Đồ án Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía

c Hồng - giảng viên Khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trường, Trường Đại học Cơng nghệ TP.HCM. Tất cả số liệu, kết quả trong đề tài này đều thu được qua nghiên cứu thực nghiệm và hồn tồn trung thực. Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 8 năm 2016 Lê Hồng Khải LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cơng nghệ TP.HCM đã tạo điều kiện cho em được học tập tại trường. Xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến quý thầy, cơ trong Khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trường, những người đã tận tình chỉ dạy, truyền đạt những kiến thức quý báu cho em, cho em được thỏa sức tìm tịi học hỏi những điều mới, dù cĩ đi đâu làm gì, em vẫn luơn tự hào là đứa con của đại gia đình Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trường. Con xin cảm ơn cha, mẹ và em trai, những người đã cho con ngày hơm nay. Gia đình đã luơn hỗ trợ tài chính, động viên tinh thần con trong suốt thời gian qua. Em xin gửi lời cảm ơn đến cơ Nguyễn Ngọc Hồng, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy cho em những kiến thức tuyệt vời, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cũng như kỹ năng sống. Được làm việc trong nhĩm nghiên cứu của cơ đối với em là một niềm vinh dự và hạnh phúc. Xin cảm ơn các bạn trong thể lớp 12DSH đã luơn giúp đỡ trong quá trình học tập, nghiên cứu và động viên tinh thần mình trong thời gian qua. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 8 năm 2016 Lê Hồng Khải MỤC LỤC MỤC LỤC .......................................................................................................................... i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. iv DANH MỤC BẢNG ......................................................................................................... v DANH MỤC HÌNH ẢNH................................................................................................ vi MỞ ĐẦU ........................................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước............................................................. 2 3. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................... 2 4. Nhiệm vụ nghiên cứu .............................................................................................. 3 5. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 3 6. Các kết quả đạt được của đề tài .............................................................................. 4 7. Kết cấu của ĐATN .................................................................................................. 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 5 1.1. Tổng quan về chi Adenosma sp.và lồi Adenosma bracteosum Bonati ............. 5 1.1.1. Tổng quan về chi Adenosma sp.................................................................... 5 1.1.2. Tổng quan về Nhân trần tía Adenosma Bracteosum Bonati ........................ 6 1.1.2.1. Tên khoa học .......................................................................................... 6 1.1.2.2. Đặc điểm thực vật và phân bố ............................................................... 7 1.1.2.3. Một số thành phần hĩa học đã nghiên cứu ............................................ 8 1.1.2.4 Hoạt tính sinh học ..................................................................................... 12 1.1.2.5 Một số bài thuốc từ Nhân trần .................................................................. 15 1.2. Định nghĩa về gốc tự do, stress oxy hĩa và chất chống oxy hĩa ...................... 15 1.2.1. Khái niệm về gốc tự do và stress oxy hĩa .................................................. 15 1.2.2. Chất chống oxy hĩa .................................................................................... 17 1.2.3. Tác hại của sự stress oxy hĩa ..................................................................... 18 i 1.2.3.1. Tác động lên DNA ............................................................................... 18 1.2.3.2. Tác động lên protein ............................................................................ 19 1.2.3.3. Tác động lên lipid ................................................................................ 19 1.3. Hợp chất tự nhiên từ thực vật và hoạt tính sinh học ......................................... 20 1.3.1. Terpenoid .................................................................................................... 20 1.3.1.1. Định nghĩa, phân loại ........................................................................... 20 1.3.1.2. Nguồn gốc và ứng dụng ....................................................................... 20 1.3.2. Steroid ......................................................................................................... 22 1.3.2.1. Định nghĩa, phân loại ........................................................................... 22 1.3.2.2. Nguồn gốc và ứng dụng ....................................................................... 23 1.3.3. Polyphenol .................................................................................................. 24 1.3.3.1. Định nghĩa, phân loại ........................................................................... 24 1.3.3.2. Nguồn gốc, ứng dụng ........................................................................... 25 1.3.3.3. Flavonoid.............................................................................................. 25 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................................ 27 2.1 Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài............................................................... 27 2.1.1 Địa điểm ...................................................................................................... 27 2.1.2 Thời gian thực hiện đề tài ........................................................................... 27 2.2 Vật liệu ............................................................................................................... 27 2.2.1 Nguyên liệu nghiên cứu .............................................................................. 27 2.2.2 Đối tượng thí nghiệm .................................................................................. 27 2.2.3 Dụng cụ, hĩa chất thí nghiệm ..................................................................... 27 2.3 Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................... 29 2.3.1. Xác định độ ẩm ........................................................................................... 30 2.3.2. Quá trình chiết và thu nhận cao chiết ......................................................... 31 2.3.3. Phương pháp xác định hàm lượng cao thu được ........................................ 33 2.3.4. Phương pháp định tính các thành phần hĩa học trong Nhân trần tía ......... 33 ii 2.3.5. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số .............................. 36 2.3.6. Phương pháp định lượng flavonoid tổng số ............................................... 36 2.3.7. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hĩa trên mơ hình DPPH ............................. 37 2.3.8. Phương pháp xác định năng lực khử .......................................................... 38 2.3.9. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ..................... 39 2.3.10. Xác định độc tính cấp diễn ......................................................................... 41 2.3.11. Đánh giá hoạt tính cao chiết trên chuột bạch ứng dụng trong mơ hình ổn định lượng đường trong máu .................................................................................... 42 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................. 45 3.1. Thử độ ẩm của dược liệu ................................................................................... 45 3.2. Khảo sát hàm lượng cao chiết ........................................................................... 45 3.3. Định tính các thành phần hĩa học cĩ trong dịch chiết Nhân trần tía ................ 47 3.4. Định lượng polyphenol tổng số trong dịch chiết .............................................. 54 3.5. Định lượng flavonoid tổng số ............................................................................ 56 3.6. Xác định hoạt tính kháng gốc tự do DPPH ....................................................... 58 3.7. Xác định năng lực khử ....................................................................................... 60 3.8. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn ........................................................... 62 3.8.1. Hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của cao cồn và cao nước ................................. 62 3.8.2. Hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của cao phân đoạn .......................................... 63 3.9. Kết quả thử độc tính cấp diễn ............................................................................ 64 3.10. Ảnh hưởng của dịch chiết Nhân trần tía lên lượng đường trong máu........... 65 3.10.1. Ảnh hưởng của việc uống glucose liều cao đến nồng độ đường trong máu của chuột ................................................................................................................... 66 3.10.2. Ảnh hưởng của các loại cao chiết đến nồng độ đường trong máu .............. 66 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 69 4.1. Kết luận .............................................................................................................. 69 4.2. Kiến nghị ............................................................................................................ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 71 iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AG: Acid Gallic. AQ: aqueous (nước). BU: n-butanol. CH: chloroform. db: gam dược liệu khơ. DMSO: Dimethyl sulfoxyde. DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl. EA: Ethyl acetate. ET: ethanol (cồn). GE: Gallic acid equivalent. HCTN: hợp chất tự nhiên. IC50: half maximal inhibitory concentration . RE: Rutin equivalent. RNS: Reactive Nitrogen Species ROS: Reactive Oxygen Species TFC: Total Flavonoids Content (Hàm lượng flavonoid tổng số). TPC: Total Polyphenols Content (Hàm lượng polyphenol tổng số). TPHH: thành phần hĩa học. TSA: tryptone soya agar. TSB: tryptone soya broth. iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các thành phần hĩa học cĩ trong tinh dầu Adenosma bracteosum Bonati ... 10 Bảng 1.2. Các ROS và RNS trong cơ thể sinh học ........................................................ 16 Bảng 1.3. Các bệnh liên quan đến sự oxy hĩa DNA ...................................................... 18 Bảng 1.4. Các bệnh liên quan đến sự oxy hĩa protein ................................................... 19 Bảng 1.5. Các bệnh liên quan đến sự oxy hĩa lipid ....................................................... 20 Bảng 2.1. Nồng độ khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết. ......................... 41 Bảng 2.2. Bảng tra nồng độ đường huyết. ...................................................................... 44 Bảng 3.1. Độ ẩm dược liệu ............................................................................................. 45 Bảng 3.2. Khảo sát hàm lượng cao chiết theo dung mơi. .............................................. 45 Bảng 3.3. Khảo sát hàm lượng thu hồi sau khi chiết lỏng-lỏng cao cồn. ...................... 46 Bảng 3.4. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hĩa học ................................................. 47 Bảng 3.5. Hình ảnh định tính thành phần hĩa học. ........................................................ 48 Bảng 3.5. Kết quả đường chuẩn acid gallic .................................................................... 54 Bảng 3.6. Kết quả hàm lượng polyphenol tổng số các cao chiết ................................... 55 Bảng 3.7. Bảng kết quả đường chuẩn Rutin ................................................................... 56 Bảng 3.8. Kết quả hàm lượng Flavonoid tổng số ........................................................... 57 Bảng 3.9. Độ hấp thụ quang ở bước sĩng 700 nm tại nồng độ 25 g/ml ...................... 61 Bảng 3.10. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của cao tổng cồn và cao tổng cồn tại nồng độ 100 mg/ml. ............................................................................................. 62 Bảng 3.11. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của các cao phân đoạn. ..... 63 Bảng 3.12. Kết quả thử độc tính cấp diễn ...................................................................... 65 Bảng 3.13. Kết quả nồng độ lượng đường trong máu chuột .......................................... 65 Bảng 3.14. Nồng độ đường trong máu của nhĩm uống glucose liều cao ...................... 66 Bảng 3.15. Khả năng làm giảm đường huyết của dịch chiết Nhân trần tía lên đường huyết của nhĩm chuột được uống đường glucose ở liều cao .......................................... 67 v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cây Nhân trần tía Adenosma Bracteosum Bonati ............................................ 7 Hình 2.1. Sơ đồ tiến trình thí nghiệm ............................................................................. 29 Hình 2.2. Sơ đồ quy trình chiết cao chiết Nhân trần tía ................................................. 31 Hình 2.3. Phản ứng quét gốc tự do DPPH ..................................................................... 37 Hình 2.4. Phản ứng xác định năng lực khử. ................................................................... 39 Hình 2.5. Chuột bạch dùng cho thí nghiệm ................................................................... 42 Hình 3.1. Dung dịch dựng đường chuẩn acid gallic ...................................................... 54 Hình 3.2. Đường chuẩn acid gallic ................................................................................. 54 Hình 3.3. Dung dịch Rutin chuẩn ................................................................................... 56 Hình 3.4. Đường chuẩn Rutin ........................................................................................ 57 Hình 3.6. Biểu đồ so sánh giá trị IC50 của các cao chiết trong thí nghiệm quét gốc tự do DPPH. ......................................................................................................................... 59 Hình 3.7. Biểu đồ thể hiện năng lực khử của các cao chiết. .......................................... 61 vi Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Gốc tự do được tạo ra trong quá trình trao đổi chất của cơ thể là một tác nhân oxy hĩa gây ra nhiều bệnh nguy hiểm như các bệnh về đường tim mạch, viêm gan, đục thủy tinh thể, lão hĩa, đột biến gen gây ung thư... Về mặt hĩa học, gốc tự do rất kém bền nên dễ dàng tấn cơng các đại phân tử sinh học như protein, lipid, carbohydrate, DNA. Điều này dẫn đến sự rối loạn và mất cân bằng của các quá trình sinh hĩa và là nguyên nhân chính gây ra nhiều loại bệnh tật. Do đĩ, việc tìm ra những hợp chất chống oxy hĩa cĩ khả năng ức chế các gốc tự do hoặc các quá trình gián tiếp sinh ra gốc tự do là điều cần thiết. Chất chống oxy hĩa cĩ thể cĩ nguồn gốc từ thiên nhiên hoặc được tổng hợp hĩa học. Tuy nhiên, những hợp chất cĩ nguồn gốc từ thiên nhiên cĩ nhiều lợi thế hơn so với những hợp chất tổng hợp do hợp chất tổng hợp gây ra những phản ứng phụ như viêm gan và ung thư. Bên cạnh đĩ, những hợp chất cĩ nguồn gốc từ thiên nhiên đơi khi tác dụng dược lý tốt hơn. Ngồi ra vấn đề liên quan đến đường huyết luơn được mọi người quan tâm đến vì lượng đường trong máu dù tăng hay giảm đi so với mức bình thường thì sẽ tác động khơng tốt đến sức khỏe. Chứng tăng đường huyết ảnh hưởng trực tiếp đến bệnh đái tháo đường, là một trong những căn bệnh trước đây dân gian vẫn thường gọi là “bệnh của người giàu”. Tăng đường huyết chỉ biểu hiện ra ngồi bằng các triệu chứng lâm sàng khi vấn đề đường huyết đã nghiêm trọng. Các thĩi quen trong ăn uống khơng điều độ, chế độ dinh dưỡng quá nhiều đồ ngọt, đồ béo hoặc uống những loại thức uống cĩ cồn như rượu, bia và ít hoạt động thể chất hay các hoạt động được lựa chọn cũng ảnh hưởng đến lượng đường trong máu và dần dần sẽ hình thành bệnh tiểu đường. Cây Nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati từ lâu trong dân gian được sử dụng như là một vị thuốc với tác dụng hỗ trợ tiêu hĩa, lợi mật, tiêu độc, lợi tiểu, chữa cảm cúm, táo bĩn, bệnh vàng da ... Ngồi ra trong cây cĩ chứa nhiều hợp flavonoid và 1 Đồ án tốt nghiệp tinh dầu, đây là những hợp chất tự nhiên với nhiều hoạt tính sinh học nổi bật. Tuy nhiên, cho đến nay Nhân trần tía vẫn chỉ được xem là một vị thuốc Đơng y, chưa cĩ cơng trình nghiên cứu nào chứng minh một cách cụ thể nhất về các hoạt tính sinh học như kháng oxy hĩa, điều trị tiểu đường, kháng khuẩn Do đĩ đề tài “Khảo sát hoạt tính sinh học của cây Nhân trần tía” được thực hiện, tạo tiền đề khoa học cho các sản phẩm ứng dụng từ nguồn dược liệu này. 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước ❖ Những nghiên cứu trong nước: Nguyễn Viết Tựu và cộng sự (1975) đã phân tích hàm lượng tinh dầu trong cây Nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati. Dương Thị Mộng Ngọc và cộng sự (2006) chứng minh cao tồn phần phối hợp giữa lá Đinh lăng và Nhân trần tía thể hiện tác động bảo vệ gan trên ba mơ hình gây tổn thương gan bằng ethanol, tetraclorua và paracetamol. Nguyễn Đức Hạnh và cộng sự (2008) đã phân lập được một số hợp chất polyphenol trong Nhân trần tía. Vũ Mạnh Hùng và Bùi Thị Bích Vân (2008) đã xác định khả năng chống nhiễm độc gan do tác dụng phụ của Rifampicin bằng sản phẩm kết hợp giữa cao Nhân trần tía và Tảo Spirulina. ❖ Những nghiên cứu ngồi nước: Tsankova và cộng sự (1994) đã phân tích thành phần tinh dầu của Adenosma bracteosum Bonati bằng GS và GC/MS. 3. Mục đích nghiên cứu Định tính thành phần hĩa học cây Nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati. Xác định hàm lượng polyphenol, flavonoid và khả năng kháng oxy hĩa cao chiết từ cây Nhân trần tía. Xác định độc tính cấp diễn và hoạt tính làm ổn định đường huyết của cao chiết thơ trên chuột bạch. 2 Đồ án tốt nghiệp Đánh giá sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn của Nhân trần tía. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu Nhiệm vụ 1: Nghiên cứu về cơ sở khoa học, tổng quan tài liệu vấn đề nghiên cứu, làm cơ sở cho các nhiệm vụ tiếp theo. Nhiệm vụ 2: Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm, thơng qua các phương pháp xác định, khảo sát, phân tích. Nhiệm vụ 3: Thu nhận cao chiết tồn phần từ cây Nhân trần tía bằng dung mơi nước và dung mơi cồn; tách và thu nhận các cao phân đoạn từ cao chiết cồn. Nhiệm vụ 4: Định tính sơ bộ các thành phần hĩa học. Nhiệm vụ 5: Xác định hàm lượng polyphenol tổng số, flavonoid tổng số của các cao chiết và cao phân đoạn từ cây Nhân trần tía. Nhiệm vụ 6: Đánh giá khả năng kháng oxy hĩa thơng qua nồng độ ức chế 50% gốc tự do DPPH, đánh giá năng lực khử của các cao chiết và cao phân đoạn. Nhiệm vụ 7: Xác định độc tính cấp diễn của cao chiết nước và cao chiết cồn. Nhiệm vụ 8: Đánh giá hoạt tính của cao chiết nước và cao chiết cồn trên mơ hình động vật ổn định lượng đường trong máu. Nhiệm vụ 9: Đánh giá sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết và cao phân đoạn. 5. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu thu thập tài liệu: các tài liệu về cây Nhân trần tía, sơ bộ thành phần hĩa học của cây Nhân trần tía, các phương pháp xác định hàm lượng các hợp chất thứ cấp, mơ hình đánh giá khả năng kháng oxy hĩa, kháng khuẩn. Phương pháp xác định độc tính cấp diễn, mơ hình thử nghiệm hoạt tính hạ đường huyết trên chuột bạch. Phương pháp làm thí nghiệm: tiến hành làm các thí nghiệm nhằm giải quyết các nhiệm vụ nghiên cứu. 3 Đồ án tốt nghiệp Phương pháp xử lý số liệu bằng tốn học và phân tích phương sai ANOVA bằng phần mềm SAS 9.4: các số liệu thu được sẽ được xử lý nhằm đưa ra kết luận cho đề tài. 6. Các kết quả đạt được của đề tài Thu nhận được cao chiết nước và cao chiết cồn từ cây Nhân trần tía bằng phương pháp ngâm dầm, thu nhận các cao phân đoạn từ cao tổng cồn qua quá trình chiết lỏng – lỏng. Xác định được hàm lượng của các cao chiết và cao phân đoạn. Định tính sơ bộ các thành phần hĩa học trong cây Nhân trần tía. Định lượng được hàm lượng polyphenol tổng số, flavonoid tổng số của các cao chiết và cao phân đoạn. Tìm ra giá trị IC50 của các cao chiết trên mơ hình DPPH, xác định giá trị hấp thu của các cao chiết trên mơ hình năng lực khử. Xác định sử dụng cao chiết với liều 3000 mg/kg thể trọng khơng gây độc cho chuột bạch. Chứng minh khả năng giúp làm ổn định đường huyết trên chuột bạch của cao nước và cao cồn. Đánh giá sơ bộ khả năng kháng khuẩn của các cao chiết từ Nhân trần tía. 7. Kết cấu của ĐATN Mở đầu Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 4 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về chi Adenosma sp.và lồi Adenosma bracteosum Bonati 1.1.1. Tổng quan về chi Adenosma sp. Chi Adenosma sp. (hay cịn được gọi là Chi Tuyến hương, Nhân trần) được xếp vào Họ Scrophulariaceae. Là lồi cỏ mọc hằng năm, cĩ mùi thơm, cĩ khoảng 15 lồi phân bố ở khu vực Bắc Á, Đơng Nam Á, Trung Quốc và quần đảo Thái Bình Dương. Theo Phạm Hồng Hộ (1999) và Đỗ Tất Lợi (2004), Việt Nam cĩ sự phân bố của nhiều lồi trong chi Adenosma sp. bao gồm: - Adenosma annamensis Yam. (Tuyến hương Trung bộ). Cây thân cỏ cao khoảng 30-40 cm, phiến lá xoăn và cĩ lơng thưa, cĩ hoa ở nách lá, mọc chủ yếu ở Quảng Nam và Đà Nẵng. - Adenosma bracteosum Bonati (Tuyến hương lá bắc, Nhân trần tía). Thân và cành cĩ màu tím đỏ, cụm hoa nằm ở ngọn cĩ những lá bắc lợp lên nhau, dạng màng, trong suốt. Mọc nhiều ở miền nam Việt Nam và rãi rác ở Campuchia , Lào. - Adenosma caeruleum R. Br. (Nhân trần nam, Hoắc hương núi, Tuyến hương lam). Thân thảo cao tới gần 1 m. Lá phía dưới mọc đối, lá phía trên cĩ khi mọc so le, hình trái xoan nhọn. Thân màu tía hay lam, chia 2 mơi, nhị 4, bầu cĩ vịi nhuỵ hơi dãn ra ở đỉnh. Quả nang dài hình trứng, cĩ mỏ ngắn nở thành 4 van. Hạt nhiều, bé, hình trứng. Mùa hoa quả tháng 4 – 9. Phân bố nhiều ở miền bắc Việt Nam, Trung Quốc, Lào, Thái Lan. - Adenosma hirsuta (Miq.) Kurz. (Tuyến hương phún). Thân thảo cao hơn 1 m, cĩ nhiều lơng, lá hình bầu dục, hai mặt lá nhiều lơng. Mọc nhiều ở vùng Tây Nguyên, rãi rác ở Đơng Nam Bộ. - Adenosma indiana (Lour.) Merr. (Nhân trần hoa đầu, Nhân trần bồ bồ, Tuyến hương Ấn). Thân hình trụ, cành non mang nhiều lơng về sau nhẵn, lúc đầu thân màu xanh sau chuyển sang màu tím nhạt, chiều cao cây 70 cm đến 100 cm. Lá mọc đối, phiến lá hình mác, đầu nhọn, mép lá cĩ răng cưa, gân lá hình lơng chim, mặt trên mang 5 Đồ án tốt nghiệp nhiều lơng hơn mặt dưới, chiều dài lá 5 cm - 8 cm, rộng lá 2 cm - 4 cm. Rễ thuộc loại rễ chùm, cĩ nhiều lơng tơ nhỏ màu trắng, rễ dài 10 - 18 cm. Hoa nhỏ, màu tím, mọc tụ tập thành đầu nang, đài cĩ lơng với hai mơi, mơi trên nguyên, mơi dưới xẻ bốn. Tràng cánh hợp với hai mơi, mơi trên xẻ bốn, mơi dưới nguyên,bốn nhị cĩ hai chiếc dài, hai chiếc ngắn. Quả thuộc loại quả nang nằm gọn trong đài hoa. Nhiều hạt nhỏ, hình trứng thuơn, cĩ nhiều gai, màu cánh gián. Lồi Adenosma indiana (Lour.) Merr. phân bố chủ yếu ở Ấn Độ, Myanma, Nam Trung Quốc, Campuchia, Lào, Việt Nam, Thái Lan. - Adenosma javanica (Bl.) Kds. (Tuyến hương java). Lồi cỏ cứng, bị dưới mặt đất, nhánh dài 0,2 - 0,4 m. Lá cĩ phiến trịn, thon, dài 1 - 5 cm, cĩ lơng phún. Hoa mọc ở nách lá. Mọc rãi rác một số nơi ở Việt Nam như Quảng Ninh, Kon Tum. Trong đĩ ba lồi Adenosma bracteosum Bonati, Adenosma caeruleum R. Br. Adenosma indiana (Lour.) Merr. là mọc phổ biến nhất ở Việt Nam. Mặc dù cả ba lồi này đã dùng từ lâu trong Y học cổ truyền như một loại dược liệu giúp giải độc, mát gan nhưng lại cĩ rất ít cơng trình nghiên cứu về chúng. Chỉ mới cĩ một số cơng trình nghiên cứu về thành phần hĩa học, hoạt tính sinh học của Adenosma caeruleum (De Abreu và cộng sự, 2009; Adam và cộng sự, 1992; Nguyễn Hồng Tuấn, 2000) và thành phần hĩa học lồi Adenosma indiana (Dương Hồng Nhung, 2015). Hiện tại lồi Adenosma bracteosum chỉ mới dừng lại ở việc khảo sát thành phần tinh dầu (Tsankova và cộng sự, 1994) và một số hợp chất polyphenol (Nguyễn Đức Hạnh và cộng sự, 2008). 1.1.2. Tổng quan về Nhân trần tía Adenosma Bracteosum Bonati 1.1.2.1. Tên khoa học Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Lamiales Họ: Scrophulariaceae 6 Đồ án tốt nghiệp Chi: Adenosma Lồi: Adenosma bracteosum Bonati (Nhân trần tía, Nhân trần Tây Ninh, Tuyến hương lá bắc). 1Hình 1.1. Cây Nhân trần tía Adenosma Bracteosum Bonati 1.1.2.2. Đặc điểm thực vật và phân bố Theo Dược Điển Việt Nam III (2002), Đỗ Tất Lợi (2004) và Phạm Hồng Hộ (1999) thì cây Nhân trần tía thuộc loại cây thân thảo, rất thơm, cao 20 – 30 cm; ít phân nhánh. Thân cĩ 4 cạnh, nhẵn hoặc cĩ lơng tuyến rải rác. Cành màu tím đỏ. Lá cây cĩ hình phiến thon, dài 2 – 2,5 cm, rộng 6 – 8 mm, nửa ơm thân, mép hơi cĩ răng nhọn ở nửa trên, mặt dưới cĩ ít lơng và cĩ tuyến, khi khơ rất dễ rụng. Cụm hoa nhân trần Tía cĩ hình trụ, mọc ở đầu cành. Đài hoa cĩ 5 lá đài hình tim nhọn, kích thước khơng đều, rời nhau, cĩ lơng rậm và cĩ tuyến ở mép. Tràng hoa cao 5 mm, màu lam, cĩ lơng rải rác ở mặt ngồi, mơi trên trịn, mơi dưới dài bằng mơi trên và chia thành 3 thùy hình 7 Đồ án tốt nghiệp trứng. Cây cĩ quả dạng quả nang, hình trứng, đơi khi thuơn dài, cao 3 mm. Quả khơng lơng, màu nâu và cĩ nhiều hạt. Nhân trần tía đang được trồng và mọc hoang tại Campuchia, Lào và miền nam Việt Nam. Cây thường mọc vào mùa mưa trên đất sét ẩm, các bờ ruộng ở độ cao 300 - 800 m. Cây thường mọc thành đám cĩ khi tới hàng chục mét vuơng trên những bãi đất bằng dưới chăn đồi, trong thung lũng hay những đám ruộng cao bỏ hoang. Ở những nơi đất ít dinh dưỡng thì cây chỉ cao 15 cm đã thấy cĩ hoa và quả. Cây mọc tốt trên đất cĩ phèn ở vùng thấp và dọc đường đi một số nơi từ Kontum, Đắk Lắk tới Tây Ninh, Thành phố Hồ Chí Minh (Đỗ Huy Bích và cộng sự, 2004). Nhân trần tía chỉ gặp vào thời gian từ giữa mùa mưa đến đầu mùa khơ hằng năm. Cây bắt đầu mọc vào tháng 6 và ra hoa vào khoảng tháng 10 - 11, tàn lụi vào tháng 12. Cây ưa táng, ưa ẩm và cĩ thể chịu được khơ hạn sau khi đã ra hoa, kết quả. Sau khi quả già, tồn cây tàn lụi. So với các lồi khác thuộc chi Adenosma sp., thì Nhân trần tía cĩ vịng đời ngắn hơn, chỉ tồn tại 5 - 6 tháng nên mức độ khai thác và sử dụng ít hơn. 1.1.2.3. Một số thành phần hĩa học đã nghiên cứu ❖ Thành phần hĩa học của một số lồi trong chi Adenosma sp. ➢ Adenosma caeruleum Adenosma caeruleum R. Br. cĩ chứa monoterpenoid peroxyde (Adam, 1992), betulinic acid, arbutin, aucubin, β-sitosterol, stigmasterol, campesterol, adenosmoside, crenatoside, verbascoside, cistanoside F, campneoside I, campneoside II, apigenin 7-O- β-D-glucuronopyranoside, apigenin 7-O-β-D-glucopyranoside (De abreu, 2009). Năm 1975, Lê Tùng Châu và cộng sự phân tích trong Adenosma caeruleum R.Br. cĩ saponin triterpenoid, flavonoid, acid nhân thơm, coumarin và tinh dầu. Cả cây o o cĩ 1% tinh dầu, hoa cĩ 1,86% tinh dầu tỷ trọng 0,8042 (25 ) nD=1,4705 (20 ) (trích dẫn bởi Đỗ Tất Lợi, 2004). ➢ Adenosma indiana 8 Đồ án tốt nghiệp Năm 1939, F. Guichard và J. Clemensat phân tích lồi Adenosma indiana (Lour.) Merr. dưới định danh Nhân trần và thấy 1,67% kali nitrat, một saponin cĩ chỉ số bọt 2.600, một glucozit tan trong axeton, trong ete, khơng tan trong nước, khoảng 0,7% tinh dầu. Tinh dầu của lồi Adenosma indiana (Lour.) Merr lỏng, màu vàng, mùi hăng gần giống như mùi long não và bạc hà, vị nĩng; tan trong methanol, ethanol, chloroform và các dung mơi hữu cơ khác. Thành phần chủ yếu của tinh dầu 20% hợp chất oxy tan trong dung dịch reorcin. Chỉ số acid 1,4; chỉ số xà phịng hĩa 11,5; chỉ số axetyl hĩa 38; chỉ số iot 121,4 (trích dẫn bởi Đỗ Tất Lợi, 2004). Năm 1950, P.V. Nair và cộng sự đã chưng cất được từ lồi Adenosma indiana (Lour.) Merr. 1% tinh dầu và đã phân tích thấy cĩ 5L.monoterpen và 2D.secquiterpen trong đĩ cĩ 38,5% cineol. Ngồi ra cịn thấy saponin triterpenoid, flavonoid, acid nhân thơm, coumarin và tinh dầu (trích dẫn bởi Đỗ Tất Lợi, 2004). Vào năm 2015, Dương Hồng Nhung đã phân lập được từ Adenosma indiana (Lour.) Merr. các hợp chất 2-(4’-hydroxyphenyl)etyl triacontanoat, β-sitosterol glucosid, acid betulinic. ❖ Thành phần hĩa học của Nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati ➢ Tinh dầu: Nguyễn Viết Tựu và cộng sự phân tích thấy trong Adenosma bracteosum Bonati cĩ 0,25% tinh dầu, màu vàng sẫm, tỷ trọng 0,890, chỉ số khúc xạ 1,496, sắc ký khí thấy 19 peak trong đĩ cĩ 5 peak lớn cineol khoảng 18% (trích dẫn bởi Đỗ Tất Lợi, 2004). Tsankova và cộng sự (1994) đã phân tích tinh dầu của Adenosma bracteosum Bonati bằng GS và GC/MS thấy một số hợp chất chính gồm thymol (25.6%), linalool (13.1%) và (E)-β-farnesene (9.5%). Ngồi ra cịn cĩ sự hiện diện của...ịnh mất khối lượng do làm khơ. Cụ thể là dùng phương pháp: sấy trong tủ sấy ở áp suất thường theo Dược điển Việt Nam Quyển III, Phụ lục 5.16. ❖ Cách thực hiện Sấy cốc cân ở nhiệt độ 125oC – 130oC trong 1 giờ. Cho cốc vào bình hút ẩm 30 phút. Dùng cân phân tích cĩ độ chính xác 0,001 g cân khối lượng của cốc. Cân chính xác 1g bột dược liệu cho vào cốc cân (đã biết trước khối lượng). Đặt vào tủ sấy ở nhiệt độ 125oC – 130oC trong 1 giờ và cân khối lượng. Làm tương tự như vậy cho đến khi trọng lượng giữa 2 lần cân khơng vượt quá 0,5 mg. ❖ Tính tốn kết quả Độ ẩm được tính bằng phần trăm theo cơng thức: (풎 − 풎 ) 푾 = 풃풅 풔풂풖 . ퟏퟎퟎ (%) 풎풃풅 Trong đĩ: W: độ ẩm của dược liệu (%) mbd: Khối lượng ban đầu (g) msau: Khối lượng sấy (g) 30 Đồ án tốt nghiệp 2.3.2. Quá trình chiết và thu nhận cao chiết 2.3.2.1. Sơ đồ quy trình Bột dược liệu khơ Ngấm kiệt với cồn 96% Ngấm kiệt với nước Cơ quay loại dung mơi Cơ quay loại dung mơi Cao chiết cồn Cao chiết nước Hịa vào nước. Chiết lỏng–lỏng với dung mơi chloroform (CHCl3) Cơ quay loại dung mơi Dịch chiết cồn-nước sau lắc CHCl 3 Cao phân đoạn CHCl3 Chiết lỏng–lỏng với Ethyl acetate (EA) Cơ quay loại dung mơi Dịch chiết cồn-nước sau lắc EA Chiết lỏng– Cao phân đoạn lỏng EA với n-butanol Cơ quay loại Cơ quay loại dung mơi dung mơi Cao phân đoạn Cao phân đoạn n-butanol nước 3Hình 2.2. Sơ đồ quy trình chiết cao chiết Nhân trần tía 31 Đồ án tốt nghiệp Thuyết minh quy trình ❖ Nguyên liệu: tồn cây Nhân trần tía tươi sau khi hái, sẽ được rửa sạch, sấy khơ ở nhiệt độ 60oC và xay cho đến khi tạo thành bột cĩ kích thước từ d = 1,5 - 2 mm. ❖ Chiết: Mục đích: Chiết các hợp chất cĩ trong cây Nhân trần tía nhờ dung mơi ethanol và nước, quá trình chiết được diễn ra trong thời gian 24 - 48 giờ, trên máy lắc 150 vịng /phút. Cách thực hiện: Ngâm bột cây Nhân trần tía vào dung mơi ethanol 96% và dung mơi nước, tỉ lệ khối lượng và dung mơi là 1:10, lắc 24 - 48 giờ với tốc độ lắc 150 vịng/phút, lặp lại 3 lần. ❖ Lọc: Để thu hồi dịch chiết cần phải qua lọc thơ để loại cặn bã nguyên liệu lẫn trong dịch chiết, thu dịch trong để chuẩn bị quá trình thu cao. ❖ Cơ quay: Nhằm thu hồi dung mơi để tái sử dụng. Dịch sau cơ quay được chuyển sang dung mơi khác để loại bỏ tạp chất khác khơng mong muốn cũng như thực hiện quá trình tiếp theo. Sau khi thu được cao khơ từ dịch chiết nước và dịch chiết cồn, một phần cao cồn và tồn bộ cao nước được bảo quản ở nhiệt độ 0oC - 4oC để tiếp tục dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. Sử dụng một phần cao khơ từ dịch chiết cồn để tiếp tục quá trình chiết phân đoạn. ❖ Chiết phân đoạn: - Cao ethanol thơ sau đĩ được hồ vào lượng nước cất vừa đủ để hịa tan cao và tiếp tục được phân chia bằng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng. - Cho dung dịch cao ethanol vào bình lĩng, thêm vào khoảng một thể tích chloroform (CHCl3) với tỉ lệ so với cao chiết là 1:1, lắc nhẹ, chờ cho hỗn hợp phân lớp hồn tồn. Lúc này, nhẹ nhàng tháo van chiết lấy pha CHCl3 nằm dưới, pha nước nằm trên được cho vào bình chứa, lặp lại quá trình này 4 lần. 32 Đồ án tốt nghiệp - Đuổi dung mơi bằng phương pháp cơ quay ở nhiệt độ 45oC, thu được cao phân đoạn CHCl3. - Dịch cịn lại tiếp tục được chiết với dung mơi Ethyl actete (EA) theo phương pháp tương tự như trên, đuổi dung mơi bằng phương pháp cơ quay ở nhiệt độ 45oC, thu được cao phân đoạn EA. - Cuối cùng, dịch được chiết tương tự với dung mơi n-butanol (BU), đuổi dung mơi bằng phương pháp cơ quay ở nhiệt độ 60oC, thu được cao phân đoạn BU. - Pha nước cuối cùng được cơ quay ở nhiệt độ 60oC, thu được cao phân đoạn nước (ký hiệu W). - Các cao phân đoạn được bảo quản ở nhiệt độ 0oC – 4oC để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.3.3. Phương pháp xác định hàm lượng cao thu được Với mỗi loại dược liệu, sau quá trình chiết xuất ta thu được cao chiết. Cân khối lượng các cao thu được trên cân phân tích 4 số lẻ. Tính tốn % cao thu được cho phép ta biết được hiệu quả kinh tế của dược liệu. Với mỗi loại dược liệu, % cao được tính theo cơng thức sau: Trong đĩ: mcao : khối lượng cao thu được (g) mdl : khối lượng dược liệu đem chiết (g) wdl : độ ẩm của dược liệu đem chiết 2.3.4. Phương pháp định tính các thành phần hĩa học trong Nhân trần tía Khảo sát sơ bộ thành phần hĩa học được áp dụng phương pháp của bộ mơn Dược liệu- Khoa Dược- Đại học Y dược TP. Hồ Chí Minh (cải tiến từ phương pháp của trường đại học Dược khoa Rumani), tham khảo thêm quy trình định tính terpenoid của Yadav và cộng sự (2011). Nguyên tắc là dựa vào độ hịa tan của các hợp chất trong 33 Đồ án tốt nghiệp dược liệu để tách các hợp chất bằng các dung mơi cĩ độ phân cực khác nhau. Sau đĩ, xác định các hợp chất này bằng các phản ứng chuyên biệt. Cao cồn và cao nước được chia làm 2 phần. Phần thứ nhất pha với H2SO4 10% sau đĩ lọc hết cặn, dịch thu được dùng để thực hiện các thử nghiệm kiểm tra sự cĩ mặt của nhĩm alkaloid. Phần thứ hai sẽ pha trong DMSO 1% sau đĩ bỏ cặn thu dịch, dịch này được đem phân tích và định tính một số thành phần hĩa học như carbohydrate, saponin, flavonoid, amino acid, anthraquinone glycoside, steroid, polyphenol, tanin. ❖ Định tính thành phần khử: Thử nghiệm Fehling: hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, cho lần lượt 1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B vào, đun cách thủy trong 5 phút và quan sát sự xuất hiện kết tủa màu đỏ của CuO. ❖ Xác định tinh dầu: Lấy khoảng 5 ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Nếu cắn cĩ mùi thơm nhẹ, thêm vào cắn một ít cồn cao độ rồi lại bốc hơi cho đến cắn. Cắn cĩ mùi thơm nhẹ đặc trưng: cĩ tinh dầu. ❖ Định tính thành phần alkaloid: Thử nghiệm Mayer: hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm, cho vài giọt thuốc thử Mayer. Quan sát kết tủa màu đục tạo thành. Thử nghiệm Dragendroff: hút 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendroff và quan sát sự hình thành kết tủa màu vàng cam. Thử nghiệm Hager: hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Hager và quan sát hình thành kết tủa màu vàng. Thử nghiệm Wagner: hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Wagner và quan sát sự hình thành kết tủa màu nâu đỏ. ❖ Định tính thành phần saponin: Thử nghiệm tạo bọt: hút 5 ml mẫu cho vào ống nghiệm, lắc mạnh và quan sát sự hình thảnh bọt ổn định. 34 Đồ án tốt nghiệp ❖ Định tính thành phần anthraquinone glycoside: Thử nghiệm Bontrager: hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml H2SO4 lỗng và đun sơi trong 30 phút, thêm vài giọt FeCl3. Tiến hành lọc nĩng và để nguội dịch lọc, thêm 3 ml benzene và lắc đều rồi để yên, tách lấy lớp benzene, thêm 2 ml ammonia 10% và đun trong 30 phút quan sát màu trong lớp ammonia. Nếu cĩ sự xuất hiện màu đỏ kết luận là cĩ anthraquinone glycosides, nếu khơng thì kết luận là âm tính. ❖ Định tính thành phần polyphenol: Lấy 0.5ml dịch chiết cho vào một ống nghiệm nhỏ. Thêm 2-3 giọt thuốc thử FeCl3 5%, lắc đều. Nếu dung dịch cĩ màu xanh đen hay xanh rêu: cĩ polyphenol. ❖ Định tính thành phần tanin: Thử nghiệm chì acetate: 2 ml dịch chiết được cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%. Cho vào 4 giọt chì acetate. Quan sát sự xuất hiện kết tủa màu vàng. Lấy 2ml dịch chiết, thêm vào 5 giọt dung dịch Gelatin – muối, lắc đều, so sánh với dung dịch ban đầu. Nếu cĩ tủa bơng trắng: cĩ tannin. ❖ Định tính thành phần flavonoid: Thử nghiệm alkaline: hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm rồi cho vào vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng. Thực hiện với đối chứng là mẫu và nước cất để so sánh, thêm vài giọt HCl lỗng. Quan sát sự xuất hiện màu vàng khi bổ sung NaOH và mất màu khi cho HCl. Thử nghiệm Shinoda: hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. Cho một ít bột Mg và một vài giọt HCl đậm đặc vào ống nghiệm. Bổ sung 5 ml cồn 95%. Nếu mẫu cĩ màu cam, hồng, đỏ đến tím chứng tỏ cĩ sự hiện diện của flavonoid. ❖ Định tính thành phần steroid: Thử nghiệm Salkowski: hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml chloroform và nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc, lắc mạnh rồi để yên cho tách thành 2 lớp và quan sát ở mặt phân cách nếu xuất hiện màu đỏ ở lớp dưới, kết luận cĩ sterol; màu vàng ở lớp dưới, kết luận là triterpenoid. 35 Đồ án tốt nghiệp ❖ Định tính thành phần triterpenoid: Thử nghiệm Liebermann-Burchard: hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2ml acetic anhydride, đun sơi và làm nguội nhanh, nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm. Quan sát nếu xuất hiện màu xanh dương đậm hay xanh lá cây, kết luận là steroid; nếu hình thành vịng màu nâu đỏ đậm, chứng tỏ cĩ triterpenoid. 2.3.5. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số ❖ Nguyên tắc: dựa vào phản ứng oxy hĩa của các polyphenol với thuốc thử Folin- Ciocateau, tạo ra sản phẩm cĩ màu xanh lam. So màu ở bước sĩng λ=765 nm, hàm lượng polyphenol được tính tốn theo đường chuẩn acid gallic. ❖ Xây dựng đường chuẩn acid gallic: - Chuẩn bị các dung dịch acid gallic cĩ các nồng độ khác nhau: 0,04; 0,06; 0,08; 0,1; 0,12; 0,14; 0,16 mg/ml. - Hàm lượng phenol tổng số được xác định bằng phương pháp quang phổ sử dụng thuốc thử Folin–Ciocalteau theo phương pháp của Waterhouse (2002), tham khảo thêm TCVN 9745-1:2013. Cho 1 ml dung dịch tác dụng với 5ml thuốc thử Folin–Ciocalteu o 10% và lắc đều, sau 5 phút bổ sung thêm 4 ml Na2CO3 7,5% và ủ 30 phút ở 40 C. Mật độ quang của các mẫu được đo tại bước sĩng 760 nm. - Đối với mẫu nghiên cứu, pha lỗng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên cứu cĩ phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn), hàm lượng polyphenol được tính tốn dựa theo đường chuẩn acid gallic. 2.3.6. Phương pháp định lượng flavonoid tổng số ❖ Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch khi phản ứng với AlCl3 tại bước sĩng λ=420 nm; tạo ra dung dịch cĩ màu vàng (theo phương pháp của Woisky và Salatino, 1998). ❖ Dựng đường chuẩn Rutin - Pha các dung dịch Rutin chuẩn bằng ethanol 96o theo dãy nồng độ: 0,01; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 (mg/ml) 36 Đồ án tốt nghiệp - Hút 2 ml từ mỗi nồng độ vào ống nghiệm sạch. - Thêm 2 ml dung dịch AlCl3 2%. - Ủ ở nhiệt độ phịng trong vịng 1 giờ. Mật độ quang của các mẫu được đo ở bước sĩng λ = 420 nm. - Đối với mẫu nghiên cứu, pha lỗng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên cứu cĩ phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn) rồi làm thí nghiệm như trên, hàm lượng flavonoid được tính tốn dựa theo đường chuẩn Rutin. 2.3.7. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hĩa trên mơ hình DPPH ❖ Nguyên tắc: Cơ chế của hoạt động quét gốc tự do DPPH là sự ghép đơi hydro và chuyển các gốc tự do sang trạng thái ổn định hơn. Khi cĩ mặt của chất chống oxy hĩa, các gốc tự do DPPH sẽ bị bắt và làm cho dung dịch bị giảm màu sắc, do đĩ độ hấp thụ của dung dịch sẽ giảm đi. Thí nghiệm được tiến thành theo hương pháp của Von Gadow, Joubert và Hansmann (1997). 4Hình 2.3. Phản ứng quét gốc tự do DPPH 37 Đồ án tốt nghiệp Đánh giá khả năng kháng oxy hĩa thơng qua IC50 là một giá trị nồng độ của mẫu mà tại đĩ nĩ cĩ thể ức chế 50% gốc tự do. ❖ Dựng đường chuẩn Vitamin C - Pha dung dịch vitamin C theo các nồng độ sau: 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 0,75 (mg/ml). - Dùng micropipet hút 50 휇푙 mỗi nồng độ vào các ống nghiệm đã chứa sẵn 2 ml dung dịch DPPH. - Ủ trong tối 15 phút ở nhiệt độ phịng. So màu ở bước sĩng λ=517 nm. - Đối với mẫu nghiên cứu, pha lỗng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên cứu cĩ phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn) rồi làm thí nghiệm như trên. Kết quả được đánh giá thơng qua giá trị IC50 (Inhibitory concentration) là nồng độ chất chống oxy hĩa cần để ức chế (trung hịa) 50% gốc tự do DPPH trong khoảng thời gian xác định. - Mẫu Vitamin C được dùng để so sánh giá trị IC50. ❖ Tính tốn kết quả Dựa theo Yen và Duh (1994), giá trị IC50 được tính tốn như sau: A −A Phần trăm ức chế (%I) = ( DPPH TN)x100% ADPPH Trong đĩ: ADPPH là giá trị OD517nm của dung dịch DPPH ban đẩu pha trong methanol. ATN là giá trị OD517nm của dung dịch chuẩn (hoặc dung dịch mẫu). Giá trị IC50 được tính tốn dựa theo đường chuẩn: y = ax+b theo cơng thức 50 − b x = a 2.3.8. Phương pháp xác định năng lực khử Năng lực khử của dịch chiết Nhân trần tía được xác định theo phương pháp của Mayakrishnan và cộng sự (2012). 38 Đồ án tốt nghiệp ❖ Nguyên tắc: Chất kháng oxy hĩa cĩ khả năng khử ion Fe3+ trong phân tử 4- 2+ [Fe(CN)6] thành Fe trong Fe4[Fe(CN)6]3, kết quả thu được là phức mành xanh ngọc bích cĩ độ hấp thu cực đại tại bước sĩng 700nm. 5Hình 2.4. Phản ứng xác định năng lực khử ❖ Quy trình thực hiện: - Chuẩn bị dung dịch mẫu cần khảo sát trong khoảng nồng độ 1 – 25 g/ml. Sử dụng chứng dương là Vitamin C. - Hút 2,5 ml dịch mẫu vào ống nghiệm, sau đĩ cho vào thêm 2,5 ml dung dịch đệm sodium phosphate 0,2M pH = 6,0. - Thêm 2,5 ml dung dịch K3[Fe(CN)6]) 1% vào hỗn hợp trên, lắc đều. - Ủ ở 50oC trong 20 phút. - Thêm 2,5 ml dung dịch TCA 10%, lắc đều. Ly tâm hỗn hợp 3000 vịng/10 phút. - Hút 2,5 ml dịch nổi vào 2,5 ml nước cất. Thêm vào 0,5 ml FeCl3 1%. - Đo mật độ quang ở bước sĩng 700nm. - Ghi nhận kết quả và lập biểu đồ biểu diễn OD theo nồng độ. 2.3.9. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ❖ Nguyên tắc: Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết dựa trên phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch của Aibinu và cộng sự (2007), các hợp chất kháng khuẩn cĩ trong cao chiết khuếch tán vào trong mơi trường agar và tác động lên 39 Đồ án tốt nghiệp vi khuẩn chỉ thị. Nếu các hợp chất trong cây cĩ khả năng ức chế vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vịng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch. ❖ Chuẩn bị mẫu thử: Pha 6 loại dịch chiết từ: cao nước (ký hiệu AQ), cao cồn (ET), cao phân đoạn Chloroform (CH), cao phân đoạn Ethyl acetate (EA), cao phân đoạn n-butanol (BU), cao phân đoạn nước (W) trong DMSO 1%. Chuẩn bị 6 loại vi khuẩn chỉ thị: Escherichia coli, Enterotoxigenic Escherichia coli -ETEC, Listeria monocytogenes, Salmonella typhii, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus. Sử dụng đối chứng dương là kháng sinh ciprofloxacin 500 g/ml. Đối chứng âm là dung dịch DMSO 1%. ❖ Tăng sinh vi sinh vật chỉ thị: Mục đích: giúp tăng nhanh sinh khối của vi sinh vật chỉ thị đến số lượng cần thiết để phục vụ cho thí nghiệm ngồi ra cịn giúp hoạt hĩa vi khuẩn trở về với trạng thái bình thường sau khi bị suy yếu trong quá trình bảo quản. Đối với các giống vi sinh vật đang khảo sát và các giống vi sinh vật được chỉ thị giữ trên mơi trường TSA hay trong glycerol, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào chai thủy tinh chứa 10 ml mơi trường TSB đã được hấp khử trùng. Sau đĩ lắc với tốc độ 150 vịng/ phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phịng. ❖ Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn: Sau khi tiến hành đo quang phổ bước sĩng 620 nm và so sánh với dung dịch McFarland 0,5 các chai mơi trường được pha lỗng theo dãy thập phân trong ống nước muối sinh lý vơ trùng sao cho mật độ vi sinh vật đạt 106 cfu/ml. Hút 0,1 ml dịch khuẩn cho vào đĩa mơi trường thạch TSA, tiến hành trang dịch vi khuẩn trên đĩa cho tới khi khơ hồn tồn. Các đĩa thạch sau đĩ được đục lỗ tạo thành các miệng giếng bằng một ống kim loại hình trụ thẳng, khơng gỉ cĩ đường kính 6 mm, khoảng cách giữa các lỗ được tính tốn từ trước sao cho cân bằng và khoảng cách giữa các vịng kháng khơng 40 Đồ án tốt nghiệp trùng lên nhau. Các cơng đoạn trên được thực hiện trong điều kiện vơ trùng với ngọn lửa đèn cồn. Tiến hành pha các loại cao cần khảo sát trong DMSO 1%. Nồng độ được thể hiện như bảng 2.1. 6 Bảng 2.1. Nồng độ khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết Mẫu thí nghiệm Nồng độ (mg/ml) Cao chiết nước 100 Cao chiết cồn 100 Cao chiết phân đoạn chloroform 50 Cao chiết phân đoạn ethylacetate 50 Cao chiết phân đoạn n-butanol 50 Cao chiết phân đoạn nước 100 Sử dụng micropipet hút chính xác 100 l dịch chiết và nhỏ vào các giếng trong đĩa mơi trường TSA đã được đục lỗ trước đĩ, thí nghiệm được lặp lại 3 lần trên mỗi chủng vi sinh vật chỉ thị. Các thao tác trên đều được thực hiện trong điều kiện vơ trùng. Đường kính vịng kháng khuẩn được xác định sau khi ủ các đĩa TSA ở 37°C trong vịng 24 giờ. 2.3.10. Xác định độc tính cấp diễn Thử nghiệm xác định độc tính cấp diễn theo phương pháp Bộ Y tế Việt Nam ban hành. Cao chiết được pha ở nồng độ cao nhất cĩ thể pha lỗng nhằm khảo sát độc tính cấp diễn. Chuột bạch đực được chia thành nhiều nhĩm tương tự nhau, mỗi con ở cùng nhĩm sẽ nhận cùng một liều khảo sát. Sự đánh giá dựa vào phản ứng sống hay chết của chuột trong mỗi nhĩm. Sau khi cho chuột uống thuốc với liều duy nhất trong ngày, quan sát hành vi, thể trạng của chuột sau 24, 36 và 48 giờ. Ghi nhận giờ xuất hiện các triệu chứng bất thường như co giật hoặc chết. Nếu cĩ chuột chết thì xét 41 Đồ án tốt nghiệp nghiệm đại thể chủ yếu gan, thận, tim, phổi. Xác định liều làm chết 50% động vật thử. [16] 6Hình 2.5. Chuột bạch dùng cho thí nghiệm Để thăm dị liều, đối với mỗi cao chiết, liều dùng 6 con chuột, mỗi con cĩ trọng lượng 20 ± 3 g, cho uống liều duy nhất trong ngày với thể tích thuốc tối đa chuột cĩ thể nhận được là 0,2 ml/10 gam thể trọng/lần/ngày (quy định cho chuột nhắt), đây là liều thực hiện cho lượng cao chiết tối đa cĩ thể hịa tan được trong 0,2 ml nước cất và chất trợ tan (Đỗ Trung Đàm, 2003). Cao chiết nước và cao chiết cồn được pha thành liều 3000 mg/kg thể trọng chuột nhằm khảo sát độc tính cấp diễn. Chuột được uống dịch chiết nước và dịch chiết cồn từ cây Nhân trần tía, với liều là 3000 mg/kg trong 1 ngày. Sau đĩ ghi nhận kết quả sau khi uống dịch chiết nước và dịch chiết cồn từ cây Nhân trần tía. 2.3.11. Đánh giá hoạt tính cao chiết trên chuột bạch ứng dụng trong mơ hình ổn định lượng đường trong máu Tiến hành theo phương pháp của Joy và Kuttan (1999) và được thay đổi bởi Rahman và cộng sự (2011), cĩ một số sự thay đổi về liều lượng mẫu thử. 42 Đồ án tốt nghiệp Chuột được nuơi ổn định trong 2 tuần đầu, cho ăn thức ăn mua ở Viện Pasteur. Chuột được bỏ đĩi trước khi tiến hành thí nghiệm 6 giờ, chuột bạch được chia thành 5 nhĩm, mỗi nhĩm 6 con. Thiết kế thí nghiệm theo mơ hình sau: + Nhĩm 1 – nhĩm chứng trắng: Chuột được uống Tween 1% liều 10 ml/kg thể trọng. + Nhĩm 2 – nhĩm độc: Chuột được uống Tween 1% liều 10 ml/kg thể trọng. + Nhĩm 3 – nhĩm chứng sinh học: Chuột được uống thuốc với thành phần glibenclamide (10 mg/kg thể trọng). + Nhĩm 4 – Chuột được uống dịch chiết nước (50 mg/kg thể trọng). + Nhĩm 5 – Chuột được uống dịch chiết cồn (50 mg/kg thể trọng). Sau 1 giờ các nhĩm từ 2 đến 5 được dùng thêm đường glucose, liều dùng 2 g/kg thể trọng. Sau 2 giờ, các nhĩm từ 1 đến 5 được tiến hành lấy máu kiểm tra lượng đường huyết. ❖ Xác định lượng đường huyết trong máu chuột: Xác định nồng độ đường huyết bằng máy đo Benecheck Plus (Đài Loan). ➢ Phương pháp: Máy đo đường huyết đo dịng điện nhỏ và hiển thị kết quả đo đường huyết. Dịng điện được cung cấp từ quá trình phản ứng của lượng đường trong máu kết hợp với chất hĩa học trên que thử. Người sử dụng cần lấy 10 µl máu tươi trong mao mạch cho mỗi lần thử, và kết quả sẽ hiển thị sau 5 giây. ➢ Nguyên tắc phản ứng: Enzyme glucose oxidase xúc tác quá trình oxy hĩa β-D-glucose thành D- gluconic acid. α-D-glucose trong máu nhanh chĩng chuyển sang dạng β, vì vậy tất cả glucose đều được đo trong cùng một thời điểm. Cảm biến sinh học enzyme glucose sử dụng một điện cực thay O2, tác động lên lượng glucose khử. Trong phản ứng mở vịng, dưới tác dụng của enzyme glucose oxidase và điện cực trong que thử làm mất các 43 Đồ án tốt nghiệp electron cần thiết, nhĩm aldehyde ở C1 bị chuyển thành acid, acid-D-gluconic và hình thành H2O2. Dịng điện tử được tạo ra tương ứng với nồng độ glucose trong máu. ➢ Thực hiện qua các bước: - Chuẩn bị que thử. - Lấy mẫu máu. - Đọc kết quả giá trị đường huyết hiện trên máy đo. - Đối chiếu với bảng đổi đơn vị chuẩn như trong bảng 2.2. 7 Bảng 2.2. Bảng tra nồng độ đường huyết mmol/L mg/dL mmol/L mg/dL mmol/L mg/dL mmol/L mg/dL mmol/L mg/dL 0,06 1 4,4 80 8,0 145 12,0 216 22,2 400 0,28 5 4,7 85 8,3 150 12,5 225 23,0 414 0,55 10 5,0 90 8,9 160 13,9 250 24,0 432 1,0 18 5,5 100 9,0 162 14,4 260 25,0 450 1,5 27 6,0 106 9,4 170 15,0 270 25,4 475 2,0 36 6,1 110 10,0 180 16,0 288 27,7 500 2,2 40 6,7 120 10,5 190 16,6 300 30,0 540 2,5 45 7,0 126 11,0 196 17,0 306 33,3 600 2,8 50 7,2 130 11,1 200 18,0 325 38,8 700 3,0 54 7,5 135 19,0 342 40,0 720 3,3 60 7,8 140 20,0 360 44,4 800 3,9 70 Thể nhẹ 20,8 375 50,0 900 4,0 72 Thể bình thường Thể nặng Thể thấp 44 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thử độ ẩm của dược liệu Nguyên liệu được sấy khơ đến khối lượng khơng đổi. Độ ẩm được xác định bằng cơng thức nêu trong mục 2.3.1 và biểu thị trong bảng 3.1 8 Bảng 3.1. Độ ẩm dược liệu Đối tượng Bột cây Nhân trần tía Độ ẩm (%) 6,58 ± 0,11 Độ ẩm là lượng nước chứa trong 100 g dược liệu. Dược liệu tươi thường chứa một lượng nước rất lớn: lá chứa khoảng 60-80% nước, thân và cành chứa khoảng 40- 50% nước. Khơng cĩ một dược liệu nào đạt độ khơ tuyệt đối (độ ẩm 0%), nhưng đối với mỗi dược liệu đều được quy định một độ ẩm an tồn. Để bảo quản tốt, dược liệu cần cĩ độ ẩm bằng hoặc dưới độ ẩm an tồn. Theo Dược điển Việt Nam, dược liệu Nhân trần tía sau khi sấy khơ cĩ độ ẩm khơng quá 13%. Như vậy mẫu cây của được sấy đảm bảo cho quá trình bảo quản. 3.2. Khảo sát hàm lượng cao chiết Bột cây Nhân trần tía sau được chiết cao theo quy trình chiết cao ở mục 2.1.2 và biểu diễn bằng sơ đồ ở hình 2.2. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.2 và bảng 3.3. 9 Bảng 3.2. Khảo sát hàm lượng cao chiết theo dung mơi Dược liệu Hàm lượng cao (%) Cao nước (AQ) Cao cồn (ET) Nhân trần tía 15,52 8,88 Hàm lượng chiết của cao nước cao hơn cao cồn, chứng tỏ trong cây Nhân trần tía chứa một lượng lớn hợp chất cĩ độ phân cực mạnh nên tan được trong nước. 45 Đồ án tốt nghiệp Nguyên nhân khác là do khi chiết bằng ethanol nồng độ cao, ethanol sẽ háo nước làm các thành tế bào bị mất nước cục bộ dẫn tới hiện tượng các tế bào bị khơ và co lại ngăn cản quá trình chiết, đồng thời nhiều hợp chất khác cũng được chiết ra khỏi tế bào như chlorophyll làm cho dịch trích chuyển sang màu xanh lục. Nhưng dung mơi nước chỉ cĩ thể chiết được những chất cĩ độ phân cực cao, cịn dung mơi cồn cĩ thể chiết được hầu hết các cĩ độ phân cực từ thấp đến cao trong cây. (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 10 Bảng 3.3. Khảo sát hàm lượng thu hồi sau khi chiết lỏng - lỏng cao cồn Hàm lượng thu hồi từ quá trình tách phân đoạn (%) Cao phân đoạn Cao phân đoạn Cao phân đoạn Cao phân đoạn Tổng các chloroform (CH) ethyl acetate n-butanol (BU) nước (W) phân đoạn (EA) 51,13 9,63 20,75 9,38 90,89 So sánh hàm lượng thu hồi từ quá chiết lỏng-lỏng từ cao tổng cồn, cho thấy các thành phần chất tan nhiều nhất trong dung mơi chloroform (chiếm 51,13% so với khối lượng cao cồn sử dụng cho quá trình chiết) chứng tỏ trong Nhân trần tía chứa nhiều hợp chất khơng phân cực và phân cực thấp. Hàm lượng cao chiết được từ phân đoạn ethylacetate thấp, chỉ chiếm 9,63%, cho thấy cĩ rất ít hợp chất tan cĩ độ phân cực trung bình. Hàm lượng cao n–butanol chiếm 20,75%. Ở độ phân cực của ethylacetate và n– butanol dễ dàng chiết được các hợp chất flavonoid (Harborne, 2013), chứng tỏ trong cây chứa một lượng đáng kể hợp chất này. Cao phân đoạn nước đạt thấp nhất, chỉ chiếm 9,38%. Đây là những nghiên cứu đầu tiên về khảo sát hàm lượng thu cao chiết bằng các loại dung mơi thơng dụng. 46 Đồ án tốt nghiệp 3.3. Định tính các thành phần hĩa học cĩ trong dịch chiết Nhân trần tía 11 Bảng 3.4. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hĩa học Nhĩm hợp chất Thuốc thử và cách thực hiện Kết quả Cao cồn Cao nước Tinh dầu Bốc hơi tới cắn +++ + Triterpenoid Phản ứng Liebermann-Burchard +++ - Steroid Salkowski ++ - Alkaloid Mayer - - Dragendroff - - Hager - - Wager - - Polyphenol FeCl3 +++ +++ Flavonoid Alkaline +++ +++ Shinoda +++ +++ Tannin Chì acetate +++ +++ Dung dịch gelatin-muối +++ +++ Saponin Lắc mạnh với dung dịch nước + ± Anthraquinone Borntrager - - glycoside Chất khử Thuốc thử Fehling - - Ghi chú: (-): Khơng cĩ; (±): Nghi ngờ, (+): Cĩ ít, (++): Cĩ, (+++): Cĩ nhiều. Kết quả cho thấy dược liệu Nhân trần tía cĩ nhiều các nhĩm hoạt chất khác nhau như flavonoid, tanin, tinh dầu, triterpenoid, steroid, saponin. Đặc biệt khơng cĩ sự hiện diện của alkaloid, anthraquinone glycoside và đường khử. Qua kết quả cĩ thể nhận thấy ảnh hưởng của dung mơi lên việc trích ly các hợp chất cĩ trong cây, điều đĩ lý giải khả năng thể hiện hoạt tính sinh học của từng loại cao chiết là khác nhau. 47 Đồ án tốt nghiệp Hình ảnh kết quả thí nghiệm được tình bày trong bảng 3.5. 12 Bảng 3.5. Hình ảnh định tính thành phần hĩa học Nhĩm hợp chất Phương pháp Cao nước Cao cồn Dịch gốc (sau ngâm H2SO4 10%) Alkaloid Mayer Dragendroff 48 Đồ án tốt nghiệp Hager Wagner Dịch gốc 49 Đồ án tốt nghiệp Saponin Tạo bọt Anthraquinone Bontrager glycoside Polyphenol Ferric chloride 50 Đồ án tốt nghiệp Alkaline Flavonoid Shinoda 51 Đồ án tốt nghiệp Chì acetate Tannin Gelatin – muối Steroid Salkowski 52 Đồ án tốt nghiệp Libermann Terpenoid Burchard Đường khử Fehling 53 Đồ án tốt nghiệp 3.4. Định lượng polyphenol tổng số trong dịch chiết ❖ Đường chuẩn Acid Gallic Hàm lượng polyphenol tổng số được xác định thơng qua đường chuẩn acid gallic 7Hình 3.1. Dung dịch dựng đường chuẩn acid gallic 13 Bảng 3.5. Kết quả đường chuẩn acid gallic Nồng độ AG (mg/ml) 0,04 0,07 0,10 0,13 0,16 OD765nm 0,197 0,379 0,553 0,717 0,871 8Hình 3.2. Đường chuẩn acid gallic 54 Đồ án tốt nghiệp Việc định lượng polyphenol tổng của các phân đoạn được tính tốn dựa vào đường chuẩn. 14 Bảng 3.6. Kết quả hàm lượng polyphenol tổng số các cao chiết Mẫu thí nghiệm Polyphenol tổng số (mg GE/g cao chiết) Cao chiết nước 202,70  2,69 e Cao chiết cồn 249,68  3,61 c Cao chiết phân đoạn chloroform 106,31  3,77 f Cao chiết phân đoạn ethylacetate 499,93  3,77 a Cao chiết phân đoạn n-butanol 454,61  2,96 b Cao chiết phân đoạn nước 228,26  7,14 d Nhận xét: Polyphenol là một trong những thành phần quan trọng nhất, chiếm tỉ lệ lớn trong thực vật nĩi chung. Chúng cũng là một trong những chất cĩ tiềm năng chống oxy hĩa mạnh, do đĩ chỉ tiêu này khá quan trọng trong nghiên cứu hoạt tính chống oxy hĩa của thực vật (Zheng và cộng sự, 2001). Theo Marja và cộng sự (1999), những lồi thực vật cĩ hàm lượng polyphenol tổng số lớn hơn 20 mg GE/db thì cĩ hoạt tính chống oxy hĩa mạnh. Qua kết từ bảng 3.6 cho thấy Nhân trần tía cơ bản cĩ hoạt tính chống oxy hĩa mạnh. Hàm lượng polyphenol tổng số thu được phụ thuộc vào loại dung mơi sử dụng trong quá trình chiết tách. Trong cao cồn chứa hàm lượng polyphenol tổng (249,68  3,61) mg GE/g cao chiết, lớn hơn rõ rệt so với cao nước (202,70  2,69) mg GE/g cao chiết. Khi tiến hành quá trình chiết lỏng-lỏng, các hợp chất cĩ độ phân cực gần bằng với dung mơi sử dụng sẽ hịa vào dung mơi, dung mơi ethyl acetate đã chiết được nhiều polyphenol nhất (499,93  3,77) mg GE/g cao chiết, tiếp sau đĩ là n-butanol (454,61  55 Đồ án tốt nghiệp 2,96) mg GE/g cao chiết, cao nước giữ lại một lượng các polyphenol rất phân cực (228,26  7,14) mg GE/g cao chiết, phân đoạn chloroform chiết được (106,31  3,77) mg GE/g cao chiết. 3.5. Định lượng flavonoid tổng số ❖ Xây dựng đường chuẩn Rutin - Dung dịch Rutin chuẩn ban đầu được pha lỗng thành các nồng độ thích hợp, cho phản ứng với AlCl3, phản ứng tạo màu vàng từ nhạt đến đậm, so màu ở bước sĩng λ= 420nm. - Độ đậm nhạt của dịch màu tùy thuộc nồng độ Rutin. 9Hình 3.3. Dung dịch Rutin chuẩn 15 Bảng 3.7. Bảng kết quả đường chuẩn Rutin Nồng độ Rutin (mg/ml) 0,01 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 OD 420nm 0,107 0,202 0,429 0,583 0,768 0,933 56 Đồ án tốt nghiệp 10Hình 3.4. Đường chuẩn Rutin Mẫu thí nghiệm được pha lỗng thành nồng độ 0,5 mg/ml và cho phản ứng với dung dịch AlCl3. Từ phương trình đường chuẩn Rutin, ta tiến hành tính tốn hàm lượng Flavonoid tổng số (mg RE/g cao chiết). 16 Bảng 3.8. Kết quả hàm lượng Flavonoid tổng số Mẫu thí nghiệm Flavonoid tổng số (mg RE/g cao chiết) Cao chiết nước 53,75  1,42 d Cao chiết cồn 101,82  0,88 b Cao chiết phân đoạn chloroform 95,35  1,12 c Cao chiết phân đoạn ethylacetate 162,81  4,60 a Cao chiết phân đoạn n-butanol 57,23  2,06 d Cao chiết phân đoạn nước 26,01  1,75 e Nhận xét: Các flavonoid là nhĩm hợp chất cĩ khả năng kháng oxy hố mạnh trong số các hợp chất polyphenol thực vật, hàm lượng flavonoid tổng ảnh hưởng lớn đến khả năng kháng oxy hĩa của dược liệu (Pietta, 2000; Kuma, 2013). 57 Đồ án tốt nghiệp Cao chiết cồn và cao chiết nước thu được hàm lượng flavonoid tổng lần lượt là 101,82  0,88 mg RE/g cao chiết và 53,75  1,42 mg RE/g cao chiết. Dung mơi ethylacetate đã tách được nhiều flavonoid nhất (162,81  4,60 mg RE/g cao chiết). Phân đoạn chloroform thu được hàm lượng flavonoid là (95,35  1,12 mg RE/g cao chiết). Phân đoạn n-butanol thu được 57,23  2,06 mg RE/g cao chiết và xếp cuối cùng là phân đoạn nước với 26,01  1,75 mg RE/g cao chiết. Mặc dù flavonoid được biết biết đến là một hợp chất tự nhiên thường cĩ độ phân cực trung bình đến rất phân cực, nhưng cũng cĩ một số flavonoid cĩ độ phân cực thấp. Phụ thuộc vào cấu trúc... nồng độ đường trong máu: kết quả nghiên cứu cho thấy cây Nhân trần tía cĩ khả năng giúp làm ổn định lượng đường trong máu. Hiệu quả giảm nồng độ đường máu của 2 nhĩm động vật dùng dịch chiết cồn và dịch chiết nước ở cùng liều 50 mg/kg thể trọng tương đương với nhĩm dùng thuốc trị bệnh tiểu đường glibenclamide (10 mg/kg thể trọng). Nghiên cứu sẽ là cơ sở cho việc ứng dụng trong sản xuất thuốc cĩ tác dụng ngăn ngừa bệnh đái tháo đường. 4.2. Kiến nghị Khảo sát thêm một số dung mơi và phương pháp khác để tăng hàm lượng trích ly. Tiến hành thử nghiệm trên những mơ hình như đái tháo đường với thời gian dài với các liều dùng dịch chiết khác nhau trên các dung mơi khác nhau. Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu của các cao chiết, thử nghiệm trên một số chủng vi khuẩn gây bệnh khác. Tiếp tục nghiên cứu thêm để phát triển sản phẩm thành thuốc cĩ tác dụng trong việc làm thuốc đặc trị đái tháo đường, viêm gan. 70 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO ❖ Tài liệu Tiếng Việt: 1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đồn Thị Thu, Nguyễn Tập, Trần Tồn (2004). Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập II, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. 2. Bộ Y Tế (2002). Dược điển Việt Nam III, Hà Nội. 3. Đỗ Trung Đàm (2003). Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp của thuốc, NXB Y học. 4. Thiard Franck, Tất Tố Trinh, Nguyễn Thụy Vy, Nguyễn Hồi Nghĩa, Nguyễn Diệu Liên Hoa, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Hạnh, Hồ Huỳnh Thùy Dương (2008). Khảo sát hoạt tính ức chế tăng trưởng của các cây thuốc Việt Nam trên dịng tế bào ung thư cổ tử cung Hela, Tạp chí Phát triển Khoa học và Cơng nghệ, 11(1), 74-81. 5. Lại Thị Ngọc Hà, Vũ Thị Thư (2009). Stress oxy hĩa các chất chống oxy hĩa tự nhiên, Tạp chí Khoa học và Phát triển, Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội, 7(5), 667-677. 6. Nguyễn Đức Hạnh, Nguyễn Minh Đức, Nguyễn Minh Cang (2008). Nghiên cứu hợp chất polyphenol từ cây Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati - Scrophulariaceae), Tạp chí Dược liệu, 13(1), 5-12. 7. Nguyễn Diệu Liên Hoa, Phạm Đình Hùng (2015). Hĩa học các hợp chất tự nhiên, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. 8. Phạm Hồng Hộ (1999). Cây cỏ Việt Nam, Tập 2. Nhà xuất bản Trẻ, Tp.HCM, 902-904. 9. Trần Hùng (2004). Phương pháp nghiên cứu dược liệu. Đại học Y Dược TP.HCM. 71 Đồ án tốt nghiệp 10. Vũ Mạnh Hùng, Bùi Thị Bích Vân (2008). Tác dụng bảo vệ gan của protecliv trên thực nghiệm, Tạp chí Dược liệu, 13(1), 40-44. 11. Đỗ Tất Lợi (2004). Những Cây Thuốc Và Vị Thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 625-629. 12. Dương Thị Mộng Ngọc, Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Thanh Tâm, Trần Cơng Luận (2006). Tác dụng bảo vệ gan của cao phối hợp từ lá Đinh lăng và Nhân trần Tây Ninh, Nghiên cứu phát triển dược liệu và đơng dược ở Việt Nam, Viện Dược liệu. 13. Dương Hồng Nhung (2015). Nghiên cứu thành phần hĩa học và hoạt tính sinh học của lồi Bồ bồ Adenosma indiana (Lour.) Merr. phân bố ở địa bàn huyện Đại Từ - tỉnh Thái Nguyên. Luận văn Thạc sĩ, Trường Đại học Sư Phạm Thái Nguyên. 14. Phịng thí nghiệm Sinh học phân tử - Bộ mơn Di Truyền. Thử nghiệm SRB, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM. 15. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007). Phương pháp cơ lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. 16. TCVN 9745-1:2013 (ISO 14502-1:2005). Phần 1: Hàm lượng polyphenol tổng số trong chè - Phương pháp đo màu dùng thuốc thử Folin-Ciocalteu. 17. Nguyễn Hồng Tuấn (2000). Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hố của Nhân trần Adenosma caeruleum và một số dược liệu khác, Luận văn tốt nghiệp Dược sỹ Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội. 18. Viện Dược Liệu - Bộ Y Tế (2006). Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ dược thảo, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ Thuật. ❖ Tài liệu Tiếng Anh: 19. Adam, G., Porzel, A., Sung, T. V., Schmidt, J. (1992). A monoterpenoid peroxyde from Adenosma caeruleum. Phytochemistry, 31(8), 2885-2887. 72 Đồ án tốt nghiệp 20. Adibhatla, R.M., Hatcher, J.F. (2010). Lipid oxidation and peroxidation in CNS health and disease: From molecular mechanisms to therapeutic opportunities, Antioxidants Redox Signaling, 12(1), 125 – 169. 21. Aibinu, I., Adenipekun, T., Adelowotan, T., Ogunsanya, T., Odugbemi, T. (2007). Evaluation of the antimicrobial properties of different parts of Citrus aurantifolia (lime fruit) as used locally. African Journal of Traditional, Complementary, and Alternative Medicines, 4(2), 185. 22. Awad AB, Williams H, Fink CS (2001). Phytosterols reduce in vitrometastatic ability of MDA-MB-231 human breast cancer cells. Nutr Cancer 40, 157–164. 23. Awad, A. B., Fink, C. S. (2000). Phytosterols as anticancer dietary components: evidence and mechanism of action, The Journal of nutrition,130(9), 2127-2130. 24. Bhowmik, A., Khan, L.A., Akhter, M., and Rokeya, B. (2009). Studies on the antidiabetic effects of Mangifera indica stem-barks and leaves on nondiabetic, type 1 and type 2 diabetic model rats, Bangladesh Journal of Pharmacology (4) 110-114. 25. Can Baser, K. H. (2008). Biological and pharmacological activities of carvacrol and carvacrol bearing essential oils. Current pharmaceutical design, 14(29), 3106-3119. 26. Cooke, M.S., Evans, M.D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. (2003). Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease, The FASEB Journal, 17, 1195 – 1214. 27. De Abreu, M. B., Malafronte, N., Van Kiem, P., Braca, A. (2009). A new iridoid from Adenosma caeruleum R. Br. Fitoterapia, 80(6), 358-360. 28. De Stefani E, Boffetta P, Ronco AL, Brennan P, Deneo-Pellegrini H, Carzoglio JC et al. (2000). Plant sterols and risk of stomach cancer: A case-control study in Uruguay. Nutr Cancer 37, 140–144. 73 Đồ án tốt nghiệp 29. Denisov, E.T., Afanas’ev, I.B. (2005). Oxidation and Antioxidants in Organic Chemistry and Biology, Taylor Francis Group, United State of America. 30. Dix, T.A., Hess, K.M., Medina, M.A., Sullivan, R.W., Tilly, S.L., Webb, T.L. (1996). Mechanism of site-selective DNA nicking by the hydrodioxyl (perhydroxyl) radical, Biochemistry, 35, 4578 – 4583. 31. Efferth, T., Kuete, V. (2010). Cameroonian medicinal plants: pharmacology and derived natural products. Frontiers in pharmacology, 1, 123. 32. Fulda, S. (2009). Betulinic acid: a natural product with anticancer activity.Molecular nutrition food research, 53(1), 140-146. 33. Geran RI, Greenberg H M, McDonald M, Abbott BJ. Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems. Cancer Chemoth Rep. 1972;33:1–17. 34. Gonzalez-Burgos, E., Gomez-Serranillos, M. P. (2012). Terpenoid compounds in nature: A review of their potential antioxidant activity. Current medicinal chemistry, 19(31), 5319-5341. 35. Harborne, J. B. (2013). The flavonoids: advances in research since 1980. Springer. 36. Huang, M., Lu, J. J., Huang, M. Q., Bao, J. L., Chen, X. P., Wang, Y. T. (2012). Terpenoids: natural products for cancer therapy. Expert opinion on investigational drugs, 21(12), 1801-1818. 37. Jovanovic S. V. and Simic M. G. (2000). Antioxidants in nutrition, Annals of the New York Academy of Sciences, 899, 326-334. 38. Joy, K.L., and Kuttan, R.J. (1999). Anti-diabetic activity of Picrorrhiza kurroa extract, Journal of Ethnopharmacology, 67:143-148. 39. Kưksal, E., GÜLÇİN, İ., Beyza, S., Sarikaya, Ư., Bursal, E. (2009). In vitro antioxidant activity of silymarin. Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry, 24(2), 395-405. 74 Đồ án tốt nghiệp 40. Mayakrishnan, V., Veluswamy, S., Sundaram, K. S., Kannappan, P., Abdullah, N. (2013). Free radical scavenging potential of Lagenaria siceraria (Molina) Standl fruits extract. Asian Pacific journal of tropical medicine, 6(1), 20-26. 41. Mendilaharsu M, Stefani ED, Deneo-Pellegrini H, Carzoglio J, Ronco A (1998). Phytosterols and risk of lung cancer: A case-control study in Uruguay. Lung Cancer 21, 37–45. 42. Mukherjee, P.K.,Wahile, A. (2006). Integrated approaches towards drug development from Ayurveda and other Indian system of medicines. J. Ethnopharmacol. 103, 25–35. 43. Nguyen Bich Thu, Trinh Nam Trung, Do Thi Ha, Nguyen Minh Khoi, Tran Viet Hung, Tran Thi Hien, Yim Namhui, KiHwan Bae (2010). Screening of Vietnamese medicinal plants for cytotoxic activity, Natural Product Sciences, 16(1). 44. Nyunai, N., Njikam, N., Addennebi, E.H., Mbaford, J.T., and Lamnaouer, D (2004) Hypoglycaemic and antihyperglycaemic activity of Ageratum conyzoides L. in rats. African Journal of Traditional Complementary and Alternative Medicines, (6) 123-130. 45. Oadir MI, Malik SA (2008). Plasma lipid profile in gynecologic cancers. Eur J Gynaecol Oncol 29, 158–161 46. Omotayo O. Erejuwa (2012). Oxidative Stress in Diabetes Mellitus: Is There a Role for Anti-hyperglycemic Drugs and/or Antioxidants? Oxidative Stress and Diseases, InTech publisher. 47. Peter H., Rui F., Isariya T., Glyn S., Peter J. H. and C.C. Lee (2007). The sulphorhodamine (SRB) assay and other approaches to testing plant extracts and derived compounds for activities related to reputed anticancer activity. Methods., 42(4), 377-387. 75 Đồ án tốt nghiệp 48. Pham-Huy, L. A., He, H., Pham-Huy, C. (2008). Free radicals, antioxidants in disease and health. Int J Biomed Sci, 4(2), 89-96. 49. Puri, D. (2014). Textbook of medical biochemistry. Elsevier Health Sciences. 50. Rahman, M., Hasan, N., Das, A. K., Hossain, T., Jahan, R., Khatun, A., Rahmatullah, M. (2011). Effect Of Delonix Regia Leaf Extract On Glucose Tolerance In Glucoseinduced Hyperglycemic Mice. African Journal of Traditional, Complementary and Alternative Medicines, 8(1). 51. Safe, S.H., L Prather, P., K Brents, L., Chadalapaka, G., Jutooru, I. (2012). Unifying mechanisms of action of the anticancer activities of triterpenoids and synthetic analogs. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry (Formerly Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents), 12(10), 1211-1220. 52. Shacter, E. (2000). Quantification and significance of protein oxidation in biological samples, Drug Metabolism Reviews, 32(34), 307 – 326. 53. Singh N. and Rajini P. S. (2004). Free radical scavenging activity of an aqueous extract of potato peel. Food chemistry, 85, 611-616. 54. Takhtajan, A. (2009). Flowering plants. Springer Science Business Media, 565. 55. Trombetta, D., Castelli, F., Sarpietro, M. G., Venuti, V., Cristani, M., Daniele, C., Bisignano, G. (2005). Mechanisms of antibacterial action of three monoterpenoids. Antimicrobial agents and chemotherapy, 49(6), 2474-2478. 56. Tsankova, E. T., Kuleva, L. V., Thanh, L. T. (1994). Composition of the Essential Oil of Adenosma bracteosum Bonati. Journal of Essential Oil Research, 6(3), 305-306. 57. Vichai, V., Kirtikara, K. (2006). Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening, Nature protocols, 1(3), 1112-1116. 58. Von Gadow A., Joubert E. and Hansmann C. F., Comparison of antioxidant activity of aspalanthin with that of orther plant phenols of Rooibos tea 76 Đồ án tốt nghiệp (Aspalathus linearis), α-tocopherol, BHT, and BHA, Journal of Agricultural and Food Chemistry 45 (1997) 632-638. 59. Wallace, K. B. (Ed.). (1997). Free radical toxicology. CRC Press. 60. Waterhouse, A. L. (2002). Determination of total phenolics. Current protocols in food analytical chemistry. 61. Woisky, R. G., Salatino, A. (1998). Analysis of propolis: some parameters and procedures for chemical quality control, Journal of apicultural research,37(2), 99-105. 62. Woyengo, T. A., Ramprasath, V. R., Jones, P. J. H. (2009). Anticancer effects of phytosterols, European Journal of Clinical Nutrition, 63(7), 813-820. 63. Yadav RN, Agrawala M. (2011). Phytochemical analysis of some medicinal plants, J Physiol; 3(12):10–14. 64. Yen G. C. and Duh P. D. (1994). Scavenging effect of methanolic extracts of peanut hulls on free radical and active oxygen species, Agricultural and Food Chemistry 42 (3) 629-632. 65. Yoshida, Y., Niki, E. (2003). Antioxidant effects of phytosterol and its components. Journal of nutritional science and vitaminology, 49(4), 277-280. 77 PHỤ LỤC 1 PHỤ LỤC 1: HĨA CHẤT 1. Mơi trường TSA: Pancreatic digest of casein 15,0 g Papaic digest of soyabean meal 5,0 g Sodium chloride 5,0 g Agar 15,0 g Nước cất 1 l 2. Mơi trường TSB: Pancreatic digest of casein 17,0 g Papaic digest of soyabean meal 3,0 g Sodium chloride 5,0 g Dextrose 2,5 g Dibasic potassium phosphate 2,5 g Nước cất 1 l 3. Dung dịch Mc Farland 0.5 BaCl2 1% 0,05 ml H2SO4 1% 9,95 ml 4. Fehling Fehling A: hịa tan 34,6 g CuSO4.5H2O vào 500ml nước cất. Fehling B: Hịa tan 125 g KOH và 173 g Kali Natri tartrate.7H2O vào 500 ml nước cất. 5. Mayer reagent: Hịa tan 1,358g HgCl2 trong 60ml nước, sau đĩ đổ vào trong dung dịch này 5 g KI được pha trong 10ml nước. Sau đĩ định mức lên 100 ml. 6. Dragendroff reagent: Gồm 2 dung dịch. - Dung dịch A: hịa tan 0,5 g Bismuth nitrate (Bi(NO3)3.5H2O) trong 20 ml acid acetic 20%. 2 - Dung dịch B: dung dịch KI 40% pha trong nước. Khi sử dụng, trộn 20 ml dung dịch A với 5 ml dung dịch B và 70 ml nước. 7. Hager reagent: Hịa tan 1 g acid picric vào 100 ml nước cất. 8. Wagner reagent: Hịa tan 2 g iodine và 6 g KI vào 100 ml nước cất. 9. Đệm phosphate 0,02M pH 6,6: Dung dịch A: Na2HPO4.2H2O 35,61 g/l Dung dịch B: NaH2PO4.H2O 27,6 g/l Nước cất 1 l Dung dịch đệm: 770 ml dung dịch A và 230 ml dung dịch B. 3 PHỤ LỤC 2: HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM Hình 1. Cây Nhân trần tía ngồi tự nhiên Hình 2. Gây mê chuột bạch. 4 Hình 3. Đo đường huyết chuột. Hình 4. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết cồn 100 mg/ml trên chủng E. coli 5 Hình 5. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết cồn 100 mg/ml trên chủng ETEC Hình 6. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước 100 mg/ml trên chủng ETEC 6 Hình 7. Hoạt tính kháng khuẩn của cao phân đoạn chloroform 50 mg/ml (hình A) và cao phân đoạn ethyl acetate 50 mg/ml (hình B) trên chủng E. coli. 7 Hình 8. Hoạt tính kháng khuẩn của cao phân đoạn chloroform 50 mg/ml (hình A), cao phân đoạn ethyl acetate 50 mg/ml (hình B) cao phân đoạn n-butanol 50 mg/ml (hình C) và cao phân đoạn nước 100 mg/ml (hình D) trên chủng ETEC. Hình 9. Hoạt tính kháng khuẩn của cao phân đoạn n-butanol 50 mg/ml trên chủng Staphylococcus aureus Hình 10. Dung dịch Mc Farland 0,5 8 PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐỘ ẨM, HÀM LƯỢNG CAO Bảng 3.1. Khảo sát độ ẩm. Khối lượng ban đầu (g) Khối lượng sau sấy (g) Độ ẩm (%) Độ ẩm trung bình (%) 1,014 0,946 6,71 1,007 0,941 6,55 6,58  0,11 1,002 0,937 6,49 Bảng 3.2. Hàm lượng cao Cao Khối lượng nguyên Độ ẩm Khối lượng cao thu Hàm lượng cao liệu (g) (%) được (g) (%) Cao nước 1000 6,58 145 15,52 Cao cồn 2000 6,58 166 8,88 Bảng 3.3 Hàm lượng thu hồi. Khối Khối lượng Thu Khối Thu Khối Thu Khối Thu Tổng lượng cao phân hồi lượng hồi lượng hồi lượng hồi cao đoạn (%) cao (%) cao phân (%) cao (%) cồn sử chloroform phân đoạn n- phân dụng (g) đoạn butanol đoạn (g) CH Ethyl (g) nước acetate BU (g) (g) W EA 100 51,13 51,13 9,63 9,63 20,75 20,75 9,38 9,38 90,89 9 PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG POLYPHENOL TỔNG SỐ, FLAVONOID TỔNG SỐ Bảng 4.1 Kết quả khảo sát hàm lượng polyphenol tổng số. Mẫu Polyphenol Trung bình Polyphenol Trung bình tổng số tổng số (mg GE/g (mg GE/g nguyên cao chiết) liệu) Cao cồn 21,82 31,46  0,42 245,77 249,68  3,61 22,46 252,88 22,23 250,39 Cao nước 31,51 22,17  0,32 203,06 202,70  2,69 31,02 199,86 31,85 205,20 Cao phân 4,98 4,83  0,17 109,75 106,31  3,77 đoạn 4,85 106,90 chloroform 4,64 102,28 Cao phân 4,24 4,28  0,03 495,66 499,93  3,77 đoạn ethyl 4,29 501,35 acetate 4,30 502,78 Cao phân 8,33 8,38  0,05 452,24 454,61  2,96 đoạn n- 8,44 457,94 butanol 8,36 453,67 Cao phân 1,84 1,90  0,06 221,49 228,26  7,14 đoạn nước 1,96 235,73 1,90 227,54 10 Bảng 4.2 Kết quả khảo sát hàm lượng flavonoid tổng số: Mẫu Flavonoid Trung bình Flavonoid Trung bình tổng số tổng số (mg RE/g (mg nguyên RE/g cao liệu) chiết) Cao cồn 9,05 8,34  0,22 101,96 101,82  0,88 9,11 102,61 8,96 100,87 Cao nước 8,12 9,04  0,08 52,29 53,75  1,42 8,35 53,82 8,56 55,13 Cao phân 4,27 4,33  0,05 94,12 95,35  1,12 đoạn 4,37 96,30 chloroform 4,34 95,64 Cao phân 1,35 1,39  0,04 157,51 162,81  4,60 đoạn ethyl 1,42 165,79 acetate 1,41 165,13 Cao phân 1,07 1,05  0,04 57,96 57,23  2,06 đoạn n- 1,01 54,91 butanol 1,08 58,83 Cao phân 0,23 0,22  0,01 27,68 26,01  1,75 đoạn nước 0,20 24,19 0,22 26,16 11 PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA BẰNG PHƯƠNG PHÁP BẮT GỐC TỰ DO DPPH Bảng 5.1. Vitamin C Nồng độ Khả năng Nồng độ sau Mẫu cao ban đầu bắt gốc Trung bình (%) (g/ml) (mg/ml) (%) 0 0 - - 16,19 0,1 2,44 15,29 36,03  2,13 14,39 37,93 0,2 4,88 36,43 50,72  1,06 33,73 Vitamin C 50,52 0,25 6,10 51,87 57,67  0,31 49,78 57,57 0,3 7,32 58,02 64,62  0,83 57,42 64,77 9,76 65,37 0,4 63,72 79,31  0,45 Bảng 5.2 Cao chiết cồn Nồng độ Khả năng Nồng độ sau Mẫu cao ban đầu bắt gốc Trung bình (%) (g/ml) (mg/ml) (%) Cao cồn 0 0 - - 12 31,33 1,5 36,59 29,69 31,43  1,80 33,28 34,93 2 48,78 38,68 37,08  1,93 37,63 44,68 3 73,17 47,98 46,48  1,67 46,78 55,62 3,5 85,37 62,07 57,82  3,68 55,77 4,5 63,57 109,76 71,66 71,36  7,65 78,86 Bảng 5.3 Cao chiết nước Nồng độ Khả năng Nồng độ sau Mẫu cao ban đầu bắt gốc Trung bình (%) (g/ml) (mg/ml) (%) 0 0 - - 31,18 1,5 36,59 32,23 30,88  1,52 Cao nước 29,24 34,33 2 48,78 33,73 33,58  0,83 32,68 3 73,17 44,38 43,48  2,38 13 40,78 45,28 57,42 3,5 85,37 53,52 54,22  2,91 51,72 4,5 61,17 109,76 62,97 61,57  1,25 60,57 Bảng 5.4 Cao phân đoạn chloroform Nồng độ Khả năng Nồng độ sau Mẫu cao ban đầu bắt gốc Trung bình (%) (g/ml) (mg/ml) (%) 0 0 - - 1 21,89 24,39 20,24 20,29  1,57 18,74 2 24,59 47,78 25,19 24,49  0,75 23,69 45,73 3 73,17 43,78 44,78  0,98 44,83 Cao phân đoạn 4 55,62 chloroform 95,24 54,87 54,62  1,15 53,37 5 70,31 121,95 72,11  1,57 72,86 14 73,16 Bảng 5.5 Cao phân đoạn Ethyl acetate Nồng độ Khả năng Nồng độ sau Mẫu cao ban đầu bắt gốc Trung bình (%) (g/ml) (mg/ml) (%) 0 0 - - 0,5 12,20 29,09 27,29 28,19  0,90 28,19 1 24,39 37,18 36,28 36,78  0,46 Cao phân đoạn 36,88 Ethyl acetate EA 1,5 36,59 45,88 43,48 44,88  1,25 45,28 2 48,78 59,37 60,87 59,82  0,91 59,22 3 84,41 73,17 84,26 84,31  0,09 84,26 Bảng 5.6 Cao phân đoạn n-butanol Nồng độ Khả năng Nồng độ sau Mẫu cao ban đầu bắt gốc Trung bình (%) (g/ml) (mg/ml) (%) 15 0 0 - - 0,5 12,20 13,97 15,00  1,34 14,52 16,52 1 24,39 26,32 27,16  1,63 29,04 Cao phân đoạn 26,13 n-butanol BU 1,5 36,59 42,47 44,34  2,12 46,64 43,92 2 48,78 56,44 55,90  1,79 53,90 57,35 2,5 60,97 70,60 68,78 69,57  0,93 69,33 Bảng 5.7 Cao phân đoạn nước Nồng độ Khả năng Nồng độ sau Mẫu cao ban đầu bắt gốc Trung bình (%) (g/ml) (mg/ml) (%) Cao phân 0 0 - - đoạn nước 1 16,64 24,39 13,79 15,44  1,48 15,89 2 31,78 47,78 27,14 29,44  2,32 29,39 16 43,03 3 73,17 41,38 42,83  1,36 Cao phân đoạn 44,08 nước 4 68,52 95,24 66,27 66,72  1,62 65,37 5 85,16 121,95 85,76 85,46  0,30 85,46 17 PHỤ LỤC 6: KẾT QUẢ KHẢO SÁT NĂNG LỰC KHỬ Nồng độ Mẫu Trung bình (g/ml) 1 0,184  0,003 5 0,319  0,004 10 0,433  0,002 Vitamin C 15 0,671  0,003 20 0,751  0,004 25 0,806  0,003 1 0,249  0,003 5 0,273  0,004 10 0,287  0,002 ET 15 0,295  0,003 20 0,314  0,004 25 0,336  0,003 1 0,171  0,001 5 0,196  0,002 10 0,209  0,003 AQ 15 0,214  0,002 20 0,219  0,002 25 0,231  0,003 1 0,199  0,004 5 0,212  0,006 CH 10 0,231  0,006 15 0,236  0,007 18 20 0,238  0,008 25 0,245  0,009 1 0,237  0,008 5 0,249  0,007 10 0,267  0,009 EA 15 0,275  0,006 20 0,293  0,003 25 0,359  0,004 1 0,172  0,002 5 0,178  0,003 10 0,185  0,002 BU 15 0,215  0,002 20 0,253  0,003 25 0,268  0,004 50 0,325  0,001 1 0,225  0,004 5 0,230  0,005 10 0,237  0,005 W 15 0,268  0,005 20 0,281  0,007 25 0,315  0,006 19 PHỤ LỤC 7: KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN Bảng 7.1. Hoạt tính kháng khuẩn của cao tổng Chủng Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình (mm) Cao cồn (100 mg/ml) E. coli 10 10,5 10 10,17  0,29 ETEC 17 16 16,5 16,50  0,50 Cao n (100 mg/ml) ETEC 14 14 13,5 13,83  0,29 Bảng 7.2. Hoạt tính kháng khuẩn của cao phân đoạn Chủng Cao Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình (mm) S. aureus BU 50 mg/ml 9 8 8 8,33  0,58 CH 50 mg/ml 8 7,5 7 7,50  0,50 EA 50 mg/ml 7,5 8 8 7,83  0,29 ETEC BU 50 mg/ml 7,5 8 7 7,50  0,50 W 100 mg/ml 8 8 7,5 7,83  0,29 E coli CH 50 mg/ml 8,5 7,5 8 8,00  0,50 EA 50 mg/ml 7,5 9 8,5 8,33  0,76 Bảng 6.3. Hoạt tính kháng khuẩn của ciprofloxacin 500 g/ml Chủng Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình (mm) Escherichia coli 15 14,5 15 14,83  0,29 Enterotoxigenic E.coli - ETEC 30 30 30,5 30,17  0,29 Listeria monocytogenes 33 33,5 33 33,17  0,29 Salmonella typhii 30 31 32 31,00  1,00 Pseudomonas aeruginosa 14 15 15 14,67  0,58 Staphylococcus aureus 14 14,5 15 14,50  0,50 20 PHỤ LỤC 8: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ BẰNG SAS 9.4 1. Hàm lượng polyphenol tổng (TPC) ‘TPC’ The ANOVA Procedure Dependent Variable: HAMLUONG Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 353908.9331 70781.7866 3912.55 <.0001 Error 12 217.0913 18.0909 Corrected Total 17 354126.0244 R-Square Coeff Var Root MSE HAMLUONG Mean 0.999387 1.465413 4.253344 290.2489 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NGTHUC 5 353908.9331 70781.7866 3912.55 <.0001 Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 18.09094 Number of Means 2 3 4 5 6 Critical Range 10.61 11.06 11.35 11.55 11.71 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N NGTHUC A 499.930 3 EA B 454.617 3 BU C 249.677 3 ET D 228.253 3 W E 202.707 3 AQ 21 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N NGTHUC F 106.310 3 CH 2. Hàm lượng Flavonoid tổng (TFC) ‘TFC’ The ANOVA Procedure Dependent Variable: HAMLUONG Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 34930.62964 6986.12593 1288.99 <.0001 Error 12 65.03827 5.41986 Corrected Total 17 34995.66791 R-Square Coeff Var Root MSE HAMLUONG Mean 0.998142 2.810722 2.328058 82.82778 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NGTHUC 5 34930.62964 6986.12593 1288.99 <.0001 ‘TFC’ The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for HAMLUONG Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 5.419856 Number of Means 2 3 4 5 6 Critical Range 5.806 6.054 6.213 6.324 6.407 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N NGTHUC A 162.810 3 EA 22 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N NGTHUC B 101.813 3 ET C 95.353 3 CH D 57.233 3 BU D D 53.747 3 AQ E 26.010 3 W 3. Giá trị IC50 trong phương pháp loại gốc tự do DPPH The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 6 15876.77627 2646.12938 550.17 <.0001 Error 14 67.33573 4.80970 Corrected Total 20 15944.11200 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.995777 3.816081 2.193102 57.47000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F T 6 15876.77627 2646.12938 550.17 <.0001 Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 14 Error Mean Square 4.809695 Number of Means 2 3 4 5 6 7 Critical Range 5.330 5.559 5.707 5.813 5.893 5.955 Means with the same letter are not significantly different. 23 Duncan Grouping Mean N T A 84.693 3 CH A A 82.533 3 AQ B 75.453 3 W B B 73.337 3 ET C 43.310 3 BU C C 38.170 3 EA D 4.793 3 VitaC 4. Xác định mối tương quan Chú thích: TPC: Hàm lượng polyphenol tổng. TFC: Hàm lượng flavonoid tổng. DPPH: Giá trị IC50 (%) RP: Giá trị độ hấp thu tại bước sĩng 700nm. The SAS System The CORR Procedure 4 Variables: TPC TFC DPPH RP Simple Statistics Variable N Mean Std Dev Sum Minimum Maximum TPC 6 300.24833 150.68439 1801 106.31000 499.93000 TFC 6 82.82833 48.25700 496.97000 26.01000 162.81000 DPPH 6 66.24833 20.27170 397.49000 38.17000 84.69000 RP 6 0.29233 0.05188 1.75400 0.23100 0.35900 Pearson Correlation Coefficients, N = 6 Prob > |r| under H0: Rho=0 TPC TFC DPPH RP 24 Pearson Correlation Coefficients, N = 6 Prob > |r| under H0: Rho=0 TPC TFC DPPH RP TPC 1.00000 0.33413 -0.96779 0.56891 0.5175 0.0015 0.2387 TFC 0.33413 1.00000 -0.46803 0.53418 0.5175 0.3492 0.2749 DPPH -0.96779 -0.46803 1.00000 -0.50715 0.0015 0.3492 0.3045 RP 0.56891 0.53418 -0.50715 1.00000 0.2387 0.2749 0.3045 The SAS System Obs _TYPE_ _NAME_ TPC TFC DPPH RP 1 MEAN 300.248 82.8283 66.2483 0.29233 2 STD 150.684 48.2570 20.2717 0.05188 3 N 6.000 6.0000 6.0000 6.00000 4 CORR TPC 1.000 0.3341 -0.9678 0.56891 5 CORR TFC 0.334 1.0000 -0.4680 0.53418 6 CORR DPPH -0.968 -0.4680 1.0000 -0.50715 7 CORR RP 0.569 0.5342 -0.5071 1.00000 5. Thí nghiệm làm ổn định đường huyết trên mơ hình động vật ‘DUONG HUYET’ The ANOVA Procedure Dependent Variable: DUONG Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 201.3466667 50.3366667 79.60 <.0001 Error 25 15.8083333 0.6323333 Corrected Total 29 217.1550000 R-Square Coeff Var Root MSE DUONG Mean 25 R-Square Coeff Var Root MSE DUONG Mean 0.927203 11.44164 0.795194 6.950000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 4 201.3466667 50.3366667 79.60 <.0001 Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 25 Error Mean Square 0.632333 Number of Means 2 3 4 5 Critical Range 1.280 1.335 1.371 1.398 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N NT A 12.0500 6 DUONG B 6.4167 6 TRANG B B 5.8833 6 NUOC B 26 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N NT B 5.2167 6 THUOC B B 5.1833 6 CON 6. Thí nghiệm khảo sát khả năng kháng khuẩn The ANOVA Procedure Dependent Variable: D Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 1 32.66666667 32.66666667 392.00 <.0001 Error 4 0.33333333 0.08333333 Corrected Total 5 33.00000000 R-Square Coeff Var Root MSE D Mean 0.989899 2.309401 0.288675 12.50000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NGTHUC 1 32.66666667 32.66666667 392.00 <.0001 Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 0.083333 Critical Value of Studentized Range 6.51116 Minimum Significant Difference 1.0852 Means with the same letter are not significantly different. Tukey Grouping Mean N NGTHUC A 14.8333 3 CP B 10.1667 3 ET Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 0.083333 27 Means with the same letter are not significantly different. Tukey Grouping Mean N NGTHUC Critical Value of Studentized Range 3.92648 Minimum Significant Difference 0.6544 Tukey Grouping Mean N NGTHUC A 14.8333 3 CP B 10.1667 3 ET The ANOVA Procedure Dependent Variable: D Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 89.05555556 44.52777778 145.73 <.0001 Error 6 1.83333333 0.30555556 Corrected Total 8 90.88888889 R-Square Coeff Var Root MSE D Mean 0.979829 5.320788 0.552771 10.38889 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NGTHUC 2 89.05555556 44.52777778 145.73 <.0001 Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 0.305556 Critical Value of Studentized Range 6.33032 Minimum Significant Difference 2.0203 Means with the same letter are not significantly different. Tukey Grouping Mean N NGTHUC A 14.8333 3 CP B 8.3333 3 EA B B 8.0000 3 CH 28 The ANOVA Procedure Dependent Variable: D Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 1215.333333 303.833333 2025.56 <.0001 Error 10 1.500000 0.150000 Corrected Total 14 1216.833333 R-Square Coeff Var Root MSE D Mean 0.998767 3.183274 0.387298 12.16667 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NGTHUC 4 1215.333333 303.833333 2025.56 <.0001 Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.15 Critical Value of Studentized Range 6.13609 Minimum Significant Difference 1.3721 Means with the same letter are not significantly different. Tukey Grouping Mean N NGTHUC A 30.1667 3 CP B 7.8333 3 EA B B 7.8333 3 W B B 7.5000 3 CH B B 7.5000 3 BU 29