Đồ án Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus (cs1b) và ứng dụng trong bảo quản nông sản

Các số liệu , kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đồ án này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Đồ án đã được chỉ rõ nguồn gốc. Học viên thực hiện đồ án Trịnh Thị Cẩm Tú i Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em học tập và hoàn thành tốt khóa học 2012 – 2016. Em xin cảm ơn thầy cô trong Khoa CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MÔI TRƯỜNG đã tận tình chỉ dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quan trọng tạo nền tảng kiến thức vững chắc để hoàn thành tốt Đồ án và sau này có thể ứng dụng vào công việc thực tiễn. Em xin cảm ơn thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Khoa CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MÔI TRƯỜNG, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp cho em thực hiện và hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp này. Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Hoài Hương đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện để em hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp này. Và em cũng gửi lời cảm ơn đến các bạn cùng khóa đã tận tình hỗ trợ, giúp đỡ, động viên khích lệ tinh thần , cùng trải qua những khó khăn trong suốt quá trình thực hiện Đồ án tốt nghiệp của mình. Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, gia đình đã luôn bên cạnh, cỗ vũ động viên tinh thần, tạo mọi điều kiện để con có thể hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp này. TP. HCM, Ngày 19 tháng 08 năm 2016 Sinh viên thục hiện Trịnh Thị Cẩm Tú ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC .......................................................................................................................... i DANH MỤC VIẾT TẮT ................................................................................................. vi DANH MỤC BẢNG ....................................................................................................... vii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ HÌNH ẢNH ............................................... viii MỞ ĐẦU ........................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 4 1.1 Các nấm gây hại trên hạt ......................................................................................... 4 1.1.1 Tình trạng nhiễm nấm gây hại trên hạt ngũ cốc .............................................. 4 1.1.2 Tình trạng nhiễm nấm trước thu hoạch ........................................................... 5 1.1.3 Tình trạng nhiễm nấm sau thu hoạch ............................................................... 5 1.1.4 Độc tố của nấm ................................................................................................. 6 1.2 Các phương pháp kháng nấm gây bệnh cho nông sản ......................................... 11 1.2.1 Kháng nấm bằng phương pháp hóa học ........................................................ 11 1.2.2 Kháng nấm bằng phương pháp sinh học: ...................................................... 12 1.3 Một số vi sinh vật điển hình có khả năng đối kháng nấm gây bệnh trong nông sản. ............................................................................................................................... 15 1.3.1 Nấm Trichoderma spp ................................................................................... 15 1.3.2 Lactobacillus spp. .......................................................................................... 17 1.3.3 Bacillus subtilis spp........................................................................................ 19 1.4 Cơ chế kháng nấm của vi khuẩn ........................................................................... 21 1.4.1 Cấu tạo thành tế bào của một số nấm gây hại nông sản ................................ 21 1.4.2 Cơ chế tác động của một số enzyme ngoại bào. ............................................ 23 1.4.3 Cơ chế kháng nấm của một số hợp chất. ....................................................... 25 1.4.4 Một số phương pháp thu enzyme và hợp chất thứ cấp từ dịch nuôi cấy vi khuẩn ....................................................................................................................... 26 1.5 Một số nghiên cứu ứng dụng màng bao trong bảo quản hạt ................................ 30 1.6 Một số nghiên cứu nước ngoài ứng dụng hợp chất thứ cấp của Bacillus spp ..... 31 1.7 Một số nghiên cứu trong nước ứng dụng hợp chất thứ cấp của Bacillus spp ...... 32 iii Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 33 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................ 33 2.2 Vật liệu – thiết bị - hóa chất .................................................................................. 33 2.2.1 Vật liệu ........................................................................................................... 33 2.2.2 Thiết bị và dụng cụ ......................................................................................... 33 2.2.3 Môi trường - Hóa chất .................................................................................... 34 2.3 Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................... 35 2.3.1 Mục đích ......................................................................................................... 35 2.3.2 Mục tiêu .......................................................................................................... 35 2.3.3 Nội dung ......................................................................................................... 35 2.4 Bố trí thí nghiêm và phương pháp ........................................................................ 36 2.4.1 Khảo sát khả năng đối kháng nấm. ................................................................ 36 2.4.2 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của VK có hoạt tính kháng nấm trong bảo quản hạt.................................................................................................................... 47 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................. 50 3.1 Sản xuất sinh khối nấm Aspergillus sp. CĐP1 làm cảm ứng hợp chất kháng nấm cho vi khuẩn Bacillus sp. CS1b .................................................................................. 50 3.2 Xác định thời gian nuôi cấy để khả năng đối kháng nấm CĐP1 cực đại ............. 51 3.2.1 Dịch nuôi cấy sau ly tâm ................................................................................ 51 3.2.2 Dịch nuôi cấy sau ly tâm xử lý nhiệt ............................................................. 53 3.2.3 So sánh khả năng đối kháng dịch nuôi cấy sau ly tâm với nấm CĐP1 của dịch nuôi cấy CS1b ở từng thời gian nuôi cấy và điều kiện xử lý nhiệt ................ 53 3.3 Khảo sát khả năng đối kháng nấm của protein kết tủa từ dịch nuôi cấy vi khuẩn CS1b sau ly tâm. .......................................................................................................... 55 3.3.1 Quy trình thu hồi protein kết tủa có hoạt tính sinh học ................................. 55 3.3.2 Định tính enzyme protease, chitinase, 휷- glucanase của protein kết tủa. ..... 56 3.3.3Khảo sát khả năng đối protein kết tủa với CĐb1 ........................................... 59 3.4 Khảo sát khả năng đối kháng cao ethyl acetate với CĐb1. .................................. 60 3.4.1 Quá trình thu cao EA...................................................................................... 60 iv Đồ án tốt nghiệp 3.4.2 Khảo sát sự ức chế của cao EA với nấm CĐP1 ............................................ 61 3.5 Khảo sát thành phần hóa học của các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn Bacillus sp. CS1b có hoat tính kháng nấm. ................................................................ 64 3.6 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của VK có hoạt tính kháng nấm trong bảo quản hạt. ............................................................................................................................... 66 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................... 76 4.1 Kết luận ................................................................................................................. 76 4.2 Kiến nghị ............................................................................................................... 76 TÀI LIỆU KHAM KHẢO VÀ PHỤ LỤC ..................................................................... 78 TÀI LIỆU KHAM KHẢO .............................................................................................. 78 PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 1 v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC VIẾT TẮT AFPA: Aspergillus flavus and parasiticus agar EA: ethyl acetate NA: Nutrient agar NB: Nutrient broth MT: Môi trường PDA: Potato dextrose agar HPLC: High pressure liquid chromatography TLC: Thin layer chromatography UV: Ultraviolet VK: vi khuẩn vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Ảnh hưởng của aflatoxin có mặt trong thức ăn đến các biểu hiện bệnh lý ở vật nuôi.. ......................................................................................................................9 Bảng 1.2: Các phương pháp khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học ..........13 Bảng 1.3: Các thành phần chính của thành tế bào ở một số nấm ..............................22 Bảng 1.4: Cơ chế tác động của mộ số hợp chất thứ cấp ............................................26 Bảng 2.1: Bố trí các thí nghiệm tạo màng bao hạt đậu phộng..................................47 Bảng 3.1: Tỷ lệ đối kháng (%) của dịch nuôi cấy VK CS1b với nấm CĐP1. ..........53 Bảng 3.2: Đường kính phân giải của enzyme của protein kết tủa bằng ethanol .......56 Bảng 3.3: Khả năng đối kháng với CĐP1 của protein kết tủa bằng ethanol .............58 Bảng 3.4: Tỷ lệ đối kháng (%) theo từng nồng độ của cao ethyl acetate với nấm CĐP1.63 Bảng 3.5: Định tính một số chất có trong dịch sau ly tâm, protein kết tủa và cao ethyl acetate .........................................................................................................................63 Bảng 3.6: Khả năng ức chế nấm mốc và vi khuẩn phát triển trên hạt đậu phộng được bao màng chitosan và sản phẩm trao đổi chất CS1b .................................................66 Bảng 3.7:Kết quả ứng dụng hợp chất thứ cấp bảo quản đậu phộng. 71 vii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ HÌNH ẢNH Hình 2.1: Sơ đồ khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng kháng nấm CĐP1 của dịch nuôi cấy CS1b sau ly tâm. ................................................................36 Hình 2.2: Sơ đồ thu sinh khối nấm CĐP1. ................................................................37 Hình 2.3: Quy trình thu hồi protein kết tủa bằng ethanol 960 ...................................40 Hình 2.4: Quy trình thu hồi cao EA ...........................................................................42 Hình 2.5: Sơ đồ ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng bằng màng bao chitosan ..........46 Hình 3.1: Nấm CĐP1 trong môi trường PDB ............................................................49 Hình 3.2: Kết quả đối kháng của dịch sau ly tâm của VK CS1b với nấm CĐP1 .....51 Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn khả năng đối kháng nấm CĐP1 của dịch nuôi cấy CS1b ở từng thời gian nuôi cấy và từng điều kiện xử lý dịch sau ly tâm ..............................54 Hình 3.4: Khả năng phân giải chitin của protein kết tủa. ..........................................56 Hình 3.5: Khả năng phân giải casein của protein kết tủa. .........................................57 Hình 3.6 Khả năng phân giải 훽 − 푔푢푐푎푛 của protein kết tủa...57 Hình 3.7: Khả năng ức chế nấm mốc CĐP1 của dung dịch protein kết tủa..59 Hình 3.8: Khả năng đối kháng nấm CĐP1 của cao EA.61 Hình 3.9: : Khả năng đối kháng nấm CĐP1 của cao EA, ...................................... ..62 Hình 3.10: Định tính một số chất có trong dịch nuôi cấy ly tâm (i), protein kết tủa (ii),.........................................64 Hình 3.11: Định tính lipid. .........................................................................................65 Hình 3.12: Sơ đồ chuẩn bị sinh khối nấm CĐP1...72 Hình 3.13: Quy trình công nghệ sản xuất cao EA.73 viii Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Lương thực, thực phẩm đặc biệt là các nông sản chính như thóc, gạo, ngô, khoai, sắn, đậu, đỗ và lạc là nguồn năng lượng chính nuôi sống loài người. Vì thế, việc nghiên cứu để nâng cao chất lượng nông sản là vấn đề được các tổ chức quốc tế cũng như các cơ quan khoa học về lương thực, thực phẩm của thế giới đặc biệt quan tâm. Việc nâng cao chất lượng nông sản bao gồm các kỹ thuật bảo quản gìn giữ các giá trị dinh dưỡng, ngăn chặn các chất độc hại nhiễm trên các nông sản đó, đồng thời chế biến nông sản thành những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao là một trong những phần cần thiết đối với ngành nông nghiệp nước ta. Độc tố aflatoxin chủ yếu do loài vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus tạo ra, là độc tố nguy hiểm nhất và thường nhiễm trên nông sản, gây độc cho người và gia súc, như gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan (ung thư gan), gây quái thai, gây đột biến,thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tử vong. Trong rất nhiều loại aflatoxin trong tự nhiên thì aflatoxin B1 được coi là chất độc nguy hiểm nhất. Mặc dù sự hiện diện của Aspergillus flavus không phải lúc nào cũng gắn liền với việc tồn tại aflatoxin với hàm lượng gây độc, nhưng nó cũng thể hiện nguy cơ lớn về việc có thể nhiễm aflatoxin. Ở nước ta với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, độ ẩm trong không khí thường cao, thời vụ canh tác, thu hoạch thường rơi vào mùa mưa, trong khi các phương tiện thu hoạch, phơi sấy nông sản kém, kho chứa không đảm bảo khô ráo, thoáng mát là điều kiện rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây nhiễm độc cho thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Khi phát triển trên lương thực nấm mốc đã sử dụng các chất dinh dưỡng gây ra tổn thất về lượng cũng như về chất của hạt. Không những thế, một số loài nấm mốc khi phát triển sinh ra các loại độc tố khác nhau và được gọi chung là mycotoxin. 1 Đồ án tốt nghiệp Nguy hiểm hơn những độc tố này có khả năng theo thức ăn vào cơ thể, gây ra độc cho con người và động vật, như gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan (ung thư gan), gây quái thai, gây đột biến,thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tử vong. Việc sử dụng các biện pháp phòng trừ độc tố nấm mốc đã được khuyến cáo sử dụng. Tuy nhiên, sự nhiễm nấm mốc và các độc tố nấm mốc nói chung và sự nhiễm aflatoxin trên nông sản ở mức độ cao quá giới hạn cho phép là không thể tránh được. Chính vì vậy cần phải có những biện pháp khử nhiễm độc tố nấm mốc bởi độc tính và nguy cơ gây ung thư của nó. Bảo quản nông sản bằng áp dụng các chất chống mốc hóa học có giá thành cao,thường có mùi khó chịu cho nông sản bị xử lý và có thể ảnh hưởng xấu lên sức khỏe người tiêu dùng. Để áp dụng “ bảo quản sinh học” trong việc bảo quản các hạt nông sản, các sản phẩm trao đổi chất vi sinh vật thường được áp dụng. Đó là lý do chúng tôi đã chọn nghiên cứu về: “ Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của Bacillus spp. (CS1b) và ứng dụng trong bảo quản nông sản”. 2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2.1 Mục tiêu Khảo sát khả năng đối kháng nấm sinh aflatoxin của sản phẩm trao đổi chất dịch nuôi cấy vi khuẩn Baccillus sp. CS1b và ứng dụng trong việc bảo quản hạt đậu phộng. 2.2 Nội dung 1. Sản xuất sinh khối nấm Aspergillus sp. CĐP1 làm cảm ứng hợp chất kháng nấm cho vi khuẩn Bacillus sp. CS1b 2. Xác định thời gian nuôi cấy vi khuẩn Bacillus sp. CS1b để khả năng đối kháng nấm CĐP1 của dịch nuôi cấy vi khuẩn CS1b đạt khả năng kháng nấm Aspergillus sp. CĐP1 cực đại. 3. Khảo sát khả năng đối kháng nấm của protein kết tủa từ dịch nuôi cấy vi khuẩn CS1b sau ly tâm. 2 Đồ án tốt nghiệp 4. Khảo sát khả năng đối kháng nấm của cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi cấy sau ly tâm. 5. Khảo sát thành phần hóa học của các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn Bacillus sp. CS1b có hoạt tính kháng nấm. 6. Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn trong việc bảo vệ hạt đậu phộng. 3. Kết cấu đồ án Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung này đề cập đến các nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu. Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án. Chương 3: Kết quả và thảo luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề tài thực hiện được và đưa ra thảo luận, biện chứng cho kết quả thu được. Chương 4: Kết luận và kiến nghị - nội dung chương tóm lại những kết quả mà đề tài đạt được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài. 3 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Các nấm gây hại trên hạt 1.1.1 Tình trạng nhiễm nấm gây hại trên hạt ngũ cốc Thế giới Sự nhiễm nấm mốc trong nông sản đã trở thành vấn đề toàn cầu. Ví dụ: Ở Đức có 84% trên 1000 mẫu nông sản thực phẩm kiểm tra có nhiễm Tricothecene, 13 % số mẫu lương thực như lúa mì, lúa mạch, yến mạch bị nhiễm ochratoxin. Ở Đan Mạch 19 trên 33 mẫu ngũ cốc kiểm tra có nhiễm ochratoxin. Ở Ấn Độ có 8 % số mẫu bánh dầu hướng dương kiểm tra có nhiễm đồng thời cả hai loại độc tố T-2 và ochratoxin. Ở Mỹ có rất nhiều mẫu bắp kiểm tra cho thấy sự nhiễm vomitoxin ( DON) ở mức 1000 ppb. Ở Úc kiểm tra trên bắp thấy có cả 3 loại mycotoxin như: aflatoxin, fumonisin và zearalenon. Theo Tiến sĩ Bangalore ( Ấn Độ) thì các loại mycotoxin khác nhau có ưu thế ở những vùng khác nhau trên thế giới: Ở Bắc Âu có ochratoxin và vomitoxin ( DON) là vấn đề đang được quan tâm nhất. Còn ở Nam Mỹ thì mycotoxin có ưu thế lại là aflatoxin và fumonisin. Việt Nam Ở Việt Nam nhiều nơi ép dầu phộng bằng bọng thủ công, độ ẩm còn cao, sau đó xếp thành chồng. Giữa các lớp bánh dầu có độ ẩm cao là môi tường thích hợp cho nấm phát triển. Nếu kho trữ thức ăn lâu ngày không làm vệ sinh, diệt nấm thì trong không khí sẽ có rất nhiều bào tử nấm tấn công nhanh các nguyên liệu này sinh ra nhiều độc tố trong thức ăn. Nấm sinh ra trong kho dự trữ phổ biến nhất là Aspergillus và Penicillium. Độc tố của chúng sinh ra chủ yếu là aflatoxin, sau đó là ochratoxin, rubratoxin và citrinin. Nó gây tổn hại nặng trên động vật, làm hư gan, thận, tạo ra màng bọc ống tiêu hóa do tế bào niêm mạc bị chết bong ra giảm hấp thu dưỡng chất, có thể gây tử vong trên số lớn gia cầm con và heo con. 4 Đồ án tốt nghiệp Riêng ở các trại gà giống độc tố nấm còn gây ra chết phôi hàng loạt, tỷ lệ ấp nở giảm rất thấp. Theo kết quả kiểm tra 29 mẫu bánh dầu đậu phộng và 25 mẫu bắp thì mức aflatoxin trong bánh dầu phộng 1200 ppb ( tối đa 5000 ppb), trong bắp 205 ppb ( tối đa 600 ppb). Các nguyên liệu còn lại như đậu nành hạt khô và bánh đầu công nghiệp của nó, bánh dầu mè công nghiệp, khô dầu dừa công nghiệp, cám 50 ppb. 1.1.2 Tình trạng nhiễm nấm trước thu hoạch Trong khi cây lương thực đang phát triển ngoài đồng hay sau khi thu hoạch nhưng trước khi hạt được đập tuốt bị các nấm mốc này xâm nhập. Tùy từng loại ngũ cốc, vùng địa lý, thời tiết mà các nấm mốc này phát triển nhiều hay ít. Các loại lúa mì, lúa gạo, đại mạch, kiều mạch, và ngô thường nhiễm các loại nấm ngoài đồng như Alternaria, Cladosporium, Helininthosporium và Furarium. Tất cả các nấm ngoài đồng đòi hỏi độ ẩm cao ở hạt để phát triển. Độ ẩm ở trạng thái cân bằng với độ ẩm tương đối 90% hay hơn nữa là điều kiện cho nấm phát triển. Các nấm mốc ngoài đồng có thể sống qua nhiều năm ở hạt khô, nhưng chết tương đối nhanh ở các hạt có độ ẩm ở trạng thái cân bằng với độ ẩm tương đối trên 70%, ở các hạt ngũ cốc giàu tinh bột, điều này có nghĩa độ ẩm trên 14%. Tóm lại, các nấm mốc ngoài đồng có thể ảnh hưởng đến bề ngoài và chất lượng của hạt. Thông thường, tổn thất gây nên do nấm mốc ngoài đồng xảy ra trước thu hoạch có thể phát hiện bằng phương pháp giám định thông thường và nó không tiếp tục tăng lên trong quá trình bảo quản. 1.1.3 Tình trạng nhiễm nấm sau thu hoạch Theo Christensen [1] các nấm mốc bảo quản gồm mười hai loài Aspergillus, trong đó có năm loài phổ biến. Một số loài Penicillium, các loài riêng lẻ của Sporendonema và một số loài nấm men cũng có thể có ở giai đoạn này. Những loài này có khả năng phát triển ở các hạt lương thực có độ ẩm cân bằng với độ ẩm tương đối 70% - 90%. Đa 5 Đồ án tốt nghiệp số các nấm này thường ở trên các nguyên liệu giàu các chất hữu cơ và vô cơ, đặc biệt trên các rau quả thối rữa, các sản phẩm thực phẩm. Chúng xuất hiện ở khắp mọi nơi trên thế giới và nhiễm trên tất cả các hạt lương thực và hạt giống. Các nấm mốc bảo quản phát triển nhanh trên hạt ở khoảng 300C - 320C và tốc độ phát triển của chúng giảm khi nhiệt độ giảm. Một vài chủng của nhóm A.glaucus phát triển chậm ở nhiệt độ 100C – 150C. Một vài loài Aspergillus đề kháng với khô cạn, nó có thể phát triển ở vài độ dưới điểm đóng băng. 1.1.4 Độc tố của nấm Một số loại độc tố của nấm Độc tố nấm còn gọi là mycototoxin là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi chất thứ cấp của các nấm mốc và gây ngộ độc với động vật có vú, cá, gia cầm. Sự sinh trưởng và phát triển của nó phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện sinh thái ( Morrau 1974) [2]. Những điều kiện đó là vùng sinh thái, khí hậu nhiệt độ, độ ẩm của không khí, lượng nước có trong cơ chất Sự sản sinh độc tố nấm mốc là kết quả của tác động qua lại của kiểu gen ( genotype) và điều kiện phát triển của chúng ( Scheoedes và Ashworth). Độc tố nấm là sản phẩm phụ tiết ra trong quá trình chuyển hóa. Cho đến nay, trên 300 loại độc tố nấm đã được phát hiện và nghiên cứu. Một loại độc tố có thể do nhiều loài nấm khác nhau sản sinh và một loại nấm có thể đồng thời sản sinh ra nhiều loại độc tố. Điều đáng chú ý là có 20 loại mycotoxin có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng thường liên quan đến an toàn thực phẩm và được tạo bởi năm chi nấm: Aspergillus, Penicillium, Furarium, Alternaria, Claviceps. ❖ Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2), sterimatocystin, acid cyclopianzoic. 6 Đồ án tốt nghiệp ❖ Các độc tố của Penicillium: patulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A, acid cyclopianzoic toxin, diacetocyscirpenol, fumonisin, moniliformin. ❖ Các độc tố của Furarium: deoxynivalenol, nivalenol, zearalenon, T-2 toxin. ❖ Các độc tố của Alternaria: acid tenuazoic, alternarion, methyl ether alternarion. ❖ Các độc tố của Claviceps: các alkaloid Ergot.[1] Những số liệu có giá trị về mycotoxin và các bệnh do mycotoxin đã thu nhận từ lĩnh vực thú y học. Các nghiên cứu trên độc vật thực nghiệm cho thấy độc tính của mycotoxin rất lớn. Hầu hết các sản phẩm thực vật có thể là cơ chất cho sự phát triển của nấm mốc và sự tạo mycotoxin tiếp theo. Vì thế nó tạo khả năng không những cho sự nhiễm trực tiếp mà còn là nguồn mang mycotoxin vào nguồn sữa, thịt. Độc tố Aflatoxin: Cơ chế gây độc của Aflatoxin Aflatoxin có khả năng liên kết với DNA trong nhân tế bào. Sự liên kết này gây ức chế enzym polymerase của RNA. Nó gây tác dụng hạn chế trong tổng hợp RNA và ức chế polymerase t-RNA. Đây là nguyên nhân gây hạn chế sự tổng hợp protein trong tế bào. Người ta cũng đã chứng minh rằng vòng α, β -lacton không bão hòa có trong phân tử aflatoxin làm cho hợp chất này có hoạt tính gây ung thư và cũng chính vòng lacton này gây ức chế tổng hợp DNA trong nhân tế bào, do đó nó làm rối loạn tăng trưởng bình thường của tế bào. Để có thể gây độc với tế bào gan cũng như tạo khối u, aflatoxin phải trải qua một quá trình biến đổi sinh học phức tạp, tạo thành dạng 2,3 – dihydrodiol (aflatoxin B1 – dhd) ở trong gan, hợp chất này là nguyên nhân gây hủy hoại gan rất nhanh. Nhóm 7 Đồ án tốt nghiệp dialdehyd phản ứng với nhóm amin của protein để tạo thành kiềm ship (Shiff’s base), gây ức chế sinh sinh tổng hợp DNA và gây nhiễm độc cấp tính. Độc tính của Aflatoxin Theo Dương Thanh Liêm (2002) [1], aflatoxin gây ra những tác hại rất lớn cho cơ thể con người và động vật. Những tác hại đó như sau:  Gây tổn thương tế bào gan: tất cả các trường hợp xác nhận sự ngộ độc aflatoxin đều có bệnh tích giống nhau là gan của động vật bị nhiễm đều hư hại nặng. Tùy theo mức độ nhiễm ít hay nhiều, lâu hay mau mà bệnh tích trên gan có khác nhau. Biểu hiện chung là: ban đầu gan biến thành màu vàng tươi, mật sưng. Sau đó gan sưng to lên, mật căng phồng và bắt đầu nổi mụt nhỏ trên bề mặt gan làm cho nó gồ ghề đôi khi có những nốt hoại tử màu trắng. Sau cùng do nhiễm khuẩn mà gan trở nên bở, dễ bể.  Thận cũng bị sưng to làm cho việc bài thải chất độc ra khỏi cơ thể trở nên khó khăn. Từ đó làm cho triệu chứng ngộ độc trở nên trầm trọng.  Bào mòn ống tiêu hóa nên làm giảm khả năng tiêu hóa các chất dinh dưỡng trong thức ăn. Đôi khi cũng thấy tổn thương ở miệng, làm cho thú khó lấy thức ăn.  Làm giảm khả năng đề kháng của động vật, ức chế hệ thống sinh kháng thể. Do đó khi nhiễm aflatoxin cơ thể rất mẫn cảm với các bệnh thông thường, có thể gây tử vong cho thú.  Làm thay đổi hoạt động sinh lý bình thường, gây rối loạn sinh sản.  Làm giảm sự thèm ăn đối với thức ăn do sự phát triển của nấm mốc làm mất mùi thức ăn.  Làm thay đổi thành phần dinh dưỡng có trong thức ăn, giá trị dinh dưỡng bị hạ thấp, làm vật nuôi chậm phát triển.  Làm giảm thấp sự sinh trưởng và giá trị kinh tế của vật nuôi. Hậu quả cuối cùng là có thể gây chết cho vật nuôi. 8 Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1: Ảnh hưởng của aflatoxin có mặt trong thức ăn đến các biểu hiện bệnh lý ở vật nuôi. (Allcroff, 1969 trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc, 2003). [2] Loại gia súc Lượng Thời kỳ nuôi Tổn thương Ảnh hưởng tới aflatoxin trong dưỡng (tuần) gan phát triển và thức ăn hàng hiệu quả thức ngày (mg/kg) ăn. Lợn 0.14 12 Trung bình Bình thường (20 – 70 kg) 0.28 12 Nhẹ Giảm sút 0.41 12 Nhẹ Giảm sút Lợn 0.28 20 Nhẹ Giảm sút (40 – 100 kg) 0.41 20 Nhẹ Giảm sút Lợn 0.69 7 Trung bình Bình thường (70 – 100 kg) Lợn nái 0.3 4 Rõ Suy giảm và (có chửa) 0.55 4 một số con chết Gà tây 0.25 4 Rõ Chậm phát (1 ngày tuổi) triển và giảm trọng lượng Gà tây 0.2 7 Nhẹ Giảm trọng (1 ngày tuổi) 0.42 7 Nhẹ lượng trong 3 0.5 7 Nặng tuần. Vịt 0.03 4 Đặc điểm điển Giảm trọng (7 ngày tuổi) hình nhiễm lượng, chết aflatoxin 50% Bê 0.2 16 Trung bình Giảm trọng 9 Đồ án tốt nghiệp (4 ngày tuổi) lượng từ 0 – 3 tháng Bò sữa 15 4 Trung bình Giảm lượng sữa Aflatoxin M1 có mặt trong sữa. Tình hình nhiễm độc Aflatoxin: Aflatoxin có mặt trong rất nhiều sản phẩm nông nghiệp, đặc biệt là các loại hạt có dầu như lạc, đậu tương và ngô (Blaney, 1985 trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003) [2]. Ở vùng Đông Nam Á và ở Úc, tỷ lệ nhiễm aflatoxin trong sản phẩm nông nghiệp là rất đáng kể. Nhiễm aflatoxin là do điều kiện bảo quản kém, việc xâm nhập của sâu mọt trong bảo quản cũng tạo điều kiện thuận lợi cho sự lây lan và phát triển nhanh chóng của Aspergillus flavus. Trong điều kiện thuận lợi, Asp. Flavus có thể tăng nhanh chỉ sau 3 – 7 ngày bảo quản. Nhiễm độc aflatoxin ở lợn là một vấn đề quan trọng, gây thiệt hại khá lớn cho ngành chăn nuôi. Tại miền Bắc Carolina – Mỹ, theo nghiên cứu của Smith (1976) trong số 94 trường hợp phát hiện aflatoxin có trong thức ăn chăn nuôi thì có đến 83 trường hợp gây ngộ độc ở lợn, 7 trường hợp ở bò và 4 trường hợp ở gia cầm. Hàm lượng aflatoxin trung bình có trong thức ăn chăn nuôi là 389 ppb và ở ngô nguyên liệu làm thức ăn là 518 ppb. (Trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê thị Ngọc Diệp, 2003) [2] Ở khu vực Đông Nam Á, theo nhận xét của Ginting (1985) và Widiastut (1988), ngô và thức ăn cho gia cầm nhiễm aflatoxin với hàm lượng lên tới 200 ppb. Ở Úc, theo Barry J. Balaney, trong 161 mẫu thức ăn cho gia cầm được phân tích thì có 13 mẫu 10 Đồ án tốt nghiệp chứa aflatoxin, trong đó có 4 mẫu nhiễm aflatoxin với hàm lượng lên đến 50 ppb. (Trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê thị Ngọc Diệp, 2003) [2]. 1.2 Các phương pháp kháng nấm gây bệnh cho nông sản 1.2.1 Kháng nấm bằng phương pháp hóa học Tình trạng sử dụng thuốc diệt nấm hóa học và tác hại Hiện nay khi sử dụng thuốc Bảo vệ thực vật nói chung cũng như thuốc trừ nấm bệnh hại cây trồng nói riêng, phần lớn bà con chúng ta vẫn làm theo cảm tính, cẩu thả, không khoa học, việc bà con nông dân sử dụng không hợp lý thậm chí lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật trong sản xuất nông nghiệp đã và đang gây những hậu quả nghiêm trọng. Thuốc diệt nấm có thể gián tiếp có hại cho sức khỏe con người do các loại lương thực, rau quả thu được từ các loại cây trồng được con người sử dụng và nó có thể gây ra dị ứng cũng như nhiều triệu chứng khác như đau đầu, tiêu chảy, các tổn hại cho các cơ quan cũng như gây ra các rối loạn nghiêm trọng và các loại bệnh tật liên quan đến hệ thần kinh. Nó cũng có thể là nguy hiểm cho các hệ sinh thái do nó có thể thoát đi và gây ô nhiễm môi trường nước và đất cũng như tích lũy sinh học và làm gia...y đã sử dụng ethyl acetate để tách các hợp chất kháng sinh từ dịch nuôi cấy C9 và cao chiết này có kết quả ức chế đáng kể sự tăng trưởng cợ nấm của các nấm gây bệnh khác nhau. Trong nghiên cứu đã xác định được hợp chất có trong cao ethyl acetate thu được từ dịch nuôi cấy C9 là DG4 (3,4 – dihydroxy – 3 – methyl – 2 – pentanone) có khả năng kích hoạt kháng hệ thống và bảo vệ cây Arabidopsis khỏi mầm bệnh ngoài ra chúng còn ức chế Rhizoctonia và tăng cường sức khỏe của cây trong nhà kính. Các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi của vi sinh vật có vai trò thay đổi sinh hóa của quá trình chuyển hóa hợp chất thứ cấp ở thực vật và cũng ức chế khả năng tổng hợp protein của các mầm bệnh. Các hợp chất này có khả năng ức chế bào tử nảy mầm, hoặc tổng hợp β- (1, 3) -D-glucan, hoặc ức chế một phần không thể thiếu của thành tế bào nấm, dẫn đến sự thay đổi của tính thấm của màng tế bào nấm. Các enzyme chitinolytic sản xuất bởi cô lập C9 có thể tham gia trong kiểm soát sinh học của nấm gây bệnh, đặc biệt là R. solani AG2-2 (IV). Mohsen Farzaneh và ctv (2016) [7] đã nghiên cứu sự ức chế sự tăng trưởng Aspergillus flavus và Aflatoxin B1 nhiễm trên hạt dẻ bằng fengycin và surfactin từ Bacillus subtilis UTBSP1. Trong nghiên cứu này, B. subtilis UTBSP1 có khả năng sản xuất surfactin và fengycin có thể giảm A. flavus tăng trưởng và độc tố AFB1 trong các 31 Đồ án tốt nghiệp loại hạt hồ dẻ. Ngoài ra, B. subtilis UTBSP1 là tác nhân hạ AFB1 ( Farzaneh et al., 2012 ) và có thể sử dụng để giảm AFB1-nội dung trong thực phẩm, thức ăn và các loại cây trồng nông nghiệp. 1.7 Một số nghiên cứu trong nước ứng dụng hợp chất thứ cấp của Bacillus spp Luận văn tốt nghiệp “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp. ứng dụng bảo quản nông sản” [3]. của hai sinh viên Đỗ Tuyết Mai và Nguyễn Văn Hương. Nghiên cứu đã phân lập Bacillus sp. CS1b có hoạt tính kháng nấm mạnh và nấm CĐP1 có khả năng sinh aflatocxin mạnh. Tiến hành cho đối kháng in vitro CS1b với CĐP1 cho kết quả CS1b kháng CĐP1 lên đến 59 %. Với kết quả in vitro khả quan họ tiếp tục thí nghiệm in vivo trên hạt đậu phộng, sử dụng hợp chất thứ cấp từ dịch nuôi cấy VK khuẩn CS1b trong môi trường có bổ sung tơ nấm CĐP1 làm chất cảm ứng kết hợp với chitosan và trong thí nghiệm cũng bổ sung 102 bào tử CĐP1. Kết quả đậu phộng có thể bảo quản đến 30 ngày. 32 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian Từ tháng 16 - 05 - 2016 đến 07 - 08 - 2016. Địa điểm Phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại học Công Nghệ TP.HCM 2.2 Vật liệu – thiết bị - hóa chất 2.2.1 Vật liệu Nguồn mẫu phân lập nấm: Mẫu nấm Aspergillus sp. CĐP1 do hai sinh viên Đỗ Tuyết Mai và Nguyễn Vân Hương phân lập từ hạt đậu phộng được mua từ chợ Tân Bình, quân Tân Bình, TP.HCM. Nguồn mẫu phân lập VK: là các chủng VK Baccillus sp. CS1b do sinh viên Trần Chí Phúc phân lập từ đất. 2.2.2 Thiết bị và dụng cụ Thiết bị: tủ ủ, tủ cấy, nồi hấp tiệt trùng (autoclave), máy li tâm, cân phân tích, máy soi UV, máy nước cất, bếp từ, 33 Đồ án tốt nghiệp Dụng cụ: ống nghiệm, đĩa petri, cốc thủy tinh (bacher), bình tam giác (erlen), ống đong, pipet thủy tinh, micropipette, đầu típ, que cấy, đèn cồn, bông không thấm, ống li tâm Eppendorf, 2.2.3 Môi trường - Hóa chất Môi trường (xem phụ lục A)  Môi trường Potato Dextrose (PDB)  Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA)  Môi trường tăng sinh nutrient Broth (NB)  Môi trường tăng sinh nutrient Broth 1 - NB1 (bổ sung tơ nấm)  Môi trường β – glucan 1%  Môi trường Casein 1 %  Môi trường Chitin 1 % Hóa chất  Dịch chiết khoai tây  Dịch tơ nấm  D – glucose  Peptone  Cao thịt (meat extract)  Cao nấm men (yeast extract)  Casein  Chitin, huyền phù chitin  Chiosan thương mại của công ty Hùng Tiến, Cần Thơ (đặc điểm hóa lý trình bày trong phụ lục A)  NaCl 34 Đồ án tốt nghiệp  Agar  Chloramphenicol  Nystatin  Phenol red  Nynhydrin  HCl  NaNO3  Đệm phosphate pH = 7  Glycerol  Cồn 960, 700  Nước cất  Moslich 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Mục đích Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học bảo quản hạt . 2.3.2 Mục tiêu Khảo sát khả năng đối kháng nấm sinh aflatoxin của sản phẩm trao đổi chất dịch nuôi cấy vi khuẩn Baccillus sp. CS1b và ứng dụng trong việc bảo quản hạt đậu phộng. 2.3.3 Nội dung 1. Sản xuất sinh khối nấm Aspergillus sp. CĐP1 làm cảm ứng hợp chất kháng nấm cho vi khuẩn Bacillus sp. CS1b 2. Xác định thời gian nuôi cấy vi khuẩn Bacillus sp. CS1b để khả năng đối kháng nấm CĐP1 của dịch nuôi cấy vi khuẩn CS1b đạt khả năng kháng nấm Aspergillus sp. CĐP1 cực đại. 35 Đồ án tốt nghiệp 3. Khảo sát khả năng đối kháng nấm của protein kết tủa từ dịch nuôi cấy vi khuẩn CS1b sau ly tâm. 4. Khảo sát khả năng đối kháng nấm của cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi cấy sau ly tâm. 5. Khảo sát thành phần hóa học của các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn Bacillus sp. CS1b có hoạt tính kháng nấm. 6. Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn trong việc bảo vệ hạt đậu phộng. 2.4 Bố trí thí nghiêm và phương pháp 2.4.1 Khảo sát khả năng đối kháng nấm. Hoạt hóa vi khuẩn CSb1 Nuôi cấy vi khuẩn trong NB1có chất cảm ứng trong từng thời gian 24h, 48h, 72h Ly tâm Bã Xử lý nhiệt Kết tủa enzyme Trích ly canh trường nuôi cấy (1000C/15p) bằng ethanol sau ly tâm (Ở từng thời gian nuôi cấy) bằng ethyl acetate Khảo sát khả năng kháng nấm Aspergillus sp. CĐP1 của vi khuẩn Bacillus sp. 36 Khảo sát thành phần hóa học của các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn Bacillus sp. CS1b có hoat tính kháng nấm. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.1: Sơ đồ khảo sát khả năng kháng nấm Aspergillus sp. CĐP1 của vi khuẩn Bacillus sp. CS1b 2.4.1.1 Tăng sinh nấm CĐP1 Chuẩn bị môi trường PDB Hấp khử trùng (1210C, 15phút) Làm nguội (300C) Giống nấm Nuôi cấy (150 vòng/ CĐP1 phút,48 giờ,t0 phòng) Thu sinh khối tế bào nấm 37 Sấy khô ở 850C Đồ án tốt nghiệp Hình 2.2: Sơ đồ thu sinh khối nấm CĐP1. - Chuẩn bị 500ml môi trường PDB, có bổ sung chloramphenicol (0.2%) cho vào bình erlen 2000 ml. Sau đó, hấp khử trùng môi trường ở 1210C trong 15 phút. - Hoạt hóa giống trên đĩa Petri PDA đến khi nấm có màu xanh đậm. Cắt thạch chứa bào tử nấm mốc cho vào môi trường PDA lỏng đã được làm nguội (300C), lắc tăng sinh 150 vòng / phút trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng. - Sau đó, lọc dịch nuôi cấy thu sinh khối, phần sinh khối tế bào được làm khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 850C đến khi khối lượng không đổi (khoảng 4 giờ). - Phân tích hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl. 2.4.1.2 Nhân giống vi khuẩn VK giữ giống trong Eppendorf (glycerol tủ đông) cấy chuyển 0,1 ml sang chai 100 ml chứa 10 ml MT NB (đã hấp khử trùng), hoạt hóa bằng cách nuôi cấy nhiệt độ phòng, máy lắc 150 vòng/ phút (máy lắc vòng) thời gian 24 giờ. Canh trường được pha loãng 10-6, 10-7 rồi cấy trang trên đĩa NA, ủ to phòng 24 giờ. Cấy 1 khuẩn lạc từ đĩa Petri vào 10 ml môi trường NB (chai 100 ml) đã được hấp khử trùng 121oC 1 atm trong 15 phút, nuôi cấy nhiệt độ phòng, máy lắc 150 vòng/ phút (máy lắc vòng) thời gian 24 giờ. 2.4.1.3 Lên men vi khuẩn thu sản phẩm trao đổi chất kháng nấm (môi trường có bổ sung tơ nấm làm chất cảm ứng) Chuẩn bị 3 bình môi trường mỗi bình chứa 100 ml NB1 có bổ sung tơ nấm làm chất cảm ứng tỷ lệ 1% (1 g/ 100 ml MT) sau đó hấp tiệt trùng. Cấy 1% giống đã được tăng 38 Đồ án tốt nghiệp sinh trước đó vào rồi đem lắc 150 vòng / phút trong 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ (sử dụng bình 500 ml). Từ 100 ml canh trường vi khuẩn được đem ly tâm 4000 vòng / phút trong 15 phút thu 90 ml dịch nổi sau ly tâm. 2.4.1.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng kháng nấm CĐP1 của dịch nuôi cấy CS1b sau ly tâm Chuẩn bị môi trường: PDA được hấp khử trùng 1210C, 1atm trong 15 phút, đổ đĩa petri đường kính 9 cm. Nấm đã được chuẩn bị trước bằng cách cấy điểm 1 bào tử ở tâm đĩa petri trên môi trường PDA, ủ từ 3 đến 5 ngày. Cắt miếng thạch có chứa bào tử nấm đặt vào tâm đĩa chuẩn bị đối kháng. Đục 4 lỗ thạch đường kính 0.8 cm trên đĩa thạch PDA. Mỗi đĩa cách đều tâm 1,5 cm. Dịch nổi sau ly tâm ở từng thời gian nuôi cấy 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ sẽ lần lượt được bơm và 4 giếng thạch mỗi giếng 0,1 ml dịch, đối chứng sử dụng môi trường NB1 thay thế cho dịch nổi sau ly tâm. Đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 ngày. (Thí nghiệm lặp lại 3 lần). 2.4.1.5 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng kháng nấm CĐP1 của dịch nuôi cấy CS1b sau ly tâm đã qua xử lý nhiệt 100 0 C Chuẩn bị môi trường: môi trường được chuẩn bị như phần khảo sát chưa qua xử lý nhiệt. Sau khi ly tâm thu dịch nổi ở từng thời gian nuôi cấy 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ. Lấy 50 ml dịch ở mỗi thời gian nuôi cấy rồi đem đi đun cách thủy ở 100 0 C trong 10 phút. Sau đó bơm lần vào giếng thạch mỗi giếng 0,1 ml dịch, đối chứng sử dụng môi trường 39 Đồ án tốt nghiệp NB1 cũng đã được xử lý nhiệt thay thế cho dịch nổi sau ly tâm. Đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 ngày. (Thí nghiệm lặp lại 3 lần). Sau thời gian ủ 5 ngày, đo đường kính nấm mốc ở đĩa đối chứng và đĩa thí nghiệm ở 2 thí nghiệm dịch nuôi cấy CS1b sau ly tâm và dịch nuôi cấy CS1b sau ly tâm đã qua xử lý nhiệt 100 0 C. Tỷ lệ ức chế được tính như sau: I% = ( DĐC – DTN)/DĐC × 100 2.4.1.6 Khảo sát khả năng đối kháng của protein kết tủa từ canh trường nuôi cấy vi khuẩn Hình 2.3: Quy trình thu hồi protein kết tủa bằng ethanol 960 40 Đồ án tốt nghiệp Canh trường lên men 24 giờ được ly tâm 4000 vòng/phút x 20 phút. Kết tủa protein từ 20 ml dịch nổi canh trường nuôi cấy vi khuẩn với tỉ lệ ethanol : dịch ly tâm = 1:1- 32:1 ở nhiệt độ 4 o C (làm lạnh ethanol và dịch nổi sau ly tâm trước khi kết tủa), để qua đêm, sau đó ly tâm thu tủa ở 4000 vòng/phút x 20 phút (hấp khử trùng ống ly tâm). Kết tủa được hòa tan vào 4 ml đệm phosphate pH = 7,0 (đã được hấp khử trùng) và cho vào ống nghiệm có nắp đã được hấp khử trùng. Định tính enzyme protease, chitinase, 훃- glucanase của protein kết tủa. Chuẩn bị đĩa thạch chứa cơ chất khảo sát:  Môi trường casein: 1% casein, 2% agar  Môi trường chitin: 1% huyền phù chitin, 2% agar  Môi trường 훽- glucan: 1% 훽- glucan, 2 % agar Tất cả môi trường đều hòa vào dung dịch đệm photphate pH = 7. Bơm protein kết tủa được ở từng nồng độ ethanol vào đĩa thạch như khảo sát enzyme của dịch nuôi cấy sau ly tâm. Sử dụng đối chứng đệm phosphate pH = 7,0 thay cho kết tủa protein. Đem ủ ở 37 o C trong 48 giờ. (Thí nghiệm lặp lại 3 lần).  Hoạt tính protease dương tính khi môi trường xung quanh đĩa tạo vùng trong suốt, có thể tăng độ tương phản nhờ nhỏ Lugol trên bề mặt thạch.  Hoạt tính chitinase dương tính khi môi trường xung quanh đĩa tạo vùng trong suốt, có thể tăng độ tương phản nhờ nhỏ Lugol trên bề mặt thạch.  Hoạt tính 훽- glucanase dương tính khi môi trường xung quanh đĩa tạo vùng trong suốt, có thể tăng độ tương phản nhờ nhỏ Lugol trên bề mặt thạch. Chuẩn bị đĩa thạch chứa cơ chất khảo sát như khảo sát enzyme của dịch nuôi cấy sau ly tâm. 41 Đồ án tốt nghiệp Khảo sát khả năng đối protein kết tủa với CĐb1. Chuẩn bị môi trường: môi trường được chuẩn bị như phần khảo sát khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy sau ly tâm với nấm CĐP1. Bơm protein kết tủa được ở từng nồng độ ethanol vào đĩa thạch như khảo sát enzyme của dịch nuôi cấy sau ly tâm. Sử dụng đối chứng đệm phosphate pH = 7,0 thay cho kết tủa protein. Đem ủ ở 30 o C trong 5 ngày. (Thí nghiệm lặp lại 3 lần). Khảo sát khả năng đối kháng của dung dịch protein kết tủa tương tự như mô tả trong quy trình đối kháng dịch ly tâm canh trường nuôi cấy vi khuẩn, ngoài đối chứng nấm mọc trên đĩa không bổ sung dịch vào giếng thạch, còn có thêm đối chứng đệm phosphate để khảo sát ảnh hưởng của đệm phosphate lên sự phát triển nấm mốc. 2.4.1.7 Trích li canh trường nuôi cấy sau li tâm bằng ethyl acetate 42 Đồ án tốt nghiệp Hình 2.4: Quy trình thu hồi cao EA Lấy 20 ml dịch nuôi cấy sau li tâm cho vào bình trích ly, sau đó thêm 20 ml ethyl acetate lắc đều, để yên cho đến khi phân pha. Thu lấy pha hữu cơ (phần dịch nổi phía trên). Pha nước (phần dịch ở dưới) sẽ đem trích li với ethyl acetate lần thứ 2 và 3 với tỷ lệ 1:1. Tiến hành trích ly đối với dịch sau ly tâm thu được sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ nuôi cấy. Pha hữu cơ (gom 3 lần trích ly) được làm khô với Na2SO4, lọc loại bỏ Na2SO4, sau 0 đó cô quay để bay hơi ở nhiệt độ 50 C. Thu hồi cặn rắn và đem cân (17 mg), sau đó hòa tan trong DMSO 5 % với nồng độ mg/ml thu được cao EA. 43 Đồ án tốt nghiệp Cao EA sau khi thu được đem thanh trùng 70 0C trong 15 phút sau đó tiến hành khảo sát khả năng đối kháng với nấm CĐP1. Khảo sát khả năng đối kháng cao ethyl acetate với CĐP1. Khảo sát khả năng đồi kháng nấm của cao chiết bằng ethyl acetate từ dịch nuôi cấy sau ly tâm ở từng thời gian nuôi cấy 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ Chuẩn bị môi trường Bơm vào đĩa petri đã được vô trùng 1 ml cao ethyl acetate sau đó cho 9 ml môi trường PDA được hấp khử trùng 1210C, 1atm trong 15 phút, lắc nhẹ. Đĩa đối chứng thay cao ethyl acetate bằng DMSO 5%. Nấm đã được chuẩn bị trước bằng cách cấy điểm 1 bào tử ở tâm đĩa petri trên môi trường PDA, ủ từ 3 đến 5 ngày. Tiến hành đối kháng Cắt miếng thạch có chứa bào tử nấm đặt vào giữa đĩa môi trường đã chuẩn bị sẵn. Đem ủ ở 30 0C trong 5 ngày. Khảo sát khả năng đối kháng nấm của cao chiết bằng ethyl acetate từ dịch nuôi cấy sau ly tâm ở từng nồng độ cao khác nhau Chuẩn bị môi trường Từ kết quả đối kháng nấm của cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi cấy sau ly tâm ở từng thời gian nuôi cấy, biết được thời gian nuôi cấy nào tốt nhất. Bơm vào đĩa petri đã được vô trùng cao ethyl acetate và môi trường PDA được hấp khử trùng 1210C, 1atm trong 15 phút với nồng độ 0,5 ml cao ethyl acetate + 0,5 ml DMSO 5 % + 9 ml PDA, 1 ml cao ethyl acetate + 9 ml PDA, 1,5 ml cao ethyl acetate + 8,5 ml PDA, 2 ml cao ethyl acetate + 8 ml PDA. Sau đó lắc nhẹ. Đĩa đối chứng thay cao ethyl acetate bằng DMSO 5%. Nấm đã được chuẩn bị trước bằng cách cấy điểm 1 bào tử ở tâm đĩa petri trên môi trường PDA, ủ từ 3 đến 5 ngày. Tiến hành đối kháng 44 Đồ án tốt nghiệp Cắt miếng thạch có chứa bào tử nấm đặt vào giữa đĩa môi trường đã chuẩn bị sẵn. Đem ủ ở 37 0C trong 5 ngày. Khảo sát thành phần hóa học dịch nuôi cấy, dịch kết tủa bằng cồn và cao ethyl acetate. Để xác định tác nhân đối kháng nấm mốc, canh trường sau khi loại bỏ tế bào được sử dụng để kết tủa protein và trích ly các hợp chất khác protein bằng dung môi kị nước chủ yếu nhằm vào các hợp chất thứ cấp VK. Bằng các phương pháp định tính các hợp chất hóa học truyền thống như thuốc thử molisch cho carbohydrate, thuốc thử biuret cho liên kết peptide, thuốc thử ninhydrin cho nhóm NH2- tự do, coomasie blue cho lipid, Dragendorff cho alkaloid. Định tính carbohydrate Thử nghiệm Molisch: Hút một ít dịch cho vào ống nghiệm, sau đó cho vài giọt thuốc thử Molisch vào, tiếp tục nhỏ từ từ 2 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc vào và đọc kết quả. Kết quả được xem là dương tính khi có hình thành phức hợp màu đỏ - tím. Định tính alkaloid Thử nghiệm Dragendorff: Hút một ít dịch cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu vàng cam. Định tính amino acid Thử nghiệm Ninhydrin: Hút một ít dịch cho vào ống nghiệm, sau đó cho vào một vài giọt thuốc thử Ninhydrin, đun sôi 5 phút và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi thấy xuất hiện màu tím (Yadav và ctv, 2013). Định tính protein 45 Đồ án tốt nghiệp Thử nghiệm Biuret: Hút một ít dịch cho vào ống nghiệm, sau đó cho vào một vài giọt thuốc thử Biuret, lắc đều sau đó để yên. Kết quả dương tính khi thấy xuất hiện màu tím hoặc màu hồng tím. Định tính lipid Thử nghiêm thực hiện trên bản mỏng. Chấm dịch trên bảng mỏng sau đó sử dụng thuốc thử coomasie blue phun hiện màu. Kết quả dương tính là xuất hiện màu xanh ở điểm chấm dịch. 46 Đồ án tốt nghiệp 2.4.2 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của VK có hoạt tính kháng nấm trong bảo quản hạt Hạt đậu phộng Khử trùng Coating trong 3 giờ Để khô ở nhiệt độ phòng Phối 12 g đậu phộng vào chai 100 ml Bào tử nấm được pha Cấy bào tử nấm vào loãng tới 10-6 chai chứa đậu phộng Ủ ở nhiệt độ phòng Quan sát thời gian từ 3 – 10 ngày Hình 2.5: Sơ đồ ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng bằng màng bao kháng nấm 47 Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.1: Bố trí các thí nghiệm tạo màng bao hạt đậu phộng Thí nghiệm Dung dịch Tỷ lệ % Đậu phộng (g) ĐC1 Nước cất 100% 12 ĐC2 Dd chitosan 0.2% trong acid acetic 1% 100% 12 Dd chitosan 0.2% trong acid acetic 1% 50% ĐC3 12 DMSO 5% 50% Dd chitosan 0.2% trong acid acetic 1% 50% ĐC4 12 Niystatin 0.4% 50% Dd chitosan 0.2% trong acid acetic 1% 50% NT1 12 Canh trường trong môi trường NB1 50% TN1 Dd chitosan 0.2% trong acid acetic 1% 50% NT2 12 Canh trường trong môi trường NB 50% Dd chitosan 0.2% trong acid acetic 1% 50% NT1 12 Sinh khối NB1 + nước muối sinh lý 50% TN2 Dd chitosan 0.2% trong acid acetic 1% 50% NT2 12 Sinh khối NB + nước muối sinh lý 50% Dd chitosan 0.2% trong acid acetic 1% 50% NT1 12 Dịch nuôi cấy sau ly tâm. 50% TN3 Dd chitosan 0.2% trong acid acetic 1% 50% NT2 12 Dịch nuôi cấy sau ly tâm xử lý 1000C 50% Dd chitosan 0.2% trong acid acetic 1% 50% TN4 12 cao EA trong DMSO 5% 50% Điều chỉnh các dung dịch về pH 5 48 Đồ án tốt nghiệp Khử trùng hạt đậu phộng Hạt đậu phộng được khử trùng bằng cồn 700 và rửa lại bằng nước cất. Ngâm hạt trong dung dịch màng bao trong 3 giờ. Ngâm mẫu hạt đậu phộng đã khử trùng trong 3 giờ lần lượt trong các dung dịch được chuẩn bị theo như bảng 2.1. Làm khô hạt Sau đó, đậu phộng đã ngâm được làm khô ở nhiệt độ phòng và phân phối vào chai 100ml. Cấy bào tử nấm Bào tử nấm chỉ thị aflatroxin được chuẩn bị trước bằng cách cấy điểm 1 bào tử ở tâm đĩa petri đường kính 9 cm đổ môi trường PDA, ủ từ 3-5 ngày. Tiến hành cắt 1 miếng thạch kích thước 1x1 (cm) có chứa bào tử nấm cho vào ống nước muối sinh lý đã hấp khử trùng. Sau đó, pha loãng đến nồng độ 10-6. Hút 0.1 ml dịch pha loãng nồng độ 10-6 vào các chai 100ml chứa 12 g đậu phộng. Lặp lại mỗi thí nghiệm 3 lần. Lắc đều chai đậu phộng và ủ ở nhiệt độ phòng. Quan sát kết quả theo thời gian 3, 5, 7, 12 ngày. 49 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Sản xuất sinh khối nấm Aspergillus sp. CĐP1 làm cảm ứng hợp chất kháng nấm cho vi khuẩn Bacillus sp. CS1b Theo nghiên cứu ĐATN Nguyễn Vân Hương (K2011) [3], chủng Bacillus sp. CS1b chỉ thể hiện khả năng kháng nấm khi được đối kháng trực tiếp hoặc thu dịch nuôi cấy trong môi trường có tơ nấm làm cảm ứng. Vì vậy để tiếp tục nghiên cứu sản xuất hợp chất kháng nấm từ Bacilus sp. CS1b, việc đầu tiên là sản xuất sinh khối tơ nấm từ nấm chỉ thị Aspergillus sp. CĐP1. Sau khi tăng sinh được 48 giờ tiến hành thu sinh khối nấm, sinh khối nấm màu vàng nhạt và lơ lửng trong môi trường nuôi cấy (hình 3.1) a) b) Hình 3.1: Sản xuất sinh khối tơ nấm CĐP1 trong môi trường PDB a) Dịch nuôi cấy, b) Sinh khối tơ nấm sau khi sấy. Tính toán hàm lượng % nitơ tổng số có trong sinh khối nấm CĐP1 sấy khô. 1.42 × (푉1−푉2) × 100 1.42 × (20 −18) × 100 N% = × 푓 = × 1 = 2,84 % 푚×1000 0.1×1000 50 Đồ án tốt nghiệp Trong đó:  V1: số ml H2SO4 0,1N cho vào bình hứng.  V2: số ml NaOH 0,1N ddax chuẩn độ.  m: số g mẫu.  1,42: hệ số, cứ 1ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với 1,42 mg Nitơ.  1000: hệ số chuyển đổi mg sang g.  f: hệ số pha loãng ( 푓 = 푎 với v: thể tích dung dịch đem cất đạm, a: thể tích bình 푣 định mức chứa mẫu sau vô cơ hóa) Hàm lượng % protein tổng số được tính theo công thức: P(%) = N × 6.25 = 2,84 x 6,25 = 17,75 % Trong đó:  N: hàm lượng % Nitơ tổng số  6.25: hệ số chuyển đổi. 3.2 Xác định thời gian nuôi cấy để khả năng đối kháng nấm CĐP1 cực đại Trong môi trường nuôi cấy có bổ sung tơ nấm làm chất cảm ứng, các hợp chất kháng nấm có thể được sinh ra đồng thời với tăng trưởng tức là sau 24 giờ nuôi cấy hoặc trễ hơn. Vì vậy, vi khuẩn được nuôi cấy theo từng thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và khảo sát khả năng đối kháng nấm mốc của dịch nuôi cấy sau ly tâm loại bỏ tế bào và dịch nuôi cấy sau ly tâm xử lý nhiệt. 3.2.1 Dịch nuôi cấy sau ly tâm Tiến hành khảo sát khả năng đối kháng của dịch sau ly tâm với nấm CĐP1 bằng phương pháp khuếch tán trong giếng thạch nhằm chọn ra thời gian nuôi cấy để vi khuẩn tiết ra hợp chất có khả năng kháng nấm CĐP1 tốt. Sau 5 ngày đọc kết quả xác định tỷ lệ đối kháng. So với đối chứng chỉ cấy nấm, hình thái nấm mốc trong các đĩa 51 Đồ án tốt nghiệp cấy dịch nuôi cấy có tơ nấm CĐP1 làm chất cảm ứng thu ở từng thời điểm 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ đều phát triển không bình thường, nấm bị khuyết tại các điểm bơm dịch nuôi cấy (hình 3.2 A, B, C). Hình 3.2: Kết quả đối kháng của dịch sau ly tâm của VK CS1b với nấm CĐP1, ĐC âm: sử dụng môi trường NB1, ĐC dương: sử dụng Nystatin, - Thí nghiệm không xử lý nhiệt: A: 24 giờ, B: 48 giờ, C: 72 giờ, - Thí nghiệm xử lý nhiệt 100 0 C: D: 24 giờ, E: 48 giờ, F: 72 giờ 52 Đồ án tốt nghiệp Kết quả đối kháng của dịch nuôi cấy sau ly tâm ở 24 giờ cho tỷ lệ đối kháng cao nhất 60,1 %. Ở thời điểm 24 giờ khả năng sinh trưởng và phát triển của Bacillus là cao nhất và có thể tiếp tục phát triển lên đến thời gian 72 giờ. Từ khảo sát trên thấy rằng ở thời điểm 24 giờ vi khuẩn sinh ra các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học cao nhất và hoạt tính giảm dần sau 48 giờ và 72 giờ. 3.2.2 Dịch nuôi cấy sau ly tâm xử lý nhiệt Nuôi cấy vi khuẩn CS1b trong môi trường có bổ sung tơ nấm, sau đó thu dịch nuôi cấy theo từng thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ rồi đem đi đun cách thủy ở nhiệt độ 1000C. Khảo sát khả năng đối kháng của dịch sau ly tâm với nấm CĐP1 bằng phương pháp khuếch tán trong giếng thạch. Sau 5 ngày đọc kết quả xác định tỷ lệ đối kháng. Đĩa thạch sử dụng môi trường NB1 làm đối chứng nấm phát triển mạnh mẽ, các đĩa cấy dịch nuôi cấy thu được ở từng thời điểm 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ nấm phát triển chậm (hình 3.2 D, E, F). Kết quả đối kháng của dịch nuôi cây sau ly tâm ở 24 giờ cho tỷ lệ đối kháng cao nhất 50,4 %. Quá trình xử lý nhiệt 100 0 C nhằm phá hủy và ngăn chặn sự ảnh hưởng của các enzyme có mặt trong dịch nuôi cấy sau ly tâm của VK CS1b lên khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy VK CS1b sau ly tâm và nấm CĐP1, ngoài ra quá trình khảo sát này còn cho ta biết được trong trong quá trình Bacillus spp (CS1b) sinh trưởng và phát triển thì chúng đã tiết ra các hợp chất kháng sinh có hoạt tính sinh học có khả năng ức chế sự sinh trưởng của nấm. 3.2.3 So sánh khả năng đối kháng dịch nuôi cấy sau ly tâm với nấm CĐP1 của dịch nuôi cấy CS1b ở từng thời gian nuôi cấy và điều kiện xử lý nhiệt Tỷ lệ đối kháng của dịch nuôi cấy vi khuẩn CS1b ở 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ với nấm CĐP1 được trình bày ở bảng 3.1. 53 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1: Tỷ lệ đối kháng (%) của dịch nuôi cấy VK CS1b với nấm CĐP1. TỶ LỆ ĐỐI KHÁNG CỦA DỊCH SAU LY TÂM VỚI CĐP1 Điều kiện 24 giờ 48 giờ 72 giờ ĐC NB ĐC Nystatin 0,4 % Nhiệt độ thường (%) 60,1 ± 0,7a 35,7 ± 1,3c 30,7 ± 3,6c 0,0 ± 0,7 64,3 ± 1,9a Xử lý 100 0C (%) 50,4 ± 2,9b 32,4 ± 1,9c 20,6 ± 2,5d 0,0 ± 0,7 64,3 ± 1,9a (Ghi chú : Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa α = 0,05 trong cùng một thí nghiệm) Ở điều kiện nhiệt độ thường khả năng đối kháng của dịch sau ly tâm có bổ sung tơ nấm ở thời gian nuôi cấy 24 giờ cho tỷ lệ kháng tốt nhất 60,1 % cùng hạng a với đối chứng dương Nystatin 64,3 %. Ở điều kiện xử lý nhiệt khả năng đối kháng của dịch sau ly tâm ở từng thời gian nuôi cấy thì ở 24 giờ cho tỷ lệ kháng tốt hơn 50,4 % xếp hạng b. Tỷ lệ kháng không có sự khác biệt ở dịch sau ly tâm không xử lý nhiệt ở thời gian 48 giờ tỷ lệ 35,7 %, 72 giờ tỷ lệ 30,7 % và dịch sau ly tâm xử lý nhiệt ở 48 giờ tỷ lệ 32,4 % cả 3 cùng xếp hạng c. Tỷ lệ kháng thấp nhất là dịch nuôi cấy sau ly tâm xử lý nhiệt 100 0 C ở 72 giờ nuôi cấy là 20,6 % xếp hạng d. Sau khi khảo sát khả năng đối kháng của dịch sau ly tâm ở từng thời gian nuôi cấy thì dịch nuôi cấy sau ly tâm ở 24 giờ nuôi cấy cho tỷ lệ đối kháng cao nhất 60,1 % (hình 3.3) xếp cũng hạng a với đối chứng dương Nystatin 64,3 %. Sự khác biệt có mức ý nghĩa α = 0,05 với độ tinh cậy 95 %. 54 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn khả năng đối kháng nấm CĐP1 của dịch nuôi cấy CS1b ở từng thời gian nuôi cấy và từng điều kiện xử lý dịch sau ly tâm. 3.3 Khảo sát khả năng đối kháng nấm của protein kết tủa từ dịch nuôi cấy vi khuẩn CS1b sau ly tâm. 3.3.1 Quy trình thu hồi protein kết tủa có hoạt tính sinh học Với các ưu điểm của ethanol trong việc sử dụng làm dung môi thu hồi enzyme như:  Thu hồi được enzyme ở dạng tinh khiết với ít tạp chất gây nhiễm độc hay ức chế đối với enzyme  Nhiệt độ bay hơi của enzyme thấp nên dễ dàng tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzyme bằng phương pháp sấy nhẹ bằng gió.  Giá thành tương đối rẻ. Tuy nhiên bên cạnh đó thì tủa bằng ethanol cũng tồn tại một số hạn chế như: làm mất hoạt tính sinh học của enzyme, thời gian thu hồi quá lâu hay quá nhanh cũng làm ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme, nhiệt độ thu hồi quá cao hay quá thấp cũng gây mất hoạt tính của chúng 55 Đồ án tốt nghiệp Với mục đích của bài là thu hồi enzyme có độ tinh khiết cao, hàm lượng nhiều, có thể ứng dụng vào sản xuất thì ethanol 960 được lựa chọn là dung môi thu hồi. Từ kết quả đối kháng dịch ly tâm của canh trường nuôi cấy VK CS1b với nấm CĐP1 cho ta biết đươc thời gian nuôi cấy VK ở 24 giờ thì dịch sau ly tâm cho tỷ lệ đối kháng cao nhất. Có thể trong thời gian này thì hoạt tính enzyme mạnh, vì vậy dịch ly tâm từ canh trường nuôi cấy VK CS1b sau 24 giờ sẽ được đem đi kết tủa protein có hoạt tính sinh học. Tiến hành tủa protein ở các nồng độ dịch : ethanol từ 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32. Hỗn hợp sẽ để trong tủ lạnh ngăn mát qua đêm rồi mới đem ly tâm thu tủa. Quá trình ly tâm cũng ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme. Khi ly tâm ở tốc độ lớn hay trong thời gian dài thì làm nhiệt độ trong hỗn hợp tăng lên có thể làm biến tính protein mất hoạt tính enzyme. Trong luận văn tốt nghiệp của hai sinh viên Văn Hương và Tuyết Mai (2015) đã thu dịch nổi từ ly tâm canh trường nuôi cấy ở 4000 vòng/phút trong hai 20 phút. Khi đem định tính enzyme thì chúng vẫn cho kết quả các enzyme protease, chitinase, β- glucanase dương tính. Vì vậy hỗn hợp dịch : ethanol sẽ ly được ly tâm ở 4000 vòng/phút trong hai 20 phút. Enzyme hoạt động tốt ở pH trung tính do đó đệm phosphate pH 7 sẽ được sử dụng để hòa tan protein kết tủa. 3.3.2 Định tính enzyme protease, chitinase, 휷- glucanase của protein kết tủa. Áp dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch để định tính enzyme protease, chitinase và β – glucanase có trong từng nồng độ ethanol dùng để kết tủa protein từ 1:1 – 1:32. Ghi lại kết quả sau 48 giờ ủ ở nhiệt độ 370C. Các tỷ lệ dịch : ethanol thu protein kết tủa đều có hoạt tính enzyme chitinase (hình 3.4 và bảng 3.2). Hoạt tính protease cũng được thấy rõ ở các tỷ lệ kết tủa protein (hình 3.5 và bảng 3.2). Riêng khi khảo sát enzyme β – glucanase sử dụng cơ chất β – glucan thì không thấy được các vòng phân 56 Đồ án tốt nghiệp hủy β – glucan màu sáng (hình 3.6). Bảng 3.2 cho thấy đường kính vòng phân giải của chủng vi khuẩn trên đĩa thạch chứa cơ chất tương ứng. Do đây chỉ là phương pháp định tính nên cũng chưa thực sự chính xác. Để xác định rõ sự có mặt của các enzyme này ta cần tiến hành định lượng chúng vì cũng có thể do sự ảnh hưởng của cồn làm mất hoạt tính của 훽– glucanase. Bảng 3.2: Đường kính phân giải của enzyme của protein kết tủa bằng ethanol KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME CỦA PROTEIN KẾT TỦA (mm) Tỷ lệ dịch : ethanol 960 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 Đường kính (chitinase) 18 23 27 27 21 20 Đường kính (protease) 15 20 24 23 22 20 Hình 3.4: Khả năng phân giải chitin của protein kết tủa, Protein kết tủa ở tỷ lệ dịch : ethanol: 1:1, 1:2 , 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 57 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5: Khả năng phân giải casein của protein kết tủa. Protein kết tủa ở tỷ lệ dịch : ethanol: 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 Hình 3.6 Khả năng phân giải 훽– glucanase của protein kết tủa. Protein kết tủa ở tỷ lệ dịch : ethanol: 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 58 Đồ án tốt nghiệp 3.3.3Khảo sát khả năng đối protein kết tủa với CĐb1 Sự ảnh hưởng của đệm phosphate lên sự phát triển nấm mốc là không đáng kể. Trong thí nghiệm, đối chứng có đệm có tỷ lệ đối kháng không đáng kể (12%) trong khi sử dụng enzyme thì đối kháng cao lên tới 58 % bảng 3.3. Tỷ lệ đối kháng với nấm CĐP1 của protein kết tủa thu được ở từng nồng độ kết tủa dịch : cồn không giống nhau và sự khác biệt này không có ý nghĩa. Mặc dù ethanol 960 là dung môi có ưu điểm thu được enzyme với độ tinh sạch cao tuy nhiên với nồng độ ethanol quá cao thì có thể gây biến tính enzyme làm cho enzyme mất hoạt tính. Ở tỷ lệ dịch : ethanol từ 1:1 (41 %) đến 1:2 (48 %) thì tỷ lệ đối kháng với nấm tăng lên và sau đó giảm ở ở tỷ lệ 1:4 (35 %). Điều này có thể cho thấy rằng ở tỷ lệ 1:2 ta thu được tủa protein có hoạt tính tương đối tốt và đến tỷ lệ 1:4 thì có thể do nồng độ ethanol cao làm biến tính protein làm khả năng đối kháng với nấm CĐP1 giảm xuống. Nhưng từ tỷ lệ 1:8 đến 1:32 thì tỷ lệ đối kháng này tăng lên đáng kể. Nguyên nhân dẫn đến sự tăng đột