Đồ án Khảo sát khả năng kháng khuẩn trong cao chiết lá đắng (vemonia amygdalina del)

cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dƣới sự hƣớng dẫn của ThS. Nguyễn Thị Thu Hƣơng. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. TP. Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên Từ Công Tính Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trƣờng cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua. Qua đây em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Thị Thu Hƣơng, ngƣời đã định hƣớng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trƣờng cùng các anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài của mình. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng nhƣ trong cuộc sống. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên Từ Công Tính Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC .................................................................................................................i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................ v DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... vi DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................... vii MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................... 4 1.1. Giới thiệu về cây lá đắng. ............................................................................... 4 1.1.1. Nguồn gốc ................................................................................................. 4 Cây lá đắng thuộc họ Cúc (Asteraceae) là họ lớn và phổ biến rộng rãi hiện nay, bao gồm 1000 chi và 20,000 loài, phân bố ở khắp các nƣớc trên thế giới. Cây lá đắng. sống đƣợc ở rất nhiều môi trƣờng khác nhau. Ở nƣớc ta, có 125 chi và 350 loài, phân bố rộng rãi từ vùng ven biển đến các vùng núi cao tới 3000 m so với mặt biển. [1]. ................................................................................................ 4 1.1.2. Phân loại .................................................................................................. 4 1.1.3. Đặc điểm và sự phân bố ............................................................................ 4 1.1.4. Tính chất dược lý của cây lá đắng. ........................................................... 5 1.2. Tổng quan về các hợp chất thứ cấp có khả năng kháng khuẩn trong thực vật . 7 1.2.1. Alkaloid ..................................................................................................... 7 1.2.2. Flavonoid .................................................................................................. 9 1.2.3. Steroid..................................................................................................... 12 1.2.4. Tanin ....................................................................................................... 13 1.3. Các phƣơng pháp tách chiết hợp chất từ thực vật .......................................... 16 1.3.1. Định nghĩa tách chiết hợp chất hợp chất từ thực vật .............................. 16 1.3.2. Các phương pháp tách chiết cao từ thực vật........................................... 17 1.3.3. Phương pháp tách chiết cao một số chất từ thực vật .............................. 24 1.4. Cơ sở khoa học kháng khuẩn của các hợp chất thứ cấp có trong thực vật ..... 26 1.4.1. Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn ........................................................... 26 1.4.2. Cơ chế kháng khuẩn của một số hợp chất ở thực vật .............................. 26 1.4.3. Tình hình nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của thực vật ở thế giới và tại Việt Nam ........................................................................................................... 28 1.4.4. Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum inhibitory concentration - MIC) ở cao chiết thực vật .............................................................................................. 29 i Đồ án tốt nghiệp 1.5. Các nhóm vi khuẩn gây hại phổ biến ở ngƣời ............................................... 30 1.5.1. Nhóm Escherichia coli ............................................................................ 30 1.5.2. Nhóm Samonella. .................................................................................... 32 1.5.3. Bacillus sppp ........................................................................................... 34 1.5.4. Staphylococcus arueus ............................................................................ 35 1.5.5. Nhóm Listeria spp. .................................................................................. 36 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 38 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................. 38 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................... 38 2.1.2. Thời gian nghiên cứu .............................................................................. 38 2.2. Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................... 38 2.2.1. Nguồn mẫu .............................................................................................. 38 2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị .................................................................................... 38 2.2.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị .................................................................. 39 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................... 40 2.3.1. Phương pháp xử lí nguồn mẫu ................................................................ 40 2.3.2. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật ..................................... 40 2.3.3. Phương pháp pha loãng mẫu .................................................................. 40 2.3.4. Phương pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị ............................................... 41 2.3.5. Phương pháp tách chiết và thu nhận cao thực vật .................................. 41 2.3.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn từ cao chiết thực vật ...... 42 2.3.7. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) .......................... 42 2.3.8. Phƣơng pháp xử lí số liệu ....................................................................... 43 2.4. Bố trí thí nghiệm ........................................................................................... 43 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất thu hồi cao từ cây lá đắng. ............................................................................... 45 2.4.2. Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ cây lá đắng. ....................................................... 46 2.4.3. Thí nghiệm 3: xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) ......................... 47 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 49 3.1. Kết quả hiệu suất thu hồi cao chiết của các dung môi khác nhau từ cây lá đắng. .................................................................................................................... 49 ii Đồ án tốt nghiệp 3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết từ cây lá đắng. ... 50 3.2.1. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm E. coli .......................................................................................................................... 50 3.2.2. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết của các dung môi khác nhau trên Bacillus Cereus ......................................................................................... 52 3.2.3. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết của các loại dung môi trên nhóm Salmonella. ............................................................................................. 54 3.2.4. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết của các dung môi trên S. Aureus. .............................................................................................................. 56 3.2.5. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết của các dung môi khác nhau trên nhóm Listeria monocytogenes. .................................................................. 58 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................... 61 1. Kết luận ....................................................................................................... 61 2. Kiến nghị ..................................................................................................... 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 62 PHỤ LỤC A ............................................................................................................. 1 Kết quả thu hồi cao chiết từ cây lá đắng. ............................................................... 1 PHỤ LỤC B ............................................................................................................. 2 1.1. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm E. Coli 2 1.2. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết của các dung môi khác nhau trên Bacillus Cereus. ........................................................................................... 3 1.3. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết của các loại dung môi trên nhóm Salmonella. ............................................................................................... 4 1.4. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết của các dung môi trên S. Aureus. ............................................................................................................... 5 1.5. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết của các dung môi khác nhau trên nhóm Listeria monocytogenes. .................................................................... 6 PHỤ LỤC C ............................................................................................................. 7 Kết quả xử lý số liệu đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết trên các nhóm vi khuẩn. ...................................................................................................... 7 1.1. Kết quả xử lý số liệu của S.Aurius ............................................................ 7 1.2. Kết quả xử lý số liệu B. Cereus ................................................................ 8 1.3. Kết quả xử lý số liệu Samonella. .............................................................. 9 1.4. Kết quả xử lý số liệu E. Coli. .................................................................. 10 iii Đồ án tốt nghiệp 1.5. Kết quả xử lý số liệu Listeria monocytogenes. ....................................... 11 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT - NB: Nutrient Broth - NA: Nutrient Agar - EMB: Eosin Methylene Blue Agar - XLD: Xylose Lysine Desoxycholate Agar - DMSO: dimethylsulfoxid v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng E.coli của cao chiết trên các dung môi .... 50 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng Bacillus cereus của cao chiết các dung môi ............................................................................................................................... 52 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng Salmonella của cao chiết các dung môi .... 54 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng S.aureus của cao chiết các dung môi ........ 56 Bảng 3.5 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng Listeria monocytogenes của cao chiết các dung môi ................................................................................................................ 58 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây lá đắng ..................................................................................................... 4 Hình 1.2. Công thức phân tử Enpherine ......................................................................... 8 Hình 1.3. Một số Eucoflavonoid ................................................................................... 10 Hình 1.4. Cấu tạo Isoflavon và rotenoid ....................................................................... 10 Hình 1.5. Cấu tạo Calophyllolid ................................................................................... 11 Hình 1.7. Cấu tạo Steroid ............................................................................................. 12 Hình 1.8. Cấu tạo Tanin ............................................................................................... 13 Hình 1.9. Cấu tạo Acid digallic và Acid trigallic.......................................................... 14 Hình 1.10. Cấu tạo penta-O-galloyl-glucose. ............................................................... 15 Hình 1.11. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt ............................................................................. 18 Hình 1.12. Bộ chiết Soxhlet ......................................................................................... 20 Hình 1.13. Máy chiết Kumagawa ................................................................................. 21 Hình 1.14. Bộ lôi cuốn hơi nƣớc .................................................................................. 21 Hình 1.15. Sơ đồ hệ thống chiết siêu tới hạn ................................................................ 23 Hình 1.16. Cột chiết pha rắn ......................................................................................... 24 Hình 1.17. Cơ chế kháng khuẩn ................................................................................... 28 Hình 1.18. Hình vi khuẩn Escherichia coli .................................................................. 31 Hình 1.19. Hình vi khuẩn Salmonella .......................................................................... 33 Hình 1.19. Hình vi khuẩn Bacullus spp. ....................................................................... 34 Hình 1.20. Hình vi khuẩn Staphylococcus arueus ........................................................ 35 Hình 1.21. Hình vi khuẩn Listeria monocytogenes ....................................................... 36 Hình 2.1. Hình ảnh cây Lá đắng ................................................................................... 38 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ................................................................. 44 Hình 2.4. Mẫu ngâm trong dung môi ........................................................................... 45 Hình 2.4. Sơ đồ đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết .................................... 46 Hình 2.6. Sơ đồ xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) ............................................ 47 Hình 3.1. Hiệu suất thu hồi cao chiết của các dung môi khác nhau từ cây Lá đắng. .... 49 Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm E.coli .................... 51 vii Đồ án tốt nghiệp Hình 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ các dung môi khác nhau trên Bacillus Cereus. ........................................................................................................... 53 Hình 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ các dung môi trên nhóm Salmonella spp. ............................................................................................................ 55 Hình 3.5 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ các dung môi trên S. Aureus .......... 57 Hình 3.6 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ các dung môi khác nhau trên nhóm Listeria monocytogenes. ............................................................................................... 59 viii Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Từ nhiều thế kỷ nay, những bài thuốc Y học cổ truyền đƣợc coi nhƣ một kho tàng dƣợc liệu quý báu. Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, gió mùa nên đƣợc thừa hƣởng nguồn động thực vật vô cùng phong phú và đa dạng sinh học với nhiều cây, con dƣợc liệu quý. Các hợp chất thiên nhiên thể hiện hoạt tính sinh học rất phong phú và là một trong những định hƣớng làm chất dẫn đƣờng để các nhà khoa học có thể tổng hợp ra nhiều loại hoạt chất mới chống lại các bệnh hiểm nghèo, các chất bảo quản thực phẩm cũng nhƣ các chế phẩm phục vụ nông nghiệp có hoạt tính cao mà không ảnh hƣởng đến môi trƣờng. Việc sử dụng các loại thuốc thảo dƣợc theo cách cổ truyền hay từ các hợp chất nguồn gốc tự nhiên có xu hƣớng ngày càng tăng đã chiếm một vị trí quan trọng trong nền y học (Các thuốc chữa bệnh có nguồn gốc tự nhiên chiếm tới 60% ). Chế phẩm thảo dƣợc dù chỉ có một loại dƣợc liệu nhƣng lại là hỗn hợp của nhiều hợp chất khác nhau và trong mọi trƣờng hợp hầu hết còn chƣa xác định đƣợc rõ hoạt chất của chúng. Vì vậy, những bài thuốc sử dụng thảo dƣợc hay những cây dƣợc liệu là đối tƣợng để cho các nhà khoa học nghiên cứu một cách đầy đủ về bản chất các hoạt chất có trong cây cỏ thiên nhiên. Từ đó định hƣớng cho việc nghiên cứu, gieo trồng, thu hoạch, chiết xuất ra các loại hoạt chất mới hay bằng con đƣờng bán tổng hợp để tạo ra những chất có hoạt tính sinh học cao, nhanh chóng đƣa vào công tác chữa trị nhiều loại bệnh thông thƣờng cũng nhƣ nan y. Chính vì vậy, việc nghiên cứu hóa thực vật những cây cỏ thiên nhiên có một ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao. Hiện phong trào sử dụng lá cây “Mật gấu” làm thuốc rất phổ biến. Thực chất đây là cây Lá đắng (khi nhai lá có cảm giác đắng nhƣng sau đó lại có vị ngọt trong miệng) ở dạng ăn nhƣ rau hoặc nấu nƣớc uống. Cây này đƣợc sử dụng từ rất lâu trong y học dân gian ở một số nƣớc Châu Phi (Nigeria, Cameroon, Zimbawe) và Châu Á trong đó hiện phổ biến ở các Nƣớc Đông Nam Á. Xuất phát từ yêu cầu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Khảo sát khả năng kháng khuẩn trong cao chiết từ cây lá đắng ”. 1 Đồ án tốt nghiệp 2. Tình hình nguyên cứu: 2.1. Nghiên cứu trong nƣớc: 2.2. Nghiên cứu ngoài nƣớc: Effect of Vernonia amygdalina Del. Leaf Ethanolic Extract on Intoxicated Male Wistar Rats Liver (Iwo MI, Sjahlim SL, Rahmawati SF). Các tính chất chống oxy hóa trong chất chiết xuất lá Methanolic của Vernonia Amygdalina Del.(Adesanoye OA, Farombi EO,Niger J Physiol Khoa học . 2014). 3. Mục đích nghiên cứu - Đánh giá ảnh hƣởng của các loại dung môi đến hiệu suất thu hồi cao từ lá cây lá đắng.. - Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ lá cây lá đắng. - Xác định chỉ số MIC của cao chiết từ lá cây lá đắng. 4. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu về cở khoa học, tổng quan tài liệu vấn đề nghiên cứu làm cơ sở cho các nhiệm vụ tiếp theo. - Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm thu nhận dịch chiết lá cây lá đắng bằng kỹ thuật chiết ngâm dầm trong ethanol 50%, 70%, 90% và nƣớc. - Đánh giá hiệu suất thu hồi cao từ lá cây lá đắng. - Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ lá cây lá đắng trên các chủng vi khuẩn. - Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết từ lá cây lá đắng. 5. Phƣơng pháp nghiên cứu - Phƣơng pháp nghiên cứu tài liệu: Thu thập và nghiên cứu các tài liệu liên quan đến cây lá đắng, phƣơng pháp tăng sinh, pha loãng, bảo quản và giữ giống vi sinh vật, phƣơng pháp tách chiết và thu nhận cao chiết thực, phƣơng pháp đục lỗ thạch khảo sát kháng khuẩn, phƣơng pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu, phƣơng pháp xử lý số liệu. 2 Đồ án tốt nghiệp - Phƣơng pháp thí nghiệm: Dựa trên các tài liệu nghiên cứu làm cơ sở tiến hành các thí nghiệm nhằm giải quyết nội dung nghiên cứu. - Phƣơng pháp xử lý số liệu bằng Microsoft Excel và phần mềm xử lí số liệu Minitab 15. 6. Kết quả đạt đƣợc của đề tài - Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm thu nhận dịch chiết lá cây lá đắng bằng kỹ thuật chiết ngâm dầm trong ethanol 50%, 70%, 90% và nƣớc. - Đánh giá hiệu suất thu hồi cao từ lá cây lá đắng. - Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ lá cây lá đắng trên các chủng vi khuẩn. - Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết từ lá cây lá đắng. 7. Kết cấu đồ án tốt nghiệp - Mở đầu - Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu - Chƣơng 2: Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu - Chƣơng 3: Kết quả - Kết luận và kiến nghị - Tài liệu tham khảo 3 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về cây lá đắng. 1.1.1. Nguồn gốc Cây lá đắng thuộc họ Cúc (Asteraceae) là họ lớn và phổ biến rộng rãi hiện nay, bao gồm 1000 chi và 20,000 loài, phân bố ở khắp các nƣớc trên thế giới. Cây lá đắng. sống đƣợc ở rất nhiều môi trƣờng khác nhau. Ở nƣớc ta, có 125 chi và 350 loài, phân bố rộng rãi từ vùng ven biển đến các vùng núi cao tới 3000 m so với mặt biển. [1]. 1.1.2. Phân loại Phân loại khoa học của cây Lá đắng: Giới Plantae Bộ Asterids Họ Asteraceae Chi Vemonia Loài Vemonia Amygdalina Tên khoa Vemonia Amygdalina học Del Hình 1.1. Cây lá đắng 1.1.3. Đặc điểm và sự phân bố 1.1.3.1. Đặc điểm thực vật học Cây lá đắng sống lâu năm, là dạng cây bụi mọc thẳng đứng, chỉ cao từ 2-3m, đƣờng kính thân rất nhỏ khoảng 2-4 cm, cây thƣờng phân nhánh ở cành gốc, khi còn non thân cây đƣợc phủ một lớp lông trắng mịn về già lớp lông này rụng dần 4 Đồ án tốt nghiệp hết; cuống lá dài, phiến lá hình trái xoan ngƣợc, mép lá có hình răng cƣa, lá đơn mọc cách, phiến lá hình trái xoan có thể dài tới 20 cm, đầu lá nhọn, đuôi là nhọn hoặc hình nêm. Cây này có nguồn gốc từ châu Phi và hiện nay cây có mặt khắp nơi trên thế giới do cây dễ trồng dễ mọc. 1.1.3.2. Phân bố Ấn độ (Bihar, Madhya Pradesh, Odisha, West Bengal); châu Phi nhiệt đới; hiện nay cây Lá Đắng đã có mặt ở hầu hết các quốc gia trên thế giới. Ở Việt Nam, cây lá đắng đƣợc trồng ở nhiều nơi do đặc tính dễ trồng . 1.1.4. Tính chất dược lý của cây lá đắng. Những hợp chất trong Lá đắng có tác dụng hỗ trợ điều trị các bệnh do quá trình viêm mạn tính, lão hoá, bệnh nhiễm giun sán, động vật nguyên sinh (protozoan) và vi khuẩn. Theo công bố trên Quyển Y – Sinh học thực nghiệm tháng 2 năm 2004 (Experimental Biology and Medicine of February 2004 Edition) cho thấy lá Đắng có tác dụng hạ thấp tỉ lệ nguy cơ bị ung thƣ vú. Lá Đắng dùng nấu dạng canh rau hay xay nhuyễn lấy nƣớc uống nhƣ dạng nƣớc bổ dƣỡng trong nhiều dạng bệnh lý khác nhau. Nhiều thầy thuốc ở Châu Phi khuyên ngƣời dân dùng trị bệnh đƣờng tiêu hoá, đái tháo đƣờng, chán ăn, kiết lỵ và các chứng rối loạn tiêu hoá. Các Polyphenol có tính kháng viêm và anti – oxidant, thải độc, bảo vệ thận, gan, hỗ trợ điều trị một số bệnh ngoài da. Giảm đƣờng huyết, bao vệ tim mạch do giúp ổn định lipid máu. Kiểm soát đƣờng huyết nhờ các hợp chất đắng trong lá nên tốt cho ngƣời đái tháo đƣờng. Tăng cƣờng hệ miễn dịch cho cơ thể. Chữa rối loạn tiêu hóa, đau bụng và tả lỵ. Hạ sốt và điều trị cảm lạnh tích cực nhờ các hợp chất xanthones, acid phenolic trong lá. 5 Đồ án tốt nghiệp Điều trị các bệnh qua đƣờng tình dục nhƣ bệnh lậu nhờ tác dụng của các chất chống oxy hóa trong lá. Chống giun sán. Chống ung thƣ. Duy trì sức sống tình dục. Giúp nhuận trƣờng và chữa táo bón. Chống sốt rét vì chất đắng trong lá có thể thay thế cho quinin. Chữa đau họng, ho, trừ đờm, chỉ cần nhai một lá trƣớc khi đi ngủ vào ban đêm và sáng sớm sẽ thấy giảm các triệu chứng ho. Tăng cƣờng khả năng sinh sản, uống nƣớc lá đắng giúp kích thích khả năng sinh sản ở phụ nữ khó sinh. Các lá có chứa nhiều carotene, giúp cân bằng quá trình tổng hợp các hormon sinh dục nữ và duy trì nồng độ estrogen do đó giúp phụ nữ khỏe mạnh và kéo dài tuổi xuân. Chống buồn nôn và tăng cƣờng cảm giác ngon miệng. Hỗ trợ điều trị viêm gan siêu vi B và C. Tăng tiết sữa cho con bú. Hạ cholesterol xấu. Tẩy độc cho cơ thể, bảo vệ gan thận. Giảm đau và làm êm dịu thần kinh dễ ngủ. Chống mẩn ngứa ngoài da. Một số bài thuốc dân gian:  Lấy 10 lá, rửa sạch, bỏ vào bình hãm với 1.5 lít nƣớc sôi, đợi khoảng 15 phút là uống đƣợc. Uống thay nƣớc lọc hàng ngày. Cách này giúp duy trì sức sống tình dục, chống xuất tinh sớm.  Lấy 8 lá mật gấu, rửa sạch, giã nát hoặc xay nhuyễn, pha với nửa cốc bia, vắt lấy nƣớc uống trƣớc khi đi ngủ để trị thoái hóa đốt sống cổ.  Ấn Độ: dùng lá chữa tiểu đƣờng, dùng cành, rễ hỗ trợ điều trị HIV, hạ sốt, giảm ho, phát ban, cảm cúm, viêm vú.  Congo: dùng lá và vỏ rễ chữa kiết lỵ, viêm dạ dày, ruột, sốt rét, viêm gan, nhiễm giun.  Nam Phi: dùng rễ chữa sán máng (huyết hấp trùng), hiếm muộn, rối loạn kinh nguyệt. 6 Đồ án tốt nghiệp  Ở khu vực Tây Phi: dùng lá làm trà lợi tiểu, chữa táo bón, nhiễm trùng da, đái đƣờng, bệnh chuyển hóa liên quan đến gan  Ở Châu Phi: Trong một thí nghiệm lâm sàng sơ bộ, ngƣời ta dùng nƣớc sắc từ 25g lá tƣơi của cây Lá đắng điều trị cho các bệnh nhân sốt rét bởi ký sinh trùng đơn bào Plasmodium falciparum mức độ nhẹ ở châu Phi thấy rằng 67% có phản ứng lâm sàng, và trong số đó thì 71% là có các triệu chứng tái phát.[6] Không có phản ứng phụ trong quá trình thí nghiệm sơ bộ. 1.2. Tổng quan về các hợp chất thứ cấp có khả năng kháng khuẩn trong thực vật 1.2.1. Alkaloid 1.2.1.1. Định nghĩa Alkaloid có nguồn gốc từ chữ alkali (tiếng ả rập) là kiềm. Những hợp chất alkaloids có chứa dị vòng nitơ, có tính base thƣờng gặp ở trong nhiều loài thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài loài động vật, có phản ứng kiềm cho các muối với acid và các muối này dễ kết tinh, chúng là một nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng về nhiều mặt, đặc biệt trong lĩnh vực y học, có giá trị chữa bệnh cao và độc đáo (R.H.F. Manske, 1973). 1.2.1.2. Phân loại  Các alkaloid thông thƣờng đƣợc phân loại theo đặc trƣng phân tử chung của chúng, dựa trên kiểu trao đổi chất đƣợc sử dụng để tạo ra phân tử. Khi không biết nhiều về tổng hợp sinh học của các alkaloid, thì chúng đƣợc gộp nhóm theo tên gọi của các hợp chất đã biết.  Các nhóm alkaloid hiện nay bao gồm:  Nhóm pyridin: piperin, coniin, trigonellin, arecaidin, guvacin, pilocarpin, cyt isin, sppartein, pelletierin.  Nhóm pyrrolidin: hygrin, cuscohygrin, nicotin  Nhóm tropan: atropin, cocain, ecgonin, scopolamin  Nhóm quinolin: quinin, quinidin, dihydroquinin, dihydroquinidin, strychnin, brucin, veratrin, cevadin 7 Đồ án tốt nghiệp  Nhóm isoquinolin:Các ancaloit gốc thuốc phiện nhƣ morphin, codein, thebain, papaverin, narcotin, sanguinarin, narcein, hydrastin, .  Nhóm phenethylamin: mescalin, ephedrin, dopamin, amphetamin  Nhóm indol: Các tryptamin: DMT, N-metyltryptamin, psilocybin, serotonin Các ergolin: Các ancaloit từ cựa ngũ cốc/cỏ nhƣ ergin, ergotamin, axít lysergic v.v Hình 1.2. Công thức phân tử Enpherine 1.2.1.3. Tính chất của alkaloid Tính base: alkaloid là các base yếu, do sự có mặt của nguyên tử N. Nhƣng độ kiềm của alkaloid không giống nhau do ảnh hƣởng khác nhau của lớp điện tích nguyên tử N gây ra và ảnh hƣởng của các nhóm chức khác. Tính base của alkaloid giảm dần theo thứ tự amoni bậc 4, amoni bậc 1, amoni bậc 2, amoni bậc 3. Các base yếu sẽ cần môi trƣờng acid mạnh hơn để tạo thành muối trong dung dich nƣớc. Vì vậy ở môi trƣờng acid yếu một số alkaloid base mạnh có thể chuyển thành muối trong khi các base yếu vẫn tồn tại trong dung dịch dƣới dạng base. Tính hòa tan: Hầu hết các alkaloid base thực tế không tan trong nƣớc nhƣng tan trong các dung môi hữu cơ nhƣ CHCl3, ete và các ancol bậc thấp. Một số nhóm alkaloid có thêm các nhóm phân cực nên tan đƣợc một phần trong nƣớc hoặc trong kiềm. Ngƣợc lại, các muối alkaloid thƣờng tan trong nƣớc, cồn và không tan trong các dung môi ít phân cực. Mặt khác còn tùy theo tính chất của alkaloid nhƣ loại bay 8 Đồ án tốt nghiệp hơi hoặc không bay hơi mà dùng phƣơng pháp chiết xuất cho thích hợp (Phan Đình Châu, 1997). 1.2.1.4. Vai trò của alkaloid Các alkaloid trong thực vật có hàm lƣợng rất thấp và khó tách chiết. Có vai trò rất lớn trong y học, dƣợc phẩm Đối với thực vật: là những chất chuyển hóa thức cấp, chất bài tiết hoặc là sản phẩm cuối trong quá trình chuyển hóa thực vật. Là những chất dự trữ nitơ trong thực vật. Là những chất bảo vệ, chống các sinh vật ăn thực vật. Đối với con ngƣời: alkaloid thƣờng có hoạt tính sinh học mạnh đến rất mạnh. Một số chất dùng làm chất độc trong săn bắn (tubocurarin, curare) (Phan Đình Châu, 1997). 1.2.2. Flavonoid 1.2.2.1. Định nghĩa Flavonoid là một nhóm lớn các hợp chất tự nhiên hay gặp trong thực vật, thƣờng có màu sắc, phần lớn là màu vàng. Tuy nhiên một số hợp chất có màu xanh, tím, đỏ cũng đƣợc xếp và nhóm lớn flavoid vì đứng về mặt hóa học, chúng có cùng một loại khung (Ngô Văn Thụ, 1978). 1.2.2.2. Phân loại Flavonoid có cấu trúc mạch C6C3C6, đều có 2 vòng thơm. Tùy thuộc vào cấu tạo phần mạch C3 trong bộ khung C6C3C6, flavonoid đƣợc phân thành các nhóm sau: Eucoflavonoid: ...C): EPEC hiện nay đƣợc biết gồm một số type huyết thanh thƣờng gây bệnh tiêu chảy cấp (bệnh viêm dạ dày – ruột) ở trẻ nhỏ (trẻ dƣới một tuổi), có thể gây thành dịch. Enteroinvasive E. coli (EIEC): là loại E. coli gây bệnh tiêu chảy ở ngƣời lớn và trẻ em với các triêu chứng nhƣ đau bụng quặn, mót rặn, đi tiêu nhiều lần, phân có nhiều mũi nhầy và máu. Enteroadherent E. coli (EAEC): là loại E. coli bám dính đƣờng ruột gây bệnh do bám và niêm mạc và làm tổn thƣơng chức năng ruột. 1.5.2. Nhóm Samonella. 1.5.2.1. Đặc điểm Salmonella là trực khuẩn gram âm, có khả năng di động, kích thƣớc tế bào khoảng 0,5 – 3 µm. Là vi khuẩn hiếu khí hay hiếu khí tùy nghi, thích hợp ở 370C, pH tối ƣu 7,2 – 7,6. 32 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.18. Hình vi khuẩn Salmonella 1.5.2.2. Khả năng gây bệnh Salmonella xâm nhập vào cơ thể qua đƣờng miệng và hầu hết là do ăn phải thức ăn bị nhiễm nhƣ thực phẩm, sữa, nƣớc uống Sau khi xuyên qua hàng rào acid dạ dày, vi khuẩn di động về phía ruột non và sinh sản ở đó, tiếp tục chui qua 1 màng nhày và vào thành ruột. Salmonella nhiễm vào cơ thể từ hai nguồn: từ phân ngƣời hay động vật, từ ngƣời bệnh. Trong đó phải kể đến tác động của động vật lông vũ, trứng và phân của chúng đã làm cho việc lan truyền Salmonella lan rộng rãi hơn khi phân của chúng nhiễm vào các thực phẩm không đƣợc bảo quản kĩ, trong quá trình giết mổ cũng cần đề phòng sự nhiễm Salmonella nếu không thực hiện đúng quy trình an toàn thực phẩm. Khả năng gây bệnh của một số loài: - Salmonella typhi: chỉ gây bệnh ở ngƣời. Ở nƣớc ta bệnh thƣơng hàn chủ yếu do S.typhi gây ra - Salmonella paratyphi A: chỉ gây bệnh thƣơng hàn cho ngƣời và cũng hay gặp ở nƣớc ta sau S.typhi - Salmonella paratyphi B: gây bệnh thƣơng hàn chủ yếu cho ngƣời, đôi khi ở cả súc vật. Bệnh thƣờng gặp ở các nƣớc châu Âu - Salmonella paratyphi C: gây bệnh thƣơng hàn chủ yếu, viêm dạ dày ruột và nhiễm khuẩn huyết. Bệnh thƣờng gặp ở các nƣớc Đông Nam Á 33 Đồ án tốt nghiệp - Salmonella typhimurium và Salmonella enteritidis: Gây bệnh cho ngƣời và gia súc, gặp trên toàn thế giới. Chúng là nguyên nhân gây nhiễm trùng, nhiễm đọc do thức ăn do ăn phải thức ăn nhiễm Salmonella - Salmonella cholera suis: loại này hay gây nhiễm khuẩn huyết 1.5.3. Bacillus sppp 1.5.3.1. Đặc điểm Bacillus là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram (+), kích thƣớc 0,5 – 0,8µm x 1,5 – 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 – 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích thƣớc từ 0,8 – 1,8µm. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt (ở 100oC trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất, chất sát trùng. Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm. Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống của bào tử Bacillus subtilis trong 200 – 300 năm. Hình 1.19. Hình vi khuẩn Bacullus spp. 1.5.3.2. Khả năng gây bệnh Trực khuẩn có ở mọi nơi trong tự nhiên và khi điều kiện sống gay go, chúng có khả năng tạo ra bào tử gần nhƣ hình cầu, để tồn tại trong trạng thái "ngủ đông" 34 Đồ án tốt nghiệp trong thời gian dài. Loại sinh vật này có cực kỳ nhiều loài khác nhau, trong đó đa số là vô hại. Hai loài đƣợc xem là quan trọng về mặt y học là Bacillus anthracis (gây ra anthrax) và Bacillus cereus (có thể gây ra một dạng bệnh từ thực phẩm tƣơng tự Staphylococcus). Hai loài nổi tiếng làm hỏng thức ăn là Bacillus subtilis và Bacillus coagulans. B. subtilis là một sinh vật hiếu khí sống ký sinh có bào tử có thể sống sót trong độ nóng cao thƣờng thấy khi nấu ăn. Nó chính là tác nhân làm cho bánh mì hƣ. B. coagulans có thể phát triến đến tận mức pH 4.2 và gây ra vị chua nặng ở thức ăn đóng hộp bị ôi (bao gồm cả các thức ăn có tính acid mà bình thƣờng có thể khống chế sự phát triển của đa số vi khuẩn ở mức thấp nhất). Ấu trùng Paenibacillus gây ra các chứng bệnh của ong mật ở ong mật. 1.5.4. Staphylococcus arueus 1.5.4.1. Đặc điểm Staphylococus aureus là tụ cầu khuẩn gram dƣơng, không di động, không sinh bào tử, có đƣờng kính < 1µm. S.aureus thƣờng đứng thành từng cụm giống nhƣ chum nhỏ và xắp xếp theo mọi hƣớng. Hình 1.20. Hình vi khuẩn Staphylococcus arueus 35 Đồ án tốt nghiệp 1.5.4.2. Khả năng gây bệnh Ở ngƣời khoẻ mạnh mang khoảng 30% Staphylococus aureu ở trên da và niêm mạc, khi có những tổn thƣơng ở da và niêm mạc hoặc những rối loạn về chức năng thì các nhiễm trùng do Staphylococus aureus dễ dàng xuất hiện. Staphylococus aureus gây mủ các vết thƣơng, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng. Staphylococus aureus còn có khả năng hình thành độc tố ruột trong thực phẩm, do đó nó có thể hình thành nên chứng nhiễm độc. 1.5.5. Nhóm Listeria spp. 1.5.5.1. Đặc điểm Listeria sppp. là trực khuẩn gram dƣơng, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi phát triển ở nhiệt độ từ 1-450C, không sinh bào tử, có long ở một đầu nên có thể di động Listeria sppp. là vi khuẩn hình que mảnh, chiều ngang khoảng 0,5 , chiều dài khoảng 1-2. Vi khuẩn thƣờng đứng riêng lẻ hoặc nối với nhau thành một chuỗi. vi khuẩn có thể tồn tại ở pH từ 4,3-9,6. Hình 1.21. Hình vi khuẩn Listeria monocytogenes 1.5.5.2. Khả năng gây bệnh Nhóm vi khuẩn Listeria sppp. có khoảng 10 loài và rất hiếm gây bệnh ở ngƣời trừ vi khuẩn Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) gây ra một căn bệnh gọi là listeriosis gây bệnh ở cả ngƣời và động vật. L. monocytogenes là tác nhân gây chết đặc biệt là ở trẻ em dƣới 1 tháng tuổi, phụ nữ mang thai, những ngƣời nhận mô 36 Đồ án tốt nghiệp cấy ghép và những bệnh nhân có hệ miễn dịch kém. L. monocytogenes tác động vào hệ thần kinh trung ƣơng và có dấu hiệu lâm sàng là viêm màng não. Ở phụ nữ mang thai, khi ngƣời mẹ bị nhiễm L. mococytogenes thì không có triệu chứng rõ ràng hoặc chỉ có triệu chứng nhẹ nhƣ bị cảm cúm trong khi bào thai và thai nhi lại bị ảnh hƣởng nghiêm trọng hơn bao gồm sẩy thai, chết non, viêm màng não ở trẻ sơ sinh hay nhiễm trùng. Vi khuẩn L. monocytogenes còn gây nhiễm định vị nhƣ viêm màng kết, nhiễm trên da, bệnh của hạch bạch huyết. 37 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu Địa điểm thu mẫu: Huyện Củ Chi- Thành phố Hồ Chí Minh. Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công Nghệ Tp. HCM. 2.1.2. Thời gian nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 30/04/2017 đến tháng 16/07/2017 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Nguồn mẫu Lá cây Lá đắng đƣợc lấy từ Huyện Củ Chi- Thành phố Hồ Chí Minh thời gian hái lá từ 9h đến 11h giờ sáng cho vào túi nilong vô trùng và vận chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành các thí nghiệm. Hình 2.1. Hình ảnh cây Lá đắng 2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị Vi khuẩn chỉ thị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là 5 chủng vi khuẩn đƣợc cung cấp bởi Viện sinh Học Nhiệt đới Tp. Hồ Chí Minh, bao gồm: - Vi khuẩn Salmonella - Vi khuẩn E. Coli - Vi khuẩn Staphylococcus arueus 38 Đồ án tốt nghiệp - Vi khuẩn Bacillus Cereus - Vi khuẩn Listeria monocytogenes 2.2.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.2.3.1. Hóa chất – môi trường - Môi trƣờng NB (Nutrient Broth) (HiMedia - Ấn Độ). - Môi trƣờng NA (Nutrient Agar) (HiMedia - Ấn Độ). - Môi trƣờng EMB (Eosin Methylene Blue Agar) (HiMedia - Ấn Độ). - Môi trƣờng XLD (Xylose Lysine Desoxycholate Agar) (HiMedia - Ấn Độ). - DMSO (dimethylsulfoxid) (Trung Quốc) - Ethanol 50%, ethanol 70%, ethanol 90% (Việt Nam) 2.2.3.2. Dụng cụ thí nghiệm - Đĩa petri - Ống nghiệm - Pipet 1ml, 10ml - Micropipette 100ml, 100ml - Bình chứ môi trƣờng 250ml, 500ml - Cốc 50ml, 100ml, 250ml, 1000ml - Đầu tuýp 100µl, 1000µl - Que cấy vòng, que trang, que gắp - Đèn cồn - Thƣớc đo - Bông gòn thấm và không thấm - Đũa thủy tinh - Ống đục lỗ đƣờng kính 6mm 2.2.3.3. Thiết bị - Tủ cấy vi sinh (Brlad France) - Tủ ủ (Memmert Germany) - Tủ lạnh Toshiba - Autolave (Huxky Đài Loan) 39 Đồ án tốt nghiệp - Máy ly tâm (Tuttligen Germany) - Cân phân tích (Orbital Germany) - Bếp từ (Billy – England) - Máy nƣớc cất (Branstead USA) 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp xử lí nguồn mẫu Lá cây sau khi thu hái về đƣợc rữa sạch bằng nƣớc máy, để ráo trong bóng râm rồi giã nhỏ để ngâm mẫu tiến hành các thí nghiệm. 2.3.2. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật Nguyên tắc: Ngoài phƣơng pháp giữ giống trên môi trƣờng thạch nghiêng, có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phƣơng pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nƣớc trong tế bào. Để khắc phục nhƣợc điểm này ngƣời ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh nhƣ glycerol. Vi khuẩn đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp rồi hút 1 ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu cặn có chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -150C (Nguyễn Lân Dũng và Dƣơng Văn Hợp, 2007). 2.3.3. Phương pháp pha loãng mẫu Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhƣng có vai trò rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lƣợng cũng nhƣ phân tích vi sinh vật. Phƣơng pháp pha loãng mẫu (mẫu lỏng và mẫu rắn) chỉ đƣợc sử dụng trong trƣờng hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lƣợng vi sinh vật trong mẫu. Đối với mẫu lỏng: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ đƣợc nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha 40 Đồ án tốt nghiệp loãng ta đƣợc nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục tiến hành nhƣ vậy cho đến khi đƣợc nồng độ cần thiết. Đối với mẫu rắn: Cân chính xác 10 gram mẫu cho vào 90 ml dung dịch pha loãng ta đƣợc nồng độ pha loãng 10-1. Sau đó tiến hành đồng nhất mẫu rồi hút 1ml dịch pha loãng ở nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta đƣợc nồng độ pha loãng 10-2. Và tiếp tục pha loãng tƣơng tự nhƣ mẫu lỏng. (Phạm Minh Nhựt, 2013). 2.3.4. Phương pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị Mục đích: Hoạt hoá các vi khuẩn có sẵn đang đƣợc bảo quản phát triển lại bình thƣờng vì chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản. Đây cũng là bƣớc đầu giúp thu sinh khối vi khuẩn nhằm phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Nguyên tắc: Sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp. Môi trƣờng dinh dƣỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh dƣỡng (đa lƣợng và vi lƣợng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hoá lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trƣờng. Đối với các giống vi khuẩn đang khảo sát và các giống vi khuẩn chỉ thị đƣợc giữ trên môi trƣờng NB hay trong glycerol, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trƣờng NB. Sau đó tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trƣờng nuôi cấy (Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013). 2.3.5. Phương pháp tách chiết và thu nhận cao thực vật Mẫu thực vật đƣợc tách chiết bởi nhiều loại dung môi khác nhau bằng phƣơng pháp chiết ngâm ở nhiệt độ thƣờng và thu nhận cao chiết bằng cách cho bay hơi, loại bỏ lƣợng dung môi của dịch chiết bằng các thiết bị cô thích hợp. Nguyên tắc phƣơng pháp chiết ngâm: mẫu thực vật đƣợc ngâm trong dung môi (w/v) trong khoảng thời gian nhất định để các chất tan trong mẫu hòa tan vào dung môi, đây là quá trình di chuyển vật chất trong hệ hai pha rắn – lỏng gồm 3 41 Đồ án tốt nghiệp giai đoạn: thâm nhập dung môi vào mẫu, hoà tan các chất trong mẫu, khuếch tán các chất tan. Mục đích: Thu hồi cao chiết thực vật ở dạng cao đặc với độ ẩm < 20% để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Tiến hành: Mẫu đã xử lí cân và ngâm với dung môi thích hợp trong vòng 24 giờ, sau đó lọc lấy dịch lọc. Tiến hành cô cách thủy ở 700C dịch lọc tới khô thu đƣợc cao chiết. Để tăng cƣờng hiệu quả chiết xuất, có thể tiến hành khuấy trộn bằng cách khuấy hoặc rút dịch chiết ở dƣới rồi lại đổ lên trên (tuần hoàn cƣỡng bức dung môi) (Nguyễn Thƣợng Đông và Đặng Quang Chung, 2008). 2.3.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn từ cao chiết thực vật Mục đích: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch hay còn gọi là phƣơng pháp khuếch tán giếng thạch. Nguyên tắc: Các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết sẽ khuếch tán vào trong môi trƣờng thạch và tác động lên các vi sinh vật chỉ thị. Nếu cao chiết có khả năng ức chế vi khuẩn thì xuất hiện vòng ức chế xung quanh giếng thạch. Từ đó, xác định đƣợc hoạt tính kháng khuẩn của cao thuốc bằng đƣờng kính vòng ức chế (mm). Cách thực hiện: Hút 0,1 ml dịch vi khuẩn đã đƣợc hoạt hóa với mật độ thích hợp cho vào môi trƣờng NA (hoặc các môi trƣờng thích hợp với từng vi khuẩn) và tiến hành trang đều đến khô. Sau đó dùng ống đục lỗ có đƣờng kính 6mm tạo các giếng trên mặt đĩa thạch, hút dịch cao chiết thực vật vào giếng, ngay tại giếng các chất kháng khuẩn trong dịch cao chiết thực vật khuếch tán vào môi trƣờng thạch và đối kháng với vi sinh vật chỉ thị, ngăn cản hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật chỉ thị xung quanh giếng (Aibinu và ctv, 2007). 2.3.7. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Phƣơng pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên môi trƣờng lỏng (broth dilution method) 42 Đồ án tốt nghiệp Nguyên tắc: dựa trên sự thay đổi độ dục của dung dịch chƣa dịch cao chiết và dịch vi khuẩn. Quan sát độ đục kết luận nồng độ ức chế tối thiểu là nồng độ thấp nhất mà tại đó ống nghiệm không bị đục. 2.3.8. Phƣơng pháp xử lí số liệu Các số liệu thực nghiệm đƣợc xử lí thống kê theo phƣơng pháp thống kê sinh học, sử dụng công cụ phân tích số liệu (data analysis) của Microsofl Excel. Kết quả thí nghiệm đƣợc đánh giá, so sánh giá trị trung bình giữa các lô thí nghiệm bằng phƣơng pháp thống kê trong Statgraphic Centurion XV veusion 15.1.02 với trắc nghiệm Tukey. 2.4. Bố trí thí nghiệm Tiến trình thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ cây lá đắng đƣợc trình bày ở hình 2.1: 43 Đồ án tốt nghiệp Mẫu cây Xử lí mẫu Tách chiết cao chiết từ Đánh giá hiệu suất thu các dung môi khác nhau hồi cao chiết Cao tổng từ các loại dung môi khác nhau Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao tổng Xác định MIC Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 44 Đồ án tốt nghiệp 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất thu hồi cao từ cây lá đắng. Mẫu cây Xử lí mẫu Ngâm dung môi Dung môi Tỉ lệ 1/3(w/v) trong 24 giờ Lọc tinh Ethanol Ethanol Ethanol Nƣớc 0 0 500 70 90 Dịch lọc Cô cách thủy (700 C) Bảo quản Cao thuốc lạnh 40 C Hình 2.4. Mẫu ngâm trong dung môi 45 Đồ án tốt nghiệp 2.4.2. Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ cây lá đắng. Vi sinh vật chỉ thị Môi trƣờng NA, XLD,EMB Tăng sinh trong môi trƣờng NB Đỗ đĩa Cao chiết Cấy trang Đo OD 600nm Đục lỗ (d = 6mm) +DMSO 10% Nhỏ dịch Dịch cao chiết Pha loãng về 106 0 cfu/ml Ủ 37 C/24 giờ Đọc kết quả Hình 2.4. Sơ đồ đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Đầu tiên đối với vi sinh vật chỉ thị tiến hành quy trình tăng sinh. Sử dụng que cấy vòng lấy sinh khối của các chủng vi sinh vật chỉ thị từ các ependoff giữ giống sang các erlen chứa 10 ml môi trƣờng NB sau đó lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Tiến hành đo OD dịch tăng sinh ở bƣớc sóng 600 nm để xác định mật độ vi khuẩn và dịch vi khuẩn đƣợc pha loãng để đạt mật độ 106 cfu/ml. Hút 100 µl dịch đã pha loãng cho vào đĩa NA, EMB, XLD trang đều đĩa cho đến khi dịch khô, dùng ống trụ kim loại có đƣờng kính 6 mm tiến hành đục 3 lỗ trên đĩa. 46 Đồ án tốt nghiệp Đối với cao chiết cần khảo sát tiến hành pha trong DMSO 10% để đạt nồng độ 1 g/ml. Sử dụng micropipette hút dịch cao chiết cho vào các lỗ đã đƣợc đục trên đĩa, tiến hành ủ ở 370C trong 24 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo vòng kháng khuẩn có trên đĩa. 2.4.3. Thí nghiệm 3: xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Vi sinh vật chỉ thị Ống nghiệm vô trùng Cao chiết Tăng sinh trong môi trƣờng NB Môi trƣờng NB +DMSO 10% Đo OD600nm 0 Ủ 37 C/24 giờ Pha loãng nhiều nồng độ theo cấp số 2 Pha loãng về 106 cfu/ml Quan sát độ đục Xác định MIC Hình 2.6. Sơ đồ xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Đầu tiên tiến hành tăng sinh vi sinh vật chỉ thị bằng cách sử dụng que cấy vòng lấy sinh khối sau đó cấy vào erlen chứa 10 ml môi trƣờng NB, đem lắc ở 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Tiến hành đo OD dịch tăng sinh ở bƣớc 47 Đồ án tốt nghiệp sóng 600 nm để xác định mật độ vi khuẩn và sau đó pha loãng về mật độ 106 cfu/ml. Cao chiết ethanol 50% đƣợc hòa tan với DMSO 10% thành dãy nồng độ theo cơ số 2 từ 12,5 mg/ml đến 100 mg/ml. Hút a ml cao chiết từ các dãy nồng độ khác nhau cho vào ống nghiệm có chứa sẵn môi trƣờng NB. Dịch cao chiết bổ sung vào ống nghiệm với tỷ lệ 1:3 (v/v). Sau đó hút dịch vi khuẩn đã đƣợc pha loãng cho vào ống nghiệm. Đối với đối chứng dƣơng chỉ có dịch cao chiết và môi trƣờng dinh dƣỡng không chứa vi sinh vật chỉ thị, đối chứng âm chứa môi trƣờng dinh dƣỡng và vi sinh vật chỉ thị không chứa cao chiết. Tất cả ống nghiệm đƣợc đem ủ ở 370C trong 24 giờ. Tiến hành đọc kết quả bằng cách so độ đục của các ống nghiệm thử nghiệm với đối chứng dƣơng. 48 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả hiệu suất thu hồi cao chiết của các dung môi khác nhau từ cây lá đắng. 25 22 25 18 19 20 15 10 5 0 Ethanol Ethanol Ethanol Nƣớc 50% 70% 90% HIỆU SUẤT Hình 3.1. Hiệu suất thu hồi cao chiết của các dung môi khác nhau từ cây lá đắng. Dựa vào hình 3.1 nhận thấy rằng hiệu suất tách chiết cao lá đắng của các dung môi khác nhau có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Kết quả tách chiết cao cho thấy hiệu suất cao của các dung môi nƣớc, ethanol 50%, ethanol 70% không có sự khác nhau một cách có ý nghĩa về măt thống kê. Trong đó, hiệu suất tách chiết của dung môi ethanol 70% lớn nhất với hiệu suất cao trung bình là 25%. Kế đến là dung môi nƣớc, ethanol 50%, ethanol 90% có hiệu suất trung bình lần lƣợt là 19%; 22%; 18 %. Dung môi cho hiệu suất tách chiết cao thấp nhất so với các dung môi khác với hiệu suất cao trung bình là 18%. Từ kết quả trên cho thấy dung môi ethanol 70% là dung môi tách chiết tốt nhất đối với cây lá đắng. nó có thể hòa tan nhiều nhất các hợp chất có hoạt tính sinh học so với các dung môi còn lại trong lá cây lá đắng. Trong một số nghiên cứu liên quan đến việc sử dụng dung môi để tách chiết hợp chất từ cây thuốc thì phần lớn các tác giả đều sử dụng dung môi ethanol 70% 49 Đồ án tốt nghiệp để tiến hành tách chiết vì ethanol 70% đƣợc biết nhƣ một dung môi vạn năng có khả năng tách chiết rất nhiều hoạt tính sinh học ra khỏi thực vật. Tuy nhiên, để đánh giá dung môi nào phù hợp tách chiết các hoạt tính sinh học có trong cây lá đắng. ngoài hiệu suất thu hồi cao cần phải tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ các dung môi này. 3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết từ cây lá đắng. 3.2.1. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm E. coli Bảng 3.1 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng E.coli của cao chiết trên các dung môi Dung môi Mean MIC (mm) (mg/ml) Nƣớc 10,3 50 ETHANOL 50% 11,6 50 ETHANOL 70% 12,3 25 ETHANOL 90% 11 50 KHÁNG SINH 33,6 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm E. coli đƣợc trình bày ở hình 3.2. 50 Đồ án tốt nghiệp 40 33,6 30 20 12,3 10,3 11,6 11 10 kính kính vòng kháng khuẩn 0 Đƣờng Nƣớc Ethanol Ethanol Ethanol KHÁNG Dung môi 50% 70% 90% SINH Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm E.coli Dựa trên hình 3.2nhận thấy rằng ngoại trừ cao chiết nƣớc các loại cao chiết của các dung môi nƣớc, ethanol 50%, ethanol 70%, ethanol 90%, từ cây lá đắng đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với vi sinh vật chỉ thị E. coli. Đối với cao chiết ethanol 70% từ cây Lá đắng kháng khuẩn đƣợc E. Coli mạnh nhất. Đồng thời hoạt tính kháng khuẩn của chúng thể hiện thông qua đƣờng kính vòng kháng khuẩn cũng mạnh nhất trong các loại cao chiết khảo sát (đƣờng kính từ 10 đến 12 mm). Trong khi đó, đối với cao chiết ethanol 50% mặc dù cũng khá rộng đối với nhóm E. coli nhƣng hoạt tính của chúng không cao bằng cao chiết ethanol 50%. Đối với cao chiết ethanol 90% từ cây Lá đắng kháng khuẩn thấp hơn các loại dung môi khác. Kết quả này cho thấy đối với nhóm E. coli, hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% là tốt nhất so với cao chiết bằng các loại dung môi khác. Tuy nhiên, so với hoạt tính kháng khuẩn của Ciprofloxacin nồng độ 500 µg/ml thì hoạt tính của cao chiết ethanol 50% thấp hơn một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). 51 Đồ án tốt nghiệp Từ kết quả đánh giá chỉ số MIC của các cao chiết từ cây Lá đắng đƣợc trình bày ở bảng 3.2 nhận thấy giá trị MIC của cao chiết ethanol 70% đối với chủng vi khuẩn khảo sát 25 mg/ml giá trị thấp nhất. Điều này có nghĩa cao chiết ethanol 70% có khả năng kháng khuẩn cao hơn các loại cao chiết khác. So với nghiên cứu của cây Eupatorium odorata đối với vi khuẩn Shi. flexneri, S. aureus, P. aeruginosa, của Natheer (2012) có giá trị MIC là 25mg/ml tƣơng đồng với giá trị MIC của cao chiết ethanol 70% nhƣng so với các loại dung môi khác thì lại thấp hơn. Từ kết quả trên có thể thấy chỉ số MIC của các cao chiết nƣớc, ethanol 50%, ethanol 90%, từ cây Lá đắng trên các chủng vi khuẩn khảo sát là 50 mg/ml cao hơn so các nghiên cứu khác trên cùng một chủng vi khuẩn ngoài trừ cao chiết ethanol 70% có giá trị tƣơng đồng 25 mg/ml. Nguyên nhân có thể là do phƣơng pháp sử dụng khác nhau, dung môi tách chiết khác nhau, nguồn mẫu ảnh hƣởng đến giá trị MIC. 3.2.2. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết của các dung môi khác nhau trên Bacillus Cereus Bảng 3.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng Bacillus cereus của cao chiết các dung môi Dung môi Mean MIC (mm) (mg/ml) Nƣớc 10 100 ETHANOL 50% 11,3 50 ETHANOL 70% 11,6 50 RTHANOL 90% 12 50 DOI CHUNG 25 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với Bacillus Cereus đƣợc trình bày ở hình 3.3. 52 Đồ án tốt nghiệp 25 25 20 11,3 11,6 12 15 10 10 5 kính vòng kháng khuẩn khuẩn kháng vòng (mm) kính 0 Ethanol Ethanol Ethanol KHANG Dung môi Đƣờng Nƣớc 50% 70% 90% SINH Hình 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ các dung môi khác nhau trên Bacillus Cereus. Dựa trên số liệu hình 3.3 nhận thấy các cao chiết của các loại dung môi khác nhau từ cây lá đắng đều có hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Bacillus Cereus. Tuy nhiên, đối với vi khuẩn Bacillus Cereus chúng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh với đƣờng kính vòng ức chế từ 9-13 mm. Đối với cao chiết ethanol 90% từ cây lá đắng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh trên vi khuẩn Bacillus Cereus với vòng ức chế trung bình là 12 mm. Ngoài ra, các cao chiết nƣớc, ethanol 50%, ethanol 70%, cũng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với vi khuẩn này, với đƣờng kính vòng ức chế trung bình của chúng không có sự khác nhau một cách có ý nghĩa về mặt thống kê. Tuy nhiên, khi so với hoạt tính kháng khuẩn của Ciprofloxacin nồng độ 500 µg/ml thì chúng thấp hơn một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). 53 Đồ án tốt nghiệp Từ kết quả đánh giá chỉ số MIC của các loại cao chiết ethanol từ cây Lá đắng đƣợc trình bày ở bảng 3.3 nhận thấy giá trị MIC của cao chiết đối với chủng vi khuẩn khảo sát đều dao động từ 50 – 100 mg/ml. Kết quả này cho thấy rằng, chủng vi khuẩn đƣợc khảo sát nhậy cảm nhƣ nhau với cao chiết ethanol 50%, 70%, 90% từ cây Lá đắng còn dung môi nƣớc có giá trị MIC cao hơn 100 mg/ml. Có thể giải thích từ kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ các dung môi khác nhau trên các chủng vi sinh vật vì hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết đối với chủng vi khuẩn không có sự sai khác quá lớn. So với nghiên cứu của cây Eupatorium odorata đối với vi khuẩn Shi. flexneri, S. aureus, P. aeruginosa, của Natheer (2012) có giá trị MIC là 25mg/ml. Trong khi đó, giá trị MIC của cây Lá đắng đối với chủng vi khuẩn này có giá trị 50 – 100 mg/ml. Từ kết quả trên có thể thấy chỉ số MIC của các cao chiết từ cây Lá đắng trên các chủng vi khuẩn khảo sát từ 50 – 100 mg/ml cao hơn so các nghiên cứu khác trên cùng một chủng vi khuẩn. Nguyên nhân có thể là do phƣơng pháp sử dụng khác nhau, dung môi tách chiết khác nhau, nguồn mẫu ảnh hƣởng đến giá trị MIC. 3.2.3. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết của các loại dung môi trên nhóm Salmonella. Bảng 3.3 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng Salmonella của cao chiết các dung môi Dung môi Mean MIC (mm) (mg/ml) Nƣớc 11,3 50 ETHANOL 50% 11,3 50 ETHANOL 70% 12,3 50 RTHANOL 90% 11,6 50 DOI CHUNG 25,3 54 Đồ án tốt nghiệp Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm Samonella spp. đƣợc trình bày ở hình 3.4. 30 25,3 25 20 12,3 15 11.3 11,3 11,6 10 5 kính vòng kháng khuẩn khuẩn kháng vòng (mm) kính 0 Dung môi Nƣớc Ethanol Ethanol Ethanol KHANG Đƣờng 50% 70% 90% SINH Hình 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ các dung môi trên nhóm Salmonella spp. Từ hình 3.4. nhận thấy rằng các cao chiết nƣớc, ethanol 50%, ethanol 70%, từ cây Lá đắng đều thể hiện khả năng ức chế đối với vi khuẩn Samonella spp. Đối với vi khuẩn Samonella spp. thì cao chiết từ cây Lá cao chiết ethanol 70% có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với vòng kháng trung bình là 12,6mm và các cao chiết khác cũng thể hiện tính kháng khuẩn với vòng kháng trung bình từ 11,3 - 11,6 , tuy nhiên hoạt tính kháng khuẩn của chúng yếu hơn cao chiết ethanol 70%. Từ kết quả này cho thấy rằng cao chiết 70% của cây Lá đắng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất so với các cao chiết từ các dung môi khác trên nhóm Samonella sppp. nhƣng vẫn nhỏ hơn của Ciprofloxacin một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). 55 Đồ án tốt nghiệp Từ kết quả đánh giá chỉ số MIC của các cao chiết từ cây lá đắng đƣợc trình bày ở bảng 3.4 nhận thấy giá trị MIC của các cao chiết đối với chủng vi khuẩn khảo sát là 50 mg/ml. Kết quả này cho thấy rằng, chủng vi khuẩn đƣợc khảo sát nhậy cảm nhƣ nhau với các cao chiết từ cây lá đắng Có thể giải thích từ kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ các dung môi khác nhau trên các chủng vi sinh vật vì hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết đối với chủng vi khuẩn không có sự sai khác quá lớn. So với nghiên cứu của cây Eupatorium odorata đối với vi khuẩn Shi. flexneri, S. aureus, P. aeruginosa, của Natheer (2012) có giá trị MIC là 25mg/ml. Trong khi đó, giá trị MIC của cây Lá đắng đối với chủng vi khuẩn này có giá trị 50 mg/ml. Từ kết quả trên có thể thấy chỉ số MIC của các cao chiết từ cây Lá đắng trên chủng vi khuẩn khảo sát 50 mg/ml cao hơn so các nghiên cứu khác trên cùng một chủng vi khuẩn. Nguyên nhân có thể là do phƣơng pháp sử dụng khác nhau, dung môi tách chiết khác nhau, nguồn mẫu ảnh hƣởng đến giá trị MIC. 3.2.4. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết của các dung môi trên S. Aureus. Bảng 3.4 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng S.aureus của cao chiết các dung môi Dung môi Mean MIC (mm) (mg/ml) Nƣớc 9,7 50 ETHANOL 50% 11 50 ETHANOL 70% 11,3 50 ETHANOL 90% 11 50 KHÁNG SINH 30,6 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ các dung môi khác nhau đối với một số vi khuẩn khác đƣợc trình bày ở hình 3.5. 56 Đồ án tốt nghiệp 40 30,6 n (mm) n ẩ 30 20 9,7 11 11,3 11 10 0 Dung môi Nƣớc Ethanol Ethanol Ethanol KHANG ng kính vòng khánkg khu vòng khánkg kính ng 50% 70% 90% SINH ờ Đƣ Hình 3.5 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ các dung môi trên S. Aureus. Đối với cao chiết ethanol 70% từ cây Lá đắng trên chủng vi khuẩn khảo sát có hoạt tính kháng khuẩn mạnh đƣợc thể hiện bởi vòng ức chế trung bình từ 11 - 12 mm. Với các cao chiết nƣớc, ethanol 50%, ethanol 90%, có hoạt tính kháng khuẩn yếu. Kết quả cho thấy rằng nhóm các vi khuẩn gây bệnh khác nhậy cảm với cao chiết ethanol 70% hơn so với các cao chiết từ các dung môi khác. Tuy nhiên, hoạt tính kháng khuẩn của chúng nhỏ hơn của Ciprofloxacin nồng độ 500 µg/ml. Từ kết quả đánh giá chỉ số MIC của các cao chiết từ cây lá đắng đƣợc trình bày ở bảng 3.5 nhận thấy giá trị MIC của các cao chiết đối với chủng vi khuẩn khảo sát đều là 50 mg/ml. Kết quả này cho thấy rằng, chủng vi khuẩn đƣợc khảo sát nhậy cảm nhƣ nhau với các cao chiết từ cây lá đắng. Có thể giải thích từ kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ các dung môi khác nhau trên các chủng vi sinh vật vì hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết đối với chủng vi khuẩn không có sự sai khác quá lớn. 57 Đồ án tốt nghiệp So với ng