Đồ án Khảo sát khả năng ứng dụng dịch nuôi cấy vi khuẩn lactobacillus sp. l5 vào bảo quản và xử lí hạt bắp

n cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Sinh viên thực hiện luận văn Nguyễn Xuân Việt i Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự hỗ trợ, giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác. Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập ở giảng đường đại học đến nay, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè. Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô ở Khoa Công Nghê Sinh Học - Thực Phẩm - Môi Trường, Trường Đại Học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu, tạo điều kiện thuận lợi nhất cho chúng em trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp tại trường. Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Hoài Hương và cô Nguyễn Thị Hai đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ em có cơ hội được thực hành, vận dụng những kiến thức đã học vào công việc thực tế và hoàn thành luận văn với kết quả tốt nhất. Cuối cùng xin cảm ơn các bạn làm luận văn ở phòng thí nghiệm đã chia sẻ những kinh nghiệm, giúp đỡ em trong quá trình hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Bài báo cáo được thực hiện trong khoảng thời gian hơn 3 tháng. Bước đầu đi vào thực tế, tìm hiểu về lĩnh vực bảo quản hạt nông sản bằng chất bảo quản có nguồn gốc sinh học, tuy nhiên kiến thức của em còn hạn chế. Do vậy, không tránh khỏi những thiếu sót là điều chắc chắn, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của quý Thầy Cô để em có kiến thức và kỹ năng tốt hơn cho công việc trong tương lai. Tp Hồ Chí Minh, 6/2017 Nguyễn Xuân Việt ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC ...................................................................................................................... iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT......................................................................................vii DANH MỤC BẢNG .................................................................................................... viii DANH MỤC HÌNH ẢNH .............................................................................................. ix MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài: .......................................................................................... 1 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .............................................................. 2 2.1. Ngoài nước ...................................................................................................... 2 2.2. Trong nước ...................................................................................................... 3 3. Mục đích nghiên cứu ................................................................................................ 3 4. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................. 3 5. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 3 6. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 4 6.1. Phương pháp luận ............................................................................................ 4 6.2. Phương pháp xử lí số liệu ................................................................................ 4 7. Kết quả đạt được ...................................................................................................... 4 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ............................................................................................ 6 1.1 Tổng quan về nấm .................................................................................................. 6 1.1.1. Giới thiệu chung .............................................................................................. 6 1.1.2. Phân loại nấm .................................................................................................. 6 1.1.3. Một số độc tố và tác hại của độc tố nấm mốc. ................................................ 7 1.2. Tổng quan về vi khuẩn lactic ............................................................................... 20 1.2.1. Đặc điểm chung ............................................................................................. 20 1.2.1.1. Hình thái và dinh dưỡng của vi khuẩn lactic .......................................... 20 1.2.1.2. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic ................................................ 20 1.2.1.3. Phân loại vi khuẩn lactic ........................................................................ 22 iii Đồ án tốt nghiệp 1.2.2. Khả sinh sinh các hợp chất kháng khuẩn của các chủng LAB ..................... 24 1.2.2.1. Bacteriocin .............................................................................................. 24 1.2.1.2. Phân loại bacteriocin .............................................................................. 25 1.2.3. Khả năng kháng nấm của LAB và ứng dụng ................................................ 27 1.2.3.1. Khả năng kháng nấm của LAB .............................................................. 27 1.2.3.2. Ứng dụng của vi khuẩn LAB ................................................................. 29 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 30 2.1. Địa điểm nghiên cứu: .............................................................................................. 30 2.2. Thời gian thực hiện: ................................................................................................ 30 2.3. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................. 30 2.3.1. Vật liệu: ............................................................................................................ 30 2.3.2. Hoá chất và môi trường sử dụng: ..................................................................... 30 2.3.2.1. Hoá chất: ................................................................................................... 30 2.3.2.2. Môi trường nuôi cấy:................................................................................. 31 2.4. Thiết bị và dụng cụ: ................................................................................................. 31 2.4.1. Thiết bị: ............................................................................................................ 31 2.4.2. Dụng cụ: ........................................................................................................... 31 2.5. Phương pháp luận: .................................................................................................. 32 2.5.1 Mục tiêu đồ án: .................................................................................................. 32 2.5.2 Nội dung: ........................................................................................................... 32 2.6. Phương pháp nghiên cứu: .................................................................................... 33 2.6.1. Sơ đồ nghiên cứu: .......................................................................................... 33 2.6.2. Khảo sát hình thái vi khuẩn .............................................................................. 34 2.6.2.1. Nhuộm Gram .......................................................................................... 35 2.6.2.2. Nhuộm bào tử ......................................................................................... 36 2.6.2.3. Thử nghiệm di động ............................................................................... 37 2.6.2.4. Thử nghiệm Catalase .............................................................................. 38 iv Đồ án tốt nghiệp 2.6.2.5. Hàm lượng acid tổng .............................................................................. 38 2.6.2.6. Thử nghiệm khả năng lên men đường .................................................... 39 2.6.2.7. Thử nghiệm Protease .............................................................................. 39 2.6.2.8. Thử nghiệm Chitinase: ........................................................................... 40 2.6.3. Khảo sát khả năng sinh IAA của chủng vi khuẩn Lactobacillus L5. ............ 40 2.6.3.1. Định tính khả năng sinh IAA ................................................................. 40 2.6.3.2. Định lượng IAA có trong dịch nuôi cấy ................................................. 40 2.6.4. Khả sát khả năng phát triển của chủng nấm Fusarium sp.: .......................... 41 2.6.5. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp. L5 với chủng nấm Fusarium sp.: ........................................................................................... 43 2.6.6. Ảnh hưởng của vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 đến độ khoẻ mầm ở cây bắp45 2.6.7. Khảo sát khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy sau gia nhiệt của chủng Lactobacillus sp. L5 với Fusarium sp.: ..................................................................... 46 2.6.8. Khảo sát khả năng ảnh hưởng của dịch buôi cấy chủng Lactobacillus sp. L5 đối với sự nảy mầm của hạt. ...................................................................................... 49 2.6.9. Khảo sát khả năng ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus spp. L5 có cảm nhiễm nấm mốc đối với sự nảy mầm của hạt. ............................................... 52 2.3.9. Ứng dụng sử dụng dịch nuôi cấy bảo quản hạt bắp ...................................... 55 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ................................................................. 57 3.1. Khảo sát sinh lý, sinh hóa và tính thuần của chủng Lactobacillus sp. L5 ........... 57 3.1.1. Hình thái khuẩn lạc trên đĩa MRS Agar ........................................................ 57 3.1.2. Hình thái tế bào ............................................................................................. 58 3.1.3. Thử nghiệm Catalase ..................................................................................... 59 3.1.4. Khả năng di động .......................................................................................... 59 3.1.5. Hàm lượng acid tổng ..................................................................................... 61 3.1.6. Khả năng lên men đường .............................................................................. 61 3.1.7. Thử nghiệm Chitinase ................................................................................... 62 3.1.8. Thử nghiệm Protease ..................................................................................... 63 v Đồ án tốt nghiệp 3.2. Định tính và định lượng IAA có trong dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5.. ...... 64 3.3. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp. L5 với chủng nấm mốc Fusarium sp.: .................................................................................................. 67 3.4. Khảo sát khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 sau gia nhiệt. ................................................................................................................... 69 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 đối với sự phát triển của hạt bắp. ..................................................................................................................... 72 3.5.1. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới thời gian nảy mầm . 72 3.5.2. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới tỉ lệ nảy mầm. ........ 74 3.5.3. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới chiều cao. ............... 76 3.5.4. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới chiều dài rễ ............. 80 3.5.5. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới sinh khối tươi. ........ 84 3.6. Ứng dụng dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 trong bảo quản hạt. ..................... 89 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................... 95 4.1. Kết luận ................................................................................................................ 95 4.2. Kiến nghị .............................................................................................................. 95 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 96 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BVTV: Bảo vệ thực vật KĐKTH: Không đun, không trung hoà KĐTH: Không đun, trung hoà KTHCN: Không trung hoà, cảm nhiễm KTHKCN: Không trung hoà, không cảm nhiễm LAB: Lactic acid bacteria MRS: Man De Rogosa and Sharpe NT: Nghiệm thức PDA: Potato Dextrose Agar PDB: Potato Dextrose Broth THCN: Trung hoà, cảm nhiễm THKCN: Trung hoà, không cảm nhiễm VSV: Vi sinh vật vii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Một số loại nấm và độc tố của chúng ............................................................ 17 Bảng 1.2: Một số sản phẩm chuyển hóa của LAB và phương thức hoạt động. ............. 23 Bảng 1.3: Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men. 28 Bảng 3.1: Hàm lượng % acid lactic của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 ............. 61 Bảng 3.2: Khả năng lên men các loại đường của Lactobacillus sp. L5 ......................... 62 Bảng 3.3: Kết quả biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo nồng độ IAA. ......... 64 Bảng 3.4: Đường kính phát triển của chủng nấm mốc Fusarium sp. ............................ 66 Bảng 3.5: Tỉ lệ ức chế (%) chủng nấm mốc Fusarium sp. của Lactobacillus sp. L5. ... 68 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của các mức xử lí nhiệt sau 15 phút đến tỉ lệ ức chế Fusarium sp. ........................................................................................................................................ 69 Bảng 3.7: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới thời gian nảy mầm. .................................. 72 Bảng 3.8: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới tỉ lệ nảy mầm. ........................................... 74 Bảng 3.9: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đối với chiều cao của cây bắp ngày 7. .......... 76 Bảng 3.10: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới rễ sau 7 ngày .......................................... 80 Bảng 3.11: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới sinh khối tươi sau 7 ngày. ..................... 84 Bảng 3.12: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đến độ khoẻ mầm sau 7 ngày ...................... 86 Bảng 3. 13: Khả năng kháng nấm của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 ở các nghiệm thức ứng dụng bảo quản hạt bắp. ................................................................................... 89 viii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cấu trúc hoá học của Trichothecennes và Detoxified ................................... 13 Hình 3.1: Khuẩn lạc Lactobacillus sp. L5 trên đĩa MRS Agar (Trái) và khuẩn lạc quan sát dưới kín hiển vi (phải). ............................................................................................. 57 Hình 3.2: Vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 sau nhuộm Gram. ......................................... 58 Hình 3.3: Vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 sau nhuộm bào tử. ........................................ 58 Hình 3.4: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 (Từ trái qua phải): Thử nghiệm âm tính của L5, Đối chứng âm vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 trong nước cất, Thử nghiệm dương tính đối với Bacillus spp. ......................................................... 59 Hình 3.5: Khả năng di động của chủng Lactobacillus sp. L5 ........................................ 60 Hình 3.6: Khả năng lên men các loại đường của Lactobacillus sp. L5 ......................... 62 Hình 3.7: Thử nghiệm chitinase của chủng Lactobacillus sp. L5.................................. 62 Hình 3.8: Thử nghiệm protease của chủng Lactobacillus sp. L5 .................................. 63 Hình 3.9: Dịch nuôi cấy sau ly tâm đổi màu khi cho thuốc thử so với ĐC. .................. 64 Hình 3.10: Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa chỉ số OD530nm và nồng độ IAA (μg/ml) ............................................................................................................................ 65 Hình 3.11: Khả năng phát triển của các chủng nấm mốc Fusarium sp. trên môi trường MRS Agar cải tiến và PDA sau 3 ngày. ......................................................................... 66 Hình 3.12: Hình thái sợi nấm và bảo tử nấm mốc Fusarium sp. dưới kính hiển vi....... 67 Hình 3.13: Khả năng ức chế nấm của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp. L5 đối với nấm mốc Fusarium sp. ................................................................................................... 68 Hình 3.14: Đồ thị thể hiện sự ảnh hưởng của chế độ xử lý nhiệt dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 lên khả năng kháng Fusarium sp.................................................. 70 Hình 3.15: Khả năng ức chế nấm của chủng Lacotbacillus sp. L5 sau khi gia nhiệt. ... 71 Hình 3.16: Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của dịch nuôi cấy trước và sau gia nhiệt đối với thời gian nảy mầm của hạt bắp....................................................................................... 73 ix Đồ án tốt nghiệp Hình 3.17: Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới tỉ lệ nảy mầm. ........................................................................................................................ 75 Hình 3.18: Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới chiều cao cây bắp ............ 77 Hình 3.19: Chiều cao cây NT THKCN sau 7 ngày. ....................................................... 78 Hình 3.20: Chiều cao cây NT THCN sau 7 ngày. .......................................................... 78 Hình 3.21: Chiều cao cây ở NT KTHKCN sau 7 ngày .................................................. 79 Hình 3.22: Chiều cao cây ở NT THKCN sau 7 ngày..................................................... 79 Hình 3.23: Đồ thị thể hiện chiều dài rễ ở các nghiệm thức sau 7 ngày. ........................ 81 Hình 3.24: Chiều dài rễ cây bắp ở NT THKCN sau 7 ngày. ......................................... 82 Hình 3.25: Chiều dài rễ cây bắp ở NT THCN sau 7 ngày. ............................................ 82 Hình 3.26: Chiều dài rễ cây bắp ở NT KTH KCN sau 7 ngày. ..................................... 83 Hình 3.27: Chiều dài rễ cây bắp ở NT KTHCN sau 7 ngày. ......................................... 83 Hình 3.28: Biểu đồ thể hiện sinh khối tươi của cây ở các NT sau 7 ngày. .................... 85 Hình 3.29: Đồ thị biểu thị độ khoẻ của mầm cây bắp sau 7 ngày ................................. 87 Hình 3.30: Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của các nghiệm thức dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 ....................................................................................................... 90 x Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài: Các loại hạt nói chung và hạt nông sản nói riêng là một phần quan trọng trong quá trình tồn tại và phát triển của loài ngoài người. Cho nên con người ngày nay luôn tìm các tăng sản lượng hạt nông sản lên tối đa trên cùng một đơn vị diện tích. Tuy nhiên chỉ tăng sản lượng hạt nông sản phục vụ cho mục đích cuối cùng vẫn chưa đủ. Sau khi thu hoạch hạt vẫn rất dễ bị tổn thương trong quá trình bảo quản và chế biến, nó ảnh hưởng nhiều đến giữ giống cho mùa vụ sau hay ảnh hưởng tới chất lượng và giá trị của nông sản. Vì vậy ngoài nghiên cứu để nâng cao sản lượng thu hoạch chúng ta cần tiến hành song song quá trình nghiên cứu bảo quản và khả năng nảy mầm của nông sản sau thu hoạch. Để làm được điều đó là một công việc không dễ dàng. Công nghệ bảo quản hạt nông sản có nhiều phương pháp khác nhau nhưng cơ bản có 3 phương pháp đó là vật lý, hoá học và sinh học. Nhưng ngày nay người ta càng ngày càng chú trọng đến phương pháp bảo quản bằng sinh học do có nhưng ưu điểm vượt trội của nó như an toàn với người sử dụng, không ảnh hưởng đến cảm quan màu sắc, mùi vị của nông sản sau thu hoạch. Các hợp chất sinh ra từ vi khuẩn lactic ngày càng được chú trọng trong bảo quản thực phẩm nhờ khả năng sinh hợp chất kháng các vi sinh vật có hại. Việc chú trọng bảo quản thực phẩm tươi sống như thịt cá trứng sữa, rau của quả là tối cần thiết nhưng việc bảo quản các loại hạt nông sản cũng rất quan trọng trong cuộc sống con người. Hạt bắp là một trong 5 loại hạt ngũ cốc quan trọng của nước ta. Do chúng ta chỉ tập trung vào số lượng nên chất lượng chưa thực sự tốt dẫn đến khả năng xuất khẩu của hạt bắp không cao. Hạt bắp rất dễ bị nhiễm các loại nấm như Aspergillus spp. làm mốc hạt, hay nấm Fusarium spp. làm thối thân thối bắp hay nấm Helminthosporium spp. gây bệnh đốm lá trên cây bắp. Trong đó loài Fusarium spp. không chỉ gây hại cho hạt 1 Đồ án tốt nghiệp bắp ảnh hưởng tới khả năng nảy mầm do chúng sinh độc tố như Zearelenone, Vomitoxin mà còn ảnh hưởng tới khả năng hô hấp của con người và động vật khi sử dụng bắp nhiễm Fusarium spp. Cùng với khả năng kháng các loài nấm bệnh của các chủng lactic trên hạt đã và đang được nghiên cứu rộng rãi trong và ngoài nước. Nước ta có các sản phẩm lên men truyền thống và công nghiệp khi sử dụng các chủng vi khuẩn lactic được chứng minh thực tế là an toàn với người sử dụng nên người thực hiện thấy đây là vấn đề cấp thiết nên đã thực hiện đề tài: “Khảo sát khả năng ứng dụng dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 vào bảo quản và xử lí hạt bắp”. 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 2.1. Ngoài nước Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về khả năng kháng nấm khác nhau như:  “Khả năng kháng nấm của 2 chủng Lactobacillus plantarum với mốc Fusarium in vitro và trong nấu mạch nha lúa mạch” của A. Laitila (2002).  Năm 2004, Cassandra De Muynck nghiên cứu “Khả năng kháng nấm của vi khuẩn sinh acid lactic trong sản xuất hợp chất kháng nấm trong thực phẩm”.  Kim Jeong Dong với “Nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn lactic phân lập từ kim chi kháng Aspergillus fumigatus” năm 2005.  R Munoz và cộng sự với nghiên cứu “Ngăn cản sự sản xuất độc tố của Aspergillus nomius của vi khuẩn sinh acid lactic và Saccharosemyces cerevisae” năm 2010.  Ghisian và cs (2005) đã nghiên cứu sự sản xuất Fumonissin từ các loài Fusarium phân lập từ ngũ cốc tươi ở Iran. Kết quả phân lập được 3619 chủng Fusarium verticilloides và Fusarium proliferatum từ 92 mẫu ngũ cốc mới thu hoạch tại 4 vùng địa lí khác nhau của Iran, đồng thời cũng xác định được hàm lượng Fumonissin mà chúng tạo ra trên môi trường ngũ cốc. 2 Đồ án tốt nghiệp 2.2. Trong nước Hiện tại nước ta cũng có khá nhiều công trình nghiên cứu vi khuẩn kháng nấm bệnh trên các loại cây và hạt khác nhau tiêu biểu như:  Chế phẩm Bimix của trung tâm công nghệ sinh học Thành Phố Hồ Chí Minh xử lí mùi hôi trong chăn nuôi khi kết hợp xử dụng sản phẩm sau lên men của 3 chủng Bacillus subtillis, Streptomycess sp, Saccharomycess cerevisiae. Sản sinh enzyme ngoại bào để ức chế nấm mốc gây bệnh. 3. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu và sản xuất chế phẩm có nguồn gốc sinh học để bảo quản và khả năng nảy mầm của hạt bắp khỏi nấm bệnh gây hại từ vi khuẩn lactic. 4. Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát khả năng bảo quản hạt của dịch nuôi cấy của chủng Lactobacillus sp. L5 trong bảo quản và sự phát triển của hạt bắp. 5. Nội dung nghiên cứu Hoạt hoá chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 và các chủng nấm Fusarium sp. Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hoá chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5. Khảo sát khả năng sinh IAA của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp. L5 với chủng nấm Fusarium sp. Khảo sát khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy ở sau khi đun ở các nhiệt độ, pH khác nhau của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 với các chủng nấm Fusarium sp.. 3 Đồ án tốt nghiệp Ứng dụng dịch nuôi cấy của vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 kích thích sinh trưởng của hạt bắp. Ứng dụng dịch nuôi cấy của vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 trong bảo quản hạt bắp. 6. Phương pháp nghiên cứu 6.1. Phương pháp luận Trên cơ sở khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic đối với các nấm gây hư hỏng hạt ngũ cốc và sinh độc tố, người thực hiện đề tài tiếp tục nghiên cứu và tìm hiểu các tác nhân gây ức chế nấm nhiễm hạt. Sau khi xác định tác nhân gây ức chế là dịch nuôi cấy, sẽ sử dụng trức tiếp để ứng dụng trong bảo quản hạt bắp đã cảm nhiễm nấm mốc. Sau đó thử nghiệm khả năng ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đối với khả năng nảy mầm của hạt bắp. 6.2. Phương pháp xử lí số liệu Phần mềm Excel 2016. Phần mềm thống kê SAS 9.4. 7. Kết quả đạt được Xác định khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 đối với chủng Fusarium sp. Xác định được khả năng kháng nấm của dịch nuôi cấy được đun ở các nhiệt độ 65oC, 80oC, 100oC trong 15 phút, trung hoà pH = 6 và không trung hoà. Xác định được ảnh hưởng của dịch nuôi cấy của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 ở các mức nhiệt độ và các độ pH đối với khả năng nảy mầm của hạt bắp. 4 Đồ án tốt nghiệp Ứng dụng dịch nuôi cấy của vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 kích thích sinh trưởng của hạt bắp. Ứng dụng trong bảo quản hạt bắp, thúc đẩy quá trình nảy mầm của hạt bắp. 5 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về nấm 1.1.1. Giới thiệu chung Nấm (Fungi, Mycota) là một giới trong số năm giới theo hệ thống phân loại của R. H. Whittaker (1996). Nấm thuộc ngành nấm (Euphycophyta), là bộ môn nghiên cứu của nấm học (Mycology), là một ngành khoa học độc lập với vi sinh vật. Tuy nhiên có một số nhóm nấm (nấm men, nấm mốc) do kích thước nhỏ bé và muốn nghiên cứu phải sử dụng các phương pháp vi sinh vật học nên được coi là đối tượng nghiên cứu của vi sinh vật học. Nấm có nhiều đặc điểm giống với thực vật nhưng khác với thực vật ở chổ không có sắc tố quang hợp và cơ thể ít phân hóa về mặt hình thái. Nấm tồn tại và phân bố khắp trng tự nhiên như đất, nước, rễ thân lá quả hạt cây. Chúng có khả năng sinh độc tố có hại cho con người, động vật và thực vật. Tuy nhiên chúng lại có vai trò rất quan trọng trong việc phân giải các hợp chất trong tự nhiên có chứa cellulose, protein, lipid, kitin, pectin, đảm bảo chu trình khép kín trong tự nhiên. 1.1.2. Phân loại nấm Dựa theo tổ chức hình thái, nấm được chia thành 4 lớp chính: Lớp Phycomycetes (lớp nấm tảo): Sợi không có vách ngăn ngăn, bào tử gồm 2 lớp phụ: Oomycetes (nấm noãn) và Zygomycetes (nấm tiếp hợp). Lớp Ascomycetes (lớp nấm túi): Sợi nấm có vách ngăn, sinh sản vô tính bằng túi bào tử, sinh sản hữu tính theo kiểu tạo túi (namg) và túi bào tử (ascospore). Lớp Basidiomycetes (lớp nấm đảm): Sinh sản hữu tính theo kiểu tạo đảm bào tử (basidiospore). Gập ở các nấm có tai nấm: Nấm rơm, nấm hương. 6 Đồ án tốt nghiệp Lớp Deuteromycetes (lớp nấm bất toàn): Không có khả năng sinh sản hữu tính và có 3 bộ. 1.1.3. Một số độc tố và tác hại của độc tố nấm mốc. Theo Nguyễn Thị Hiền (2009) cho biết: Trong 300 loại độc tố vi nấm đã biết, chỉ có 20 loài ảnh hưởng đến sức khỏe con người, khoảng 15 loài gây ung thư. Trong một thời gian dài, người ta ít chú ý đến khả năng gây bệnh trong thực phẩm bị mốc. Nhưng vào năm 1960, hơn 100000 con gà tây ở Anh đã bị chết một cách rất khó hiểu. Sau đó, người ta đã phát hiện ra nguyên nhân là những con gà này đã ăn bột lạc nhiễm Aspergillus flavus, chính nấm mốc này đã tạo ra những độc tố nguy hiểm. Nhờ phát hiện này người ta đã khẳng định rằng con người cũng có thể bị bệnh nếu ăn phải những hạt mốc, kể cả với lương rất nhỏ. Một số độc tố thường gặp như sau:  Aflatoxin, Ochratoxins do Aspercillus spp. Điều đầu tiên chúng ta cần biết aflatoxin là tinh thể trắng, bền với nhiệt, không bị phân hủy khi đun nấu ở nhiệt độ thông thường (ở 1200oC, phải đun 30 phút mới mất tác dụng độc) do vậy nó có thể tồn tại trong thực phẩm không cần sự có mặt của nấm mốc tương ứng; đồng thời nó rất bền với các men tiêu hóa. Tuy nhiên nó lại không bền dưới ánh sáng mặt trời và tia tử ngoại, nên việc khử độc thực phẩm sẽ có nhiều biện pháp hơn. Có 17 loại aflatoxin khác nhau, nhưng thường gặp và độc nhất là aflatoxin B1. Aflatoxin B1 là phân tử ái mỡ, có trọng lượng phân tử thấp, dễ dàng được hấp thu sau khi ăn, sự hấp thu là hoàn toàn. 7 Đồ án tốt nghiệp Theo Bộ môn Dược lý – Vệ sinh an toàn thực phẩm (2011), cho biết: Aflatoxine liên quan tới các bệnh khác nhau ở gia súc, vật nuôi trong nhà cũng như con người; là loại độc tố nấm mốc được nghiên cứu rộng và sâu nhất trên toàn thế giới. Cần lưu ý rằng aflatoxin có thể sinh ra trong ngũ cốc ngay cả trước khi thu hoạch, trong thu hoạch và sau thu hoạch nếu ngũ cốc không được bảo quản đúng cách hay được sinh ra trong thức ăn chăn nuôi trước khi được sử dụng. Nói chung, khi aflatoxin sinh ra, khó có thể làm gì để loại bỏ chúng khỏi ngũ cốc hay thức ăn chăn nuôi. Các loại độc tố này có cấu tạo hoá học rất ổn định và không bị phá huỷ bởi nhiệt, ánh sáng, axit, xử lý kiềm, hay kéo dài thời gian lưu trữ. Khi người và động vật ăn phải thực phẩm ... Máy nước cất Bể điều nhiệt 2.4.2. Dụng cụ: Ống nghiệm, đĩa petri nhựa và thuỷ tinh, erlen, cốc thuỷ tinh, bình định mức, ống đong, đũa thuỷ tinh. Pipet thuỷ tinh 5ml, 10ml, 20ml, micropipet 100 – 1000μl. 31 Đồ án tốt nghiệp Que cấy, que trang, kẹp gấp thạch, que đục lỗ thạch, đèn cồn, dao mổ, eppendorf 1ml. Bông thấm nước, bông không thấm nước, giấy lọc, giá đỡ ống nghiệm. 2.5. Phương pháp luận: 2.5.1 Mục tiêu đồ án: Khảo sát khả năng ứng dụng của dịch nuôi cấy, của vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 trong bảo quản hạt bắp và ảnh hưởng của djch nuôi cấy đôi với khả năng nảy mầm của hạt bắp. 2.5.2 Nội dung: Hoạt hoá chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 và chủng Fusarium .sp. Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hoá chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 và chủng Fusarium .sp. Khả sát khả năng sinh IAA có trong dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp. L5. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp. L5 với chủng nấm Fusarium sp. Khảo sát khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sp L5 sau gia nhiệt ở mức nhiệt độ 65oC, 80oC, 100oC trong 15 phút. Khảo sát tỉ lệ nảy mầm của hạt sau khi ngâm hạt trong dịch nuôi cấy ở thời điểm 30 phút sau cảm nghiễm nấm Fusarium sp. khi gia nhiệt ở các nhiệt độ độ 65oC, 80oC, 100oC trong 15 phút và không gia nhiệt. Ứng dụng dịch nuôi cấy của vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 trong bảo quản hạt bắp và khả năng nảy mầm của hạt sau thu hoạch. 32 Đồ án tốt nghiệp 2.6. Phương pháp nghiên cứu: 2.6.1. Sơ đồ nghiên cứu: Chủng vi khuẩn lactic Chủng nấm mốc Khảo sát đặc điểm hình thái, Khảo sát khả năng phát triển sinh hoá, sinh IAA Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp giữa chủng vi khuẩn lactic và chủng nấm mốc Khảo sát khả năng đối kháng nấm của dịch vi khuẩn sau khi gia nhiệt Khảo sát khả năng đối kháng Khảo sát khả năng đối kháng nấm của dịch vi khuẩn sau khi nấm của dịch vi khuẩn sau khi gia nhiệt 15 phút ở các mốc gia nhiệt 15 phút ở các mốc nhiệt 100oC, 80oC và 65oC điều nhiệt 100oC, 80oC và 65oC chỉnh pH = 6 không điều chỉnh pH Ứng dụng dịch nuôi cấy vi khuẩn để bảo quản và thúc đẩy quá trình nảy mầm của hạt bắp 33 Đồ án tốt nghiệp 2.6.2. Khảo sát hình thái vi khuẩn Chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 Tăng sinh trong môi trường Khảo sát khả năng sinh IAA MRS Broth Ủ 37oC, 24 giờ Cấy chuyền qua môi trường MRS Agar Quan sát hình thái khuẩn lạc Khảo sát đặc điểm hình thái  Nhuộm Gram và đặc điểm nuôi cấy  Nhuộm bào tử  Khả năng lên men đường  Thử nghiệm Catalase  Acid tổng  Thử nghiệm enzyme Khẳng định ngoại bào giống thuần 34 Đồ án tốt nghiệp Thuyết minh quy trình: Mục đích: Khẳng định tính thuần của chủng vi khuẩn lactic, thực hiện một số phản ứng sinh hoá và khảo sát khả năng sinh IAA của chủng vi khuẩn. Các chủng vi khuẩn lactic có thể bị suy yếu và nhiễm các loài vi khuẩn khác trong quá trình bảo quản. Do đó, người thực hiện đề tài tiến hành thí nghiệm này nhằm khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần của chúng và hoạt hoá lại chủng vi khuẩn cho các thí nghiệm về sau. Chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 được tăng sinh lại trong môi trường MRS Broth và ủ ở 37°C trong 24 giờ. Sau đó, tiến hành cấy chuyển trên MRS Agar và ủ 1 ngày ở 37°C sau đó quan sát hình thái khuẩn lạc và khảo sát đặc điểm nuôi cấy. 2.6.2.1. Nhuộm Gram Mục đích: Xác định vi khuẩn thuộc Gram dương hay Gram âm. Tiến hành: Dựa theo phương pháp Hucker cải tiến và sử dụng dịch nuôi cấy sau 24 giờ. Chuẩn bị vết bôi: Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí. Cố định tế bào: Hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần. Nhuộm bằng dung dịch Violet trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô. 35 Đồ án tốt nghiệp Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safarin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí. Soi kính: Dùng vật kính x100 nhỏ dầu quan sát. Kết quả: Vi khuẩn Gram dương bắt màu tím, Gram âm bắt màu hồng. 2.6.2.2. Nhuộm bào tử Mục đích: Vì vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 không sinh bào tử và do tế bào chất của bào tử và tế bào chất bắt màu khác nhau. Phương pháp này nhằm loại bỏ các vi khuẩn sinh bào tử như Bacillus spp. hay Clostridium spp. Tiến hành: Phương pháp Schaeffer – Fulton. Bước 1: Làm vết bôi và cố định tiêu bản Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng (hoặc mẫu nghi ngờ nhiễm khuẩn) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí, hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính. Cố định vết bôi bằng cách nhỏ lên vết bôi 1 – 2 giọt cồn 96o . Đốt cháy khoảng 10 giây và dập tắt ngay. Đặt tiêu bản lên trên giá đỡ, giá đỡ đặt trên cốc thuỷ tinh có chứa một ít nước đang đun nóng 85 – 90oC (không để cho sôi) trên bếp. Bước 2: Tiến hành nhuộm tiêu bản Đặt miếng giấy lọc lên trên vết bôi. Nhỏ 2 – 3 giọt dung dịch malachite 5% lên vết bôi và tiến hành hơ hơi nước nóng 36 Đồ án tốt nghiệp trong 5 – 10 phút. Nếu thấy thuốc nhuộm trên giấy bị khô thì phải bổ sung. Rửa vết bôi bằng nước cất trong 30 giây (lúc đó các tế bào dinh dưỡng sẽ bị mất màu còn bào tử vẫn giữ lại màu). Đặt tiêu bản lên giá đỡ, giá được đặt trên chậu rửa. Đặt giấy lọc lên trên vết bôi. Nhỏ 2 – 3 giọt dung dịch safranin hay fuchsin lên trên miếng giấy lọc, để 30 giây. Rửa nước rồi thấm khô hay để khô tự nhiên vết bôi. Bước 3: Quan sát tiêu bản trên kính hiển vi quang học với vật kính dầu soi kính (x100). Kết quả: Tiêu bản nhuộm đúng thì bào tử sẽ bắt màu xanh lục, tế bào chất bắt màu đỏ hồng. Lưu ý: Để dễ dàng quan sát được bào tử nên cấy vi khuẩn trên môi trường dinh dưỡng chứa 0,005% MnCl2 (5mg/l) trước 2 tuần trên môi trường thạch nghiêng. Có thể thay thế dung dịch lục Malachite 5% bằng dung dịch Methylen Blue 6%. 2.6.2.3. Thử nghiệm di động Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật trong môi trường thạch mềm 0,5 – 0,7% agar. Vì vi khuẩn lactic không có khả năng di động, chỉ mọc theo đường cấy thẳng đứng trong ống chứa môi trường thạch mềm và không làm đục môi trường xung quanh nên trong thử nghiệm này, ta loại bỏ được các vi khuẩn di động không phải là vi khuẩn lactic, chúng sẽ mọc lan ra khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh. 37 Đồ án tốt nghiệp Tiến hành: - Dùng que cấy cấy thẳng đâm vào môi trường thạch mềm, lưu ý không đâm đến chạm đáy ống nghiệm. - Đặt ống nghiệm thẳng đứng, ủ ở 37oC và quan sát sau 1-3 ngày. Kết quả: Vi khuẩn mọc lan rộng quanh vết cấy tức là chúng có khả năng di động. Vi khuẩn chỉ mọc theo vết cấy tức là chúng không có khả năng di động. 2.6.2.4. Thử nghiệm Catalase Mục đích: Xác định vi khuẩn có khả năng sinh enzyme catalase. Tiến hành: Dùng H2O2 nhỏ trực tiếp lên khuẩn lạc 18 – 24 giờ. Quan sát kết quả. Kết quả: Vi khuẩn có khả năng sinh enzyme catalase nếu xuất hiệt bọt khí sủi bọt mạnh và nhanh, âm tính khi không có hiện tượng xảy ra. 2.6.2.5. Hàm lượng acid tổng Mục đích: Xác định hàm lượng acid tồng bằng phương pháp quy về acid lactic để xác định hàm lượng acid lactic sinh ra từ chủng vi khuẩn lactic thử nghiệm. Hàm lượng acid trong dịch lên men có thể định lượng bằng dung dịch kiềm chuẩn nhờ có sự đổi màu của dung dịch thuốc thử Phenolphatalein. Tiến hành: Cho vào bình tam giác 10ml dịch lên nuôi cấy vi khuẩn, thêm 2 – 3 giọt Phenolphtalein và chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt. Sử dụng máy đo pH để chuẩn độ đến khi pH đạt 8,0 và ghi kết quả. 38 Đồ án tốt nghiệp Kết quả: Hàm lượng acid tổng được quy về acid lactic như sau: V1 × K %Acid lactic = x 100% V2 Trong đó: V1: Thể tích NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ (ml). K: Hệ số đổi ra acid tương ứng, với acid lactic là 0,009. V2: Thể tích dịch nuôi cấy đem đi chuẩn độ (ml). 2.6.2.6. Thử nghiệm khả năng lên men đường Mục đích: Kiểm tra khả năng lên men các loại đường khác nhau của vi khuẩn. Tiến hành: Môi trường MRS Broth lần lượt thay thế đường glucose thành các loại đường Sucrose, Maltose và Xylose. Sau đó phối vào ống nghiệm có ống durham, hấp khử trùng và cấy vi khuẩn vào, ủ ở 37°C trong 24 giờ và quan sát. Kết quả: Dương tính khi môi trường đục, chuyển vàng và có hay không sinh khí trong ống durham. Kết quả âm tính khi môi trường trong, không sinh hơi. 2.6.2.7. Thử nghiệm Protease Mục đích: Xác định khả năng tiết enzyme protease phân huỷ cơ chất casein. Tiến hành: Đĩa petri được phối môi trường MRS có bổ sung casein 1% đã được hấp khử trùng. Đục lỗ đĩa thạch và hút dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic vào các lỗ. Sau đó ủ ở 37°C trong 24 – 48 giờ và đo đường kính vòng phân giải. Kết quả: Vi khuẩn có khả năng phân huỷ casein khi xung quanh lỗ có vòng phân giải, nếu không có thì xung quanh lỗ, môi trường vẫn sẽ đục. 39 Đồ án tốt nghiệp 2.6.2.8. Thử nghiệm Chitinase: Mục đích: Xác định vi khuẩn có khả năng sinh enzyme chitinase phân huỷ chitin. Tiến hành: Đĩa petri được phối môi trường gồm huyền phù chitin 1% bổ sung 2% agar đã được hấp khử trùng. Đục lỗ đĩa thạch và bơm dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic vào các lỗ. Sau đó ủ ở 37°C trong 24 – 48 giờ và nhỏ thuốc thử Lugol rồi đo đường kính vòng phân giải. Kết quả: Vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme chitinase khi môi trường xung quanh tạo quầng sáng không bắt màu thuốc thử Lugol. 2.6.3. Khảo sát khả năng sinh IAA của chủng vi khuẩn Lactobacillus L5. 2.6.3.1. Định tính khả năng sinh IAA Phương pháp Salkowski: Thuốc thử Salkowski sẽ cho màu vàng nhạt đến hồng đậm tuỳ thuộc vào hàm lượng IAA có trong dịch nuôi cấy. Đo bước sóng 530nm. Thu dịch nuôi cấy và li tâm 8000rpm/phút trong 15 phút, lấy 1ml dịch cho vào ống nghiệm dán băng kéo đen , bổ sung 2ml thuốc thử Salkowski, lắc đều, để trong bóng tối 15 phút để phản ứng xảy ra hoàn toàn. Tiến hành đo OD ở bước sóng 530nm, dựa vào đường chuẩn xác định nồng độ IAA tạo thành. 2.6.3.2. Định lượng IAA có trong dịch nuôi cấy Chuẩn bị thuốc thử Salkowski. Lấy 553ml H2SO4 (98%) cho vào nước cất đủ 1 lít, để nguội sau 12 giờ được dung dịch H2SO4 10,8M. Cân 4,5g FeCl3 cho vào 1 lít dung dịch H2SO4 10,8M ở trên. Ta thu được thuốc thử Salkowski. 40 Đồ án tốt nghiệp Chuẩn bị dung dịch IAA các nồng độ chuẩn: Cân 0.01g IAA bổ sung vào 100ml môi trường MRS Broth ban đầu, thu được dung dịch IAA có nồng độ 100mg/l. Pha loãng để thu được dung dịch IAA ở các nồng độ 5, 10, 15, 20, 25 mg/l. Hút 1ml mỗi nồng độ IAA ở trên cho vào ống nghiệm được dán băng keo đen, bổ sung vào mỗi ống 2ml thuốc thử Salkowski, lắc đều, để 15 phút trong tối ở nhiệt độ phòng chờ phản ứng xảy ra hoàn toàn. Tiến hành đo OD ở bước sóng 530nm. Từ kết quả, ta xác định được phương trình đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa chỉ số OD530 và nồng độ IAA (mg/l) gọi tắt là đường chuẩn IAA. 2.6.4. Khả sát khả năng phát triển của chủng nấm Fusarium sp.: Chủng nấm Fusarium sp. Tăng sinh trong môi trường PDB Ủ 25 – 30oC, 24 giờ Cấy điểm sang môi trường PDA và MRS Agar cải tiến Ủ 25 – 30oC,72 giờ Đo đường kính tản nấm xác định khả năng Quan hình hình thái nấm tăng trưởng của nấm 41 Đồ án tốt nghiệp Thuyết minh quy trình: Chủng nấm Fusarium sp. được lấy từ phòng thí nghiệm Trung tâm Ươm tạo, Khu Nông nghiệp Công Nghệ Cao Thành phố Hồ Chí Minh, người thực hiện tiến hành kiểm tra sự phát triển của các chủng nấm, vì chủng nấm mốc cần khoẻ mạnh để làm đề tài. Chủng nấm mốc được tăng sinh trong môi trường PDB sau đó ủ cấy điểm sang đĩa môi trường PDA đã được hấp khử trùng và ủ ở 37°C trong vòng 72 giờ. Sau đó dùng que đục, đục lỗ thạch nấm và chuyển từ môi trường PDA sang môi trường MRS Agar cải tiến, ủ ở 25 – 30°C trong vòng 72 giờ. Tiến hành quan sát hình thái bào tử của chủng nấm bằng phương pháp phòng ẩm. Tiến hành đo đường kính vòng phát triển của tản nấm. 42 Đồ án tốt nghiệp 2.6.5. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp. L5 với chủng nấm Fusarium sp.: Chủng vi khuẩn Chủng nấm Fusarium sp. Lactobacillus sp. L5 Tăng sinh trong môi trường MRS Broth Tăng sinh trong môi trường PDB Ủ 25 – 30oC, 24 giờ Cấy điểm trên môi trường PDA Ủ 37oC, 24 giờ Ủ 25 – 30oC, 72 giờ Đục lỗ Đĩa MRS Agar cải tiến Tỉ lệ ức chế nấm Chủng vi khuẩn lactic L5 được tăng sinh trong môi trường MRS Broth ở 37°C trong 24 giờ, tỉ lệ cấy giống là 5%. Tiến hành khảo sát khả năng kháng nấm. 43 Đồ án tốt nghiệp Môi trường sử dụng là MRS Agar cải tiến, được kẻ 2 đường cách đều mép đĩa 1.5 cm. Chủng nấm được tăng sinh trong môi trường PDB ủ ở 25 – 30oC trong 24 giờ sau đó cấy điểm trên môi trường PDA. Đục thạch nấm với cấy đục lỗ có đường kính 0.5cm và đặt vào tâm đĩa. Ủ ở 25 – 30oC trong 24 giờ. Sử dụng que cấy vòng cấy ria 2 đường đã kẻ trước đó lên đĩa thạch MRS Agar cải tiến có thạch nấm. Đĩa đối chứng âm không cấy ria và Đối chứng dương cấy ria Carbenzym với nồng độ 150µl trong 100ml nước cất và đối chứng cấy ria môi trường nuôi cấy. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần và ủ ở 37°C trong 72 giờ. Sau đó đo đường kính vòng nấm và tính tỉ lệ kháng nấm. Công thức tính tỉ lệ kháng nấm: Dđối chứng− Dthí nghiệm Tỉ lệ kháng nấm (%) = x 100% Dđối chứng Trong đó: Dđối chứng : Đường kính vòng nấm đĩa đối chứng (mm). Dthí nghiệm: Đường kính vòng nấm đĩa thí nghiệm (mm). 44 Đồ án tốt nghiệp 2.6.6. Ảnh hưởng của vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 đến độ khoẻ mầm ở cây bắp Mục đích: Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của cây bắp trong điều kiện phòng thí nghiệm. Tiến hành: Kết quả khảo sát đến độ khoẻ của mầm theo (Abdul Baki and Anderson, 1973) với công thức: Độ khỏe mầm = (Trung bình chiều dài rễ + trung bình chiều dài chồi) x tỷ lệ hạt nảy mầm (%). 45 Đồ án tốt nghiệp 2.6.7. Khảo sát khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy sau gia nhiệt của chủng Lactobacillus sp. L5 với Fusarium sp.: Chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. L5 Tăng sinh trong môi trường MRS Broth Trung hoà pH=6 Không trung hoà Đun nóng ở các Đun nóng ở các mức nhiệt 100oC, mức nhiệt 100oC, Không đun 80oC, 65oC trong Không đun 80oC, 65oC trong 15 phút 15 phút Đĩa MRS Agar cải tiến Chủng nấm mốc trên PDA Ủ 37oC, 72 giờ Đục lỗ Đo đường kính tăng trưởng của tản nấm Tỉ lệ ức chế nấm 46 Đồ án tốt nghiệp Chủng vi khuẩn lactic L5 được tăng sinh trong môi trường MRS Broth ở 37°C trong 24 giờ, tỉ lệ cấy giống là 5%. Dịch nuôi cấy được chia trung hoà về pH=6 bằng NaOH 2N và không trung hoà: 1. Phần trung hoà:  Đun 100oC, 80oC, 65oC trong 15 phút.  Không đun. 2. Phần không trung hoà:  Đun 100oC, 80oC, 65oC trong 15 phút.  Không đun. Tiến hành khảo sát khả năng kháng nấm. Môi trường sử dụng là MRS Agar cải tiến, được kẻ 2 đường cách đều mép đĩa 1.5cm. Chủng nấm được tăng sinh trong môi trường PDB ủ ở 25 – 30oC trong 24 giờ sau đó cấy điểm trên môi trường PDA.Đục thạch nấm với cấy đục lỗ có đường kính 0.5cm và đặt vào tâm đĩa. Ủ ở 25 – 30oC trong 24 giờ. Sử dụng que cấy vòng cấy ria dịch nuôi cấy đun, trung hoà; không đun, trung hoà; đun, không trung hoà và không đun không trung hoà ở các mức nhiệt độ lên 2 đường đã kẻ trước đó trên đĩa thạch MRS Agar cải tiến có thạch nấm. Đĩa đối chứng âm không cấy ria và Đối chứng dương cấy ria Carbenzym với nồng đồ 150µl trong 100ml nước cất và đối chứng cấy ria môi trường nuôi cấy. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần và ủ ở 37°C trong 72 giờ. Sau đó đo đường kính vòng nấm và tính tỉ lệ kháng nấm. 47 Đồ án tốt nghiệp Công thức tính tỉ lệ kháng nấm: Dđối chứng− Dthí nghiệm Tỉ lệ kháng nấm (%) = x 100% Dđối chứng Trong đó: Dđối chứng : Đường kính vòng nấm đĩa đối chứng (mm). Dthí nghiệm: Đường kính vòng nấm đĩa thí nghiệm (mm). 48 Đồ án tốt nghiệp 2.6.8. Khảo sát khả năng ảnh hưởng của dịch buôi cấy chủng Lactobacillus sp. L5 đối với sự nảy mầm của hạt. Chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 Tăng sinh trong môi trường MRS Broth Trung hoà pH=6 Không trung hoà Đun nóng ở các Đun nóng ở các mức nhiệt 100oC, mức nhiệt 100oC, Không đun 80oC, 65oC trong Không đun 80oC, 65oC trong 15 phút 15 phút Hạt bắp đã Xử lí hạt khử trùng bề mặt bằng cồn 70o Đất được hấp khử trùng ở Trồng hạt 121oC trong 20 phút Tỉ lệ nảy mầm, chiều dài cây, sinh khối cây 49 Đồ án tốt nghiệp Chủng vi khuẩn lactic L5 được tăng sinh trong môi trường MRS Broth ở 37°C trong 24 giờ, tỉ lệ cấy giống là 5%. Dịch nuôi cấy được chia trung hoà về pH=6 bằng NaOH 1N và không trung hoà: 1. Phần trung hoà:  Đun 100oC, 80oC, 65oC trong 15 phút.  Không đun. 2. Phần không trung hoà:  Đun 100oC, 80oC, 65oC trong 15 phút.  Không đun. Tiến hành khảo sát khả năng nảy mầm của hạt bắp: Hạt bắp được lựa chọn cảm quan với những hạt to khoẻ, không bị tổn thương vật lí, lá mầm không bị đen. Hạt bắp sau đó được rửa bằng các ngâm trong cồn 70 trong 30 giây sau đó rửa lại bằng nước cất. Chủng vi khuẩn được tăng sinh trong erlen sau đó cho hạt bắp và ngâm trong mỗi nghiệm thức: NT1: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy trung hoà, đun 100oC trong 15 phút. NT2: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy không trung hoà, đun 100oC trong 15 phút. NT3: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy trung hoà, đun 80oC trong 15 phút. NT4: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy không trung hoà, đun 80oC trong 15 phút. NT5: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy trung hoà, đun 65oC trong 15 phút. NT6: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy không trung hoà, đun 65oC trong 15 phút. 50 Đồ án tốt nghiệp NT7: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy trung hoà, không đun. NT8: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy không trung hoà, không đun. NT9: Hạt ngâm trong nước NT10: Hạt không ngâm NT11: Hạt ngâm trong dịch Carbenzim 0,15%. Đất Tribat được mua tại vườn cây cảnh sau đó được hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút để loại bỏ vi khuẩn, nấm lẫn trong đất. Sau đó đất được chia ra từng ly nhựa với lượng đất bằng nhau, gieo mỗi cốc 3 hạt với mỗi nghiệm thức trồng 36 hạt. Canh thời gian nảy mầy của hạt, tính tỉ lệ nảy mầm, sinh khối, thân, lá, rễ so sánh với hạt ngâm trong nước và hạt không ngâm. 51 Đồ án tốt nghiệp 2.6.9. Khảo sát khả năng ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus spp. L5 có cảm nhiễm nấm mốc đối với sự nảy mầm của hạt. Chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 Tăng sinh trong môi trường MRS Broth Trung hoà pH=6 Không trung hoà Đun nóng ở Đun nóng ở các mức các mức Không đun Không đun nhiệt 100oC, nhiệt 100oC, 80oC, 65oC 80oC, 65oC trong 15 trong 15 Xử lí hạt Hạt bắp đã khử trùng bề mặt bằng 2 Cảm nhiễm nấm 1cm nấm trên đĩa cồn 70o thạch trên 1 gam hạt Đất được hấp khử Trồng hạt trùng ở 121oC Tỉ lệ nảy mầm, chiều dài cây, sinh khối cây 52 Đồ án tốt nghiệp Chủng vi khuẩn lactic L5 được tăng sinh trong môi trường MRS Broth ở 37°C trong 24 giờ, tỉ lệ cấy giống là 5%. Dịch nuôi cấy được chia trung hoà về pH=6 bằng NaOH 2N và không trung hoà: . Phần trung hoà:  Đun 100oC, 80oC, 65oC trong 15 phút.  Không đun. . Phần không trung hoà:  Đun 100oC, 80oC, 65oC trong 15 phút.  Không đun. Tiến hành khảo sát khả năng nảy mầm của hạt bắp: Hạt bắp được lựa chọn cảm quan với những hạt to khoẻ, không bị tổn thương vật lí, lá mầm không bị đen. Hạt bắp sau đó được rửa bằng các ngâm trong cồn 70 30 giây sau đó rửa lại bằng nước cất. Hạt được cảm nhiễm nấm Fusarium sp. Với diện tích 1cm2 tản nấm trên 1 gam hạt. Chủng vi khuẩn được tăng sinh trong erlen sau đó cho hạt bắp và ngâm trong mỗi nghiệm thức trong 30 phút NT1: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy trung hoà, đun 100oC trong 15 phút. NT2: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy không trung hoà, đun 100oC trong 15 phút. NT3: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy trung hoà, đun 80oC trong 15 phút. NT4: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy không trung hoà, đun 80oC trong 15 phút. NT5: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy trung hoà, đun 65oC trong 15 phút. 53 Đồ án tốt nghiệp NT6: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy không trung hoà, đun 65oC trong 15 phút. NT7: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy trung hoà, không đun. NT8: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy không trung hoà, không đun. NT9: Hạt ngâm trong nước NT10: Hạt không ngâm NT11: Hạt ngâm trong dịch Carbenzim 0,15%. Đất Tribat được mua tại vườn cây cảnh sau đó được hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút để loại bỏ vi khuẩn, nấm lẫn trong đất. Sau đó đất được chia ra từng li với lượng đất bằng nhau, gieo mỗi cốc 3 hạt với mỗi nghiệm thức trồng 36 hạt. Canh thời gian nảy mầy của hạt, tính tỉ lệ nảy mầm, sinh khối, thân, lá, rễ so sánh với hạt ngâm trong nước và hạt không ngâm. 54 Đồ án tốt nghiệp 2.3.9. Ứng dụng sử dụng dịch nuôi cấy bảo quản hạt bắp Hạt bắp Khử trùng bề mặt bằng cồn Ngâm trong dịch nuôi cấy 30 phút Để khô ở nhiệt độ phòng Huyền phù nấm 2 Chai thuỷ tinh 100ml mốc 10 bào tử Bảo quản ở nhiệt độ phòng Theo dõi theo thời gian Hạt bắp được lựa chọn cảm quan, mẩy, không bị tổn thương vật lí, lá mầm không bị đen, được ngâm trong cồn 70° để khử trùng bề mặt và rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 lần. Sau đó để ráo. Cứ mỗi 12g bắp, sẽ được ngâm trong 100ml dịch nuôi cấy được chuẩn bị như sau: NT1: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy trung hoà, đun 100oC trong 15 phút. NT2: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy không trung hoà, đun 100oC trong 15 phút. NT3: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy trung hoà, đun 80oC trong 15 phút. 55 Đồ án tốt nghiệp NT4: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy không trung hoà, đun 80oC trong 15 phút. NT5: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy trung hoà, đun 65oC trong 15 phút. NT6: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy không trung hoà, đun 65oC trong 15 phút. NT7: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy trung hoà, không đun. NT8: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy không trung hoà, không đun. NT9: Hạt ngâm trong nước NT10: Hạt ngâm trong dịch Carbenzim 0,15%. Sau khi ngâm 30 phút, hạt sẽ được để khô. Cảm nhiễm bằng 0,1ml huyền phù nấm chứa 1cm thạch nấm trong 100ml nước muối bổ sung Tween 80 0,2% trên 1 gam hạt. Sau đó tiến hành quan sát. 56 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Khảo sát sinh lý, sinh hóa và tính thuần của chủng Lactobacillus sp. L5 Chủng Lactobacillus sp. L5 được lấy từ ống giống khoa CNSH – TP – MT, Trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh. Đã được sử dụng và nghiên cứu qua các đồ án tốt nghiệp cho thấy chúng có khả năng kháng nấm. Nên người thực hiện đề tài đã sử dụng chúng vi khuẩn LAB này sử dụng cho đề tài. Để khẳng định tính thuần, sinh enzyme ngoại bào người thực hiện đề tài đã hoạt hoá từ ống giống bảo quản lạnh đông và kiểm tra một số đặc điểm thường có của chủng Lactobacillus sp. L5 để đề tài được thực hiện với độ tin cậy cao. 3.1.1. Hình thái khuẩn lạc trên đĩa MRS Agar Hình 3.1: Khuẩn lạc Lactobacillus sp. L5 trên đĩa MRS Agar (Trái) và khuẩn lạc quan sát dưới kín hiển vi (phải). Kết quả: Khuẩn lạc Lactobacillus sp. L5 có hình tròn bóng lồi, bờ đều, màu trắng đục. 57 Đồ án tốt nghiệp 3.1.2. Hình thái tế bào Nhuộm Gram: Hình 3.2: Vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 sau nhuộm Gram. Kết luận: Chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 là vi khuẩn Gram dương do bắt màu tím dưới thuốc thử bổ sung, hình que, có thể đứng đơn lẻ hay theo cụm hay chuỗi. Nhuộm bào tử: Hình 3.3: Vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 sau nhuộm bào tử. Chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 bắt màu hồng do thuốc thử bổ sung và do không sinh bào tử. 58 Đồ án tốt nghiệp 3.1.3. Thử nghiệm Catalase Hình 3.4: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 (Từ trái qua phải): Thử nghiệm âm tính của L5, Đối chứng âm vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 trong nước cất, Thử nghiệm dương tính đối với Bacillus spp. Kết quả thử nghiệm cho thấy chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 không có khả năng sinh catalase. Thử nghiệm được so sánh với chủng vi khuẩn Bacillus spp. 3.1.4. Khả năng di động Ở vi khuẩn có tiên mao, chúng sẽ có khả năng di động, vì vậy trong môi trường thạch mềm, chúng sẽ phát triển lan sang môi trường xung quanh vết cấy chứ không mọc theo vết cấy, tạo thành những vệt mờ đục môi trường. Vi khuẩn lactic là vi khuẩn hiếu khí chịu oxy nên chúng vừa có thể phát triển ở phía trên vừa có thể phát triển ở sâu trong môi trường ở những chủng không có tiên mao, chúng sẽ tăng sinh khối theo vết cấy vì chúng không có khả năng di chuyển, vì vậy ta thấy một vệt thẳng theo vết cấy. 59 Đồ án tốt nghiệp Khi ta ủ vi khuẩn sau 24 giờ ở 37oC, do ống nghiệm được bịt kín nên nếu có khí sinh ra sẽ đẩy phần thạch trồi lên so với đáy ống. Hình 3.5: Khả năng di động của chủng Lactobacillus sp. L5 (A: ĐC Bacillus spp.; B: Chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 ). Kết quả: Chủng Lactobacillus sp. L5 không lan rộng chỉ tăng sinh khôi theo đường cấy và không sinh hơi so với đối chứng chủng Bacillus spp. mọc lan và sinh hơi đẩy thạch lên cao so với thử nghiệm. 60 Đồ án tốt nghiệp 3.1.5. Hàm lượng acid tổng Để thử nghiệm môi trường khảo sát kháng nấm tốt, người thực hiện đề tài tiến hành thử nghiệm xác định hàm lượng acid tổng để khẳng định chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh acid lactic cao, có hoạt tính kháng nấm tốt. Kết quả hàm lượng % acid lactic của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 được nuôi cấy trong môi trường MRS broth ở 37oC trong 24 giờ. Bảng 3.1: Hàm lượng % acid lactic của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 Chủng % Acid tổng trung bình OD hiệu chỉnh trung bình Lactobacillus sp. L5 1,3 2,3 3.1.6. Khả năng lên men đường Theo cơ chế trao đổi chất, LAB có thể thuộc nhóm lên men đồng hình hoặc nhóm lên men dị hình. Đối với lên men đồng hình, acid lactic là sản phẩm duy nhất theo con đường đường phân, đối với lên men dị hình vì sử dụng con đường 6- phosphogluconate/phosphoketolase vì thế thì ngoài acid lactic còn có CO2. Như vậy, khi lên men nếu chỉ sinh acid, không sinh khí thì LAB thuộc nhóm lên men đồng hình. Ngược lại nếu cả acid và khí tạo thành LAB thuộc nhóm lên men dị hình. Các chủng LAB khác nhau có khả năng lên men các con đường khác nhau.Kết quả lên men các loại đường cho thấy vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 có khả năng lên men đồng hình đường Saccarose, Glucose, lên men dị hình Lactose và không có khả năng lên men Xylose. Chủng Lactobacillus sp. L5 có khả năng lên men Saccarose, Glucose, Lactose và không có khả năng lên men Xylose. 61 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2: Khả năng lên men các loại đường của Lactobacillus sp. L5 Loại đường Saccarose Lactose Glucose Xylose Kết quả + + + - Hình 3.6: Khả năng lên men các loại đường của Lactobacillus sp. L5 3.1.7. Thử nghiệm Chitinase Hình 3.7: Thử nghiệm chitinase của chủng Lactobacillus sp. L5 62 Đồ án tốt nghiệp Từ kết quả kháng nấm trực tiếp, người thực hiện đề tài thử nghiệm khả năng sinh enzyme ngoại bào gồm chitinase và protease. Kết quả cho thấy chủng Lactobacillus sp. L5 có khả năng phân giải chitin sau khi gia nhiệt ở 100C, 80C, 65C. 3.1.8. Thử nghiệm Protease Hình 3.8: Thử nghiệm protease của chủng Lactobacillus sp. L5 Từ kết quả kháng nấm trực tiếp, người thực hiện đề tài thử nghiệm khả năng sinh enzyme ngoại bào gồm chitinase và protease. Kết quả cho thấy chủng Lactobacillus sp. L5 có khả năng phân giải protease sau khi gia nhiệt ở 100C, 80C, 65C. Kết luận: Như vậy qua các kết quả trên người thực hiện đề tài khẳng định giống Lacotbacillus sp. L5 thuần khiết, sinh enzyme ngoại bào Chitinase, Protease, âm tính với Catalase, không di động, sinh acid lactic phù hợp cho các thí nghiệm của đề tài. 63 Đồ án tốt nghiệp 3.2. Định tính và định lượng IAA có trong dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5. Basavaraj M. Kuraber và cộng sự (2012) đã nghiên cứu về khả năng sinh IAA của các chủng để kích thích khả năng sinh trưởng và phát triển của các loại hạt. Người thực hiện đề tài đã kiểm tra khả năng sinh IAA trong dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây. Hình 3.9: Dịch nuôi cấy sau ly tâm đổi màu khi cho thuốc thử so với ĐC. Bảng 3.3: Kết quả biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo nồng độ IAA. Thể tích IAA 100m/l (ml) 0 5 10 15 20 25 Thể tích môi trường MRS 100 95 90 85 80 75 Nồng độ IAA (µg/ml) 0 5 10 15 20 25 Số đo 0D 530 0 0.156 0.258 0.423 0.540 0.653 64 Đồ án tốt nghiệp ĐƯỜNG CHUẨN IAA 0.7 0.6 y = 0.0262x + 0.011 R² = 0.9964 0.5 0.4 0.3 OD530nm 0.2 0.1 0 0 5 10 15 20 25 30 Nồng độ IAA ( µg/ml) Hình 3.10: Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa chỉ số OD530nm và nồng độ IAA (μg/ml) Sau khi đo quang dịch nuôi cấy của chủng Lactobacillus sp. L5 và đường chuẩn tính được nồng độ IAA có trong dịch nuôi cấy sau 24 giờ là 3,1 μg/ml. Như vậy chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 có khả năng sinh IAA. 3.2 Khảo sát khả năng phát triển của các chủng nấm Fusarium sp.: Nấm Fusarium sp. Là loại nấm có nhiều trong đất tự nhiên, phát triển mạnh, gây hại cho rễ cây như bắp, cà chua, hồ tiêu. Chúng có thể xuất hiện ở hạt gây ngộ độc cho các loại gia súc khi ăn phải. Trong khi đó đã có nhiều đề tài sử dụng chủng LAB kháng các loại nấm Aspergillus spp. trong các đề tài tốt nghiệp trước nên người thực hiện đề tài chọn chủng nấm mốc Fusarium sp. Để tiến hành khảo sát khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5. Sau khi lấy chủng nấm mốc người thực hiện đề tài đã tiến hành khảo...00 Đun 80 Đun 65 Không đun Môi trường Trung hoà K TH Carbenzim Hình 3.14: Đồ thị thể hiện sự ảnh hưởng của chế độ xử lý nhiệt dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 lên khả năng kháng Fusarium sp. Kết quả sau khi xử lý số liệu trên ANOVAvà phần mềm Excel từ bảng và hình cho thấy: Tỉ lệ ức chế chủng nấm Fusarium sp. ở thí nghiệm không đun trung hoà pH và không đun không trung hoà cho kết quả đối kháng cao gần như tương đương với đối chúng Carbenzim, cụ thể tỉ lệ kháng của NT không đun, trung hoà p H là 57,2%, không đun không trung hoà là 50,9% và đối chứng Carbenzim 0,15%, là 60,7%. Khi đun ở 65oC trung hoà và không trung hoà tỉ lệ kháng có giảm nhưng không đáng kể so với đối chứng Carbenzim 0,15% là 49,6%, 43,8% và 61,3%. Tuy nhiên khi đun ở 80oC và 100oC trung hoà và không trung hoà thì tỉ lệ kháng nấm Fusarium sp. giảm rõ rệt cụ thể ở 100oC trung hoà là 17%, không trung hoà là 10,7%. Ở 80oC trung hoà là 34,3%, không trung hoà chỉ còn 20.3%. Có sự khác biệt so với đối chứng carbenzim. Người thực hiện đề tài cũng đã thử ảnh hưởng của môi 70 Đồ án tốt nghiệp trường nuôi cấy chủng Lactobacillus sp. L5 có ảnh hưởng tới sự kháng nấm mốc không, kết quả chỉ kháng 5 – 7% so với đối chứng là 60,7% của Carbenzim. Như vậy người thực hiện đề tài thấy rằng khi gia nhiệt ở các mức nhiệt 65oC, 80oC và 100oC, tỉ lệ kháng giảm dần. So với kết quả kháng nấm Aspergillus sp. CĐP1 của Bích Trâm (2016) thì tỉ lệ kháng là 65.85%, sau khi gia nhiệt tỉ lệ kháng giảm còn 33.54%; chứng tỏ tác nhân kháng nấm là có thể là protein, có thể enzyme ngoại bào. Tuy nhiên enzyme ngoại bào bị bất hoạt khi gia nhiệt lên cao. Hình 3.15: Khả năng ức chế nấm của chủng Lacotbacillus sp. L5 sau khi gia nhiệt. (I: Không gia nhiệt; II: Đun 100oC; III: Đun 80oC; IV: ĐUN 65oC) 71 Đồ án tốt nghiệp 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 đối với sự phát triển của hạt bắp. 3.5.1. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới thời gian nảy mầm. Bảng 3.7: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới thời gian nảy mầm. THỜI GIAN NẢY MẦM (Giờ) Nghiệm thức Cảm nhiễm Không CN Carbenzim 72-74 70-72 Nước cất 72-73 68-71 Đun 100, TH 70-72 68-71 Đun 100, KTH 70-72 68-71 Đun 80, TH 71-73 70-72 Đun 80, KTH 71-73 71-72 Đun 65, TH 71-73 71-72 Đun 65, KTH 74-75 72-73 K Đun, TH 74-75 71-73 K Đun, KTH 74-75 72-73 72 Đồ án tốt nghiệp THỜI GIAN NẢY MẦM 76 (Giờ) 74 72 70 68 66 64 62 CN KCN Hình 3.16: Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của dịch nuôi cấy trước và sau gia nhiệt đối với thời gian nảy mầm của hạt bắp. Kết quả sau khi xử lý số liệu trên ANOVAvà phần mềm Excel từ bảng 3.7 và hình 3.16 cho thấy: Dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 ảnh hưởng tới thời gian nảy mầm của hạt nhưng không đáng kể. Ở thí nghiệm đun 100oC cho thời gian nảy mầm từ 68-70 giờ sau khi gieo tương đương với đối chứng dương và âm là carbenzim và nước, và thời gian nảy mầm tăng dần KHI sự gia nhiệt giảm dần. Khi đun ở 80oC thời gian nảy mầm của hạt tăng lên khoảng từ 70-71 giờ sau khi gieo, nhiều hơn không đáng kể so với đối chứng. Khi gia nhiệt ở 65oC và không gia nhiệt thì thời gian nảy mầm tương đương nhau và lâu hơn so với đối chứng carbenzim, nước khoảng từ 71-74 giờ sau khi gieo. 73 Đồ án tốt nghiệp Người thực hiện đề tài cũng đã thử ảnh hưởng thời gian nảy mầm của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp. L5 khi đối kháng nấm mốc bằng cách cảm nhiễm nấm vào hạt trước khi gieo, kết quả cho thấy nấm mốc làm cho thời gian nảy mầm của hạt chậm hơn khoảng 1-3 giờ so với hạt không nhiễm nấm. Như vậy người thực hiện đề tài thấy rằng khi gia nhiệt ở các mức nhiệt 100oC, 80oC và 65oC, thời gian nảy mầm giảm dần, chứng tỏ tác nhân ảnh hưởng đến thời gian nảy mầm là enzyme ngoại bào. 3.5.2. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới tỉ lệ nảy mầm. Bảng 3.8: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới tỉ lệ nảy mầm. TỈ LỆ NẢY MẦM (%) Nghiệm thức Cảm nhiễm Không CN Carbenzim 70 70 Đối chứng (-) 81,48 83,24 Đun 100, TH 81,4 85,2 Đun 100, K TH 78,3 85,2 Đun 80, TH 70,4 76,8 Đun 80, K TH 74,27 85,2 Đun 65, TH 81,48 85,18 Đun 65, K TH 74,27 85,2 K Đun, TH 81,4 79,6 Không đun, K TH 81,48 88,89 74 Đồ án tốt nghiệp TỈ LỆ NẢY MẦM 100 (%) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 CN Không CN Hình 3.17: Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới tỉ lệ nảy mầm. Kết quả sau khi xử lý số liệu trên ANOVA và phần mềm Excel từ bảng 3.8 và hình 3.17 cho thấy: Khi ngâm với Carbenzim tỉ lệ nảy mầm của hạt bị ức chế cho nên Carbenzim đã ảnh hưởng không tốt đến quá trình nảy mầm của hạt bắp. Trong khi đó ở các nghiệm thức khác lại cho tỉ lệ nảy mầm là tương đối đồng đều và có phần tốt hơn so với carbenzim. Và cao nhất là nghiệm thức không đun, không trung hòa là 88.9% cao hơn so với carbenzim (70%). Tuy nhiên ở các nghiệm thức có cảm nhiễm nấm tỉ lệ nảy mầm thấp hơn so với các nghiệm thức không cảm nhiễm nấm. Ví dụ như ở nghiệm thức đun 65oC trung hoà không cảm nhiễm nấm có tỉ lệ nảy mầm là 85,2% trong khi đó khi cảm nhiễm nấm giảm 11% phần trăm chỉ còn 74,3% nhưng vẫn cao hơn đối chứng Carbenzim là 70%. 75 Đồ án tốt nghiệp Ở giai đoạn này nấm chưa có tác động cụ thể đến rễ cây nên kết quả chưa xác định cụ thể được nên người thực hiện đề tài tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy của Lactobacillus sp. L5 đối với chủng nấm mốc Fusarium sp về chiều cao cây, chiều dài rễ và sinh khối tươi của cây bắp ở các nghiệm thức khác nhau. 3.5.3. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới chiều cao. Bảng 3.9: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đối với chiều cao của cây bắp ngày 7. CHIỀU CAO CÂY (mm) Nghiệm thức Cảm nhiễm Không CN Carbenzim 170i ± 10 180,7i ± 5,8 Nước cất 192,3fgh ± 2,5 195,7efgh ± 4,6 Đun 100, TH 246b ± 3 255,3a ± 5 Đun 100, KTH 227,3d ± 4 238c ± 2 Đun 80, TH 234,7cd ± 3,2 247,3c ± 4 Đun 80, KTH 228,7d ± 1,5 238c ± 3 Đun 65, TH 198ef ± 2,6 202e ± 5,6 Đun 65, KTH 190hg ± 7,5 197,3efg ± 3,2 K Đun, TH 191,3fhg ± 1,5 194efgh ± 4,4 K Đun, KTH 188,3h ± 3,1 189,7h ± 4,9 76 Đồ án tốt nghiệp CHIỀU CAO CÂY SAU 7 NGÀY 300 250 (mm) 200 150 100 50 0 CN KCN Hình 3.18: Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới chiều cao cây bắp sau 7 ngày. Kết quả sau khi xử lý số liệu trên ANOVA và phần mềm Excel từ bảng 3.10 và hình 3.19 cho thấy: Dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 ảnh hưởng tích cực đến khả năng tăng chiều cao cây, đặc biệt là đối với dịch đun 100oC trung hòa cho tỷ lệ tăng chiều cao rõ rệt nhất 255mm so với carbenzim (195mm) và nước (180mm). Chiều cao cây giảm sau khi cảm nhiễm nấm với tỷ lệ trung bình là 8mm. Số liệu sau khi được xử lí thông kê cho thấy, dịch nuôi cấy sau khi gia nhiệt 100oC, trung hòa xếp hạng cao hơn so với nước và carbenzim với độ tin cậy là 95%. Ngoài ra, dịch nuôi cấy không gia nhiệt, khả năng ức chế nấm và khả năng phát triển chiều cao cây là tương đương nhau, xếp hạng xấp xỉ và cao hơn so với nước và carbenzim. 77 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.19: Chiều cao cây NT THKCN sau 7 ngày. Hình 3.20: Chiều cao cây NT THCN sau 7 ngày. 78 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.21: Chiều cao cây ở NT KTHKCN sau 7 ngày Hình 3.22: Chiều cao cây ở NT THKCN sau 7 ngày 79 Đồ án tốt nghiệp 3.5.4. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới chiều dài rễ Bảng 3.10: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới rễ sau 7 ngày CHIỀU DÀI RỄ (mm) Nghiệm thức Cảm nhiễm Không CN Carbenzim 170edf ± 2 180,3d ± 2,1 Nước cất 83,7j ± 4,2 84,3j ± 1,5 Đun 100, TH 192bc ± 6,5 204a ± 10,1 Đun 100, KTH 187,7c ± 5,1 198,3ab ± 2,5 Đun 80, TH 179,3ed ± 3,5 195,3b ± 6 Đun 80, KTH 176edf ± 4,6 180d ± 3,6 Đun 65, TH 165g ± 3,6 171gf ± 4,6 Đun 65, KTH 156,7h ± 5,7 172,3ef ± 4,6 K Đun, TH 86j ± 3,6 94,3i ± 1,5 K Đun, KTH 87,7ij ± 2,1 94,3i ± 0,6 80 Đồ án tốt nghiệp CHIỀU DÀI RỄ SAU 7 NGÀY 250 (mm) 200 150 100 50 0 CN KCN Hình 3.23: Đồ thị thể hiện chiều dài rễ ở các nghiệm thức sau 7 ngày. Kết quả sau khi xử lý số liệu trên ANOVA và phần mềm Excel từ bảng 3.11 và hình 3.24 cho thấy: Dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 ảnh hưởng tích cực đến khả năng phát triển rễ, cao nhất là dịch đun 100oC trung hòa cho tỷ lệ tăng chiều là 204 mm, tăng trung bình khoảng 25 mm so với carbenzim và 120 mm so với nước. Chiều dài rễ giảm sau khi cảm nhiễm nấm với tỷ lệ trung bình là 9 mm. Kết quả sau khi xử lý số liệu trên ANOVA cho thấy, dịch nuôi cấy sau khi gia nhiệt 100oC, trung hòa xếp hạng cao hơn so với nước và carbenzim với độ tin cậy là 95%. Ngoài ra, khả năng ức chế nấm và khả năng phát triển rễ là tương đương nhau nhưng khi gia nhiệt càng cao thì khả năng tăng trưởng càng tốt. 81 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.24: Chiều dài rễ cây bắp ở NT THKCN sau 7 ngày. Hình 3.25: Chiều dài rễ cây bắp ở NT THCN sau 7 ngày. 82 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.26: Chiều dài rễ cây bắp ở NT KTH KCN sau 7 ngày. Hình 3.27: Chiều dài rễ cây bắp ở NT KTHCN sau 7 ngày. 83 Đồ án tốt nghiệp 3.5.5. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới sinh khối tươi. Bảng 3.11: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới sinh khối tươi sau 7 ngày. SINH KHỐI TƯƠI (mg) Nghiệm thức Cảm nhiễm Không CN Carbenzim 897,4j ± 11,5 987,4j ± 35,2 Nước cất 1131,3hi ± 55,2 1220hg ± 70 Đun 100, TH 1810cd ± 60,8 2560a ± 45,8 Đun 100, KTH 1781d ± 47,1 2173,3b ± 76,4 Đun 80, TH 1536,7e ± 51,3 2103,3b ± 23,1 Đun 80, KTH 1570g ± 26,5 1876,7c ± 45,1 Đun 65, TH 1263,3g ± 95 1490ef ± 75,5 Đun 65, KTH 1296,7g ± 57,7 1520ef ± 34,6 K Đun, TH 1166,7hi ± 49,3 1433,3f ± 34,6 K Đun, KTH 1106,7i ± 49,3 1300g ± 34,6 84 Đồ án tốt nghiệp SINH KHỐI TƯƠI 3000 (mg) 2500 2000 1500 1000 500 0 Cảm nhiễm Không CN Hình 3.28: Biểu đồ thể hiện sinh khối tươi của cây ở các NT sau 7 ngày. Kết quả sau khi xử lý số liệu trên ANOVA và phần mềm Excel từ bảng 3.12 và hình 3.29 cho thấy: Sinh khối tươi của cây sau khi ngâm dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tốt hơn so với carbenzim và nước, cao nhất là dịch đun 100oC trung hòa cho tỷ lệ sinh khối tươi là 2560 mg, cho sinh khối tươi nhiều hơn so với nước (1220 mg) và carbenzim (987.4 mg). Sinh khối tươi sau khi cảm nhiễm nấm sẽ có sự chênh lệch không đáng kể với khi chưa cảm nhiễm với tỷ lệ trung bình là 310 mg. Kết quả sau khi sau xử lý số liệu cho thấy, dịch nuôi cấy sau khi gia nhiệt 100oC, trung hòa xếp hạng cao nhất và hơn hẳn so với nước và carbenzim với độ tin cậy là 95%. Ngoài ra, khả năng ức chế nấm tương đương nhau và khả năng tăng sinh khối tươi tăng khi gia nhiệt lên cao, tác nhân ức chế nấm và kích thích sinh trưởng ngoài enzyme còn có tác nhân khác cần tìm hiểu. 85 Đồ án tốt nghiệp 3.5.6. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đến độ khoẻ của cây. Bảng 3.12: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đến độ khoẻ mầm sau 7 ngày Độ khoẻ của mầm N7 Cảm nhiễm Không cảm nhiễm Carnbenzim 280,4f ± 9,1 291e ± 4,5 Nước cất 194,3j ± 1,9 228,2i ± 4,9 Đun 100, TH 357b ± 4,9 374,4a ± 9,4 Đun 100, K TH 292,2e ± 1,4 355,6b ± 2,1 Đun 80, TH 337,4c ± 4,3 360,8b ± 4,2 Đun 80, KTH 284,9ef ± 3,9 340,7c ± 0,8 Đun 65, TH 255,6g ± 3,1 304d ± 8,2 Đun 65, KTH 244h ± 6,2 301,3d ± 1,6 Không đun, TH 195,2j ± 3,5 235i ± 2,5 Không đun, K TH 194,3j ± 3,2 231,5i ± 4,2 86 Đồ án tốt nghiệp 400 70 350 60 300 50 250 40 200 30 150 100 20 Tỉ lệ lệ Tỉ (%) chế ức Độ khỏe khỏe Độ của mầm 50 10 0 0 Cảm nhiễm Không cảm nhiễm Tỉ lệ đối kháng (%) 400 70 350 60 300 50 250 40 200 150 30 100 20 Độ khỏe mầm khỏe Độ mầm 50 10 lệ Tỉ (%) chế ức 0 0 Cảm nhiễm Không cảm nhiễm Tỉ lệ đối kháng (%) Hình 3.29: Đồ thị biểu thị độ khoẻ của mầm cây bắp sau 7 ngày Kết quả sau khi xử lý số liệu trên ANOVA và phần mềm Excel từ bảng 3.9 và hình 3.18 cho thấy: Độ khỏe của mầm sau khi ngâm dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tốt hơn so với nước (100%) và đối với hạt đã cảm nhiễm nấm thì tỷ lệ trung bình giảm 87 Đồ án tốt nghiệp 19% so với chưa cảm nhiễm. Mầm khỏe nhất khi ngâm trong dịch đun 100C, trung hòa (197.7%), tốt hơn so với nước 92.7%. So với dịch không đun thì tốt hơn (67%) nhưng khả năng kháng nấm thì giảm 41%. Sau khi xử lí số liệu cho thấy, dịch nuôi cấy sau khi gia nhiệt 100C, trung hòa xếp hạng cao hơn so với nước, với độ tin cậy là 95%. Ngoài ra, dịch nuôi cấy sau khi gia nhiệt tuy hoạt tính kháng nấm giảm nhưng vẫn có khả năng ức chế và lại kích thích tăng trưởng cho cây, ngoài tác nhân kháng nấm và kích thích tăng trưởng là enzyme còn có tác nhân kháng cần phải tìm hiểu. 88 Đồ án tốt nghiệp 3.6. Ứng dụng dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 trong bảo quản hạt. Thí nghiệm này nhằm xác định thời gian kháng nấm tối đa ở các nghiệm thức dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 đối với nấm Fusarium sp. Kết quả được trình bày ở bảng 3.12 và hình 3.30: Bảng 3. 13: Khả năng kháng nấm của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 ở các nghiệm thức ứng dụng bảo quản hạt bắp. Ngày 1 3 5 7 10 14 21 Nhày bắt đầu mọc nấm Carbenzim 0,15% - - - - + ++ ++ 10 ĐC (Nước cất) - + ++ +++ ++++ ++++ ++++ 3 Đun 100, THCN - + ++ +++ ++++ ++++ ++++ 3 Đun 100, KTHCN - + ++ +++ ++++ ++++ ++++ 3 Đun 80, THCN - - + ++ +++ ++++ ++++ 5 Đun 80, KTHCN - + + ++ +++ ++++ ++++ 3 Đun 65, THCN - - - - + ++ +++ 10 Đun 65, KTHCN - - - - + ++ +++ 10 K Đun, THCN - - - - + ++ ++++ 10 K Đun, KTHCN - - - - + ++ +++ 10 (+: bắt đầu xuất hiện nấm, ++: nấm mọc tơ trắng; +++ nấm mọc dày tơ dài có màu xanh; ++++ nấm mọc dày khắp bề mặt hạt có màu xanh). 89 Đồ án tốt nghiệp 90 Đồ án tốt nghiệp 91 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.30: Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của các nghiệm thức dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 (Từ trái qua: Ngày 1, ngày 3, ngày 5, ngày 7, ngày 10, ngày 14, ngày 21. Từ trên xuống: ĐC (+) Đối chứng Carbenzim 0,15%, ĐC (-) Đối chứng nước cất, NT 1 100TH, NT2 100KTH, NT3 80TH, NT4 80KTH, NT5 65TH, NT6 65KTH, NT7 KĐTH, NT8 KĐKTH). ĐC (+) Đối chứng Carbenzim: Nấm mốc phát triển sau 10 ngày. ĐC (-) Đối chứng nước cất: Nấm mốc bắt đầu mọc ở ngày thứ 3 và phát triển khá mạnh. 92 Đồ án tốt nghiệp NT1 100TH: Nấm mốc bắt đầu mọc vào ngày 3 và phát triển khá mạnh cho thấy tỉ lệ kháng nấm thấp ứng với thí nghiệm invitro tỉ lệ kháng nấm chỉ 17%. NT2 100KTH: Nấm mốc cũng mọc vào ngày 3 và phát triển mạnh ứng với tỉ lệ đối kháng invitro là 10,7%. NT3 80TH: Nấm mốc bắt đầu mọc và phát triển từ ngày 5. NT4 80KTH: Nấm mốc bắt đầu mọc và phát triển ở ngày 3. NT5 65TH: Ở nghiệm thức này nấm mốc bắt đầu mọc và phát triển ở ngày 10. NT6 65KTH: Nấm mốc mọc và phát triển ở ngày 10. NT7 KĐTH: Nấm mốc bắt đầu mọc và phát triển ở ngày 10. NT8 KĐKTH: Nấm mốc bắt đầu mọc và phát triển ở ngày 10. Qua kết quả từ bảng 3.13 và hình 3.30 cho thấy khi gia nhiệt lên càng cao tỉ lệ kháng nấm càng giảm. Cụ thể ở NT KĐTH và KĐKTH bảo quản được 14 ngày nhưng khi gia nhiệt lên cao ở 65oC giảm còn 7 ngày, lên 80oC còn 5 ngày và 100oC chỉ đc 3 ngày bằng với đối chứng ngâm nước cất. THẢO LUẬN Từ các kết quả khảo sát khả năng kháng nấm và kích thích tăng trưởng từ chủng Lactobacillus sp. L5, người thực hiện đề tài đề xuất sản xuất chế phẩm sinh học kháng nấm để bảo quảo hạt và chế phẩm vừa kích thích tăng trưởng vừa kháng đc nấm nhằm nâng cao khả năng bảo quản hạt và kích thích tăng trưởng của hạt mà không sử dụng đến các hợp chất hoá học dư lượng trong hạt và ảnh hưởng đến chất lượng của hạt trong sản xuất. 93 Đồ án tốt nghiệp ĐỀ NGHỊ QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG VÀ KHÁNG NẤM FUSARIUM SP. CỦA CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS SP. L5 Mật rỉ Xử lý Chuẩn bị môi trường nuôi cấy Giống vsv LAB Tiệt trùng Nhân giống trên MRS broth ở 37C Nuôi cấy ở 37C, 24 giờ trong 1 ngày Gia nhiệt ở 65C Phối trộn trong 15 phút Phối trộn Chế phẩm kích Chế phẩm bảo thích nảy mầm hạt quản hạt 94 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 ban đầu được khẳng định là chủng vi khuẩn lactic bằng các biện pháp sinh hoá, sinh lý, hình thái. Chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 được xác định là có khả năng kháng nấm thông qua thí nghiệm đối kháng với chủng nấm mốc Fusarium sp. với tỉ lệ đối kháng trung bình 61%. Dịch nuôi cấy của Lactobacillus sp. L5 có khả năng kháng nấm và khả năng này thay đổi nhưng không đáng kể theo pH, nhưng giảm 35 - 40% khi gia nhiệt 100°C, 20 – 23% ở 80oC và 5 – 7% ở 65oC trong 15 phút. Ứng dụng thành công dịch nuôi cấy trong bảo quản hạt bắp. Ứng dụng thành công dịch nuôi cấy trong thúc đẩy sự phát triển của hạt bắp và ức chế nấm Fusarium sp. gây thối rễ ở cây bắp. 4.2. Kiến nghị Vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 có khả năng kháng nấm triển vọng vì vậy cần phải được định danh đến cấp loài nhờ API kit hay giải trình tự gene 16S rRNA. Xác định thành phần hoá học có trong dịch nuôi cấy. Xác định chất và hàm lượng có khả năng kích thích sinh trưởng của cây bắp. Sản xuất chế phẩm lỏng Lactobacillus sp. L5 có khả năng kháng nấm và kích thích sinh trưởng cho cây bắp nhằm nâng cao sản lượng và chất lượng. 95 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Bộ môn Dược lý – Vệ sinh an toàn thực phẩm (2011). Giáo trình vệ sinh an toàn thực phẩm, Đại học Thái Nguyên, trang 45 – 52. 2. Hoa Thị Minh Tú, Nguyễn Tiến Thành, Lê Thanh Mai, Lê Thanh Bình (2007). Một số tính chất của bcteriocin được tổng hợp bởi vi khuẩn lactic phân lập từ sữa bò tươi. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, tập 45, trang 82. 3. Nguyễn Đức Lượng (2002). Công nghệ vi sinh vật tập 2 Vi sinh vật học công nghiệp. NXB Đại học Quốc Gia Tp.HCM. 4. Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Hồng, Lê Đình Lương (1982). Vi nấm. NXB Khoa học và kỹ thuật, trang 108 - 110. 5. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyền, Phạm Văn Ty (2009). Vi Sinh Vật Học. NXB Giáo Dục, trang 200 – 218. 6. Nguyễn Thị Hiền, Phan Thị Kim, Trương Thị Hòa, Lê Thị Lan Chi (2009). Vi sinh vật nhiễm tạp trong lương thực - thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội, trang 66 - 81. 7. Phạm Duy Tường (2009). Dinh dưỡng và vệ sinh an toàn thực phẩm. NXB Giáo Dục, trang 162-164. 96 Đồ án tốt nghiệp Tài liệu Tiếng Anh 8. A. Laitila, H-L. Alakomi, L. Raaska, T. Mattila-Sandholm and A. Haikara (2002). Antifungal activities of two Lactobacillus plantarum strains against Fusarium moulds in vitro and in malting of barley. 9. Barbara M. Lund, Tony C. Baird – Parker and Grahame W. Gould (2000); The Microbiological Safety and Quality of Food, Volume I, II; Aspen Publisher, Inc. Gaithersburg, Maryland. 10. Basavaraj M. Kuraber và cộng sự (2012). Isolation and functional characterization of lactic acid bacteria from different sources: 21 - 40. 11. Fowler G.G., Javis B and Tramer. J. (1975). The assay of nisin in foods. Society of Applied Bacteriology Technology Ser.8, page 91-105. 12. Gerkaeva T. 2008. Introdiction to Fusarium – apictorial atlas, Mitt Biol Bundesand – u Forswisch Berlin – Dahlem 209: 1 – 406. 13. Gerlach Ư, Nirenberg HI (1982). The genus Fusarium – a pictorial atlas. Mitt Biol Bundesanst Land – u Forstwirsch Berlin – Dahlem, page 1- 406. 14. Ghiasian S.A, Rezayat S.M, Kord B.P, Maghsood A.H, Yazdanpanah H, Shephard G.S, Westhuizen L, Vismer H.F, Walter F.O.M. 2005. Fumonisin production by Fusarium species isolated from freshly harvested cỏn in Iran. Mycopathologia, 31 – 40. 15. Klaenhammer R. 1993. Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria. FEMS Microbiology Reviews, vol.12. page 39-89 . 16. Magnusson, J. and J. Schnurer. 2001. Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis strain Si3 produces a broad-spectrum proteinaceous antifungal compound. Appl Environ Microbiol 67(1): 1-5. 17. Nabil Saad. (2004). Aflatoxins: Occurrence and Health Risks. 97 Đồ án tốt nghiệp 18. Roy, U., V. K. Batish, S. Grover, and S. Neelakantan. 1996. Production of antifungal substance by Lactococcus lactis subsp. lactis CHD-28.3. International Journal of Food Microbiology 32(1-2): 27-34. 19. Roy, U., V. K. Batish, S. Grover, and S. Neelakantan. 1996. Production of antifungal substance by Lactococcus lactis subsp. lactis CHD-28.3. International Journal of Food Microbiology 32(1-2): 27-34. 20. Scott, P.M. 1984. Effects of food processing on mycotoxins. J. Food Prot., 47(6): 489. 21. Seifert và cs (1996). Fusarium interactive key. Agriculture and Agri – Food Canada. 22. United States Department of Agriculture (2009). Grain Fungal Diseases and Mycotoxin Reference. 98 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A. THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM A1. Môi trường Potato Dextrose Agar. Thành phần Gam/L D-glucose 20 Dịch chiết khoai tây 1000ml 1000ml Agar 20 pH 5,6 ± 0,2 Dịch chiết khoai tây: 200g khoai tây thái lát, đun với 1000ml nước cất trong 30 phút. Thu dịch chiết và định mức lên 1000ml. A2. Môi trường Potato Dextrose Broth. Thành phần Gam/L D-glucose 20 Dịch chiết khoai tây 1000ml 1000ml pH 5,6 ± 0,2 Dịch chiết khoai tây: 200g khoai tây thái lát, đun với 1000ml nước cất trong 30 phút. Thu dịch chiết và định mức lên 1000ml. 1 Đồ án tốt nghiệp A3. Môi trường de Man, Rogosa và Sharpe Agar (MRS agar): Thành phần trong 1 lít: Thành phần Gam/L Beef extract 10.0 Yeast extract 10.0 Sodium acetate 5.0 Sodium acetate 5.0 Dextrose 20.0 Amonium citrate 2.0 Dipotassium phosphate 2.0 Tween 80 1.0 Magiesium sulfate 0.1 Manganese sulfate 0.05 Agar 15 Nước cất 1000ml pH tại 25°C 6.5 ± 0.2 2 Đồ án tốt nghiệp A4. Môi trường de Man, Rogosa và Sharpe Broth (MRS Broth): Thành phần Gam/L Beef extract 10.0 Yeast extract 10.0 Sodium acetate 5.0 Sodium acetate 5.0 Dextrose 20.0 Amonium citrate 2.0 Dipotassium phosphate 2.0 Tween 80 1.0 Magiesium sulfate 0.1 Manganese sulfate 0.05 Nước cất 1000ml pH tại 25°C 6.5 ± 0.2 3 Đồ án tốt nghiệp A5. Môi trường Chitin 1% Thành phần Gam/L Chitin 10 Agar 15 Đệm Phosphate pH= 7 1000ml A6. Môi trường Casein 1% Thành phần Gam/L Casein 10 Agar 15 Đệm Phosphate pH= 7 1000ml 4 Đồ án tốt nghiệp B. PHỤ LỤC BẢNG LIỆU Chú thích: CBZ Carbenzim KTH Không trung hoà TH Trung hoà CN Cảm nhiễm KCN Không cảm nhiễm B.1. TỈ LỆ KHÁNG NẤM Ở CÁC MỨC NHIỆT ĐỘ: The SAS System 14:23 Thursday, July 12, 2017 6 The ANOVA Procedure Dependent Variable: TILEKHANG Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 10 13216.02667 1321.60267 110.43 <.0001 Error 22 263.28667 11.96758 Corrected Total 32 13479.31333 RSquare Coeff Var Root MSE TILEKHANG Mean 0.980467 10.66624 3.459418 32.43333 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NGHIEMTHUC 10 13216.02667 1321.60267 110.43 <.0001 The SAS System 14:23 Thursday, July 12, 2017 7 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for TILEKHANG NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. 5 Đồ án tốt nghiệp Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 22 Error Mean Square 11.96758 Critical Value of t 2.07387 Least Significant Difference 5.8579 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NGHIEMTHUC A 60.467 3 CBZ A A 57.233 3 KDTH B 50.900 3 KDKTH B C B 49.600 3 80KTH C C 43.833 3 65KTH D 34.300 3 65TH E 20.267 3 100KTH E E 17.033 3 100TH F 10.700 3 80TH F F 7.467 3 MTTH F F 4.967 3 MTKTH 6 Đồ án tốt nghiệp B.2. ĐỘ KHOẺ CỦA CÂY CON SAU 7 NGÀY: The SAS System 15:45 Thursday, July 19, 2017 15 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DOKHOE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 40 Error Mean Square 23.16433 Critical Value of t 2.02108 Least Significant Difference 7.9423 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NGHIEMTHUC A 374.367 3 100THKCN B 360.800 3 80THKCN B B 356.967 3 100THCN B B 355.600 3 100KTHKC C 340.700 3 80KTHKCN C C 337.433 3 80THCN D 303.967 3 65THKCN D D 301.300 3 65KTHKCN E 292.200 3 100KTHCN E E 290.967 3 CBZKCN E F E 284.867 3 80KTHCN F F 280.367 3 CBZCN G 255.567 3 65THCN H 244.033 3 65KTHCN 7 Đồ án tốt nghiệp I 235.000 3 KDTHKCN I I 231.467 3 KDKTHKCN I I 228.200 3 NCKCN J 195.233 3 KDTHCN J J 194.300 3 KDKTHCN J J 194.300 3 NCCN 8 Đồ án tốt nghiệp B.3. CHIỀU CAO CÂY SAU 7 NGÀY: System 15:25 Thursday, July 12, 2017 31 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NGHIEMTHUC 20 100KTHCN 100KTHKC 100THCN 100THKCN 65KTHCN 65KTHKCN 65THCN 65THKCN 80KTHCN 80KTHKCN 80THCN 80THKCN CBZCN CBZKCN KDKTHCN KDKTHKCN KDTHCN KDTHKCN NCCN NCKCN Number of Observations Read 60 Number of Observations Used 60 The SAS System 15:25 Thursday, July 12, 2017 32 The ANOVA Procedure Dependent Variable: CHIEUCAOCAY Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 19 39163.93333 2061.25965 99.82 <.0001 Error 40 826.00000 20.65000 Corrected Total 59 39989.93333 R-Square Coeff Var Root MSE CHIEUCAOCAY Mean 0.979345 2.163574 4.544227 210.0333 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NGHIEMTHUC 19 39163.93333 2061.25965 99.82 <.0001 The SAS System 15:25 Thursday, July 12, 2017 33 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for CHIEUCAOCAY NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 40 Error Mean Square 20.65 9 Đồ án tốt nghiệp Critical Value of t 2.02108 Least Significant Difference 7.4989 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NGHIEMTHUC A 255.333 3 100THKCN B 247.333 3 80THKCN B B 246.000 3 100THCN C 238.000 3 100KTHKC C C 238.000 3 80KTHKCN C D C 234.667 3 80THCN D D 228.667 3 80KTHCN D D 227.333 3 100KTHCN E 202.000 3 65THKCN E F E 198.000 3 65THCN F E F E G 197.333 3 65KTHKCN F E G F H E G 195.667 3 NCKCN F H G F H G 194.000 3 KDTHKCN F H G F H G 192.333 3 NCCN F H G F H G 191.333 3 KDTHCN H G H G 190.000 3 65KTHCN H H 189.667 3 KDKTHKCN H H 188.333 3 KDKTHCN 10 Đồ án tốt nghiệp I 176.667 3 CBZKCN I I 170.000 3 CBZCN B.4. CHIỀU DÀI RỄ SAU 7 NGÀY: 15:25 Thursday, July 12, 2017 38 The ANOVA Procedure Dependent Variable: CHIEUDAIRE Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 19 114986.1833 6051.9044 311.95 <.0001 Error 40 776.0000 19.4000 Corrected Total 59 115762.1833 R-Square Coeff Var Root MSE CHIEUDAIRE Mean 0.993297 2.876593 4.404543 153.1167 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NGHIEMTHUC 19 114986.1833 6051.9044 311.95 <.0001 The SAS System 15:25 Thursday, July 12, 2017 39 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for CHIEUDAIRE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 40 Error Mean Square 19.4 Critical Value of t 2.02108 Least Significant Difference 7.2684 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NGHIEMTHUC 11 Đồ án tốt nghiệp A 204.000 3 100THKCN A B A 198.333 3 100KTHKC B B 195.333 3 80THKCN B B C 192.000 3 100THCN C C 187.667 3 100KTHCN D 180.333 3 CBZKCN D D 180.000 3 80KTHKCN D E D 179.333 3 80THCN E D E D F 176.000 3 80KTHCN E D F E D F 174.000 3 CBZCN E F E F 172.333 3 65KTHKCN F G F 171.000 3 65THKCN G G 165.000 3 65THCN H 156.667 3 65KTHCN I 94.333 3 KDKTHKCN I I 94.333 3 KDTHKCN I J I 87.667 3 KDKTHCN J J 86.000 3 KDTHCN J J 84.333 3 NCKCN J J 83.667 3 NCCN 12 Đồ án tốt nghiệp B.5. SINH KHỐI TƯƠI SAU 7 NGÀY: The SAS System 15:25 Thursday, July 12, 2017 44 The ANOVA Procedure Dependent Variable: KHOILUONGTUOI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 19 10530094.69 554215.51 170.43 <.0001 Error 40 130076.67 3251.92 Corrected Total 59 10660171.36 R-Square Coeff Var Root MSE KHOILUONGTUOI Mean 0.987798 3.773559 57.02558 1511.188 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NGHIEMTHUC 19 10530094.69 554215.51 170.43 <.0001 The SAS System 15:25 Thursday, July 12, 2017 45 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for KHOILUONGTUOI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 40 Error Mean Square 3251.917 Critical Value of t 2.02108 Least Significant Difference 94.104 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NGHIEMTHUC A 2560.00 3 100THKCN B 2173.33 3 100KTHKC B B 2103.33 3 80THKCN C 1876.67 3 80KTHKCN 13 Đồ án tốt nghiệp C D C 1810.00 3 100THCN D D 1781.00 3 100KTHCN E 1570.00 3 80KTHCN E E 1536.67 3 80THCN E F E 1520.00 3 65KTHKCN F E F E 1490.00 3 65THKCN F F 1433.33 3 KDTHKCN G 1300.00 3 KDKTHKCN G G 1296.67 3 65KTHCN G G 1263.33 3 65THCN G H G 1220.00 3 NCKCN H H I 1166.67 3 KDTHCN H I H I 1131.33 3 NCCN I I 1106.67 3 KDKTHCN J 987.40 3 CBZKCN J J 897.37 3 CBZCN 14