Đồ án Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây lan một lá nervilia aragoana

ác số liệu và kết quả nêu trong đồ án là đúng sự thật và chƣa có ai công bố ở các công trình khác. TP.HCM, ngày 6 tháng 7 năm 2017 Sinh viên thực hiện Trịnh Kim Thảo Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô Trần Thị Ngọc Mai – Giảng viên Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công nghệ TPHCM, ngƣời đã tận tình dìu dắt, hƣớng dẫn và chỉ bảo em trong suốt thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến thầy Mai Đình Trị - Trƣởng phòng Hợp chất thiên nhiên hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ Hóa học, ngƣời trực tiếp quản lí, giúp đỡ em trong suốt quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp tại đây và em cũng xin cảm ơn đến những anh chị đang công tác tại đơn vị đã nhiệt tình và chỉ bảo để em có thể hoàn thành tốt đồ án nghiên cứu của mình. Xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công nghệ TPHCM cũng nhƣ nhà trƣờng đã tạo điều kiện tốt nhất cho em đƣợc học tập nghiên cứu để hoàn thành đồ án này. Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn đến chị Đỗ Phƣơng Vy, ngƣời đã hỗ trợ và cho em nhiều kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện đồ án. Xin gửi lời cảm ơn đến những bạn bè, anh chị đang nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công nghệ TPHCM đã tận tình hỗ trợ, giúp đỡ cùng nhau vƣợt qua khó khăn để hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp. Cuối cùng xin cảm ơn những ngƣời thân yêu trong gia đình dành cho tôi sự quan tâm, chia sẻ, động viên, khích lệ trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu để tôi hoàn thành đồ án này. Do thời gian thực hiện có hạn, kiến thức còn nhiều hạn chế nên đồ án thực hiện chắc chắn không tránh khỏi những sai sót nhất định. Em rất mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp của thầy cô để em có thêm kinh nghiệm và tiếp tục hoàn thiện đồ án tốt nghiệp của mình. TP.HCM, ngày 6 tháng 7 năm 2017 Sinh viên thực hiện Trịnh Kim Thảo Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC ................................................................................................................... i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................... v DANH MỤC BẢNG BIỂU ...................................................................................... vi DANH MỤC HÌNH ẢNH ....................................................................................... vii MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc ............................................................. 2 3. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................ 3 4. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 3 5. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ........................................................................... 3 5.1 Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................................ 3 5.2 Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................... 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ....................................................................................... 5 1.1 Tổng quan về cây Lan một lá (Nervilia aragoana) .............................................. 5 1.1.1 Phân loại khoa học và phân bố ........................................................................... 5 1.1.1.1 Phân loại khoa học .......................................................................................... 5 1.1.1.2 Phân bố ............................................................................................................ 6 1.1.2 Đặc điểm thực vật .............................................................................................. 6 1.1.3 Thành phần hóa học ........................................................................................... 7 1.1.4 Giá trị dƣợc liệu ................................................................................................. 9 1.1.5 Các nghiên cứu trên thế giới về Lan một lá (Nervilia aragoana) .................... 11 1.2 Tổng quan về các phƣơng pháp chiết xuất .......................................................... 12 1.2.1 Các quá trình xảy ra trong chiết xuất ............................................................... 12 1.2.1.1 Sự hòa tan ...................................................................................................... 13 1.2.1.2 Sự khuếch tán ................................................................................................ 13 1.2.1.3 Quá trình thẩm tích ........................................................................................ 14 1.2.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình chiết xuất ................................................ 15 1.2.2.1 Nguyên liệu ................................................................................................... 15 i Đồ án tốt nghiệp 1.2.2.2 Dung môi ....................................................................................................... 16 1.2.2.3 Kỹ thuật chiết ................................................................................................ 17 1.2.3 Các phƣơng pháp chiết ..................................................................................... 18 1.2.3.1 Phƣơng pháp ngâm ........................................................................................ 18 1.2.3.2 Chiết bằng phƣơng pháp ngấm kiệt .............................................................. 20 1.2.3.3 Các phƣơng pháp chiết khác ......................................................................... 21 1.3 Tổng quan về hoạt tính kháng oxy hóa ............................................................... 21 1.3.1 Giới thiệu chung ............................................................................................... 21 1.3.1.1 Khái niệm về stress oxy hóa ......................................................................... 21 1.3.1.2 Sự hình thành các gốc tự do của oxy trong cơ thể ........................................ 22 1.3.1.3 Sự phòng vệ của cơ thể chống lại gốc tự do ................................................. 24 1.3.2 Một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính kháng oxy hóa ................................ 26 1.3.2.1 Flavonoid ....................................................................................................... 26 1.3.2.2 Terpenoid ...................................................................................................... 28 1.1.3 Các phƣơng pháp xác định tác dụng chống oxi hóa ........................................ 29 1.1.3.1 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng MDA ...................................................... 29 1.1.3.2 Các phƣơng pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa .................................... 30 1.4 Tổng quan về hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm........................................... 32 1.4.1 Khái niệm chung .............................................................................................. 32 1.4.2 Cơ chế đối kháng .............................................................................................. 33 1.4.3 Một số loài vi khuẩn, nấm gây bệnh thƣờng gặp ............................................. 33 1.4.3.1 Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) .................................................................... 33 1.4.3.2 Trực khuẩn (Escherichia coli) ..................................................................... 34 1.4.3.2 Nấm mốc Aspergillus .................................................................................... 36 1.4.3.3 Nấm sợi Fusarium ........................................................................................ 37 1.4.3.4 Nấm Neoscytalidium dimidiatum .................................................................. 38 1.4.4 Các phƣơng pháp thử hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm in vitro .............. 40 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 42 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu. ...................................................................... 42 ii Đồ án tốt nghiệp 2.1.1 Thời gian nghiên cứu ....................................................................................... 42 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu ........................................................................................ 42 2.2 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 42 2.2.1 Nguồn mẫu ....................................................................................................... 42 2.2.2 Vi sinh vật chỉ thị ............................................................................................. 42 2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất .............................................................................. 42 2.3.1 Thiết bị ............................................................................................................. 42 2.3.2 Dụng cụ ............................................................................................................ 43 2.3.3 Hóa chất ........................................................................................................... 43 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................... 43 2.4.1 Phƣơng pháp thu và xử lý mẫu ........................................................................ 43 2.4.2 Phƣơng pháp tách chiết và thu nhận cao chiết ................................................. 44 2.4.2.1 Phƣơng pháp chiết ngâm dầm ....................................................................... 44 2.4.2.2 Phƣơng pháp chiết bằng máy Soxhlet ........................................................... 45 2.4.3 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa bằng phƣơng pháp DPPH ......................... 47 2.4.4 Đánh giá khả năng kháng khuẩn, kháng nấm bằng phƣơng pháp khuếch tán trên giếng thạch (well diffusion agar method) .......................................................... 49 2.4.5 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC ........................................................... 51 2.4.6 Phƣơng pháp xử lí số liệu................................................................................. 53 2.5 Bố trí thí nghiệm ................................................................................................. 53 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 60 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của phƣơng pháp tách chiết đến tỷ lệ thu hồi của cao chiết cây N. aragoana ......................................................................................... 60 3.2 Kết quả khảo sát quá trình chiết phân đoạn từ cao chiết cây N. aragoana ......... 61 3.3 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bắt gốc tự do DPPH của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây N. aragoana ..................................................................... 63 3.4 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn cây N. aragoana ...................................................................................... 68 iii Đồ án tốt nghiệp 3.4.1 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết và các cao phân đoạn cây N. aragoana ........................................................................................................ 68 3.4.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn cây N. aragoana ............................................................................................................... 70 3.5 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết và các cao phân đoạn đối với các chủng vi sinh vật gây bệnh ............................................................ 75 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 78 4.1 Kết luận ............................................................................................................... 78 4.2 Kiến nghị ............................................................................................................. 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 80 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DMSO : Dimethyl sulfoxide DPPH : 1,1 diphenyl – 2 – picrylhydrazyl EA : Ethyl Acetate EtOH : Ethanol MeOH : Methanol MIC : Minimum Inhibitory Concentration : Nồng độ ức chế tối thiểu PDA : Potato Dextro Agar PE : Petroleum ether TSA : Tryptic Soy Agar TSB : Tryptone Soya Broth v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1. Giá trị I % ức chế gốc tự do DPPH của cao chiết Ethanol ....................... 63 Bảng 3.2. Giá trị I % ức chế gốc tự do DPPH của cao phân đoạn PE ...................... 64 Bảng 3.3. Giá trị I % ức chế gốc tự do DPPH của cao phân đoạn EA ..................... 65 Bảng 3.4. Giá trị I % ức chế gốc tự do DPPH của cao phân đoạn nƣớc ................... 66 Bảng 3.5. Giá trị I % ức chế gốc tự do DPPH của Vitamin C .................................. 67 Bảng 3.6. Kết quả so sánh hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn đối với 5 chủng vi sinh vậy gây bệnh ............................................... 74 Bảng 3.7. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết và các cao phân đoạn đối với 5 chủng vi sinh vật gây bệnh ....................................................... 76 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Ảnh Nervilia aragoana ............................................................................... 7 Hình 1.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus .............................................................. 34 Hình 1.3. E.coli quan sát dƣới kính hiển vi với kích thƣớc 2 µm ............................. 35 Hình 1.4. Nấm mốc Aspergillus ................................................................................ 37 Hình 1.5. Nấm sợi Fusarium ..................................................................................... 38 Hình 1.6. Nấm Neoscytalidium dimidiatum .............................................................. 39 Hình 2.1. Mẫu bột N. aragoana ................................................................................ 44 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát .............................................................. 54 Hình 2.3. Mẫu bột chiết bằng hệ thống Soxhlet ........................................................ 56 Hình 3.1. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ thu hồi cao chiết cây N. aragoana ....................... 60 Hình 3.2. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ thu hồi các cao phân đoạn từ cao chiết cây N. aragoana ................................................................................................................... 62 Hình 3.3. Biểu đồ biểu diễn % ức chế của cao Ethanol ............................................ 63 Hình 3.4. Biểu đồ biểu diễn % ức chế của cao phân đoạn PE .................................. 64 Hình 3.5. Biểu đồ biểu diễn % ức chế của cao phân đoạn EA ................................. 65 Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn % ức chế của cao phân đoạn nƣớc ................................. 66 Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn % ức chế của mẫu Vitamin C ......................................... 67 Hình 3.8. Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết, cao phân đoạn và đối chứng kháng sinh Ampicillin đối với vi khuẩn Escherichia coli ....................... 69 Hình 3.9. Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết, cao phân đoạn và đối chứng kháng sinh Ampicillin đối với vi khuẩn S.aureus .................................... 70 Hình 3.10. Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng nấm của cao chiết, cao phân đoạn và đối chứng thuốc Ketoconazole đối với chủng nấm Aspergillus niger ...................... 71 Hình 3.11. Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng nấm của cao chiết, cao phân đoạn và đối chứng thuốc Ketoconazole đối với chủng nấm Fusarium solani ....................... 72 Hình 3.12. Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng nấm của cao chiết, cao phân đoạn và đối chứng thuốc Ketoconazole đối với chủng nấm Neoscytalidium dimidiatum ..... 73 vii Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cây dƣợc liệu từ lâu đƣợc xem là cơ sở để điều trị các bệnh truyền nhiễm khác nhau trong y học cổ truyền, và một loạt các hợp chất đƣợc biết đến mang tính chất điều trị. Các hợp chất có nguồn gốc thực vật đang có tầm quan trọng lớn trong dƣợc phẩm và các ứng dụng điều trị vì thƣờng có ít tác dụng phụ và không gây độc. Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng. Theo kết quả điều tra của Viện Dƣợc Liệu gần đây đƣợc ghi nhận đƣợc 3948 loài thực vật và nấm lớn có công dụng làm thuốc, 52 loài tảo biển, 408 loài động vật và 75 loại khoáng vật có công dụng làm thuốc ở Việt Nam. Kết quả này cũng đã cho thấy nguồn dƣợc liệu ở nƣớc ta rất phong phú. Con số này sẽ còn tăng thêm, nếu đi sâu điều tra cụ thể hơn một số nhóm động - thực vật tiềm năng. Stress oxy hóa, gây ra bởi các gốc oxy, đuợc cho là nguyên nhân chính trong các bệnh thoái hóa khác nhau nhƣ ung thƣ, xơ vữa động mạch, loét dạ dày. Chất chống oxy hoá là những hợp chất giúp ức chế nhiều phản ứng oxy hóa gây ra bởi các gốc tự do nhƣ vậy nhƣ oxy đơn, superoxide, gốc peroxy, hydroxyl các gốc tự do và peroxy nitrate, do đó ngăn ngừa hoặc trì hoãn thiệt hại cho tế bào và các mô. Mặc dù có một số chất chống oxy hoá tổng hợp các hợp chất nhƣ butylated hydroxyl anisole (BHA) và butyl hóa toluene hydroxyl (BHT), thƣờng đƣợc sử dụng trong thực phẩm chế biến, tuy nhiên nhiều nghiên cứu đã báo cáo rằng các hợp chất này có thể có tác dụng phụ [21]. Bên cạnh những loại thuốc chống nấm, kháng oxy hóa đƣợc tổng hợp bằng con đƣờng hóa học đƣợc bày bán tràn lan trên thị trƣờng không rõ độc hại thì tình trạng tiêu thụ lạm thuốc kháng sinh tại Việt Nam ngày càng gia tăng. Một nghiên cứu của Bộ Y tế trong thời gian gần đây đã chỉ ra rằng, việc tự ý sử dụng thuốc kháng sinh của ngƣời dân Việt Nam ở thành thị là 88%, trong khi ở nông thôn lên tới 91%, không phải bệnh viện tuyến trung ƣơng sử dụng thuốc kháng sinh nhiều hơn các bệnh viện địa phƣơng. Mà ngƣợc lại, tỉ lệ sử dụng kháng sinh ở các bệnh 1 Đồ án tốt nghiệp viện tuyến trung ƣơng chỉ chiếm gần 30% chi phí điều trị trong khi các bệnh viện tuyến tỉnh là 35%, tuyến huyện là 45%, sự quan tâm đến y học cổ truyền đã tăng lên. Theo WHO đã đƣa ra cảnh báo đến năm 2050, tình trạng kháng thuốc kháng sinh có thể là nguyên nhân gây tử vong cho 10 triệu ngƣời trên toàn cầu. Đáng báo động hơn, trong số các quốc gia có tình trạng kháng thuốc kháng sinh nghiêm trọng thì Việt Nam là một trong số những nƣớc đứng đầu. Để tìm ra giải pháp cho vấn đề sản xuất thuốc kháng kháng sinh, thuốc chống nấm, chống oxy hóa đồng thời giảm chi phí trong sản xuất và tiêu dùng dƣợc liệu, các nhà khoa học bắt đầu tiềm kiếm và nghiên cứu các loài cây có chứa hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao để làm thuốc. Để làm đƣợc điều đó việc đầu tiên là cần phải xác định hoạt tính trị liệu và độc tính của một số loài thực vật trƣớc khi dùng làm thuốc là điều rất cần thiết. Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây Lan một lá (Nervilia aragoana)” nhằm nâng cao giá trị sử dụng và góp phần vào kho tàng cây thuốc đặc hữu của Việt Nam. 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc Tại Việt Nam vẫn chƣa tìm thấy tài liệu về nghiên cứu hoạt tính sinh học của loài cây Lan một lá, tuy nhiên ở một số nƣớc trên thế giới đã có những nghiên cứu liên quan đƣợc công bố: - Năm 2009, K. Himakar Reddy, P.V.G.K. Sharma, và cộng sự đã so sánh hoạt tính chống nấm và chống oxy hoá từ chiết xuất Ethyl acetate của toàn bộ cây Nervilia aragoana Gaud. (Orchidaceae) với chiết xuất Ethanol của Atlantica monophylla Linn. (Rutaceae) [21]. - Năm 2013, Elizabeth Thomas, Aneesh T. P, và cộng sự, đã nghiên cứu xác định thành phần hóa học có trong thân rễ của Nervilia aragoana bằng phƣơng pháp quang phổ [16]. - Năm 2013, Elizabeth Thomas và cộng sự đã nghiên cứu về đặc điểm, tác dụng dƣợc lý của cây Lan một lá [18]. 2 Đồ án tốt nghiệp - Năm 2013, EK Dilipkurma và GR Janardhana công bố kết quả nghiên cứu hoạt tính tái tạo tận, tuyến tụy và bình thƣờng hóa lƣợng đƣờng trong máu từ các chiết xuất Nervilia aragoana trên đối tƣợng chuột [15]. 3. Mục tiêu nghiên cứu - Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của cao chiết và các cao phân đoạn cây Nervilia aragoana. Xác định nồng độ ức chế 50% gốc tự do (IC50). - Khảo sát khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn cây Nervilia aragoana. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết và các cao phân đoạn cây Nervilia aragoana. 4. Nội dung nghiên cứu - Đánh giá ảnh hƣởng của phƣơng pháp tách chiết đến tỷ lệ thu hồi cao chiết cây Nervilia aragoana. Xác định hiệu suất chiết giữa các phƣơng pháp tách chiết. - Xác định tỷ lệ thu hồi các cao phân đoạn sau trích ly của cao chiết cây Nervilia aragoana. - Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bắt gốc tự do từ cao chiết và các cao phân đoạn cây Nervilia aragoana. Xác định nồng độ ức chế 50% gốc tự do (IC50) từ cao chiết và các cao phân đoạn cây Nervilia aragoana. - Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn cây Nervilia aragoana đối với các chủng vi khuẩn và nấm gây bệnh. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết và các cao phân đoạn cây Nervilia aragoana. 5. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 5.1 Đối tƣợng nghiên cứu Thực hiện nghiên cứu trên đối tƣợng cây Nervilia aragoana, tiến hành khảo sát các hoạt tính kháng oxy hóa, kháng khuẩn và kháng nấm từ cao chiết các cao phân đoạn của loài cây này. 5.2 Phạm vi nghiên cứu Mẫu cây Nervilia aragoana đƣợc tách chiết từ dung môi Ethanol sau khi thu cao chiết tiến hành trích ly cao chiết với các loại dung môi khác nhau từ kém phân 3 Đồ án tốt nghiệp cực đến phân mạnh: Petroleum ether, Ethyl acetate, nƣớc. Sau đó cao chiết và các cao phân đoạn thu đƣợc tiến hành khảo sát khả năng kháng oxy hóa bắt gốc tự do DPPH (1,1-dihenyl-2-picrylhydrazyl); khả năng kháng khuẩn trên các vi khuẩn gây bệnh: Escherichia coli, Staphylococcus aureus; khả năng kháng nấm trên các chủng nấm gây bệnh nhƣ: Fusarium solani, Aspergillus niger, Neoscytalidium dimidiatum. 4 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây Lan một lá (Nervilia aragoana) 1.1.1 Phân loại khoa học và phân bố 1.1.1.1 Phân loại khoa học Hệ thống phân loại của Nervilia aragoana [34] Kingdom Plantae Division Angiospermae Class Monocotyledoneae Order Asparagales Family Orchidaceae Subfamily Epidendroideae Tribe Gastrodieae Subtribe Nervilliinae Genus Nervilia Species Nervilia aragoana GAUD Nervilia bao gồm một số loài sau: Nervilia aragoana Commons ex Gaudich. (Trân châu xanh, Thanh thiên quỳ xanh), Nervilia fordii (Hance) Schltr. (Trân châu, Thanh thiên quỳ, Lan một lá, Lan cờ), Nervilia plicata (Andrews) Schltr. (Trân châu xếp, Thanh thiên quỳ lá xếp) [2], [35]. Một số tên gọi khoa học khác của Nervilia aragoana: Aplostellis aragoana (Gaudichaud-Beaupré) Ridley; Aplostellis flabelliformis (Lindley) Ridley; Epipactis carinata Roxburgh; Nervilia carinata (Roxburgh) Schlechter; Nervilia flabelliformis (Lindley) Tang & Wang; Nervilia scottii (Reichenbach f.) Schlechter; Nervilia tibetensis Rolfe; Nervilia yaeyamensis Hayata; Pogonia carinata (Roxburgh) Lindley; Pogonia gracilis Blume; Pogonia flabelliformis Lindley; Pogonia nervilia Blume; Pogonia scottii Reichenbach f. [36], [37], [38], [39]. 5 Đồ án tốt nghiệp 1.1.1.2 Phân bố N. aragoana là một loài hoa phong lan sống trên mặt đất (địa lan) đƣợc tìm thấy chủ yếu ở những khu rừng rậm rạp ẩm ƣớt ở Ấn Độ [40], [41]. Nó chủ yếu đƣợc tìm thấy trong các khu rừng của Darjeeling Himalaya trồng ở độ cao 400 – 1000 m [28]. Nó cũng đƣợc báo cáo là có trong dãy McIlwraith ở Queensland, Australia, từ độ cao 0 – 150 mét. Vì vậy cây chủ yếu đƣợc tìm thấy ở Ấn Độ, Malaysia, bắc Thái Lan, Lào, Miến Điện, Indonesia và New Guinea. Ở nƣớc ta Lan một lá mọc trên kẽ đá, nơi rợp vùng núi đá vôi và ở nơi ẩm vùng chân núi Cao Bằng, Lạng Sơn, Lào Cai, Hoà Bình, Ninh Bình. Cây chỉ mọc ở khe núi, nơi thấp và ẩm ƣớt, dƣới bóng cây to. Miền núi phía bắc gồm: Văn Uyên, Cao Lộc, Đồng Mỏ, Hữu Lũng, Trùng Kháng, Quảng Uyên (Cao Bằng). Gần đây xuất hiện tại các tỉnh: Lao Cai, Hà Giang, Tuyên Quang, Hà Tây, Hoà Bình, Sơn La, Lai Châu Loài cây này cho ra hoa quả vào khoảng độ tháng 3 – 6. Thu hái vào mùa thu, rửa sạch, phơi khô, vò nhẹ rồi phơi lại. Phơi và vò ngày 2 – 3 lần cho tới khô hẳn. Cũng có thể thu hái toàn cây quanh năm, dùng tƣơi hay phơi khô. Hiện loài cây này đang bị suy giảm nghiêm trọng do chặt phá rừng hủy hoại nơi cƣ trú và nhất là đối tƣợng săn tìm khai thác "tuyệt diệt". Nervilia aragoana nằm trong danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 2) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 của Chính phủ để hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thƣơng mại. Vì vậy cần có biện pháp xây dựng khu bảo tồn và nhân giống Lan trong các vƣờn quốc gia và di chuyển một lƣợng cây sống có thể của loài này về khu vực bảo tồn và chăm sóc. 1.1.2 Đặc điểm thực vật [17] Cây thân thảo cao dƣới 20 cm, mọc ở đất, có củ chìm, thân rễ tròn to 15 mm, ra hoa và lá không đồng thời (cho ra hoa trƣớc rồi mới đến lá). Cuống lá cao 10 – 15 cm. Lá màu xanh, đôi khi có chấm màu tía sẫm, không có lông, dài 12 cm, rộng 16 cm, hình tim rất rộng, mép hơi lƣợn sóng, thùy gốc ít nhiều phủ lên nhau. Cụm hoa cao tới 30 cm, cán mang vài bẹ nhỏ, dài 1,5 cm, hẹp. Cuống và bầu dài 6 Đồ án tốt nghiệp 8 – 10 mm. Lá đài và cánh hoa hẹp, xoè, màu xanh nhợt, dài 2 – 2,5 cm. Môi ngắn hơn lá đài, màu trắng có các gân màu xanh hoặc tía nhạt; thùy bên nhỏ, hình tam giác, đứng, đỉnh xòe; thùy giữa hình trứng có mép cong, có lông ở trên gân. Cây mới tái sinh bằng chồi và hạt. Mọc rải rác trong rừng thƣa, ở độ cao 200 – 500 m. Hình 1.1. Ảnh Nervilia aragoana [42] 1.1.3 Thành phần hóa học Bhogaonkar và cộng sự cho biết thành phần hóa học của N. aragoana bằng cách sử dụng các xét nghiệm nhận dạng thông thƣờng. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng cây N. aragoana có chứa hợp chất alkaloids, flavonoid, triterpenoid, khoáng chất, acid amin. Lá của cây đƣợc báo cáo là chứa flavonoid, glycosid cyanogenic, terpenoid và tannin [25], [27]. Beena và Radhakrishnan cũng báo cáo các thành phần hóa học loài cây này bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC) các vết chất khác nhau đƣợc phát hiện có trong chiết xuất cao Methanolic của N. aragoana bằng cách soi đèn UV và phun thuốc thử hiện màu. Các tác giả cũng đã báo cáo về phân tích thành phần hóa học các chất chiết xuất từ thân, rễ và lá bằng các phƣơng pháp xác định thành phần hóa học khác nhau. Phân tích từ chiết xuất nƣớc của rễ đã cho thấy sự hiện diện của flavonoid, glycoside, sterol và tannin. Và phân tích từ chiết xuất nƣớc của lá cho thấy sự có mặt của flavonoids, glycosides và tannin. Họ cũng ghi nhận sự hiện diện của alkaloid có trong thành phần hóa học loài cây này [14]. 7 Đồ án tốt nghiệp Tohru và cộng sự đã báo cáo các acid béo khác nhau trong các chiết xuất khác nhau của toàn bộ cây khô. Các chiết xuất ether của toàn bộ cây đã đƣợc phân tích bởi GC – MS sau khi methyl hóa và báo cáo có chứa các acid béo nhƣ methyl palmitate, methyl lenolate và methyl lenolinate. Phần trung tính của chiết xuất ethereal đƣợc báo cáo chứa phytol, glyceride hỗn hợp, hai chất kết tinh tạo thành hỗn hợp các rƣợu triterpene. Hỗn hợp này đã đƣợc xác định có chứa cycloeucalenol acetate, dihydrocyclonervilol acetate, dihydrocycloeucalenol acetate (Sau khi acetyl hóa), hai triterpene cyclonervilol và cyclohomonervilol theo phân tích GC – MS [32]. Loài cây này cũng báo cáo có chứa 24 – Isopropenyl cholesterol [29]. Các chiết xuất methanolic đƣợc báo cáo là chứa một lƣợng lớn L – norelucine bằng cách so sánh trực tiếp với mẫu thực bằng phƣơng pháp phân tích acid amin. Phần hòa tan của chiết xuất methanolic đƣợc báo cáo có chứa hợp chất giống nhƣ chiết xuất ethereal [32]. Các cấu trúc hóa học thành phần hóa học đƣợc xác định có trong chiết xuất của N. aragoana báo cáo bởi Tohru Kikuchi đƣợc đƣa ra dƣới đây [32]: CH3 (CH2)3 (CH2 CH=CH)2 (CH2)7 COOCH3 Methyl linolate CH3 (CH2CH=CH)3 CH7 COOCH3 Methyl linolenate Phytol 8 Đồ án tốt nghiệp Cycloeucalenol acetate Dihydroeucalenol acetate Stigmasterol 1.1.4 Giá trị dược liệu Loài cây N. aragoana đã có nhiều sử dụng trong y học cổ truyền và cũng trong y học dân gian. Củ và lá là những phần chính đƣợc dùng làm thuốc [40]. Cây có tác dụng làm mát, thuốc lợi tiểu và thuốc bổ. Hữu ích trong chữa đau dạ dày, đau thắt 9 Đồ án tốt nghiệp ngực, đau thắt cổ, bệnh hoại tử [27]. Củ đƣợc sử dụng làm thuốc cho điều trị chứng động kinh, trong bệnh tiểu tiện, tiêu chảy và hen suyễn [40, 14]. Củ tƣơi đƣợc ... của tế bào. Ngoài ra vitamin C còn có khả năng tái tạo vitamin E dạng oxy hóa trở về dạng khử.  Những chất nhƣ acid uric huyết tƣơng, GSH ở dịch tế bào cũng có tính chất loại bỏ gốc tự do.  Phân tử β - caroten cũng có tính chất chống oxy hóa theo cơ chế nhận năng lƣợng kích thích của oxy đơn bội, biến oxy đơn bội thành oxy thƣờng và bản thân β - carotene trở thành dạng kích thích, sau đó trở về trạng thái bình thƣờng hoàn toàn bằng hiện tƣợng vật lý là năng lƣợng kích thích truyền cho các liên kết nội tạng dƣới dạng nhiệt. - Những protein khóa ion kim loại chuyển tiếp Ion sắt hoặc đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc tự do. Việc phức hóa các ion này, không để cho tồn tại ở trạng thái tự do sẽ làm mất khả năng xúc tác gốc. Trong cơ thể có nhiều protein có chức năng này. Khóa sắt transferin, lactoferin. Khóa đồng có ceruloplasmin. Cơ thể khỏe mạnh chỉ cần 30% lƣợng các protein đã đủ khóa tất cả sắt và đồng ở dạng phức, không có ion sắt, đồng tự do trong cơ thể. 1.3.2 Một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính kháng oxy hóa Hợp chất thiên nhiên là các sản phẩm hữu cơ của các quá trình trao đổi chất trong cơ thể sống. Ngành hóa học nghiên cứu tính chất và cấu trúc của các hợp chất thiên nhiên đƣợc gọi là hóa học các hợp chất thiên nhiên. Lịch sử các hợp chất thiên nhiên có từ xa xƣa. Ngành y học cổ truyền của nhiều nƣớc đã biết nhiều đến độc tính và tác dụng kháng oxy hoá của nhiều chất có nguồn gốc động thực vật. Các nhóm hợp chất có trong tự nhiên bao gồm: terpennoid, steroid, flavonoid, alkaloid.Chúng là sản phẩm của quá trình trao đổi thứ cấp. Các chất trao đổi thứ cấp đƣợc nghiên cứu nhiều do tác dụng dƣợc lý và các hoạt tính sinh học của chúng. 1.3.2.1 Flavonoid Đại cƣơng về flavonoid 26 Đồ án tốt nghiệp Flavonoit là những chất màu thực vật có cấu trúc cơ bản nhƣ sau: 2' 3' 8 1 O 2 7 4' 3 5' 6 6' 4 5 O Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3 – diphenylpropan, nghĩa là 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một dây có 3 carbon, nên thƣờng đƣợc gọi là C6 – C3 – C6. Thƣờng các flavonoid có mang một hoặc nhiều nhóm –OH ở vị trí 5 và 7 trên nhân A và ở vị trí 3, 4, 5 trên nhân B. Các flavonoid có thể hiện diện ở dạng tự do hoặc dạng glycoside. Các đƣờng thƣờng gặp nhất là đƣờng D – glucose, kế đó là D – galactose, L – rhamnose, L – arabinose, D – xylose, D – apiose và acid uronic [39]. Tại các vòng có liên kết với hay một vài nhóm hydroxyl tự do hay đã thay thế một phần. Vì vậy về bản chất chúng là những poliphenol có tính acid. Các poliphenol có thể phản ứng với nhau qua các nhóm OH để tạo thành phân tử phức tạp hơn hoặc có thể liên kết với các hợp chất khác trong cây nhƣ các đƣờng hoặc protein. Hoạt tính kháng oxy hóa của flavonoid [44] Flavonoid là một nhóm các hợp chất đƣợc gọi là “những ngƣời thợ sửa chữa sinh hóa của thiên nhiên” nhờ vào khả năng sửa chữa các phản ứng cơ thể chống lại các hợp chất khác trong các dị ứng nguyên, virus và các chất sinh ung thƣ. Các chất flavonoid là những chất oxy hóa chậm hay ngăn chặn quá trình oxy hóa do các gốc tự do, có thể là nguyên nhân làm cho tế bào hoạt động khác thƣờng. Các gốc tự do sinh ra trong quá trình trao đổi chất thƣờng là các gốc tự do nhƣ -OH, ROO- (là các yếu tố gây biến dị, huỷ hoại tế bào, ung thƣ, tăng nhanh sự lão hoá). Một trong những nhóm flavonoid thực vật hữu ích nhất là proanthocyanidins (còn đƣợc gọi là procyanidins). Nhóm này mang lại rất nhiều ích lợi cho sức khỏe. Mỗi proanthocyanidins liên kết với các loại proanthocyanidins khác. Một hỗn hợp gồm các proanthocyanidins liên kết với nhau dạng dime, trimepolime đƣợc gọi chung là procyanidolic oligomer, gọi tắt là PCO. 27 Đồ án tốt nghiệp Năm 1986, Jacques Masquelier là ngƣời khám phá ra các đặc tính chống ôxy hóa và thu dọn gốc tự do của PCO. Nhiều phƣơng pháp hiện đại và phức tạp đã chứng minh hoạt động bảo vệ mạch máu của PCO và tạo cơ sở vững chắc cho việc sử dụng PCO trong điều trị các bệnh lý mạch máu. Các phƣơng pháp này cho thấy PCO có khả năng: + Bắt giữ gốc tự do hydroxyl. + Bắt giữ lipide peroxide. + Làm chậm trễ đáng kể sự khởi đầu của quá trình peroxide hóa lipide. + Kìm giữ các phân tử sắt tự do, giúp ngăn chặn sự peroxide hóa lipide do sắt. + Ức chế sự sản sinh ra gốc tự do bằng cách ức chế không cạnh tranh men xanthin oxidase. + Ức chế sự tổn thƣơng do các enzyme (hyaluronidase, elastase,collagenase) có thể làm thoái hóa cấu trúc mô liên kết. - Các Flavonoid còn có khả năng tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng nhƣ những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hoá. Do đó, các chất flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hoá, thoái hoá gan, tổn thƣơng do bức xạ. 1.3.2.2 Terpenoid Đại cƣơng về terpennoid [45] Trong thiên nhiên, terpenoid chủ yếu có trong các loại thực vật. Chúng có vai trò quan trọng đối với cơ chế bảo vệ cũng nhƣ trong việc sinh sản của nhiều loại cây, vì phát ra mùi hƣơng và dẫn dụ côn trùng thụ phấn. Vào năm 1818 ngƣời ta đã tìm đƣợc một số hợp chất và xác định đƣợc rằng tỉ lệ nguyên tử C : H ở tinh dầu là 5 : 8. Tiếp thep đó là một số hợp chất hidrocacbon không no, không vòng hoặc có vòng đã đƣợc tách ra. Chúng có công thức tổng quát là (C5H8)n , (n ≥ 2) và đƣợc đặt tên là Terpen. Phân tử của các hợp chất này có các mạch nhánh là các nhóm CH3- xuất hiện một cách có chu kì trong mạch cacbon. 28 Đồ án tốt nghiệp Phân tử terpenoid có cấu tạo mạch hở hoặc mạch vòng và có chứa các liên kết đôi C=C . Cấu trúc của terpenoid đƣợc tạo thành do isoprene kết hợp với nhau theo kiểu “ đầu nối với đuôi”, hoặc đuôi nối với đuôi. Phân tử terpenoid có thể có 1 vòng hoặc nhiều vòng, có thể là vòng hở hay vòng kín và các liên kết phải tuân theo qui tắc isopren. Hoạt tính kháng oxy hóa của terpenoid Terpenoid có tác dụng chống viêm, chống lại sự hình thành các khối u và giúp giảm hàm lƣợng chất béo. Theo công bố của Mahato và công sự năm 1997 terpenoid đƣợc tìm thấy trong các loại thực vật thuộc nhóm bạch quả, ví dụ nhƣ hƣơng thảo (Rosemarinus officinalis) và nhân sâm (Panax ginseng) có tác dụng tăng cƣờng sức khỏe. Triterpene là một phân lớp của terpenoid và có độ dài mạch carbon là 30. Khối lƣợng phân tử khoảng từ 400 đến 600 kDa, triterpene có cấu trúc hóa học phức tạp và có khả năng bị oxy hóa cao. Nhiều loài cây có khả năng tổng hợp triterpene trong quá trình sinh trƣởng và phát triển. Một số có chứa nhiều triterpene trong nhựa, qua đó giúp các cây này chống lại các loại bệnh. Mặc dù có hàng trăm loại triterpene đã đƣợc phân lập từ rất nhiều loại thực vật khác nhau và phân nhóm này cũng đã cho thấy có rất nhiều tiềm năng nhƣng hiện nay có rất ít những ứng dụng của triterpene đƣợc sử dụng trong thực tế. 1.1.3 Các phương pháp xác định tác dụng chống oxi hóa 1.1.3.1 Phương pháp xác định hàm lượng MDA[4], [5], [20], [24] Có nhiều phƣơng pháp đƣợc dùng trong nghiên cứu quá trình peroxyd hóa lipid màng tế bào. Các phƣơng pháp này dựa trên: - Sự xác định các sản phẩm của quá trình peroxyd hóa lipid 29 Đồ án tốt nghiệp - Sự nhận biết các gốc tự do trong chuỗi phản ứng nhƣ đo phát quang sinh học đánh giá các gốc LOO hình thành, đo lƣợng các dien liên hợp hình thành. - Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của mô Hai nhóm 1 và 2 đơn giản và dễ thực hiện hơn so với nhóm 3, đặc biệt là phƣơng pháp xác định sản phẩm sinh ra trong quá trình peroxyd hóa lipid: malonyl dialdehyt (MDA), là sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxyd hóa lipid màng tế bào do đó đƣợc áp dụng rộng rãi trong thực tế. Phƣơng pháp sử dụng acid thiobarbituric thƣờng đƣợc áp dụng để xác định hàm lƣợng MDA trong tổ chức tế bào, từ đó đánh giá khả năng chống oxi hóa in vitro hoặc in vivo của chất nghiên cứu thể hiện qua việc làm giảm hàm lƣợng MDA. Nguyên tắc MDA đƣợc sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid, khi cho phản ứng với acid thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bƣớc sóng 532 nm. Phản ứng thực hiện ở môi trƣờng pH 2 – 3, nhiệt độ 90 – 100 °C trong vòng 10 – 15 phút. Đo cƣờng độ màu của phức suy ra lƣợng MDA có trong mẫu. 1.1.3.2 Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa Phƣơng pháp sử dụng DPPH [12] Marsden Blois là ngƣời đầu tiên đặt nền móng cho phƣơng pháp DPPH cách đây gần 50 năm (1958), ở thí nghiệm đầu tiên Blois đã thử hoạt tính chống oxi hóa của amino acid cystein bằng cách dùng DPPH chuẩn độ nó rồi đo độ hấp thu theo thời gian ở bƣớc sóng 517nm. Tên khoa học của DPPH là 1,1 diphenyl -2-picrylhydrazyl (2,2 diphenyl- picrylhydrazyl), là gốc tự do bền, màu tím, phân tử không bị dimer hóa nhƣ một số gốc tự do khác. 30 Đồ án tốt nghiệp O2N . N N NO2 O2N DPPH (1,1 – dihenyl – 2 – picrylhydrazyl) Khi DPPH phản ứng với chất có khả năng cho nguyên tử H, nó sẽ chuyển về dạng khử có màu vàng nhạt (màu của nhóm picryl). Phản ứng đƣợc thực hiện nhƣ sau: O N O2N 2 H . . + N N NO2 + RH N N NO2 R O2N O2N * Nguyên tắc Hoạt tính chống oxi hóa oxi hóa của một chất đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo phổ UV, sử dụng thuốc thử là DPPH. Phản ứng đƣợc tiến hành dựa theo trên nguyên lý: DPPH có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hòa hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cƣờng độ hấp phụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxi hóa đƣợc đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy so màu ở bƣớc sóng 517 nm. Phƣơng pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II (Iron chelating activity) [22] Ion sắt hoặc đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc tự do. Đánh giá khả năng phòng ngừa sinh ra các gốc tự do của chất nghiên cứu thể hiện qua sự khóa các ion kim loại chuyển tiếp vào dạng phức, không thể cho tồn tại ở trạng thái tự do, sẽ làm mất khả năng xúc tác gốc. Hoạt tính chống oxy hóa đƣợc thể hiện qua 31 Đồ án tốt nghiệp việc ngăn chặn sự tạo thành phức chất có màu giữa ion sắt II với 2,2’ – bipyridyl (thuốc thử ferrozine, đặc hiệu với ion sắt II) và đƣợc đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy so màu ở bƣớc sóng 562 nm. Phƣơng pháp đánh giá khả năng đánh bắt gốc superoxyd O2‾ (Superoxide scavenging) [23] Đánh giá khả năng phòng vệ loại bỏ các gốc tự do đã sinh ra của chất nghiên cứu qua việc ngăn chặn sự tạo thành gốc superoxyd O2‾. Gốc superoxyd đƣợc tạo thành trong phản ứng giữa xanthin và xanthin oxydase sẽ đƣợc định lƣợng bằng phƣơng pháp khử sử dụng nitroblue tetrazolium (NBT) cho phức chất có màu tím đƣợc đo quang ở bƣớc sóng λ = 550 nm. Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử đƣợc thể hiện qua việc làm giảm sự hình thành phức màu tím. Phƣơng pháp đánh giá khả năng đánh bắt peroxyhydro H2O2 (Hydrogen peroxide scavenging activity) [19] Hai tiểu phân O2‾ và H2O2 sinh ra từ các chuyển hóa trong cơ thể với nồng độ vô cùng thấp, dễ dàng bị loại bỏ và không độc hại cho cơ thể nhƣng nếu hiện diện ở 1 nồng độ cao (do stress oxy hóa) chúng có thể tạo ra O2, OH là những phân tử và gốc có khả năng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với các chất hữu cơ tạo ra các peroxyd và từ đó tạo ra nhiều sản phẩm độc hại cho tế bào. Hoạt tính chống oxy hóa và mẫu thử đƣợc thể hiện qua việc làm giảm lƣợng H2O2 đƣa đến làm giảm phản ứng màu giữa H2O2 và đỏ phenol (màu của đỏ phenol sẽ chuyển sang màu tím sau phản ứng với H2O2 trong sự hiện diện của enzyme peroxydase từ cải gia vị (horseradish). 1.4 Tổng quan về hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm 1.4.1 Khái niệm chung Theo Silva và Fernandes (2010), kháng khuẩn, kháng nấm thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật, có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng khuẩn, kháng nấm thƣờng có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở một nồng độ thƣờng rất nhỏ. 32 Đồ án tốt nghiệp Những tính chất này có thể phụ thuộc vào cấu trúc hóa học khác nhau nhƣ: alkaloid, tannin, flavonoid, tinh dầu 1.4.2 Cơ chế đối kháng - Ức chế quá trình tổn hợp vách tế bào (vỏ) của vi khuẩn, nấm. Do tác động lên quá trình tổng hợp vách nên làm cho vi sinh vật dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp suất thẩm thấu. - Ức chế chức năng của màng tế bào. Cơ chế làm mất chức năng của màng làm cho các phân tử có khối lƣợng lớn và các ion bị thoát ra ngoài. - Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein và lipid, quá trình tổng hợp acid nucleic. 1.4.3 Một số loài vi khuẩn, nấm gây bệnh thường gặp 1.4.3.1 Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) [1] Tụ cầu đã đƣợc R. Koch mô tả từ năm 1878. Sau đó, Pasteur (1880) và Ogston (1881) gọi vi khuẩn này là tụ cầu và xếp vào loài Staphylococcus. Đến năm 1884, Rosenbach nghiên cứu chi tiết về khả năng gây bệnh và xếp loại của tụ cầu. Tụ cầu có nhiểu loại: có loại gây bệnh, thƣờng gặp nhất là tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và có loại bình thƣờng sống trên da và niêm mạc, không gây bệnh. Tuy nhiên, trong một số điều kiện nhất định, loại không gây bệnh có thể trở nên gây bệnh. Ngoài ra, còn có những tụ cầu kỵ khí đôi khi cũng gây bệnh Đặc điểm Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus spp.) có hình cầu, đƣờng kính 0,8 – 1µm, đứng tụ lại với nhau thành từng đám nhƣ chùm nho, có thể đứng lẻ tẻ hoặc thành từng đôi hay thành từng chuỗingắn. Staphylococcus spp. là nhóm vi khuẩn Gram dƣơng, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi, không có vỏ, không di động, không sinh bào tử và có khả năng sinh nội độc tố. Chúng phát triển đƣợc trong điều kiện nhiệt độ và pH chênh lệch nhiều (nhiệt độ từ 100C – 450C). 33 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus Khả năng gây bệnh - Các bệnh ngoài da: trên mặt da có những vết xây xát, tụ cầu xuống tổ chức dƣới da gây các bệnh mụn nhọt, viêm da, đầu đinh, đinh râu - Nhiễm khuẩn huyết do tụ cầu: thƣờng xảy ra ở những ngƣời có sức đề kháng yếu hoặc trẻ em. Thƣờng mắc sau các nhiễm khuẩn địa phƣơng. Bệnh thƣờng nặng, có thể gây chết ngƣời hoặc có thể trở thành mạn tính gây nên viêm xƣơng, viêm khớp, viêm phổi, viêm cơ, - Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp tính: bệnh xảy ra nhanh, trầm trọng với các dấu hiệu nôn mữa dữ dội. 1.4.3.2 Trực khuẩn (Escherichia coli) [1] Đặc điểm E.coli là trực khuẩn Gram âm, hình que thẳng. Kích thƣớc dài, ngắn khác nhau trung bình từ 2 – 3 µm, rộng 0,5 µm; trong những điều kiện nuôi cấy không thích hợp (ví dụ trong môi trƣờng có kháng sinh) trực khuẩn có thể rất dài (6 – 8 µm). Rất ít chủng E.coli có vỏ, không sinh bào tử, hầu hết có lông và có khả năng di động. Trực khuẩn E. coli hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, có thể phát triển ở nhiệt độ từ 150C – 400C, phát triển thích hợp ở nhiệt độ 370C với pH = 7,2 –7,4; phát triển đƣợc ở pH = 5,5 – 8,0. 34 Đồ án tốt nghiệp Trong môi trƣờng lỏng, sau 4 – 5 giờ, E. coli đã làm đục nhẹ môi trƣờng, càng để lâu càng đục nhiều và sau vài ngày có thể có váng mỏng trên mặt môi trƣờng, để lâu vi khuẩn lắng xuống đáy ống. Trên môi trƣờng thạch thƣờng, sau 18 – 24 giờ, khuẩn lạc tròn, đều, bóng, không màu hay màu xám nhẹ, đƣờng kính 2 – 3 mm. Hình 1.3. E.coli quan sát dƣới kính hiển vi với kích thƣớc 2 µm Khả năng gây bệnh E.coli là nguyên nhân gây ra các bệnh ở ngƣời nhƣ tiêu chảy, gây viêm đƣờng tiêu hóa, tiết niệu, sinh dục, đƣờng mật, đƣờng hô hấp. Là một trong những nguyên nhân chính gây ra bệnh nhiễm khuẩn huyết, là căn nguyên thƣờng gặp trong bệnh viêm màng não, viêm phổi ở trẻ mới sinh.Nhƣng nhiễm khuẩn quan trọng nhất là viêm dạ dày ruột ở trẻ em. E.coli còn gặp trong nhiễm trùng ngoại khoa, nhiễm trùng trong bỏng. Trong các loại độc tố của E.coli, độc tố shiga là nguy hiểm nhất đƣợc biết đến trên ngƣời, làm hủy hoại các vi nhung mao hấp thu của tế bào biểu mô ruột. Nó xâm nhập vào tế bào biểu mô đại tràng, ức chế quá trình tổng hợp protein làm chết tế bào. Hậu quả là gây viêm đại tràng xuất huyết, gây tiêu chảy phân nhƣ máu. Những trƣờng hợp hoại tử nặng có thể gây thủng ruột. 35 Đồ án tốt nghiệp E.coli gây bệnh thực nghiệm: khả năng gây bệnh cho súc vật tƣơng đối thấp, phải cần một số lƣợng lớn vi khuẩn vào phúc mạc chuột nhắt hoặc đƣờng tĩnh mạch cho thỏ mới gây chết đƣợc súc vật. 1.4.3.2 Nấm mốc Aspergillus [7] Aspergillus là một trong những chi có tên lâu đời nhất của nấm. Đến năm 1926, Aspergillus đã trở thành một trong những nhóm nấm mốc nỗi tiếng và đƣợc nghiên cứu nhiều nhất. Cuối thế kỉ thứ 19, một số công trình nghiên cứu cho biết một số sản phẩm lên men của một số loài thuộc giống Aspergillus là acid hữu cơ nhƣ acid oxalic, acid citric...và do đó Aspergillus bắt đầu đƣợc chú ý nghiên cứu về nhiều mặt nhƣ: sinh hóa, lên men, phân loại. Đặc điểm Nấm mốc Aspergillus có hình dạng sợi, phân nhánh có vách ngăn (cấu tạo đa bào), không màu, màu nhạt hoặc trở nên nâu, nâu nhạt ở một số vùng nhất định của khuẩn lạc. Có bào tử đính (conidiophore). Bào tử đính phát triển thành từ tế bào rất dày ở bên trong hệ sợi nấm gọi là tế bào gốc (foot cell). Nó tạo thành sợi cuống dài và kết thúc khi tạo ra một cấu trúc phồng hình củ hành gọi là túi. Xung quanh túi là một hoặc hai cuống để đính bào tử gọi là cuống đính bào tử hay thể bình. Từ cuống đính bào tử ngoài cùng, bào tử đƣợc sinh ra, gọi là bào tử đính. 36 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.4. Nấm mốc Aspergillus Khả năng gây bệnh Nấm mốc Aspergillus là vi nấm không chỉ gây hại ở thực vật mà còn gây những bệnh nguy hiểm ở ngƣời. Sau đây là một số loài: - Aspergillus flavous – một loại nấm thuộc chi Aspergillus là tác một nhân gây bệnh viêm phổi, viêm giác mạc cho ngƣời. Nhiều chủng sản sinh ra độc tố aflatoxin – một hợp chất gây ung thƣ gan. - Aspergillus niger loài nấm này gây ra căn bệnh đƣợc gọi là mốc đen trên một số loại trái cây và rau quả nhƣ nho, hành tây, đậu phộng và là một chất gây ô nhiễm phổ biến của thực phẩm. Ngoài ra chúng còn là một trong những nguyên nhân phổ biến nhất của nhiếm trùng tai nấm, mà có thể gây đau thính lực và trong trƣờng hợp nghiêm trọng gây thiệt hại cho ống tai và màng tympanic. 1.4.3.3 Nấm sợi Fusarium [43] Đặc điểm Giống nấm này sinh trƣởng tốt trong điều kiện nhiệt độ ôn hòa đến lạnh, có ít nhất đến 100 loài. Trên thạch – khoai tây – dextrose, giống này tạo khuẩn lạc giống nhƣ bông và có màu trắng. Tuy nhiên, cũng có một số loài cho khuẩn lạc có màu đỏ, xanh hay vàng. Một vài loài có giai đoạn sinh sản hữu tính. Hệ bào tử đính tạo bởi giống này có kích thƣớc bé tí và đôi khi rất khó phát hiện. Có hai loại bào tử: bào tử lớn và bào tử bé. Loại bé thƣờng đƣợc tạo từ 1 – 2 tế bào bào tử có hình chữ nhật hay hình quả lê. Đa số các loài giống Fusarium tạo bào tử bé. Bào tử lớn có kích thƣớc lớn hơn, có dạng xuồng hay hình dấu phẩy, bào tử có nhiều vách ngăn đứng. Một số loài của Fusarium tạo chlamydospore (bào tử vách dày) có vách ngăn dày trong các hệ sợi, ở dạng đơn, dang chuỗi hoặc dạng chùm. Nhiều loài cũng sinh ra mycotoxin. Tất cả chúng đều không gây nhiễm trùng. 37 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.5. Nấm sợi Fusarium Khả năng gây bệnh Các bệnh héo Fusarium là vấn đề quan trọng ở Việt Nam. Những bệnh héo này do các dạng loài của F. oxysporum gây ra. Một vài dạng F. oxysporum cũng có thể gây thối dƣa hấu và củ khoai tây đã bị sâu hoặc dụng cụ gặt hái làm tổn thƣơng. Thối bắp ngô, chủ yếu do F. graminearum và F. verticillioides gây ra, ngày càng trở nên nghiêm trọng ở Việt Nam. Cả hai loài đều sản sinh độc tố nấm tồn tại trong hạt. Một số dạng Fusarium solani gây thối cổ rễ cây con họ đậu nhƣ đậu Hà Lan, đậu cô ve, và thối rễ ở các cây trƣởng thành. Các dạng khác có thể gây hại ở khu vực gốc thân cây lớn, nhƣ cây vải, bị yếu đi do yếu tố môi trƣờng làm stress và do các bệnh khác. Fusarium decemcellulare đã đƣợc phân lập từ cành nhãn bị thối ở miền bắc Việt Nam (theo L. Burgess, thông tin chƣa xuất bản) và từ cà phê ở Tỉnh Đắc Lắc. 1.4.3.4 Nấm Neoscytalidium dimidiatum [8] Đặc điểm Neoscytalidium dimidiatum thuộc ngành nấm túi (Ascomycota), Ascomyta có cơ thể sinh dƣỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp, có vách ngăn, một tế bào thƣờng có một nhân đôi khi có nhiều nhân, dạng chuyên hóa dạng sợi bắt đầu đứt đoạn ra tạo thành cơ thể đơn bào hình tròn, bầu dục chứa nhiều nhân hay một nhân. Vách tế bào cấu tạo bằng chitin hay glucan, đa số lại ký sinh gây bệnh trên thực vật, 38 Đồ án tốt nghiệp động vật, ngƣời gây nên những thiệt hại lớn. Ascomycota sinh sản sinh dƣỡng bằng sự chia đôi tế bào nảy chồi, đứt đoạn sợi nấm, bào tử áo, bào tử màng nhày, sinh sản vô tính bằng bào tử đính (conidia), và sinh sản hữu tính bằng bào tử túi. Các bào tử khác tính (+, -) sợi nấm đơn bội, phân nhánh thành sợi nấm hình thành các cặp cơ quan sinh sản, giao phối sinh chất, hình thành sợi sinh túi đa bào, sau đó phân chia nguyên nhiễm kết hợp thành nhân lƣỡng bội rồi giảm nhiễm tạo thành bào tử túi. Chu trình sống của Ascomycota gồm 3 giai đoạn: giai đoạn đơn bội, giai đoạn song hạch và giai đoạn lƣỡng bội, trong đó giai đoạn đơn bội chiếm ƣu thế. Một số Ascomycota hình thành quả thể trong đó có quả thể kín, quả thể mở lỗ và quả thể hở. Hình 1.6. Nấm Neoscytalidium dimidiatum Khả năng gây bệnh Theo báo cáo đầu tiên về nấm N. dimidiatum và N. novaehollandiae trên cây xoài tại Australia (J. D. Ray, T. Burgess, V. M. Lanoielet. 2010) N. dimidiatum là loài nấm có phạm vi phân bố và có nhiều ký chủ: cây dƣơng mại, hạt sẻ, sung, vả, cây có múi, chuối, mận, và nhiều cây trồng khác ở Mỹ. N. dimidiatum còn gây hại trên xoài và nhất là trên thanh long, chúng gây các triệu chứng nhƣ héo cành, chết mầm, thối, chảy gôm và làm cây chết. 39 Đồ án tốt nghiệp 1.4.4 Các phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm in vitro [28] Mục đích của việc thử nghiệm tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm in vitro là xác định thuốc nghiên cứu có tác dụng trên vi sinh vật nào và mức độ tác dụng in vitro nhƣ thế nào. Có nhiều phƣơng pháp nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm in vitro sau đây là một số phƣơng pháp chính: - Kỹ thuật định tính để thăm dò tác dụng trên vi sinh vật Nếu tiến hành thử định lƣợng tác dụng của dịch chiết trên tất cả các loài vi sinh vật sẽ mất nhiều thời gian mà có khi cũng không thu đƣợc kết quả mong muốn. Để giảm thiểu khối lƣợng công việc mà vẫn thu đƣợc kết quả, trƣớc hết thử định tính tác dụng của A trên tất cả loại vi sinh vật thử nghiệm. + Nếu thử định tính mà thấy dịch chiết không có tác dụng trên một loại vi khuẩn nào thì có thể kết luận ngay mà không phải thử định lƣợng. + Nếu thử định tính mà thấy dịch chiết có tác dụng trên loại vi sinh vật nào thì khi thử định lƣợng chỉ cần thử trên loại vi sinh vật đó. + Nếu thử định tính mà thấy dịch chiết có tác dụng trên nhiều trong số những loại vi sinh vật thử thì có thể phân tích, đánh giá xem dịch chiết có chiều hƣớng tác dụng trên vi khuẩn Gram dƣơng hay vi khuẩn Gram âm nhiều hơn, cũng nhƣ chiều hƣớng sử dụng dịch chiết để làm thuốc tác dụng trên loại vi sinh vật gây bệnh gì để đi sâu vào nghiên cứu có tính chất định lƣợng một số loại vi sinh vật nhất định. - Kỹ thuật dùng khoanh giấy trên môi trƣờng đặc Nguyên tắc của phƣơng pháp: xác định khả năng của thuốc đƣợc tẩm vào khoanh giấy, khuếch tán vào lớp thạch gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở xung quanh khoanh giấy tẩm thuốc. Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng của thuốc càng mạnh. - Kỹ thuật dùng ống trụ trên môi trƣờng đặc Cũng nhƣ kĩ thuật dùng khoanh giấy, nguyên tắc của phƣơng pháp là xác định khả năng của thuốc, cho vào trong ống trụ, khuếch tán vào lớp thạch, gây ức chế sự 40 Đồ án tốt nghiệp phát triển của vi khuẩn ở xung quanh ống trụ đựng thuốc. Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng thuốc càng mạnh. - Kỹ thuật dùng hệ nồng độ trong môi trƣờng lỏng Nguyên tắc: dùng hàng loạt ống nghiệm chứa môi trƣờng lỏng có chất dinh dƣỡng thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn định nghiên cứu. Thêm những nồng độ khác nhau của thuốc nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn vào các ống. Xác định nồng độ thấp nhất của thuốc ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Nồng độ này đƣợc gọi là nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: Minimal Inhibitory Concentration). Phƣơng pháp này còn đƣợc gọi là kĩ thuật hòa loãng 2 lần liên tiếp (Two – fold serial dilution) hoặc phƣơng pháp hệ nồng độ. - Kỹ thuật sinh tự ký Khi đã xác định đƣợc dịch chiết toàn phần của một cây dƣợc liệu có tác dụng kháng trên một loại vi sinh vật nào đó. Muốn xác định xem thành phần nào trong cây dƣợc liệu có tác dụng thì có thể phân lập ra một dạng chiết khác nhau rồi đem thử với vi sinh vật đó, ta sẽ biết đƣợc thành phần nào không có tác dụng, thành phần nào có tác dụng và mức độ tác dụng. Nhƣng để thăm dò nhanh hơn, ta có thể dùng phƣơng pháp sinh tự kí. 41 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu. 2.1.1 Thời gian nghiên cứu Đề tài nghiên cứu đƣợc thực hiện từ tháng 3 năm 2017 đến tháng 6 năm 2017. 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Viện Công nghệ Hóa Học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công Nghệ Tp. HCM. 2.2 Vật liệu nghiên cứu 2.2.1 Nguồn mẫu Mẫu cây Lan một lá (Nervilia aragoana) đƣợc thu hái tại tỉnh Kom Tum. 2.2.2 Vi sinh vật chỉ thị Vi sinh vật chỉ thị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là 2 chủng vi khuẩn đƣợc cung cấp bởi Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh (Escherichia coli, Staphylococcus aureus) và 3 chủng nấm đƣợc cung cấp bởi phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công Nghệ Tp. HCM (Fusarium solani, Neoscytalidium dimidiatum của TS. Nguyễn Thị Hai; Aspergillus niger của TS. Nguyễn Hoài Hƣơng). 2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 2.3.1 Thiết bị - Autoclave (Huxky Đài Loan) - Tủ ủ 370C (Memmert mermany) - Máy ly tâm (Tuttligen Germany) - Máy đo UV – VIS (Hach) - Cân phân tích (Orbital Germany) - Bếp từ (Billy – England) - Máy chƣng cất nƣớc (Branstead USA) - Máy cô quay chân không (IKA RV 10 digital V) - Tủ sấy (Memmert mermany) 42 Đồ án tốt nghiệp - Bộ chiết Soxhlet - Tủ cấy an toàn sinh học 2.3.2 Dụng cụ - Đĩa petri nhựa, thủy tinh 9cm - D ụ ng c ụ đục lỗ (d= 6 mm) - Ống đong 100 ml, 250 ml, 500 ml - Thƣớc đo - Ống nghiệm lớn, nhỏ - Bông thấm và bông không thấm nƣớc - Becher 100 ml, 250 ml, 500 ml - Đũa thuỷ tinh - Pipet 1 ml, 2ml, 5ml, 10 ml, 20ml - Micropipette 100 µl, 1000 µl - Pipet pasteur thủy tinh - Đầu típ 100 µl, 1000 µl - Ống ly tâm ependoff 2 ml - Đèn cồn - Bình môi trƣờng 250 ml, 500 ml, 1000 - Các loại dụng cụ khác nhƣ: bao chịu ml nhiệt, kéo, giấy giói, kẹp gấp, muỗng, - Que cấy trang dao, thun,... - Bình tam giác 100 ml 2.3.3 Hóa chất - Môi trƣờng nuôi cấy: TSA, TSB, PDA. - Dung môi: Entanol, Metanol, Chloroform, Ethyl acetate, Petroleum ether, Dimethylsulfoxid (DMSO) (Trung Quốc), Nƣớc cất. - DPPH. - Vitamin C tinh khiết, Ampicilin 500mg (Việt Nam), Ketoconazole 200mg (Việt Nam). - H2SO4 đậm đặc, glyxerol. 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu Mẫu cây đƣợc thu hái một lƣợng lớn toàn bộ các bộ phận rễ, thân, lá, sau khi thu hái về đƣợc tiến hành rửa sạch với nƣớc, để ráo, làm khô bằng cách sấy mẫu ở nhiệt độ 400C. Mẫu cây sau khi sấy khô đƣợc tiến hành xay nghiền thành dạng bột. Lƣợng mẫu đã xay mịn thu đƣợc sẽ đƣợc bảo quản ở nhiệt độ phòng. 43 Đồ án tốt nghiệp Hình 2.1. Mẫu bột N. aragoana 2.4.2 Phương pháp tách chiết và thu nhận cao chiết Mẫu bột cây đƣợc chiết tách và thu nhận cao chiết bằng 2 phƣơng pháp: chiết ngâm dầm và chiết Soxhlet 2.4.2.1 Phương pháp chiết ngâm dầm Nguyên tắc Sử dụng phƣơng pháp chiết ngâm dầm, mẫu thực vật đƣợc ngâm trong lƣợng lớn dung môi (w/v) ở khoảng thời gian nhất định để các chất tan trong mẫu hòa tan vào dung môi. Tiến hành + Tiến hành ngâm a (g) mẫu bột N. aragoana với dung môi Ethanol theo tỷ lệ 1 : 20 (w/v) trong bình erlen thủy tinh đậy kính tránh sự bay hơi của dung môi. Bình ngâm mẫu đƣợc đặt trên máy lắc, quá trình đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ để dung môi có thể xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. + Sau đó, dung dịch chiết sẽ đƣợc lọc chân không bằng giấy lọc, thu riêng dịch chiết, phần bã bột mẫu cây đƣợc tiếp tục cho thêm lƣợng dung môi mới vào và tiến hành chiết nhiều lần cho đến khi dịch lọc thu đƣợc có màu trong suốt. Phần dịch chiết thu đƣợc cô đặc, thu hồi cao chiết bằng phƣơng pháp cô quay chân không ở 700C. Cao chiết đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 40C để thực hiện cho các thí nghiệm tiếp theo. 44 Đồ án tốt nghiệp Tỷ lệ thu hồi cao đƣợc tính theo công thức sau: (%) Trong đó TLTH_ND: tỷ lệ thu hồi cao thu đƣợc (%) a1: khối lƣợng bình cô quay chứa cao chiết (g) a2: khối lƣợng bình cô quay ban đầu (g) a: khối lƣợng mẫu bột ban đầu dùng để ngâm với dung môi (g) 2.4.2.2 Phương pháp chiết bằng máy Soxhlet Nguyên tắc Chiết Soxhlet là một kiểu chiết liên tục đƣợc thực hiện nhờ cấu tạo đặc biệt của dụng cụ chiết. Bản chất của quá trình chiết là tuân theo định luật phân bố chất trong hai pha không trộn lẫn vào nhau. Trong đó pha rắn nằm trong mẫu sẽ đƣợc hòa tan bởi pha lỏng gọi chung là dung môi. Tiến hành + Mẫu bột N. aragoana chứa m (g) đƣợc cho vào các túi lọc nhỏ, mỗi túi chứa khoảng 5g bột cây sau đó đặt trực tiế...ạt tính kháng đƣợc chủng S.aureus. 3.4.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn cây N. aragoana Kết quả khảo sát hoạt tính kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn cây N. aragoana đối với chủng vi khuẩn Aspergillus niger Hoạt tính kháng nấm đƣợc tiến hành khảo sát từ cao chiết và các cao phân đoạn gồm: Cao chiết Enthanol, cao PE, cao nƣớc ở nồng độ 200 mg/ml trên chủng 70 Đồ án tốt nghiệp nấm gây bệnh Aspergillus niger. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần, tiến hành theo phần trình bày ở thí nghiệm 4. Kết quả khảo sát đƣợc thể hiện ở Hình 3.10. 30 c 25 20 15 b 10 5 Đƣờng kính vòng kháng (mm) khángkính vòng Đƣờng a a 0 Cao Ethanol Cao nƣớc Cao PE Ketoconazole Hình 3.10. Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng nấm của cao chiết, cao phân đoạn và đối chứng thuốc Ketoconazole đối với chủng nấm Aspergillus niger Từ kết quả thể hiện trên Hình 3.10 có thể nhận thấy rằng chỉ cao chiết Ethanol thể hiện khả năng kháng với đƣờng kính vòng kháng là 11,5 mm. Riêng cao PE và cao nƣớc có phổ kháng hẹp không kháng đƣợc chủng nấm này. Chủng vi sinh vật này rất nhạy cảm với thuốc Ketoconazole ở nồng độ 10 mg/ml với đƣờng kính vòng kháng là 24,16 mm. Khi so sánh khả năng ức chế của các cao chiết với thuốc chống nấm Ketoconazole, nhận thấy cao chiết Ethanol mặt dù có phổ kháng nhỏ hơn nhƣng cũng thể hiện đƣợc hoạt tính kháng đối với chủng Aspergillus niger. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn cây N. aragoana đối với chủng vi khuẩn Fusarium solani Tiến hành khảo sát khả năng kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn gồm: Cao chiết Enthanol, cao PE, cao nƣớc ở nồng độ 200 mg/ml trên chủng nấm gây bệnh Fusarium solani. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần, tiến hành theo phần trình bày ở thí nghiệm 4. Kết quả khảo sát đƣợc thể hiện ở Hình 3.11. 71 Đồ án tốt nghiệp 30 c 25 c 20 b 15 10 5 Đƣờng kính vòng kháng (mm) khángkính vòng Đƣờng a 0 Cao Ethanol Cao nƣớc Cao PE Ketoconazole Hình 3.11. Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng nấm của cao chiết, cao phân đoạn và đối chứng thuốc Ketoconazole đối với chủng nấm Fusarium solani Dựa vào kết quả trên Hình 3.11 nhận thấy rằng cao chiết Ethanol và cao nƣớc có khả năng ức chế đƣợc chủng nấm Fusarium solani với đƣờng kính vòng kháng trung bình lần lƣợt là 22,33 mm và 16 mm. Ở cao chiết Ethanol thể hiện khả năng kháng tốt nhất với đƣờng kính vòng kháng là 22,33 mm, tiếp theo là cao nƣớc với đƣờng kính vòng kháng 16 mm, cao PE có phổ kháng hẹp không kháng đƣợc chủng nấm này. Chủng vi sinh vật này khá nhạy cảm với thuốc kháng sinh ở nồng độ 10 mg/ml với đƣờng kính vòng kháng là 23,33 mm. Khi so sánh khả năng ức chế của các cao chiết Ethanol với thuốc chống nấm Ketoconazole, nhận thấy cao chiết Ethanol có phổ kháng và hoạt tính kháng nấm tƣơng đƣơng, không có sự khác biệt về phƣơng diện thống kê (p < 0,05). Cao nƣớc mặc dù phổ kháng nhỏ hơn so với mẫu đối chứng nhƣng cũng thể hiện đƣợc hoạt tính kháng đƣợc chủng Fusarium solani. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn cây N. aragoana đối với chủng nấm Neoscytalidium dimidiatum Hoạt tính kháng nấm đƣợc tiến hành khảo sát từ cao chiết và các cao phân đoạn gồm: Cao chiết Enthanol, cao PE, cao nƣớc ở nồng độ 200 mg/ml trên chủng 72 Đồ án tốt nghiệp nấm gây bệnh Neoscytalidium dimidiatum. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần, tiến hành theo phần trình bày ở thí nghiệm 4. Kết quả khảo sát đƣợc thể hiện ở Hình 3.12. 30 c 25 b 20 a a 15 10 5 Đƣờng kính vòng kháng (mm) khángkính vòng Đƣờng 0 Cao Ethanol Cao nƣớc Cao PE Ketoconazole Hình 3.12. Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng nấm của cao chiết, cao phân đoạn và đối chứng thuốc Ketoconazole đối với chủng nấm Neoscytalidium dimidiatum Kết quả thể hiện ở Hình 3.12 cho thấy hoạt tính kháng nấm của các loại cao chiết có phổ hoạt động rộng khi đều kháng chủng nấm khảo sát với đƣờng kính vòng kháng từ 14,67 mm – 24 mm. Ở cao nƣớc thể hiện hoạt tính kháng nấm tốt nhất với đƣờng kính vòng kháng trung bình 23 mm, tiếp theo là cao chiết Ethanol với đƣờng kính vòng kháng trung bình 19 mm, cao PE có đƣờng kính vòng kháng thấp hơn các cao còn lại với đƣờng kính vòng kháng là 14,67 mm. Chủng vi sinh vật này khá nhạy cảm với thuốc chống nấm ở nồng độ 10 mg/ml với đƣờng kính vòng kháng là 14,33 mm. Khi so sánh khả năng ức chế của các cao chiết với thuốc chống nấm Ketoconazole, nhận thấy cao nƣớc và cao Ethanol có phổ kháng cao hơn thuốc Ketoconazole. Bên cạnh đó cao PE có phổ kháng tƣơng đƣơng với thuốc Ketoconazole, không có sự khác biệt về phƣơng diện thống kê (p < 0,05). Điều này cho thấy cao chiết và cao phân đoạn cây N. aragoana đều thể hiện đƣợc hoạt tính kháng tốt đối với chủng Neoscytalidium dimidiatum. 73 Đồ án tốt nghiệp Kết quả so sánh hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn đối với 5 chủng vi sinh vậy gây bệnh Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Aspergillus niger, Fusarium solani, Neoscytalidium dimidiatum. Sau khi tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây N. aragoana ở nồng độ 200 mg/ml trên 5 chủng vi sinh vật gây bệnh Escherichia coli và Staphylococcus aureus, Aspergillus niger, Fusarium solani, Neoscytalidium dimidiatum kết quả so sánh đƣờng kính vòng ức chế của 3 loại cao chiết đƣợc trình bày ở Bảng 3.6. Bảng 3.6. Kết quả so sánh hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn đối với 5 chủng vi sinh vậy gây bệnh Mẫu thử Chủng vi sinh vật Đối chứng Cao Ethanol Cao PE Cao nƣớc Escherichia coli 15,16 ± 0,28c 11,16 ± 0,28a 12,33 ± 0,28b 31,16 ± 0,28d Staphylococcus aureus 18,00 ± 0.86c 11,67 ± 0,28a 13,16 ± 0,28b 18,16 ± 0,57c Aspergillus niger 11,50 ± 0,50b - - 24,16 ± 3,40c Fusarium solani 22,33 ± 1,52c - 16,00 ± 0,00b 23,33 ± 0,57c Neoscytalidium dimidiatum 19,00 ± 0,00b 14,67 ± 0,57a 24,00 ± 1,00c 14, 33 ± 0,57a Qua kết quả thể hiện ở Bảng 3.6 có thể kết luận rằng cao chiết và cao phân đoạn cây N. aragoana ở nồng độ 200 mg/ml có phổ hoạt động và hoạt tính kháng khuẩn khác nhau trên 5 chủng vi sinh gây bệnh. Trong đó, cao chiết Ethanol có khả năng ức chế tốt với cả 5 chủng vi sinh vật khảo sát so với các dung môi còn lại. Tất cả các kết quả nhận đƣợc cho thấy, cao chiết Ethanol có khả năng ức chế đƣợc 5/5 chủng vi khuẩn gây bệnh khảo sát với đƣờng kính vòng kháng từ 15,16 mm – 22,33 mm. Riêng với chủng nấm Neoscytalidium dimidiatum khi so sánh với đối chứng, cao chiết ở nồng độ 200 mg/ml có phổ kháng cao hơn thuốc Ketoconazole (10 mg/ml). 74 Đồ án tốt nghiệp Cao nƣớc, có phổ kháng đƣợc 4/5 chủng vi sinh vật khảo sát. Cao chiết PE kháng đƣợc 3/5 chủng vi sinh vật khảo sát, nhƣng lại có hoạt tính kháng thấp hơn cao Ethanol và cao nƣớc khi chỉ kháng tốt đối với chủng Escherichia ecoli, Staphylococcus aureus. Từ các kết quả khảo sát thu đƣợc ở những thí nghiệm trên cho thấy, ở cao chiết Ethanol ban đầu các hợp chất hóa học đều tập trung nên sẽ có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm tốt nhất. Riêng đối với hai cao chiết phân đoạn là cao nƣớc và cao PE, khi so sánh 2 cao chiết này về độ phân cực thì các hợp chất hóa học phân cực mạnh nằm trong cao nƣớc sẽ có hoạt tính kháng các chủng vi sinh vật cao hơn so với các hợp chất hóa học phân cực yếu nằm trong cao PE. Trong nghiên cứu của K. Himakar Reddy cộng sự (2010), cao chiết Ethanol từ cây N. aragoana cũng cho thấy hoạt tính kháng chủng nấm Aspergillus niger ở nồng độ 5 mg/ml với đƣờng kính vòng kháng là 12 mm. Trên cơ sở thực nghiệm trên, tiến hành xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với 5 chủng vi sinh vật gây bệnh từ các cao chiết và cao phân đoạn của cây N. aragoana. 3.5 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết và các cao phân đoạn đối với các chủng vi sinh vật gây bệnh Trên cơ sở các kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của cao chiết và cao phân đoạn của cây N. aragoana, tiến hành thí nghiệm khảo sát xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết và các cao phân đoạn đối với 5 chủng vi sinh vật bệnh theo phần trình bày tiến hành ở thí nghiệm 5, thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết và các cao phân đoạn đối với 5 chủng vi sinh vật gây bệnh đƣợc trình bày ở Bảng 3.7. 75 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.7. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết và các cao phân đoạn đối với 5 chủng vi sinh vật gây bệnh Cao chiết Vi sinh vật khảo sát MIC (mg/ml) Cao Ethanol Escherichia coli 12,5 Staphylococcus aureus 12,5 Aspergillus niger 50 Fusarium solani 50 Neoscytalidium dimidiatum 25 Cao PE Escherichia coli 25 Staphylococcus aureus 25 Aspergillus niger 200 Fusarium solani 200 Neoscytalidium dimidiatum 25 Cao nƣớc Escherichia coli 12,5 Staphylococcus aureus 12,5 Aspergillus niger 200 Fusarium solani 50 Neoscytalidium dimidiatum 25 Dựa vào Bảng 3.7 có thể nhận thấy rằng nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết Ethanol đối với 5 chủng vi sinh gây bệnh biến động từ 12,5 mg/ml đến 50 mg/ml. Giá trị MIC của cao chiết Ethanol đối với nhóm vi khuẩn là 12,5 mg/ml, còn với 2 chủng nấm Aspergillus niger và Fusarium solani giá trị MIC là 50 mg/ml, riêng chủng nấm Neoscytalidium dimidiatum có giá trị MIC là 25 mg/ml. Giá trị MIC của cao nƣớc biến động cao hơn so với cao chiết Ethanol trong khoảng từ 12,5 – 200 mg/ml. Đối với nhóm vi khuẩn gây bệnh E. coli và S. aureus là 12,5 mg/ml. Còn ở các chủng nấm gây bệnh khác nhau giá trị MIC không giống nhau, kết quả giá trị MIC lần lƣợt là 200 mg/ml, 50 mg/ml, 25 mg/ml tƣơng ứng với 3 chủng Aspergillus niger, Fusarium solani, Neoscytalidium dimidiatum. 76 Đồ án tốt nghiệp Cao PE có giá trị MIC là 25 mg/ml đối với 3 chủng vi sinh vật gây bệnh E. coli, S. areus và chủng nấm Neoscytalidium dimidiatum. Trong khảo sát giá trị nồng độ ức chế tối thiểu MIC của cao PE đối với 2 chủng nấm Aspergillus niger và Fusarium solani thì giá trị MIC là 200 mg/ml. Escherichia coli và Staphylococcus areus là chủng vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột và bệnh cơ hội trên da nguy hiểm ở ngƣời, các chủng vi khuẩn này nhạy cảm với kháng sinh Ampicillin ở nồng độ 10 mg/ml đồng thời chúng bị ức chế bởi cao chiết Ethanol và cao nƣớc với nồng độ tối thiểu là 12,5 mg/ml. Điều này cho thấy cao chiết Ethanol và cao nƣớc có khả năng kháng tốt đối với 2 chủng vi khuẩn trên. Trong nghiên cứu của K. Himakar Reddy cộng sự (2010) giá trị MIC từ cao chiết Ethanol cây Nervillia aragoana đối với chủng nấm Aspergillus niger là 1,2 mg/ml. Kết quả trong nghiên cứu này cho giá trị MIC của cao chiết Ethanol là (50 mg/ml) thấp hơn so với nghiên cứu của K. Himakar Reddy cộng sự (2010) trên cùng một chủng nấm chỉ thị khảo sát. Nguyên nhân ảnh hƣởng đến sự khác biệt giá trị MIC có thể do sử dụng phƣơng pháp khác nhau và nhiều yếu tố môi trƣờng sống loài cây Nervilia aragoana. Từ kết quả xác định giá trị MIC trong thí nghiệm, có thể kết luận rằng cao chiết và cao phân đoạn của cây Nervilia aragoana có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm khá mạnh trên 5 chủng vi khuẩn gây bệnh và thể hiện ở giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) ở mức trung bình. Điều này có ý nghĩa lớn trong việc lựa chọn một số hoạt chất kháng khuẩn, kháng nấm từ thực vật nhằm thay thế các loại thuốc kháng sinh và tránh hiện tƣợng kháng lại kháng sinh của các chủng vi sinh vật gây bệnh nguy hiểm cho con ngƣời. 77 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua thời gian thực hiện đề tài, các kết quả nghiên cứu thu đƣợc nhƣ sau: - Tách chiết và thu đƣợc cao chiết từ hai phƣơng pháp khác nhau, trong đó phƣơng pháp chiết Soxhlet cho tỷ thu hồi cao chiết cao hơn so với phƣơng pháp chiết ngâm dầm. - Trích ly thu đƣợc 3 cao phân đoạn từ phân cực yếu đến phân cực mạnh lần lƣợt là: Cao PE, cao EA, cao nƣớc. - Đánh giá đƣợc hoạt tính kháng oxy hóa, kháng khuẩn và kháng nấm cao chiết và các cao phân đoạn từ cây Nervilia aragoana. Ở phần khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm, cao chiết Ethanol ban đầu luôn cho hoạt tính kháng cao hơn các cao phân đoạn, riêng phần khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa, cao EA có nồng độ ức chế 50% gốc tự do là 127 µg/ml cao nhất so với cao chiết Ethanol và các cao phân đoạn còn lại. Tuy nhiên do mẫu ban đầu khối lƣợng quá ít, sau quá trình trích ly thu các cao phân đoạn, cao EA cho tỷ lệ thu hồi cao rất thấp chỉ đủ tiến hành khảo sát ở phần đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa. - Xác định đƣợc nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây Nervilia aragoana đối với 5 chủng vi sinh gây bệnh. Với cao Ethanol giá trị MIC từ 5 chủng vi sinh vật gây bệnh lần lƣợt là: E. coli 12,5 mg/ml; S. aureus 12,5 mg/ml; Aspergillus niger 50 mg/ml; Fusarium solani 50 mg/ml; Neoscytalidium dimidiatum 25 mg/ml. Đối với cao PE giá trị MIC từ 5 chủng vi sinh vật gây bệnh lần lƣợt là: E. coli 25 mg/ml; S. aureus 25 mg/ml; Aspergillus niger 200 mg/ml; Fusarium solani 200 mg/ml; Neoscytalidium dimidiatum 25 mg/ml. Còn với cao nƣớc giá trị MIC từ 5 chủng vi sinh vật gây bệnh lần lƣợt là: E. coli 12,5 mg/ml; S. aureus 12,5 mg/ml; Aspergillus niger 200 mg/ml; Fusarium solani 50 mg/ml; Neoscytalidium dimidiatum 25 mg/ml. Từ các kết quả khảo sát ban đầu về hoạt tính sinh học của cây Nervilia aragoana, nhận thấy rằng đây là một loại thảo dƣợc có hoạt tính sinh học tƣơng đối cao. Tuy ở cao chiết Ethanol đƣợc thu hồi bằng phƣơng pháp chiết Soxhlet cho tỷ lệ 78 Đồ án tốt nghiệp thu hồi cao tốt nhất trong 2 phƣơng pháp khảo sát nhƣng do quá trình chiết xuất thực hiện ở nhiệt độ 1000C cao dẫn đến nhiều khả năng các hợp chất hóa học kém bền nhiệt đã bị biến tính, vì thế trong các khảo sát hoạt tính sinh học về sau thực hiện ở cao chiết Ethanol thu đƣợc từ phƣơng pháp ngâm dầm. Cao chiết và cao phân đoạn thu đƣợc từ phƣơng pháp ngâm dầm cho hoạt tính oxy hóa, và kháng vi sinh vật khá tốt, đặt biệt là cao chiết Ethanol và cao phân đoạn nƣớc chứa nhiều hợp chất hóa học mang tính phân cực mạnh nên thể hiện khả năng kháng tốt hơn so với cao phân đoạn PE mang các hợp chất hóa học phân cực kém. 4.2 Kiến nghị Trong thời gian ngắn thực hiện đề tài này, các kết quả thu đƣợc chỉ là những kết quả khảo sát bƣớc đầu. Cần có những nghiên cứu sâu hơn về: - Định tính một số hợp chất hóa học có trong các cao phân đoạn. Tiến hành tinh chế xác định thành phần hóa học bằng các phƣơng pháp nhƣ: sắc kí cột, sắc kí cột lỏng cao áp (HPLC). - Đánh giá khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn đối với nhiều chủng vi sinh vật khác. - Tiến hành nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm thử nghiệm trên động vật. 79 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Bộ Y tế, Vụ Khoa học – Đào tạo (2001). “Vi sinh vật học”, Nhà xuất bản Y học Hà Nội. [2] Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học. [3] Nguyễn Thƣợng Dong và cộng sự (2006). “Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ dược thảo”, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. [4] Trần Văn Hiền, Tạ Thị Phong, Trần Lê Dung, Nguyễn Thị Minh Thu, Trần Công Khánh (1999). "Thử thuốc độc tính cấp diễn và tác dụng bảo vệ tế bào gan của cây Xuân Hoa", Tạp chí Dƣợc học, số 9, tr. 15 – 17. [5] Nguyen Thi Thu Huong, Kino Matsumoto, Ryoji Kasai, Kazuo Yamasali, Hiroshi Wantanabe (1998). "Invitro antioxidant activity of Vietnamese ginseng saponin and its components", Biol. Pharm. Bull. 21, 278 – 298. [6] Trần Hùng và cộng sự (2013), “Phương pháp nghiên cứu dược liệu”, NXB Đại học Y dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh, tr. 118 – 126 [7] Nguyễn Đức Lƣợng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006). “Thí nghiệm vi sinh vật học”, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, tr. 50 – 54. [8] Lý Phƣơng Ngà (2014). “Nghiên cứu xác định nấm gây bệnh loét trên cây thanh long”, Đồ án tốt nghiệp, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. [9] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007). Các phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. [10] Nguyễn Quang Thƣờng (1999). “Stress oxy hóa”, Tạp chí Dƣợc học số 9, tr. 21 – 22. [11] Nguyễn Quang Thƣờng. “Gốc tự do của oxy trong Y và Dược”, Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội, Bộ môn Hóa lý vô cơ (Tủ sách sau đại học). 80 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO NƢỚC NGOÀI [12] Amaraowiez R., Pegg. R P., Rahimi – Moghaddam P., Barl B., Weil J. A (2004). "Free radical scavenging capacity and antioxidant activity of selected plant species from the canadian praries", Food Chemistry, 84, 551 – 562. [13] Arjun Prasad Tiwari, Bhavana Joshi and A. A. Ansari, Less Known Ethnomedicinal Uses of Some Orchids by the Tribal inhabitants of Amarkantak Plateau Madhya Pradesh, India. Nature and Science 2012, 10: 12, 33- 37. [14] Beena C., Radhakrishnan V.V., Bioprospecting on the endangered medicinal plant Nervilia aragoana gaud, Journal of Progressive Agriculture, 2011. [15] EK Dilipkurma, GR Janardhana (2013), “Antidiabetic and regenerative effects of alcoholic corm extract Nervilia aragoana Gaud. in Streptozoto – nicotinamide induced NIDDM rats”. International Journal of Phytomedicine 5, pp. 207 – 210. [16] Elizabeth Thomas, Aneesh T. P, Della Grace Thomas, R. Anandan (2013), “GC-MS analysis of phytochemial compounds present in the rhizomes Of Nervilia aragoana Gaud”. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, Vol. 6. [17] Elizabeth Thomas, Aneesh T. P, Della Grace Thomas (2013), “Nervilia aragoana Gaud, a terrestrial Orchid, Amrita Vishwa Vidyapeetham University, India. [18] Elizabeth Thomas, Aneesh T. P, Della Grace Thomas (2013), “Nervilia aragoana Gaud, a terrestrial Orchid”. Indo-Global Research Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 3. [19] Hisashi Hosoe, Toshihiko Kaise, Kenji Ohmori (2002). “Effect on the reactive oxygen species of Erdosteine and its metabolite in vitro”, Arzneim Forsch Drug Res, 52, 435 – 440. [20] Kaori Yobimoto, Kinzo Matsumoto, Nguyen Thi Thu Huong, Ryoji Kasai, Kazuo Yamasali, Hiroshi Wantanabe (2000). "Suppressive effects of Vietnamese ginseng saponin and its major component majonoside – R2 on psychological stress 81 Đồ án tốt nghiệp – induced enhancement of lipid peroxidation in the mouse brain". Pharamocology Biochemistry and Behavior, 66, 1661 – 1667. [21] K. Himakar Reddy, P.V.G.K. Sharma, and O.V.S. Reddy (2009), “A comparative in vitrostudy on antifungal and antioxidant activities of Nervilia aragoana and Atlantia monophylla”, Pharmaceutical Biology, Vol. 48, pp. 595– 602. [22] Lapenna, D. Ciofani, G. Festi, D. Neri, M. Pierdomenico, SD. Giamberardino, MA. Cuccurullo, F. (2002). “Antioxidant properties of ursooxycholic acid”, Biochem Pharmacol, 64, 1661 – 1667. [23] Lee, SM, Na, MK, An, RB, BS, HK (2003). “Antioxidant activity of two phloroglucinol derivatives from Dryopteris crassirhizoma”, Biol Pharm Bull, 26, 1354 – 1356. [24] Matsumoto, K. Yobimoto, K. Huong, NT. Abdel – Fattah, M. Van, HT. Wantanabe (1999). "Psychological stress – induced enhancement of brain lipid peroxidation via nitric oxide systems and its modulation by anxiolytic and anxiogenic drugs in mice". Brain Res, 839, 74 – 84. [25] M. Maridass, M. I. Zahir and G. Raju, Phytochemical Survey of Orchids in the Tirunelveli Hills of South India, Ethnobotanical Leaflets, 2008, 12, 705- 12. [26] P. Ramesh, Renganathan and C. Mani, Medicinal uses of some epiphytic and terrestrial Orchids, Int. J. Cur. Tr. Res., 2012, 1: 1, 13-16. [27] P. Y. Bhogaonkar and V. D. Devankar, Pharmacognostic Studies on Padmacarini, Aryavaidyan, Nov. 2006- Jan. 2007, 20, No. 2, 74-79. [28] Rajendra Yonzone, D. Lama, R. B. Bhujel and Samuel Rai. (2012), Orchid species diversity of Darjeeling Himalaya of India, International Journal of Pharmacy [29] Shigetoshi Kadota, Takehiko Shima and Tohru Kikochi, Studies on the Constituents of Orchidaceous Plants. VII. the C24 Stereochemistry of Cyclohomonervilol and 24-Isopropenylcholesterol, Nonconventional Sidechain 82 Đồ án tốt nghiệp and Triterpene and Sterol, from Nervilia purpurea Schlechter. Chem. Pharm. Bull, 1987, 35: 1, 200-210 .and Life Sciences, pp. 1533-1550. [30] Sies, (1986). “Biochemistry of oxidative stress”, 25 : 1058 – 1071. [31] S. Y. Kamble, S. R. Patil, P. S. Sawant, Sangita Sawant, S. G. Pawar and E. A. Singh, Studies on Plants used in traditional medicine by Bhilla tribe of Maharashtra, Indian Journal of Traditional Knowledge, July 2010, 9: 3, 591-598. [32] Tohru Kikuchi, Shigetoshi Kadota, Sayaka Hanagaki, Hisashi Suehara, Tsuneo Namba, Chun-Ching Linn and Woei Song Kan, Studies on the Constituents of Orchidaceous Plants. 1. Constituents of Nervilia purpurea SCHLECHTER and Nervilia aragoana GAUD.Pharmaceutical Society of Japan, Chem. Pharm. Bull, 1981, 29: 7, 2073-2078. TÀI LIỆU THAM KHẢO INTERNET [33] NeMedPlant A Database of medicinal plants from northeast india Result.php?g=Nagaland. [34] https://vi.wikipedia.org/wiki/Nervilia_aragoana [35] &id=2528:lan-tran-chau&catid=17:bien-kho&Itemid=36. [36] Prof Summer's Web Garden [37] Australian tropical rainforest orchids [38] Catalogue of life, china 2012 annual checklist. [39] Discover Life. [40] Ayurvedic medicinal plants [41] Envis centre on medicinal plants. [42] 83 Đồ án tốt nghiệp [43] https://duongsinhnucuoixanh.wordpress.com/2013/09/27/cay-mot-la-thanh- thien-quy. [44] [45] 84 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA BẮT GỐC TỰ DO DPPH CỦA CAO CHIẾT VÀ CÁC CAO PHÂN ĐOẠN TỪ CÂY N. ARAGOANA 1. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bắt gốc tự do DPPH của cao chiết Ethanol từ cây N. aragoana Giá trị OD 517 nm của mẫu đối chứng lặp lại 3 lần kết quả lần lƣợt là: 1,541 – 1,547 – 1,544. Nồng độ OD 517 nm I (%) IC50 (µg/ml) (µg/ml) 1000 0,224 0,222 0,225 85,65 85,43 85,46 400 0,510 0,530 0,500 65,74 67,62 66,90 350 0,591 0,590 0,593 61,86 61,60 61,65 162,26 300 0,636 0,634 0,637 59,02 58,74 58,73 250 0,682 0,681 0,685 55,98 55,63 55,74 200 0,726 0,725 0,726 53,14 52,98 52,89 2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bắt gốc tự do DPPH của cao phân đoạn PE từ cây N. aragoana Giá trị OD 517 nm của mẫu đối chứng lặp lại 3 lần kết quả lần lƣợt là: 1,515 – 1,510 – 1,513. 1 Đồ án tốt nghiệp Nồng độ OD 517 nm I (%) IC50 (µg/ml) (µg/ml) 1000 0,535 0,532 0,533 64,69 64,77 64,77 400 0,773 0,770 0,774 48,98 49,01 48,84 350 0,810 0,812 0,814 46,53 46,23 46,20 419,40 300 0,852 0,853 0,855 43,76 43,51 43,49 250 0,891 0,890 0,894 41,19 41,01 40,91 200 0,934 0,933 0,935 38,35 38,21 38,20 3. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bắt gốc tự do DPPH của cao phân đoạn EA từ cây N. aragoana Giá trị OD 517 nm của mẫu đối chứng lặp lại 3 lần kết quả lần lƣợt là: 1,551 – 1,552 – 1,550. Nồng độ OD 517 nm I (%) IC50 (µg/ml) (µg/ml) 1000 0,278 0,279 0,276 82,08 82,02 82,19 400 0,504 0,507 0,504 67,50 67,33 67,48 350 0,565 0,566 0,563 63,57 63,53 63,67 127,35 300 0,601 0,604 0,602 61,25 61,08 61,16 250 0,653 0,657 0,655 57,90 57,67 57,74 200 0,707 0,705 0,702 54,42 54,57 54,70 4. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bắt gốc tự do DPPH của cao phân đoạn nƣớc từ cây N. aragoana Giá trị OD 517 nm của mẫu đối chứng lặp lại 3 lần kết quả lần lƣợt là: 1,556 – 1,559 – 1,554. 2 Đồ án tốt nghiệp Nồng độ OD 517 nm I (%) IC50 (µg/ml) (µg/ml) 1000 0,253 0,255 0,251 83,74 83,64 83,85 400 0,572 0,575 0,57 63,24 63,12 63,32 350 0,616 0,617 0,614 60,41 60,42 60,49 173,55 300 0,658 0,659 0,655 57,71 57,73 57,85 250 0,702 0705 0,701 54,88 54,79 54,89 200 0,759 0,761 0,758 51,22 51,19 51,22 5. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bắt gốc tự do DPPH của mẫu Vitamin C Giá trị OD 517 nm của mẫu đối chứng lặp lại 3 lần kết quả lần lƣợt là: 1,557 – 1,559 – 1,553. Nồng độ OD 517 nm I (%) IC50 (µg/ml) (µg/ml) 30 0,212 0,215 0,213 86,38 86,21 86,28 25 0,376 0,379 0,375 75,85 75,69 75,85 20 0,543 0,544 0,545 65,16 65,11 64,91 15,68 15 0,767 0,768 0,764 50,74 50,74 50,80 10 1,078 1,076 1,077 30,76 30,98 30,65 3 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM CỦA CAO CHIẾT VÀ CÁC CAO PHÂN ĐOẠN CÂY N. ARAGOANA 1. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết, các cao phân đoạn cây N. aragoana (nồng độ 200 mg/ml) và kháng sinh Ampicillin (10 mg/ml) đối với 2 chủng vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus Vi khuẩn Cao Ethanol Cao PE Cao nƣớc Ampicillin (10 mg/ml) E. coli 15 15 15,5 11 11 11,5 12 12,5 12,5 31 31,5 31 S. aureus 18,5 18,5 17 11,5 12 11,5 13 13 13,5 18 18,5 18,5 2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng nấm của cao chiết, các cao phân đoạn cây N. aragoana (nồng độ 200 mg/ml) và Ketoconazole (10 mg/ml) đối với 3 chủng nấm Aspergillus niger, Fusarium solani, Neoscytalidium dimidiatum. Vi nấm Cao Ethanol Cao PE Cao nƣớc Ketoconazole (10 mg/ml) Aspergillus niger 12 11,5 11 - - - - - - 28 23 21,5 Fusarium solani 22 24 21 - - - 16 16 16 24 23 23 Neoscytalidium 19 19 19 15 15 14 23 24 25 15 14 14 dimidiatum 4 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU THỐNG KÊ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM CỦA CAO CHIẾT VÀ CÁC CAO PHÂN ĐOẠN TỪ CÂY N. ARAGOANA ĐỐI VỚI CÁC CHỦNG VI KHUẨN, NẤM GÂY BỆNH 1. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây N. aragoana đối với vi khuẩn Escherichia coli Bảng One – Way ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 777.063 3 259.021 3108.25 0.0000 Within groups 0.666667 8 0.0833333 Total (Corr.) 777.729 11 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Mẫu thử Count Mean Homogeneous Groups Cao PE 3 11.1667 X Cao nƣớc 3 12.3333 X Cao Ethanol 3 15.1667 X Ampicillin 3 31.1667 X 5 Đồ án tốt nghiệp 2. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây N. aragoana đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus Bảng One – Way ANOVA Source Sum of Squares Df Mean F-Ratio P-Value Square Between groups 99.75 3 33.25 106.40 0.0000 Within groups 2.5 8 0.3125 Total (Corr.) 102.25 11 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Mẫu thử Count Mean Homogeneous Groups Cao PE 3 11.6667 X Cao nƣớc 3 13.1667 X Cao Ethanol 3 18.0 X Ampicillin 3 18.1667 X 3. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây N. aragoana đối với chủng nấm Aspergillus niger Bảng One – Way ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between 1194.75 3 398.25 134.62 0.0000 groups Within groups 23.6667 8 2.95833 Total (Corr.) 1218.42 11 6 Đồ án tốt nghiệp Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Mẫu thử Count Mean Homogeneous Groups Cao PE 3 0.0 X Cao nƣớc 3 0.0 X Cao Ethanol 3 11.5 X Ketoconazole 3 24.1667 X 4. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây N. aragoana đối với chủng nấm Fusarium solani Bảng One – Way ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between 1045.58 3 348.528 522.79 0.0000 groups Within groups 5.33333 8 0.666667 Total (Corr.) 1050.92 11 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Mẫu thử Count Mean Homogeneous Groups Cao PE 3 0.0 X Cao nƣớc 3 16.0 X Cao Ethanol 3 22.3333 X Ketoconazole 3 23.3333 X 7 Đồ án tốt nghiệp 5. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây N. aragoana đối với chủng nấm Neoscytalidium dimidiatum Bảng One – Way ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 184.667 3 61.5556 147.73 0.0000 Within groups 3.33333 8 0.416667 Total (Corr.) 188.0 11 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Mẫu thử Count Mean Homogeneous Groups Ketoconazole 3 14.3333 X Cao PE 3 14.6667 X Cao Ethanol 3 19.0 X Cao nƣớc 3 24.0 X 8 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC D: HÌNH ẢNH VÒNG KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG NẤM CỦA CAO CHIẾT VÀ CAO PHÂN ĐOẠN TỪ CÂY N. ARAGOANA 1. Hình ảnh vòng kháng khuẩn của chiết và các cao phân đoạn từ cây N. aragoana đối với chủng Escherichia coli Hình a. Vòng kháng khuẩn của cao chiết, các cao phân đoạn và đối chứng kháng sinh Ampicillin đối với vi khuẩn Escherichia coli 2. Hình ảnh vòng kháng khuẩn của chiết và các cao phân đoạn từ cây N. aragoana đối với chủng Staphylococcus aureus Hình b. Vòng kháng khuẩn của cao chiết, các cao phân đoạn và đối chứng kháng sinh Ampicillin đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus 9 Đồ án tốt nghiệp 3. Hình ảnh vòng kháng nấm của chiết và các cao phân đoạn từ cây N. aragoana đối với chủng Aspergillus niger Hình c. Vòng kháng nấm của cao chiết Ethanol và đối chứng thuốc Ketoconazole đối với chủng nấm Aspergillus niger 4. Hình ảnh vòng kháng nấm của chiết và các cao phân đoạn từ cây N. aragoana đối với chủng Fusarium solani Hình d. Vòng kháng nấm của cao chiết Ethanol, cao nƣớc và đối chứng thuốc Ketoconazole đối với chủng nấm Fusarium solani 10 Đồ án tốt nghiệp 5. Hình ảnh vòng kháng nấm của chiết và các cao phân đoạn từ cây N. aragoana đối với chủng Neoscytalidium dimidiatum Hình e. Vòng kháng nấm của cao chiết, các cao phân đoạn và đối chứng thuốc Ketoconazole đối với chủng nấm Neoscytalidium dimidiatum 11