất với 16,33 ± 0,47 mm 50 3.1.4 Khả năng đối kháng kháng với vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp đường vuông góc Cross Streak Để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, ngoài việc cạnh tranh vị trí bám dính thì khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh là một đặc tính rất quan trọng của các chủng VSV được chọn làm probiotic. Các chủng Bacillus được tiến hành khảo sát khả năng đối kháng với 3 chủng VK kiểm định gồm E. coli, Salmonella typhimurium, Streptococcus aureus. Tiến hành theo phương pháp 1.4.7.4, thu được kết quả như sau: Bảng 3.4 Hoạt tính đối kháng của các chủng Bacillus với vi khuẩn kiểm định Khoảng cách đối kháng của các chủng Bacillus (mm) STT Kí hiệu chủng Salmonella Streptococcus E. coli typhimurium aureus 1 BI1 - - 4 2 BI2 - - 6 3 BI3 - - 3 4 BI4 - - 5 5 MN1 - - 2 6 MN2 - - - 7 Sub - - 4 8 Yoi - - 7 9 Liche - - 5 10 Natto - - 4 11 BA - - 2 51 BI1 BI2 Sub Yoi Liche BI4 Hình 3.2 Hoạt tính đối kháng với VK kiểm định của các chủng Bacillus Kết quả được trình bày ở trên bảng cho thấy, 10/11 chủng có khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định Streptococcus aureus, trong đó chủng Yoi, BI2, Liche, BI4 cho hoạt tính đối kháng tương đối mạnh (7 mm, 6 mm, 5 mm, 5 mm). Tất cả 11 chủng Bacillus khảo sát không có khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định E. coli và Salmonella typhimurium. Tóm lại, chủng Yoi cho khả năng đối kháng mạnh với Streptococcus aureus với khoảng cách đối kháng là 7 mm Như vậy, qua 4 bước sàng lọc và tuyển chọn các đặc tính probiotic của các chủng Bacillus trong điều kiện in vitro, nhận thấy được 2 chủng Sub và Yoi có tiểm năng sử dụng làm probiotic trong chăn nuôi. Bước kế tiếp, 2 chủng vi khuẩn này sẽ được khảo sát khả năng tạo sinh khối và sinh bào tử. Từ đó chọn ra chủng vi khuẩn tốt nhất cho sản xuất probiotic dạng bào tử Bacillus. 52 3.2 Đặc tính sinh học và phân loại chủng đã tuyển chọn 3.2.1 Đặc tính hình thái của chủng Sub và Yoi Hình thái khuẩn lạc Hình thái tế bào (x40) Hình thái bào tử (x40) Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và bào tử của chủng Sub Hình thái khuẩn lạc Hình thái tế bào (x40) Hình thái bào tử (x40) Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và bào tử của chủng Yoi 53 3.2.2 Tổng hợp một số đặc tính probiotic của chủng Sub và Yoi Bảng 3.5 Tổng hợp một số đặc tính probiotic của chủng Sub và Yoi Stt Đặc tính probiotic Sub Yoi 1 Tỷ lệ sống sót ở pH 2 sau 180 phút 43,35% 48,44% Khả năng chịu muối mật 2% sau 180 2 64,44% 27,74% phút Vòng phân giải protease (Khả năng phân 3 15,67 ± 0,47 15,00 ± 0,81 giải casein, mm) Vòng phân giải amylase (Khả năng phân 4 14,67 ± 0,47 13,00 ± 0,00 giải tinh bột, mm) Vòng phân giải cellulase (Khả năng 5 15,00 ± 0,0 14,67 ± 0,47 phân giải cellulose, mm) Khoảng cách đối kháng với VK kiểm 6 định Streptococcus aureus (Khả năng 4 7 đối kháng với VK kiểm đinh, mm) 3.3 Thiết lập đường cong tăng trưởng chủng Sub 3.3.1 Thiết lập đường chuẩn Việc thiết lập đường cong tăng trưởng một cách gián tiếp theo giá trị OD bắt buộc phải thông qua một bước là thiết lập đường chuẩn tương quan giữa OD và mật độ tế bào. Sau các thao tác pha loãng, đo OD và đếm thì có được các dữ liệu như sau: 54 Bảng 3.6 Kết quả khảo sát đường chuẩn chủng Sub OD N (cfu/ml) Log N 0,16 9,70 × 107 7,99 0,215 1,02 × 108 8,01 0,27 1,18 × 108 8,07 0,354 1,38 × 108 8,14 0,4 1,51 × 108 8,18 0,474 1,73 × 108 8,24 0,541 2,10 × 108 8,32 Dựa vào phân tích sự tuyến tính của giá trị OD theo Log N dựa vào công cụ Data Analysis Regressio, ta có được phương trình hồi quy: y = 0,8792x + 7,8312. Với giá trị R Square = 0,991 cho thấy 99,1% các trường hợp xảy ra được giải thích bằng phương trình y = 0,8792x + 7,8312, chỉ có 0,9% trường hợp không thể giải thích với phương trình này. Mặt khác, giá trị P-value của Intercept và OD đều nhỏ hơn 0,05 chứng tỏ phương trình y = 0,8792x + 7,8312 có ý nghĩa thống kê. Như vậy, phương trình hồi quy này là phù hợp Hình 3.5 Đường tương quan giữa giá trị OD và Log N chủng Sub 55 3.3.2 Thiết lập đường cong tăng trưởng Dựa vào biểu đồ cho thấy chủng Sub có pha lag rất nhỏ, chỉ trong 1 giờ đầu nuôi cấy, sau giờ thứ 1 bắt đầu pha log và kéo dài tới giờ thứ 12, kế tiếp là pha ổn định kéo dài tới thời điểm 24 giờ. Hình 3.6 Đường cong tăng trưởng chủng Sub theo thời gian 3.4 Thiết lập đường cong tăng trưởng chủng Yoi 3.4.1 Thiết lập đường chuẩn Việc thiết lập đường cong tăng trưởng một cách gián tiếp theo giá trị OD bắt buộc phải thông qua một bước là thiết lập đường chuẩn tương quan giữa OD và mật độ tế bào. Sau các thao tác pha loãng, đo OD và đếm thì có được các dữ liệu như sau: 56 Bảng 3.7 Kết quả khảo sát đường chuẩn chủng Yoi OD N (cfu/ml) Log N