Đồ án Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật và chitosan lên sự tạo chồi lan cattleya hybrid white

công trình nghiên cứu thực sự của tôi dưới sự hướng dẫn của ThS. Nguyễn Thị Thu Hương – giảng viên Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Đề tài được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và tiến hành nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Vật, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, thuộc Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Các số liệu và bảng trong bài là hoàn toàn trung thực. Đồ án không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, nếu phát hiện có bất kì gian lận nào tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. TP.HCM, ngày 15 tháng 8 năm 2016 Sinh viên thực hiện Nguyễn Gia Lộc i LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến Quý Thầy Cô ở Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường của trường Đại học Công nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình đã truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho em trong suốt thời gian học tập tại trường. Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu đồ án mà còn là hành trang quí báu để em bước vào đời một cách vững chắc và tự tin. Đặc biệt cho phép em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS. Nguyễn Thị Thu Hương – người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu và cung cấp những tư liệu quý giá cho em thực hiện tốt bài đồ án tốt nghiệp này. Cảm ơn cô đã tiếp thêm cho em niềm tin và nghị lực để định hướng cho tương lai. Qua bài đồ án này, em cũng xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho em tiếp cận và học hỏi nhiều kinh nghiệm trong quá trình làm đồ án. giúp em nắm vững những kiến thức đã học. Bên cạnh đó, em cũng xin cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và thầy Nguyễn Trung Dũng cán bộ phòng thí nghiệm đã giúp đỡ em trong suốt thời gian làm đồ án. Cảm ơn các bạn phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đã giúp đỡ, hỗ trợ mình trong suốt quá trình làm đồ án. Cuối cùng em kính chúc Quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp trồng người. TP.Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 8 năm 2016 Sinh viên thực hiện đồ án Nguyễn Gia Lộc ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ ii MỤC LỤC .............................................................................................................. iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................ v DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. vi DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ vii DANH MỤC BIỂU ĐỒ .......................................................................................... viii MỞ ĐẦU ...................................................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1 2. Mục đích của đề tài ............................................................................................. 2 3. Nội dung của đề tài ............................................................................................. 2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nguyên cứu ........................................ 2 5. Kết quả đạt được của đề tài ................................................................................. 3 6. Kết cấu của đồ án ................................................................................................. 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4 1.1. Giới thiệu về phương pháp nuôi cấy ................................................................. 4 1.1.1. Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô thực vật ......................................... 4 1.1.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô ở Việt Nam ............................................. 4 1.1.3. Ứng dụng của nhân giống in vitro ................................................................. 5 1.1.4. Ưu và nhược điểm của quá trình nhân giống ................................................. 6 1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống in vitro ............................... 7 1.2. Ý nghĩa của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật .................................... 9 iii 1.3. Sự phát sinh hình thái ........................................................................................ 10 1.4. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và các yếu tố ảnh hưởng ..................... 11 1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng về chitosan ................................................ 16 1.6. Giới thiệu về cây Cattleya ................................................................................. 18 1.6.1. Giới thiệu chung về cây phong lan ................................................................ 18 1.6.2. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và phát triển phong lan trên thế giới và ở Việt Nam .................................................................................................................. 25 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................. 32 2.1 Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài ............................................................... 32 2.1.1. Địa điểm thí nghiệm ....................................................................................... 32 2.1.2. Thời gian tiến hành thí nghiệm ...................................................................... 32 2.2. Vật liệu .............................................................................................................. 32 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu..................................................................................... 32 2.2.2. Môi trường nuôi cấy ....................................................................................... 32 2.2.3. Điều kiện thí nghiệm ...................................................................................... 33 2.3. Phương pháp...................................................................................................... 33 2.4. Bố trí thí nghiệm ............................................................................................... 34 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White .............................................. 34 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ BA cố định lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White ....................................................... 44 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ BA, NAA cố định lên sự tạo chồi Cattleya Hybrid White .............................................. 35 2.5. Chỉ tiêu theo dõi ................................................................................................ 36 2.6. Thống kê và xử lý số liệu .................................................................................. 37 iv CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 38 3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy. .................................... 38 3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy. .................................... 45 3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy. .................... 51 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 58 4.1.Kết luận .............................................................................................................. 58 4.2. Kiến nghị ........................................................................................................... 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 59 PHỤ LỤC ................................................................................................................... 1 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BA 6-benzyl-aminopurine DNA deoxyribonucleic acid MS Murashige và Skoog (1962) NAA Alpha-naphtalenacetic acid TCN Trước Công Nguyên TP. HCM Thành Phố Hồ Chí Minh 2,4-D 2,4-dichlopophenoxyacetic acid vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên tạo chồi lan Cattleya Hybrid White ........................................................... 34 Bảng 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ BA cố định lên tạo chồi lan Cattleya Hybrid White ................................................................. 35 Bảng 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ BA, NAA cố định lên tạo chồi lan Cattleya Hybrid White ............................................. 36 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy ................................. 39 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy ................................. 46 Bảng 3.3. Ảnh hưởng chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy ........................... 52 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hoa lan Cattleya Hybrid White ............................................................... 21 Hình 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 g/l) ..... 41 Hình 3.2. Ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 g/l) ..... 42 Hình 3.3. Ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 g/l) ..... 48 Hình 3.4. Ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 g/l) ..... 49 Hình 3.5. Ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 5; 10; 15; 20; 25 g/l) ...................................................................................................... 54 Hình 3.6. Ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 5; 10; 15; 20; 25 g/l) ...................................................................................................... 55 viii DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 g/l) ................................................................................................ 40 Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ NAA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 g/l) ................................................................................................ 47 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ chitosan là: 0; 5; 10; 15; 20; 25 g/l) ....................................................................... 53 ix LỜI MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cùng với sự phát triển của văn minh nhân loại, đời sống con người ngày càng được nâng cao, cả về mặt vật chất và tinh thần. Nhu cầu thưởng thức cái đẹp, đặc biệt cái đẹp đến từ thiên nhiên, cỏ cây hoa lá dần đi vào đời sống mỗi người dân. Từ xa xưa, chơi hoa, trồng hoa và thưởng thức hoa đã được coi là một thú vui nghệ thuật độc đáo và thú vị. Ngày nay, nghề trồng hoa và kinh doanh hoa đang ngày càng được chú tâm và phát triển bởi nó không chỉ bó hẹp trong giá trị thưởng thức mà còn mang lại giá trị kinh tế rất cao. Phong lan là một trong những loài hoa có chất lượng cao, giá trị kinh tế lớn, được nhiều người yêu thích bởi có hoa đẹp, cấu trúc hoa kiêu kỳ, phức tạp. Hơn nữa, màu sắc hoa vô cùng phong phú, hương thơm quyến rũ, thời gian chơi dài. Nhờ quá trình sưu tầm các loài lan đẹp, lạ mắt và các kỹ thuật lai tạo ra các thứ lan mới, số loài hoa lan hiện nay trên thế giới có thể đã lên đến 100 ngàn loài. Vì thế, trong thời gian gần đây, trên thế giới cũng như ở Việt Nam, thú chơi lan đã trở thành thông dụng và có điều kiện hơn, không phân biệt địa vị, tuổi tác, hoàn cảnh kinh tế. Số người chơi và yêu chuộng hoa lan ngày càng tăng, hay nói cách khác, nhu cầu sử dụng các chủng loại lan đã và đang tăng. Hoa lan hiện đang được trồng và kinh doanh với 3 kiểu dáng: hoa cắt cành, cây đã thành thục trong chậu treo hay bám trên giá thể và cây lan con từ 10 – 15 cm. Được mệnh danh là “hoàng hậu” của các loài lan, Cattleya nổi bật với vẻ đẹp kiêu sa, quý phái không chỉ ở cánh hoa mà ở tất cả các bộ phận của cây, cùng với hương thơm dễ chịu làm mê đắm lòng người. Cattleya có thể sống được ở vùng nóng và vùng ôn đới, đặc biệt đây là giống rất thích hợp với điều kiện khí hậu của Việt Nam với biên độ rộng. Chính vì thế nó được trồng và phát triển mạnh ở tất cả các nơi, các tỉnh phía Nam, phía Bắc và ngay cả trên vùng Cao Nguyên, tuy nhiên mỗi nơi đều có cách trồng khác nhau. Đối với các nước có nền công nghiệp hoa lan 1 phát triển mạnh như Thái Lan, Hà Lan, Đài Loan và Trung Quốc, lan nói chung và Cattleya nói riêng đều được đầu tư đi sâu nghiên cứu để không chỉ tạo ra giò lan đẹp mà còn có giá cả cạnh tranh. Do đó việc giảm giá thành cây giống để cung cấp cho người sản xuất, mở rộng diện tích đang là vấn đề bức xúc hiện nay. Để giải quyết vấn đề này người ta áp dụng nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô vì hệ số nhân cao, có thể nhân nhanh được hàng loạt các cây con giống có năng suất và phẩm chất tốt như bố mẹ chọn lọc. Từ một cây mẹ ban đầu ta có thể nhận ra hàng ngàn cây con có kích thước và chất lượng đồng đều như nhau, giúp việc nhân giống được nhanh hơn. Mặt khác, cây con ổn định về di truyền, đồng thời giảm tác hại cho cây giống và đem lại hiệu quả thiết thực trong việc nâng cao chất lượng cây giống và giảm giá thành. Chính vì vậy tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng thực vật và chitosan lên sự tăng trƣởng và nhân chồi Cattleya Hybrid White” nhằm mục đích tìm hiểu rõ hơn về môi trường nuôi cấy. 2. Mục đích của đề tài Xác định nồng độ BA và NAA thích hợp nhất lên khả năng tạo chồi lan Cattleya Hybrid White. Đánh giá hoạt tính kích thích tạo chồi khi bổ sung chitosan trong môi trường nuôi cấy mô cây lan Cattleya Hybrid White. 3. Nội dung của đề tài  Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White.  Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White.  Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nguyên cứu Ý nghĩa khoa học: - Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học có giá trị về môi trường nuôi cấy tăng trưởng lan và lan Cattleya nói riêng. 2 - Là cơ sở cho nghiên cứu cải tiến môi trường nuôi cấy các loài lan khác nói chung. Ý nghĩa thực tiễn: - Kết quả của nghiên cứu là cơ sở để tạo môi trường nuôi cấy thích hợp nhân nhanh giống lan Cattleya Hybrid White ở quy mô lớn, tạo cây con sạch bệnh nhằm cung cấp cho sự đa dạng giống lan tại Việt Nam. 5. Kết quả đạt đƣợc của đề tài - Xác định được nồng độ BA thích hợp cho quá trình tạo chồi lan Cattleya Hybrid White. - Xác định được nồng độ NAA thích hợp cho quá trình tạo chồi lan Cattleya Hybrid White. - Xác định được nồng độ chitosan thích hợp cho quá trình tạo chồi lan Cattleya Hybrid White. 6. Kết cấu của đồ án Đồ án bao gồm các chương sau: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về phƣơng pháp nuôi cấy 1.1.1. Khái niệm về phƣơng pháp nuôi cấy mô thực vật Nuôi cấy mô (tissue culture) là sự nuôi cấy vô trùng các cơ quan, mô, tế bào thực vật và các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật trên môi trường nuôi cấy được xác định rõ. Việc nuôi cấy được duy trì dưới điều kiện kiểm soát. Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền (giống cây trồng), sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý. Môi trường có chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và đường. 1.1.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô ở Việt Nam Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật du nhập vào nước ta từ năm 1960 ở miền Nam và đầu những năm 1970 ở miền Bắc, nhưng thực sự phát triển từ năm 1980. Lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng. Nhiều tỉnh thành trong cả nước đã xây dựng nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu công nghệ cao để phát triển lĩnh vực nuôi cấy mô này và đã mang lại nhiều thành tựu nổi bật:  Người ta có thể sản xuất giống trong phòng thí nghiệm để đưa ra sản xuất nhanh chóng hơn nhiều phương pháp cổ điển, nhờ vậy mà một người có thể sản xuất ra 130.000 cây Hồng/năm từ một gốc Hồng.  Ở miền Bắc, nhân giống vô tính ở thực vật được ứng dụng ở hầu hết các loài thực vật nông, lâm sản, bảo tồn thành công các loại gỗ quý như: Vù hương (loại gỗ tiết tinh dầu dùng trong dược phẩm, mỹ phẩm), cây Đăng lấy gỗ, Chè vang (một loại chè rất khó trồng). Kỹ thuật này giúp lai tạo thành công giống Lúa chịu hạn DR1, nhân giống nhiều loại khoai tây, mía,...  Từ năm 2001 đến nay, Sở Khoa học – Công nghệ Lạng Sơn, hàng năm cung cấp hàng vạn cây giống Bạch đàn Eucalyptus urophylla. 4  Trung tâm ứng dụng và chuyển giao tiến bộ công nghệ tỉnh Vĩnh Phúc ứng dụng thành công công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân giống cây Lô hội, một loài dược liệu quý ở địa phương.  Việt Nam có thể trở thành quốc gia sản xuất Phong lan lớn trong khu vực. Chỉ với 3 người, phòng nuôi cấy mô – trung tâm giống và kỹ thuật cây trồng Phú Yên có thể tạo 500.000 cây lan cấy mô theo yêu cầu của khách hàng. Hiện nay 100% nông dân Đà Lạt sử dụng cây giống từ nuôi cấy mô.  Năm 2002, Lê Thị Kim Đào và cộng sự tại Trung tâm Ứng dụng Khoa học Kỹ thuật Bình Định đã nhân giống thành công 4 loại cây Trầm hương, Bạch đàn Urophylla, cây Hông, Giổi xanh bằng phương pháp nuôi cấy mô cho chất lượng cây giống tốt và hiệu quả kinh tế cao.  Năm 2008, công nghệ nuôi cấy mô đã có những bước đột phá mới: nhân giống thành công giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) quý hiếm từ một số tế bào gốc của sâm Ngọc Linh bằng công nghệ sinh khối tế bào, nhóm nghiên cứu học viện Quân y đã thành công trong việc nuôi cấy thành số lượng lớn, toàn bộ quy trình chỉ mất 10 đến 20 ngày, trong khi bình thường phải mất khoảng 6 năm sâm mới cho thu hoạch. Đã khôi phục nhiều loài lan rừng quý hiếm khỏi nguy cơ tuyệt chủng, đặc biệt là loài lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) – loài lan duy nhất có hương thơm trên thế giới. 1.1.3. Ứng dụng của nhân giống in vitro  Nhân nhanh giống, tạo cây con đồng đều về hình thái, đồng nhất về di truyền.  Tạo cây trồng sạch bệnh.  Sản xuất cây đơn bội.  Lai xa.  Bảo quản nguồn gene. 5 1.1.4. Ƣu và nhƣợc điểm của quá trình nhân giống Ưu điểm:  Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành được số lượng lớn cây giống từ một mô, cơ quan của cây với một kích thước nhỏ khoảng 0,1 – 10 mm. Trong khi đó phương pháp nhân giống truyền thống thì để tạo thành cây giống, ít nhất phải sử dụng một phần cơ quan dinh dưỡng của cây với kích thước từ 5 – 20 cm.  Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo được sẽ không bị nhiễm bệnh từ môi trường bên ngoài.  Sử dụng vật liệu sạch virus và có khả năng nhân nhanh số lượng lớn cây giống sạch virus.  Hoàn toàn chủ động điều chỉnh các tác nhân, điều chỉnh khả năng tái sinh của cây như thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, theo ý muốn.  Hệ số nhân giống cao nên có thể sản xuất số lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn. Hệ số nhân giống ở các loại cây nằm trong khoảng 36 – 1012/năm, như vậy không có một kỹ thuật nhân giống vô tính nào khác lại có hệ số nhân giống cao hơn.  Có thể tiến hành quanh năm mà không chịu sự chi phối của điều kiện ngoại cảnh, của thời vụ.  Cây giống in vitro nếu chưa có nhu cầu sử dụng thì có thể bảo quản được trong thời gian dài ở điều kiện in vitro. Nhược điểm:  Mặc dù có hệ số nhân giống cao nhưng cây giống tạo ra kích thước nhỏ và đôi khi xuất hiện những dạng cây không mong muốn.  Cây giống in vitro được cung cấp nguồn carbohydrate nhân tạo nên khả năng tự tổng hợp các hợp chất hữu cơ của cây kém. Đồng thời cây giống in vitro được nuôi dưỡng trong bình thuỷ tinh hoặc bình nhựa nên độ ẩm không khí thường bão 6 hoà. Do đó khi trồng ra điều kiện tự nhiên cây thường bị mất cân bằng nước, gây hiện tượng héo và chết. Vì vậy trước khi chuyển cây từ điều kiện in vitro ra điều kiện ex vivo cần phải trải qua giai đoạn huấn luyện để cây quen dần với điều kiện bên ngoài có độ ẩm không khí thấp và ánh sáng mạnh, nhiệt độ cao thường không ổn định, nghèo dinh dưỡng.  Cần trang thiết bị hiện đại, kỹ thuật viên có tay nghề cao.  Những vấn đề tồn tại trong vi nhân giống: o Tính bất định về mặt di truyền. o Sự nhiễm mẫu. o Việc sản sinh các hợp chất độc từ mô nuôi cấy. o Hiện tượng thuỷ tinh thể. 1.1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nhân giống in vitro  Mẫu nuôi cấy Murashige (1974) ghi nhận sự quan trọng của chọn lựa mẫu cấy thích hợp và chỉ cho thấy hầu hết những cơ quan có thể dùng để nuôi cấy mô. Kiểu gen ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy. Với loài Thuốc lá được sử dụng như cây kiểu mẫu, Cheng và Smith (1973) ghi nhận sự khác nhau giữa các genome qua nuôi cấy sinh trưởng mô lõi. Hơn nữa, Jaramillo và Summers (1990) ghi nhận kiểu di truyền ảnh hưởng đến số lượng và đường kính mô sẹo qua nuôi cấy hạt phấn Cà chua Lycopersicon esculentum Mill.  Chọn cơ quan Murashige (1974) cho rằng hầu hết các loại cơ quan và mô đều có khả năng sử dụng nuôi cấy in vitro. Ông cho rằng mẫu nuôi cấy khác nhau ở các loài khác nhau, như ở Petunia dùng chồi đỉnh để nuôi cấy, theo Doerschung và Miller (1976) cho rằng chồi mầm thích hợp làm mẫu nuôi cấy ở các cây nảy mầm từ hạt.  Tuổi và sinh lý Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của mẫu nuôi cấy cho thấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hoá tế bào và tuổi sinh lý. Có nhiều 7 nghiên cứu khác nhau về ảnh hưởng của tuổi sinh lý mẫu nuôi cấy, theo Pierik (1970) ghi nhận rễ phát sinh trên lá non và không phát sinh trên lá già.  Mẫu in vitro Trong những năm gần đây, nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu in vitro có khả năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên đồng ruộng hay trong vườn ươm như ở cây Azalea (Economou và Read, 1986). Tuy nhiên, Lu et al., (1991) ghi nhận nuôi cấy túi phấn đạt tỷ lệ thành công cao khi nuôi cấy túi phấn trên cây đồng ruộng.  Sức sống của mẫu Điều cần thấy rằng mẫu cây mẹ có ảnh hưởng rất quan trọng đến nuôi cấy in vitro. Morel (1952, 1955) nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để loại virus sản xuất những cây sạch bệnh và điều này nói lên rằng cần phải cẩn thận chọn mẫu nuôi cấy nhất là đối với những cây bệnh, nếu nuôi cấy cây bị bệnh thì sẽ có một số lượng lớn những cây bệnh được nhân lên.  Điều kiện nuôi cấy o Điều kiện vô trùng Theo Nguyễn Quang Thạch nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo tốt điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy hoặc môi trường bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết. Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của của nuôi cấy mô in vitro. Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học, tia cực tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn. Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định. Tuy vậy, nếu tìm được nồng độ và thời gian xử lý thích hợp sẽ cho tỷ lệ sống cao, thông thường hay sử dụng một số hóa chất như HgCl2 0.1%, NaHCl 10%, cồn o 76 , để khử trùng. Phương tiện khử trùng: nồi hấp vô trùng, tủ sấy, buồng và bàn cấy vô trùng, phòng nuôi cấy. 8 o Nhiệt độ Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy mô là 20 – 27oC, nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sinh trưởng và phát triển cây in vitro qua những tiến trình sinh lý như hô hấp hay hình thành tế bào hay cơ quan. o Cường độ ánh sáng Cường độ ánh sáng là một nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đến khả năng nuôi cấy in vitro cây có lá xanh. Ảnh hưởng của ánh sáng có liên hệ với các loài, có loài chịu ánh sáng cao, ánh sáng trung bình và ánh sáng thấp hay tối. Việc nuôi cấy in vitro tốt nhất trong điều kiện ánh sáng 1000 lux (Dương Công Kiên, 2002). o Quang kỳ và chất lượng ánh sáng Thời gian chiếu sáng: ảnh hưởng sâu sắc đến những đáp ứng sinh lý ở cây trồng. Chất lượng ánh sáng: ảnh hưởng trực tiếp đến cây in vitro, vì ánh sáng cao hơn ánh sáng đỏ hay ánh sáng đỏ có ảnh hưởng đến những biến đổi sinh lý trên cây như ra hoa, chế độ dinh dưỡng và những hiện tượng khác như tăng sinh chồi in vitro. o Các chất khí: Thành phần chất khí trong bình nuôi cấy có ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây in vitro. O2, CO2 và ethylene là những chất được khảo sát nhiều. CO2 có thể bị giới hạn trong bình nuôi cấy và sử dụng nắp bình có lỗ thông khí, sử dụng bình có bổ sung CO2 và làm giàu CO2 trong phòng dưỡng cây có thể cho vi nhân giống hạ giá thành. O2 có giới hạn trong nuôi cấy mô. Ethylene xem như là chất làm giảm sinh trưởng trong nuôi cấy mô. Auxin hưởng đến sự phóng thích ethylene. Nâng cao hàm lượng ethylene làm giảm sinh trưởng mô sẹo. 1.2. Ý nghĩa của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật ngày nay có ý nghĩa quan trọng trong công nghệ sinh học. Khi tiến hành các kỹ thuật chuyển gen để tạo các giống cây trồng mới, 9 chúng ta đều cần đến kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật vì phương pháp này có những ưu điểm đáng kể:  Nhân giống với hệ số nhân cao trong thời gian ngắn.  Tạo ra các dòng cây con hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền.  Có thể thực hiện bất kỳ địa điểm nào.  Không phụ thuộc vào thời vụ, thời tiết và không đòi hỏi phải có một diện tích lớn mà vẫn có hiệu suất cao.  Có thể phục tráng và nhân giống một số cây trồng quý bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo cây sạch bệnh.  Dễ dàng học hỏi và trao đổi công nghệ với các nước tiên tiến trên thế giới.  Bảo quản giống dễ dàng bằng cách tạo ra thể phôi hoặc bảo quản lạnh. 1.3. Sự phát sinh hình thái Định nghĩa Phát sinh hình thái ở thực vật là thuật ngữ dùng để chỉ những thay đổi của cơ quan, mô hay ở mức tế bào thực vật (Bùi Trang Việt, 2000), bao gồm sự phát sinh chồi bất định, phát sinh rễ bất định, tạo phôi soma, Phát sinh hình thái là một trong những vấn đề căn bản và phức tạp nhất của sinh học. Nhiều nhà sinh học thực vật cho rằng không thể chỉ mô tả hình thái và cấu trúc thực vật mà cần tìm hiểu nguồn gốc phát sinh và các yếu tố liên quan trọng các biến đổi hình thái và cấu trúc đó. Do đó, không có một kỹ thuật hay phương pháp riêng rẽ nào có thể chứng minh được tất cả mọi khía cạnh của nó. Những kỹ thuật từ nhiều lĩnh vực khác nhau như mô học, giải phẫu học, sinh lý học, tế bào học và di truyền học đều có thể giúp ta tìm hiểu hiện tượng phát sinh hình thái. Trong số các phương pháp thực nghiệm, hai phương pháp thường được dùng nhất là:  Cắt bỏ một vùng lân cận của mô phân sinh và theo dõi các biến đổi phát triển sau đó. 10  Nuôi cấy in vitro trong điều kiện vô trùng và có kiểm soát các phần tách rời của một cơ thể thực vật. Trong phương pháp này, nên áp dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh vì mẫu cấy có kích thước nhỏ, rất khó tiến hành nghiên cứu sinh lý học. Trong phát sinh cơ quan, chồi thường được cảm ứng và tăng trưởng trước, rễ được tạo ra sau. Cũng có thí nghiệm tạo rễ trước, sau đó mới hình thành chồi như trên cây Malus pumila, sự tạo rễ và chồi được cảm ứng bởi Agrobacterium rhizogenes (James et al., 1988). Với những cây thân gỗ cứng, chồi thường được cảm ứng trực tiếp từ bộ lá. 1.4. Các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật và các yếu tố ảnh hƣởng ...y có chất các dinh dưỡng và ông đã tách ra được vô số các cây lan con. Phương pháp này giúp sản xuất ra những cây lan con giữ được đặc tính di truyền của cây lan mẹ, trong lúc đó việc gieo hạt lan lại tạo ra những cây lan con khác với cây mẹ. Áp dụng phương pháp của Morel, Michel Vacherot và Maurice Lecouffe đã tiến hành sản xuất và cho ra đời hàng loạt các cây lan con theo phương pháp này. Ngày nay, ngoài một số các nhà gây giống lan chuyên nghiệp ở khắp Âu, Á, các trại lan ở Mỹ, Châu Phi, Hawaii, Singapore, Thái Lan đã đạt đến mức sản xuất lan kỹ nghệ. Ở Mỹ, nhất là lễ Valentine, Secretary Day và dạ vũ tốt nghiệp Prom, hàng năm tiêu thụ đến 20 triệu lan cài áo (brioche) hoặc bouquet (Widiastoety, 1995). Phong lan dần được xuất khẩu và lưu thông như một ngành thương mại và được phát triển nhanh ra nhiều nước. Ngày nay, các nước phát triển như Pháp, Mỹ, Hà Lan, Thái Lan, Nhật Bản, Đài Loan, Úc, Trung Quốc, đã có nhiều nghiên cứu, sử dụng nhiều thành tựu khác nhau của ưu thế lai, nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy 26 mô tế bào, kỹ thuật di truyền, và kết quả là đã tạo ra hàng nghìn giống phong lan, địa lan có màu sắc sặc sỡ, hương thơm quyến rũ đem lại lợi ích kinh tế rất lớn cho những nước này, trung bình 100 – 500 triệu USD/năm. Nhiều nước xuất khẩu hoa lan lớn như Thái Lan, Đài Loan, Hà Lan, Úc, Nhật Bản và Trung Quốc đạt doanh thu vài trăm triệu USD/năm (Phạm Hoàng Hộ, 1992). Thái Lan: nhờ khả năng thực hiện công nghệ mới trong nuôi cấy mô và lai tạo, với giá lao động thấp, khí hậu tốt, giao thông tốt cho phép Thái Lan sản xuất quanh năm và xuất đi 50 nước trên thế giới. Hiện nay, Thái Lan là nước đứng đầu thế giới về xuất khẩu hoa lan, đạt 110 triệu USD trong năm 2003 (Nguyễn Công Nghiệp, 2000). Thái Lan có 18 phòng nuôi cấy mô hoa lan thương mại hoạt động ở Băng Cốc và các vùng phụ cận. Hàng năm nước này sản xuất 31,6 triệu cây con trong đó Dendrobium chiếm 80%, Mokara 5%, còn lại là các loài lan khác. Đài Loan: chú trọng đầu tư nhiều vào nuôi trồng Phalaenopsis và chọn tạo nhiều giống mới, đem lại doanh thu hàng năm trên 9,3 tỷ Đài tệ. Hiện nay đã tạo ra được một số giống lan quý có khả năng cắt hoa và trồng trong chậu (Nguyễn Xuân Linh, 1998). Trung Quốc: là nước có truyền thống tuyển chọn và tạo các giống lan kiếm. Họ sử dụng các phương pháp lai hữu tính thu quả, sau đó gieo và tuyển chọn các loài hoa đáp ứng được màu sắc, kiểu dáng rồi sử dụng kỹ thuật nhân giống in vitro và in vivo để tạo ra một số lượng lớn các cây, sau đó cho ra hoa đồng loạt tạo ra sản phẩm hàng hóa có giá trị kinh tế cao, giá từ 5 – 10 USD/cành (Phạm Hoàng Hộ, 1992). Ở Singapore, nghề trồng lan xuất khẩu trên quy mô lớn bắt đầu từ năm 1987. Nhà nước đã thấy rõ tiềm năng xuất khẩu loại lan này trên thị trường thế giới nên đã mở rộng trang trại trồng hoa lan. Hiện nay Singapore chiếm 12% thị trường kinh doanh phong lan trên thế giới. Nhật Bản: đã đầu tư 6,6 triệu USD cho Thái Lan để mở rộng cơ sở sản xuất với công suất 10 triệu cây hoa mỗi năm và hiện nay Nhật cũng là khách hàng lớn 27 nhất của Singapore với khả năng tiêu thụ 60% số cây lan nước này (Nguyễn Tiến Bân, 1992). 1.6.2.2. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và phát triển phong lan ở Việt Nam Trước những năm 1986, nghề trồng hoa của Việt Nam chỉ tập trung ở một vài làng nghề ở Hà Nội, Hải Phòng, TP. HCM, Đà Lạt và một vài tỉnh miền Tây Nam Bộ. Diện tích trồng hoa của Việt Nam theo số liệu thống kê năm 1993 chỉ chiếm 0,02% tổng diện tích đất nông nghiệp (khoảng 1.585 ha). Trong đó diện tích trồng hoa lan chiếm 10%. Trong những năm gần đây, do sự phát triển chung của nền kinh tế, đời sống nhân dân ngày càng được cải thiện từ đó nhu cầu chơi hoa ngày càng phát triển rộng rãi. Thị trường WTO mở cửa kết hợp với chính sách sản xuất theo hướng hàng hoá xuất khẩu của nhà nước đã tác động mạnh mẽ, tích cực đến ngành sản xuất hoa nói chung và hoa lan nói riêng. Sản xuất hoa lan ở Việt Nam tập trung theo 2 hướng chính: - Sản xuất theo quy mô công nghiệp các loài lan mới lai tạo hoặc dược nhập hội (lan công nghiệp) - Khai thác và nuôi trồng các loài hoa lan bản địa (lan rừng). Tuy nhiên các chính sách đầu tư của nhà nước hầu hết chỉ tập trung vào mảng lan cắt cành và sản xuất cây con giống của một số loài lan công nghiệp như Hồ Điệp (Phalaenopsis), Cát lan (Cattleya), Vũ Nữ (Oncidium), Hoàng Thảo (Dendrobium). Các dự án ñầu tư phát triển hoa cây cảnh của các tỉnh đều hướng tới sản xuất lan cắt cành, đặc biệt ở các tỉnh phía Nam. Tại hội thảo về hiện trạng và hướng phát triển hoa lan trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh năm 2005, ông Nguyễn Thiện Nhân – Phó Chủ tịch thường trực Thành phố cho biết, với thế mạnh là hoa nhiệt đới, lan cắt cành sẽ trở thành cây chủ lực của thanh phố Hồ Chí Minh trong những năm tới. Ở miền Bắc, một số cơ quan nghiên cứu như: Viện Di truyền nông nghiệp, Viện Sinh học nông nghiệp, trường đại học Nông nghiệp Hà Nội,... trong những năm vừa qua cũng đã tập trung nghiên cứu các phương pháp nhân 28 giống vô tính in vitro và cho ra đời mỗi năm hàng vạn cây con giống hoa lan có giá trị. Viện Nghiên cứu Rau quả đã triển khai dự án “Hoàn thiện quy trình nhân giống và sản xuất một số giống lan Hồ Điệp ở quy mô công nghiệp” và đã có sản phẩm đưa ra thị trường phục vụ người chơi. Hải Phòng xây dựng khu Nông nghiệp công nghệ cao (Mỹ Đức, An Lão) với mục tiêu cụ thể: sản xuất 300.000 cây giống hoa lan bằng công nghệ của Viện Sinh học nông nghiệp trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội và của Hiệp hội hoa Thái Lan. Tất cả những chính sách đầu tư trên đã đem lại hiệu quả to lớn thúc đẩy ngành sản xuất lan công nghiệp phát triển và thu được nhiều thành tựu, đáp ứng nhu cầu trong nước và một phần được xuất ra thị trường quốc tế đem lại nguồn thu ngoại tệ cho quốc gia và thu nhập lớn cho người trồng, người kinh doanh và người đầu tư vào lĩnh vực này. Khác với lan công nghiệp, lan bản địa (lan rừng) lại chỉ phát triển nhỏ lẻ và được nuôi trồng ở quy mô hộ gia đình, tập trung chủ yếu ở Hà Nội và một số vùng phụ cận. Xã Đông La – Hoài Đức – Hà Nội những năm gần đây trở nên nổi tiếng với nghề trồng lan, đây được coi là trung tâm nuôi trồng phong lan rừng lớn nhất miền Bắc. Đến nay cả xã đã có 52 hộ trồng lan, trong đó có hơn 30 hộ có diện tích vườn lan từ 500 đến 1000 m2,tập trung nhiều nhất ở thôn Đông Lao và Đồng Nhân với những vườn lan như Huyền Chân, Trường Uyên, Thực Hà, Tiền Hảo,... Theo lãnh đạo xã Đông La, nghề trồng lan đã đóng góp đáng kể cho phát triển kinh tế của địa phương, tạo việc làm, tăng thu nhập cho người lao động. Trung bình mỗi năm, trừ chi phí, một hộ trồng lan cũng có lãi hàng trăm triệu đồng, gấp nhiều lần nghề nông nghiệp khác. Bên cạnh Đông La, một số địa phương như Gia Lâm, Đông Anh (Hà Nội), Văn Giang (Hưng Yên), Mộc Châu (Sơn La), Phổ Yên (Thái Nguyên) cũng đang có nhiều hộ gia đình tập trung đầu tư vào sản xuất và nuôi trồng phong lan bản địa, tuy nhiên quy mô diện tích các vườn lan này khá nhỏ, chỉ từ 300 – 500 m2. Số 29 lượng loài cũng rất ít, phổ biến là các loài Đai Châu, Đuôi Cáo, Hoàng Thảo, Quế Lan Hương và một số loài lan Hài. Nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm cho nên chủng loại lan ở Việt Nam rất phong phú. Theo các chuyên gia về hoa của trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, với khoảng trên 800 loài lan hiện có, khí hậu thích hợp và nhiều nguyên liệu làm giá thể tốt cho cây sinh trưởng, Việt Nam có thể trở thành một nước sản xuất hoa phong lan lớn trong khu vực (Nguyễn Xuân Linh, 2002).Tuy nhiên, sản xuất hoa lan ở Việt Nam mới chỉ phát triển mạnh mẽ ở các tỉnh phía Nam, đặc biệt là Đà Lạt và TP.HCM. Hiện nay mới chỉ có một số công ty lớn, trong đó có những công ty nước ngoài trồng phong lan tại Đà Lạt, TP.HCM, Đồng Nai với diện tích khoảng 50 – 60 ha/một doanh nghiệp. Một vài địa phương khác phong lan chỉ mới trồng ở quy mô gia đình, trên diện tích vài m2, cá biệt mới có vài hộ trồng trên 1 – 2 ha. Theo tính toán, mỗi năm Việt Nam phải chi hàng tỷ đồng để nhập phong lan từ các nước láng giềng cho nhu cầu nội địa. Chỉ tính riêng tại thành phố Hồ Chí Minh, năm 2003 doanh số kinh doanh hoa lan và cây cảnh mới đạt 200 – 300 tỷ đồng, nhưng chỉ trong quý I năm 2006, doanh số này đã đạt 400 tỷ đồng; các cơ sở kinh doanh hoa lan, cây cảnh tăng nhanh từ 264 cơ sở năm 2003 lên trên 1000 cơ sở. Riêng phong lan mỗi năm ở thành phố này cũng đã tiêu thụ trên 1 triệu cây (Nguyễn Xuân Linh, 2000). Lĩnh vực kinh doanh lan ở Việt Nam còn rất non trẻ, mới thực sự bắt đầu được hơn 10 năm trở lại đây. Theo ông Đồng Văn Khiêm – Giám đốc công ty Phong lan xuất khẩu TP.HCM thì khó khăn lớn nhất là Nhà nước chưa có chính sách phát triển ngành lan, chưa có một văn bản nào để khuyến khích, chính sách thuế không rõ ràng, Bên cạnh đó, việc xuất khẩu lan hiện còn qua ủy thác, không tạo được sự chủ động cho nhà sản xuất. Để có thể đáp ứng nhu cầu nội địa, tiến vào thị trường phong lan thế giới, ngoài việc khắc phục những khó khăn trên, ngành công nghiệp hoa lan của Việt 30 Nam còn phải quan tâm rất nhiều đến vấn đề về tạo giống, công nghệ sản xuất, canh tác, công nghệ sau thu hoạch, đóng gói, kiểm dịch và đầu tư mở rộng cơ sở hạ tầng cho sản xuất loài hoa này (Ngô Quang Vũ, 2002). 31 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài 2.1.1. Địa điểm thí nghiệm Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại Học Công Nghệ TP. HCM , 475A Điện Biên Phủ , P.25, Q. Bình Thạnh, TP. HCM. 2.1.2. Thời gian tiến hành thí nghiệm Đề tài nghiên cứu sẽ tiến hành từ tháng 3/2016 đến tháng 8/2016 tại phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học thực vật – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại Học Công Nghệ TP. HCM. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Nguồn mẫu được sử dụng trong đề tài được tạo từ các mô sẹo in vitro, của giống phong lan Cattleya Hybire White tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại Học Công Nghệ TP. HCM. 2.2.2. Môi trƣờng nuôi cấy Môi trường cơ bản là MS (Murashige và Skoog, 1962). Các chất bổ sung bao gồm:  Chất điều hòa sinh trưởng thực vật: 2,4-D, NAA (naphatalenacetic acid), BA (6-Benzyl-aminopurine).  Chitosan  Agar  Nguồn carbon: sucrose, glucose, fructose, lactose, manitol, sorbitol.  Nước dừa  Than hoạt tính 32 2.2.3. Điều kiện thí nghiệm Để đảm bảo điều kiện vô trùng, các thí nghiệm được thực hiện trong phòng nuôi riêng với các điều kiện:  Nhiệt độ: 25 ± 2oC  Cường độ sáng: 2500 – 3000 lux  Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày  Độ ẩm trung bình : 85 – 90% 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu Các thao tác trong phòng cấy  Rửa tay kỹ bằng xà phòng, mặc áo blouse, đeo găng tay, khẩu trang trước khi vào phòng cấy.  Dùng khăn lau tủ cấy bằng cồn 70o.  Bật đèn UVđể khử trùng tủ cấy trong 30 phút, xịt cồn bộ dụng cụ cần cấy và cho vào tủ trước.  Sau khi bật UV xong bật quạt khoảng 15 phút và lau tủ cấy lại bằng cồn 70o.  Môi trường và chai mẫu phải lau cồn trước khi đưa vào tủ cấy.  Khi cấy cần tránh quơ tay ngang qua các dụng cụ và mẫu cấy. Hạn chế đi lại trong suốt quá trình cấy.  Hơ miệng chai cấy thật kỹ trước và sau khi cấy.  Dụng cụ sau mỗi lần cấy phải được đốt lại bằng cồn 90o.  Hạn chế nói chuyện trong quá trình làm thí nghiệm.  Sau khi cấy ghi lại ngày tháng, tên giống,... để thuận tiện cho việc theo dõi.  Sau khi chấm dứt cấy, cần phải tắt đèn cồn, tắt tủ cấy, làm vệ sinh sạch sẽ.  Ngoài ra cần chú ý trong quá trình làm việc, cồn 96o rất dễ cháy do đó phải tuyệt đối thật cẩn thận. 33 2.4. Bố trí thí nghiệm 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White Mục đích: xác định nồng độ BA thích hợp cho sự tạo chồi của lan Cattleya Hybrid White. Tiến hành: từ mẫu cấy chồi Lan Cattleya Hybrid White được cấy trực tiếp vào môi trường MS đặc có bổ sung 0,5 mg/l NAA, 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính, 20% nước dừa và nồng độ BA thay đổi tương ứng như ở bảng 2.1. Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hƣởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên tạo chồi Cattleya Hybrid White Nghiệm thức BA (mg/l) NAA (mg/l) A0 0,0 A1 0,5 A2 1,0 0,5 A3 1,5 A4 2,0 A5 2,5 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của NAA kết hợp với nồng độ BA cố định lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White Sau thí nghiệm 1, chúng tôi xác định được nồng độ BA tối ưu cho sự tăng trưởng chồi Cattleya Hybrid White, chúng tôi tiến hành thí nghiệm này nhằm tìm ra nồng độ NAA kết hợp với nồng độ BA cố định cho sự tăng trưởng chồi Cattleya Hybrid White. 34 Mục đích: xác định nồng độ tối ưu của BA và NAA cho sự tạo chồi của lan Cattleya Hybrid White. Tiến hành: từ mẫu cấy chồi Lan Cattleya Hybrid White được cấy vào môi trường MS đặc có bổ sung 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính, 20% nước dừa, 1 mg/l BA cố định và nồng độ NAA thay đổi tương ứng với các nghiệm thức khác nhau như ở bảng 2.2. Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hƣởng của NAA kết hợp với nồng độ BA cố định lên tạo chồi Cattleya Hybrid White Nghiệm thức NAA (mg/l) BA (mg/l) B0 0,0 B1 0,5 B2 1,0 1 B3 1,5 B4 2,0 B5 2,5 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của chitosan kết hợp với nồng độ BA, NAA cố định lên tạo chồi Cattleya Hybrid White Sau thí nghiệm 1 và 2, chúng tôi xác định được nồng độ BA, NAA tối ưu cho sự tăng trưởng chồi Cattleya Hybrid White, chúng tôi tiến hành thí nghiệm này nhằm tìm ra nồng độ chitosan kết hợp với nồng độ BA, NAA cố định cho sự tăng trưởng chồi Cattleya Hybrid White. Mục đích: xác định nồng độ chitosan thích hợp cho sự hình thành chồi lan Cattleya Hyrid White. 35 Tiến hành: từ mẫu cấy chồi Lan Cattleya Hybrid White được cấy trực tiếp vào môi trường MS đặc có bổ sung agar 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính, 20% nước dừa, 1 mg/l BA cố định, 1,5 mg/l NAA cố định và nồng độ chitosan thay đổi tương ứng với các nghiệm thức khác nhau như ở bảng 2.3. Bảng 2.3: Khảo sát ảnh hƣởng của chitosan kết hợp với nồng độ BA, NAA cố định lên tạo chồi Cattleya Hybrid White Nghiệm thức Chitosan (g/l) BA (mg/l) NAA (mg/l) C0 0 C1 5 C2 10 1 1,5 C3 15 C4 20 C5 25 2.5. Chỉ tiêu theo dõi - Khối lượng tươi (g) - Khối lượng khô (g) - Tỷ lệ sống sót (%) - Số lá (lá/cây) - Đường kính lá (cm) - Chiều dài lá (cm) - Số chồi (chồi/mẫu) - Chiều cao chồi (cm) - Số rễ (rễ/cây) - Chiều dài rễ (cm) 36 2.6. Thống kê và xử lý số liệu Xử lý số liệu thu được bằng phần mềm Microsoft Excel 2010® và phần mềm SAS 9.1. Tất cả các số liệu sau khi thu thập ứng với từng chỉ tiêu theo dõi, được thống kê và biểu diễn dưới dạng các giá trị trung bình cùng ký tự a,b, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a,b,) chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. 37 38 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy Chồi lan Cattleya được cấy trực tiếp vào môi trường MS sự phản ứng của chúng là khác nhau khi được nuôi cấy trên môi trường thạch MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA, 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính, 20% nước dừa và nồng độ BA thay đổi tương ứng (0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5) mg/l. Trong thí nghiệm khảo sát ảnh của nồng độ BA lên khả năng hình thành chồi của lan Cattleya sau 8 tuần nuôi cấy. Theo quan sát chúng tôi nhận được: Sau 4 tuần nuôi cấy ở một số mẫu cấy bắt đầu phát triển chồi nhưng mẫu cấy chưa có sự phản ứng rõ rệt so với đối chứng. Đến tuần thứ 6 và thứ 7, các mẫu cấy ở nghiệm thức có sự khác biệt rõ rệt ở các nồng độ, mẫu cấy xuất hiện nhiều chồi hơn và kích thước tăng dần theo thời gian nuôi cấy với các chỉ tiêu theo dõi thể hiện nỗi bật là khối lượng chồi, số lá, chiều dài lá, số chồi, số rễ, chiều dài rễ. Sự khác biệt về hình thái giữa các nghiệm thức bắt đầu tuần thứ 8 trở đi, các mẫu cấy tăng trưởng tốt, nhiều chồi, ở nghiệm thức A0; A1 và A2. Sức sống của mẫu cấy bị chậm lại ở nghiệm thức A3; A4 và A5, mẫu giảm dần sức sống so với các tuần đầu ở nghiệm thức thứ 5. Đến tuần thứ 8, các mẫu cấy ở các nghiệm thức có sự khác biệt rõ rệt về hình thái. Chúng tôi tiến hành thu thập số liệu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1; đồ thị 3.1; hình 3.1; hình 3.2. 38 Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy N Nồng Khối Khối Số chồi Số lá Số rễ Đƣờng Chiều Chiều Chiều Đặc điểm T độ lƣợng lƣợng (chồi/mẫu) (lá/cây) (rễ/mẫu) kính lá dài lá dài rễ cao chồi (mg/l) tƣơi (g) khô (g) (cm) (cm) (cm) (cm) Cây phát triển bình thường, rễ dài, lá A0 0 2,170c 0,307d 6,333c 15,66c 24,667b 0,7667b 1,1bc 2,667b 0,9d to nhưng ít chồi và lá. Cây phát triển tốt, lá to và dài. A1 0,5 3,174b 0,583bc 10,333b 35,67b 23,667b 0,8b 1,4b 2,5b 1,233cd Cây phát triển xanh tốt, chồi A2 1 7,415a 1,762a 13,333a 44,667a 51a 1,2667a 2,133a 2,033b 2,333a nhiều, nhiều lá, nhiều rễ, lá to nhƣng dày, chồi cao. Cây phát triển không đều, ít chồi và A3 1,5 1,528c 0,347cd 5,667cd 12,333c 13,667c 0,633bc 1,6ab 2,833ab 1,9abc lá, rễ nhiều mà ngắn. Cây phát triển không đều, nhiều A4 2 1,807c 0,428bcd 1,333e 15c 17,332bc 0,7b 0,633c 2,6ab 1,466bcd chồi, lá nhỏ, rễ ít và ngắn Cây phát triển chậm, ít chồi, lá nhỏ bc b de c bc c bc a ab A5 2,5 2,364 0,604 3,333 3,333 17 0,3 17 3,367 2,066 và ít, rễ dài, cây thấp. Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê.các mẫu tự khác nhau (a, b,) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05 39 55,000 50,000 45,000 40,000 Khối lượng tươi (g) 35,000 Khối lượng khô (g) Số chồi (chồi/mẫu) 30,000 Số lá (lá/cây) 25,000 Số rễ (rễ/mẫu) Đường kính lá (cm) 20,000 Chiều dài lá (cm) Chiều dài rễ (cm) 15,000 10,000 5,000 0,000 A0 A1 A2 A3 A4 A5 Biểu đồ 3.1. Ảnh hƣởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tƣơng ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 mg/l) 40 Hình 3.1. Ảnh hƣởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tƣơng ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 mg/l) 41 Hình 3.2. Ảnh hƣởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tƣơng ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 mg/l) 42 Nhận xét và thảo luận: Từ kết quả thu nhận được ở bảng 3.1, biểu đồ 3.1, hình 3.1, hình 3.2 sau 8 tuần nuôi cấy in vitro các chồi cây đã phát triển. Các nghiệm thức khác nhau tỷ lệ phát sinh chồi khác nhau. Ở nghiệm thức A2 với nồng độ 1 mg/l BA, cây phát triển xanh, cao hơn so với nghiệm thức A0 với (2,33 > 0,90 cm), chồi được phát triển nhiều A2 (13,333 chồi/mẫu) gấp 2 lần A0 ( 6,333 chồi/mẫu), trọng lượng tươi đạt mức cao nhất trong 6 nghiệm thức, trọng lượng tươi của nghiệm thức A2 (7,41 g) gấp 3,41 lần A0 (2,17). Trọng lượng khô ở nghiệm thức này là A2 (1,7628 g) cao hơn 5,7 lần so với A0 (0,3072 g). Với nồng độ thích hợp thì tế bào thực vật được cung cấp đầy đủ thích hợp để phát triển cây hoàn chỉnh. Về mặt hình thái cây phát triển xanh tốt, nhiều lá (44,00 lá/cây), lá to và nhiều, rễ nhiều (51,00 rễ/mẫu), rễ dài (2,033 cm). Tỷ lệ cây phát triển giảm dần ở các nghiệm thức A0, A1, A3, A4, A5. Ở nghiêm thức A0 cây phát triển bình thường, phát triển ổn định ở các chỉ tiêu. Ở nghiệm thức A1 cây phát triển tốt, cao hơn so với nghiệm thức A0 với (1,233 > 0,90 cm), trọng lượng tươi ở nghiệm thức này là (3,174 g) cao hơn 1,46 lần so với A0 (2,17 g). Trọng lượng khô ở nghiệm thức A1 là (0,583 g) lớn hơn 1,89 lần so với A0 (0,307 g). Nhìn chung cây phát triển không đều. Ở nghiệm thức A3 cây phát triển không tốt, khối lượng nhỏ (1,582 g) và số lá ít (12,33 lá/cây). Cây phát triển không đồng đều. Ở nghiệm thức A4 cây phát triển tốt, xanh, nhưng số chồi ít (1,33 chồi/mẫu) và ngắn (1,466 cm). Ở nghiệm thức A5 với nồng độ 2,5 g/l BA ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng của chồi cây vì nồng độ BA khá cao có khả năng làm giảm hay thay đổi cân bằng các chất điều hòa tăng trưởng nội sinh trong cây, làm thay đổi áp suất thẩm thấu của môi trường, gây stress cho cây. Nhìn chung cây phát triển chậm ít chồi (1,33 chồi/mẫu), ít lá (6,67 lá/cây), lá nhỏ, rễ ngắn (5,67 cm). 43 Theo Đàm Sao Mai và cộng sự (2009) khi giải thích về kết quả thí nghiệm của cây Thông đỏ cho rằng trong quá trình sinh tổng hợp protein, BA tác động lên tế bào thực vật không chỉ ở giai đoạn dịch mã mà còn ở giai đoạn sao mã. Sự có mặt của BA ở nồng độ nhất định đã làm tăng quá trình tổng hợp các sinh chất trong tế bào và mô thực vật, dẫn đến tế bào phân chia nhanh hơn do đó chiều cao chồi khi có bổ sung BA sẽ cao hơn so với đối chứng (không bổ sung BA) là điều tất yếu. Song vượt quá ngưỡng kích thích thì BA lại ức chế các quá trình trên, do đó mẫu cấy có chiều cao giảm dần. Điều này cũng giải thích cho kết quả thí nghiệm về cây Cattleya in vitro, so với thời điểm sau 8 tuần nuôi cấy ở nghiệm thức MS + 0,5 mg/l BA có số chồi cao tương đương so với môi trường đối chứng. Nguyên nhân là do ảnh hưởng của BA làm cho chiều cao chồi tăng lên nhiều so với môi trường không bổ sung BA. Bên cạnh đó, Bảng 3.1 cũng cho thấy nồng độ BA càng cao thì số chồi cũng càng giảm. Kết quả này cũng phù hợp với nhận định của Teixeira và cộng sự (2004) cho rằng trong quá trình nhân chồi cây (Prunus spp.) BA có ảnh hưởng quan trọng đến chiều cao chồi, sử dụng BA nồng độ cao (trên 2 mg/l) ức chế sự phát triển chiều cao của chồi. Sau 8 tuần nuôi cấy thì nghiệm thức BA 5 mg/l cho kết quả thấp nhất trong việc tạo chồi. Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), nếu nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi nhưng những chồi này không thể kéo dài. Ngoài ra, qua quá trình thí nghiệm cũng ghi nhận được cụm chồi có sức sống kém ở môi trường bổ sung BA với nồng độ cao nên khả năng tạo chồi thấp. Tóm lại, từ kết quả phân tích các chỉ tiêu cho thấy ở nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức MS bổ sung 1 mg/l BA đạt hiệu quả cao cho sự hình thành số chồi. Trong đó, nghiệm thức BA 1 mg/l cho kết quả tốt nhất. Kết quả trên phù hợp với kết quả thí nghiệm của Đàm Sao Mai và cộng sự (2009) cho rằng nồng độ BA phù hợp cho sự hình thành chồi Thông đỏ trong thí nghiệm này là 1 mg/l. Tương tự với kết quả trên, trong trường hợp cây Populus Tremila L. thì Angeles và cộng sự (2003) đã dùng BA 1 mg/l để tạo chồi là tối ưu (Đàm Sao Mai và cộng sự, 2009). Như vậy, tôi thấy rằng nồng độ BA (A2) tối ưu là 1 mg/l ở nghiệm thức A2 cho sự sinh trưởng và phát triển của lan Cattleya Hybird White. 44 3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy Chồi lan Cattleya được cấy trực tiếp vào môi trường MS sự phản ứng của chúng là khác nhau khi được nuôi cấy trên môi trường thạch MS có bổ sung 1 mg/l BA, 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính, 20% nước dừa và nồng độ NAA thay đổi tương ứng (0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5) mg/l. Trong thí nghiệm khảo sát ảnh của nồng độ NAA lên khả năng hình thành chồi của lan Cattleya sau 8 tuần nuôi cấy. Theo quan sát chúng tôi nhận được: Sau 4 tuần nuôi cấy ở một số mẫu cấy bắt đầu phát triển chồi nhưng mẫu cấy chưa có sự phản ứng rõ rệt so với đối chứng. Đến tuần thứ 6 và thứ 7, các mẫu cấy ở nghiệm thức có sự khác biệt rõ rệt ở các nồng độ, mẫu cấy xuất hiện nhiều chồi hơn và kích thước tăng dần theo thời gian nuôi cấy với các chỉ tiêu theo dõi thể hiện nỗi bật là khối lượng chồi, số lá, chiều dài lá, số chồi. Sự khác biệt về hình thái giữa các nghiệm thức bắt đầu tuần thứ 8 trở đi, các mẫu cấy tăng trưởng tốt, nhiều chồi, ở nghiệm thức B1; B2 và B3. Sức sống của mẫu cấy bị chậm lại ở nghiệm thức B4 và B5, mẫu giảm dần sức sống so với các tuần đầu ở nghiệm thức thứ 5. Đến tuần thứ 8, các mẫu cấy ở các nghiệm thức có sự khác biệt rõ rệt về hình thái. Chúng tôi tiến hành thu thập số liệu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2; đồ thị 3.2; hình 3.3; hình 3.4. 45 47 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy N Nồng Khối Khối Số chồi Số lá Số rễ Đƣờng Chiều Chiều Đặc điểm T độ lƣợng lƣợng (chồi/mẫu) (lá/cây) (rễ/mẫu) kính lá dài lá dài rễ (mg/l) tƣơi (g) khô (g) (cm) (cm) (cm) Cây phát triển bình thường, lá to B0 0 8,034b 0,423b 48,66b 20,33b 0,00c 0,7667b 0,24d 0,00c nhưng ít chồi và lá. B1 0,5 5,504d 0,331cd 36,33d 15,00c 0,00c 0,8b 0,56bc 0,00c Cây phát triển không tốt, lá ít. Cây phát triển không đều, ít chồi B2 1 6,875c 0,344c 43,33c 19,00b 0,00c 1,2667a 0,65bc 0,00c và lá. Cây phát triển xanh tốt, chồi B3 1,5 9,887a 0,550a 60,00a 27,66a 43,00a 1,33a 1,44a 2,33a nhiều, nhiều lá, nhiều rễ, lá to xanh. Cây phát triển không đều, nhiều B4 2 4,483e 0,137e 29,00e 14,00c 33,00b 0,7b 0,86b 1,20b chồi, lá nhỏ, rễ ít và ngắn Cây phát triển chậm, ít chồi, lá B5 2,5 4,265e 0,2689d 28,66e 12,00c 0,00c 0,3c 0,36cd 0,00c nhỏ và ít Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê.các mẫu tự khác nhau (a, b,) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05 46 60,000 55,000 50,000 45,000 Khối lượng tươi (g) 40,000 Khối lượng khô (g) 35,000 Số chồi (chồi/mẫu) Số lá (lá/cây) 30,000 Số rễ (rễ/mẫu) 25,000 Đường kính lá (cm) Chiều dài lá (cm) 20,000 Chiều dài rễ (cm) 15,000 10,000 5,000 0,000 B0 B1 B2 B3 B4 B5 Biểu đồ 3.2. Ảnh hƣởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tƣơng ứng với nồng độ NAA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 mg/l) 47 Hình 3.3. Ảnh hƣởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tƣơng ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 mg/l) 48 Hình 3.4. Ảnh hƣởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tƣơng ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 mg/l) 49 50 Nhận xét và thảo luận: Từ kết quả thu nhận được ở bảng 3.2, biểu đồ 3.2, hình 3.3, hình 3.4 sau 8 tuần nuôi cấy in vitro các chồi cây đã phát triển. Các nghiệm thức khác nhau tỷ lệ phát sinh chồi khác nhau. Nghiệm thức B0 cây phát triển xanh tốt bình thường, chồi và lá xanh. Nghiệm thức B1 cây phát triển thấp hơn so với nghiệm thức B0 trọng lượng tươi ở nghiệm thức này là 5,504 g nhỏ hơn 1,4 lần so với B0 (8,034 g). Trọng lượng khô ở nghiệm thức này là B1 là 0,331 g nhỏ hơn 1,27 lần so với B0 (0,4236 g). Nhìn chung cây phát triển chậm, ít chồi (36,33 chồi/mẫu), ít lá (15,00 lá/cây). Ở nghiệm thức B2 cây phát triển không đều, thấp hơn so với nghiệm thức B0 với trọng lượng tươi ở nghiệm thức này là 6,875 g nhỏ hơn 1,1 lần so với B0 (8,034 g). Trọng lượng khô ở nghiệm thức này là B2 là 0,344 g nhỏ hơn 1,2 lần so với B0 (0,423 g). Nhìn chung cây phát triển không đều, ít lá (19,00 lá/cây). Ở nghiệm thức B3 cây phát triển xanh tốt, chồi cây nhiều, cao hơn so với nghiệm thức B0 với trọng lượng tươi ở nghiệm thức này là 9,887g cao hơn 1,2 lần so với B0 (8,034 g). Với nồng độ thích hợp thì tế bào thực vật được cung cấp đầy đủ thích hợp để phát triển cây hoàn chỉnh. Về mặt hình thái cây phát triển xanh tốt, nhiều lá (27,66 lá/cây), lá to, rễ nhiều (43,00 rễ/mẫu), rễ dài (2,3 cm). Ở nghiệm thức B4, B5 cây phát triển không đều, thấp hơn so với nghiệm thức B0. Về mặt hình thái cây thấp, lá nhỏ, ít chồi, lá của cây có màu xanh nhạt. Ở bảng 3.2 cho thấy nghiệm thức có số rễ cao nhất là nghiệm thức MS bổ sung 1,5 mg/l NAA (43,00 rễ/mẫu) khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% với các nghiệm thức còn lại. Nghiệm thức có số rễ thấp nhất là nghiệm thức không bổ sung NAA, tuy nhiên nghiệm thức này khác biệt không có ý nghĩa với nghiệm thức 1 mg/l NAA. Kết quả nhận được sau 8 tuần khi cấy cũng cho thấy, môi trường có 1,5 mg/l NAA là nghiệm thức cho chiều dài rễ dài nhất (2,33 cm), khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại. Từ kết quả phân tích ở bảng 3.2 cho thấy môi trường MS có bổ sung NAA ở nồng độ 1,5 mg/l là thích hợp nhất cho sự tạo rễ của lan Cattleya Hybrid White in vitro. Kết quả này cũng tương ứng với kết quả thí nghiệm của Đàm Sao Mai và cộng 50 sự, (2009) trên cây Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) cho rằng khi bổ sung NAA ở nồng độ 1,5 mg/l vào môi trường nuôi cấy sẽ cho sự hình thành rễ tốt nhất, hay kết quả thí nghiệm của Nguyễn Văn Ây và Lê Văn Hòa (2010) trên cây Tre rồng cũng cho thấy bổ sung NAA ở nồng độ 2 – 4 mg/l là thích hợp nhất cho sự tạo rễ in vitro. Tóm lại, tôi thấy rằng nồng độ NAA (B3) tối ưu là 1,5 mg/l ở nghiệm thức B3 cho sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White in vitro. 3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy Chồi lan Cattleya được cấy trực tiếp vào môi trường MS sự phản ứng của chúng là khác nhau khi được nuôi cấy trên môi trường thạch MS có bổ sung 1 mg/l BA, 1,5 mg/l NAA, ...sday, August 14, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 4.49891852 0.89978370 43.73 <.0001 Error 12 0.24689071 0.02057423 Corrected Total 17 4.74580922 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.947977 21.33336 0.143437 0.672361 The SAS System 3 22:58 Thursday, August 14, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F khoiluongkho 5 4.49891852 0.89978370 43.73 <.0001 The SAS System 4 22:58 Thursday, August 14, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.020574 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 0.2552 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N khoiluongkho A 1.7628 3 A2 B 0.6044 3 A5 B 3 C B 0.5832 3 A1 C B C B D 0.4287 3 A4 C D C D 0.3478 3 A3 D D 0.3072 3 A0  Số chồi The SAS System 1 23:43 Thursday, August 14, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values sochoi 6 A0 A1 A2 A3 A4 A5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 2 23:43 Thursday, August 14, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 295.6111111 59.1222222 29.56 <.0001 Error 12 24.0000000 2.0000000 Corrected Total 17 319.6111111 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.924909 21.03789 1.414214 6.722222 The SAS System 3 23:43 Thursday, August 14, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F sochoi 5 295.6111111 59.1222222 29.56 <.0001 The SAS System 4 23:43 Thursday, August 14, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 2 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 2.5159 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N sochoi A 13.333 3 A2 B 10.333 3 A1 4 C 6.343 3 A0 C D C 5.667 3 A3 D D E 3.333 3 A5 E E 1.333 3 A4  Số rễ The SAS System 1 00:00 Friday, August 15, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values sore 6 A0 A1 A2 A3 A4 A5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 2 00:00 Friday, August 15, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 2783.777778 556.755556 24.50 <.0001 Error 12 272.666667 22.722222 Corrected Total 17 3056.444444 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.910790 19.41224 4.766783 24.55556 The SAS System 3 00:00 Friday, August 15, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F sore 5 2783.777778 556.755556 24.50 <.0001 The SAS System 4 00:00 Friday, August 15, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 22.72222 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 8.4801 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N sore A 51.000 3 A2 B 24.667 3 A0 B 5 B 23.667 3 A1 B C B 17.333 3 A4 C B C B 17.000 3 A5 C C 13.667 3 A3  Đường kính lá The SAS System 1 00:23 Friday, August 15, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values duongkinhla 6 A0 A1 A2 A3 A4 A5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 2 00:23 Friday, August 15, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 1.46444444 0.29288889 7.03 0.0028 Error 12 0.50000000 0.04166667 Corrected Total 17 1.96444444 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.745475 27.41966 0.204124 0.744444 The SAS System 3 00:23 Friday, August 15, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F duongkinhla 5 1.46444444 0.29288889 7.03 0.0028 The SAS System 4 00:23 Friday, August 15, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.041667 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 0.3631 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N duongkinhla A 1.2667 3 A2 B 0.8000 3 A1 6 B B 0.7667 3 A0 B B 0.7000 3 A4 B C B 0.6333 3 A3 C C 0.3000 3 A5  Chiều dài lá The SAS System 1 00:42 Friday, August 15, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values chieudaila 6 A0 A1 A2 A3 A4 A5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 2 00:42 Friday, August 15, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 5.25111111 1.05022222 11.32 0.0003 Error 12 1.11333333 0.09277778 Corrected Total 17 6.36444444 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.825070 24.47634 0.304594 1.244444 The SAS System 3 00:42 Friday, August 15, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F chieudaila 5 5.25111111 1.05022222 11.32 0.0003 The SAS System 4 00:42 Friday, August 15, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.092778 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 0.5419 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N chieudaila A 2.1333 3 A2 A 7 B A 1.6000 3 A3 B B 1.4000 3 A1 B B C 1.1000 3 A0 C C 0.6333 3 A4 C C 0.6000 3 A5  Chiều dài rễ The SAS System 1 00:57 Friday, August 15, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values chieudaire 6 A0 A1 A2 A3 A4 A5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 2 00:57 Friday, August 15, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 3.25333333 0.65066667 3.07 0.0519 Error 12 2.54666667 0.21222222 Corrected Total 17 5.80000000 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.560920 17.71830 0.460676 2.600000 The SAS System 3 00:57 Friday, August 15, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F chieudaire 5 3.25333333 0.65066667 3.07 0.0519 The SAS System 4 00:57 Friday, August 15, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.212222 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 0.8195 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N chieudaire A 3.3667 3 A5 A B A 2.8333 3 A3 8 B A B A 2.6000 3 A4 B B 2.5000 3 A1 B B 2.2667 3 A0 B B 2.0333 3 A2  Chiều cao chồi The SAS System 1 01:06 Friday, August 15, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values chieucaochoi 6 A0 A1 A2 A3 A4 A5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 2 01:06 Friday, August 15, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 4.41833333 0.88366667 4.56 0.0146 Error 12 2.32666667 0.19388889 Corrected Total 17 6.74500000 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.655053 26.68656 0.440328 1.650000 The SAS System 3 01:06 Friday, August 15, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F chieucaochoi 5 4.41833333 0.88366667 4.56 0.0146 The SAS System 4 01:06 Friday, August 15, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.193889 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 0.7833 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N chieucaochoi A 2.3333 3 A2 A B A 2.0667 3 A5 B A 9 B A C 1.9000 3 A3 B C B D C 1.4667 3 A4 D C D C 1.2333 3 A1 D D 0.9000 3 A0  Số lá The SAS System 1 23:48 Thursday, August 14, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values sola 6 A0 A1 A2 A3 A4 A5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 2 23:48 Thursday, August 14, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 2665.166667 533.033333 24.48 <.0001 Error 12 261.333333 21.777778 Corrected Total 17 2926.500000 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.910701 19.85816 4.666667 23.50000 The SAS System 3 23:48 Thursday, August 14, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F sola 5 2665.166667 533.033333 24.48 <.0001 The SAS System 4 23:48 Thursday, August 14, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 21.77778 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 8.302 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N sola A 44.667 3 A2 B 35.667 3 A1 C 17.667 3 A5 C C 15.667 3 A0 10 C C 15.000 3 A4 C C 12.333 3 A3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ BA cố định lên sự tăng trưởng chồi lan Cattleya Hybrid White  Khối lượng tươi The SAS System 1 11:27 Thursday, August 15, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values KLT 6 B0 B1 B2 B3 B4 B5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 2 11:27 Thursday, August 15, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 72.05446308 14.41089262 52.46 <.0001 Error 12 3.29612019 0.27467668 Corrected Total 17 75.35058327 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.956256 8.052335 0.524096 6.508622 The SAS System 3 11:27 Thursday, August 15, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F KLT 5 72.05446308 14.41089262 52.46 <.0001 The SAS System 4 11:27 Thursday, August 15, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.274677 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 0.9324 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N KLT A 9.8873 3 B3 B 8.0346 3 B0 11 C 6.8757 3 B2 D 5.5047 3 B1 E 4.4839 3 B4 E E 4.2655 3 B5  Khối lượng khô The SAS System 1 00:40 Friday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values khoiluongkho 6 B0 B1 B2 B3 B4 B5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 2 00:40 Friday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 0.29110939 0.05822188 43.22 <.0001 Error 12 0.01616519 0.00134710 Corrected Total 17 0.30727458 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.947392 10.71303 0.036703 0.342600 The SAS System 3 00:40 Friday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F khoiluongkho 5 0.29110939 0.05822188 43.22 <.0001 The SAS System 4 00:40 Friday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.001347 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 0.0653 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N khoiluongkho A 0.55000 3 B3 B 0.42363 3 B0 C 0.34407 3 B2 12 C D C 0.33107 3 B1 D D 0.26890 3 B5 E 0.13793 3 B4  Số lá The SAS System 1 00:45 Friday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values sola 6 B0 B1 B2 B3 B4 B5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 2 00:45 Friday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 482.6666667 96.5333333 32.78 <.0001 Error 12 35.3333333 2.9444444 Corrected Total 17 518.0000000 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.931789 9.532991 1.715938 18.00000 The SAS System 3 00:45 Friday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F sola 5 482.6666667 96.5333333 32.78 <.0001 The SAS System 4 00:45 Friday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 2.944444 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 3.0526 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N sola A 27.667 3 B3 B 20.333 3 B0 B B 19.000 3 B2 13 C 15.000 3 B1 C C 14.000 3 B4 C C 12.000 3 B5  Đường kính lá The SAS System 1 00:55 Friday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values duongkinhla 6 B0 B1 B2 B3 B4 B5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 2 00:55 Friday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 2.78944444 0.55788889 125.53 <.0001 Error 12 0.05333333 0.00444444 Corrected Total 17 2.84277778 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.981239 14.45783 0.066667 0.461111 The SAS System 3 00:55 Friday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F duongkinhla 5 2.78944444 0.55788889 125.53 <.0001 The SAS System 4 00:55 Friday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.004444 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 0.1186 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N duongkinhla A 1.33333 3 B3 B 0.36667 3 B2 B 14 B 0.33333 3 B1 B C B 0.26667 3 B0 C B C B 0.26667 3 B4 C C 0.20000 3 B5 C 0.20000 3 B5  Chiều dài lá The SAS System 1 01:08 Friday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values chieudaila 6 B0 B1 B2 B3 B4 B5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 2 01:08 Friday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 2.74296111 0.54859222 18.82 <.0001 Error 12 0.34973333 0.02914444 Corrected Total 17 3.09269444 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.886916 24.76159 0.170717 0.689444 The SAS System 3 01:08 Friday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F chieudaila 5 2.74296111 0.54859222 18.82 <.0001 The SAS System 4 01:08 Friday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.029144 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 0.3037 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N chieudaila A 1.4400 3 B3 15 B 0.8667 3 B4 B C B 0.6533 3 B2 C B C B 0.5667 3 B1 C C D 0.3667 3 B5 D D 0.2433 3 B0  Số chồi The SAS System 1 01:14 Friday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values sochoi 6 B0 B1 B2 B3 B4 B5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 2 01:14 Friday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 2229.333333 445.866667 105.60 <.0001 Error 12 50.666667 4.222222 Corrected Total 17 2280.000000 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.977778 5.011719 2.054805 41.00000 The SAS System 3 01:14 Friday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F sochoi 5 2229.333333 445.866667 105.60 <.0001 The SAS System 4 01:14 Friday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 4.222222 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 3.6555 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N sochoi A 60.000 3 B3 16 B 48.667 3 B0 C 43.333 3 B2 D 36.333 3 B1 E 29.000 3 B4 E E 28.667 3 B5  Số rễ The SAS System 1 13:34 Thursday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values Sore 6 B0 B1 B2 B3 B4 B5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 2 13:34 Thursday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 5926.000000 1185.200000 309.18 <.0001 Error 12 46.000000 3.833333 Corrected Total 17 5972.000000 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.992297 15.45703 1.957890 12.66667 The SAS System 3 13:34 Thursday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F Sore 5 5926.000000 1185.200000 309.18 <.0001 The SAS System 4 13:34 Thursday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 3.833333 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 3.4831 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Sore 17 A 43.000 3 B3 B 33.000 3 B4 C 0.000 3 B2 C C 0.000 3 B1 C C 0.000 3 B0 C C 0.000 3 B5  Chiều dài rễ The SAS System 1 13:38 Thursday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values chieudaire 6 B0 B1 B2 B3 B4 B5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 2 13:38 Thursday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 17.77611111 3.55522222 206.43 <.0001 Error 12 0.20666667 0.01722222 Corrected Total 17 17.98277778 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.988508 20.54089 0.131233 0.638889 The SAS System 3 13:38 Thursday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F chieudaire 5 17.77611111 3.55522222 206.43 <.0001 The SAS System 4 13:38 Thursday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.017222 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 0.2335 18 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N chieudaire A 2.6333 3 B3 B 1.2000 3 B4 C 0.0000 3 B2 C C 0.0000 3 B1 C C 0.0000 3 B0 C C 0.0000 3 B5 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ BA, NAA cố định lên tăng trưởng chồi Cattleya Hybrid White  Khối lượng tươi The SAS System 1 23:47 Thursday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values KLT 6 C0 C1 C2 C3 C4 C5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 2 23:47 Thursday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 92.26642608 18.45328522 484.91 <.0001 Error 12 0.45665741 0.03805478 Corrected Total 17 92.72308349 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.995075 6.947920 0.195076 2.807694 The SAS System 3 23:47 Thursday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F KLT 5 92.26642608 18.45328522 484.91 <.0001 The SAS System 4 23:47 Thursday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 19 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.038055 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 0.347 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N KLT A 7.6433 3 C0 B 3.2364 3 C2 C 1.9190 3 C3 D 1.4441 3 C1 D D 1.3386 3 C5 D D 1.2646 3 C4  Khối lượng khô The SAS System 1 23:56 Thursday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values KLK 6 C0 C1 C2 C3 C4 C5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 2 23:56 Thursday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 0.21265788 0.04253158 39.21 <.0001 Error 12 0.01301746 0.00108479 Corrected Total 17 0.22567535 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.942318 19.66531 0.032936 0.167483 The SAS System 3 23:56 Thursday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F KLK 5 0.21265788 0.04253158 39.21 <.0001 The SAS System 4 23:56 Thursday, August 16, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the 20 experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.001085 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 0.0586 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N KLK A 0.37420 3 C0 B 0.24367 3 C2 C 0.12737 3 C4 C C 0.11350 3 C1 C C 0.07450 3 C5 C C 0.07167 3 C3  Số lá The SAS System 1 00:08 Friday, August 17, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values sola 6 C0 C1 C2 C3 C4 C5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 2 00:08 Friday, August 17, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 37525.61111 7505.12222 582.29 <.0001 Error 12 154.66667 12.88889 Corrected Total 17 37680.27778 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.995895 6.573955 3.590110 54.61111 The SAS System 3 00:08 Friday, August 17, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F sola 5 37525.61111 7505.12222 582.29 <.0001 The SAS System 4 00:08 Friday, August 17, 2016 The ANOVA Procedure 21 t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 12.88889 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 6.3868 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N sola A 152.333 3 C0 B 63.333 3 C2 C 33.667 3 C3 C D C 28.333 3 C1 D D 25.000 3 C4 D D 25.000 3 C5  Chiều dài lá The SAS System 1 00:22 Friday, August 17, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values chieudaila 6 C0 C1 C2 C3 C4 C5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 2 00:22 Friday, August 17, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 3.91111111 0.78222222 36.10 <.0001 Error 12 0.26000000 0.02166667 Corrected Total 17 4.17111111 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.937666 28.18647 0.147196 0.522222 The SAS System 3 00:22 Friday, August 17, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F chieudaila 5 3.91111111 0.78222222 36.10 <.0001 The SAS System 4 22 00:22 Friday, August 17, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.021667 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 0.2619 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N chieudaila A 1.4333 3 C0 B 0.8000 3 C2 C 0.4000 3 C4 C D C 0.2000 3 C3 D C D C 0.1667 3 C1 D D 0.1333 3 C5  Đường kính lá The SAS System 1 00:26 Friday, August 17, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values DKla 6 C0 C1 C2 C3 C4 C5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 2 00:26 Friday, August 17, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 1.19777778 0.23955556 35.93 <.0001 Error 12 0.08000000 0.00666667 Corrected Total 17 1.27777778 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.937391 26.24453 0.081650 0.311111 The SAS System 3 00:26 Friday, August 17, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F 23 DKla 5 1.19777778 0.23955556 35.93 <.0001 The SAS System 4 00:26 Friday, August 17, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.006667 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 0.1453 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N DKla A 0.80000 3 C0 B 0.50000 3 C2 C 0.20000 3 C4 C C 0.16667 3 C5 C C 0.13333 3 C3 C C 0.06667 3 C1  Số chồi The SAS System 1 00:32 Friday, August 17, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values sochoi 6 C0 C1 C2 C3 C4 C5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 2 00:32 Friday, August 17, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 210877.6111 42175.5222 686.40 <.0001 Error 12 737.3333 61.4444 Corrected Total 17 211614.9444 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.996516 8.076457 7.838651 97.05556 The SAS System 3 00:32 Friday, August 17, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F 24 sochoi 5 210877.6111 42175.5222 686.40 <.0001 The SAS System 4 00:32 Friday, August 17, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 61.44444 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 13.945 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N sochoi A 323.667 3 C0 B 133.000 3 C2 C 47.667 3 C1 D 32.000 3 C3 D D 25.000 3 C4 D D 21.000 3 C5 25