Đồ án Khảo sát khả năng đối kháng của nấm trichoderma spp. với các nấm gây bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu

n Giang. Quê quán: Xã Tân Lập 1 – huyện Tân Phước – tỉnh Tiền Giang. MSSV: 1211100073 Lớp: 12DSH02 Trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. Tôi xin cam đoan: - Đồ án tốt nghiệp là thành quả từ sự nghiên cứu hoàn toàn thực tế trên cơ sở các số liệu thực tế và được thực hiện theo hướng dẫn của giáo viên hướng dẫn. - Đồ án được thực hiện hoàn toàn mới, là thành quả của riêng tôi, không sao chép theo bất cứ đồ án tương tự nào. - Mọi sự tham khảo sử dụng trong đồ án đều được trích dẫn các nguồn tài liệu trong báo cáo và danh mục tài liệu tham khảo. - Mọi sao chép không hợp lệ, vi phạm quy chế của nhà trường, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Tp.HCM, ngày 30 tháng 07 năm 2016 Sinh viên TRẦN HÀ PHƢƠNG HẢO LỜI CẢM ƠN Qua 4 năm học tập và rèn luyện tại trường Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, được sự chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình của quý thầy cô, đặc biệt là quý thầy cô khoa Môi Trường – Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt cho tôi những kiến thức về lý thuyết và thực hành trong suốt thời gian học tập. Và trong thời gian thực hiện đồ án tại Công Ty TNHH Điền Trang, tôi có nhiều cơ hội áp dụng kiến thức học ở trường vào môi trường thực tế ở công ty, đồng thời học hỏi được nhiều kinh nghiệm làm việc của các anh chị tại công ty. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Công ty TNHH Điền Trang đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho để tôi có thể thực hiện đề tài tốt nghiệp tại công ty. Em cảm ơn các anh, chị ở phòng Nghiên cứu và Phát triển của Công ty TNHH Điền Trang đã hỗ trợ, chia sẽ và giúp đỡ cho em trong thời gian thực hiện đề tài. Em xin chân thành cám ơn Tiến sĩ Nguyễn Thị Hai, người đã hết lòng hướng dẫn, chỉ bảo và tận tình giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến gia đình, nơi là chỗ dựa vững chắc cho con trong suốt thời gian học tập. Trong quá trình viết luận văn báo cáo, do kiến thức còn hạn hẹp nên không tránh khỏi những thiếu sót trong cách hiểu và những lỗi trình bày, tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp của quý thầy cô và Ban lãnh đạo nhà trường, các anh chị trong công ty để giúp bài báo cáo tốt nghiệp của tôi đạt kết quả tốt hơn. Tp.HCM, ngày 30 tháng 07 năm 2016 Sinh viên TRẦN HÀ PHƢƠNG HẢO Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC ................................................................................................................................. i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................................v DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................................... vi DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ............................................................................................. vii DANH MỤC HÌNH ẢNH .................................................................................................. viii MỞ ĐẦU................................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ......................................................................................... 1 2. Tình hình nghiên cứu .............................................................................................. 2 3. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................... 3 4. Nhiệm vụ nghiên cứu ............................................................................................... 3 5. Phƣơng pháp nghiên cứu........................................................................................ 3 6. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài ............................................................................ 3 7. Kết cấu của Đồ án Tốt nghiệp ............................................................................... 4 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................. 5 1.1. Tổng quan về cây hồ tiêu ........................................................................................ 5 1.1.1. Nguồn gốc và phân bố cây hồ tiêu ................................................................. 5 1.1.2. Phân bố địa lý ..................................................................................................... 5 1.1.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ hồ tiêu ........................................................... 6 1.1.3.1. Tình hình sản xuất ....................................................................................... 6 1.1.3.2. Tình hình tiêu thụ ........................................................................................ 9 1.1.4. Tình hình nghiên cứu dịch hại cây hồ tiêu ở Thế giới và Việt Nam....... 11 1.1.4.1. Thế Giới ..................................................................................................... 11 1.1.4.2. Ở Việt Nam ................................................................................................. 12 1.2. Một số nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu ..................................................... 14 1.2.1. Nấm Phytophthora spp. .................................................................................. 14 1.2.1.1. Đặc điểm sinh học của nấm Phytophthora spp ..................................... 14 i Đồ án tốt nghiệp 1.2.1.2. Vòng đời .................................................................................................... 15 1.2.1.3. Phytophthora gây bệnh trên cây hồ tiêu................................................. 16 1.2.2. Nấm Fusarium spp. ......................................................................................... 18 1.2.2.1. Đặc điểm sinh học của nấm Fusarium spp. ........................................... 18 1.2.2.2. Vòng đời .................................................................................................... 20 1.2.2.3. Fusarium gây bệnh trên cây hồ tiêu ....................................................... 21 1.2.3. Nấm Colletotrichum spp. ................................................................................ 23 1.2.3.1. Đặc điểm sinh học của nấm Colletotrichum spp................................... 23 1.2.3.2. Vòng đời .................................................................................................... 25 1.2.3.3. Colletotrichum gây bệnh trên cây hồ tiêu .............................................. 26 1.3. Biện pháp sinh học trong quản lý bệnh hại cây trồng ................................... 27 1.3.1. Lịch sử biện pháp sinh học............................................................................. 27 1.3.1.1. Thế giới ....................................................................................................... 27 1.3.1.2. Việt Nam ..................................................................................................... 28 1.3.2. Khái niệm........................................................................................................... 28 1.3.3. Ưu và nhược điểm của biện pháp sinh học trong nông nghiệp ............... 28 1.3.3.1. Ưu điểm ...................................................................................................... 28 1.3.3.2. Nhược điểm ................................................................................................ 29 1.3.4. Các ứng dụng sinh học trong quản lý bệnh hại trên cây hồ tiêu............. 29 1.4. Nấm Trichoderma spp. trong quản lý bệnh cây trồng .................................. 31 1.4.1. Nấm Trichoderma spp..................................................................................... 31 1.4.1.1. Phân loại ................................................................................................... 31 1.4.1.2. Sự phân bố của nấm Trichoderma spp ................................................... 31 1.4.1.3. Đặc điểm hình thái .................................................................................... 32 1.4.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa, sinh học ..................................................... 33 1.4.1.5. Cơ chế đối kháng nấm gây bệnh cây trồng ............................................ 34 1.4.2. Ứng dụng trong nông nghiệp của nấm Trichoderma ................................ 38 ii Đồ án tốt nghiệp 1.4.2.1. Khả năng kiểm soát bệnh cây .................................................................. 38 1.4.2.2. Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng................................................ 39 1.4.2.3. Khả năng phân huỷ cellulose, phân giải lân chậm tan. ....................... 40 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................ 41 2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài .............................................................. 41 2.2. Vật liệu ...................................................................................................................... 41 2.2.1. Nguồn gốc nấm đối kháng, nấm gây bệnh .................................................. 41 2.2.1.1. Nấm đối kháng ........................................................................................... 41 2.2.1.2. Nấm gây bệnh ............................................................................................ 41 2.2.2. Trang thiết bị và hóa chất sử dụng ............................................................... 41 2.2.3. Môi trường nuôi cấy ........................................................................................ 41 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu...................................................................................... 42 2.3.1. Phương pháp thu mẫu..................................................................................... 42 2.3.1.1. Thu mẫu đất (Theo TCVN 4046 – 85) ................................................... 42 2.3.1.2. Thu mẫu bệnh............................................................................................. 42 2.3.2. Phân lậpTrichoderma spp. và nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu ....... 44 2.3.2.1. Phân lập nấm Trichoderma spp. trong đất ........................................... 44 2.3.2.2. Phân lập nấm Phytophthora gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu ... 45 2.3.2.3. Phân lập nấm Fusarium gây bệnh chết chậm trên cây hồ tiêu ........... 46 2.3.2.4. Phân lập nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư trên cây hồ tiêu ..... 47 2.3.3. Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm ................................................... 48 2.3.4. Xác định hoạt tính cellulose: Phương pháp khuếch tán trên thạch ....... 49 2.3.5. Xác định khả năng đối kháng ........................................................................ 49 2.3.6. Đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu. .................................................................................... 50 2.3.6.1. Đánh giá tính đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm Phytophthora sp. (phân lập trong mẫu đất trồng tiêu)........................................... 50 iii Đồ án tốt nghiệp 2.3.6.2. Đánh giá tính đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm Fusarium sp. (phân lập từ rễ cây tiêu bị bệnh chết chậm)..................................... 51 2.3.6.3. Đánh giá tính đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm Colletotrichum sp. (phân lập từ lá cây hồ tiêu bị bệnh thán thư) ......................... 51 2.3.7. Phương pháp phân tích số liệu ...................................................................... 51 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................... 52 3.1. Kết quả phân lập nấm Trichoderma spp. .......................................................... 52 3.2. Kết quả phân lập nấm bệnh................................................................................. 55 3.2.1. Kết quả phân lập nấm Phytophthora sp....................................................... 55 3.2.2. Kết quả phân lập nấm Fusarium sp. ............................................................ 56 3.2.3. Kết quả phân lập nấm Colletotrichum sp. ................................................... 57 3.3. Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng Trichoderma ..... 61 3.4. Đánh giá khả năng đối kháng Trichoderma spp. với nấm bệnh đã đƣợc phân lập............................................................................................................................... 63 3.4.1. Khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng Trichoderma spp. ......... 63 3.4.2. Trichoderma spp. đối kháng với nấm Phytophthora sp. gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu................................................................................................... 67 3.4.3. Trichoderma spp. đối kháng với nấm Fusarium sp. gây bệnh chết chậm trên cây hồ tiêu................................................................................................................ 72 3.4.4. Trichoderma spp. đối kháng với nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên cây tiêu .............................................................................................................. 77 3.4.5. Tổng hợp khả năng đối kháng của các Trichoderma spp. với 3 nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu ..................................................................................... 83 KẾT LUẬN ............................................................................................................................ 85 KIẾN NGHỊ ........................................................................................................................... 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................. 87 PHỤ LỤC 1 .............................................................................................................................. 1 PHỤ LỤC 2 ............................................................................................................................ 10 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VPA: Hiệp Hội hồ tiêu Việt Nam IAA: Acid indolacetic EU: Liên minh châu Âu (European Union) USD: Đô la Mỹ (United States dollar) ITC: Trung tâm thương mại quốc tế CABI: Tổ chức phi lợi nhuận PDA: Potato Dextro Agar CMC: Carboxy methyl cellulose DRBC: Dichoran Rose Bengal Chloramphenicol WA: Water agar NPK: Nitơ photpho kali (Ure – lân – kali) ĐK: Đối kháng ĐC: Đối chứng. NSC: Ngày sau cấy v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Diện tích, năng suất và sản lượng hồ tiêu năm 2014 ......................................... 7 Bảng 1.2: Giá tổng hợp của tiêu đen và tiêu trắng (Đơn vị: USD) .................................. 10 Bảng 1.3: Tần suất xuất hiện sâu bệnh hại trên cây hồ tiêu tại ba vùng điều tra............ 12 Bảng 3.1: Mật số nấm Trichoderma trong đất Bình Phước .............................................. 52 Bảng 3.2: Số chủng Trichoderma bắt ra ở mỗi vườn......................................................... 52 Bảng 3.3: Các chủng Trichoderma spp. phân lập từ các mẫu đất tỉnh Bình Phước ..... 54 Bảng 3.4: Bán kính tản nấm Trichoderma spp. sau các ngày nuôi cấy ........................... 64 Bảng 3.5: Tỷ lệ (%) đối kháng Trichoderma spp. đối với Phytophthora sp................... 68 Bảng 3.6: Tỷ lệ (%) đối kháng Trichoderma spp. đối với Fusarium sp.......................... 73 Bảng 3.7: Tỷ lệ (%) đối kháng Trichoderma spp. đối với Colletotrichum sp. ............... 78 Bảng 3.8: Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma với Phytophthora sp. sau 3 NSC và Fusarium sp., Colletotrichum sp. sau 7 NSC. ...................................................... 83 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 1.1: Tăng trưởng về số lượng hồ tiêu ở Đông Nam Á và các quốc gia khác ..... 8 Biểu đồ 1.2: Nhập khẩu hồ tiêu của 28 quốc gia EU từ một số nước Đông Nam Á ..... 11 giai đoạn 2010 – 2014 (đơn vị: USD) .................................................................................. 11 Biểu đồ 3.1 Đường kính phân giải cellulose của các chủng Trichoderma spp. ............. 61 Biểu đồ 3.2: Tỷ lệ (%) đối kháng Trichoderma spp. với Phytophthora sp. 5 NSC ....... 70 Biểu đồ 3.3: Tỷ lệ (%) đối kháng Trichoderma spp. với Fusarium sp. 7 NSC .............. 75 Biểu đồ 3.4: Tỷ lệ (%) đối kháng Trichoderma spp. với Colletotrichum sp. 7NSC...... 80 vii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Bản đồ phân bố các vùng trồng tiêu tại Việt Nam .............................................. 6 Hình 1.2: Các sản phẩm của cây hồ tiêu................................................................................ 9 Hình 1.3: Chu kì sống của Phytophthora ............................................................................ 15 Hình 1.4: Triệu chứng của bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu ........................................... 16 Hình 1.5: Thiệt hại của bệnh chết nhanh ............................................................................ 18 Hình 1.6: Fusarium gây cây héo rủ và các loại bào tử ...................................................... 20 Hình 1.7: Triệu chứng của bệnh chết chậm trên cây hồ tiêu............................................. 22 Hình 1.8: Thiệt hại của bệnh chết chậm .............................................................................. 23 Hình 1.9: Cọng mang bào tử đính và bào tử đính của nấm Colletotrichum ................... 24 Hình 1.10: Triệu chứng của bệnh thán thư trên cây hồ tiêu .............................................. 26 Hình 1.11: Thiệt hại do nấm Colletotrichum gây ra .......................................................... 27 Hình 1.12: Nấm Trichoderma mọc trong tự nhiên............................................................. 32 Hình 1.13: Khuẩn lạc của nấm Trichoderma Harzianum ................................................. 32 Hình 1.14: Vách tế bào Rhizoctonia solani bị enzyme của Trichoderma chọc thủng... 35 Hình 1.15: Nấm Trichoderma (vàng) ký sinh trên nấm Pythium (xanh) ........................ 36 Hình 1.16: Sự phát triển rễ cây giữa việc sử dụng và không sử dụng Trichoderma ..... 39 Hình 1.17: Gia tăng sản lượng ớt với hạt giống xử lý và không xử lý Trichoderma .... 39 Hình 2.1: Thu mẫu đất ........................................................................................................... 42 Hình 2.2: Thu mẫu lá tiêu bệnh thán thư ............................................................................. 43 Hình 2.3: Lấy mẫu rễ tiêu có triệu chứng bệnh chết chậm ............................................... 43 Hình 2.3: Bẫy nấm Phytophthora bằng cánh hoa hồng ..................................................... 46 Hình 2.4: Rễ tiêu có triệu chứng bệnh chết chậm .............................................................. 47 Hình. 3.1: Nấm Trichoderma trên môi trường DRBC sau 3 ngày. .................................. 52 Hình 3.2: Hình thái đại thể và vi thể của nấm Trichoderma sp. phân lập từ đất ............ 53 Hình 3.3: Cánh hoa hồng bị chuyển màu và đặt trên môi trường WA ............................ 55 Hình 3.4: Nấm Phytophthora sp. trên trường PDA ........................................................... 55 viii Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5: Bào tử và các du động bào tử của Phytophthora sp. dưới hính hiển vi ......... 56 Hình 3.6: Nấm Fusarium sp. trên môi trường WA ............................................................ 56 Hình 3.7: Nấm Fusarium sp. trên môi trường PDA........................................................... 57 Hình 3.8: Đại bào tử và các tiểu bào tử của nấm Fusarium sp......................................... 57 Hình 3.9: Tơ nấm Colletotrichum sp. phát triển từ mẫu lá bệnh ...................................... 58 Hình 3.10: Nấm Colletotrichum sp. trên môi trường PDA ............................................... 58 Hình 3.11: Bào tử nấm Colletotrichum sp. ......................................................................... 59 Hình 3.12: Khả năng phân giải cellulose của các chủng Trichoderma spp. ................... 62 Hình 3.13: Hình thái chủng nấm Trichoderma sp. phát triển qua các ngày ................... 63 Hình 3.14: Các chủng Trichoderma có khả năng phủ kín đĩa sau 4 ngày nuôi cấy....... 66 Hình 3.15: Trichoderma sp. đối kháng với Phytophthora sp. theo dõi qua các ngày ... 67 Hình 3.16: Các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng cao với Phytophthora sp. và đĩa nấm Phytophthora sp. sau 7 ngày nuôi cấy .................................................................. 71 Hình 3.17: Nấm Trichoderma sp. đối kháng với Fusarium sp. theo dõi qua các ngày. 72 Hình 3.18: Chủng Trichoderma spp. có khả năng đối kháng cao với nấm Fusarium sp. và đĩa nấm bệnh Fusarium sp. sau 7 ngày nuôi cấy........................................................... 76 Hình 3.19: Nấm Trichoderma sp. đối kháng với nấm Colletotrichum sp. ...................... 77 Hình 3.20: Khuẩn ty Trichoderma sp. quấn chặt lấy khuẩn ty Colletotrichum sp......... 81 Hình 3.21: Các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng cao với Colletotrichum sp. sau 7 ngày nuôi cấy và đĩa nấm bệnh Colletotrichum sp. sau 5 ngày nuôi cấy............. 82 ix Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hồ tiêu là một trong những loại cây công nghiệp xuất khẩu chủ lực của nước ta. Sản lượng xuất khẩu hồ tiêu hằng năm đứng hàng đầu thế giới. Theo Hiệp hội hồ tiêu Việt Nam (VPA), sản lượng hồ tiêu trong tháng 11 năm 2015 của cả nước xấp xỉ khoảng 124.000 tấn, kim ngạch đạt gần 1,2 tỷ, tăng 2,8 % giá trị so với năm 2014. Do giá trị xuất khẩu cao nên diện tích trồng tiêu ngày càng tăng. Trong đó, Bình Phước dẫn đầu cả nước về diện tích và sản lượng, tổng diện tích trồng tiêu trên toàn tỉnh là 13.000 ha và cho sản lượng trên 30.000 tấn/năm. Để đạt được năng suất cao, nhiều hộ nông dân đã bón quá nhiều phân vô cơ đến mức báo động: 1200 kg N, 1230 kg P2O5 và 1425 kg K2O/ha, vượt 4 - 5 lần khuyến cáo phân bón cho cây tiêu (Đỗ Trung Bình, 2013). Hệ quả không chỉ nông dân phải mất nhiều tiền vào phân bón hóa học mà hệ sinh vật đất và chất lượng đất cũng bị tàn phá nghiêm trọng. Đất đai ngày càng thoái hóa, dinh dưỡng trong đất bị mất cân đối, tồn dư các chất độc hại trong đất ngày càng cao, nguồn bệnh tích lũy trong đất càng nhiều dẫn đến phát sinh một số dịch hại không dự báo trước, việc trồng trọt về sau ngày càng khó khăn hơn. Trong những năm gần đây hiện tượng chết nhanh và chết chậm trên cây tiêu diễn ra khá phổ biến ở nhiều vùng với tỷ lệ cây bệnh từ 10 – 15 %. Thậm chí, có nhiều vườn có tỷ lệ thiệt hại lên đến 80 – 90 % (Lê Văn Trịnh, 2009). Bệnh đã gây thiệt hại nặng hàng trăm hecta hồ tiêu trong tỉnh Bình Phước. Trước tình hình đó, các biện pháp sinh học được xem là giải pháp giúp giảm lượng phân bón, tăng năng suất cây trồng và thân thiện với môi trường. Hiện nay, theo định hướng phát triển nền nông nghiệp bền vững, có giá trị xuất khẩu cao, việc tăng cường sử dụng những chế phẩm sinh học, phân bón hữu cơ trong canh tác cây trồng đang được chú trọng. Chế phẩm nấm Trichoderma được ứng dụng phổ biến vì chi phí thấp, cách sử dụng đơn giản và quan trọng nhất là hiệu quả đem lại 1 Đồ án tốt nghiệp cao. Trichoderma là một loại vi nấm hoại sinh trong đất có khả năng đối kháng các vi nấm gây bệnh thực vật với phổ tác động rộng, thông qua ba cơ chế bao gồm ký sinh, tiết ra kháng sinh và enzyme phân hủy vách tế bào của nấm bệnh (Nguyễn Văn Đĩnh và cộng sự, 2007), đặc biệt là không gây hại cho con người và thân thiện với môi trường. Xuất phát từ những yêu cầu trên, việc phân lập các chủng nấm Trichoderma ở trong đất, có khả năng đối kháng tốt với các nấm Phytophthora, Fusarium, Colletotrichum, làm nguồn vật liệu để sản xuất chế phẩm nấm Trichoderma là lý do mà em chọn đề tài: ―Khảo sát khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. với các nấm gây bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu‖. 2. Tình hình nghiên cứu  Trong nước Nguyễn Ngọc Phúc năm 2005, đã tiến hành khảo sát mật độ Trichoderma trong đất và mối liên hệ của chúng với các yếu tố môi trường như: pH, độ ẩm, hàm lượng Mg, Ca, Từ đó, phân lập các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng mạnh với các nấm bệnh Đỗ Thu Hà và Lê Tố Nga (2015) phân lập các chủng nấm trong đất tại Đà Nẵng và tuyển chọn các chủng nấm có khả năng đối kháng tốt với chủng nấm Fusarium, Colletotrichum gây bệnh trên cây ớt, lên men xốp tạo chế phẩm sinh học. Phạm Thị Thiên (2014) đã khảo sát khả năng kết hợp một số chủng Bacillus có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và sinh IAA với nấm Trichoderma sp. để kiểm soát sinh học nấm Pythium sp. và Fusarium sp. gây bệnh trên cây hồ tiêu. Trần Kim Loan và cộng sự (2008) thuộc viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, với chế phẩm sinh học Trichoderma (Tricho – VN) phòng trừ bệnh do nấm Phytophthora gây ra trên cây hồ tiêu. 2 Đồ án tốt nghiệp  Nước ngoài S. Goswami và cộng sự (2015) các chủng Trichoderma được phân lập từ đất của vườn chè ở Ấn Độ được đánh giá khả năng đối kháng chống lại mầm bệnh trên cây trà, chủ yếu là nấm Pestalotia theae và Fusarium solani. Mausam Verma và cộng sự (2007), 18 chủng Trichoderma từ đất của các vùng khác nhau ở Ấn Độ được phân tích về khả năng kiểm soát sinh học chống lại bệnh bạc lá khoai môn, mầm bệnh chính là Phytophthora colocasiae. 3. Mục đích nghiên cứu Tìm ra các chủng nấm Trichoderma spp. có khả năng đối kháng với nấm bệnh Phytophthora sp., Fusarium sp. và Colletotrichum sp., làm cơ sở cho việc sử dụng trong phòng trừ nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập một số chủng Trichoderma spp. trong đất trồng tiêu tại một số vườn thuộc tỉnh Bình Phước. Phân lập các nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu: Phytophthora sp. gây bệnh chết nhanh, Fusarium sp. gây bệnh chết chậm và Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư. Khảo sát đối kháng của nấm Trichoderma spp. phân lập được trong đất với các nấm Phytophthora sp., Fusarium sp. và Colletotrichum sp. gây bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu trong điều kiện phòng thí nghiệm. 5. Phƣơng pháp nghiên cứu Sử dụng các phương pháp thường quy trong nghiên cứu khoa học. 6. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài Dựa hình thái đại thể, hình thái vi thể và tốc độ tăng trưởng, người thực hiện đề tài đã phân lập được 34 chủng Trichoderma khác nhau hoàn toàn từ các mẫu đất ở tỉnh Bình Phước. Phân lập được 3 chủng nấm gây bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu là Phytophthora sp., Fusarium sp. và Colletotrichum sp. từ đất và các mẫu bệnh. 3 Đồ án tốt nghiệp Trong số 34 chủng Trichoderma spp. có 8 chủng đối kháng 100 % với Phytophthora sp., 3 chủng đối kháng 100 % với Fusarium sp và 18 chủng có khả năng đối kháng 100 % với Colletotrichum sp. Chủng BP2_B.2 có khả năng đối kháng cao với cả 3 chủng nấm bệnh chỉ sau 3 ngày nuôi cấy. Khảo sát sinh enzyme cellulase, chủng BP3_03.4 có hoạt tính enzyme rất mạnh. Ứng dụng tốt trong phân hủy các hữu cơ, dùng làm compost. 7. Kết cấu của Đồ án Tốt nghiệp “Khảo sát khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. với các nấm gây bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu”, có tất cả 3 chương gồm: Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU: Giới thiệu tổng quan về nguồn gốc, phân bố, tình hình sản xuất, tiêu thụ và thực trạng canh tác cây hồ tiêu ở Việt Nam. Qua đó, trình bày các đặc điểm sinh học cũng như triệu chứng, thiệt hại của một số nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu như nấm Phytophthora spp., nấm Fusarium spp., nấm Colletotrichum spp. Từ đó, đưa ra các kết quả nghiên cứu và ứng dụng của các biện pháp sinh học trong nông nghiệp, nổi bật là nấm Trichoderma spp. trong quản lý bệnh hại trên cây hồ tiêu, cụ thể như khả năng phân hủy chất hữu cơ hay những cơ chế đối kháng với nấm bệnh cây trồng. Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP: Trình bày về vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu bao gồm phần trình bày về thời gian và địa điểm tiến hành đề tài, nguồn gốc nấm đối kháng, nấm gây bệnh. Phương pháp nghiên cứu tập trung ở phần thu mẫu, phân lập nấm Trichoderma spp. và nấm bệnh, cũng như đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm bệnh bằng phương pháp sử lý số liệu thống kê SAS. Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trình bày kết quả phân lập nấm Trichoderma spp. và nấm bệnh. Qua đó, đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma với nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu đã được phân lập. 4 Đồ án tốt nghiệp Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về cây hồ tiêu 1.1.1. Nguồn gốc và phân bố cây hồ tiêu [22] Cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) thuộc họ Piperaceae, là một loại dây leo thân gỗ lâu năm. Có nguồn gốc từ bang Tây Ghats (Ấn Độ), được trồng cách nay khoảng 6.000 năm (Sasikumar và cộng sự, 1999; Ravindran và cộng sự, 2000). Hạt tiêu đen là một loại gia vị phổ biến được sử dụng để tăng hương vị cho nhiều loại món ăn trên toàn thế giới. Ở Ấn Độ, hồ tiêu được mệnh danh là ―Vua của các loại gia vị‖. Ở Việt Nam, cây hồ tiêu mọc hoang được tìm thấy từ trước thế kỷ XVI, nhưng đến thế kỷ XVII mới được trồng. Đến cuối thế kỷ XIX, hồ tiêu được trồng với diện tích tương đối khá lớn ở Phú Quốc, Hòn Chồng và Hà Tiên (Kiên Giang), chủ yếu do người Hoa gốc ở đảo Hải Nam theo Mạc Cửu di cư vào Hà Tiên. Cũng trong khoảng thời gian này và đầu thế kỷ XX, cây hồ tiêu theo chân các chủ đồn điền người Pháp phát triển lên vùng Bình Long, Bà Rịa - Vũng Tàu, Quảng Trị và Quảng Nam. 1.1.2. Phân bố địa lý Hồ tiêu là loại cây đặc trưng ở vùng nhiệt đớ...Wood và Tveit 27 Đồ án tốt nghiệp năm 1955 đã đưa ra 3 cơ chế đối kháng giữa vi sinh vật là cạnh tranh, kháng sinh và tiêu diệt nhau. 1.3.1.2. Việt Nam Trước kia, nông dân đã biết dùng kiến vàng để trừ sâu hại trong vườn cam quýt. Từ thập niên 1970, Biện pháp sinh học ở nước ta mới đã đạt được một số thành tựu, các nghiên cứu tập trung vào 2 hướng:  Bảo vệ duy trì và phát triển quần thể thiên địch có sẵn.  Bổ sung thiên địch vào sinh quần cây trồng nông lâm nghiệp. 1.3.2. Khái niệm Theo Nguyễn Văn Đĩnh và cộng sự (2004), Biện pháp sinh học là dùng các sinh vật để khống chế hay tiêu diệt các sinh vật hại, rộng hơn là dùng các sinh vật, sản phẩm của chúng để kìm hãm sinh vật hại, làm cho chúng giảm số lượng và độc tính, không gây hại với các loại sinh vật có ích an, toàn với sức khỏe con người và môi trường. 1.3.3. Ưu và nhược điểm của biện pháp sinh học trong nông nghiệp 1.3.3.1. Ưu điểm Không gây ô nhiễm môi trường, an toàn cho người và động vật. Ngoài ra còn phù hợp với phát triển của nền nông nghiệp Việt Nam. Hiệu quả kinh tế cao, sinh vật có khả năng tồn tại lâu trong quần xã, kiểm soát sự phá hoại của sinh vật gây hại. Không ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng nông sản. Trong khi biện pháp hoá học để lại dư lượng thuốc bảo vệ thực vật cao, gây ngộ độc và ảnh hưởng đến sức khoẻ con người. Phóng thích thiên địch tốn ít thời gian hơn phun thuốc và không gây mùi khó chịu như sử dụng thuốc hóa học, nhất là trong nhà kính nóng ẩm. Việc phóng thích thiên địch được tiến hành ngay sau khi gieo trồng, nông dân có thể kiểm tra sự thành công của biện pháp này chỉ cần một vài lần kiểm tra sau đó nhưng đối với biện pháp hoá học cần sự kiểm ta thường xuyên trong suốt vụ. 28 Đồ án tốt nghiệp Các chế phẩm sinh học và thiên địch tiêu diệt được nhiều loài sinh vật gây hại, có sức tàn phá lớn. Các biện pháp đấu tranh sinh học duy trì được hệ sinh thái trong tự nhiên góp phần bảo vệ các loài sinh vật. 1.3.3.2. Nhược điểm Tác động thường chậm nên không có khả năng dập dịch. Nghiên cứu và nhân nuôi cần trang thiết bị và kinh phí cao. Sản phẩm sinh học thường chịu ảnh hưởng của điều kiện môi trường. Quy trình áp dụng khắt khe, đòi hỏi người sử dụng phải có trình độ nhất định. Sinh vật, thiên địch rất nhạy cảm và dễ tổn thương. Khi du nhập nhiều loài thiên địch về Việt Nam, chúng không phát triển, hiệu quả sử dụng không cao (chưa thích nghi được với môi trường). Khi tiêu diệt sinh vật gây hại này lại tạo điều kiện cho các sinh vật gây hại khác phát triển. Một loài thiên địch có thể vừa là sinh vật có lợi vừa là sinh vật có hại. 1.3.4. Các ứng dụng sinh học trong quản lý bệnh hại trên cây hồ tiêu Các nhà khoa học đã sử dụng chế phẩm sinh học chitin, chitosan và chitosan oligomer cho cây hồ tiêu, tách chiết từ vỏ tôm cua, côn trùng, vách tế bào nấm. Đây là những thành phần không độc hại, phân hủy sinh học nhanh và an toàn với môi trường. Ở cây tiêu kiến thiết cơ bản, các thành phần chitosan và chitosan oligomer có hoạt tính kích thích tăng trưởng hồ tiêu, tăng số lượng vi sinh vật có lợi, hạn chế nấm gây hại trong đất và tăng cường hệ thống đề kháng. Ứng dụng vào tiêu kinh doanh, các chế phẩm được tưới cho tiêu ba lần, mỗi lần cách nhau 15 ngày. Sau ba tháng, số lượng nấm mốc và xạ khuẩn có trong đất tăng lên nhanh chóng [7]. Hầu hết số xạ khuẩn và nấm mốc này có khả năng tổng hợp các loại enzyme làm tan vách tế bào của các loại nấm gây bệnh và một số côn trùng, giúp cho cây hồ tiêu có khả năng làm tăng đề kháng với các loại nấm bệnh trong đất. 29 Đồ án tốt nghiệp Trong quá trình canh tác, khi bón các chế phẩm chitosan và chitosan oligomer đã làm giảm đáng kể số lượng nấm Fusarium và tuyến trùng gây hại trên cây hồ tiêu. Mặt khác, khi phun chế phẩm chitosan oligomer nồng độ 200 mg/l lên lá, lượng diệp lục trong lá cây hồ tiêu tăng gần 50 %. Cây được kích thích sinh trưởng thân dây chính và các cành nhánh phát triển nhanh hơn [7]. Những nghiên cứu trong phòng thí nghiệm tại Viện Khoa học Kỹ Thuật Nông Nghiệp miền Nam đã cho kết luận là các chủng nấm Trichoderma và Bacillus có khả năng ức chế và bào mòn vách tế bào của các chủng nấm Phytophthora spp., Fusarium spp., và Sclerotium spp. làm cho các nấm bệnh này không phát triển được hoặc bị tiêu diệt. Theo Nguyễn Văn Tuất (2012), các chủng nấm Trichoderma, Glioclacdium có hàm lượng chitinase giữ vai trò chính trong hoạt động ký sinh với các nấm gây bệnh, trong quá trình đó chúng tiết ra hệ enzyme phân hủy tế báo nấm gây bệnh, các enzyme này có đốc tính rất mạnh với nấm bệnh và được coi là nhân tố tích cực trong phòng trừ bệnh hại cây trồng. Thực tế, ứng dụng các chế phẩm Trichoderma và Bacillus trên đồng ruộng phòng trị bệnh chết nhanh cho hồ tiêu có hiệu lực rất cao. Chế phẩm Pseudomonas có khả năng ngăn chặn sự phát triển và phát tán lây lan của nấm bệnh, khống chế các bệnh do nấm Phytophthora, Fusarium, Palmivora gây bệnh chết nhanh, chết chậm, xì mủ, thối lở cổ rễ, có khả năng thẩm thấu vào bên trong tế bào, phân bổ kháng sinh cho thân, cành, lá, rễ, bảo vệ bộ rễ, thân tăng sức đề kháng chống lại nấm bệnh. Anisaf SH - 01 có thành phần là Polyphenol được chiết xuất từ thực vật không gây độc hại cho cây trồng, vật nuôi, đảm bảo vệ sinh an toàn nông sản và bảo vệ môi trường sinh thái. Các nhà khoa học Trung tâm Phát triển Công nghệ cao thuộc Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam đã triển khai nghiên cứu ứng dụng của thuốc trên cây hồ tiêu. Kết quả cho thấy sản phẩm có tác dụng phòng trừ rệp sáp, hạn chế bệnh vàng lá, tuyến trùng, hồ tiêu ở nồng độ 1 %, lượng nước thuốc sử dụng là 3 - 5 lít/cây, sử dụng theo đường phun cả cây với kết hợp với tưới gốc. Ngoài việc sử dụng 30 Đồ án tốt nghiệp thuốc trừ sâu bảo vệ thực vật Anisaf SH - 01, các nhà nghiên cứu đồng thời sử dụng các chế phẩm Anisaf SH - 01 (1) và Anisaf SH - 01 (2) nhằm hỗ trợ quá trình hấp thu dinh dưỡng của cây trồng và cải tạo chất lượng đất [42]. 1.4. Nấm Trichoderma spp. trong quản lý bệnh cây trồng 1.4.1. Nấm Trichoderma spp. 1.4.1.1. Phân loại [26] Nấm Trichoderma spp. là một trong những vi nấm gây nhiều khó khăn cho việc định danh, phân loại do còn nhiều đặc điểm cần thiết cho việc định danh, phân loại vẫn chưa được biết đầy đủ. Theo truyền thống, hệ thống phân loại thường dựa vào sự khác biệt về hình thái, đặc điểm bào tử, cành bào tử và quá trình sinh sản bào tử vô tính. Năm 1801, Persoon ex Gray đã xác định Trichoderma thuộc:  Giới (Kingdom): Fungi  Ngành (Division): Ascomycota  Lớp (Class): Euascomycetes  Bộ (Order): Hypocreales  Họ (Family): Hypocreaceae  Chi (Genus): Trichoderma 1.4.1.2. Sự phân bố của nấm Trichoderma spp [26] Nấm Trichoderma spp. khá phổ biến trong tự nhiên, đặc biệt là trong môi trường đất. Hầu hết các dòng Trichoderma đều hoại sinh, chúng phổ biến trong những khu rừng nhiệt đới ẩm hay cận nhiệt đới, ở rễ cây, trong đất hay trên xác sinh vật đã chết, hoặc thực phẩm bị chua, ngũ cốc, lá cây hay kí sinh trên những loại nấm khác. Khi quan sát hạch nấm hay chồi mầm của nhiều loài nấm khác cũng có thể tìm thấy các loài Trichoderma. Trichoderma rất ít tìm thấy trên thực vật sống và không sống nội kí sinh với thực vật. Mỗi dòng nấm Trichoderma khác nhau có yêu cầu nhiệt độ và độ ẩm khác nhau. Sự phân bố và điều kiện môi trường sống của các loài Trichoderma có liên hệ 31 Đồ án tốt nghiệp mật thiết với nhau. Nhìn chung, các loài Trichoderma xuất hiện ở vùng đất acid nhiều hơn ở vùng đất trung tính hoặc kiềm. Hình 1.12: Nấm Trichoderma mọc trong tự nhiên (Nguồn: Google hình ảnh) 1.4.1.3. Đặc điểm hình thái [26] Kubicek và Harman (1998) đã mô tả chi tiết 33 loài Trichoderma spp. Ông cho rằng: Tùy từng loài nấm mà chúng có hình dạng và kích thước khác nhau. Khuẩn ty (sợi nấm) có tốc độ phát triển rất nhanh, trên môi trường PDA ban đầu có màu trắng, khi sinh bào tử thì chuyển sang xanh đậm, xanh vàng hoặc lục trắng. Ở một số loài còn có khả năng tiết ra một số chất làm thạch của môi trường PDA hóa vàng. Hình 1.13: Khuẩn lạc của nấm Trichoderma Harzianum [25] 32 Đồ án tốt nghiệp Một số loài Trichoderma cuống bào tử chưa được xác định. Cuống bào tử là một nhóm sợi nấm bện vào nhau. Số loài khác có cuống bào tử mọc lên từ những cụm hay những nốt sần dọc theo sợi nấm hoặc ở khu vực tỏa ra của khuẩn lạc (T. koningii), có kích thước từ 1 – 7 µm, có hình đệm rất rắn chắc hoặc dạng như bông không rắn chắc, những nốt sần dạng này được tách dễ dàng khỏi bề mặt thạch agar và chúng hoạt động như chồi mầm. Bào tử đính của Trichoderma mọc ở đỉnh của cuống sinh bào tử, mang các bào tử trần bên trong không có vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ nhờ chất nhầy. Bào tử có hình bầu dục với kích thước khoảng 3 – 5 µm x 2 – 4 µm, rất hiếm khi bào tử của nấm này có hình cầu. Vách bào tử trơn láng, tuy nhiên ở một vài loài Trichoderma (T. viride) bào tử có vách xù xì như có nhiều mụn cơm (Mecray, 2002). Nhờ có khả năng tạo thành bào tử áo (chlamydospores) nên nấm Trichoderma có khả năng tồn tại 110 – 130 ngày dù không được cung cấp chất dinh dưỡng. Chlamydospores dạng hình cầu méo, đơn bào, mặc dù cũng có một số loài có khả năng hình thành nên các bào tử áo đa bào (Papavizas, 1985), Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ, làm tăng khả năng sống sót của Trichoderma trong môi trường không được cung cấp chất dinh dưỡng nên chlamydospores có thể được dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học. 1.4.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa, sinh học [26] Đa số các chủng nấm Trichoderma phát triển tốt ở pH 4.5 – 6.5, nhiệt phát triển tối ưu thường là 25 – 30oC. Theo Prasun K. M. và Kanthadai R. (1997) hình thái khuẩn lạc và bào tử của Trichoderma khác nhau khi ở những nhiệt độ khác nhau. Trichoderma có thể sản xuất nhiều kháng sinh và enzyme như chitinolytic (enzyme phân giải chitin), cellulolytic (enzyme phân giải cellulose), đây là hai enzyme chính phân giải thành và màng tế bào, phá hủy khuẩn ty của các nấm bệnh. 33 Đồ án tốt nghiệp Trong quá trình sinh sản vô tính của nấm Trichoderma, có thể xảy ra hiện tượng đột biến nên di truyền lại cho thế hệ sau hoặc sai sót từ quá trình phân chia tế bào và tác động của điều kiện môi trường sống khác nhau nên sẽ dẫn đến sự sai khác và đa dạng trong kiểu gen cũng như kiểu hình của cùng một loài Trichoderma. Vì thế, sẽ tạo ra những dòng thích nghi tốt trong điều kiện sinh thái, địa lý khác nhau và đây chính là những dòng rất có ý nghĩa trong nghiên cứu cũng như trong việc tạo chế phẩm sinh học kiểm soát mầm bệnh thực vật 1.4.1.5. Cơ chế đối kháng nấm gây bệnh cây trồng Nhiều cơ chế được ứng dụng trong phòng trừ sinh học của Trichoderma spp. đối với nấm gây bệnh, ba cơ chế đối kháng chính là ký sinh, cạnh tranh và tiết ra kháng sinh.  Kháng sinh Godtfredson và Vangedal (1965) đã mô tả hoạt chất amin của Trichoderma là một hợp chất có 3 đơn vị isopren như một hợp chất kháng sinh. Dennis và Webster (1971) đã báo cáo, acetaldehyde là thành phần kháng sinh dễ bay hơi được sản xuất bởi Trichoderma. Trên đĩa cấy Trichoderma đối kháng sự phát triển của P. meadii gần như hoàn toàn. Với P. vexans và R. solani, đối kháng không hoàn toàn vì tỷ lệ phát triển của R. solani và P. vexans cao hơn P. meadii. Các nghiên cứu cho thấy, một lượng dịch tiết của Trichoderma có đặc tính kháng sinh. Sản phẩm của nấm Trichoderma là một acid bazơ đơn chưa bão hòa ở thể hoạt động chống lại những loài nấm gây bệnh [54]. 34 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.14: Vách tế bào của nấm Rhizoctonia solani bị enzyme của nấm Trichoderma chọc thủng và sau đó xâm nhập vào [15] T. virens sản xuất gliotoxin và gliovirin, chúng kìm hãm sự phát triển của Rhizoctonia solani và Pythium spp. Isonitriles được sản xuất bởi T. hamatum, T. harzianum, T. viride, T. koningii, T. polysporum hạn chế sự phát triển của nấm bệnh. Ở loài T. atroviride và T. viride tiết 6 - pentyl alpha-pyrone (α – pyrones) có hương dừa, hoạt động của loại phytotoxin này có thể ngăn cản sự nảy mầm của những noãn bào tử nấm gây bệnh Phytophthrora cinnamomea và Botrytis cinnerea. Peptaibols do T. polysporum, T. harzianum, T. koningii sản xuất giúp ngăn cản sự tổng hợp enzyme liên kết với màng trong sự hình thành tế bào, đồng thời hoạt động hỗ trợ enzyme phá huỷ thành tế bào ngăn chăn sự phát triển của mầm bệnh và kích thích cây trồng kháng lại mầm bệnh. Steroids (viridin) là một độc tố thực vật có hiệu lực như một loại thuốc diệt cỏ giúp hạn chế sự nảy mầm của bào tử, được sản xuất bởi T. virens [26].  Ký sinh 35 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.15: Nấm Trichoderma (vàng) ký sinh trên nấm Pythium (xanh) trên hạt đậu Hà Lan [15] Theo Chet (1990) nấm Trichoderma ký sinh gồm 4 giai đoạn [18]: o Nhận ra vật chủ nhờ tính hướng hóa chất, nấm ký sinh phân nhánh hướng về những nấm đã được định trước (do những nấm này tiết ra các hóa chất). o Sự nhận dạng đặc hiệu do sắp xếp bởi lectin trên bề mặt tế bào của nấm và mầm bệnh. o Trichoderma ký sinh và cuộn quanh sợi nấm vật chủ thông qua hình thành các dạng móc hay giác bám. o Tiết enzyme chitinase, β – glucanase, protease có khả năng bào mòn thành tế bào hay tiết ra những loại kháng sinh gây thủng sợi nấm vật chủ. Trong nghiên cứu invitro, đối kháng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh R. solani và P. meadii, hoạt động ký sinh của Trichoderma đã được quan sát trên sợi nấm của mầm bệnh trong những sợi nấm cuộn, quá trình thâm nhập và sự tiêu biến sợi nấm. Như sự ảnh hưởng lẫn nhau giữa sợi nấm và mầm bệnh thường xuyên được theo dõi qua nét đặc trưng trên Trichoderma. Weinding (1932) đã theo dõi sợi nấm 36 Đồ án tốt nghiệp Trichoderma phát triển gần kề sợi nấm Rhizoctonia, cuộn xung quanh và sau đó tìm thấy mọc bên trong nấm bệnh [54].  Cạnh tranh [25], [26], [54]. Trichoderma cạnh tranh với nấm gây bệnh cây trồng, làm suy kiệt chúng bằng cách hút hết dưỡng chất một cách thụ động bằng những bào tử chống chịu (chlamydospores). Cạnh tranh mô già hoặc mô chết với nấm Botrysis spp. và Sclerotina spp. gây bệnh cho cây (xâm nhập vào những mô già hoặc mô chết, sử dụng chúng làm nền tảng để từ đó xâm nhập vào những mô khoẻ). Nấm Trichoderma sử dụng những mô già và mô chết của cây chủ, bằng cách đó nấm Trichoderma cạnh tranh và tiêu diệt đường xâm nhiễm của nấm Botrysis spp. và Sclerotina spp. Cạnh tranh dịch tiết của cây với nấm Pythium spp. do dịch tiết của cây kích thích sự nảy mầm, mọc thành khuẩn ty của những túi bào tử Pythium spp. (gây bệnh cho cây) và lây nhiễm vào cây. Trichoderma làm giảm sự nảy mầm của nấm Pythium spp. bằng cách sử dụng dịch tiết đó vì thế mà các bào tử Pythium spp. không thể nảy mầm. Trichoderma còn đối kháng với các nấm gây bệnh bằng cách chiếm giữ vùng xâm nhiễm của mầm bệnh vào những vị trí bị thương, do đó ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh. Các nghiên cứu với T. viride và T. harzianum để kiểm soát bệnh thối rữa than, rễ đã cho thấy rằng với một mật độ 105 CFU/gram đất trồng đã cho sự hiệu quả giảm bớt bệnh hại. Điều này cho thấy rằng với một mức độ nhất định Trichoderma sẽ cho sự cạnh tranh với các mầm bệnh trong đất trồng. Wells (1988) nghĩ rằng sự có mặt ở khắp mọi nơi của Trichoderma ở đất nông nghiệp và đất tự nhiên khắp thế giới là bằng chứng trực tiếp cho thấy chúng vừa cạnh tranh không gian và vừa cạnh tranh nguồn dinh dưỡng. 37 Đồ án tốt nghiệp 1.4.2. Ứng dụng trong nông nghiệp của nấm Trichoderma Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần Thơ, Viện Lúa Đồng bằng Sông Cửu Long, Công ty Thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cho thấy hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng bằng Sông Cửu Long và Đông Nam Bộ. Các nghiên cứu cho ta thấy: 1.4.2.1. Khả năng kiểm soát bệnh cây Nhiều chủng nấm Trichoderma có khả năng kiểm soát các loài nấm gây bệnh cho cây trồng. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với các loại nấm gây bệnh thối rễ chủ yếu như: Pythium, Rhizoctonia và Fusarium [6]. Các loài nấm Trichoderma nói chung phát triển trong môi trường tự nhiên trên bề mặt của rễ cây, do đó có tác dụng kiểm soát sinh học với một số bệnh trên rễ gây ra bởi tuyến trùng và nấm, nó còn giúp tái tạo, phục hồi các rễ bị tổn thương do tuyến trùng hoặc rệp sáp gây ra. Nấm Trichoderma còn tạo ra các chất có hoạt tính tương tự như ―thuốc kháng sinh‖, có tác dụng kìm hãm sự tăng trưởng của các tác nhân gây bệnh đồng thời Trichoderma còn ký sinh các loài nấm gây bệnh, tiết ra các enzyme phân hủy chúng [31]. Ngoài ra nấm Trichoderma phòng trừ được các bệnh trên lá do loài nấm này kích thích bộ rễ tổng hợp chất đề kháng để chống lại các tác nhân vi sinh vật xâm nhập, các chất đề kháng này từ rễ di chuyển đến các bộ phận phía trên của cây [6]. Những phát hiện mới hiện nay cho thấy rằng một số chủng nấm Trichoderma có khả năng hoạt hóa cơ chế tự bảo vệ của thực vật, từ đó những chủng nấm này cũng có khả năng kiểm soát những bệnh do các tác nhân khác ngoài nấm. 38 Đồ án tốt nghiệp 1.4.2.2. Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng Hình 1.16: Sự phát triển của hệ rễ cây trồng giữa việc sử dụng và không sử dụng Trichoderma [25] Ghi chú: Without T-22: không được xử lí với T-22 With T-22: đã xử lí với T-22 Hình 1.17: Sự gia tăng sản lượng trên cây ớt với hạt giống được xử lý và không xử lý Trichoderma [25] Nấm Trichoderma kích thích sự tăng trưởng và phát triển của bộ rễ. Trichoderma bám vào những vùng rễ cây như những sinh vật cộng sinh khác. Nó tiết ra đất những chất kích thích để rễ cây ăn sâu xuống lòng đất, làm cho rễ cây khỏe hơn và tăng khả 39 Đồ án tốt nghiệp năng hút dinh dưỡng, tăng khả năng phòng vệ, tạo thành một lớp thành bảo vệ vùng rễ tránh sự xâm nhập của nấm bệnh, làm giảm khả năng nhiễm bệnh nhờ Trichoderma bám vào các đầu rễ cây, tăng khả năng ra hoa, thụ phấn, tăng trọng lượng quả và chiều cao của cây, tăng năng suất cây trồng. Hiện nay, một chủng nấm Trichoderma đã được phát hiện có khả năng tăng số lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1 m dưới mặt đất). Những rễ sâu này giúp các loài cây như bắp hay cây cảnh có khả năng chịu được hạn hán [6]. 1.4.2.3. Khả năng phân huỷ cellulose, phân giải lân chậm tan. Lợi dụng khả năng phân hủy cellulose, phân giải lân của nấm Trichoderma mà trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh để thúc đẩy quá trình phân hủy hữu cơ được nhanh chóng. Sử dụng chế phẩm Trichoderma ủ phân hữu cơ để bón cho cây trồng sẽ giúp tăng cường hệ vi sinh vật có ích trong đất. Phân giải nhanh các chất hữu cơ thành dạng dễ tan, cung cấp dinh dưỡng cho cây, phòng một số nấm bệnh gây hại cho cây trồng, chất lượng phân cao hơn. Chế phẩm nấm Trichoderma được sử dụng để xử lý giúp phân hủy rơm rạ, sau đó được dùng phối hợp với phân lân sinh học như dạng phân hữu cơ. Phân hữu cơ được bón riêng rẽ hoặc phối hợp với phân vô cơ (NPK) trên nền sét nặng. Kết quả nghiên cứu hai năm trên giống lúa IR64 cho thấy: nếu bón liên tục 100% phân hữu cơ cho năng suất tăng hơn so với đối chứng là 13,58% và nếu bón kết hợp 50% phân hữu cơ với 50% phân vô cơ cho năng suất tăng hơn so với đối chứng là 22,46%. Khi bón 100% phân hữu cơ thì côn trùng và bệnh khô vằn xuất hiện trể hơn và ít gây hại cho cây lúa và quần thể vi sinh vật đất ổn định hơn, có chiều hướng gia tăng hơn so với bón 100% phân vô cơ (Lưu Hồng Mẫn và cộng sự, 2001) [14]. Với những hiệu quả mà chế phẩm Trichoderma mang lại, bà con nông dân nên sử dụng chế phẩm sinh học thay cho việc dùng các loại phân bón hóa học để cải thiện năng suất và chất lượng cây trồng, góp phần bền vững môi trường đất canh tác nông nghiệp. 40 Đồ án tốt nghiệp Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài Đề tài được thực hiện từ ngày 24 tháng 3 đến ngày 15 tháng 6, tại phòng Nghiên cứu và Phát triển của Công ty TNHH Điền Trang, số 67, Đường 16, Khu phố 4, Phường Cát Lái, Quận 2, TP.HCM. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Nguồn gốc nấm đối kháng, nấm gây bệnh 2.2.1.1. Nấm đối kháng Các chủng nấm đối kháng Trichoderma được phân lập từ mẫu đất thu thập tại vườn trồng tiêu thuộc huyện Bù Gia Mập và Bù Đốp, tỉnh Bình Phước. Các chủng nấm Trichoderma sau khi được phân lập sẽ tiến hành khảo sát khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp., Fusarium sp., Phytophthora sp. gây bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu. 2.2.1.2. Nấm gây bệnh Nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên lá, Fusarium sp. gây bệnh chết chậm, Phytophthora sp. gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu được phân lập từ các vườn hồ tiêu bị nấm bệnh tấn công ở tỉnh Bình Phước. 2.2.2. Trang thiết bị và hóa chất sử dụng Một số trang thiết bị và hóa chất phục vụ cho nghiên cứu đề tài được cung cấp bởi Công ty TNHH Điền Trang. 2.2.3. Môi trường nuôi cấy Môi trường DRBC (Dichoran Rose Bengal Chloramphenicol) Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) Môi trường CMC (Carboxy methyl cellulose) Môi trường WA (Water Agar). 41 Đồ án tốt nghiệp 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp thu mẫu 2.3.1.1. Thu mẫu đất (Theo TCVN 4046 – 85) Các mẫu đất được lấy trên vườn theo quy tắc đường thẳng góc: Mỗi vườn lấy 5 mẫu, một mẫu ở trung tâm và bốn mẫu ở 4 góc vườn. Ở mỗi điểm chiếu theo rìa tán lá tiêu, đào một hố nhỏ sâu 15 cm, sau đó dùng dao nạo một lớp đất mỏng đều đặn từ trên xuống dưới theo chiều thẳng đứng, lấy khoảng 200 g. Mẫu sau khi lấy được đựng trong bao zip, ghi rõ tên vườn, vị trí cây lấy mẫu, Đánh số vào vị trí cây lấy mẫu. Hình 2.1: Thu mẫu đất 2.3.1.2. Thu mẫu bệnh Các phương lấy mẫu bệnh ở lá, thân và rễ. (QCVN 01 – 172: 2014).  Thu mẫu bệnh ở lá Lấy những lá tiêu trên bề mặt xuất hiện những vùng bị nâu vàng hay màu đen với nhiều hình dạng cũng như kích cỡ khác nhau ở khắp mặt lá. Bề mặt bên ngoài vết bệnh có màu vàng ngăn cách giữa phần lá chưa bị bệnh và đã bị bệnh, phần bị bệnh bên trong là những vòng tròn đồng tâm và có những viền đen bao bọc phía bên ngoài. Đựng mẫu rễ trong bao zip, ghi rõ ngày lấy mẫu, ký tự mã hóa mẫu và đánh dấu vị trí cây lấy mẫu. Mẫu lấy về phân lập càng sớm càng tốt, trong trường hợp nếu không phân lập được thì bảo quản trong điều kiện khô ráo ở nhiệt độ 14 – 20oC. 42 Đồ án tốt nghiệp Hình 2.2: Thu mẫu lá tiêu bệnh thán thư  Thu mẫu bệnh ở rễ Đào rễ tơ ở độ sâu 15 - 20 cm và cách gốc 20 - 30 cm. Chọn những rễ tơ có triệu chứng các chấm đen, vết thối trên rễ và đầu mút. Dựng mẫu rễ vào bao zip, ghi rõ ngày lấy mẫu, ký hiệu mã hóa mẫu và đánh dấu vị trí cây lấy mẫu. Mẫu lấy về phân lập càng sớm càng tốt, trong trường hợp nếu không phân lập được thì bảo quản trong điều kiện khô ráo ở nhiệt độ 14 – 20oC. Hình 2.3: Lấy mẫu rễ tiêu có triệu chứng bệnh chết chậm 43 Đồ án tốt nghiệp 2.3.2. Phân lập nấm Trichoderma spp. và nấm bệnh phổ biến trong đất và trên cây hồ tiêu 2.3.2.1. Phân lập nấm Trichoderma spp. trong đất (TCVN 4833 – 89, TCVN 4881 - 89)  Quy trình Mẫu đất Trộn đều mẫu Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml nước muối sinh lý Pha loãng mẫu thành các nồng độ 10-2, 10-3 Hút 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào đĩa petri, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần Đổ đĩa (môi trường DRBC nguội 40 - 45oC) và lắc đều Ủ ở nhiệt độ phòng từ 2 – 3 ngày Đọc kết quả: đếm khuẩn lạc đặc Chọn các khuẩn lạc đặc trưng,riêng lẻ Làm thuần 44 Đồ án tốt nghiệp  Thuyết minh quy trình 30 mẫu đất thu thập từ 6 vườn hồ tiêu thuộc tỉnh Bình Phước (mỗi vườn lấy 5 mẫu), dùng để phân lập nấm Trichoderma spp. theo phương pháp của Aneza (2002). Cân 25 g đất/mẫu cho vào bình tam giác chứa 225 ml nước cất vô trùng, đặt 15 phút trên máy lắc, pha loãng dung dịch mẫu bằng cách lấy 1 ml dung dịch đất cho vào ống nghiệm có chứa 9ml nước cất vô trùng, đồng nhất mẫu và nước cất bằng máy vortex. Sau đó, tiếp tục pha loãng ra các nồng độ 10-2, 10-3. Dùng micropipette vô trùng riêng cho từng độ pha loãng, hút 1 ml dung dịch mẫu ở mỗi nồng độ 10–1, 10–2, 10–3 vào đĩa petri vô trùng. Mỗi độ pha loãng lặp lại 2 lần. Môi trường DRBC nguội 40 – 45oC, đổ môi trường vào đĩa petri đã hút mẫu. Lắc dàn đều mẫu, đợi bề mặt thạch khô, úp ngược đĩa petri, ủ ở nhiệt độ phòng từ 2 – 3 ngày. Chọn các khuẩn lạc đặc trưng, riêng lẻ. Tiến hành làm thuần trên môi trường PDA. Theo dõi từng ngày, ủ ở nhiệt độ phòng 4 – 5 ngày. Quan sát dưới kính hiển vi. Cấy chuyền, tiếp tục làm thuần trên môi trường PDA. 2.3.2.2. Phân lập nấm Phytophthora gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu Mẫu đất bệnh được thu thập ở các cây hồ tiêu bị bệnh chết nhanh, tiến hành chẩn đoán nhanh sự hiện diện của nấm Phytophthora bằng phương pháp bẫy cánh hoa hồng. Phương pháp được thực hiện như sau: o Thu thập mẫu đất ở gốc cây tiêu bị chết nhanh. o Cân 100 g đất, hòa vào nước cất vô trùng trong cốc tỉ lệ 1 phần đất: 2 phần nước. Khuấy nhẹ đất trong cốc, để lắng xuống trong 2 giờ (tốt nhất để qua đêm). o Cắt cánh hoa hồng (hoa màu hồng hay màu đỏ) có kích thước 0,5 x 0,5 cm thả vào cốc nước. o Để yên cốc qua đêm ở nhiệt độ phòng. 45 Đồ án tốt nghiệp o Quan sát cánh hoa hồng sau 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày. Khi thấy cánh hoa bị chuyển màu, đem quan sát dưới kính hiển vi. Nếu thấy xuất hiện các bào tử hình trứng có vách mịn, du động bào tử chuyển động trong nước, thì đem đặt cánh hoa hồng lên môi trường WA. o Theo dõi sự phát triển của sợi nấm trên môi trường WA. Tiến hành làm thuần, dùng que cấy lấy ít tơ nấm cấy sang môi trường PDA. Đặt đĩa cấy ở nhiệt độ phòng. Quan sát đĩa cấy nấm Phytophthora mọc hình bông cúc, ít sợi nấm, tơ nấm màu trắng bông xốp. Hình 2.3: Bẫy nấm Phytophthora bằng cánh hoa hồng 2.3.2.3. Phân lập nấm Fusarium gây bệnh chết chậm trên cây hồ tiêu Mẫu bệnh được thu thập từ các rễ cây hồ tiêu có triệu chứng thâm đen, hư thối. Sau khi thu mẫu về, tiến hành phân lập trong điều kiện phòng thí nghiệm. Rửa mẫu dưới vòi nước đang chảy để loại bỏ đất và bụi bẩn. Nhúng dụng cụ trong cồn 90o và hơ khô trên ngọn lửa. Khử trùng bề mặt rễ bằng dung dịch Javen 1 % khoảng 10 - 15 giây, sau đó rửa lại bằng nước vô trùng và để khô trên giấy thấm vô trùng. 46 Đồ án tốt nghiệp Hình 2.4: Rễ tiêu có triệu chứng bệnh chết chậm Dùng dụng cụ đã khử trùng cắt rễ thành từng mẫu cấy nhỏ 1 - 2 mm ở phần ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh, sau đó cấy lên môi trường WA. Dùng kẹp ấn nhẹ những mẫu cấy lên mặt thạch gần mép đĩa môi trường. Đặt ngược đĩa cấy để tránh đọng hơi nước trên bề mặt môi trường ở nhiệt độ phòng trong 3 - 5 ngày cho đến khi tản nấm phát triển, quan sát hàng ngày dưới kính hiển vi để kiểm tra các sợi nấm mọc từ các mẫu cấy. Cấy truyền lên môi trường PDA, làm thuần nấm bằng cách cấy đỉnh sinh trưởng của sợi nấm. 2.3.2.4. Phân lập nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư trên cây hồ tiêu Mẫu bệnh được thu thập từ các lá tiêu có những đốm màu nâu hay đậm dần thành màu đen, rìa vết bệnh có quầng đen. Rửa sạch mẫu lá dưới vòi nước đang chảy. Sau khi rửa sạch có thể nhìn thấy rõ những triệu chứng điển hình của bệnh thán thư. Nhúng các mẫu vào dung dịch cồn 70o để khử trùng bề mặt khoảng 30 giây, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng, để khô trên giấy thấm vô trùng. Nhúng dụng cụ trong cồn 90o và hơ khô trên ngọn lửa đèn cồn. Dùng kéo cắt mẫu thành những mẫu cấy nhỏ khoảng 3 – 5 mm, là phần ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe, cấy vào môi trường WA. Đặt đĩa cấy ở nhiệt độ phòng. Quan sát hàng ngày dưới kính hiển vi để kiểm tra các sợi nấm mọc từ các mẫu cấy. Cấy truyền chúng sang môi trường PDA cho đến khi 47 Đồ án tốt nghiệp thu được nấm thuần. Làm thuần nấm bằng cách cấy đỉnh sinh trưởng của sợi nấm. Cấy truyền chúng sang môi trường PDA cho đến khi thu được nấm thuần. 2.3.3. Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm  Hình thái đại thể: Dùng que cấy vô trùng lấy ít sợi nấm, cấy điểm vào giữa đĩa petri có đổ một lớp mỏng môi trường thạch. Ủ ở nhiệt độ phòng, quan sát khuẩn lạc theo từng ngày. Dùng kính lúp ba chiều soi mô tả các đặc điểm: o Kích thước, hình dạng khuẩn lạc để biết tốc độ phát triển của nó. o Màu sắc khuẩn lạc mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc. o Màu sắc của môi trường do sắc tố nấm sợi tạo ra. o Dạng sợi nấm mọc ở mặt trên môi trường. o Đặc điểm của mép khuẩn lạc. o Giọt nước đọng, chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt khuẩn lạc.  Hình thái vi thể: Dùng phương pháp phòng ẩm. Chuẩn bị môi trường thích hợp, đổ vào các đĩa petri. Nhỏ nước cất vô trùng cho ướt toàn bộ giấy thấm trong đĩa petri. Sau đó, đặt ba thanh đũa tre lên đĩa rồi đặt lame lên ba thanh đũa tre. Sử dụng dao mổ vô trùng cắt một khối thạch (1 cm2) từ đĩa môi trường PDA chuyển sang đặt lên lame đã chuẩn bị trong đĩa nuôi cấy. Dùng dây cấy đã khử trùng, lấy sinh khối nấm đã làm thuần cấy vào 4 mặt bên của khối thạch. Sau đó đậy lamelle lên trên khối thạch. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi sợi nấm mọc đều và hình thành bào tử. Lấy lam ra, nhuộm nấm bằng phương pháp nhuộm methylene blue. Quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính 20X về các đặc điểm sau: o Hình dạng cuống sinh bào tử. o Hình dạng thể bình. o Hình dạng các thể bọng. 48 Đồ án tốt nghiệp o Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn. o Đặc điểm bào tử đính, Màu sắc, kích thước bào tử. 2.3.4. Xác định hoạt tính cellulose: Phương pháp khuếch tán trên thạch  Nguyên tắc Cellulase tác động lên cơ chất CMC trong môi trường thạch. CMC bị phân hủy thành các đường khử làm độ đục của môi trường bị giảm và trở nên trong suốt khi nhuộm bằng Lugol. Độ lớn của vòng phân giải phản ánh hoạt tính của enzyme.  Tiến hàn...erma 30 25.7a 25 20 15 10.7bc 12.5b bcd 10.2bcde 10.3 10bcdef 9.3bcdefg 7.7cdefg 9.2bcdefg 10 7defghi efghij 4.7hijklm 6.7 ghijk defghi ghijk 5.8ghijk 6 hijklmn 7 ghijk 6 5.5hijkl 5.5hijkl 4.5 4ijklmn 4.3hijklmn 6.5 5hijklm 5hijklm hijklmn ijklmn 4.5 3.5ijklmn jklmn 5 3.3jklmn 3.5 3klmn 3.3 2lmn mn 1n 1n 1.5 0 Biểu đồ 3.1 Đường kính phân giải cellulose của các chủng Trichoderma spp. 61 Đồ án tốt nghiệp Khả năng sinh enzyme cellulase của vi sinh vật là một trong những yếu tố quyết định khả năng phân giải các chất hữu cơ. Kết quả quan sát đường kính vòng phân giải cellulose của các chủng Trichoderma phân lập được ở biểu đồ 3.1 cho thấy, tất các chủng Trichoderma khảo sát đều có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase phân giải cellulose. Nhưng nhìn chung khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng Trichoderma khảo sát đều yếu và rất yếu. Trong đó, chủng Trichoderma BP3_B4 và BP3_B7 có đường kính vòng phân giải chỉ 1 mm. Bên cạnh các chủng có khả năng sinh enzyme cellulose yếu, chủng Trichoderma BP3_03.4 lại có khả năng phân giải cellulose mạnh, đường kính vòng phân giải là 25,7 mm. Hình 3.12: Khả năng phân giải cellulose của các chủng Trichoderma spp. 62 Đồ án tốt nghiệp 3.4. Đánh giá khả năng đối kháng Trichoderma spp. với nấm bệnh đã đƣợc phân lập 3.4.1. Khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng nấm Trichoderma spp. phân lập từ đất Hình 3.13: Hình thái chủng nấm Trichoderma sp. phát triển qua các ngày 63 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4: Bán kính tản nấm Trichoderma spp. sau các ngày nuôi cấy Bán kính tản nấm Trichodema spp. (cm) sau các ngày Các chủng nuôi cấy Trichoderma 3NSC 4NSC 5NSC ef cde a BP1_01.1 45,7 70,7 80 d cd a BP1_01.3 52,7 72,0 80 efghi abc a BP1_02 43,7 75,0 80 d bcd a BP1_04.1 51,0 72,3 80 ghij jklm c BP1_02.3 41,7 56,0 73,0 d bcd a BP1_04.3 50,7 73,3 80 e abc a BP1_B 46,3 75,7 80 cd ab a BP2_02.4 53,7 78,0 80 efghi klm cd BP2_03.3 43,0 54,0 70,3 b a a BP2_03.4 61,7 80,0 80 efg bcd a BP2_03.5 45,3 72,7 80 k lm d BP2_04.2 37,0 52,7 65,0 b a a BP2_04.3 65,3 80,0 80 l n e BP2_04.4 31,3 43,7 58,3 c a a BP2_B.1 57,0 80,0 80 a a a BP2_B.2 80,0 80,0 80 efgh fgh a BP3_01.1 44,7 63,3 80 hij m cd BP3_01.2 41,0 50,7 70,3 l n e BP3_01.3 32,0 42,7 55,3 ijk hijkl c BP3_02.1 40,7 58,0 72 efghij hijkl ab BP3_02.2 42,7 58,0 78,9 jk ijkl a BP3_02.3 39,0 57,3 80 64 Đồ án tốt nghiệp hij fghi a BP3_02.4 41,0 62,3 80 cd a a BP3_02.5 54,3 80,0 80 fghij ghij a BP3_03.4 42,0 61,0 80 e cd a BP3_03.3 46,0 71,0 80 hij hijkl bc BP3_04.2 41,0 58,0 74,3 efghi fg a BP3_04.3 44,0 64,7 80 ef hijkl a BP3_04.5 45,7 58,0 80 hij def a BP3_B.4 41,3 68,0 80 efghi ghijk a BP3_B.7 43,3 59,7 80 cd bc a BP4_01.1 53,3 74,0 80 efghi efg a BP5_03 44,0 65,0 80 ghij hijk a BP5_B.2 41,7 58,7 80 Sự tăng trưởng của nấm là một chỉ tiêu quan trọng để lựa chọn chủng vi sinh vật ứng dụng tạo chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh hại cây trồng. Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy đa số các chủng Trichoderma đều phát triển rất nhanh trên môi trường PDA. Sau 5 ngày nuôi cấy, tản nấm phát triển đầy đĩa với bán kính 80 (mm). Đặc biệt chủng Trichoderma BP2_B.2 có tốc độ tăng trưởng cao nhất, tản nấm phát triển đầy đĩa chỉ sau 3 ngày nuôi cấy. Nhưng bên cạnh đó, vẫn có những chủng Trichoderma như BP2_04.2, BP2_04.4 và BP3_01.3 mà người thực hiện đề tài phân lập có khả năng sinh trưởng yếu. Sau 5 ngày nuôi cấy, bán kính tăng trưởng trung bình sau 3 lần khảo sát chỉ đạt gần 65 mm. 65 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.14: Các chủng Trichoderma có khả năng phủ kín đĩa sau 4 ngày nuôi cấy 66 Đồ án tốt nghiệp 3.4.2. Trichoderma spp. đối kháng với nấm Phytophthora sp. gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu Hình 3.15: Trichoderma sp. đối kháng với Phytophthora sp. theo dõi qua các ngày 67 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.5: Tỷ lệ (%) đối kháng Trichoderma spp. đối với Phytophthora sp. sau các ngày theo dõi Các chủng Tỉ lệ đối kháng (%) sau các ngày theo dõi Trichoderma 3NSC 4NSC 5NSC 55,9cd 74,7bc 81,1bcd BP1_01.1 44,7gh 71,1cd 78,2def BP1_01.3 46,4fgh 61,3f 74,8efg BP1_02 52de 73,3bc 81,5bcd BP1_04.1 44,7gh 59,6fg 70,0hij BP1_02.3 55,3cd 74,7bc 85,2b BP1_04.3 49,2ef 61,8f 78,2def BP1_B 47,5fg 67,6de 79,2cde BP2_02.4 43,0hi 61,8f 70,4ghij BP2_03.3 62,1b 73,8bc 82,9bc BP2_03.4 51,9de 67,1e 78,5cdef BP2_03.5 31,6lmn 58,2fg 67,0jkl BP2_04.2 48,6efg 59,6fg 66,3jklm BP2_04.3 24,8o 48,4mno 57,4pq BP2_04.4 46,9fhg 75,5b 79,6cd BP2_B.1 74,0a 100a 100a BP2_B.2 36,2ik 52,9ijk 66,7jkl BP3_01.1 39,6ij 56,4ghi 66,3jklm BP3_01.2 34,5klm 49,3klmno 59,3opq BP3_01.3 35,0klm 50,2jklmn 61,1nop BP3_02.1 32,8klmn 49,3klmno 58,2pq BP3_02.2 68 Đồ án tốt nghiệp 36,2kj 57,3gh 74,3fgh BP3_02.3 34,5kml 51,6jklm 61,5nop BP3_02.4 39,5ij 53,8hij 63,3lmno BP3_02.5 35,6ikl 52,4jkl 68,9ijk BP3_03.4 29,4n 46,2o 55,6q BP3_03.3 31,6lmn 46,7no 56,3q BP3_04.2 36,2jk 53,3ij 64,0lmn BP3_04.3 33,3klmn 50,7jklm 64,4klmn BP3_04.5 31,1mn 58,7fg 73,0ghi BP3_B.4 36,7jk 51,1jklm 61,1nop BP3_B.7 54,5c 72,0bc 79,6cd BP4_01.1 31,6lmn 48,9lmno 61,5nop BP5_03 36,7jk 52,0jklm 61,8mnop BP5_B.2 69 Đồ án tốt nghiệp 120 100a 100 81.1bcd b bc bcd 85.2 79.2cde 82.9 ghi 81.5 cdef 73 def 78.5 cd jkl cd 78.2 78.2def 79.6 66.7 ijk klmn 79.6 80 efg 67jkl 74.3fgh 68.9 64.4 74.8 hij 70.4ghij 66.3jklm mnop 70 66.3jklm nop 63.3lmno lmn 61.8 61.1 64 nop 59.3opq 61.5nop 56.3q 61.1 61.5nop pq 58.2pq 60 57.4 55.7q 40 20 0 Biểu đồ 3.2: Tỷ lệ (%) đối kháng của nấm Trichoderma spp. với nấm Phytophthora sp. 5 NSC 70 Đồ án tốt nghiệp Khả năng đối kháng là chỉ tiêu quyết định và là yếu tố quan trọng nhất thể hiện hiệu quả ức chế của vi sinh vật trong phòng trừ bệnh hại cây trồng. Tỷ lệ đối kháng của các chủng Trichoderma khảo sát được trình bày ở bảng 3.5 cho thấy các chủng Trichoderma phân lập được trong đất Bình Phước đều có khả năng ức chế nấm Phytophthora sp. gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu trong điều kiện phòng thí nghiệm. Sau 4 ngày nuôi cấy, chủng nấm Trichoderma BP2_B.2 có khả năng ức chế 100 % nấm Phytophthora sp. theo cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống, nhờ vào tốc độ phát triển nhanh. Sau 11 ngày nuôi cấy, 8 chủng Trichoderma khác là BP1_01.1, BP1_04.1, BP1_04.3, BP1_B, BP2_02.4, BP2_03.4, BP2_B.1 và BP4_01.1 cũng có khả năng đối kháng 100 % nấm Phytophthora sp (Phụ lục 2). Bên cạnh đó, ngoài khả năng cạnh tranh dinh dưỡng thì sự đối kháng nấm bệnh còn phụ thuộc vào khả năng tiết kháng sinh, enzyme chitinase và các yếu tố cơ học khác. ĐC Hình 3.16: Các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng cao với Phytophthora sp. và đĩa nấm Phytophthora sp. sau 7 ngày nuôi cấy 71 Đồ án tốt nghiệp 3.4.3. Trichoderma spp. đối kháng với nấm Fusarium sp. gây bệnh chết chậm trên cây hồ tiêu Hình 3.17: Nấm Trichoderma sp. đối kháng với Fusarium sp. theo dõi qua các ngày. 72 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.6: Tỷ lệ (%) đối kháng Trichoderma spp. với Fusarium sp. sau các ngày theo dõi Các chủng Tỉ lệ (%) đối kháng sau các ngày theo dõi Trichoderma 3NSC 5NSC 7NSC 12,1cdefg 36,4ijklm 52,0efghij BP1_01.1 15,1bcde 37,1hijkl 52,0efghij BP1_01.3 10,6cdefg 41,2fghi 53,5defghij BP1_02 12,1cdefg 37,2hijkl 52,3defghij BP1_04.1 15,1bcde 34,3klmn 47,3ijk BP1_02.3 16,7bcd 43,1defgh 56,6defgh BP1_04.3 13,6cdef 42,2efghi 53,5defghij BP1_B 15,1bcde 44,0cdefg 57,4defg BP2_02.4 13,6cdef 34,3jkml 48,1hijk BP2_03.3 15,1bcde 48,1cde 61,2cd BP2_03.4 12,1cdefg 40,2fghij 55,8defghi BP2_03.5 10,7cdefg 27,4no 40,3kl BP2_04.2 22,7b 50,0c 60,5de BP2_04.3 12,1cdefg 19,6p 38,0l BP2_04.4 12,1cdefg 44,1cdefg 69,7bc BP2_B.1 100a 100a 100a BP2_B.2 15,1bcde 49,0cd 59,7def BP3_01.1 9,1defg 25,5op 75,2b BP3_01.2 10,7cdefg 31,4lmno 45,7jkl BP3_01.3 15,1bcde 37,3hijkl 51,2fghij BP3_02.1 15,2bcde 30,4mno 49,6ghij BP3_02.2 73 Đồ án tốt nghiệp 6,0fg 42,1efghi 55,0defghi BP3_02.3 12,1cdefg 46,1cdef 58,1defg BP3_02.4 7,6efg 100a 100a BP3_02.5 12,1cdefg 32,4lmn 48,0hijk BP3_03.4 10,7cdefg 71,6b 100a BP3_03.3 12,1cdefg 32,4lmn 48,0hijk BP3_04.2 12,1cdefg 43,1defgh 50,7ghij BP3_04.3 4,5g 34,3jklm 51,2fghij BP3_04.5 9,1defg 41,2fghi 57,3defg BP3_B.4 16,2bcd 39,2ghijk 52,0efghij BP3_B.7 10,7cdefg 42,2efghi 55,0defghi BP4_01.1 18,2bc 49,0cd 77,5b BP5_03 12,1cdefg 48,1cde 59,7def BP5_B.2 Kết quả đánh giá tính đối kháng của các chủng Trichoderma spp. phân lập trong đất Bình Phước đối với nấm Fusarium sp. gây bệnh chết chậm ở cây hồ tiêu trên môi trường dinh dưỡng PDA (Bảng 4.4 và Hình 4.5) cho thấy, các chủng Trichoderma spp. đều có khả năng đối kháng với nấm Fusarium sp. ở thời điểm sau 7 ngày nuôi câý. Phần lớn các chủng Trichoderma đối kháng nấm Fusarium sp. ở mức độ trung bình từ 40 – 59 %. Nhưng bên cạnh đó vẫn có các chủng có khả năng đối kháng cao lên đến 100 % như BP2_B.2 sau 3 ngày nuôi cấy và BP3_03.3, BP3_2.5 sau 7 ngày nuôi cấy. 74 Đồ án tốt nghiệp 120 100a 100a 100a 100 b 80 75.2b 77.5 bc 69.7 defg efghij cd 58.1 52 61.2 de 57.3defg defg 60.5 def 51.2fghij def efghij defgh57.4 59.7 55defghi 59.7 52 56.6 defghi 51.2fghij defghi 60 defghij defghij 55.8 55 52.3 53.5 49.6ghij ghij defghij 45.7jkl hijk 50.7 53.5 48.1hijk 48 52efghij 47.3ijk kl 48hijk 40.3 38l 40 20 0 Biểu đồ 3.3: Tỷ lệ (%) đối kháng của Trichoderma spp. với Fusarium sp. 7 NSC 75 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.18: Chủng Trichoderma spp. có khả năng đối kháng cao với nấm Fusarium sp. và đĩa nấm bệnh Fusarium sp. sau 7 ngày nuôi cấy 76 Đồ án tốt nghiệp 3.4.4. Trichoderma spp. đối kháng với nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên cây tiêu Hình 3.19: Nấm Trichoderma sp. đối kháng với nấm Colletotrichum sp. 77 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.7: Tỷ lệ (%) đối kháng nấm Trichoderma spp. đối với nấm Colletotrichum sp. qua các ngày theo dõi Các chủng Tỉ lệ đối kháng (%) sau các ngày theo dõi Trichoderma 3NSC 5NSC 7NSC 6,4ghi 59,8cde 69,6de BP1_01.1 1,6i 49,0ijkl 68,2def BP1_01.3 6,3ghi 51,0ghijkl 63,7efghij BP1_02 9,5fgh 53,9efghij 67,4defg BP1_04.1 0,0i 41,2mn 57,1hijk BP1_02.3 1,6i 50,0hijkl 100,0a BP1_04.3 6,4ghi 59,8cde 69,6de BP1_B 6,3ghi 51,0ghijkl 64,4defghi BP2_02.4 3,2hi 45,1lm 57,8ghijk BP2_03.3 0,0i 48,1jkl 100,0a BP2_03.4 1,6i 54,9defghi 74,1cd BP2_03.5 0,0i 33,4o 51,8kl BP2_04.2 20,6bcd 55,9defgh 66,7defgh BP2_04.3 1,6i 22,5p 42,2lm BP2_04.4 0,0i 52,0fghijk 65,9defgh BP2_B.1 100,0a 100,0a 100,0a BP2_B.2 22,2bc 57,2defg 70,4de BP3_01.1 12,7efg 52,0fghijk 83,6bc BP3_01.2 20,6bcd 60,8cd 83,7bc BP3_01.3 22,2bc 49,0ijkl 62,2efghij BP3_02.1 19,0bcde 52,9fghij 85,9b BP3_02.2 78 Đồ án tốt nghiệp 20,6bcd 51,9fghijk 65,9defgh BP3_02.3 17,5cde 46,1klm 62,9efghij BP3_02.4 17,4cde 67,7bc 100,0a BP3_02.5 20,6bcd 57,8cdef 58,8fghijk BP3_03.4 14,3def 48,1jkl 56,9hijk BP3_03.3 20,6bcd 37,2no 39,2m BP3_04.2 25,4b 54,9defghi 100,0a BP3_04.3 22,2bc 59,8cde 69,6de BP3_04.5 17,5cde 48,1jkl 56,9hijk BP3_B.4 20,6bcd 48,1jkl 54,9ijk BP3_B.7 3,2hi 49,0ijkl 49,0klm BP4_01.1 20,6bcd 67,6b 71,6de BP5_03 20,6bcd 53,9efghij 53,9jk BP5_B.2 79 Đồ án tốt nghiệp 120 100a 100a 100a 100a 100a 100 bc 83.7 b 83.6bc 85.9 69.6de 80 def 69.6de 74.1cd defgh defgh 68.2 65.9 de 65.9 de de defg defghi 70.4 69.6 71.6 67.4 64.4 66.7defgh efghij efghij efghij 62.2 62.9 58.8fghijk 63.7 57.8ghijk 56.9hijk hijk 56.9hijk ijk 60 57.1 kl 54.9 53.9jk 51.8 49klm lm 42.2 39.2m 40 20 0 Biểu đồ 3.4: Tỷ lệ (%) đối kháng của nấm Trichoderma spp. với Colletotrichum sp. 7NSC 80 Đồ án tốt nghiệp Tất cả các chủng Trichoderma phân lập được đều có khả năng đối kháng với các chủng Colletotrichum sp. ở các mức độ khác nhau (bảng 3.7). Các chủng Trichoderma BP2_B.2, BP3_01.3, BP3_02.5 và BP5_03 có khả năng đối kháng Colletotrichum sp. theo cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống, nhờ vào tốc độ phát triển nhanh. Bên cạnh tốc độ phát triển nhanh, các chủng Trichoderma còn lại còn có khả năng kí sinh trên khuẩn ty nấm bệnh. Khuẩn ty Trichoderma áp sát và quấn chặt lấy khuẩn ty Colletotrichum, hoặc tiết enzyme và ăn sâu vào bên trong khuẩn ty nấm bệnh (hình 3.20). Trong một số trường hợp, rất có thể Trichoderma hút các chất dinh dưỡng từ khuẩn ty nấm bệnh và phát triển rất mạnh, tạo nhiều bào tử hơn so với khi phát triển trên môi trường PDA (BP3_02.5, BP3_03.3). Trong số 34 chủng Trichoderma sp. khảo sát, sau 9 ngày nuôi cấy có đến 18 chủng khả năng đối kháng đạt hiệu quả tối đa (Phụ lục 2). Hình 3.20: Khuẩn ty Trichoderma sp. quấn chặt lấy khuẩn ty Colletotrichum sp. 81 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.21: Các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng cao với Colletotrichum sp. sau 7 ngày nuôi cấy và đĩa nấm bệnh Colletotrichum sp. sau 5 ngày nuôi cấy 82 Đồ án tốt nghiệp 3.4.5. Tổng hợp khả năng đối kháng của các Trichoderma spp. với 3 nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu Bảng 3.8: Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma với Phytophthora sp. sau 3 NSC và Fusarium sp., Colletotrichum sp. sau 7 NSC. Tỉ lệ đối kháng (%) sau các ngày theo dõi Các chủng Trichoderma Phytophthora sp. Fusarium sp. sau Colletotrichum sau 5 NSC 7 NSC sp. sau 7 NSC 81,1bcd 52,0efghij 69,6de BP1_01.1 78,2def 52,0efghij 68,2def BP1_01.3 74,8efg 53,5defghij 63,7efghij BP1_02 81,5bcd 52,3defghij 67,4defg BP1_04.1 70,0hij 47,3ijk 57,1hijk BP1_02.3 85,2b 56,6defgh 100,0a BP1_04.3 78,2def 53,5defghij 69,6de BP1_B 79,2cde 57,4defg 64,4defghi BP2_02.4 70,4ghij 48,1hijk 57,8ghijk BP2_03.3 82,9bc 61,2cd 100,0a BP2_03.4 78,5cdef 55,8defghi 74,1cd BP2_03.5 67,0jkl 40,3kl 51,8kl BP2_04.2 66,3jklm 60,5de 66,7defgh BP2_04.3 57,4pq 38,0l 42,2lm BP2_04.4 79,6cd 69,7bc 65,9defgh BP2_B.1 100a 100a 100,0a BP2_B.2 66,7jkl 59,7def 70,4de BP3_01.1 66,3jklm 75,2b 83,6bc BP3_01.2 83 Đồ án tốt nghiệp 59,3opq 45,7jkl 83,7bc BP3_01.3 61,1nop 51,2fghij 62,2efghij BP3_02.1 58,2pq 49,6ghij 85,9b BP3_02.2 74,3fgh 55,0defghi 65,9defgh BP3_02.3 61,5nop 58,1defg 62,9efghij BP3_02.4 63,3lmno 100a 100,0a BP3_02.5 68,9ijk 48,0hijk 58,8fghijk BP3_03.4 55,6q 100a 56,9hijk BP3_03.3 56,3q 48,0hijk 39,2m BP3_04.2 64,0lmn 50,7ghij 100,0a BP3_04.3 64,4klmn 51,2fghij 69,6de BP3_04.5 73,0ghi 57,3defg 56,9hijk BP3_B.4 61,1nop 52,0efghij 54,9ijk BP3_B.7 79,6cd 55,0defghi 49,0klm BP4_01.1 61,5nop 77,5b 71,6de BP5_03 61,8mnop 59,7def 53,9jk BP5_B.2 Ở bảng 3.8, người thực hiện đề tài nhận thấy Trichoderma có phổ tác đông rộng. Tuy nhiên, mức độ đối kháng của Trichoderma còn phụ thuộc vào chủng Trichoderma, chủng nấm bệnh và thời gian cấy đối kháng. Trong số 34 chủng phân lập trong đất Bình Phước, nổi trội nhất là chủng Trichoderma BP2_B có khả năng đối kháng mạnh với cả 3 chủng nấm gây bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu là Phytophthora sp., Fusarium sp. và Colletotrichum sp. Đây là một tác nhân hứa hẹn có nhiều triển vọng sản xuất các chế phẩm sinh học dùng trong kiểm soát và phòng trừ nấm bệnh hại cây trồng. Ngoài ra, còn các chủng BP1_04.3, BP2_03.4 và BP3_02.5 cũng có khả năng đối kháng cao với 3 chủng nấm gây bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu. 84 Đồ án tốt nghiệp KẾT LUẬN Đã phân lập được 34 chủng nấm Trichoderma từ đất trồng hồ tiêu ở tỉnh Bình Phước Đã phân lập được nấm gây bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu: Phytophthora sp. gây bệnh chết nhanh, Fusarium sp. gây bệnh chết chậm và Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư. Các chủng nấm Trichoderma phân lập được trong đất đều sinh enzyme cellulase yếu, vòng phân giải cellulose từ 1 – 12,5 mm sau 4 ngày nuôi cấy, trừ chủng BP3_03.4 có khả năng sinh enzyme cellulase mạnh, vòng phân giải cellulose 25,7 mm. Các chủng nấm phân lập được đều sinh trưởng và phát triển mạnh trên môi trường PDA, đặc biệt là các chủng BP2_B.1, BP2_B.2, BP2_03.4, BP2_04.3 và BP3_02.5 chỉ sau 4 ngày đã phát triển đầy đĩa. Có 9 chủng Trichoderma đối kháng 100 % với nấm Phytophthora sp. là BP1_01.1, BP1_04.1, BP1_04.3, BP1_B, BP2_02.4, BP2_03.4, BP2_B.1, BP2_B.2 và BP4_01.1. Có 3 chủng Trichoderma đối kháng 100 % với nấm Fusarium sp. là BP2_B.2, BP3_02.5 và BP3_03.3. Có 18 chủng Trichoderma đối kháng 100 % với nấm Colletotrichum sp. là BP1_01.1, BP1_04.3, BP2_02.4, BP2_03.4, BP2_03.5, BP2_B.1, BP2_B.2, BP3_01.1, BP3_01.2, BP3_01.3, BP3_02.2, BP3_02.3, BP3_02.5, BP3_03.3, BP3_04.3, BP4_01.1, BP5_03 và BP5_B.2. Chủng nấm Trichoderma BP2_B.2 có khả năng đối kháng tốt với cả 3 nấm bệnh. Chủng BP1_01.1, BP1_04.3, BP2_02.4, BP2_03.4 và BP4_01.1 có khả năng đối kháng tốt với Phytophthora sp và Colletotrichum sp. Chủng BP3_02.5 và BP3_03.3 đối kháng tốt với nấm Fusarium sp. và Colletotrichum sp. 85 Đồ án tốt nghiệp KIẾN NGHỊ 1. Tiến hành nghiên cứu hiệu quả của nấm Trichoderma spp. phân lập được từ đất trong phòng trừ nấm bệnh Phytophthora sp., Fusarium sp. và Colletotrichum sp. gây hại trên cây hồ tiêu trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng ruộng. 2. Tiếp tục thử nghiệm khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp. phân lập được từ đất với nấm gây bệnh trên các loại cây trồng điển hình khác như Neoscytalidium spp, Rhizoctonia solani, 3. Định danh chính xác các chủng nấm Trichoderma spp. phân lập được từ trong đất Bình Phước qua hình thái vi thể và sinh học phân tử. 4. Tiến hành tạo chế phẩm sinh học Trichoderma từ nguồn giống đã khảo sát, đặc biệt là chủng BP2_B.2 dùng bổ sung vào phân bón hữu cơ vi sinh trong kiểm soát nấm bệnh. 5. Tiếp tục phân lập thêm một số chủng Trichoderma spp. nhằm tìm ra những chủng có tính đối kháng mạnh đối với nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu và các loại cây trồng khác. 86 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TRONG NƢỚC [1] Bộ Trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Phê duyệt quy hoạch phát triển ngành hồ tiêu Việt Nam đến năm 2020, tầm nhìn đến năm 2030, 27/06/2014, Quyết định, số 1442/QĐ – BNN – PT. [2] Cao Ngọc Điệp, Giáo trình Thực tập môn nấm học. [3] Cục Xúc tiến Thương mai (2015), Sản lượng và tiêu thụ hồ tiêu trên thế giới: con số và dự báo. [4] Cục xúc tiến thương mại (2015), EU: Thị trường nhập khẩu hồ tiêu tiềm năng cho các nước khu vực Đông Nam Á – Phần 1. [5] Cục Xúc tiến Thương mại (2015), Thị trường tiêu thụ thế giới 5/2015 và dự báo [6] Dương Hoa Xô (2005), Vai trò nấm đối kháng Trichoderma trong kiểm soát vi sinh, Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Thành phố Hồ Chí Minh. [7] Đại học Tây Nguyên (2013), Sử dụng chế phẩm sinh học trong canh tác hồ tiêu. [8] Đỗ Thu Hà (2004), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam - Đà Nẵng. Luận án tiến sĩ, Đại Học Sư Phạm Hà Nội. [9] Đỗ Trung Bình (2016), Sản xuất hồ tiêu hữu cơ ở Việt Nam, Viện Khoa học Kỹ thuật miền Nam Việt Nam [10] Đỗ Trung Bình (2013), Sản xuất hồ tiêu Việt Nam thách thức và cơ hội, Báo cáo tổng kết đề tài cấp bộ, Viện Khoa học Kỹ thuật miền Nam [11] Hiệp Hội Hồ tiêu Việt Nam (4/2014), Ngành Hồ tiêu Việt Nam. [12] Hiệp Hội Hồ tiêu Việt Nam (2014), Diện tích, năng suất và sản lượng hồ tiêu năm 2014. [13] Hoàng Minh Tiến (2011), Đấu tranh sinh học, Bài giảng. [14] Huỳnh Văn Phục (2006), Khảo sát tính đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây lúa và cây bắp, luận văn, Trường Đại học Nông Lâp, TP.HCM. 87 Đồ án tốt nghiệp [15] Hứa Võ Thành Long (2010). Sản xuất bào tử nấm Trichoderma spp. làm thuốc trừ nấm bệnh cây trồng, Khóa luận tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ sinh học, Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh. [16] Khóa luận ―Điều tra diện tích canh tác và diễn biến của một số loài sâu bệnh hại chính trên cây tiêu tại huyện Buôn Đôn – tỉnh Đắk Lắk‖ (2014). [17] Khóa luận ―Nghiên cứu nấm Fusarium spp. gây hại trên cây hồ tiêu ở Quảng Trị‖, luận văn (2010). [18] Lại Hà Tố Hoa (2006), Định danh nấm Trichoderma dựa vào trình tự vùng ITS – rDNA và vùng TEF, Đại học Nông Lâm, TP.HCM [19] Lê Quang Bình (2014), Phân tích thực trạng kinh doanh xuất khẩu hồ tiêu Việt Nam vào thị trường Mỹ và giải pháp thúc đẩy xuất khẩu đến năm 2020, báo cáo thực hành nghề nghiệp, trường Đại học Tài Chính – Marketing [20] Lê Văn Trịnh (2009), Nghiên cứu chế phẩm sinh học phòng trừ tuyến trùng và nấm bệnh vùng rễ cà phê và hồ tiêu, Báo cáo tổng kết đề tài cấp nhà nước, Viện Bảo vệ Thực Vật, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. [21] Mi Phương (2012), Chữa bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu bằng vi khuẩn, Báo Gia Lai. [22] Nguyễn Công Thành, Phòng Nghiên cứu cây công nghiệp, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam, 08/2014. [23] Nguyễn Huỳnh Hoàng Minh (2008), Định danh nấm Phytophthora spp. bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, luận văn kỹ sư, Trường Đại học Nông Lâm, TP.HCM [24] Nguyễn Ngọc Châu (1995), Thành phần sâu bệnh hại hồ tiêu ở Tân Lâm – Quảng Trị. Tạp chí bảo vệ thực vật 1/1995 [25] Nguyễn Ngọc Phúc (2005), Bước đầu khảo sát mối quan hệ giữa sự hiện diện Trichoderma và các yếu tốt của đất, luận văn tốt nghiệp, Đại học Nông Lâm, TP.HCM. 88 Đồ án tốt nghiệp [26] Nguyễn Thị Khả Tú (2007), Định danh và phân nhóm nấm Trichoderma spp. phân lập tại Việt Nam, Luận văn tốt nghiệp, Đại học Nông Lâm, TP.HCM [27] Ngô Trường (2015), ―Khắc tinh‖ bệnh chết nhanh chết chậm, Khuyến nông, Nông nghiệp Việt Nam [28] Nguyễn Văn Đĩnh và cộng sự (2004), Giáo trình Biện pháp sinh học trong bảo vệ thực vật, Đại học Nông nghiệp Hà Nội. [29] Nguyễn Vịnh (2014), Bình Phước: Diện tích tiêu chết vì bệnh tăng nhanh, báo Bình Phước. [30] Nguyễn Vịnh (2014), Đồng Nai: hơn 600 hecta tiêu bị sâu bệnh. [31] Nguyễn Vịnh (9/2012), Một số ích lợi của vi nấm Trichoderma, Mục: Trồng và chăm sóc tiêu. [32] Phạm Đình Quân (2009), Nghiên cứu bệnh thán thư (Colletotrichum spp.) hại quả ớt tại Hải Dương vụ đông xuân năm 2008 – 2009 và biện pháp phòng trừ, luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp Hà Nội. [33] Phạm Ngọc Dung (2011), Nghiên cứu ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ quản lý tổng hợp bệnh hại chủ yếu trên cây hồ tiêu nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất và thu thập cho người dân nghèo tỉnh quản trị, Báo cáo tổng kết, Bộ Nông nghiệp và Phá triển Nông thôn. [34] Phạm Thị Ngọc Lan (2012). Giáo trình thực tập vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đại học Huế. [35] TCVN 4046 – 85, Đất trồng trọt – Phương pháp lấy mẫu [36] TCVN 4833-89 (ISO 4833-1978), Hướng dẫn chung đếm vi sinh vật kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 300C [37] TCVN 4881-89 (ISO 6887-1983 ), Hướng dẫn chung về cách pha chế dung dịch pha loãng để kiểm nghiệm vi sinh vật [38] Tây Đô – Nguồn: SGGP.or.vn, Tây Nguyên ồ ạt trồng tiêu phá vỡ quy hoạch, nuôi mầm dịch bệnh. 89 Đồ án tốt nghiệp [39] Tôn Nữ Tuấn Nam (2008), Đánh giá chất lượng và thị trường hồ tiêu tại Việt Nam, báo cáo, dự án Quản lý bền vững nguồn tài nguyên thiên nhiên miền Trung., TP.HCM. [40] Trần Mỹ Duyên (2009), Khảo sát khả năng tạo bào tử của nấm Colletotrichum spp. môi trường nhân tạo, luận văn tốt nghiệp kỹ sư nông học, Đại học Cần Thơ. [41] Trần Thị Hà Giang (2014), Nghiên cứu bệnh thán thư (Colletotrichum spp.) và biện pháp phòng trừ tại Quỳnh Phụ, tỉnh Thái Bình, Học viên Nông nghiệp Việt Nam, Hà Nội [42] Trung tâm Phát triển Công nghệ cao, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (2015), Nghiên cứu phát triển và ứng dụng một số chế phẩm có nguồn gốc sinh học trong canh tác chè, cà phê, hồ tiêu theo hướng phát triển bền vững tại Tây Nguyên. [43] Viện Khoa học Kỹ thuật miền Nam Việt Nam (04/2016), Bệnh thán thư. [44] Viện Khoa học Kỹ Thuật Nông Nghiệp miền Nam, Bệnh chết nhanh, 04/2016. [45] Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (1998), Bệnh cây nông nghiệp, Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội, Hà Nội. TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI [46] André Drenth và David I. Guest (2004), Diversity and Management of Phytophthora in Southeast Asia, BPA Print Group Pty Ltd. Melbourne, Australia [47] Aneza K. R., 2002. Experoments in microbiology plant pathology tissue culture and mushroom production technolog. [48] Byron Caughey (2012), Advantages & Disadvantages of Biological Control. [49] Canan Usta (2013), Microorganisms in Biological Pest Control — A Review (Bacterial Toxin Application and Effect of Environmental Factors) (pg.290-291) 90 Đồ án tốt nghiệp [50] Dhanasekaran D., Thajuddin N., Panneerselvam A. (2012). Applications of Actinobacterial Fungicides in Agriculture and Medicine. Fungicides for Plant and Animal Diseases, p. 34. [51] (Gagkaeva T. (2008) Introduction to Fusarium taxonomy, St. Petersburg, Russia. [52] Ken Pegg and Andrew Manners (2014), Fusarium a formidable nursery pathogen, Agri – science Queensland, Department of Agriculture, Fisheries and Forestry, Ecosciences Precinct, GPO Box 267, Brisbane QLD [53] Lin X và Heitman J. (2005), Chlamydospore Formation during Hyphal Growth in Cryptococcus neoformans, American Society for Microbiology. [54] R.K.Upadhyay, K.G.Mukerji và B.P.Chamola (2000), Biocontrol potential and its exploitation in sustainable agricultural – Volume 1: Crop diseases, weeds and nematodes (pg.229-230). [55] Sachiko Schott, Life cycle of Colletotrichum, Ehow. [56] Seifert K. (1996), Fusarium interactive key, Agriculture and Agri - Food Canada. [57] Susan Groenewald (2005), Biology, pathogenicity and diversity of Fusarium oxysporum f.sp. cubense, Publisher University of Pretoria. [58] Vinit Kumar Mishra (2010) In vitro antagonism of Trichjoderma species against Pythium aphanidermatum Phytology, p. 28-35. TÀI LIỆU INTERNET [59] [60] [61] [62] p21719a204666.htm#.V54ZvtJ97IV 91 Đồ án tốt nghiệp [63] [64] Syngenta, Kỹ thuật canh tác hồ tiêu r.aspx [65] www.hippocampus-bildarchiv.de [66] [67] 92 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 1 Hình thái đại thể và hình thái vi thể của các chủng Trichoderma spp. phân lập trong đất Bình Phƣớc. Hình thái đại thể Hình thái vi thể BP1_01.1 BP1_01.3 BP1_02 1 Đồ án tốt nghiệp BP1_02.3 BP1_04.1 BP1_04.3 BP1_B 2 Đồ án tốt nghiệp BP2_02.4 BP2_03.3 BP2_03.4 BP2_03.5 3 Đồ án tốt nghiệp BP2_04.2 BP2_04.3 BP2_04.4 BP2_B.1 4 Đồ án tốt nghiệp BP2_B.2 BP3_01.1 BP3_01.2 BP3_01.3 5 Đồ án tốt nghiệp BP3_02.1 BP3_02.2 BP3_02.3 BP3_02.4 6 Đồ án tốt nghiệp BP3_02.5 BP3_03.3 BP3_03.4 BP3_04.2 7 Đồ án tốt nghiệp BP3_04.3 BP3_04.5 BP3_B.4 BP3_B.7 8 Đồ án tốt nghiệp BP4_01.1 BP5_03 BP5_B.2 9 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 2 Các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng cao với nấm Phytophthora sp. sau 7 và 9 ngày theo dõi 10 Đồ án tốt nghiệp Các chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng cao với Colletotrichum sp. sau 9 và 11 ngày theo dõi 11 Đồ án tốt nghiệp 12 Đồ án tốt nghiệp Bán kính tản nấm Trichoderma sau 5 ngày nuôi cấy 5 NGAY NUOI CAY 09:50 Thursday, August 17, 2016 3 The GLM Procedure t Tests (LSD) for D NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 66 Error Mean Square 6.078134 Critical Value of t 2.65239 Least Significant Difference 5.3392 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 80.000 3 BP1_01.1 A A 80.000 3 BP1_01.3 A A 80.000 3 BP1_02 A A 80.000 3 BP3_04.3 A A 80.000 3 BP1_04.1 A A 80.000 3 BP1_04.3 A A 80.000 3 BP1_B A A 80.000 3 BP2_02.4 A A 80.000 3 BP3_03.3 A A 80.000 3 BP2_03.4 A A 80.000 3 BP2_03.5 A A 80.000 3 BP2_B.2 A A 80.000 3 BP2_04.3 A A 80.000 3 BP3_B.4 13 Đồ án tốt nghiệp A A 80.000 3 BP2_B.1 A A 80.000 3 BP3_02.5 A A 80.000 3 BP3_01.1 A A 80.000 3 BP5_B.2 A A 80.000 3 BP3_02.4 A A 80.000 3 BP4_01.1 A A 80.000 3 BP3_04.5 A A 80.000 3 BP3_02.3 A A 80.000 3 BP3_B.7 A A 80.000 3 BP3_03.4 A A 80.000 3 BP5_03 A B A 78.667 3 BP3_02.2 B B C 74.333 3 BP3_04.2 C C 73.000 3 BP1_02.3 C C 72.000 3 BP3_02.1 C D C 70.333 3 BP3_01.2 D C D C 70.333 3 BP2_03.3 D D 65.000 3 BP2_04.2 E 58.333 3 BP2_04.4 E E 55.333 3 BP3_01.3 14 Đồ án tốt nghiệp Môi trƣờng trƣờng Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Thành phần môi trƣờng Số lƣợng Đơn vị Glucose 10 g Peptone 5 g K2HPO4 1 g MgSO4 0,5 g Dichloran (0,2% W/v trong ethanol) 1 ml Rose Bengal 0,5 ml Chloramphenicol 0,1 g Agar 15 g Nước cất 1000 ml Môi trƣờng PDA (Potato Dextrose Agar) Thành phần: Dịch chiết khoai tây: 250 g Dextrose: 20 g Agar: 20 g Nước cất: 1000 ml Môi trƣờng CMC (Carboxy methyl cellulose) Thành phần: NaNO3: 0,4 g K2HPO4: 0,2 g MgSO4: 0,1 g KCl: 0,1 g CMC: 1% Agar: 2% Nước cất: 1000 ml Môi trƣờng WA (Water Agar) Thành phần: Agar: 20 g và Nước cất: 1000 ml 15