Đồ án Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô dược (lindera myrrha)

tài này là công trình nghiên cứu của riêng người thực hiện đề tài dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hoàng Dũng và Ths. Lê Quỳnh Loan. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực. Mọi tài liệu tham khảo dùng trong đề tài này đều được trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên công trình, thời gian, địa điểm công bố. Tất cả nội dung, sao chép không hợp lệ, vi phạm quy chế đào tạo, không trung thực, người thực hiện đề tài xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. TP. Hồ Chí Minh, Ngày 18 tháng 7 năm 2017 Sinh viên thực hiện Võ Thị Thuận i Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Lời đầu tiên em xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, Ban chủ nhiệm bộ môn Công nghệ sinh học cùng thầy, cô bộ môn Công nghệ sinh học trường Đại học Công Nghệ TP.HCM đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu và kĩ năng để em hoàn thành tốt quá trình học tập, hoàn thành khóa luận này và làm nền tảng chuẩn bị cho công việc sau này. Trong suốt khoảng thời gian làm đề tài tốt nghiệp tại phòng Vi sinh - Viện Sinh học Nhiệt đới. Em xin chân thành gửi lời cám ơn đến: TS. Hoàng Quốc Khánh, trưởng phòng vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, Thầy đã tạo cho em được làm đề tài tại đây. TS. Nguyễn Hoàng Dũng đã gợi ý đề tài, tận tình hướng dẫn chi tiết công việc, luôn theo sát chỉ dẫn, động viên em, hỗ trợ kinh phí suốt quá trình làm khóa luận. ThS. Lê Quỳnh Loan đã hướng dẫn tận tình, giúp đỡ và hỗ trợ em trong suốt thời gian làm đề tài tốt nghiệp. Thầy Ngô Đức Duy đã tạo điều kiện, hỗ trợ em làm đề tài tốt nghiệp. Em xin chân thàh cám ơn cô Nguyễn Hoài Hương, phòng Vi sinh, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại học Công Nghệ TP. HCM đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình nhận đề tài. Cám ơn tập thể lớp 13DSH02 đã cùng em trao đổi, cùng nhau học tập trong suốt bốn năm tại trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, cám ơn tập thể phòng Vi sinh – Viện Sinh học Nhiệt đới đã động viên và hết lòng giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Cuối cùng, con gửi lời cám ơn sâu sắc đến Ba Mẹ đã sinh ra và nuôi dạy con, cám ơn anh chị trong gia đình luôn bên cạnh động viên em trong suốt quá trình học tập và trưởng thành. ii Đồ án tốt nghiệp Vì kiến thức bản thân còn hạn chế, trong quá trình nghiên cứu, hoàn thiện đề tài này em không tránh khỏi những sai sót, kính mong nhận được những ý kiến đóng góp từ phía quý Thầy Cô. Tp. Hồ Chí Minh, Ngày 18 tháng 7 năm 2017 Sinh viên thực hiện Võ Thị Thuận iii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC CAM ĐOAN ...................................................................................................... i LỜI CÁM ƠN ................................................................................................... ii MỤC LỤC ....................................................................................................... iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................... vii DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................ viii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ..................................................................... ix MỞ ĐẦU ............................................................................................................1 1. Đặt vấn đề1 2. Tình hình nghiên cứu...2 3. Mục đích nghiên cứu...3 4. Nhiệm vụ nghiên cứu...3 5. Phương pháp nghiên cứu.4 6. Kết quả đạt được..4 7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài.5 8. Kết cấu Đồ án tốt nghiệp.....5 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................6 1.1. Giới thiệu chung về chi Lindera (Họ Lauraceae) ............................6 iv Đồ án tốt nghiệp 1.1.1. Chi Lindera (Họ Lauraceae) ...........................................................6 1.1.2. Nghiên cứu về thành phần hoá học .................................................8 1.2. Tổng quan về cây ô dƣợc ..................................................................9 1.2.1. Phân loại khoa học ..........................................................................9 1.2.2. Đặc điểm thực vật .........................................................................10 1.2.3. Thành phần hoá học ......................................................................12 1.2.4. Công dụng theo y học dân gian .....................................................12 1.3. Tổng quan về quá trình tổng hợp sắc tố da ..................................12 1.3.1. Ảnh hưởng của tia cực tím (UV) trên người .................................12 1.3.2. Melanin .........................................................................................14 1.3.3. Vai trò của melanin .......................................................................15 1.3.4. Phân loại melanin ..........................................................................16 1.3.5. Con đường tổng hợp hoá học melanin ..........................................17 1.3.6. Các lại bênh liên quan đến sắc tố ..................................................19 1.3.7. Một số hoạt chất ức chế quá trình tổng hợp melanin ....................22 1.4. Tổng quan về chiết xuất dƣợc liệu .................................................27 1.4.1. Chiết xuất dược liệu ......................................................................27 1.4.2. Phương pháp chiết xuất .................................................................29 1.4.3. Phương pháp Soxhlet ....................................................................31 1.5. Hoạt tính kháng oxy hoá ................................................................31 1.5.1. Khái niệm về gốc tự do .................................................................31 1.5.2. Phương pháp nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá .......................33 1.6. Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ..................................................37 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............39 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..................................................39 2.2. Vật liệu nghiên cứu .........................................................................39 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................39 2.2.2. Dụng cụ - Thiết bị .........................................................................39 2.2.3. Hoá chất ........................................................................................39 v Đồ án tốt nghiệp 2.3. Quy trình thực hiện .........................................................................40 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................41 2.4.1. Phương pháp thu và xử lý mẫu .....................................................41 2.4.2. Quy trình chiết và thu nhận cao chiết ...........................................41 2.4.3. Phương pháp xác định thành phần hoá học ..................................43 2.4.4. Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do (DPPH assay) .........47 2.4.5. Phương pháp nuôi cấy tế bào (B16F10) .......................................49 2.4.6. Phương pháp xác định độc tính .....................................................49 2.4.7. Phương pháp xác định hàm lượng melanin ..................................49 2.4.8. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ............................50 2.4.9. Xử lý số liệu ..................................................................................51 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................52 3.1. Kết quả thu nhận cao tổng methanol ô dƣợc................................52 3.2. Định tính thành phần cao tổng methanol ô dƣợc .........................53 3.3. Kết quả hoạt tính kháng oxy hoá của cao tổng methanol ô dƣợc ..54 3.4. Khảo sát tác dụng của ô dƣợc lên độc tính của tế bào u sắc tố B16F10... 56 3.5. Khảo sát tác dụng của ô dƣợc lên quá trình tổng hợp melanin ..57 3.6. Kết quả chiết và thu nhận cao phân đoạn ....................................58 3.7. Kết quả định tính thành phần hoá học cao phân đoạn ...............59 3.8. Kết quả hoạt tính kháng oxy hoá cao chiết phân đoạn ...............61 3.9. Khảo sát tác dụng của phân đoạn cao lên độc tính và ức chế melanin của tế bào u sắc tố B16F10 ................................................................63 3.10. Kết quả xác định thành phần hoá học bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .............................................................................64 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................67 4.1. Kết luận ............................................................................................67 4.2. Đề nghị ..............................................................................................68 vi Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DHICA 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid DHI 5,6-dihydroxyindole DHICA 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid DMSO Dimethyl sulfoxide DOPA 3,4-dihydroxyphenylalanine DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl HPLC High Pressure Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) IC50 Half maximal Inhibitory Concentration (Nồng độ của một chất mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do, tế bào hoặc enzyme) MTT 3-(4,5- dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide PIH Post-inflammatory hyperpigmentation TRP-1 DHICA oxidation TRP-2 DOPA chrome tautomerase vii Đồ án tốt nghiệp UV Ultraviolet (Tia cực tím). DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Dung môi khác nhau dung trong chiết xuất các nhóm hoạt chất trong dược liệu. ...................................................................................................................28 Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cao tổng methanol ô dược ...................................................................................................................................53 Bảng 3.2. Kết quả xác định thành phần hoá học các mẫu cao phân đoạn ô dược ...59 viii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Lindera ....................................................8 Hình 1.2. Một số hợp chất Sesquiterpenoids được xác định trong chi Lindera ........8 Hình 1.3. Một số hợp chất alkaloids được xác định trong chi Lindera .....................9 Hình 1.4. Cây ô dược ...............................................................................................11 Hình 1.5. Cấu trúc phân tử melanin (1,3,5-triazine-2,4,6-triamine) .......................14 Hình 1.6. Cấu tạo của da .........................................................................................14 Hình 1.7. Công thức hoá học của các loại melanin. ................................................17 Hình 1.8. Hai nhóm chính của melanin. ..................................................................17 Hình 1.9. Sơ đồ các con đường tổng hợp melanin ..................................................18 Hình 1.10. Các bệnh da tăng sắc tố. ........................................................................20 Hình 1.11. Các bệnh giảm sắc tố. ............................................................................21 Hình 1.12. Hydroquinone ........................................................................................23 Hình 1.13. Niacinamide (Vitamin B3) ....................................................................23 Hình 1.14. Arbutin (4-Hydroxyphenyl-α-D-glucopyranoside) ...............................24 Hình 1.15. Azelaic acid ...........................................................................................25 Hình 1.16. Kojic acid ...............................................................................................26 Hình 1.17. Vitamin C ..............................................................................................26 Hình 1.18. Một số hợp chất ức chế quá trình tổng hợp melanin .............................27 ix Đồ án tốt nghiệp Hình 1.19. Bình ngấm kiệt ......................................................................................30 Hình 1.20. Dụng cụ chiết Soxhlet ...........................................................................31 Hình 1.21. DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) ................................................34 Hình 1.22. Phản ứng của DPPH (gốc tự do) thành DPPH (không có gốc tự do)....35 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình và phương pháp thực hiện .............................................41 Hình 2.2. Quy trình xử lý mẫu ...............................................................................41 Hình 2.3. Phản ứng của DPPH (gốc tự do) thành DPPH (không có gốc tự do)......47 Hình 2.4. Sơ đồ điều kiện chạy sắc ký HPLC. ........................................................51 Hình 3.1. Mẫu ô dược ..............................................................................................52 Hình 3.2. Mẫu được chiết ngâm dầm với dung môi Methanol và mẫu cao thu được. ...................................................................................................................................53 Hình 3.3. Đồ thị thể hiện khả năng kháng oxy hóa của ..........................................55 Hình 3.4. Tác dụng của cao methanol ô dược lên độc tính tế bào. .........................56 Hình 3.6. Tác dụng của cao methanol ô dược lên quá trình tổng hợp melanin. .....57 Hình 3.5. Tế bào B16F10 melanoma thu nhận sau khi xử lý với cao methanol ô dược ...........................................................................................................................57 Hình 3.7. Biểu đồ thể hiện hiệu suất thu hồi (%) của các cao phân đoạn ô dược ...59 Hình 3.8. Đồ thị thể hiện khả năng chống oxi hóa của các cao dịch chiết. .............61 Hình 3.9. Biểu đồ thể hiện giá trị IC50 của các phân đoạn cao ô dược ....................62 Hình 3.10. Tác dụng của phân đoạn cao lên độc tính và ức chế melanin của tế bào u sắc tố B16F10 .........................................................................................................63 Hình 3.12. Phổ HPLC dịch cao chiết phân đoạn ethyl acetate ô dược....................65 Hình 3.11. Phổ HPLC dịch cao chiết methanol ô dược ..........................................65 x Đồ án tốt nghiệp xi Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Melanin là một hợp chất phenolic sinh học cao phân tử có vai trò quan trọng trong việc tạo nên sắc tố da ở người. Các hắc tố (melanin) trong da được sản xuất bởi tế bào hắc tố nằm trong lớp nền của biểu mô. Trong tế bào hắc tố, melanin được tổng hợp trong một bào quan đặc biệt gọi là melanosome. Melanosome chứa nhiều enzyme cần thiết cho quá trình tổng hợp melanin. Tuy nhiên, việc gia tăng lượng melanin tổng hợp ở biểu mô sẽ gây ra hiện tượng đen da hoặc một số bệnh về da như: nám da, tàn nhang và tăng sắc tố sau viêm do melanin được tích luỹ vượt mức ở biểu mô. Những biểu hiện bên ngoài của những bệnh này có thể có tác động mạnh đến tâm lý người bệnh cũng như làm giảm các hoạt động xã hội, hiệu quả trong công việc hay tự kỷ. Do đó, có rất nhiều nghiên cứu được tiến hành và rất nhiều hoạt chất làm trắng da đang được sàng lọc. Tuy nhiên, tại nhiều quốc gia, các chất làm trắng da như hydroquinone, corticosteroids, các hợp chất chứa thủy ngân vẫn còn được sử dụng bất chấp tác dụng nguy hại của chúng. Một số chất khác như arbutin, kojic acid, vitamin C cũng đươc sử dụng nhưng những chất này có nhược điểm là hiệu quả không cao hoặc không bền. Thế giới thực vật là nguồn tài nguyên phong phú và vô cùng quý giá về những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học. Không chỉ các nước phương Đông mà các nước phương Tây cũng tiêu thụ một lượng rất lớn dược liệu. Nhiều hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học tốt đã được phân lập và đưa vào sử dụng với mục đích chữa bệnh và làm đẹp. Xu hướng đi sâu nghiên cứu và tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học tốt từ các loài thực vật làm mỹ phẩm đang ngày càng thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học bởi ưu điểm của chúng là những hợp chất có thể ức chế quá trình tổng hợp melanin nhưng không gây chết cho tế bào và có nguồn gốc thiên nhiên độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể hơn so với các dược phẩm tổng hợp. 1 Đồ án tốt nghiệp Việt Nam là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có hệ thực vật đa dạng và phong phú. Theo thông kê “Tiếp cận các nguồn gen và chia sẻ lợi ích” của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Thế giới (IUCN) thì nước ta có khoảng gần 13.000 loài thực vật bậc cao trong đó có khoảng hơn 4.000 loài được sử dụng làm thuốc. Trước kia, các cây thuốc dân gian đóng vai trò quan trọng trong việc chữa bệnh cho con người. Ngày nay, các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học được phân lập từ thực vật đã được nghiên cứu và ứng dụng trực tiếp làm các chất dẫn đường cho một loạt các hợp chất ứng dụng mới trong các ngành công nghiệp như chữa bệnh, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm v.v Do đó, việc tiếp tục nghiên cứu tính chất và tác dụng của các hợp chất thiên nhiên vẫn đang là nhiệm vụ của rất nhiều nha khoa học. Trong thế giới thực vật muôn màu, đa dạng, cây ô dược (Lindera myrrha Merr) là một loài thuộc chi Lindera, họ Long não (Lauraceae) được sử dụng để trị bệnh một số bệnh trong y học cổ truyền như: đau bụng, nôn mửa, trị tiểu nhiều lần hoặc đái dầm, trị chứng rối loạn tiêu hóa ăn không tiêu, và một số bệnh khác. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của loài này đã chỉ ra sự có mặt của các lớp chất alkaloid, tinh dầuNhiều hoạt chất trong số đó đã thể hiện nhiều hoạt tính sinh học tốt như: Borneol, Linderane, Linderalactone. Tuy nhiên, khả năng kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố của ô dược chưa được nghiên cứu chuyên sâu. Do vậy, đề tài “Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố từ loài ô dƣợc (Lindera myrrha Merr)” được thực hiện để tiến hành kiểm tra khả năng ức chế quá trình tổng hợp melanin từ ô dược. 2. Tình hình nghiên cứu  Tình hình nghiên cứu trên thế giới Cho đến nay, những nghiên cứu về loài ô dược vẫn chưa được công bố nhiều. Tuy nhiên, những nghiên cứu về những loài thuộc chi Lindera đã được công bố. Năm 1925, lần đầu tiên Kondo và cộng sự đã xác định được hợp chất lindeneol từ loài L. strychnifolia. Sau đó, năm 1964, takeda và cộng sự đã xác định được hơn 100 chất tương tự, những hợp chất này chủ yếu được phân lập từ L. strychnifolia, L. 2 Đồ án tốt nghiệp chunii và L. aggregate. Trong đó có một số hợp chất có tính chống ung thư, chống viêm và kháng vi – rút. Năm 2011, Kim và cộng sự đa tìm ra các hợp chất flavonoids (có dạng một phân tử flavone kết hợp với một hoặc hai nhóm p-methene) có tác dụng gây độc tế bào và ức chế sự phóng thích LDH từ các tế bào thần kinh H9c2. Chiết xuất L. aggregata thường được chỉ định để điều trị các bệnh về hệ tiết niệu như đái tháo đường và đá tiểu và có tác dụng rõ rệt đến viêm dạ dày mãn tính và viêm khớp mãn tính đã được Zang và Wang công bố năm 2000. Năm 2002, Lee và cộng sự đã công bố hợp chất lucitone có độc tính tế bào với các dòng tế bào ung thư B16 – F10, HT1080 và K562 với giá trị ED50 lần lượt là 2,2; 2,5 và 8,3 lg/ml.  Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Trong tài liệu những cây thuốc và vị thuốc ở Việt Nam, theo Đỗ Tất Lợi, loài ô dược ở Việt Nam được sử dụng như một vị thuốc nam có rất nhiều công dụng chữa bệnh như: trị đau bụng, chứng rối loạn tiêu hoá (ăn không tiêu, ợ hơi, ợ chua, buồn nôn), tiểu nhiều lần hoặc đái dầm. Mặc dù loài ô dược đã được sử dụng trong y học cổ truyền, nhưng hiện nay ở Việt Nam chưa có hoạt tính ức chế hắc tố nào về loài này. Việc nghiên cứu thành phần hóa học và các hoạt tính sinh học sẽ góp phần làm sáng tỏ thêm thành phần hóa học cũng như các kinh nghiệm sử dụng dược liệu này trong dân gian và đặc thù loài tại Việt Nam để định hướng cho những nghiên cứu ứng dụng tiếp theo. 3. Mục đích nghiên cứu - Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá của cao chiết ô dược. - Khảo sát khả năng ức chế quá trình tổng hợp hắc tố của cao chiết ô dược. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu 4.1. Giai đoạn 1 - Tiến hành chiết, cô quay chân không và thu cao methanol. - Định tính thành phần hoá học từ cao methanol. - Thử hoạt tính kháng oxy hóa từ cao methanol thu được. 3 Đồ án tốt nghiệp - Khảo sát tác dụng của ô dược lên quá trình tổng hợp melanin. - Khảo sát tác dụng của ô dược lên độc tính của tế bào u sắc tố B16F10. 4.2. Giai đoạn 2 - Từ cao tổng methanol, tiến hành chiết phân đoạn với các dung môi có độ phân cực khác nhau (hexan, chloroform, ethyl acetate), cô quay chân không và thu cao chiết. - Khảo sát tác dụng của các cao phân đoạn lên hoạt tính kháng oxy hóa của các phân đoạn. - Khảo sát tác dụng của phân đoạn cao chiết ô dược lên quá trình tổng hợp melanin. - Khảo sát tác dụng của phân đoạn cao chiết ô dược lên độc tính của tế bào u sắc tố B16F10 4.3. Giai đoạn 3 Xác định thành phần hoá học cao ô dược bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. 5. Phƣơng pháp nghiên cứu  Nghiên cứu lý thuyết - Thu thập, tổng hợp tài liệu, tư liệu về nguồn nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu các hợp chất tự nhiên, thành phần hóa học và ứng dụng của loài ô dược. - Tổng hợp tài liệu về phương pháp lấy mẫu, chiết tách và xác định thành phần hóa học các chất từ thực vật. - Tổng hợp tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hóa học và ứng dụng của loài ô dược.  Nghiên cứu thực nghiệm - Phương pháp lấy và xử lí mẫu. - Phương pháp tách chiết các hợp chất hữu cơ bằng dung môi: phương pháp chiết rắn – lỏng, chiết lỏng – lỏng. 4 Đồ án tốt nghiệp - Phương pháp xác định thành phần hoá: định tính và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). - Phương pháp sinh học thăm dò hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố của cao chiết. - Phương pháp xác định độc tính của cao chiết lên tế bào.  Sử dụng phần mềm Sigma Plot version 10.0 và phần mềm Microsoft Excel 2010 để xử lý số liệu. 6. Các kết quả đạt đƣợc Chiết mẫu ô dược với dung môi, hiệu suất thu hồi 12,46%. Từ cao tổng methanol, chiết phân đoạn với bốn loại dung môi, hiệu suất thu hồi của phân đoạn cao hexan là 3,42%, chloroform 10,57% và ethyl acetate 23,45%, nước 43,02%. Định tính thành phần hoá học, kết quả cho thấy các mẫu cao đều chứa nhiều hợp chất hoá học như: alkaloid, carbohydrate, flavonoid, chất béo, protein. Cao methanol từ cây ô dược cho hiệu quả ức chế quá trình tổng hợp melanin và không gây độc cho tế bào ở nồng độ 200 g/ml. Cao methanol có khả năng bắt gốc tự do cao với IC50 = 58,89 g/ml. Phân đoạn Ethyl acetate có khả năng bắt gốc tự do cao nhất trong các phân đoạn với IC50 = 10,71 g/ml. Cho hiệu quả ức chế tổng hợp melanin và không gây độc với tế bào ở nồng độ 200 g/ml. 7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Những kết quả nghiên cứu sẽ góp phần cung cấp các thông tin có ý nghĩa khoa học về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cao ô dược, qua đó góp phần nâng cao giá trị ứng dụng của cây ô dược trong ngành dược liệu. 8. Kết cấu của Đồ án tốt nghiệp Kết cấu của đồ án tốt nghiệp này gồm có 4 chương: - Chương 1: Tổng quan tài liệu - Chương 2: Vật liệu và phương pháo nghiên cứu - Chương 3: Kết quả và thảo luận - Chương 4: Kết luận và đề nghị. 5 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về chi Lindera (Họ Lauraceae) 1.1.1. Chi Lindera (Họ Lauraceae) Chi Lindera thuộc họ Long não (Laraceae) hay còn gọi là Nguyệt quế, gồm khoảng 100 loài, phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn thế giới, đặc biệt là các nước Đông Nam Á và Brazil. Chúng chủ yếu là các loại thân gỗ hay cây bụi có hương thơm (Võ Văn Chi, 1997). Cây gỗ có cành non màu xanh, vỏ có mùi thơm, thường có chồi ngủ đông. Lá thường mọc cụm đầu cành, có ba gân chính hay hệ gân đơn giản. Hoa mẫu ba, thường có nhị lép và tuyến mật ở gốc chỉ nhị. Quả thường có đài dính liền, phát triển thành dạng đấu dưới quả (Phạm Hoàng Hộ, 1991) (Hình 1.1). Theo thông kê “Tiếp cận các nguồn gen và chia sẻ lợi ích” của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Thế giới (IUCN), Lindera không chỉ mang giá trị kinh tế cao mà bên cạnh đó nó còn mang tính dược lý và sinh học như khả năng chống ung thư, cao huyết áp, kháng viêm và được dùng làm thuốc giảm đau. Các nghiên cứu đã tìm ra được khoảng 341 thành phần có trong cây bao gồm sesquiterpenoids, alkaloids, butanolides, lucidones, flavonoids và phenylpropanoids. Butanolides và lucidones quyết định khả năng chống ung thư, trong khi aporphine alkaloids lại quyết định khả năng kháng viêm và giảm đau. Tuy vậy, những hợp chất này cần được đánh giá thêm, thông qua các nghiên cứu chuyên sâu. Cây thuộc họ Lauraceae mang giá trị kinh tế cao vì một số loài của chúng được ứng dụng rộng rãi làm nguồn gia vị, dầu thơm và đặc biệt là dược liệu. Hơn nữa, chúng còn đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái vì là loài cây chiếm ưu thế trong các khu rừng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Gentry, 1988; Van der Werff và Richter, 1996). Lindera, một chi chính trong họ Lauraceae, phân bố rất rộng rãi ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới ở Châu Á và Trung Tây Mỹ, bao gồm khoảng 100 loài (Flora Republicae Popularis Sinicae, 1982). 6 Đồ án tốt nghiệp Hầu hết các loài trong chi Lindera chứa một lượng dầu rất lớn, ứng dụng tốt trong việc sản xuất xà phòng, chất bôi trơn và dùng để tách chiết acid lauric. Nhiều loài khác thì được dùng trong việc sản xuất gia vị, nước hoa và vật liệu xây dựng. Đáng nói nhất đó là tính dược liệu của chi. Những chiết xuất từ củ, thân, lá, rễcó công dụng ấm thận, giảm đau, chán nản (17 công thức trong “Dược điển Trung Quốc”); điều trị các bệnh tiết niệu như đái dầm, sỏi thận và dùng để chữa trị viêm khớp, viêm dạ dày mãn tính. Ngoài ra, lá của một số loài thuộc chi Lindera như L. aggregate còn điều trị viêm vú, viêm tế bào da, mụn nhọt (Han và cộng sự, 2008). Lá tươi xào với rượu gạo có thể điều trị bệnh thấp khớp. Chiết xuất của L. aggregate tại Nhật Bản được dùng để điều trị bệnh đột quỵ và bệnh tả (Chou và cộng sự, 2000). Vỏ cây của loài L. obtusiloba dùng làm tan máu bầm, thông cổ. Rễ của L. glauca điều trị mệt mỏi, viêm khớp (Zang và Wang, 2000). Rễ, vỏ cây và cành của L. umbellata chữa loét dạ dày, đau bụng, bệnh tả, tê phù, chống co thắt (Tanaka và cộng sự, 1985). Lindera glauca Lindera aggregate Lindera myrhaa Lindera obtusiloba 7 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Lindera 1.1.2. Nghiên cứu về thành phần hoá học Trong tổng thể, 341 chất chuyển hóa thứ cấp đã được cô lập và xác định từ chi Lindera cho đến nay. Những thành phần chủ yếu gồm có bảy loại: sesquiterpenoids, alkaloids, butanolides, lucidones, flavonoids, phenylpropanoids và các loại khác. Trong đó, sesquiterpenoids và alkaloids là thành phần chiếm ưu thế (Hình 1.2, hình 1.3). 1.1.2.1. Sesquiterpenoids Năm 1925, Kondo và cộng sự lần đầu tiên đã xác định được hợp chất lindeneol từ loài L. strychnifolia. Năm 1964, Takeda và cộng sự đã xác định được hơn 100 chất tương tự. Nhìn chung, những hợp chất này được phân lập từ L. strychnifolia, L. chunii, và L. aggregata. Một số hợp chất có đặc tính kháng ung thư, kháng viêm và R1: OH R1: OH R2: H R2: H R: H Lindeneol Linderene Lindenenone Lindestrene Linderalactone 1,4-Dimethyl-7- Linderazulene ethylazulene Hình 1.2. Một số hợp chất Sesquiterpenoids được xác định trong chi Lindera kháng vi-rút. 8 Đồ án tốt nghiệp 1.1.2.2. Alkaloids Alkaloids là một trong những chất chuyển hoá thứ cấp phổ biến nhất và là thành phần quan trọng trong chi Lindera. Đa số các hợp chất alkaloids có tác dụng giảm huyết áp, chống viêm và giảm đau đáng kể. Năm 2000, Chang và cộng sự đã xác định được những hợp chất alkaloids từ 10 loài Lindera như: aporphines, benzylinocinolines, isopavines, proaporphine. R1: H R1: H R2, R3: -CH2- R2: OCH2O R4, R5: -CH2- R3: OCH2O R6: H R4: H Hernandonine Lindechunine B R : H 1 R2: H N-p-Coumaroyltyramine Squamolone R: H Hernovine Northalifoline Hình 1.3. Một số hợp chất alkaloids được xác định trong chi Lindera 1.2. Tổng quan về cây ô dƣợc 1.2.1. Phân loại khoa học Giới: Thực vật (Plantae) 9 Đồ án tốt nghiệp Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida) Bộ: Long Não (Laurales) Họ: Long não (Lauraceae) Chi: Lindera Loài: Lindera Myrrha Merr Cây ô dược có tên khoa học là Lindera myrrha (Lour.) Merr. Ngoài ra còn có các đồng danh khoa học là: Lindera myrrha (Lour.) Merr, Laurus myrrha Lour (Hình 1.4). Tại Việt Nam, cây ô dược còn được gọi là: thiên thai ô dược, bàng tỵ, bàng kỳ, nuy chướng, nuy cước chướng, đài ma, phòng hoa, thai ô dược, thổ mộc hương, tức ngư khương, kê cốt hương, bạch diệp sài, cây dầu đắng, ô dược nam (Lê Đình Sáng, 2010). 1.2.2. Đặc điểm thực vật Ô dược là một cây gỗ nhỏ: Thân cao độ 1,3 - 1,4 m, cành non, gầy, màu đen nhạt, có long vàng hoe, khi già trở nên nhẵn (Đỗ Tất Lợi, 2000). Lá mọc so le, hình bầu dục hoặc hình trứng, dài 6 cm, rộng 2 cm, đầu lá thót thành đuôi ngắn, gốc hơi tròn, mặt trên nhẵn bóng, mặt dưới có lông, có ba gân, hai gân phụ bắt đầu từ điểm cách cuống lá 2 mm, dài ra chừng 2/3 lá, mặt trên lõm, mặt dưới lồi lên. Cuống dài 7 - 10 mm, lúc đ... tế bào khiến chất dinh dưỡng thất thoát, tế bào không tăng trưởng. Chúng tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da khiến ta có những vết đồi mồi trên mặt, trên mu bàn tay. Ngoài ra, chúng còn tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp các phân tử protein, đường bột, lipid, enzyme trong tế bào, gây đột biến ở gene, ở DNA, 32 Đồ án tốt nghiệp RNA, làm chất collagen, và elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc (Kedare và Singh, 2011). Theo bác sĩ Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây ra sự hóa già và sự chết của các sinh vật. Ông cho là gốc tự do phản ứng lên ty lạp thể, gây tổn thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc, khiến chúng trở nên vô dụng và mất khả năng sản xuất năng lượng (Harman, 1956). Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh, đáng kể nhất gồm có: bệnh xơ vữa động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thủy tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan. Các nghiên cứu cũng phát hiện rằng các gốc dạng oxy hóa hoạt động (ROS) sẽ được loại bỏ bằng các chất chống oxy hóa tự nhiên có sẵn trong cơ thể như enzyme superoxid dismutase (SOD), enzyme glutathion peroxidase (GSP-Px), enzyme catalase (CAT) để tạo sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống oxy hóa trong cơ thể con người. Đó là một trạng thái cơ bản của cân bằng nội mô (homeostasis) (Gruber và cộng sự, 2008). Ngày nay, do ảnh hưởng của điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường, tiếng ồn, căng thẳng, lo lắng hay sử dụng các thực phẩm chứa nhiều chất oxy hóa đã tạo điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau đó là sự gia tăng các dạng oxy hoạt động. Các dạng oxy hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ứng bất lợi, tổn thương cho cơ thể và là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nan y. Do đó cần có những nghiên cứu, tìm hiểu về các chất có khả năng chống oxy hóa mang lại những tác dụng tốt, có lợi cho sức khỏe của con người. Bên cạnh đó, chúng ta cũng cần khảo sát thêm những quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa tối ưu và dễ thực hiện để phục vụ cho việc nghiên cứu (Cai và cộng sự, 2004). 1.5.2. Phương pháp nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá Hiện nay có rất nhiều phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa: oxigen radical absorbane capacity (ORAC), Total radical-trapping antioxidant parameter (TRAP), ferrie reducing antioxidant power assay (FRAP), 1,1 diphenyl -2-picrylhydrazyl radical scavenging (DPPH), 33 Đồ án tốt nghiệp 1.5.2.1. Phương pháp sử dụng DPPH Blois là người đầu tiên đặt nền móng cho phương pháp DPPH cách đây gần 50 năm (1958), ở thí nghiệm đầu tiên Blois đã thử hoạt tính chống oxy hóa của amino axit cystein bằng cách dùng DPPH chuẩn độ nó rồi đo độ hấp thu theo thời gian ở bước sóng 517nm (Blois, 1958). Nguyên tắc: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do được dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hóa th ể hiện qua việc giảm màu của DPPH, được xácđịnh bằng cách đo quang ở bước song λ = 517 nm. Phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa DPPH có những ưu điểm (Brand- William và cộng sự, 2011): - Phương pháp đơn giản, thiết bị yêu cầu không quá phức tạp. - Tiến hành nhanh chóng - Thích hợp nhiều tác nhân chống oxy hóa. Ngoài ra, nó còn được dùng đo tính chống oxy hóa cho các sản phẩm thực phẩm. Tên khoa học của DPPH là (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl; C18H12N5O6, M= 394,33) là một gốc tự do bền (hình 1.121), trong dung dịch ethanol tuyệt đối sẽ có màu tím, phân tử không bị dime hóa như một số gốc tự do khác, và độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517 nm. Khi Hình 1.21. DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) DPPH phản ứng với các chất có tính kháng oxy hóa, electron thừa của nguyên tử nitơ trong DPPH sẽ kết hợp với nguyên tử hydro từ chất có tính kháng oxy hóa để tạo thành dạng hydrazine tương ứng là 2,2-Diphenyl-1-picryldrazine không có gốc tự do. Kết quả làm mất màu tím của DPPH ban đầu và dung dịch dần chuyển 34 Đồ án tốt nghiệp sang màu vàng (Kedare và Singh, 2011) (Hình 1.22). 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl 2,2-Diphenyl-1-picryldrazine Hình 1.22. Phản ứng của DPPH (gốc tự do) thành DPPH (không có gốc tự do). 1.5.2.2. Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II Nguyên tắc: Ion sắt hoặc đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc tự do. Đánh giá khả năng phòng ngừa sinh ra gốc tự do của chất nghiên cứu thể hiện qua sự khóa các ion kim loại chuyển tiếp vào dạng phức, không để cho tồn tại ở trạng thái tự do, sẽ làm mất khả năng xúc tác gốc. Hoạt tính chống oxy hóa được thể hiện qua việc ngăn chặn tạo thành phức chất có màu giữa ion sắt II và 2,2’-bipyridyl (thuốc thử ferrozine, đặc hiệu với ion sắt II) (Gruber và cộng sự, 2008). *- 1.5.2.3. Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt gốc superoxyd O2 Nguyên tắc: Đánh giá khả năng phòng vệ loại bỏ gốc tự do đã sinh ra của chất *- nghiên cứu thông qua việc ngăn chặn sự tạo thành gốc superoxyd O2 . Gốc superoxyd được tạo thành trong phản ứng giữa xanthin và xanthin oxydase sẽ được định lượng bằng phương pháp khử sử dụng nitroblue tetrazolim (NBT) cho phức chất có màu tím được đo ở bước sóng λ = 550 nm. Hoạt tính của mẫu thử được thể hiện qua việc giảm sự hình thành phức màu tím (Gruber và cộng sự, 2008). 1.5.2.4. Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt gốc peroxyhydro H2O2 - Nguyên tắc: Hai tiểu phân O2* và H2O2 sinh ra từ các chuyển hóa trong cơ thể với nồng độ vô cùng thấp, dễ dàng bị loại bỏ và không độc hại trong cơ thể nhưng nếu hiện điện ở nồng độ cao chúng sẽ tạo ra 1O2, *OH là phân tử và gốc có khả năng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với các chất hữu cơ tạo ra các peroxyd và 35 Đồ án tốt nghiệp từ đó tạo ra nhiều sản phẩm độc hại cho tế bào. Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử được thể hiện qua việc làm giảm H2O2 đưa đến làm giảm phản ứng màu giữa H2O2 và đỏ phenol (màu của đỏ phenol chuyển sang màu tím sau phản ứng với H2O2 trong sự hiện diện của enzyme peroxydase) (Gruber và cộng sự, 2008). 1.5.2.5. Tình hình nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hoá ở các loài thực vật hiện nay. Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới có hệ thực vật rất phong phú và đa dạng. Thực vật là nguồn cung cấp nhiều hợp chất quý giá có giá trị trong dược học và thực phẩm (Suganya và cộng sự, 2007; Chen và cộng sự, 2007; Mustafa và cộng sự, 2010). Đặc biệt, thực vật là nguồn cung cấp dồi dào các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa như các hợp chất polyphenol, flavonoid, caroten, ascorbic acid,.  Trong nước Nhiều loài lá thực vật khác nhau đã được tiến hành chiết và xác định hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH của chúng bao gồm: Lá Ổi (Psidium guyjava), lá Dâm bụt (Hibiscus rosa-sinensis), lá Lốt (Piper lolot), lá Nhãn lồng (Passiflora foetida), lá Khoai lang (Lpomoea batatas). Tất cả nguyên liệu này được thu mẫu tại Đồi La Sang, trường Đại học Nha Trang trong tháng 6/2011. Ngò rí (Coriandrum satinum), rau Bồ ngót (Sauropus androgynus), rau Răm (Persicaria odorata), Nha đam (Aloe vera), lá Tía tô (Perilla frutescens), lá Sả (Cymbopogon), lá Mã đề (Plantago), lá Diếp cá (Houttuynia cordata), lá rau má (Centella asiatica), lá trầu không (Piper betle). Ngoài ra, Nấm rơm tươi (Volvariella volvacea) cũng được nghiên cứu (Dương Thị Kim Nguyên và cộng sự, 2012). Khảo sát khả năng kháng oxy hoá của cây ô rô (Acanthus ilicifolius L.) (Đái Thị Xuân Trang và cộng sự, 2014). Tất cả dịch chiết từ 15 loại lá thực vật và một loại nấm rơm trồng ở Việt Nam đều thể hiện hoạt tính chống oxi hóa (dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH). Khả năng chống oxi hóa của dịch chiết khác nhau theo loài.  Ngoài nước 36 Đồ án tốt nghiệp Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện cho thấy trong các phần của thực vật chứa nhiều các chất chống oxi hóa như: Phenolics, flavonoids, tanins, vitamins, quinines, coumarins, lignans, ligin (Cai và cộng sự, 2004; Amarowicz và cộng sự, 2004). Như vậy, thực vật sẽ là một nguồn nguyên liệu tốt để thu nhận và ứng dụng các chất có hoạt tính chống oxi hóa và hoạt tính sinh học. 1.6. Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC HPLC là chữ viết tắt của 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography) (Master, 2007). Phương pháp này ra đời năm 1967 – 1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích. Hiện nay, đây là phương pháp được ứng dụng rất lớn trong nhiều ngành kiểm nghiệm nhất là kiểm nghiệm thuốc. Và hiện tại, đây là công cụ đắt lực nhất trong phép phân tích định tính và định lượng các loại dược phẩm đa thành phần (Karger, 1997). Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử) (Karger, 1997). Nguyên tắc chung: Sắc ký lỏng là một kỹ thuật tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá trình vừa có tính chất hoá học lại vừa có cả tính chất lý học. Nó là những cân bằng động xảy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động, là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất tan (hỗn hợp mẫu phân tích) theo từng lớp chất trong cột (pha tĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cột tách. Trong quá trình đó chất tan luôn luôn được phân bố lại giữa hai pha, trong khi pha động chảy liên tục 37 Đồ án tốt nghiệp qua cột tách với một thành phần pha động nhất định, hay gradient. Nghĩa là đối với một phân tử chất tan, thì trong quá trình sắc ký, nó luôn chuyển từ pha này sang pha kia nhiều lần từ dầu cột đên cuối cột sắc ký. Mặt khác, cũng vì cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử của chất tan là khác nhau nên tốc độ dịch chuyển trung bình của mỗi chất tan là khác nhau. Khi ở trong pha động, nó chuyển dịch theo tốc độ của dòng pha động, còn khi ở trên pha tĩnh nó lại không dịch chuyển, mà bị pha tĩnh giữ lại. Như vậy là có một khoảng thời gian nhất định chất tan bị giữ lại trong cột tách sắc ký, thời gian này phụ thuộc vào bản chất sắc ký của cột pha tĩnh, cũng như tính chất và cấu trúc của mỗi chất tan khác nhau đồng thời cũng phụ thuộc vào bản chất của thành phần pha động dùng để rửa giải chất tan, có chất tan ít bị lưu giữ, điều đó dẫn đến kết quả là, có quá trình tách của các chất xảy ra trong cột sắc ký (Bùi Thị Ngoan và cộng sự, 2009). Vậy phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách chất trong đó xảy ra quá trình các chất tan chuyển dịch trong cột tách có chứa các chất nhồi kích thước nhỏ, chất tan chuyển dịch với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào hệ số phân bố của nó. Các chất nhồi cột có kích thước đủ nhỏ để đáp ứng hiệu quả tách sắc ký tốt. Thành phần pha động có thể thay đổi để đạt được lực rửa giải phù hợp nhất. Sau khi chất tan chuyển tới cuối cột tách được chuyển tới detector để phát hiện. Tuỳ thuộc vào bản chất của chất tan mà dùng các loại detector khác nhau (Bùi Thị Ngoan và cộng sự, 2009). 38 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ tháng 2 năm 2017 đến tháng 6 năm 2017 tại Viện Sinh học nhiệt đới (Địa chỉ: 9/621 xa lộ Hà Nội, Phường Linh Trung, Quận Thủ Đức, T.P Hồ Chí Minh). 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu Mẫu ô dược (đã được phơi khô) được thu mua tại đường Hải Thượng Lãn Ông, quận 5, TP. Hồ Chí Minh. 2.2.2. Dụng cụ - Thiết bị - Tủ cấy vô trùng - Nồi hấp - Tủ sấy tiệt trùng - Bếp điện - Tủ ấm, tủ lạnh - Máy đo pH - Cân phân tích, cân điện tử - Phễu, giấy lọc - Bể ổn định nhiệt - Bình tam giác, ống nghiệm - Pipette loại 100 -1000 l. Đầu tuýp loại 100 -1000 l - Máy cô quay chân không hiệu HEIDOLPH LABOROTA 4001 - Máy đọc đĩa hiệu BENCHMARK PLUS - Máy chạy sắc ký HPLC hiệu WATER 2695 SEPARATIONS MODUTE; WATERS 2414 REFRACTIVE INDEX DETECTOR; WATER 2996 PHOTODIODE ARRAY DETECTOR - Máy đánh sóng siêu âm hiệu S 300H ELMASONIC 2.2.3. Hoá chất - Ethanol absolute (Chemsol -Việt Nam). - DMSO (dimethyl sulfoxide) (Sigma – Mỹ). - DPPH (2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl hydrate). - Vitamin C, Arbutin (Sigma – Mỹ), môi trường DMEM, trypsin/ EDTA. 39 Đồ án tốt nghiệp - Dung môi phân tích: Methanol, Hexan, Chloroform, Ethyl acetate (Chemsol -Việt Nam). - Thuốc thử: Mayer, Wagner, Molish, Fehling A, Fehling B, Benedict, CuSO4 2%, Gelatin 1%, Amonium 10%, HCl đậm đặc, Ethanol 95%, cồn tuyệt đối 2.3. Quy trình thực hiện Xem hình 2.1 Rễ cây ô dược Methanol Nghiền và chiết với dung môi methanol Lọc Dịch methanol Cô quay chân không Cao methanol Xác định thành phần hoá học Thử hoạt tính Ức chế tổng hợp Kháng oxy hóa: melanin DPPH assay Phân đoạn cao (hexane, chloroform, ethyl acetate, nước) Xác định thành phần hoá học Thử hoạt tính Phân đoạn có hoạt tính cao nhất 40 Đồ án tốt nghiệp Hình 2.1. Sơ đồ quy trình và phương pháp thực hiện 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp thu và xử lý mẫu Rễ cây mẫu, sau khi thu nhận sẽ được rửa sạch và được phơi khô trong không khí cho đến khi khối lượng không đổi. Các mẫu phơi khô sẽ được nghiền thành bột mịn. Bột mẫu sẽ được đựng trong túi nhựa và được bảo quản ở 40oC (Hình 2.2). Mẫu cây cây Rửa sạch Phơi khô đến khi trọng lượng không đổi Xay mẫu đến kích thước đồng nhất Mẫu Hình 2.2. Quy trình xử lý mẫu 2.4.2. Quy trình chiết và thu nhận cao chiết 2.4.2.1. Chiết cao tổng Kỹ thuật chiết ngâm dầm (chiết rắn – lỏng) Kỹ thuật chiết ngâm dầm dùng để lấy các hợp chất tự nhiên ra khỏi thực vật thô ban đầu. Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không gỉ có nắp đậy. Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch chiết được lọc qua một tờ giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ có cao chiết. Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chiết bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm 41 Đồ án tốt nghiệp một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây. Có thể gia tăng hiệu quả chiết bằng cách đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bung ra làm dung dịch chiết trào ra ngoài). Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là đủ vì với một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến mức bão hòa, không thể hòa tan thêm được nhiều hơn. Chiết nhiều lần, mỗi lần một ít lượng dung môi. Dung môi sau khi thu hồi được làm khan nước bằng các chất làm khan và được tiếp tục sử dụng để chiết các lần sau.  Nguyên liệu: Ô dược khô được nghiền đến kích thước đồng nhất.  Mục đích: Chiết các hợp chất có trong ô dược nhờ dung môi methanol.  Cách thực hiện: Bột ô dược được chiết 3 lần bằng dung môi methanol (1:4 v/v) trong vòng 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết methanol sau đó được lọc qua giấy lọc, cô cạn bằng máy cô quay chân không ở 40oC để tạo thành cao methanol. 2.4.2.2. Chiết phân đoạn Kỹ thuật chiết lỏng •lỏng Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng áp dụng để phân chia cao chiết thô ban đầu (thường là cao alcol thô) thành các phân đoạn cao có tính phân cực khác nhau. Nguyên tắc: Dung môi có tính phân cực khác nhau sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực tương ứng với nó. Phương pháp này dựa trên sự phân bố của chất tan vào hai pha và hai pha lỏng này không hòa tan vào nhau, thực hiện bằng bình lóng. Cao alcol thô ban đầu được hòa tan vào nước. Việc chiết được thực hiện lần lượt bằng các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần. Chiết nhiều lần với mỗi loại dung môi, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi, đến khi chiết kiệt mới chuyển sang dung môi khác. Thu hồi dung môi được các cao phân đoạn tương ứng (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2000-2001).  Nguyên liệu: cao tổng methanol đã thu nhận được.  Mục đích: phân đoạn cao tổng methanol bằng các dung môi hữu cơ để tạo thành các phân đoạn hexane, chloroform, ethyl acetate. Cách thực hiện: 42 Đồ án tốt nghiệp Cao methanol thô sau đó được hòa vào lượng nước cất (1:4 v/v) để hòa tan cao và tiếp tục được phân chia bằng kỹ thuật chiết lỏng - lỏng. Cho dung dịch cao methanol vào bình lóng, thêm vào khoảng một thể tích hexane với tỉ lệ so với cao chiết là 1:1, lắc nhẹ, chờ hỗn hợp phân lớp hoàn toàn. Lúc này, nhẹ nhàng tháo van chiết lấy pha nước nằm dưới, pha hexane nằm trên được cho vào bình chứa, lặp lại quá trình này 3 lần. Dịch còn lại tiếp tục được chiết với dung môi chloroform theo phương pháp tương tự như trên, pha chloroform nằm dưới được cho vào bình chứa. Cuối cùng, dịch được chiết tương tự với dung môi ethyl acetate, pha ethyl acetate nằm trên và pha nước nằm dưới được cho vào bình chứa. Các dịch chiết (hexane, chloroform, ethyl acetate) sau đó được đem đi cô quay chân không ở nhiệt độ 40oC, dịch chiết nước được cô quay chân không ở 50oC. Các cao phân đoạn được bảo quản ở nhiệt độ 0oC - 4oC để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.4.2.3. Hiệu suất chiết  Hiệu suất chiết cao tổng ( ) Trong đó: H: hiệu suất chiết cao tổng a: khối lượng mẫu cao sau khi cô quay (g) b: khối lượng mẫu ban đầu trước khi chiết (g)  Hiệu suất chiết cao phân đoạn ( ) Trong đó: H’: hiệu suất chiết cao phân đoạn a’: khối lượng cao sau cô quay (g) b’: khối lượngcao tổng dùng chiết phân đoạn (g) 2.4.3. Phương pháp xác định thành phần hoá học Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết ô dược bằng các phản ứng hóa học theo các phương pháp thông dụng trong phòng thí nghiệm đã 43 Đồ án tốt nghiệp được chuẩn hoá để sơ bộ hóa thành phần hoạt chất. Định tính alcaloid bằng thuốc thử Dragendorff, nhận biết flavonoid bằng các phản ứng đặc trưng với dung dịch NaOH 10%, nhận biết terpenoid bằng axit sulfuric 10% trong ethanol, nhận biết carotenoid bằng dung dịch H2S04 đậm đặc, nhận biết saponin bằng lắc dung dịch loãng trong nước, nhận biết tinh dầu bằng bốc hơi tới cắn, nhận biết chất béo bằng nhỏ dung dịch lên giấy. Đối với chỉ tiêu Alkaloid: mẫu cao được ngâm trong HCl 10% trong khoảng 30 - 60 phút. Sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc. Thu phần dịch trong để tiến hành thử nghiệm. Đối với chỉ tiêu Glycoside: mẫu cao được tiến hành thuỷ phân với dung dịch HCl đậm đặc trong bể điều nhiệt trong 2 giờ. Sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc. Thu phần dịch trong để tiến hành thử nghiệm. Đối với các chỉ tiêu còn lại: mẫu cao được pha trong dung môi dùng để chiết ban đầu cho đến khi tan hết. Sau đó tiến hành lọc bằng giấy lọc để thu dịch trong và tiến hành thử nghiệm. 2.4.3.1. Carbohydrate  Thử nghiệm Molisch - Hút 2ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Thêm vào 5 – 6 giọt thuốc thử Molisch - Nhỏ từ từ 2ml dung dịch H2SO4 đậm đặc trên thành ống nghiệm Kết quả: Hình thành phức hợp màu đỏ - tím ở lớp ngăn cách.  Thử nghiệm Fehling - Hút 2ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Cho lần lượt 1ml thuốc thử Fehling A và 1ml thuốc thử Fehling B - Đun cách thuỷ trong 5 phút và đọc kết quả Kết quả: Quan sát kết tủa màu nâu đỏ của Cu2O.  Thử nghiệm Benedict - Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Thêm 2 ml thuốc thử Benedict 44 Đồ án tốt nghiệp - Đun cách thuỷ trong 2 phút, đọc kết quả Kết quả: Quan sát màu sắc của dug dịch, mỗi loại carbohydrate sẽ cho một màu đặc trưng. 2.4.3.2. Alkaloid  Thử nghiệm Mayer - Hút 2ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Cho vài giọt thuốc thử Mayer Kết quả: Quan sát kết tủa màu đục tạo thành  Thử nghiệm Wagner - Hút 2ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Thêm 2ml thuốc thử Wagner Kết quả: Hình thành kết tủa màu nâu đỏ 2.4.3.3. Glycosides  Thử nghiệm Borntrager (Anthaquinone glycosides) - Hút 2ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Thêm 2ml dung dịch H2SO4 loãng và đun sôi - Tiến hành lọc nóng và để nguội dịch lọc - Thêm 3 ml chloroform và lắc đều sau đó để yên - Tách lấy lớp chloroform - Thêm 2ml ammonia 10% và quan sát màu trong lớp ammonia Kết quả: Xuất hiện màu đỏ. 2.4.3.4. Flavonoid  Thử nghiệm với thuốc thử Alkalie - Hút 2ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng. Thực hiện đối chứng là mẫu và nước cất để so sánh. - Thêm vài giọt HCl loãng, thấy mất màu chứng tỏ có sự hiện diện của Flavonoid Kết quả: Xuất hiện màu vàng khi bổ sung NaOH và mất màu khi cho HCl. 45 Đồ án tốt nghiệp  Thử nghiệm Shinoda - Hút 2ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Cho bột Magnesium và một vài giọt HCl đậm đặc vào ống nghiệm - Bổ sung 5 ml cồn 95% Kết quả: Nếu mẫu có màu cam, hồng, đỏ đến tím chứng tỏ có sự hiện diện của Flavonoid.  Thử nghiệm Ferric chloride - Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm - Thêm vài giọt thuốc thử Ferric chloride 5% Kết quả: Xuất hiện màu xanh hoặc tím 2.4.3.5. Phenolic  Foam test - Hút 5 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Lắc mạnh Kết quả: Hình thành bọt ổn định.  Thử nghiệm Gelatin - Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Thêm một vài giọt gelatin 1% Kết quả: Xuất hiện kết tủa trắng 2.4.3.6. Dầu và chất béo  Spot test - Cho một giọt dịch mẫu thấm vào giấy lọc - Vết dầu xuất hiện trên giấy lọc cho thấy sự có mặt của dầu hoặc chất béo. 2.4.3.7. Protein  Thử nghiệm Biuret - Hút 2ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Thêm 1 giọt dung dịch CuSO4 2% - Bổ sung 1 ml ethanol 95% - Sau đó, cho từng miếng KOH đến dư 46 Đồ án tốt nghiệp Kết quả: Xuất hiện phức chất màu xanh tím. 2.4.3.8. Gum và chất nhầy - Hút 2ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Thêm 25 ml cồn tuyệt đối, khuấy liên tục Kết quả: Xuất hiện kết tủa trắng đục chứng tỏ có sự hiệm diện của gum và chất nhầy. 2.4.4. Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do (DPPH assay) 2.4.4.1. Nguyên tắc hoạt động gốc tự do DPPH DPPH là một gốc tự do bền, dung dịch có màu tím, bước sóng cực đại hấp thu tại 517 nm. Các chất có khả năng kháng oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt. Hoạt tính chống oxy hóa của một chất được xác định bằng phương pháp đo phổ UV, sử dụng thuốc thử là DPPH. Phản ứng được tiến hành dựa theo trên nguyên lý: DPPH có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp phụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxy hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy so màu ở bước sóng 517 nm (Hình 2.3). Hình 2.3. Phản ứng của DPPH (gốc tự do) thành DPPH (không có gốc tự do). 47 Đồ án tốt nghiệp 2.4.4.2. Biểu diễn kết quả thử nghiệm DPPH Khả năng khử gốc tự do DPPH của một cao chiết (hoặc chất chống oxy hóa) ở nồng độ xác định được biểu diễn thông qua phần trăm ức chế (I%) được tính theo công thức: ( ) Kết quả thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa của một chất bằng phương pháp DPPH được báo cáo bằng IC50 (half maximal Inhibitory Concentration). IC50 được định nghĩa là nồng độ của chất mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do, tế bào hoặc enzyme. IC50 là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát, mẫu có hoạt tính kháng oxy hoá càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp.  Cách tính IC50: Tiến hành khảo sát hoạt tính của mẫu ở nhiều nồng độ khác nhau và tính I% của từng nồng độ. Với những mẫu có phần trăm bắt gốc tự do biến thiên tuyến tính với nồng độ, vẽ đường phi tuyến biểu diễn mối liên hệ giữa phần trăm bắt gốc tự do và nồng độ mẫu (với y là phần trăm bắt gốc tự do và x là nồng độ mẫu). Tìm phương trình phi tuyến, xác định hệ số a và b của phương trình. Thay y = 50 vào phương trình ta sẽ thu được giá trị x, đó chính là nồng độ ức chế được 50% gốc tự do (IC50)  Quy trình - Bước 1: hòa tan DPPH vào methanol tuyệt đối để đạt nồng độ 0,6 mg/ml. - Bước 2: hòa tan vitamin C (đối chứng dương) vào nước cất sau đó vortex để đạt nồng độ 2 mg/ml. Pha loãng dung dịch xuống nồng độ 0,2 mg/ml và bao tube lại bằng giấy bạc. - Bước 3: mẫu cao ô dược thô được hòa tan trong ethanol tuyệt đối, vortex để đạt nồng độ 1 mg/ml. Pha loãng mẫu thành dãy các nồng độ. - Bước 4: hút 100 μl methanol tuyệt đối – đối chứng âm. - Bước 5: hút 100 μl vitamin C - đối chứng dương ở nồng độ 0,2 mg/ml. - Bước 6: hút lần lượt 100 μl mẫu ở các nồng độ đã pha. 48 Đồ án tốt nghiệp - Bước 7: thêm 100 μl dung dịch DPPH vào tất cả các giếng, trộn đều hỗn hợp. - Bước 8: bao đĩa bằng giấy bạc và ủ ở 37oC trong 30 phút. - Bước 9: đo OD ở bước sóng 517 nm. Thực hiện mỗi nồng độ 3 lần lặp lại. Khả năng kháng oxy hóa hay bắt các gốc tự do DPPH của mẫu sẽ được tính theo công thức sau: Khả năng kháng oxy hóa của mẫu = (1 - ODmẫu/ODđối chứng) x 100. 2.4.5. Phương pháp nuôi cấy tế bào (B16F10) Tế bào B16F10 melanoma và Melan-a melanocyte được cung cấp bởi ATCC. Tế bào B16F10 được nuôi trên môi trường DMEM bổ sung 10% (v/v) huyết thanh o bê (FBS) và 1% (v/v) kháng sinh penicillin/streptomycine ở 37 C, 5% CO2, hơi nước bão hòa. Môi trường nuôi tế bào Melan-a melanocyte tương tự như môi trường nuôi tế bào B16F10 melanoma nhưng có bổ sung 200 nM tetradecanoyl phorbol acetate (TPA). Tế bào được cấy chuyền sau mỗi 3 ngày và sử dụng cho đến lần cấy chuyền thứ 30. 2.4.6. Phương pháp xác định độc tính Để xác định độc tính, thử nghiệm dựa trên sự đổi màu của MTT (3-(4,5- dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) được sử dụng. Tế bào được nuôi trên đĩa 96 giếng (96-well plate) ở mật độ tế bào 2.5 x 103. Sau 24 giờ, tế bào được ủ với mẫu cần kiểm tra ở các nồng độ khác nhau và được nuôi cấy tiếp trong 48 giờ. Sau đó 100 µl dung dịch MTT nồng độ 5 mg/ml được bổ sung vào các giếng. Sau 4 giờ ủ ở 37oC, môi trường chứa dung dịch MTT được hút ra và 100 µl DMSO được cho vào để hòa tan các formazan được tạo ra. Sau đó mẫu được đem đi đo quang phổ ở bước sóng 540 nm. 2.4.7. Phương pháp xác định hàm lượng melanin Tế bào được nuôi cấy ở mật độ 6 x 104 tế bào trên đĩa 6 giếng (6 - well plate). Sau 24 giờ nuôi cấy, tế bào được ủ với các mẫu cần kiểm tra trong vòng 48 giờ. Sau 48 giờ nuôi cấy, tế bào được thu nhận và được hòa tan trong 200 µl DMSO chứa 49 Đồ án tốt nghiệp 10% NaOH. Sau đó, mẫu được đem đun ở 80oC trong vòng 1 giờ. Hàm lượng melanin được xác định bằng cách đo quang phổ ở bước sóng 405 nm. Arbutin (200 µl/ml) được xử dụng làm đối chứng dương. Tế bào được nuôi trên môi trường DMEM bổ sung 10% (v/v) huyết thanh bê o (FBS) và 1% (v/v) kháng sinh penicillin/streptomycine ở 37 C, 5% CO2, có hơi nước bão hòa. 2.4.8. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC - Mục đích: xác định thành phần hợp chất trong mẫu cao chiết ô dược. - Nguyên lý hoạt động: Bơm cao áp đẩy dung môi pha động đi qua cột chứa chất nhồi là các hạt có đường kính nhỏ, mẫu phân tích đưa vào cột qua bộ phận tiêm mẫu, tại đây các thành phần của hợp chất sẽ được phân tách, đầu dò ghi nhận tín hiệu các chất phân tích khi ra khỏi cột, tín hiệu đi đến hệ thống dữ liệu tạo sắc ký đồ. - Tiến hành sắc lý:  Điều kiện phân tích: + Pha tĩnh: Cột sắc ký C18 (5 μm; 150×4,6 mm) + Pha động: Gradient Methanol - H2O từ 30% methanol đến 100% methanol + Tốc độ dòng: 1 ml/phút + Thể tích mẫu tiêm: 20 μl + Nhiệt độ: 25 ± 2oC + Khảo sát chương trình chạy gradient ở thời gian 50 phút theo sơ đồ hình 2.4. + Detector UV 210 nm. 50 Đồ án tốt nghiệp Hình 2.4. Sơ đồ điều kiện chạy sắc ký HPLC. 2.4.9. Xử lý số liệu Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Sử dụng phần mềm Sigma Plot version 10.0 và phần mềm Microsoft Excel 2010 để xử lý số liệu. Giá trị số liệu được biểu thị ở giá trị trung bình SD. 51 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả thu nhận cao tổng methanol ô dƣợc Mẫu ô dược khô được nghiền đến kích thước đồng nhất (1 - 2 mm3), cho mẫu vào túi vải, buộc kỹ. Trạng thái mẫu: màu vàng nhạt, vị đắng (Hình 3.1). Hình 3.1. Mẫu ô dược. (A) Mẫu sau khi thu; (B) mẫu sau khi nghiền nhỏ Cao methanol tổng được thu nhận bằng kỹ thuật chiết ngâm dầm được trình bày ở mục 2.3.2.2. Khối lượng bột ô dược đem ngâm là 500 g, sử dụng hết 3,2 lít dung môi methanol để chiết trong 3 lần. Lọc loại bỏ bã thu dịch chiết. Dịch chiết được tiến hành cô quay chân không đuổi dung môi, thu hồi dung môi thu cao tổng. Mẫu cao sau khi cô quay sẽ để khô ở nhiệt độ 40oC đến khối lượng không đổi. Thu được cao methanol tổng có khối lượng là 62,32 g. Hiệu suất điều chế cao methanol tổng được tính theo công thức ở mục 2.3.2.4 là 12,46% (Hình 3.2). 52 Đồ án tốt nghiệp (A) (B) (C) Hình 3.2. Mẫu được chiết ngâm dầm với dung môi Methanol và mẫu cao thu được. (A) Mẫu đang ngâm dầm; (B) Lọc thu dịch chiết; (C) Cao Methanol tổng thu được 3.2. Định tính thành phần cao tổng methanol ô dƣợc Kết quả định tính thành phần hoá học của cao tổng methanol ô dược được trình bày ở bảng 3.1. Dấu (+) cho kết quả d... phân cực trung bình chiếm đa số. Cao methanol từ cây ô dược cho hiệu quả ức chế quá trình tổng hợp melanin và không gây độc cho tế bào ở nồng độ 200 g/ml. Ở nồng độ 100 µg/ml và 200 µg/ml, cao methanol cây ô dược có thể ức chế 32,79% và 42,58% quá trình tổng hợp melanin. Cao methanol có khả năng bắt gốc tự do cao với IC50 = 58,89 g/ml. Các phân đoạn cao ô dược (hexane, chloroform, ethyl acetate, nước) đều có khả năng bắt gốc tự do và khả năng bắt gốc tự do tỉ lệ thuận với nồng độ. Trong đó, phân đoạn ethyl acetate có hiệu quả loại bỏ gốc tự do cao nhất trong các phân đoạn còn lại với IC50 = 10,71 g/ml, cho hiệu quả ức chế tổng hợp melanin (42,58 %) và không gây độc với tế bào ở nồng độ 200 g/ml. Sắc ký cao tổng methanol có 8 cấu tử chính có độ phân cực khác nhau từ không phân cực đến phân cực. Phân đoạn cao ethyl acetate có 10 cấu tử chính và các cấu tử đầu có hàm lượng tương đối lớn, phân đoạn cao ethyl acetate chứa chủ yếu các hợp chất có độ phân cực trung bình. Kết quả nghiên cứu tạo cơ sở khoa học cho khoa học dược liệu cơ bản và nhằm góp phần định hướng cho những nghiên cứu tiếp theo về thành phần và hoạt tính sinh học của loài ô dược. 67 Đồ án tốt nghiệp 4.2. Đề nghị Phân tách các hợp chất và xác định cấu trúc của các hợp chất có hoạt tính ức chế melanin từ phân đoạn cao ethyl acetate của cây ô dược. Xác định cơ chế của các đơn chất có hoạt tính lên quá trình tổng hợp hắc tố. 68 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Võ Văn Chi (1997). Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, TP. Hồ Chí Minh. [2] Phạm Hoàng Hộ (1991). Cây cỏ Việt Nam, Mekong Printing, TP. Hồ Chí Minh. [3] Trần Phạm Tuệ Hưng, Nguyễn Thị Mỹ Hạnh, Quách Ngô Diễm Phương (2014). Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxi hoá, ức chế tyrosinase của cao ethanol chiết xuất từ huỳnh anh (Allamanda Neriifolia), Tạp chí phát triển kha học và công nghệ, 17 (T3), 61-69. [4] Đỗ Tất Lợi (2000). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y Học. [5] Bùi Thị Ngoan, Trần Thắng, Đào Tố Uyên, Phạm Văn Hoan (2009). Xác định Sudan I trong một số loại gia vị bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), Tạp chí y học thực hành, 1 (641+642), 58-60. [6] Dương Thị Kim Nguyên, Nguyễn Xuân Duy và Nguyễn Anh Tuấn (2012). Ảnh hưởng của điều kiện chiết lá Trà xanh và sử dụng dịch chiết để hạn chế biến đen ở tôm và oxi hóa chất béo ở cá, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 8, 67-74. [7] Nguyễn Kim Phi Phụng (2000-2001). Các phương pháp nhận danh; trích ly cô lập các hợp chất hữu cơ, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. [8] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007). Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. [9] Lê Đình Sáng (2010). Cây thuốc nam, Bách Khoa Y Học. [10] Nguyễn Trọng Tuân, Nguyễn Quốc Châu Thanh, Mai Văn Hiếu (2017). Thành phần hoá học và hoạt tính kháng oxy hoá của cây Bạch đầu ông (Vernoria cinereae L.) Less, Họ Cúc (Asteaceae), Tạp chí Khoa học trường Đại học Cần Thơ, 49(A), 104 - 109. 69 Đồ án tốt nghiệp [11] Đái Thị Xuân Trang, Nguyễn Thị Yến Chi, Trương Đình Yến An, Phan Kim Định (2014). Khảo sát khả năng kháng oxy hoá của cây ô rô (Acanthus ilicifolius L.), Tạp chí khoa học, 35, 104-110. [12] Đái Thị Xuân Trang, Nguyễn Thị Mai Phương, Võ Thị Ngọc Diễm, Quách Tú Huê (2012). Khảo sát hiệu quả hạ đường huyết và chống oxy hóa của cao chiết cây Nhàu (Morindan citrifolia L.) ở chuột bệnh tiểu đường, Tạp chí Khoa học, Đại học Cần Thơ, 23b; 115 -124. [13] Đái Thị Xuân Trang, Võ Thị Tú Anh (2016). Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và kháng vi khuẩn Enterobacter cloacae của các cao chiết từ cây cỏ mật (Eclipta alba Hask), Tạp chí Khoa học, Đại học Cần Thơ, Vol 19, T5, 76 - 83. Tài liệu nước ngoài [14] Amarowicz, R., Peggb, R. B., Rahimi-Moghaddamc, P., Barl, B. and Weil, J. A. (2004). Free-radical scavenging capacity and antioxidant activity of selected plant species from the Canadian prairies, Food Chemistry, 84, 551-562. [15] Ana, L.K., Kavanagh, R.J., Wakamatsu, K., Ito, S., Pipitone M.A. and Abdel-Malek, Z.A. (2003). Cutaneous Photobiology. The Melanocyte vs the Sun: Who Will Win the Final Round?, Pigment Cell Research,16, 434-447. [16] Andrzej, S. and John, P. (1988). Animals under the Sun: Effects of Ultraviolet Radiation on Mammalian Skin, Clinics in Dermatology, 16, 503-515. [17] Blois, M. S. (1958). Antioxidant determinations by the use of a stable free radical, Nature, 26, 1199–1200. 
 [18] Brand-Williams, W., Cuvelier, M.E. and Berset, C. (1995). Use of free radical method to evaluate antioxidant activity, Lebensmittel-Wissenschaft and Technology, 28, 25-30. [19] Brenner, M. and Hearing, V.J. (2008). The protective role of melanin against UV damage in human skin, Photochemistry and Photobiology, 84 (3), 539– 49. 70 Đồ án tốt nghiệp [20] Briganti, S., Camera, E. and Picardo, M. (2003). Natural Resources Containing Arbutin. Determination of Arbutin in the Leaves of Bergenia crassifolia (L.) Fritsch, Notulse Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca, 37, 129-132. [21] Briganti, S., Camera, E., and Picardo, M. (2003). Chemical and Instrumental approaches to treat hyperpigmention, Pigment Cell Research, 16, 101- 110. [22] Cai, Y., Luo, Q., Sun, M. and Corke, H. (2004). Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plants associated with anticancer, Life science, 74, 2157-2184. [23] Chang, Y.C., Chang, F.R. and Wu, Y.C. (2000). The constituents of Lindera glauca, Journal of the Chinese Chemical Society, 47, 373–380. [24] Chen, C.Y., Kuo, P.L., Chen, Y.H., Huang, J.C., Ho, M.L., Lin, R.J., Chang, J.S., and Wang, H.M. (2009). Tyrosinase inhibition, free radical scavenging, antimicroorganism and anticancer proliferation activities of Sapindus mukorossi extracts, Dermatology Nursing, 16, 401-406. [26] Chen, H.Y., Lin, Y.C., and Hsieh, C.L. (2007). Evaluation of antioxidant activity of aqueous extract of some selected nutraceutical herbs, Journal of Food Chemistry, 104, 1418-1424. [27] Chou, G.X., Noerio, N., Ma, C.M., Wang, Z.T., Hattori, M., Xu, L.S. and Xu, G.J. (2000). Seven new sesquiterpene lactones from Lindera aggregate, Journal of China Pharmaceutical University, 31 (5), 339. [28] Duskova, J., Duse, J., Jahodar, L. and Poustka, F. (2005). Arbutin, salicin: the possibilities of their biotechnological production, Ceska a Slovenska farmacie, 54 (2), 78–81. [29] Flora of China Editorial Committee (1982). Flora Republicae Popularis Sinicae Lauraceae, Lindera, vol 31, Science Press, Beijing, 379. [30] Gentry, A.H. (1988). Changes in plant community diversity and floristic composition on environmental and geographical gradients, Annals of the Missouri Botanical Garden, 75, 1–34. 71 Đồ án tốt nghiệp [31] Gruber, J., Schaffer, S. and Halliwell, B. (2008). The mitochondrial free radical theory of ageing--where do we stand?, Frontiers in Bioscience, 13, 6554–79. [32] Han, Z., Zheng, Y.L., Chen, N., Luan, L.J., Zhou, C.X., Gan, L.S. and Wu, Y.J. (2008). Simultaneous determination of four alkaloids in Lindera aggregata by ultra-high-pressure liquid chro-matography-tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography, 1212 (1), 76–81. [33] Harman, D. (1956). Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry, Journal of Gerontology, 11 (3), 298-300. [34] Houghton, P.J. and Raman, A. (1998). Laboratory Handbook for Fractionation of Natural Extracts, Chapman and Hall, London, 199. [35] IUCN office in Vietnam and GIZ, (2004). Project paper BIODIV- Capacity building for development of access benefit sharing legislation in Vietnam, A Vietnamese-German Cooperation project, Implementing the biodiversity Convention. [36] Jimbow, K., Quevedo, W.C., Fitzpatrick, T.B. and Szabo, G. (1976). Some aspects of melanin biology: 1950–1975, The Journal of Investigative Dermatology, 67 (1), 72-89. [37] Karger, Barry, L. (1997). HPLC: Early and Recent Perspectives, Journal of Chemical Education, 74, 45. [38] Kedare, B. S. and Singh, P. R. (2011). Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay, Journal of Food Science and Technology, 48, 412–422. [39] Kim, J.A., Jung, Y.S., Kim, M.Y., Yang, S.Y., Lee, S. and Kim, Y.H. (2011). Protective effect of components isolated from Lindera erythrocarpa against oxidative stress-induced apoptosis of H9c2 cardiomyocytes, Phytotherapy Reseach, 25(11), 1612 – 1617. [40] Lee, S.M., Baek, S.H., Lee, C.H., Lee, H.B. and Kho, Y.H. (2002), Cyto- toxicity of lignans from Lindera erytherocarpa Makino, Natural Product Sciences, 8(3), 100 - 102. 72 Đồ án tốt nghiệp [41] MacKay, D., Hathcock, J. and Guarneri, E. (2012). Niacin: Chemical forms, bioavailability, and health effects, Nutrition Reviews, 70 (6), 357–366. [42] McMaster, M.C. (2007). HPLC, a practical user's guide, Wiley. [43] Meredith, P. and Riesz, J. (2004). Radiative relaxation quantum yields for synthetic eumelanin, Photochemistry and Photobiology, 79 (2), 211-6. [44] Mustafa, R. A., Abdul Hamid, A., Mohamed, S. and Abu Bakar, E. (2010). Total phenolic compounds, flavonoids, and radical scavenging activity of 21 selected tropical plants, Journal of Food Science, 75(1), C28-35. [45] Nguyen, Q.V. and Eun, J.B. (2013). Antimicrobial activity of some Vietnamese medicinal plants extracts, Journal of Medicinal Plants Research Vol. 7 (35), 2597-2605. [46] O'Donoghue, J.L. (2006). Hydroquinone and its analogues in dermatology – a risk-benefit viewpoint, Journal of Cosmetic Dermatology, 5 (3), 196–203. [47]Przemyslaw, M.P. and Maja, G. (2006). Melanin Synthesis in Microorganisms - Biotechnological and Medical Aspects, Acta Biochimica Polonica, 53, 429-443. [48] Sarangarajan, R. and Apte, S.P. (2005). Melanin aggregation and polymerization: possible implications in age-related macular degeneration, Ophthalmic Research. 37 (3), 136–41. [49] Solano, F., Briganti, S., Picardo, M., and Ghanem, G. (2006). Hypoigmenting agents: an updated review on biological, chemical and clinical aspects, Rigment Cell Rresearch, 19, 500-571. [50] Suganya, T., Siriporn, O. and Sombat, C. (2007). Study on antioxidant activity of certain plants in Thailand: Mechanism of antioxidant action of guava leaf extract, Journal of Food Chemistry, 103, 381-388. [51] Takeda, K., Minato, H., Ishikawa, M. (1964a). Components of the root of Lindera strychnifolia Vill. Part VIII. Structures of linderalactone and isolinderalactone, Journal of the Chemical Society, 4578–4582. 73 Đồ án tốt nghiệp [52] Tanaka, H., Ichino, K. and Ito, K. (1985). A novel flavanone, lindera-tone, from Lindera umbellate, Chemical and Pharmaceuti-cal Bulletin, 33 (6), 2602–2604. [53] Van der Werff, H., Richter, H.G. (1996). Toward an improved classif ication of Lauraceae, Annals of the Missouri Botanical Garden, 83, 409–418. [54] Wang, K.H. and Lin, R.D. (2006). Cosmetic applications of selected Chinese herbal medicines, Journal of Ethnopharmacology, 106, 353-359. [55] Zhang, C.F., Wang, Z.T. (2000). An advance in the study on medicinal plant of Lindera, Shenyang Pharmaceutical University, 17(3), 230–234. Tài liệu internet [56] Cơ sở dữ liệu Wikipedia, 7/2017, https://en.wikipedia.org/wiki/Hydroquinone [57] Cơ sở dữ liệu Wikipedia, 1/2015, https://en.wikipedia.org/wiki/Kojic [58] Cơ sở dữ liệu Wikipedia, 6/2017, https://en.wikipedia.org/wiki/Azelaic_acid [59] Cơ sở dữ liệu Wikipedia, 4/2017, https://vi.wikipedia.org/wiki/Vitamin_C [60] Flora of China Editorial Committee, 2010, =118626 74 Đồ án tốt nghiệp 75 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: THỐNG KÊ KẾT QUẢ HIỆU SUẤT THU HỒI CÁC ĐOẠN MẪU CAO CHIẾT Ô DƢỢC Bảng 1. Hiệu suất thu hồi cao dịch chiết với các dung môi khác nhau Dung môi Ethyl Methanol Hexan Chloroform Nƣớc tách chiết acetate Khối lƣợng 500 30 30 30 30 mẫu chiết (g) Khối lƣợng cao thu đƣợc 62,320 1,038 3,170 7,035 12,906 (g) Hiệu suất thu 12,464 3,460 10,567 23,450 43,020 hồi (%) 1 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: THỐNG KÊ KẾT QUẢ KHẢ NĂNG BẮT GỐC TỰ DO CỦA MẪU CHUẨN VITAMIN C VÀ CÁC MẪU CAO CHIẾT Ô DƢỢC Bảng 2. Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của VitaminC OD Nồng độ % Bắt Độ lệch OD1 OD2 OD3 trung (g/ml) gốc tự do chuẩn bình 0,0000 0,65 0,69 0,67 0,67 0,00 3,30 2,0 0,47 0,48 0,49 0,48 28,29 1,15 3,9 0,39 0,39 0,40 0,39 49,8 0,17 7,8 0,32 0,32 0,32 0,32 56,2 0,17 15,6 0,14 0,15 0,15 0,15 70,1 0,87 31,3 0,08 0,08 0,08 0,08 85,1 0,09 R2 = 0.98 IC50 = 6 g/ml do tự gốc bắt % Nồng độ mẫu (mg/ml) Hình 1. Đồ thị thể hiện khả năng chống oxi hóa của vitamin C 2 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3. Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Methanol thu được OD Nồng độ % Bắt Độ lệch OD1 OD2 OD3 trung (g/ml) gốc tự do chuẩn bình 7,8125 0,452 0,45 0,454 0,452 6,996 0,412 15,625 0,413 0,427 0,412 0,417 14,129 1,726 31,25 0,358 0,349 0,352 0,353 27,366 0,934 62,5 0,246 0,234 0,234 0,238 51,029 1,426 125 0,089 0,094 0,103 0,095 80,384 1,459 250 0,085 0,085 0,085 0,085 82,579 0,119 (+)Vitamin C 0,085 0,075 0,081 0,080 78,463 0,005 (100 g/ml) (-) Ethanol 0,504 0,496 0,458 0,486 0 0,025 Nonlinear Regression Data Source: Data 1 in Notebook2 Equation: Hyperbola, Modified Hyperbola III f=a-b/(1+c*x)^(1/d) R Rsqr Adj Rsqr Standard Error of Estimate 0.9977 0.9955 0.9887 3.4869 Coefficient Std. Error t P VIF a 84.5329 3.4812 24.2827 0.0017 5.9803< b 88.3460 5.9305 14.8969 0.0045 5.6927< c -0.0040 0.0031 -1.2923 0.3254 161.4922< d -0.2849 0.2644 -1.0774 0.3940 171.1631< Analysis of Variance: Uncorrected for the mean of the observations: DF SS MS Regression 4 16857.9751 4214.4938 Residual 2 24.3175 12.1588 3 Đồ án tốt nghiệp Total 6 16882.2927 2813.7154 Corrected for the mean of the observations: DF SS MS F P Regression 3 5375.1004 1791.7001 147.3587 0.0067 Residual 2 24.3175 12.1588 Total 5 5399.4180 1079.8836 Statistical Tests: PRESS 355967.7292 Durbin-Watson Statistic 2.5195 Failed Normality Test Passed (P = 0.8795) K-S Statistic = 0.2250 Significance Level = 0.8795 Constant Variance Test Passed (P = 0.0600) Power of performed test with alpha = 0.0500: 1.0000 Regression Diagnostics: Row Std. Res. Stud. Res. Stud. Del. Res. 1 -0.5604 -9.7681< (+inf)< 2 1.0343 4.1713< (+inf)< 3 -0.3780 -0.6008 -0.4693 4 -0.5384 -0.7179 -0.5892 5 0.0098 0.0121 0.0086 6 0.4281 0.7587 0.6357 Influence Diagnostics: Row Cook's Dist Leverage DFFITS 1 7223.6434< 0.9967 (+inf)< 2 66.4029< 0.9385 (+inf)< 3 0.1377 0.6041 -0.5798 4 0.1003 0.4376 -0.5198 5 1.9069E-005 0.3414 0.0062 6 0.3081 0.6816 0.9301 95% Confidence: Row Predicted 95% Conf-L 95% Conf-U 95% Pred-L 95% Pred-U 1 84.5329 69.5546 99.5113 63.3328 105.7331 2 76.7775 62.2430 91.3121 55.8886 97.6665 3 52.3470 40.6859 64.0081 33.3451 71.3490 4 29.2436 19.3183 39.1689 11.2546 47.2326 5 14.0946 5.3281 22.8611 -3.2819 31.4712 6 5.5031 -6.8833 17.8894 -13.9524 24.9585 4 Đồ án tốt nghiệp Bảng 4. Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Hexan thu được OD Nồng độ % Bắt Độ lệch OD1 OD2 OD3 trung (g/ml) gốc tự do chuẩn bình 7,8125 0,499 0,454 0,455 0,470 9,744 4,941 15,625 0,428 0,448 0,421 0,462 11,218 2,695 31,25 0,409 0,407 0,417 0,411 20,962 1,018 62,5 0,383 0,377 0,388 0,383 26,411 1,059 125 0,343 0,34 0,346 0,343 34,038 0,577 250 0,25 0,278 0,283 0,274 48,013 3,424 500 0,184 0,206 0,179 0,190 63,526 2,762 (+)Vitamin C 0,085 0,075 0,081 0,080 78,463 0,005 (100 g/ml) (-) Ethanol 0,526 0,52 0,514 0,520 0 0,006 Nonlinear Regression Data Source: Data 1 in Notebook3 Equation: Hyperbola, Modified Hyperbola III f=a-b/(1+c*x)^(1/d) R Rsqr Adj Rsqr Standard Error of Estimate 0.9957 0.9915 0.9829 2.4612 Coefficient Std. Error t P VIF a668211.49938062283.6311 0.0829 0.9392 0.0000 b668201.67938062283.6916 0.0829 0.9392 0.0000 c 0.0142 0.0075 1.8972 0.1541 0.0000 d26287.7969317322.6275 0.0828 0.9392 0.0000 Analysis of Variance: Uncorrected for the mean of the observations: DF SS MS Regression 4 8997.2325 2249.3081 Residual 3 18.1727 6.0576 Total 7 9015.4052 1287.9150 Corrected for the mean of the observations: DF SS MS F P 5 Đồ án tốt nghiệp Regression 3 2111.1231 703.7077 116.1701 0.0013 Residual 3 18.1727 6.0576 Total 6 2129.2958 354.8826 Statistical Tests: PRESS 73.5003 Durbin-Watson Statistic 1.7245 Passed Normality Test Passed (P = 0.9710) K-S Statistic = 0.1739 Significance Level = 0.9710 Constant Variance Test Failed (P = 0.0145) Power of performed test with alpha = 0.0500: 1.0000 Regression Diagnostics: Row Std. Res. Stud. Res. Stud. Del. Res. 1 0.2242 0.5952 0.5175 2 -0.1235 -0.1504 -0.1232 3 -0.6958 -0.9019 -0.8625 4 0.1836 0.2219 0.1827 5 0.7364 0.8341 0.7771 6 0.7918 0.9649 0.9487 7 -1.1168 -1.6463 -4.3263< Influence Diagnostics: Row Cook's Dist Leverage DFFITS 1 0.5357 0.8581 1.2727 2 0.0027 0.3258 -0.0857 3 0.1383 0.4047 -0.7112 4 0.0057 0.3148 0.1238 5 0.0492 0.2204 0.4132 6 0.1129 0.3266 0.6608 7 0.7948 0.5398 -4.6856 95% Confidence: Row Predicted 95% Conf-L 95% Conf-U 95% Pred-L 95% Pred-U 1 62.9738 55.7181 70.2295 52.2969 73.6507 2 48.3167 43.8461 52.7874 39.2980 57.3354 3 35.7510 30.7679 40.7341 26.4676 45.0345 4 25.9583 21.5635 30.3531 16.9769 34.9396 5 19.1490 15.4716 22.8265 10.4960 27.8020 6 14.9102 10.4336 19.3867 5.8885 23.9318 7 12.4923 6.7375 18.2471 2.7729 22.2118 6 Đồ án tốt nghiệp Bảng 5. Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Chloroform thu được OD Nồng độ % Bắt Độ lệch OD1 OD2 OD3 trung (mg/ml) gốc tự do chuẩn bình 7,8125 0,425 0,414 0,412 0,417 19,807 1,346 15,625 0,402 0,406 0,409 0,406 21,987 0,675 31,25 0,371 0,374 0,378 0,375 28,013 0,675 62,5 0,346 0,341 0,341 0,343 34,103 0,555 125 0,272 0,267 0,272 0,271 48,013 0,555 250 0,178 0,173 0,172 0,174 66,475 0,618 500 0,084 0,084 0,084 0,084 83,846 0 (+)Vitamin C (0,1 0,084 0,084 0,084 0,080 78,463 0,005 mg/ml) (-) Ethanol 0,526 0,52 0,514 0,520 0 0,06 Nonlinear Regression Data Source: Data 1 in Notebook4 Equation: Hyperbola, Modified Hyperbola III f=a-b/(1+c*x)^(1/d) R Rsqr Adj Rsqr Standard Error of Estimate 0.9997 0.9994 0.9987 0.8641 Coefficient Std. Error t P VIF a 93.8184 10.3487 9.0657 0.0028 1004.1178< b 76.1638 10.6736 7.1357 0.0057 564.9454< c 4.6522E-006 0.0014 0.0033 0.9976 260704930.6461< d 0.0011 0.3506 0.0033 0.9976 261101986.3610< Analysis of Variance: Uncorrected for the mean of the observations: DF SS MS Regression 4 16575.4928 4143.8732 Residual 3 2.2398 0.7466 Total 7 16577.7326 2368.2475 7 Đồ án tốt nghiệp Corrected for the mean of the observations: DF SS MS F P Regression 3 3525.3231 1175.1077 1573.9533 <0.0001 Residual 3 2.2398 0.7466 Total 6 3527.5629 587.9272 Statistical Tests: PRESS 71.2012 Durbin-Watson Statistic 3.0505 Failed Normality Test Passed (P = 0.6450) K-S Statistic = 0.2634 Significance Level = 0.6450 Constant Variance Test Passed (P = 0.0956) Power of performed test with alpha = 0.0500: 1.0000 Regression Diagnostics: Row Std. Res. Stud. Res. Stud. Del. Res. 1 -0.0454 -0.6453 -0.5677 2 0.1677 0.6009 0.5231 3 -0.0645 -0.0977 -0.0799 4 -0.7969 -0.9753 -0.9636 5 1.4398 1.7228 13.6059< 6 -0.4280 -0.5707 -0.4936 7 -0.2727 -0.3670 -0.3066 Influence Diagnostics: Row Cook's Dist Leverage DFFITS 1 20.9500< 0.9951 -8.0542 2 1.0679 0.9221 1.7992 3 0.0031 0.5636 -0.0908 4 0.1184 0.3323 -0.6798 5 0.3203 0.3015 8.9396< 6 0.0634 0.4376 -0.4353 7 0.0273 0.4479 -0.2762 95% Confidence: Row Predicted 95% Conf-L 95% Conf-U 95% Pred-L 95% Pred-U 1 83.8854 81.1424 86.6284 80.0014 87.7694 2 66.3294 63.6889 68.9699 62.5171 70.1417 3 48.0686 46.0042 50.1329 44.6301 51.5070 4 34.7911 33.2059 36.3764 31.6171 37.9651 5 26.7688 25.2588 28.2787 23.6316 29.9059 6 22.3570 20.5381 24.1760 19.0600 25.6540 7 20.0433 18.2031 21.8836 16.7346 23.3521 8 Đồ án tốt nghiệp Bảng 6. Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Ethyl acetate thu được OD Nồng độ % Bắt Độ lệch OD1 OD2 OD3 trung (g/ml) gốc tự do chuẩn bình 1,953125 0,446 0,423 0,431 0,434 16,667 2,245 3,90625 0,354 0,398 0,393 0,382 26,601 4,633 7,8125 0,287 0,304 0,275 0,289 44,487 2,802 15,625 0,18 0,267 0,2 0,216 58,526 8,763 31,25 0,079 0,101 0,083 0,088 83,141 2,254 62,5 0,079 0,082 0,076 0,079 84,808 0,577 125 0,074 0,071 0,075 0,073 85,897 0,401 250 0,082 0,081 0,081 0,082 84,359 0,111 500 0,087 0,085 0,086 0,086 83,462 0,192 (+)Vitamin C 0,084 0,084 0,084 0,080 78,463 0,005 (100 g/ml) (-) Ethanol 0,526 0,52 0,514 0,520 0 0,006 Nonlinear Regression Data Source: Data 1 in Notebook5 Equation: Hyperbola, Modified Hyperbola III f=a-b/(1+c*x)^(1/d) R Rsqr Adj Rsqr Standard Error of Estimate 0.9963 0.9926 0.9816 3.8599 Coefficient Std. Error t P VIF a 85.5243 3.8380 22.2838 0.0020 5.9319< b 77.1442 7.0683 10.9141 0.0083 5.9743< c -0.0160 0.0194 -0.8229 0.4970 238.9774< 9 Đồ án tốt nghiệp d -0.2416 0.3407 -0.7092 0.5517 249.2193< Analysis of Variance: Uncorrected for the mean of the observations: DF SS MS Regression 4 20464.8107 5116.2027 Residual 2 29.7981 14.8991 Total 6 20494.6088 3415.7681 Corrected for the mean of the observations: DF SS MS F P Regression 3 4007.9813 1335.9938 89.6697 0.0110 Residual 2 29.7981 14.8991 Total 5 4037.7794 807.5559 Statistical Tests: PRESS 4446.1646 Durbin-Watson Statistic 3.2826 Failed Normality Test Passed (P = 0.9989) K-S Statistic = 0.1443 Significance Level = 0.9989 Constant Variance Test Passed (P = 0.0600) Power of performed test with alpha = 0.0500: 0.9998 Regression Diagnostics: Row Std. Res. Stud. Res. Stud. Del. Res. 1 -0.1856 -1.7425 (+inf)< 2 0.5167 1.5586 (+inf)< 3 -0.9195 -1.4175 (+inf)< 4 0.8678 1.2108 1.6568 5 0.0354 0.0438 0.0310 6 -0.3144 -0.5850 -0.4543 Influence Diagnostics: Row Cook's Dist Leverage DFFITS 1 66.1143< 0.9886 (+inf)< 2 4.9200< 0.8901 (+inf)< 3 0.6916 0.5793 (+inf)< 4 0.3470 0.4863 1.6120 5 0.0003 0.3446 0.0224 6 0.2105 0.7111 -0.7127 95% Confidence: Row Predicted 95% Conf-L 95% Conf-U 95% Pred-L 95% Pred-U 1 85.5243 69.0108 102.0377 62.1038 108.9447 2 81.1468 65.4778 96.8157 58.3139 103.9796 3 62.0747 49.4346 74.7149 41.2038 82.9457 4 41.1376 29.5559 52.7192 20.8902 61.3850 5 26.4658 16.7164 36.2153 7.2077 45.7239 6 17.8804 3.8759 31.8849 -3.8440 39.6048 10 Đồ án tốt nghiệp Bảng 7. Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao nước thu được OD Nồng độ % Bắt Độ lệch OD1 OD2 OD3 trung (g/ml) gốc tự do chuẩn bình 7,8125 0,438 0,433 0,418 0,429 17,372 2,001 15,625 0,454 0,446 0,423 0,441 15,192 3,095 31,25 0,405 0,405 0,387 0,399 23,263 1,999 62,5 0,358 0,359 0,338 0,352 32,372 2,278 125 0,294 0,297 0,285 0,292 43,846 1,201 250 0,203 0,208 0,189 0,2 61,538 1,894 500 0,081 0,091 0,086 0,086 83,462 0,962 (+)Vitamin C 0,084 0,084 0,084 0,080 78,463 0,005 (100 g/ml) (-) Ethanol 0,526 0,52 0,514 0,520 0 0,006 Nonlinear Regression Data Source: Data 1 in Notebook6 Equation: Hyperbola, Modified Hyperbola III f=a-b/(1+c*x)^(1/d) R Rsqr Adj Rsqr Standard Error of Estimate 0.9982 0.9964 0.9929 2.1294 Coefficient Std. Error t P VIF a31104.525727689864.1744 0.0011 0.9992 1.1836E+015< b31091.995527689865.9170 0.0011 0.9992 1.1816E+015< c 0.0093 0.0248 0.3762 0.7318 4324.5295< d 760.5390 679013.9462 0.0011 0.99921568586103.9745< Analysis of Variance: Uncorrected for the mean of the observations: DF SS MS Regression 4 14783.6681 3695.9170 Residual 3 13.6034 4.5345 Total 7 14797.2715 2113.8959 11 Đồ án tốt nghiệp Corrected for the mean of the observations: DF SS MS F P Regression 3 3818.3234 1272.7745 280.6888 0.0004 Residual 3 13.6034 4.5345 Total 6 3831.9268 638.6545 Statistical Tests: PRESS 105.0394 Durbin-Watson Statistic 2.6681 Failed Normality Test Passed (P = 0.5592) K-S Statistic = 0.2817 Significance Level = 0.5592 Constant Variance Test Failed (P = 0.0061) Power of performed test with alpha = 0.0500: 1.0000 Regression Diagnostics: Row Std. Res. Stud. Res. Stud. Del. Res. 1 0.0398 0.1639 0.1344 2 -0.0870 -0.5244 -0.4492 3 -0.1345 -0.1712 -0.1405 4 0.4952 0.6675 0.5907 5 0.1286 0.1616 0.1326 6 -1.3642 -1.6000 -3.4112< 7 0.9220 1.6292 3.9185< Influence Diagnostics: Row Cook's Dist Leverage DFFITS 1 -0.1207 1.0590 (+inf)< 2 2.4315 0.9725 -2.6718 3 0.0045 0.3826 -0.1106 4 0.0910 0.4496 0.5339 5 0.0038 0.3666 0.1009 6 0.2404 0.2731 -2.0908 7 1.4084 0.6797 5.7088< 95% Confidence: Row Predicted 95% Conf-L 95% Conf-U 95% Pred-L 95% Pred-U 1 83.3768 76.4031 90.3505 73.6528 93.1008 2 61.7236 55.0407 68.4066 52.2059 71.2413 3 44.1326 39.9408 48.3244 36.1642 52.1011 4 31.3173 26.7732 35.8614 23.1580 39.4765 5 22.9953 18.8921 27.0985 15.0731 30.9175 6 18.0972 14.5558 21.6385 10.4509 25.7435 7 15.4085 9.8213 20.9957 6.6255 24.1915 12 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C: THỐNG KÊ KẾT QUẢ TÁC DỤNG CỦA CAO METHANOL Ô DƢỢC LÊN QUÁ TRÌNH TỔNG HỢP MELANIN Bảng 8. Tác dụng của cao methanol ô dược lên quá trình tổng hợp melanin Nồng độ mẫu Độ lệch % Melanin % Ức chế (g/ml) chuẩn 12,5 99,76 0,24 4,21 25,0 93,34 6,66 2,22 50,0 84,11 15,89 1,33 100,0 67,21 32,79 4,56 200,0 57,42 42,58 4,88 PBS 100 0 1,42 Arbutin 80,03 19,97 3,37 (200 g/ml) 13 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC D: THỐNG KÊ KẾT QUẢ KHẢO SÁT TÁC DỤNG CỦA CAO METHANOL Ô DƢỢC LÊN ĐỘC TÍNH TẾ BÀO Bảng 9. Tác dụng của cao methanol ô dược lên độc tính tế bào Nồng độ mẫu % Tế bào sống Độ lệch chuẩn (µg/ml) 12,5 101,3 5,21 25,0 97,34 4,22 50,0 98,33 4,33 100,0 96,23 4,56 200,0 95,14 4,11 PBS 100 3,42 Arbutin 99,4 2,37 (200 µg/ml) 14 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC E: CÁC GIAI ĐOẠN CHIẾT CÁC PHÂN ĐOẠN CAO Ô DƢỢC Hình 2. Các giai đoạn chiết phân đoạn. (A) Chiết lỏng – lỏng, (B) Dịch chiết các phân đoạn, (C) Cô quay chân không dịch chiết, (D) Cao phân đoạn thu được sau cô quay 15 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC F: HÌNH ẢNH THỬ NGHỆM KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HOÁ CỦA MẪU CAO CHIẾT Ô DƢỢC BẰNG PHƢƠNG PHÁP DPPH Nồng độ mẫu (mg/ml) 0,25 Đối chứng (+) 0,125 Vitamin C 0,0625 Đối chứng (-) 0,03125 Ethanol 0,015625 0,0078125 Hình 3. Phản ứng DPPH cao Methanol (A) (B) (C) (D) (+) (-) Hình 4. Phản ứng DPPH các cao phân đoạn. (A) cao hexan, (B) cao chloroform, (C) cao ethyl acetate, (D) cao nƣớc, (+) đối chứng dƣơng vitamin C, (-) đối chứng âm ethanol. 16 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC G: THỐNG KÊ KẾT QUẢ GIÁ TRỊ IC50 CỦA MẪU CHUẨN VÀ CÁC MẪU CAO CHIẾT Ô DƢỢC Bảng 10. Giá trị IC50 cảu các đoạn cao chiết và mẫu chuẩn Vitamin C Các phân Ethyl Vitamin Methanol Hexan Chloroform Nƣớc đoạn acetate C IC 50 58,89 273,13 136,63 10,71 161,62 6 (g/ml) 17 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC H: CÁC THUỐC THỬ DÙNG TRONG QUÁ TRÌNH XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HOÁ HỌC F1. Thử nghiệm định tính Carbohydrate  Molisch: Thuốc thử Molisch: Hoà tan 5g -napthon vào ethanol 95%. Định mức đến 100ml.  Fehling: Thuốc thử Fehling A: hoà tan 34,6g CuSO4.5H2O vào 500ml nước cất. Thuốc thử Fehling B: Hoà tan 125g KOH và 173g Kali Natri tartrate.7H2O vào 500 ml nước cất. F2. Thử nghiệm định tính Alkaloid  Mayer: Hoà tan 1,358g HgCl2 trong 60ml nước, sau đó đổ vào trong dung dịch này 5g KI được pha trong 10ml nước. Định mức đến 100ml.  Wagner: Hoà tan 2g iodine và 6g KI vào 100ml nước cất. 18 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC G: HÌNH ẢNH KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH THÀNH PHẦN HOÁ HỌC TRONG MẪU CAO CHIẾT C. Ethyl C. Chlor C. Methanol C. Nước acetate -form Hình 5. Hình ảnh thử nghiệm Fehling định tính Carbohydrate C. Methanol C. Chloro- C. Ethyl C.Nước C.Methanol C.Chloro C.Ethyl C.Nước form acetate form acetate (A) (B) Hình 6. Hình ảnh thử nghiệm Molish (A) và Benedict (B) định tính Carbohydrate C. Methanol C.Chloro C. Ethyl C.Nước C. Methanol C. Chloro C. Ethyl C. Nước form acetate form acetate Hình 7. Hình ảnh thử nghiệm Wagner (A) và Mayer (B) định tính Alkaloid 19 Đồ án tốt nghiệp C.Methnol C. Chloro- C.Ethyl C.Nước form acetate Hình 8. Hình ảnh thử nghiệm Foam định tính Saponin C. Methnol C.Chloro C.Ethyl C.Nƣớc -form acetate Hình 9. Hình ảnh thử nghiệm Bontranger định tính Glycoside 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 (A) (B) (C) Hình 10. Hình ảnh định tính Flavonoid. (A) thử nghiệm Alkaline, (B) thử nghiệm Shinoda, (C) thử nghiệm Ferric chloride. 1-cao methnol, 2-cao chloroform, 3-cao ethyl acetate, 4-cao nước C. Methanol C. Chloroform C.Ethyl acetate C.Nƣớc Hình 11. Hình ảnh định tính Phenolic và tannin bằng thử nghiệm Gelatin 20 Đồ án tốt nghiệp C. Methanol C. Chloroform C. Ethyl acetate C. Nước Hình 12. Hình ảnh định tính chất nhầy Hình 13. Hình ảnh định tính chất béo bằng thử nghiệm Spot C. Methanol C.Ethyl acetate C. Chloroform C.Nước Hình 14. Hình ảnh thử nghiệm Biuret định tính Protein 21 Đồ án tốt nghiệp 22