Đồ án Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thu sinh khối và các phương pháp thu hoạch, bảo quản tảo Spirulina platensis

ôi trồng, thu hoạch, chế biến sinh khối vi tảo, các loại công nghệ này đang không ngừng được hoàn thiện, hạ giá thành và nâng cao chất lượng sinh khối, mặt khác sử dụng vi tảo đang được mở rộng trong các lĩnh vực như dùng làm thức ăn bổ dưỡng cho người và thức ăn cho động vật, đặc biệt là các ngành nuôi trồng thủy sản, nguồn phân bón sinh học, năng lượng sạch, các hóa chất trong công nghiệp và dược phẩm, xử lý môi trường. Tuy ở nước ta đã có nhiều nghiên cứu về loại tảo này nhưng quy mô ứng dụng còn chưa rộng. Hiện tại ở Đà Nẵng vẫn chưa có cơ sở nào sản xuất sinh khối để phục vụ cho các ngành thực phẩm và y học, sở dĩ như thế là do thành phần môi trường nuôi cấy còn sử dụng quá nhiều hóa chất nên môi trường nuôi cấy đắt, do đó kém kinh tế dẫn đến chi phí đầu tư cao, các điều kiện để nuôi cấy cũng chưa tốt nhất và phương pháp thu nhận sinh khối tảo chưa được triệt để, hiệu quả chưa cao. Ngoài ra, cũng chưa có phương pháp bảo quản giống tốt trong một thời gian dài để chủ động được nguồn giống để giảm chi phí sản xuất cho những đợt sau. Trước những lý do như thế chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thu sinh khối và các phương pháp thu hoạch, bảo quản tảo Spirulina platensis”. Nhằm mục đích tìm ra môi trường ít thành phần hóa chất, rẻ tiền, phương pháp thu hoạch tốt và các phương pháp bảo quản giống trong một thòi gian dài để chủ động trong quá trình nuôi cấy và mang lại tính kinh tế. PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về đối tượng thí nghiệm 1.1.1. Vai trò, vị trí của tảo Spirulina trong công nghệ sinh học (CNSH) Công nghệ sinh học là một lĩnh vực công nghệ cao dựa trên nền tảng khoa học về sự sống, kết hợp với quy trình và thiết bị kỹ thuật nhằm tạo ra các công nghệ khai thác các hoạt động sống của vi sinh vật, tế bào thực vật và động vật để sản xuất ở quy mô công nghiệp các sản phẩm sinh học có chất lượng cao phục vụ cho lợi ích, nhu cầu của con người đồng thời phát triển kinh tế- xã hội và bảo vệ môi trường [30]. Trong tự nhiên vai trò của giới tảo (Algae) nói chung, nhất là tảo biển với vai trò quang hợp gắn giữ cacbonic đã tạo ra khoảng 500 tỷ tấn chất hữu cơ có thể sử dụng được (trong đó có nhiều hoạt chất sinh học quý) và thải ra 90% lượng oxy trong bầu khí quyển cần cho sự hô hấp của người và động vật. Chính điều này đã kích thích nghề nuôi tảo biển ra đời và đặc biệt xuất hiện Công nghệ sinh học vi tảo với bộ 3 nổi tiếng là Chlorella, Scenedesmus và Spirulina, chúng có nhiều giá trị trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm... Trong 3 nhóm tảo trên thì Spirulina hiện được chọn để phát triển sản xuất hơn 2 loại kia do 5 ưu thế sau: - Hiệu quả kinh tế cao và góp phần bảo vệ, cải thiện môi trường: Spirulina không những đơn giản trong nhu cầu dưỡng chất mà còn rất hiệu quả trong sử dụng năng lượng ánh sáng mặt trời, nước (có thể dùng nước biển, nước lợ, nước mặn,...), tạo ra 16,8 tấn oxy/năm... Điều này giúp bảo vệ môi trường khí quyển, giảm hiệu ứng nhà kính (green house). - Giá trị sử dụng đã vượt ra khỏi ranh giới truyền thống là dùng làm thực phẩm. Theo Thạc sĩ- Dược sĩ Lê Văn Lăng, giảng viên Trường Đại học Y Dược TpHCM, Spirulina là nguồn dinh dưỡng quý của tự nhiên. Nó có đủ các thành phần thiết yếu: protein- lipid- glucid cùng khoảng 30 vi lượng và hầu hết các vitamin cần thiết cho cơ thể, đáp ứng hoàn hảo công thức chuẩn về chế phẩm dinh dưỡng- vi lượng khoáng- vitamin do FAO/WHO công bố và là sản phẩm cải thiện suy dinh dưỡng rất tốt cho trẻ em, người già, người bệnh sau phẫu thuật... Mặt khác, với các hoạt chất: Phycocyanin, Sulfolipid, Spirulan, Betacaroten, các khoáng vi lượng (coban, kẽm, sắt) và các vitamin cần thiết, tảo Spirulina còn có giá trị dược liệu, giúp cơ thể tăng cường miễn dịch, chống lại bệnh tật. Có thể dùng tảo Spirulina hỗ trợ trong điều trị các bệnh: viêm gan, suy gan, đục thủy tinh thể, suy giảm thị lực, rụng tóc Song song đó, tảo Spirulina cũng có tác dụng trong phòng chống một số bệnh ung thư do các hoạt chất tăng cường miễn dịch, chống oxy hóa, bảo vệ tế bào, chống đột biến gen. Năm 1996- 1997, một nhóm nhà khoa học người Nhật đã phân lập và xác định cấu trúc một hoạt chất mới trong Spirulina và đặt tên là Spirulan (Ca-Sp). Các thử nghiệm đã chứng tỏ Ca- Sp có tác dụng kháng virus HIV type 1 và virus Herpes simplex type 1 [31]. - Tham gia vào việc xử lý môi trường: ngoài việc cung cấp dưỡng khí oxy, Spirulina còn có khả năng gắn giữ mạnh các cation độc như chì, thuỷ ngân, cadimi,... nên chúng có thể dùng để xử lý chất thải lỏng, xử lý nước thải [29]. - Spirulina có thể là đối tượng chuyển tải các tiến bộ khoa học kỹ thuật rất hiện đại trong công nghệ sinh học: + Nuôi định hướng thu các chất có lợi cho dinh dưỡng và trị bệnh cho người và động vật. Đã có các tiến bộ về nuôi cấy Spirulina gắn Iod (phòng trị bệnh thiếu vi chất iod), gắn Selen, gắn Germani (chất chống oxy hoá, chống lão hoá, phòng chống ung thư...)v.v... Hoặc nuôi với những tiền chất định hướng cho sinh khối Spirulina giàu acid béo cần thiết, giàu beta-caroten. Sự thành công trong tương lai phụ thuộc vào việc chọn giống Spirulina và tìm tòi công nghệ phù hợp, sẽ cho những lô/mẻ sinh khối Spirulina rất có giá trị trong y dược. + Spirulina với công nghệ chuyển nạp gen: Chuyển nạp gen là kỹ thuật phân lập gen từ cơ thể cho (donor) cấy ghép vào bộ máy di truyền của cơ thể nhận (receiver) nhằm tạo ra tính trạng mới cần thiết từ cơ thể đó. Kỹ thuật tân tiến này đang được nghiên cứu với Spirulina ở 2 hướng sau: Chuyển gen chịu trách nhiệm di truyền tạo phao khí của Spirulina giúp vi sinh vật nổi trên mặt nước dễ dàng. Ta biết muốn phòng trừ bệnh sốt rét phải diệt muỗi Anopheles stopenis, bệnh sốt xuất huyết phải diệt muỗi Aedes aegypti, bệnh giun chỉ phải diệt muỗi Culex quinquefasciatus. Một cách hiệu quả cắt đứt vector truyền bệnh này là diệt ấu trùng (bọ gậy, lăng quăng...) của chúng. Hiện một số nghiên cứu cho thấy có những vi sinh vật, hoặc vi nấm có thể thực hiện được điều này. Tuy vậy, việc phải sống trôi nổi trên mặt nước (môi trường ấu trùng các loại muỗi gây bệnh sinh sống) để diệt ấu trùng muỗi lại là điểm không có hoặc yếu kém của các vi sinh vật này. Do vậy có thể tách gen di truyền tạo phao khí nổi trên mặt nước của Spirulina ghép vào vi sinh vật có ích trên, tạo ra những đặc điểm mong muốn diệt ấu trùng muỗi gây bệnh [1]. Chuyển nạp gen tạo chất dẻo sinh học cho Spirulina: có thể ghép vào Spirulina gen tạo chất polyhydroxyl butylat (P.H.B), gen này có ở vi khuẩn Aleutroplus, để tạo ra giống Spirulina mới có đặc tính phát triển sinh khối nhanh, đồng thời chứa P.H.B với hàm lượng thích hợp. Trích ly chất P.H.B để sản xuất nhựa thay thế nhựa dẻo (như polystyrene) và chất dẻo mới này dễ bị phân huỷ không làm ô nhiễm môi trường v.v... [22]. - Spirulina tương đối thích nghi với mọi quy mô sản xuất: có thể thu hoạch từ tự nhiên hoặc nuôi ở quy mô nhỏ (hộ gia đình, làng xã), trong điều kiện bán tự nhiên với kỹ thuật đơn giản như nuôi trồng thuỷ sản, và nuôi ở quy mô công nghiệp [11]. 1.1.2. Phân loại học Mang nhiều tên gọi khác nhau như Spirulina, Arthrospira và là một chủ đề được thảo luận nhiều từ trước đến nay, nhất là khi cái tên “tảo” được nhắc đến lần đầu tiên. Năm 1852, việc phân loại học đầu tiên được viết bởi Stizenberger. Ông đưa ra tên loài mới là Arthrospira dựa vào cấu trúc chứa vách ngăn, đa bào, dạng xoắn. Gomont đã khẳng định những nghiên cứu của Stizenberger vào năm 1892, đồng thời Gomont bổ sung thêm loài không có vách ngăn là Spirulina và loài có vách ngăn là Arthrospira. Như vậy, tên được công nhận là Arthrospira, nhưng trong những hoạt động khảo sát và nghiên cứu Arthrospira được gọi là Spirulina, do đó tên Spirulina được sử dụng phổ biến cho đến nay thay cho tên Arthrospira. Hình 1.1: Tảo Spirullina platensis 1.1.3. Đặc điểm sinh học của Spirulina Loài Spirulina (Arthrospira) platensis thuộc[2]: Chi : Spirulina (Arthrospira) Họ : Oscillatoriceae Bộ : Oscillatoriales Lớp : Cyanophyceae Ngành : Cyanophyta 1.1.3.1. Đặc điểm hình thái Tên “Spirulina” xuất phát từ tiếng Latinh “helix” hoặc “spiral” biểu hiện hình dạng xoắn của nó. Spirulina là tảo đa bào, dạng sợi, sống cộng sinh, các tế bào được phân biệt bởi vách ngăn, dạng sợi xoắn hình lò xo không phân nhánh, số vòng xoắn lớn nhất là 6- 8 vòng đều nhau. Đường kính xoắn khoảng 35- 50mm, bước xoắn là 60mm, chiều dài sợi tảo có thể đạt 250mm. Nhiều trường hợp Spirulina có kích thước lớn hơn. Các vách ngang chia sợi Spirulina thành nhiều tế bào riêng rẽ liên kết với nhau bằng cầu liên bào. Sợi tảo Spirulina có khả năng chuyển động và tự vận động theo kiểu trượt quanh trục của sợi [13]. 1.1.3.2. Đặc điểm cấu tạo Tế bào Spirulina có cấu trúc giống với sinh vật Prokaryote thiếu các hạt liên kết với màng. Thuộc gram âm, thành tế bào nhiều lớp và được bao bọc bởi màng polysaccharide nhầy. Thành tế bào Spirulina không chứa celulose mà hệ tiêu hóa con người không phân cắt được. Spirulina có tỷ lệ chuyển hóa quang hợp khoảng 10% so với chỉ 3% của các thực vật sống trên cạn như đậu nành. Tế bào tảo Spirulina chưa có nhân điển hình, vùng nhân chỉ là vùng giàu axit nucleic chưa có màng nhân bao bọc, phân bố trong nguyên sinh chất. Thành tế bào Spirulina có cấu trúc nhiều lớp, không chứa celulose mà chứa mucopolyme, pectin và các loại polysacharid khác. Màng tế bào nằm sát ngay dưới thành tế bào và nối với màng quang hợp thylakoid tại một vài điểm. Spirulina không có lục lạp mà chỉ chứa thylakoid quang hợp nằm rải rác trong nguyên sinh chất. Màng thylakoid bao quanh các hạt polyphosphat có đường kính 0,5- 1μ thường nằm ở trung tâm tế bào. Sắc tố quang hợp chính là phycocyanin, bên cạnh đó còn có chlorophyll a. Ngoài ra, tế bào Spirulina không có không bào thực, chỉ có không bào chứa khí làm chức năng điều chỉnh tỉ trọng tế bào. Không bào khí có vai trò rất quan trọng trong việc làm cho Spirulina nổi lên mặt nước [10]. Spirullina là một chi tảo thuộc ngành tảo lam, tế bào Spirulina không có ty thể và mạng lưới nội chất, tuy nhiên tế bào vẫn có ribosome với hệ số lắng 70S và một số thể vùi như hạt polyphotphat, glycogen, phycocyanin, cacboxysome và hạt mesosome [10]. L1 L4 L3 L2 Hình 1.2. Lát cắt tế bào Spirulina platensis Thành tế bào dưới kính hiển vi điện tử hiện lên gồm 4 lớp: từ lớp L1 đến lớp L4 (L1, L2, L3, L4). L1 và L3 chứa vật liệu dạng sợi. L2 là một peptidoglycan giống như ở tế bào vi khuẩn. L4 được sắp xếp chạy theo chiều dọc của trục sợi Spirulina [4]. Hình 1.2. cũng cho thấy một vách ngăn đang hình thành, vách ngăn này gồm ba lớp: L2 kẹp giữa hai L1, có thể hình dung như hình 1.3. L1 L2 L1 L4 L3 L2 L1 Màng sinh chất Hình 1.3. Mô hình sắp xếp vách tế bào Spirulina platensis Lớp L1 và L3 có chức năng vận chuyển điện tử, do đó hai lớp L2 và L4 tập trung các điện tử đó. Độ dày của mỗi lớp từ 10-15nm, nên độ dày của toàn bộ thành tế bào là khoảng 40- 60nm. Các lớp L1, L3, L4 có độ dày bằng nhau, lớp L1 lớn hơn [2]. 1.1.3.3. Đặc điểm sinh thái Spirulina là chi tảo lam phân bố rộng trong đất, nước ngọt, nước lợ, nước mặn và suối nước nóng. Đây là một trong khoảng 2500 loài cyanophyta cổ nhất, tự dưỡng đơn giản, có khả năng tổng hợp các chất cần thiết cho cơ thể, kể cả các đại phân tử phức tạp để xây dựng tế bào và có khả năng cố định đạm rất cao, chúng không thể sống hoàn toàn trong tối Trong quá trình sinh trưởng và phát triển tảo Spirulina chịu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường. Những yếu tố như ánh sáng, nhiệt độ, pH và thành phần dinh dưỡng không chỉ ảnh hưởng đến quang hợp và sản xuất sinh khối tế bào mà còn ảnh hưởng tới các hoạt động chuyển hóa của tế bào. a) Ảnh hưởng của ánh sáng Ánh sáng là nhân tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến quang hợp của các sinh vật. Do bản chất tiền nhân của Spirulina nên ánh sáng không ảnh hưởng nhiều tới quá trình phát triển. Tuy nhiên, Spirulina cũng giống như nhiều loài tảo khác có khả năng quang tự dưỡng và phụ thuộc vào ánh sáng vì đây là nguồn năng lượng chính [28]. Hầu hết, các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm về đáp ứng của Spirulina đối với ánh sáng là được thực hiện dưới điều kiện phát triển quang tự dưỡng bằng việc sử dụng môi trường khoáng và bicarbonate như một nguồn carbon. Từ các nghiên cứu đó cho thấy sự phát triển của Spirulina trở nên bão hòa ở cường độ ánh sáng 1µmol m-2 s-1 khoảng bằng 10- 15% lượng ánh sáng mặt trời ở bước sóng 400- 700nm, giá trị này tùy thuộc vào điều kiện phát triển và mối tương quang giữa chlorophyll và sinh khối [28]. Ngoài ra, cường độ chiếu sáng còn ảnh hưởng đến các hàm lượng các chất bên trong tế bào tảo. Một số nghiên cứu đã nhận định rằng khi cường độ chiếu sáng tăng thì hàm lượng của acid béo (PUFA) giảm [26]. Theo Seshadri & Thomas (1979), sự tác động của ánh sáng tới Spirulina là bởi hai yếu tố chính đó là thời gian và cường độ chiếu sáng. Quá trình nuôi cấy ngoài trời thì cường độ ánh sáng tối hảo cho Spirulina trong khoảng 20- 30klux. Về thực hành nuôi cấy Spirulina thì cường độ ánh sáng tối ưu là 25- 30klux, ở khoảng này hoạt tính quang hợp cao nhất, cần điều chỉnh đạt được khoảng cường độ chiếu sáng này trong nuôi cấy [11]. Ngoài ra, cường độ ánh sáng còn phụ thuộc vào mật độ nuôi cấy của tảo, vì khi cường độ ánh sáng cao mà mật độ tảo lớn thì mỗi sợi tảo vẫn nhận được cường độ ánh sáng nhỏ. Nhiều loại vi tảo có cường độ quang hợp bão hoà ở khoảng 33% tổng lượng cường độ ánh sáng. Vì vậy trong điều kiện ánh sáng có cường độ cao và thời gian chiếu sáng dài, người ta thấy xuất hiện hiện tượng quang ức chế có thể làm tảo chết hoặc làm giảm đáng kể năng suất nuôi trồng [1]. Theo Charenkova C.A (1977) thì thời gian chiếu sáng càng dài thì năng suất tảo Spirulina càng cao. Năng suất tảo đạt cao nhất khi chiếu sáng liên tục. Như vậy tảo Spirulina không có chu kỳ quang [1]. b) Ảnh hưởng của nhiệt độ Trong khi ánh sáng được xem là nhân tố môi trường quan trọng nhất cho quang hợp của vi sinh vật thì nhiệt độ là nhân tố cơ bản nhất cho sự sống của sinh vật. Nhiệt độ ảnh hưởng đến tất cả hoạt động sống của vi sinh vật như quá trình trao đổi chất, thành phần dinh dưỡng cũng như các đặc tính sinh lý khác. Nhiệt độ môi trường luôn là một trong những yếu tố nhạy cảm ảnh hưởng đến bất kỳ sinh vật nào. Nhiệt độ môi trường nuôi là yếu tố cần đáp ứng liên tục, vì rất dễ bị chi phối và tác động bởi điều kiện xung quanh, mức độ và thời gian chiếu sáng. Do vậy nhiệt độ là một trong những yếu tố thường xuyên được theo dõi trong công nghệ nuôi trồng vi tảo [28]. Spirulina phát triển ở nhiệt độ khá cao, chúng có khả năng phát triển mạnh ở khoảng nhiệt độ 32- 400C. Nhiệt độ cực thuận cho nuôi cấy Spirulina là 35- 380C. Ở nhiệt độ dưới 250C Spirulina phát triển rất chậm, ở nhiệt độ trên 380C tảo này sẽ chết rất nhanh [21]. Tuy vậy, trong tự nhiên người ta phát hiện Spirulina ở những suối nước nóng đến 690C. Ngoài ra, nhiệt độ còn ảnh hưởng đến thành phần sinh hóa của tảo. Theo một nghiên cứu đã cho thấy rằng: ở nhiệt độ 350C không ảnh hưởng xấu lên sản xuất sinh khối nhưng lại ảnh hưởng tích cực lên sản xuất protein, lipid và phenolic. Nhiều chủng khác nhau sẽ phát triển ở các khoảng nhiệt độ khác nhau [28]. Có một mối liên hệ giữa nhiệt độ và ánh sáng trong quá trình nuôi cấy tảo. Giống như hai mặt đối lập của một quá trình thống nhất, chúng đều đóng vai trò quan trọng quyết định đến năng suất và sinh khối của Spirulina. Sinh trưởng của tảo đạt cao nhất với một cường độ và thời gian chiếu sáng thích hợp, kèm theo nó là một chế độ nhiệt tương đối ổn định. c) Ảnh hưởng của pH pH môi trường là một trong các nhân tố quan trọng trong nuôi cấy Spirulina. pH tối ưu cho sự phát triển của chi này là kiềm và kiềm cao. Đây là ưu thế lớn giúp Spirulina ít bị lây nhiễm bởi các tảo khác [14]. Tuy nhiên, pH là yếu tố nội tại luôn luôn thay đổi, không những do chế độ chiếu sáng, nhiệt độ hàm lượng các chất dinh dưỡng tạo nên mà còn do tác động ngược lại của chính trạng thái sinh trưởng của quần thể tảo. Khi tảo phát triển càng mạnh, pH môi trường bị thay đổi và trở thành yếu tố kìm hãm cho sự sinh trưởng và phát triển. Do đó, pH môi trường quá cao hay quá thấp đều làm chậm quá trình sinh trưởng của tảo [20]. Theo Trần Văn Tựa và Nguyễn Hữu Thước (1993) thì pH môi trường từ 8,5- 9 là pH tối ưu cho tảo Spirulina sinh trưởng và phát triển. Ở pH này, nguồn cacbon vô cơ được tảo đồng hóa nhiều nhất. Tuy nhiên ở pH= 10- 11 Spirulina vẫn có khả năng phát triển nhưng rất chậm. Một nghiên cứu đã chỉ ra rằng mặc dù Spirulina là loài tảo sống trong môi trường kiềm nhưng giá trị pH > 10,3 là có hại cho môi trường nuôi cấy [6]. Vì vậy pH được coi là yếu tố chỉ thị, phản ánh các thành phần nuôi dưỡng cung cấp cho môi trường nuôi dưỡng tảo, chủ yếu là nguồn bicarbonat và khí CO2 hoà tan [11]. d) Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng Spirulina có thể sống trong môi trường tự nhiên đến các môi trường nhân tạo hoặc nửa nhân tạo bằng bổ sung các chất khoáng cần thiết vào nguồn nước tự nhiên: nước biển, nước suối khoáng, nước khoáng ngầm, giếng khoan... Thành phần dinh dưỡng bao gồm cả nguyên tố đa lượng (C, N, P, K, S, Mg, Na, Cl, Ca và Fe) và nguyên tố vi lượng (Zn, Cu, Ni, Co,W). Tất cả điều ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tảo. Trong đó, các nguyên tố vi lượng là thành phần bắt buộc hay tác nhân kích thích hoạt động của nhiều hệ enzyme, có tác dụng thúc đẩy sinh tổng hợp chlorophyll và làm giảm sự phân hủy chlorophyll nhờ làm tăng độ bền vững của phức hệ liên kết giữa chlorophyll và protein. Ngoài ra, nhiều nguyên tố vi lượng còn làm tăng khả năng tổng hợp carotenoid [14]. Các nguyên tố vi lượng thật sự cần thiết cho quá trình sinh trưởng của tảo, tuy nhiên hàm lượng của chúng trong nước tự nhiên là rất thấp, có thể không cung cấp đủ cho nhu cầu sinh trưởng của tảo do đó việc bổ sung vi lượng vào môi trường nuôi cấy là hết sức cần thiết. Trong nuôi cấy tảo, vi lượng thường được bổ sung với một lượng rất nhỏ vì khi hàm lượng vượt quá ngưỡng chịu đựng của vi tảo, chúng có khả năng gây độc cho tế bào [20]. 1.1.4. Đặc điểm sinh sản Spirulina có hai hình thức sinh sản đó là sinh sản sinh dưỡng và sinh sản vô tính. Hình thức sinh sản sinh dưỡng được thực hiện bằng cách gãy từng khúc của sợi tảo, khúc gãy gọi là khúc tản. Từ một sợi tảo mẹ, hình thành nên những đoạn Necridia (gồm các tế bào chuyên biệt cho sự sinh sản). Trong các Necridia hình thành các đĩa lõm ở hai mặt và sự tách rời tạo các hormogonia bởi sự chia cắt tại vị trí các đĩa này. Trong sự phát triển, dần dần phần đầu gắn tiêu giảm, 2 đầu hormogonia trở nên tròn nhưng vách tế bào vẫn có chiều dày không đổi. Các hormogonia phát triển, trưởng thành và chu kì sinh sản được lập đi lập lại một cách ngẫu nhiên, tạo nên vòng đời của tảo. Kiểu sinh sản này thường gặp ở các sợi tảo có dạng chuỗi tế bào xếp nối nhau. Trong thời kì sinh sản tảo Spirulina nhạt màu ít sắc tố xanh hơn bình thường [5, 13]. Hình 1.4. Vòng đời của tảo Spirulina Trong một số điều kiện sống không thuận lợi, Spirulina cũng có khả năng tạo bào tử giống vi khuẩn, đó là hình thức sinh sản vô tính. Bào tử tảo có chứa nhiều chất dinh dưỡng ở dạng dự trữ và được bao bọc bởi một lớp dày, khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng sẽ tạo thành sợi mới. Chu kỳ phát triển của tảo Spirulina rất ngắn, nuôi trong phòng thí nghiệm thì thời gian thế hệ của nó chỉ kéo dài trong 24 giờ, ở điều kiện tự nhiên là khoảng 3- 5 ngày [7]. 1.1.4. Thành phần dinh dưỡng của tảo Spirulina - Hàm lượng protein trong Spirulina thuộc vào loại cao nhất trong các thực phẩm hiện nay 60- 70% trọng lượng khô, cao hơn trong thịt bò 3 lần, trong đậu tương 2 lần. Cứ 1kg tảo xoắn Spirulina chứa 55mg vitamin B1, 40mg vitamin B2, 3mg vitamin B6, 2mg vitamin B12, 113mg vitamin PP, 190mg vitamin E, 4.000mg caroten trong đó β-Caroten khoảng 1700mg (tăng thêm 1000% so với cà rốt), 0,5mg acid folic, inosit khoảng 500- 1.000mg. Phần lớn chất béo trong Spirulina là acid béo không no, trong đó acid linoleic 13.784mg/kg, γ-linoleic 11.980mg/kg. Đây là điều hiếm thấy trong các thực phẩm tự nhiên khác. Hàm lượng khoáng chất có thể thay đổi theo điều kiện nuôi trồng, thông thường sắt là 580- 646mg/kg (tăng thêm 5.000% so với rau chân vịt), mangan là 23- 25mg/kg, Magie là 2.915- 3.81mg/kg, selen là 0,4mg/kg, canxi, kali, phospho đều khoảng là 1.000- 3.000mg/kg hoặc cao hơn (hàm lượng canxi tăng hơn sữa 500%). Hàm lượng cacbonhydrat khoảng 16,5%, hiện nay đã có những thông tin dùng glucose chiết xuất từ tảo Spirulina để tiến hành những nghiên cứu chống ung thư [34, 35]. - Tảo Spirulina có chứa phong phú các acid amin cần thiết như lysin, threonin... rất quan trọng cho trẻ đặc biệt là trẻ thiếu sữa mẹ. Hàm lượng khoáng chất và các nguyên tố vi lượng phong phú có thể phòng tránh bệnh thiếu máu do thiếu dinh dưỡng một cách hiệu quả và cũng là nguồn bổ sung dinh dưỡng rất tốt cho trẻ lười ăn [34]. - Trong tảo Spirulina có chứa nhiều loại chất chống lão hóa như β-caroten, vitamin E, acid γ-linoleic. Những chất này có khả năng loại bỏ các gốc tự do thông qua tác dụng chống ôxi hóa, làm chậm sự lão hóa của tế bào, đồng thời sắt, canxi có nhiều trong tảo vừa dễ hấp thụ vừa có tác dụng phòng và hỗ trợ điều trị các bệnh thường gặp ở người già như thiếu máu, xốp xương...[34]. - Có thể dùng tảo Spirulina hỗ trợ trong điều trị bệnh viêm gan, suy gan, bệnh nhân bị cholesterol máu cao và viêm da lan tỏa, bệnh tiểu đường, loét dạ dày tá tràng và suy yếu hoặc viêm tụy, bệnh đục thủy tinh thể và suy giảm thị lực, bệnh rụng tóc. Với liều dùng vừa phải, Spirulina làm cân bằng dinh dưỡng, tổng hợp các chất nội sinh, tăng hormon và điều hòa sinh lý [34]. - Tảo tiêu diệt được Candida albicans, một loại nấm thường kí sinh trong đường ruột của nạn nhân AIDS. Hiện nay Spirulina còn được nghiên cứu invitro, để ngăn chặn sự tấn công của virus HIV. Ngoài ra, tảo Spirulina có những tác dụng đã và đang được các nhà khoa học nghiên cứu [32, 33, 34]. 1.2. Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng tảo Spirulina 1.2.1. Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng tảo Spirulina trên thế giới Người ta bắt đầu biết đến tảo Spirulina qua loại thức ăn Tecuitlatl của người dân Aztec (Mêhicô) và bánh Dihé của bộ tộc Kanembu (Cộng hòa Chad và Niger). Việc phát hiện và phát triển tảo Spirulina ra khắp thế giới gắn liền với lịch sử tìm ra châu Mỹ của Christophe Colomb năm 1492. Mãi đến năm 1960, khi Leonard và Comperé (người Bỉ) phân tích và công bố giá trị dinh dưỡng của Tecuitlatl và Dihé chứa hàm lượng protein cao thì Spirulina được giới khoa học quan tâm nhiều hơn. Năm 1963, Giáo sư Clement thuộc Viện nghiên cứu dầu hỏa Pháp là người đầu tiên nghiên cứu nuôi tảo Spirulina ở quy mô công nghiệp thành công. Năm 1967, nghiên cứu này đã được triển khai tại Công ty Sosa Texcoco ở Mêhicô, Spirulina đã được nuôi trồng ở quy mô lớn trên suối nước khoáng giàu bicacbonat. Tiếp sau đó, hàng loạt xí nghiệp sản xuất tảo Spirulina đã xuất hiện ở Mỹ, Ấn Độ, Nhật Bản, Thái Lan, Hàn Quốc, Trung Quốc,[11]. Nhu cầu về các chất có giá trị cao trong tảo Spirulina dùng để làm thuốc và thực phẩm chức năng ngày càng tăng. Viện Nghiên cứu truyền nhiễm virus, trường Y khoa Harvard, Earthrise Farms (California) gần đây công bố nghiên cứu của họ về khả năng ức chế sự nhân lên của virus HIV- 1 trong dòng tế bào T của nước chiết từ Spirulina. Nếu một người sử dụng 2- 3g tảo Spirulina sẽ giúp tăng cường sức khỏe và khả năng tự bảo vệ của cơ thể [27]. Tảo lam Spirulina platensis có thể là chỉ thị tốt nhất cho một vài loại nước thải. Spirulina có khả năng loại bỏ kim loại nặng cadimi trong nước thải rất tốt, do độ hấp thụ cũng như hiệu suất hấp thụ kim loại của nó rất cao [29]. Ngoài các hướng nghiên cứu đã được chỉ ra ở trên, hiện nay đã có nhiều công bố thông báo về khả năng chuyển gen ở tảo Spirulina bằng việc áp dụng công nghệ gen, kỹ thuật DNA tái tổ hợp đang được thực hiện ở Nhật Bản và một số nước, nhằm mục đích tạo ra những chủng giống Spirulina có những đặc tính mong muốn cho định hướng ứng dụng như tăng cường khả năng tổng hợp acid γ- linolenic hoặc là tạo chất dẻo sinh học dễ phân hủy[22]. Việc sử dụng tảo Spirulina platensis trong các nghiên cứu về vũ trụ là hướng có triển vọng. Ý tưởng về vi hệ sinh thái tự cung tự cấp “MELISSA” (Micro Ecological Life Support System Alternative) cho các chuyến du hành vũ trụ sử dụng tảo Spirulina platensis để chuyển nước thải, CO2, phân, nước tiểu thành sinh khối tảo dinh dưỡng, H2O sạch và O2 cung cấp lại cho người đang được NASA (Cơ quan hàng không và vũ trụ Hoa Kỳ) thử nghiệm ở dạng pilot [24]. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng tảo Spirulina ở Việt Nam Ở Việt Nam, tảo Spirulina được nhập nội từ Pháp năm 1972 và trở thành đối tượng nghiên cứu sinh lý, sinh hóa, tại Viện Sinh vật học (nay là Viện Công nghệ sinh học) do cố Giáo sư- TSKH. Nguyễn Hữu Thước chủ trì. Những thí nghiệm nghiên cứu về tác động của ánh sáng, nhiệt độ, pH đã cho phép đẩy nhanh quá trình thích ứng của tảo này ở điều kiện Việt Nam. Các nghiên cứu tác động của các nguyên tố khoáng lên sinh trưởng và quang hợp của tảo Spirulina là cơ sở cho việc thiết lập những môi trường dinh dưỡng rẻ tiền, thích hợp cho nuôi trồng chúng. Chính trên nền môi trường này, Spirulina đã được đưa vào thử nghiệm nuôi trồng đại trà tại Hà Nội, Bình Thuận, Bến Tre, Thành phố Hồ Chí Minh [7]. Vào đầu thời điểm năm 1980, ở Thuận Hải, hai sản phẩm Spirulina đã được xí nghiệp dược phẩm TW24 tung ra thị trường dưới tên gọi “Linavina” và “Lactogyl” để làm thuốc bổ dưỡng. Sinh khối Spirulina cũng được các đơn vị như bệnh viện Thống Nhất, bệnh viện phụ sản Từ Dũ, bệnh viện tỉnh Thuận Hải, trung tâm dinh dưỡng trẻ em thành phố Hồ Chí Minh tiến hành thử nghiệm chống suy dinh dưỡng ở trẻ em và người già [11, 18]. Trong khoảng thời gian 1981- 1985, Phòng Công nghệ Tảo- Viện Công nghệ sinh học đã hợp tác chặt chẽ với Bộ môn Hóa Công nghệ trường Đại học Bách khoa Hà Nội và Công ty Công nghiệp tỉnh Thuận Hải (nay là tỉnh Bình Thuận) để triển khai nuôi trồng Spirulina ở quy mô lớn tại suối nước khoáng Vĩnh Hảo giàu bicacbonat và các chất khoáng khác, tận dụng gió, ánh sáng, nhiệt độ cao quanh năm. Ban đầu, Spirulina được nuôi trồng ở quy mô 60 bể (mỗi bể 45m3) với năng suất 8- 10g khô/m2/ngày. Cũng trong thời gian này, hàng loạt nghiên cứu ứng dụng sinh khối Spirulina cho gia cầm, cá, vịt, ong, tằm cũng đã được thực hiện. Năm 1994, Nguyễn Thị Đệ đã tiến hành nghiên cứu vai trò và một số tính chất của phycobiliprotein chính trong tảo Spirulina [3,17]. Năm 1996, Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phước Hiền, Dương Trọng Hiền đã khẳng định khả năng ứng dụng của phycobleu tách chiết từ Spirulina platensis cho bệnh nhân ung thư. Phycobleu có tác dụng nâng cao thể trạng cho bệnh nhân ung thư vùng đầu, cổ trong thời gian chiếu xạ hoặc sau phẫu thuật và loại sản phẩm này không gây phản ứng phụ nào [15]. Năm 1997, một nhóm nhà nghiên cứu đã thử nghiệm một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Spirulina platensis trong điều kiện chịu mặn NaCl và đã kết luận rằng hàm lượng chlorophyll và carotenoid có khuynh hướng tăng khi tăng nồng độ trong môi trường. Như vậy muốn sản xuất nhiều chlorophyll và carotenoid thì trong môi trường nuôi cấy có thể bổ sung thêm một ít muối NaCl [12]. Năm 2008, Hoàng Sỹ Nam, Đặng Diễm Hồng đã tiến hành nuôi trồng thử nghiệm 2 chủng tảo Spirulina platensis CNT và Spirulina platensis C1 trong các loại nước khoáng Thạch Thành- Thanh Hóa, Thanh Tân- Thừa Thiên Huế và Thanh Liêm- Hà Nam đã cho kết quả là cả 3 loại nước khoáng điều có thể sử dụng để nuôi trồng tảo, trong đó loại nước khoáng ở Thanh Hóa thì cho chi phí nuôi tảo giảm được một nửa mà chất lượng tảo vẫn đảm bảo để làm thực phẩm cho người và động vật nuôi [9]. 1.3. Các vấn đề trong nuôi tảo Spirulina platensis Trước tình hình nhu cầu sử dụng tảo Spirulina trong các lĩnh vực khác nhau ngày càng tăng ở Việt Nam, song lượng sinh khối tảo này sản xuất ra vẫn còn chưa đáp ứng đủ, do đó việc lựa chọn, tạo đột biến được những chủng giống tảo Spirulina tốt là điều kiện trước tiên. Ngoài ra, phải tìm được môi trường dinh dưỡng thích hợp, rẻ tiền để nuôi trồng loài tảo này ở quy mô lớn, phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam nhằm không ngừng nâng cao năng suất và chất lượng sinh khối tảo là điều cần được quan tâm và có ý nghĩa thực tiễn to lớn. *Spirulina sản xuất ra đường (carbohydrate hoặc saccharide) trong suốt quá trình chúng quang hợp. Khi nồng độ các chất này trở nên dư thừa trong cơ thể, chúng sẽ tiết ra môi trường. Vì những chất đường nhầy nên khi sợi tảo trườn lên sẽ tạo ra khối nhầy và các sợi tảo sẽ không tiếp xúc được với môi trường dinh dưỡng nên chúng sẽ bị chết vì đói. Chúng ta phải cảnh giác với 3 nguyên nhân dẫn đến việc sản sinh đường quá mức, đặc biệt khi nhiệt độ cao đe dọa quang phân giải. Thứ hai là thiếu nitrogen phức hợp trong môi trường vì nitrogen phức hợp trong tế bào được sử dụng để chuyển hóa polysaccharide thành protein. Khi chúng không được chuyển hóa thành protein thì chúng sẽ tiết ra môi trường. Và sự thừa bicarbonate hoặc thiếu sulfur trong môi trường cũng dẫn tới làm sản sinh đường dư thừa [12]. *Các vi sinh vật nhiễm tạp: - Động vật chân chèo (Rotifers) kích thước từ 100- 2mm Đôi khi một số động vật chân chèo rơi vào trong môi trường và chúng thường sử dụng tảo làm thức ăn. Vào ban đêm, tảo tiêu thụ oxygen và sản sinh ra CO2, khí này có tác dụng đầu độc động vật. Vì vậy, nên dừng khuấy vào ban đêm và tảo sẽ sử dụng oxygen hòa tan và do đó động vật thiếu oxygen chúng sẽ bị chết. Cách khác để hạn chế động vật là sử dụng chúng. Dùng một lưới dài, hình túi (mắt lưới đường kính 10m) gắn bên trong bể, tại các góc bên phải theo hướng di chuyển của môi trường nuôi cấy như vậy các động vật này sẽ bị giữ lại trên lưới. Những động vật này là thức ăn rất tốt cho tôm hoặc cá con [12, 38] . - Amoeba Những loài này khác với động vật nguyên sinh ở chỗ chúng ăn tảo. R.R. Kudo đã mô tả 74 loài amoeba khác nhau. Có một loài trong số chúng gây nguy hiểm cho người đó là Entamoeba histolytica. Chúng lan truyền bằng các bào tử “hình trứng”, các bào tử này bị chết trong nước nhiệt độ 450C trong thời gian 1h và ở nhiệt độ 550C trong ít giây. Nhiệt độ bên trong của thiết bị sấy sử dụng năng lượng mặt trời dao động từ 50-600C và ...nên OD ngày nuôi đầu tiên đạt giá trị tương đối cao là 0,193; những ngày tiếp theo sau đó thì OD tăng lên rất chậm, cụ thể là 0,203 vào ngày thứ 2 và 0,214 vào ngày thứ 3. Nguyên nhân có sự tăng chậm như thế có thể là do tảo bị sốc khi nuôi cấy trong môi trường có bổ sung rỉ đường hơn là trong môi trường Zarrouk chuẩn. Từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 8 có sự phát triển nhanh hơn những ngày khác là từ 0,339 lên 0,495 cách nhau đến 0,156. Những ngày sau đó tảo phát triển rất tốt và đạt OD cao nhất là 1,248 vào ngày thứ 17. Cũng tương tự như trong môi trường bổ sung 0,75ml rỉ đường thì ở trường hợp bổ sung 1ml rỉ đường thì những ngày đầu sự phát triển của tảo rất chậm do sốc môi trường. Nhìn vào đồ thị ta thấy OD ngày đầu tiên là 0,179 và đạt cao nhất là vào ngày 17 với giá trị OD là 0,901. Tốc độ phát triển ban đầu của tảo ở trường hợp bổ sung 1,5ml rỉ đường cũng chậm như hai trường hợp bổ sung 0,75ml và 1ml rỉ đường. Và OD ở trường hợp này cũng đạt cao nhất là 0,651 vào ngày thứ 17 và giảm xuống còn 0,582 vào ngày thứ 18. So sánh tốc độ phát triển của tảo trong 4 loại môi trường khác nhau: môi trường 1: môi trường Zarrouk chuẩn, môi trường 2: 0,75ml rỉ đường + 16,8g NaHCO3, môi trường 3: 1ml rỉ đường + 16,8g NaHCO3, môi trường 4: 1,5ml rỉ đường + 16,8g NaHCO3. Ta thấy ở môi trường Zarrouk chuẩn thì sự phát triển của tảo là tốt nhất. Các giá trị OD tăng lên rất nhanh và đạt cao nhất là vào ngày thứ 16 với giá trị OD đạt 2,357, giá trị này cao hơn các giá trị OD cao nhất trong các môi trường khác rất nhiều, cụ thể là hơn 1,11 so với môi trường 2, hơn so 1,475 với môi trường 3 và hơn 1,706 so với môi trường 4. Ta thấy tốc độ sinh trưởng và phát triển của tảo ở môi trường Zarrouk cao hơn rất nhiều so với các môi trường khác nhưng do thành phần môi trường Zarrouk quá là nhiều hóa chất, muốn pha môi trường Zarrouk ta phải tốn nhiều thời gian và tiền bạc, nếu ta đưa vào nuôi tảo đại trà ở quy mô rộng lớn như quy mô công nghiệp thì có lẽ sẽ cần rất nhiều chi phí ban đầu, như thế sẽ không có tính kinh tế. Để tiết kiệm và nâng cao tính kinh tế thì ta nên chọn môi trường rỉ đường + NaHCO3, dù sinh khối tảo ở môi trường dạng này không cao như trong môi trường Zarrouk nhưng rỉ đường là phế liệu của công nghệ sản xuất đường, dễ kiếm, rẻ tiền. Nếu ta không dùng rỉ đường thì có thể rỉ đường của công nghệ sản xuất đường có thể là chất thải làm ô nhiễm môi trường, vì thế chọn rỉ đường để nuôi cấy tảo là con đường hiệu quả và kinh tế. Kết quả nghiên cứu của tôi cho kết quả tốt nhất khi nuôi trên môi trường rỉ đường có bổ sung NaHCO3 (trừ môi trường Zarrouk) là khi bổ sung 0,75ml rỉ đường, so với kết quả nghiên cứu của Bùi Thị Ngọc Bích (2006) thì môi trường tốt nhất lại là khi bổ sung 1ml rỉ đường. Sở dĩ có sự khác biệt như thế cũng có thể do giống tảo ban đầu có chất lượng khác nhau, điều kiện nuôi cấy khác nhau hoặc là rỉ đường khi dùng để pha môi trường có nồng độ khác nhau (2- 4%). Mục đích của chúng ta là tìm ra nguồn nguyên liệu rẻ tiền dễ kiếm để thay thế và giảm lượng hóa chất tối đa trong nuôi cấy tảo từ đó giảm chi phí đầu vào. Và môi trường rỉ đường có bổ sung thêm NaHCO3 đã thỏa mãn được phù hợp yêu cầu đưa ra. Tóm lại thì môi trường ta chọn để nuôi cấy tảo tốt nhất là môi trường 2: 0,75ml rỉ đường + 16,8g NaHCO3 và thời gian thu hoạch tốt nhất là khoảng ngày thứ 17. A B C D Hình 3.4 : Mẫu tảo nuôi ở 4 loại môi trường khác nhau A: Mẫu nuôi trong môi trường Zarrouk B: Mẫu nuôi trong môi trường 0,75ml rỉ đường + 16,8g NaHCO3. C: Mẫu nuôi trong môi trường 1ml rỉ đường + 16,8g NaHCO3. D: Mẫu nuôi trong môi trường 1,5ml rỉ đường + 16,8g NaHCO3. 3.4. Khảo sát các loại ánh sáng ảnh hưởng lên sự sinh trưởng, phát triển của tảo Để khảo sát ảnh hưởng của các loại ánh sáng lên tốc độ sinh trưởng, phát triển của tảo ta tiến hành nuôi cấy dưới ánh sáng đèn huỳnh quang và dưới ánh sáng đèn Led. Tiến hành thí nghiệm và đo OD để xác định tốc độ sinh trưởng của tảo trong các môi trường và trong điều kiện ánh sáng khác nhau. Sau khi tiến hành thực nghiệm ta có kết quả đo OD (phụ lục 5) và đồ thị như hình 3.5 Như ta đã biết ánh sáng là nhân tố quan trọng nhất cho sự quang hợp nếu không có ánh sáng thì quang hợp sẽ bị ngưng trệ và tốc độ sinh trưởng phát triển sẽ bị kìm hãm. Theo TS. Dương Tấn Nhựt thì ánh sáng đèn Led có ảnh hưởng rất tốt đến sự sinh trưởng phát triển của một số loại cây trong nuôi cấy mô vì thế nên tôi đã tiến hành thử nghiệm ánh sáng đèn Led xanh có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của tảo không và đó là sự ảnh hưởng tiêu cực hay tích cực. Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn đường cong sinh trưởng theo thời gian đo OD ở bước sóng 420 nm của tảo ở môi trường Zarrouk dưới điều kiện ánh sáng huỳnh quang và ánh sáng Led. Các đường dọc theo mỗi thời gian đo OD biểu thị sự sai số của kết quả đo vì chúng tôi tiến hành đo mẫu lặp lại 3 lần nên sẽ có sai số, đồ thị có thể dịch chuyển lên trên hay xuống dưới tùy thuộc vào mẫu sai số âm hay sai số dương. Ở đồ thị hình 3.5 ở trên chúng tôi biểu thị cả 2 giá trị sai số cận trên và sai số cận dưới (xem phụ lục 5). Qua đồ thị hình 3.5 ta thấy sự sinh trưởng và phát triển của tảo dưới điều kiện ánh sáng khác nhau là khác nhau nhiều. Ở điều kiện ánh sáng huỳnh quang thì OD thấp nhất vào ngày đầu tiên là 0,094 và những ngày tiếp theo OD tăng tuyến tính và ở ngày thứ 8 thì đạt 0,524. Trong khi đó đối với mẫu nuôi ở ánh sáng Led xanh thì tốc độ sinh trưởng và phát triển rất chậm, OD ngày đầu tiên là 0,075 đến ngày thứ 7 đạt 0,191 và tới ngày thứ 8 thì chỉ còn 0,176. Mà như ta khảo sát ở mục 3.3 thì trong môi trường Zarrouk sinh khối tảo đạt cao nhất là ở khoảng ngày nuôi thứ 16. Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn đường cong sinh trưởng theo thời gian đo OD ở bước sóng 420 nm của tảo ở môi trường rỉ đường dưới điều kiện ánh sáng Huỳnh quang và ánh sáng Led. Qua đồ thị hình 3.6, ta thấy tổng quan rằng khi nuôi tảo dưới ánh sáng của đèn huỳnh quang thì hiệu quả cao hơn nhiều so với ánh sáng đèn Led. Trong cùng môi trường rỉ đường mà khi nuôi dưới ánh sáng đèn huỳnh quang thì OD tăng nhanh và đạt 0,291 vào ngày thứ 8, còn nuôi dưới ánh sáng đèn Led xanh thì OD cao nhất vào ngày thứ 3 với OD đạt 0,156 và OD giảm dần trong những ngày tiếp theo, ngày thứ 4 còn 0,136, đến ngày thứ 5 thì đạt 0,141 và tiếp tục giảm xuống còn 0,134 vào ngày thứ 7. Thực nghiệm cho thấy các mẫu khi nuôi trong môi trường Zarrouk và môi trường rỉ đường, dưới 2 điều kiện ánh sáng khác nhau là ánh sáng đèn huỳnh quang và đèn Led thì hiệu quả cao nhất vẫn là ở môi trường Zarrouk và dưới ánh sáng huỳnh quang. Hình 3.7 . Mẫu tảo nuôi trong môi trường rỉ đường sau 10 ngày nuôi cấy dưới loại ánh sáng khác nhau A: Mẫu nuôi dưới ánh sáng đèn huỳnh quang B: Mẫu nuôi dưới ánh sáng đèn Led A B Như vậy, ứng dụng ánh sáng đèn Led xanh trong nuôi cấy tảo là không hiệu quả. Các nguyên nhân có thể là do cường độ và thời gian chiếu sáng của đèn không đáp ứng đủ yêu cầu cho tảo quang hợp, cũng có thể là do khả năng hấp thụ ánh sáng xanh đèn Led của tảo kém nên hiệu quả nuôi cấy không cao. 3.5. Phương pháp xác định trọng lượng khô của sinh khối Tiến hành thí nghiệm ở 2 mẫu tảo nuôi cấy khác nhau là mẫu tảo nuôi có sục khí và mẫu tảo nuôi kín không sục khí. Mỗi mẫu thực hiện 4 đợt thí nghiệm, mỗi đợt tiến hành 3 lần ta được kết quả xem ở phụ lục 6. Hình 3.8: Đồ thị trọng lượng sinh khối khô trung bình qua 3 lần của 4 đợt thí nghiệm của mẫu tảo nuôi trong môi trường rỉ đường không sục khí và có sục khí. Nhận xét: Qua đồ thị hình 3.8, ta thấy trọng lượng sinh khối khô trung bình qua 3 lần của 4 đợt thí nghiệm của hai mẫu tảo nuôi cấy là mẫu nuôi trong môi trường rỉ đường có sục khí và mẫu nuôi trong môi trường rỉ đường không sục khí thì mẫu nuôi có sục khí có trọng lượng sinh khối khô lớn hơn nhiều, thậm chí gấp đôi so với mẫu tảo nuôi kín không sục khí. Đối với mẫu không sục khí thì trọng lượng sinh khối khô tăng dần qua 4 đợt thí nghiệm trung bình qua 3 lần của đợt thí nghiệm 1 là 4,12g/l, đợt 2 là 4,54g/l, đợt 3 là 5,05g/l và đợt 4 là 5,87g/l. Đối với mẫu tảo có sục khí thì trọng lượng sinh khối khô trung bình tương đương nhau, thay đổi trong khoảng từ 9,24- 9,29g/l. Qua kết quả đó ta thấy ảnh hưởng của việc sục khí khi nuôi cấy tảo cũng ảnh hưởng rất nhiều đến sinh khối. Như vậy mẫu tảo khi được sục khí sẽ cho sinh khối cao hơn so với mẫu không được sục khí. 3.6. Khảo nghiệm các phương pháp thu hoạch 3.6.1. Thu hoạch bằng phương pháp lọc thủ công Trong quá trình làm thí nghiệm nhận thấy Spirulina platensis là một trong những đối tượng có thể thu hoạch bằng cách lọc do có kích thước tương đối. Có thể nói lọc là phương pháp thu hoạch tảo vừa tiện lợi, vừa dễ thực hiện, mà chi phí lại rẻ. Bảng 3.1: Khối lượng sinh khối tươi của mẫu nuôi cấy được thu hoạch bằng phương pháp lọc thủ công Đợt thí nghiệm Khối lượng sinh khối tươi của mẫu nuôi cấy (g/l) Mẫu nuôi ARK Mẫu nuôi ARH Đợt 1 11,23 14,00 Đợt 2 10,31 13,50 Đợt 3 12,06 14,12 Qua bảng 3.1. ta thấy mẫu nuôi cấy hở có sục khí cho khối lượng sinh khối tảo trong 1 lít dịch sinh khối nhiều hơn mẫu nuôi kín không sục khí trung bình là 2,67g/l. Phương pháp này cho hiệu quả tương đối nhưng tốn nhiều thời gian. 3.6.2. Thu hoạch bằng phương pháp lọc có bơm chân không Vì khi lọc bằng vải lọc thì tảo vẫn có thể đi qua được lớp vải lọc, do đó hiệu quả lọc không cao, còn khi lọc bằng giấy lọc thì tảo được giữ lại gần như hoàn toàn trên giấy lọc nhưng nếu lọc như thế thì sẽ tốn rất nhiều thời gian, chính vì như thế nên chúng tôi tiến hành lọc bằng giấy lọc dưới trọng lực có bơm chân không. Thực nghiệm ta thu được kết quả như bảng 3.2. Bảng 3.2: Khối lượng sinh khối tươi của mẫu nuôi cấy được thu hoạch bằng phương pháp lọc có sử dụng bơm chân không Đợt thí nghiệm Khối lượng sinh khối tươi của mẫu nuôi cấy (g/l) Mẫu nuôi ARK Mẫu nuôi ARH Đợt 1 18,23 20,09 Đợt 2 18,31 19,98 Đợt 3 17,86 20,12 Qua bảng 3.1. và bảng 3.2. ta thấy hiệu quả thu hoạch có bơm chân không lớn hơn nhiều so với lọc thủ công. Đối với mẫu ARK khi thu hoạch bằng phương pháp thủ công thì khối lượng tươi đạt trung bình qua 3 đợt thí nghiệm chỉ là 11,2g/l còn với phương pháp lọc có bơm chân không thì đạt tới 18,13g/l. Đối với mẫu ARH khi thu hoạch bằng phương pháp thủ công có khối lượng tươi trung bình qua 3 đợt thí nghiệm là 13,87 còn phương pháp có bơm chân không đạt 20,06g/l. Tóm lại phương pháp lọc có bơm chân không lớn hơn phương pháp lọc thủ công trung bình là 7g/l. 3.6.3. Thu hoạch bằng chất keo tụ và tuyển nổi Nhiều nhà khoa học đã sử dụng thành công phương pháp kết tụ và tuyển nổi để thu hoạch tảo. Theo phương pháp này đầu tiên người ta cho phèn (là chất kết tụ) để kết tụ tảo lại sau đó sục không khí vào để các cụm kết tủa đó nổi lên và được vớt ra ngoài. Bảng 3.3: Khối lượng sinh khối tươi của mẫu nuôi cấy được thu hoạch bằng chất keo tụ và tuyển nổi Đợt TN Khối lượng sinh khối tươi của mẫu nuôi cấy (g/l) Mẫu nuôi ARK Mẫu nuôi ARH Al2(SO4)3 AlCl3 Al2(SO4)3 AlCl3 Đợt 1 15,23 13,98 17,39 17,00 Đợt 2 14,47 14,09 17,30 16,09 Đợt 3 15,02 14,20 17,45 16,67 Qua bảng 3.3. ta thấy lượng sinh khối tươi ở mẫu nuôi hở cho kết quả lớn hơn mẫu nuôi kín không sục khí. Và hiệu quả keo tụ và thu hoạch của Al2(SO4)3 cao hơn AlCl3. Hiệu quả thu hoạch của Al2(SO4)3 qua 3 đợt thí nghiệm đạt trung bình 14,91 đối với mẫu nuôi kín và đạt 17,38 đối với mẫu nuôi hở có sục khí. Còn hiệu quả của AlCl3 đạt 14,09 đối với mẫu nuôi kín và đạt 16,59 đối với mẫu nuôi hở có sục khí. Theo kết quả thu được và theo lý thuyết ta có thể cho rằng khối lượng tảo khi thu hoạch bằng Al2(SO4)3 lớn hơn khi thu hoạch bằng AlCl3 có thể là do khối lượng hóa chất còn trong sinh khối tảo. Vì SO42- có khối lượng phân tử lớn hơn Cl-. Ta cũng không thể loại bỏ khả năng hiệu quả thu hoạch cao hơn của Al2(SO4)3. Hình 3.9. Mẫu tảo được kết tụ khi bổ sung phèn nhôm và nổi lên khi được sục không khí A. Bổ sung Al2(SO4)3 B. Bổ sung AlCl3 A B Tuy nhiên, theo phương pháp này phải tiêu tốn khá nhiều hoá chất (liều lượng phèn tới 70- 100 mg/1 lít dung dịch), do hàm lượng phèn cao như vậy trong sản phẩm có thể gây độc hại đối với các động vật nuôi. 3.6.4. Thu hoạch bằng phương pháp tự kết tủa Tự kết tủa là hiện tượng lắng đọng tảo sau một thời gian nuôi cấy do độ pH tăng lên rất cao. Vì tảo tiêu thụ CO2 nên độ pH tăng lên dần dẫn tới việc kết tủa của hydroxyt magie (Mg(OH)2) và carbonatcanxi (CaCO3) sẽ kéo theo tảo lắng xuống. Bảng 3.4: Khối lượng sinh khối tươi của mẫu nuôi cấy được thu hoạch bằng phương pháp tự kết tủa Đợt thí nghiệm Khối lượng sinh khối tươi của mẫu nuôi cấy (g/l) Mẫu nuôi ARK Mẫu nuôi ARH Đợt 1 6,23 7,09 Đợt 2 6,31 6,98 Đợt 3 6,86 7,12 Qua bảng 3.4. ta thấy hiệu quả thu hoạch bằng phương pháp này rất thấp. Chỉ đạt khối lượng trung bình qua 3 đợt thí nghiệm là 6,47g/l đối với mẫu nuôi kín không sục khí và đạt 7,06g/l đối với mẫu nuôi hở có sục khí. Việc thu hoạch tảo theo phương pháp này có một số nhược điểm: do thu hoạch bằng lắng trọng lực dẫn tới yêu cầu phải tuyệt đối tĩnh, nhiệt độ và thời tiết có thể ảnh hưởng tới việc tăng cao pH do đó ảnh hưởng tới việc lắng đọng tảo, mặt khác theo phương pháp này cần một diện tích khá rộng. Hình 3.10. Mẫu tảo tự kết tủa do độ pH tăng trong quá trình nuôi cấy A. Nuôi trong môi trường Zarrouk B. Nuôi trong môi trường rỉ đường 3.6.5. Thu hoạch bằng phương pháp siêu âm Trước khi tiến hành siêu âm, ta tiến hành đếm số lượng tế bào có trong dịch nuôi cấy ban đầu và sau siêu âm ta cũng đếm số lượng tế bào trong dịch sau siêu âm để từ đó xác định được hiệu quả thu hoạch bằng siêu âm. Bảng 3.5. Số lượng tế bào của các chủng nuôi cấy trước khi xử lý siêu âm Điều kiện nuôi cấy Số lượng tế bào (106 tế bào/ lít) Nuôi trong bình kín 1341 Nuôi hở có sục khí 1759 Kết quả sau khi xử lý siêu âm Tiến hành thí nghiệm siêu âm thu hoạch tảo vào cuối pha logarit. Do không có thiết bị siêu âm nào khác nên chỉ sử dụng máy siêu âm hiệu Elmasonic S300H Lắc đều mẫu trước khi cho vào bình tam giác với các mức thể tích 50 và 100ml. Ứng với mỗi mức thể tích tiến hành xử lý siêu âm lần lượt ở các khoảng thời gian 5- 15 phút. Thực hiện thí nghiệm ở máy siêu âm. Sau khi thí nghiệm xong để lắng mẫu từ 3- 4 giờ, sau đó hút phần dịch trên và cố định bằng lugol trung tính để đếm số lượng tảo còn lại sau khi xử lý siêu âm. Thao tác được tiến hành nhanh chóng và nhẹ nhàng tránh làm động lớp tảo lắng dưới đáy bình. Lặp lại thí nghiệm 3 lần. Sau khi xác định số lượng tảo trước và sau khi siêu âm ta suy ra được hiệu quả thu hoạch bằng siêu âm. Từ thực nghiệm ta có kết quả sau khi xử lý siêu âm các mẫu tảo được trình bày ở bảng 3.6. Bảng 3.6. Tỉ lệ tế bào lắng khi thu hoạch tảo bằng siêu âm Thời gian siêu âm (giây) Tỉ lệ tế bào lắng (%) Các dung tích mẫu xử lý (ml) Trung bình của hai loại thể tích 50 100 ASH ASK ASH ASK ASH ASK 300 14,52 20,90 10,90 15,62 12,71 18,26 360 23,65 36,30 23,24 26,78 23,45 31,54 420 43,98 49,92 37,79 39,34 40,89 44,63 480 60,05 58,99 44,62 45,39 52,34 52,19 540 74,34 70,23 56,80 56,95 65,57 63,59 600 89,82 84,92 63,93 67,93 76,88 76,43 660 98,61 99,02 79,45 76,27 89,24 87,28 720 100 100 87,90 88,85 93,95 94,43 780 100 100 90,96 97,09 95,48 98,55 840 100 100 98,79 100 99,40 100 900 100 100 100 100 100 100 ASH: Mẫu tảo nuôi hở có sục khí sau khi siêu âm ASK: Mẫu tảo nuôi kín không có sục khí sau khi siêu âm Kết quả thu hoạch tảo bằng phương pháp siêu âm (bảng 3.6) cho thấy không có sự giảm đáng kể quần thể tảo trong thời gian 300 giây tiếp xúc nhưng có sự lắng đáng kể ở thời gian tiếp xúc dài hơn. Khi xử lý ở 300 giây thì đối với mức thể tích 50ml thì ASH chỉ đạt 14,52%, ASK chỉ đạt 20,9%, còn đối với mẫu có thể tích 100ml thì hiệu quả xử lý trong 300 giây của ASH chỉ đạt 10,9% và mẫu ASK đạt 15,62%. Tỉ lệ lắng của tảo tăng lên đáng kể khi tăng dần thời gian tiếp xúc với sóng siêu âm và khi tăng đến 660 giây thì mẫu có thể tích 50ml có tỉ lệ lắng gần như hoàn toàn, mẫu ASH đạt 98,61% và mẫu ASK đạt 99,02%. Ở thời gian tiếp xúc 660 giây, đối với mẫu có thể tích 100ml có tỉ lệ lắng đối với mẫu ASH chỉ đạt 79,45% và mẫu ASK đạt 76,27% vì vậy ta cần tăng thêm thời gian tiếp xúc với sóng siêu âm. Và khi tăng đến 840 giây thì tỉ lệ lắng của ASK đạt 100% còn mẫu ASH chỉ đạt 98,79%, đến khi tăng thời gian lên 900 giây thì toàn bộ tảo trong mẫu lắng hoàn toàn 100% (37kHz, 1000W). Như vậy, ở cùng tần số, cùng cường độ sóng siêu âm thì thời gian tiếp xúc sóng siêu âm càng lâu thì hiệu quả thu hoạch tảo bằng siêu âm càng hiệu quả. Theo kết quả nghiên cứu của Trương Thị Hồng Yến (Đồ án tốt nghiêp, 2008) thì ở tần số 40kHz, cường độ 350W ( Power sonic 405) làm lắng dịch huyền phù tảo mọc tự nhiên chỉ sau 3 phút và ở tần số 35kHz, cường độ 120W ( Ultrasonic cleaner) làm lắng sau 5 phút, còn kết quả của chúng tôi thì khác xa với kết quả nghiên cứu của Trương Thị Hồng Yến, các nguyên nhân dẫn đến sự khác nhau này có thể là do nguồn mẫu thí nghiệm có số lượng tế bào khác nhau, thiết bị thí nghiệm khác nhau. Ngoài ra cũng vì điều kiện giới hạn không thể thực hiện siêu âm ở các thiết bị khác nhau nên chỉ siêu âm được ở máy siêu âm có cường độ và tần số cố định nên không thể có những kết luận chính xác về sự tăng hay giảm tần số và cường độ thì có ảnh hưởng gì đến quần thể tảo nuôi cấy. Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn tỉ lệ % lắng của tế bào tảo theo thời gian tiếp xúc với sóng siêu âm của 4 mẫu tảo khác nhau. Nhận xét: Qua đồ thị hình 3.11 ta thấy mẫu có dung tích 50ml có hiệu quả lắng khi siêu âm lớn hơn mẫu có dung tích 100ml. Đối với mẫu có dung tích 50ml, không sục khí và có sục khí thì hiệu quả lắng 100% ở 720 giây. Đối với mẫu có dung tích 100ml thì thời gian tiếp xúc siêu âm tăng lên rất nhiều, mẫu không sục khí thì tỉ lệ lắng đạt 100% sau 840 giây còn đối với mẫu sục khí thì thời gian tăng hơn 1 phút, có nghĩa là lắng 100% sau 900 giây. Qua đó ta thấy rằng mẫu được nuôi ở chế độ có sục khí thì thời gian tiếp xúc với sóng siêu âm thường dài hơn so với mẫu không sục khí, sở dĩ như vậy có thể là do mẫu được nuôi ở chế độ có sục khí thì mật độ tế bào lớn hơn. Do mật độ tế bào lớn hơn nên khi tiếp xúc với sóng siêu âm thì trung bình mỗi tế bào tiếp xúc được với sóng siêu âm là ít hơn nhiều so với mật độ tế bào trong môi trường ít. Do mật độ tế bào lớn hơn nên để tỉ lệ lắng của tảo là 100% thì ta tăng thêm thời gian tiếp xúc tối ưu nhất với sóng siêu âm. Hiệu quả thu hoạch bằng siêu âm phụ thuộc vào cường độ, tần số siêu âm. Ngoài ra còn phụ thuộc vào những yếu tố khác như thời gian siêu âm, mật độ tế bào tảo trong mẫu trước khi siêu âm... Chính các yếu tố đó làm nên sự sai khác kết quả với các nghiên cứu của các tác giả khác. Hình 3.12 . Mẫu tảo nuôi hở có sục khí trước khi tiếp xúc với sóng siêu âm Hình 3.13. Mẫu tảo nuôi hở có sục khí sau khi tiếp xúc với sóng siêu âm Hình 3.14. Mẫu tảo nuôi kín không sục khí trước khi tiếp xúc với sóng siêu âm Hình 3.15. Mẫu tảo nuôi kín không sục khí sau khi tiếp xúc với sóng siêu âm Hình 3.16. Mẫu tảo lắng 100% sau khi tiếp xúc với sóng siêu âm trong một thời gian. Bảng 3.7: Khối lượng sinh khối tươi của mẫu nuôi cấy được thu hoạch bằng phương pháp siêu âm Đợt thí nghiệm Khối lượng sinh khối tươi của mẫu nuôi cấy (g/l) Mẫu nuôi ARK Mẫu nuôi ARH Đợt 1 21,32 24,05 Đợt 2 20,98 24,20 Đợt 3 21,02 23,92 Hình 3.17. Sinh khối tảo thu được sau khi siêu âm Qua bảng 3.7 ta thấy hiệu quả thu hoạch bằng siêu âm đạt khá cao so với các phương pháp thu hoạch khác. Đạt khối lượng trung bình qua 3 đợt thí nghiệm là 21,11g/l đối với mẫu nuôi kín không sục khí (lớn hơn phương pháp lọc thủ công 9,91g/l, lớn hơn phương pháp lọc có bơm chân không là 2,97g/l, lớn hơn phương pháp tự lắng là 14,64g/l) và đạt 24,06g/l đối với mẫu nuôi hở có sục khí (lớn hơn phương pháp lọc thủ công 10,18g/l, lớn hơn phương pháp lọc có bơm chân không là 3,99g/l, lớn hơn phương pháp tự lắng là 16,99g/l). Tóm lại, qua thực nghiệm các phương pháp thu hoạch ta thấy phương pháp siêu âm cho hiệu quả cao nhất nhưng nó có nhược điểm là yêu cầu trạng thái tĩnh của môi trường và tiếp theo đó là phương pháp lọc có bơm chân không. Nếu thu hoạch ở quy mô phòng thí nghiệm thì ta nên thu hoạch theo phương pháp siêu âm và lọc có bơm chân không sẽ đảm bảo được các thông số như đảm bảo vệ sinh, an toàn, hiệu quả, không gây độc hại, thiết bị đơn giản ..., còn nếu ở quy mô lớn, quy mô công nghiệp thì phương pháp siêu âm và lọc có bơm chân không không khả thi cho lắm vì sẽ tốn nhiều chi phí, vậy ta nên sử dụng phương pháp lọc qua lưới lọc hay dùng máy lọc thùng quay. 3.7. Phương pháp đánh giá chất lượng tảo nuôi 3.7.1. Định lượng chlorophyll Sau thực nghiệm và xử lý số liệu ta có bảng đo OD các mẫu (xem phụ lục 7) và kết quả nồng độ Chlorophyll như bảng 3.8. sau: Bảng 3.8. Nồng độ chlorophyll có trong các mẫu nuôi cấy khác nhau Mẫu nuôi cấy Nồng độ Chlorophyll (mg/g) AZ 6,641 AR 6,023 AS3 5,406 Nhận xét: Qua bảng 3.8 ta thấy nồng độ Chlorophyll của các mẫu nuôi cấy thay đổi trong khoảng 5,406- 6,641 mg/g. Mẫu nuôi trong môi trường rỉ đường có hàm lượng chlorophyll cao nhất trong 3 mẫu và mẫu sau siêu âm 3 ngày có hàm lượng tương đương với các mẫu khác. Challem (1981) gọi chlorophyll là máu xanh vì nó giống hemoglobin, chỉ khác là nhóm kim loại của nó là Mg ở dạng ion (nên có màu xanh) thay vì Fe trong hemoglobin (màu đỏ). Có ý kiến cho rằng nếu như kim loại trong chlorophyll được thay bằng ion Fe thì nó có thể thay thế hemoglobin trong mô bào. Trong sinh khối S. platensis có chứa khoảng 1,15% chlorophyll, chiếm tỉ lệ cao nhất so với các loại thực phẩm tự nhiên khác. Theo nghiên cứu của Hoàng Nghĩa Sơn (2000) trong 10g sinh khối khô có chứa 115mg Chlorophyll, chiếm tỉ lệ 1,15% trong 10g sinh khối khô. Theo nghiên cứu của Phan Văn Dân (2009) thì hàm lượng Chlorophyll nuôi hở có mái che, có sục khí với vận tốc 0,5m/s đạt 16,35, còn mẫu khi nuôi dưới ánh nắng có sục khí với tốc độ 0,5m/s thì chỉ đạt 5,09mg/g. Các mẫu nuôi cấy của chúng tôi có hàm lượng Chlorophyll thấp hơn so với các nghiên cứu khác có thể là do chủng giống khác nhau, điều kiện nuôi cấy khác xa nhau, môi trường nuôi cấy khác nhau, thời gian thu hoạch và phân tích khác nhau nên hàm lượng Chlorophyll thu được cũng khác nhau. 3.7.2. Định lượng phycocyanin Sau khi tiến hành thí nghiệm và xử lý số liệu ta có kết quả đo OD các mẫu nuôi (xem phụ lục 7) và nồng độ phycocyanin có trong các mẫu nuôi cấy như trong bảng 3.9 sau: Bảng 3.9. Nồng độ phycocyanin có trong các mẫu nuôi cấy khác nhau Mẫu nuôi cấy Nồng độ phycocyanin (mg/g) AZ 56,75 AR 53,3 AS3 47,83 Nhận xét: Sắc tố là yếu tố rất quan trọng giúp tổng hợp các loại hormon cần thiết để điều khiển các hoạt động của cơ thể. Hàm lượng sắc tố trong sinh khối Spirulina platensis rất cao, đặc biệt là carotenoid, chlorophyll, phycocyanin. Nhưng trong đó phycocyanin là sắc tố đóng vai trò rất quan trọng trong Spirulina platensis và tồn tại dưới dạng một protein phức hợp, chiếm đến 20% trọng lượng sinh khối khô. Trong phycocyanin có cả nguyên tố Fe, Mg vì vậy nó rất có ý nghĩa dinh dưỡng ở người khi nhu cầu bổ sung các khoáng này dưới dạng hữu cơ. Các chủng nuôi cấy ở môi trường khác nhau thì hàm lượng phycocyanin cũng khác nhau. Theo nghiên cứu của Hoàng Nghĩa Sơn (2000) hàm lượng sắc tố phycocyanin có trong 10g sinh khối khô là 1500-2000 mg. Qua bảng trên ta thấy môi trường nuôi cấy khác nhau thì hàm lượng phycocyanin có trong mẫu cũng khác nhau. Trong môi trường Zarrouk thì hàm lượng phycocyanin là cao nhất đạt 56,75 mg/g, còn trong môi trường rỉ đường và mẫu sau khi siêu âm 3 ngày thì nồng độ phycocyanin là 53,3 mg/g và 47,83 mg/g. Qua đó ta thấy mẫu tảo sau khi siêu âm để thu hoạch và đã được phục hồi sau 3 ngày thì hàm lượng phycocyanin có trong mẫu cũng không khác gì lắm so với các mẫu nuôi ở môi trường khác, do đó ta có thể thu hoạch tảo bằng phương pháp siêu âm mà chất lượng thành phần các chất có trong tảo cũng được đảm bảo. Kết quả thu được cho thấy chủng tảo nuôi cấy của chúng tôi cũng cho kết quả khác với nghiên cứu của Hoàng Nghĩa Sơn đã công bố (2000). Theo nghiên cứu của Phan Văn Dân (2009) thì hàm lượng phycocyanin của mẫu khi nuôi dưới ánh nắng có sục khí với tốc độ 0,1m/s đạt 50,26mg/g, mẫu khi nuôi dưới điều kiện có mái che và sục khí với vận tốc 0,1m/s thì đạt hàm lượng cao hơn là 121,25mg/g. Nhìn chung các mẫu chúng tôi nuôi ở các môi trường khác nhau cũng cho hàm lượng phycocyanin tương đối so với các nghiên cứu khác. Sở dĩ có sự khác biệt là do chủng giống khác nhau, được nuôi ở môi trường khác nhau, điều kiện nuôi cấy khác nhau, thời gian thu hoạch mẫu, thời gian phân tích khác nhau, cũng có thể do phương pháp phân tích khác nhau nên hàm lượng phycocyanin thu được của mỗi mẫu cũng khác nhau. 3.7.3. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford Protein là thành phần quan trọng để đánh giá chất lượng dinh dưỡng của tảo. Để đánh giá chất lượng tảo được nuôi ở các điều kiện khác nhau có giá trị dinh dưỡng như thế nào thì ta tiến hành định lượng protein có trong mẫu theo phương pháp Bradford. Hàm lượng protein trong Spirulina dao động từ 50-70% trọng lượng khô. Hàm lượng protein này thấp hơn từ 5-10% tùy vào thời gian thu hoạch và môi trường sống. Giá trị cao nhất thường đạt được khi thu hoạch vào buổi sáng sớm của ngày nắng. Spirulina có hàm lượng protein cao hơn bất kỳ một loại thực phẩm nào khác, nhiều hơn thịt động vật và cá tươi (15 – 25% trọng lượng tươi), đậu nành (35% trọng lượng khô), sữa bột (35% trọng lượng khô), trứng (12% trọng lượng tươi), đậu phộng (25% trọng lượng khô), lúa gạo (8 – 14% trọng lượng khô), sữa (3% trọng lượng tươi). Hình 3.18. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn để xác định hàm lượng protein có trong mẫu Sau thực nghiệm ta được kết quả đo OD để xây dựng đường chuẩn như bảng 8.1 trong phụ lục 8. Nên ta có đồ thị đường chuẩn như hình 3.18 Dựa vào đồ thị đường chuẩn ở hình 3.18 ta có phương trình đường chuẩn y = 0.0053x có hệ số tương đối R2 = 0.9965, với giá trị này R2 có thể chấp nhận để tính toán kết quả của hàm lượng protein tạo thành. Từ đường chuẩn dựng được chúng tôi tiến hành đo mẫu tảo OD595nm xác định hàm lượng protein của các chủng tảo nuôi cấy. Thay giá trị ∆OD595nm của các chủng tảo (bảng 8.1 trong phụ lục 8) vào đồ thị đường chuẩn ta có bảng 3.10. Bảng 3.10. Hàm lượng protein của các chủng tảo nuôi cấy Mẫu nuôi cấy Nồng độ protein( mg/ml) Hàm lượng protein (% trọng lượng tươi) AZ 0,609 60,9 AR 0,593 59,3 AS3 0,537 53,7 Với số liệu như bảng 3.10 ở trên ta thấy rằng: Hàm lượng protein của các chủng Spirulina platensis nuôi cấy được dao động khoảng 53,7 – 60,9%. Trong đó, chủng AZ có hàm lượng protein cao nhất đạt 60,9% và chủng AR đạt 59,3% và chủng AS3 đạt 53,7%. Nhìn chung có sự chênh lệch về hàm lượng protein có trong các mẫu khác nhau. Qua đó ta thấy chất lượng tảo nuôi trong môi trường Zarrouk cho lượng protein cao hơn khi nuôi trong môi trường rỉ đường và hàm lượng protein có trong mẫu sau khi phục hồi sau 3 ngày (sau khi tiến hành siêu âm) cũng đạt khá cao. Theo PGS-TS Đặng Đình Kim nghiên cứu cho thấy hàm lượng protein của chủng tảo Spirulina platensis là rất cao từ 66– 67 % [10]. Ở thí nghiệm của Goksan nghiên cứu về sự phát triển của Spirulina platensis trong những hệ thống nuôi cấy khác nhau dưới điều kiện nhà kính, hàm lượng protein trong hệ thống các bình trong suốt (transparent jars) là 33% (so với trọng lượng khô), túi polyethylene (54,5%), hệ thống ao hồ tạo dòng chảy (raceway ponds) (58,3%) [13]. Theo Harriet, khi nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên hàm lượng protein trong môi trường nước được mặn hóa (salinated water) thì hàm lượng protein đạt 48,59% (so với trọng lượng khô) và hàm lượng protein ở môi trường nước thải loại muối (desalonator wastewater) đạt 56,17% [11]. Như vậy tóm lại, các mẫu khác nhau có hàm lượng protein khác nhau có thể là do những nguyên nhân sau: Các giống tảo khác nhau cũng cho hàm lượng protein khác nhau, các mẫu nuôi ở điều kiện môi trường khác nhau sẽ có hàm lượng protein khác nhau. Ngoài ra hàm lượng protein còn phụ thuộc vào thời gian thu hoạch, có thể ở mẫu này đến thời gian thu hoạch nhưng mẫu khác thì chưa tới giai đoạn thu hoạch. 3.8. Kết quả thuần chủng giống tảo 3.8.1. Phương pháp chiếu tia UV Tia cực tím có khả năng diệt khuẩn, điều đó có nghĩa rằng Spirulina platensis cũng là đối tượng chịu ảnh hưởng, khả năng này càng dễ xảy ra khi Spirulina platensis được phơi trực tiếp dưới tia cực tím. Thực nghiệm cho thấy rằng nếu chiếu tia UV trong 30 phút thì Spirulina platensis bị phá hủy thành các đoạn ngắn, còn nếu chiếu trong 60 phút thì các tế bào bị phả hủy và các chất trong tế bào được giải phóng ra môi trường. Hiệu quả thuần chủng mẫu bằng cách chiếu trực tiếp tia UV vào dịch nuôi cấy là không khả thi mà bên cạnh đó còn có tác động xấu đến Spirulina platensis. Hình 3.19. Mẫu tảo bị nhiễm sau khi được cấy lên môi trường thạch từ dịch được chiếu tia UV Ở hình 3.19 ta thấy mẫu tảo sau khi chiếu tia UV được cấy trên môi trường thạch thì bị nhiễm. Các nguyên nhân có thể là do độ vô trùng của tủ cấy không đảm bảo, khoảng cách giữa đèn UV và mẫu cần thuần chủng xa nhau nên cường độ không đủ để tiêu diệt vi sinh vật. Do Spirulina platensis có kích thước lớn hơn nhiều lần vi khuẩn thì lượng tia UV mà chúng nhận được cũng sẽ nhiều hơn. Ngoài ra, cũng có thể do mật độ tế bào trong mẫu cao quá nên mỗi tế bào nhận được ít tia UV nên không có khả năng diệt khuẩn và Spirulina platensis có cấu trúc xoắn lò xo nên luôn tồn tại những vị trí bị che khuất theo chiều dài sợi đây chính là chỗ mà UV hầu như không thể tiếp cận để phát huy tính sát khuẩn do đó đây cũng là nơi mà vi khuẩn có thể ẩn nấp để tránh tác động của tia UV. 3.8.2. Phương pháp cấy chuyền trên môi trường thạch Zarrouk vô trùng. Trên môi trường thạch Zarrouk, Spirulina platensis với khả năng phát triển nhanh hơn vi khuẩn tạp nhiễm trong những giờ đầu tiên nuôi cấy nhờ đó nên ta có thể tận dụng đặc điểm này để làm thuần chủng giống. Khi các sợi tảo đầu tiên được mọc ra thì tiến hành rửa 5- 7 lần và cấy chuyền lên m