Đồ án Khảo sát đột biến gen ret trên ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận mang tính gia đình

ào tuyến thượng thận mang tính gia đình” là thành quả nghiên cứu trên cơ sở số liệu thực tế và được thực hiện dưới sự hướng dẫn trực tiếp của giáo viên hướng dẫn. Mọi tham khảo trong đồ án này đều được trích dẫn rõ ràng nguồn gốc. Mọi sao chép vi phạm quy chế của nhà trường em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Tp.Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 07 năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Mỹ Hiền LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Tp.HCM đã tận tình giảng dạy và truyền đạt những kiến thức, lòng nhiệt huyết cũng như niềm đam mê nghiên cứu cho em trong suốt thời gian học tập tại trường. Em xin gửi lời cảm ơn đến TS.BS. Đỗ Đức Minh, người thầy, người anh đã tận tình hướng dẫn em các thông tin về lâm sàng, về kiến thức sinh học phân tử trong suốt thời gian làm đồ án. Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các anh chị ở Trung tâm Y sinh học phân tử - Đại học Y Dược Tp. HCM đã luôn quan tâm, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận này. Thời gian học hỏi và làm việc trong môi trường thân thiện, luôn nhận được sự giúp đỡ cũng như góp ý nhiệt tình của anh chị ở Trung tâm là khoảng thời gian quý báu, mang lại cho em thêm nhiều kiến thức và kinh nghiệm trong quá trình làm việc. Và trên hết, con xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới gia đình. Cảm ơn cha, mẹ đã sinh thành, nuôi dưỡng con khôn lớn, luôn bên cạnh động viên, ủng hộ, dõi theo bước đường con đi. Tp.Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 07 năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Mỹ Hiền Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. U sắc bào tuyến thượng thận 2 1.1.1. Giới thiệu 2 1.1.2. Nguyên nhân 3 1.1.3. Biểu hiện 4 1.1.4. Xét nghiệm chẩn đoán 4 1.1.5. Điều trị 4 1.2. Bất thường di truyền 5 1.3. Các bệnh và hội chứng liên quan 8 1.3.1. Hội chứng NF1 8 1.3.2. Hội chứng VHL 8 1.3.3. Hội chứng MEN 9 1.4. Cấu trúc, đột biến, chức năng của gen RET 10 1.5. Các phương pháp giải trình tự 13 1.5.1. Phương pháp hóa học 13 1.5.2. Phương pháp enzyme 13 1.5.3. Giải trình tự bằng máy tự động (automated sequencer) 14 1.5.4. Kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới-454 Pyrosequencing 15 1.6. Cơ sở dữ liệu và phần mềm phân tích trình tự nucleotide 16 1.6.1. Cơ sở dữ liệu 16 1.6.2. Phần mềm phân tích trình tự nucleotide 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG - VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 2.1. Thiết kế nghiên cứu 17 2.2. Đối tượng nghiên cứu 17 i Đồ án tốt nghiệp 2.3. Vật liệu 19 2.3.1. Dụng cụ và thiết bị 19 2.3.2. Hóa chất 20 2.4. Sơ đồ quy trình thực hiện 23 2.5. Thuyết minh quy trình 24 2.5.1. Quy trình tách chiết DNA 24 2.5.1.1. Nguyên tắc: 24 2.5.1.2. Các bước thực hiện: 24 2.5.2. Quy trình PCR gen RET 25 2.5.2.1. Nguyên tắc: 25 2.5.2.2. Các bước thực hiện: 27 2.5.3. Điện di sản phẩm PCR 27 2.5.3.1. Nguyên tắc: 27 2.5.3.2. Các bước thực hiện: 29 2.5.4. Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR 30 2.5.4.1. Nguyên tắc: 30 2.5.4.2. Các bước thực hiện: 30 2.5.5. Quy trình cycle sequencing 31 2.5.5.1. Mục đích: 31 2.5.5.2. Các bước thực hiện: 31 2.5.6. Quy trình tủa sản phẩm cycle 32 2.5.6.1. Nguyên tắc: 32 2.5.6.2. Các bước thực hiện: 32 2.5.7. Giải trình tự bằng máy ABI 3500 33 2.5.7.1. Nguyên tắc: 33 2.5.7.2. Đọc trình tự chuỗi DNA: 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 3.1. Kết quả, bàn luận tách chiết 35 3.2. Kết quả, bàn luận PCR với cặp mồi đặc hiệu 35 ii Đồ án tốt nghiệp 3.3. Kết quả, bàn luận tinh sạch sản phẩm PCR 37 3.4. Phản ứng cycle sequencing và đọc kết quả giải trình tự 38 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận 44 4.2. Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ Aa Amino acid Bp Base pair CATE Catecholamines CT Computed tomography DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxynucleotide triphosphate ddNTP Dideoxynucleotide triphosphate GDNF Glial cell line Derived Neurotrophic Factor GFLs Family Ligands MEN2 Đa u tuyến nội tiết loại 2 MRI Chụp cộng hưởng từ (Magnetic resonance imaging) NCBI National Center For Biotechnology Information NF1 Neurofibromatosis loại 1 PCCs Pheochromocytomas PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi gen invitro) PGLs Paragangliomas PPGLs Pheochromocytomas và Paragangliomas RNA Ribonucleic acid SNP Điểm đa hình nucleotide đơn (Single Nucleotide Polymorphisms) VHL Hội chứng Von Hippel-Lindau iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Trình tự mồi xuôi và mồi ngược dùng cho phản ứng PCR ...................... 21 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR........................................................................ 27 Bảng 2.3: Các thông số điêṇ di DNA bằ ng gel agarose ............................................ 28 Bảng 2.4: Thành phần trong một phản ứng cycle sequencing ................................. 32 Bảng 2.5: Thành phần hỗn hợp tủa DNA .................................................................. 33 Bảng 3.1: Kết quả đo nồng độ nucleic acid trong mẫu.............................................. 35 Bảng 4.1: Kết quả giải trình tự phát hiện SNP tại exon 11, 13 [1] ........................... 44 v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Mô tả cách tiếp cận xét nghiệm gen theo hướng dẫn của Hội Nội tiết ....... 5 Hình 1.2: Bé trai 4 tuổi có biểu hiện điểm hạt cà phê và tàn nhang ............................ 8 Hình 1.3: Vị trí gen RET trên nhiễm sắc thể số 10 .................................................... 10 Hình 1.4: Cơ chế phân tử của đột biến gen RET ....................................................... 12 Hình 1.5: Hình kí xạ tự ghi kết quả giải trình tự DNA trên gel polyacrylamide ...... 14 Hình 1.6: Sơ đồ khối một máy tự động giải trình tự dùng bản gel polyarylamide ... 15 Hình 2.1: Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân ............................................................... 18 Hình 2.2: Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase ............................................................. 26 Hình 2.3: Các chu kỳ của PCR................................................................................... 26 Hình 2.4: Mô tả quá trình tinh sạch sản phẩm PCR .................................................. 30 Hình 3.1: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm các exon 10, 11,13, 14 - 15,16 .......... 36 Hình 3.2: So sánh trình tự mẫu RET1 (exon 11) với trình tự chuẩn ......................... 39 Hình 3.3: So sánh trình tự mẫu RET1 (exon 13) với trình tự chuẩn ......................... 39 Hình 3.4: So sánh trình tự mẫu RET2 (exon 11) với trình tự chuẩn ......................... 40 Hình 3.5: So sánh trình tự mẫu RET2 (exon 13) với trình tự chuẩn ......................... 40 Hình 3.6: So sánh trình tự mẫu RET3 (exon 11) với trình tự chuẩn ......................... 41 Hình 3.7: So sánh trình tự mẫu RET3 (exon 13) với trình tự chuẩn ......................... 41 Hình 3.8: So sánh trình tự mẫu RET4 (exon 11) với trình tự chuẩn ......................... 42 Hình 3.9: So sánh trình tự mẫu RET4 (exon 13) với trình tự chuẩn ......................... 42 Hình 3.10: So sánh trình tự mẫu RET5 (exon 11) với trình tự chuẩn ....................... 43 Hình 3.11: So sánh trình tự mẫu RET5 (exon 13) với trình tự chuẩn ....................... 43 vi Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU U sắc bào tuyến thượng thận (PPGLs) là bệnh nội tiết hiếm tại Việt Nam. Tìm hiểu về căn bệnh này giúp chúng ta có những biện pháp phòng ngừa, giảm nguy cơ mắc bệnh cũng như kịp thời thăm khám nếu gặp các triệu chứng bất thường. Paragangliomas (PGLs) là khối u có nguồn gốc từ mào thần kinh nằm ở các hạch thần kinh giao cảm hoặc phó giao cảm khắp cơ thể, khi khối u nằm ở tủy thượng thận thì gọi là pheochromocytomas (PCCs), với các triệu chứng lâm sàng là đánh trống ngực, nhức đầu và ra nhiều mồ hôi, kèm theo tăng huyết áp, tiết các chất catecholamines (CATE) [9]. Theo dõi lâm sàng là điều cần thiết để chẩn đoán và điều trị PPGLs, hầu hết các khối u tiết CATE nếu không được điều trị thì tỷ lệ tử vong do tim mạch cũng như di căn sang các mô, cơ quan lân cận rất cao. Việc xác định bất thường di truyền là quan trọng vì ít nhất 1/3 bệnh nhân bị PPGLs có đột biến dòng mầm gây bệnh ở 1 trong số 14 gen gây bệnh gồm: NF1, RET, VHL, SDHD, SDHC, SDHB, EGLN1/PHD2, KIF1B, SDH5/SDHAF2, IDH1, TMEM127, SDHA, MAX và HIF2A [5,9,11]. Theo hướng dẫn thực hành của Hội Nội tiết lâm sàng, bệnh nhân PPGLs cần được thăm khám và kiểm tra di truyền cho người thân để sàng lọc di truyền gây bệnh. Xuất phát từ thực tiễn trên nhóm tiến hành đề tài “Khảo sát đột biến gen RET trên ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận mang tính gia đình” bằng cách sử dụng phương pháp mô tả hàng loạt ca, với mục tiêu cụ thể: - Giải trình tự 6 exon gen RET (exon 10,11,13,14,15,16) - Phân tích kết quả giải trình tự gen dựa trên dữ liệu ngân hàng gen National Center For Biotechnology Information (NCBI) Đồ án tốt nghiệp gồm có 4 chương: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Đối tượng – Vật liệu – Phương pháp Chương 3: Kết quả – Bàn luận Chương 4: Kết luận – Kiến nghị 1 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Đồ án tốt nghiệp 1.1. U sắc bào tuyến thượng thận 1.1.1. Giới thiệu Paragangliomas (PGLs) là khối u có nguồn gốc từ mào thần kinh nằm ở các hạch thần kinh giao cảm hoặc phó giao cảm khắp cơ thể, khi khối u nằm ở tủy thượng thận thì gọi là pheochromocytomas (PCCs) và thường tiết các chất catecholamines (CATE): epinephrine, norepinephrine, dopamine. Khoảng 80-85% các khối u là PCCs và 15-20% là PGLs [9]. Tủy thượng thận nằm ở trung tâm của mỗi tuyến thượng thận bao gồm các tế bào thần kinh nội tiết (chromaffin) sản xuất và giải phóng epinephrine (adrenaline) vào máu để đáp ứng với kích hoạt của hệ thống thần kinh giao cảm. Neuroblastoma (u nguyên bào thần kinh) và pheochromocytomas (PCCs) là hai loại u quan trọng nhất phát sinh từ tủy thượng thận. Cả hai loại u này cũng có thể phát sinh từ các vị trí ngoài tuyến thượng thận, cụ thể trong vùng cận hạch của chuỗi giao cảm [17]. U sắc bào tuyến thượng thận bao gồm u lành tính hoặc ác tính của thượng thận. Một trong số đó được chú ý đến do sản xuất thừa hormones nội tiết. Ung thư thượng thận là sự hiện diện của các khối u ác tính ở tuyến thượng thận, bao gồm u nguyên bào thần kinh, ung thư biểu mô vỏ thượng thận (adrenocortical carcinoma) và một số u tế bào ưa crôm thượng thận (PGLs) [1]. Hầu hết u tế bào ưa crôm và tất cả các u tuyến thượng thận là những khối u lành tính, không di căn hoặc xâm lấn các mô lân cận, nhưng có thể gây ra vấn đề sức khỏe đáng kể bởi sự mất cân bằng hormones. Sự phổ biến của PPGLs ở bệnh nhân tăng huyết áp trong phòng khám ngoại trú nói chung dao động từ 0,2 - 0,6%. Ở trẻ em bị tăng huyết áp, sự phổ biến của PPGLs là khoảng 1,7%. Gần 5% bệnh nhân PCCs có khối u thượng thận tình cờ được phát hiện trên hình ảnh giải phẫu. Nghiên cứu khám nghiệm tử thi cho thấy khối u không được chẩn đoán trong 0,05 - 0,1% bệnh nhân [9]. PCCs sản xuất, tích trữ và tiết CATE. Hầu hết PCCs tiết cả epinephrine và norepinephrine và sự tiết này không liên quan đến kích thích thần kinh. Ngoài ra, PCCs còn tiết các hormones khác như adrenocorticotropic hormone, somatostatin, 2 Đồ án tốt nghiệp calcitonin, oxytocin và vasopressin. Nhiều công trình nghiên cứu về PPGLs đã đúc kết quy luật số 10 của bệnh lý này, đó là: 10% xảy ra ở trẻ em, 10% ác tính, 10% ngoài thượng thận và 10% không chức năng [11]. PCCs có ở mọi lứa tuổi, có thể độc lập hoặc liên kết với một hội chứng ung thư di truyền, chẳng hạn như đa u thần kinh nội tiết (Multiple endocrine neoplasma- MEN) loại 2A và 2B, u xơ thần kinh (neurofibromatosis) loại 1 (NF1), hoặc hội chứng Von Hippel-Lindau (VHL). Chỉ có 10% PCCs thượng thận ác tính, phần còn lại là lành tính [21]. Chẩn đoán xác định bằng đo nồng độ của các chất chuyển hóa CATE trong nước tiểu. Hầu hết PCCs được điều trị ban đầu với các thuốc kháng adrenergic, phẫu thuật được sử dụng để loại bỏ khối u khi bệnh nhân ổn định. 1.1.2. Nguyên nhân U sắc bào tuyến thượng thận có thể xuất hiện đơn lẻ (các khối u đặc, một bên và u ở trong vùng thượng thận) hoặc có tính chất gia đình (điển hình cũng ở tủy thượng thận nhưng thường nhiều ổ và ở cả 2 bên), ở hai nghiên cứu lớn, tần suất u tủy thượng thận có tính chất gia đình chiếm khoảng 30% và thường nằm trong bệnh cảnh của hội chứng di truyền trội nhiễm sắc thể thường. Những bất thường di truyền phối hợp với u tủy thượng thận có thể là nguyên nhân do đột biến gen sinh ung thư như RET hoặc gen ức chế u như VHL hoặc NF1. Khuyến cáo sàng lọc di truyền cho những bệnh nhân được chẩn đoán u tủy thượng thận trước 20 tuổi, u thượng thận 2 bên, đa u cận hạch, hay cho những bệnh nhân có tiền sử gia đình có người mắc u tủy thượng thận hay u cận hạch [22]. Vì PCCs xuất phát từ vùng tủy thượng thận, các khối u này giải phóng không liên tục một lượng các CATE có tác dụng sinh học gây ra các triệu chứng co mạch với tăng cả huyết áp tâm thu, tâm trương và tăng nhịp tim. Trong tế bào ưa crôm, norepinephrine và epinephrine được chuyển hóa bởi enzyme O-methyl transferase thành các dẫn xuất O-methyl tương ứng lần lượt là normetanephrine và metanephrine. Vì chuyển hóa CATE trong khối u độc lập với sự tình trạng giải phóng CATE (CATE có thể được giải phóng từng lúc hoặc với tỷ lệ thấp), định lượng các chất chuyển hóa của CATE ở huyết tương và ở nước tiểu có độ nhạy cao 3 Đồ án tốt nghiệp hơn và đóng vai trò căn bản trong chẩn đoán u tủy thượng thận [22]. Ngoài ra, môi trường ô nhiễm, chế độ ăn uống không khoa học, hút thuốc lá, sử dụng rượu bia trong thời gian dài, cũng làm tăng nguy cơ ung thư tuyến thượng thận. 1.1.3. Biểu hiện - Triệu chứng lâm sàng thường có: đánh trống ngực, nhức đầu, ra nhiều mồ hôi, kèm theo tăng huyết áp (lúc này triệu chứng trên sẽ có độ nhạy 91%, độ đặc hiệu 94%). - Tiết nhiều CATE có thể dẫn đến suy tim, phù phổi, loạn nhịp và xuất huyết nội sọ. Tuy nhiên triệu chứng nổi trội nhất vẫn là tăng huyết áp. Tăng tiết CATE làm cho bệnh nhân loạn nhịp tim. Các cơn kịch phát thường kéo dài dưới 1 giờ và có thể bị thúc đẩy bởi phẫu thuật, thay đổi tư thế, tập thể dục, mang thai [22]. 1.1.4. Xét nghiệm chẩn đoán Theo hướng dẫn thực hành của Hội Nội tiết lâm sàng khuyến cáo: - Xét nghiệm sinh hóa ban đầu: đo huyết tương metanephrines tự do hoặc metanephrines phân đoạn niệu, lấy mẫu máu bệnh nhân theo hướng dẫn của tài liệu tham khảo, sử dụng phương pháp sắc ký lỏng: phổ khối lượng hoặc phát hiện điện hóa. Đề nghị những bệnh nhân có kết quả xét nghiệm là dương tính cần được theo dõi mức độ tăng giá trị và biểu hiện lâm sàng [9]. - Hình ảnh học: chụp cắt lớp vi tính (CT), chụp MRI ở bệnh nhân có di căn, sử dụng 123 I-metaiodobenzylguanidine (MIBG) ghi xạ hình, sử dụng 18 F- fluorodeoxyglucose (18 FFDG) chụp cắt lớp phát xạ [9]. - Kiểm tra di truyền: thử nghiệm di truyền tại các phòng thí nghiệm uy tín với những bệnh nhân nghi ngờ đột biến dòng mầm và được tư vấn sau khi có kết quả [9]. 1.1.5. Điều trị - Cắt bỏ hoàn toàn khối u. - Điều chỉnh chế độ ăn uống có nhiều natri và chất lỏng để điều hòa việc tiết CATE gây ra co huyết khối để ngăn chặn hạ huyết áp nghiêm trọng sau khi loại bỏ khối u. 4 Đồ án tốt nghiệp 1.2. Bất thường di truyền Cứ 3 ca PPGLs thì có 1 ca là do nguyên nhân di truyền và chủ yếu là do đột biến dòng mầm tại 1 trong số 14 gen gồm: NF1, RET, VHL, SDHD, SDHC, SDHB, EGLN1/PHD2, KIF1B, SDH5/SDHAF2, IDH1, TMEM127, SDHA, MAX và HIF2A [9] Hình 1.1: Mô tả cách tiếp cận xét nghiệm gen theo hướng dẫn của Hội Nội tiết Có thể nghi ngờ 6 bệnh khác nhau về gia đình có biểu hiện lâm sàng: bệnh NF1, MEN2, VHL, ung thư biểu mô tế bào thận với đột biến SDHB [13], khối u car-ney (u tuyến thượng thận, khối u hạch dạ dày, chondroma phổi) và hội chứng Carney- Stratakis (u tuyến tụy và sarcomas dạ dày) [14]. Các hội chứng MEN2 và VHL thường được đặc trưng bởi các dấu hiệu lâm sàng riêng biệt hướng tới việc kiểm tra các gen RET và VHL. Phát hiện đột biến gen NF1 rất phức tạp mặc dù xét nghiệm có sẵn trong các phòng xét nghiệm trực tuyến, việc chẩn đoán xác định hội chứng chủ yếu dựa vào các triệu chứng lâm sàng [12]. Tuy nhiên, một số bệnh nhân có đột biến gen NF1 và một số báo cáo về PPGLs đều có đặc điểm tương đồng [4, 6]. Những phát hiện này cho thấy tầm quan trọng của việc 5 Đồ án tốt nghiệp điều tra về dấu hiệu lâm sàng có thể xảy ra của một đột biến cơ bản ở tất cả các bệnh nhân PPGL. Với bệnh gia đình (di truyền) việc phát hiện nguyên nhân gây bệnh giúp tư vấn di truyền chẩn đoán, điều trị sớm các thành viên khác trong gia đình. *Theo tờ báo của Hiệp hội Mỹ về việc quản lý bệnh Ung thư tuyến giáp dạng tuỷ [16] Nhóm bệnh MEN2A có đến 95% bệnh nhân đột biến gen RET ở codon 609, 611, 618 và 620 ở vị trí exon 10 hoặc codon 630, 634 của exon 11. Hầu như tất cả bệnh nhân có biểu hiện u tuyến giáp dạng tuỷ và một số ít bệnh nhân mắc bệnh PCCs hoặc u tuyến cận giáp, thường phụ thuộc vào đột biến đặc trưng của RET. Ví dụ như đột biến RET ở codon 634 khiến nguy cơ mắc PCCs cao và tăng theo độ tuổi. · 30 tuổi – 25%. · 50 tuổi – 52%. · 77 tuổi – 82%. Song, bệnh nhân mắc bệnh PCCs lại chiểm tỷ lệ thấp hơn khi bị đột biến exon 10. Tỷ lệ như sau: · Codon 609 – 4 → 26%. · Codon 611 – 10 → 25%. · Codon 618 – 12 → 23%. · Codon 620 – 13 → 24%. Nhóm bệnh MEN2B Khoảng 75% trường hợp MEN2B riêng lẻ và bệnh nhân bị ảnh hưởng bởi đột biến ở gen RET, 25% trường hợp xảy ra có liên quan đến di truyền trong gia đình. Với những bệnh nhân đột biến ở gen RET, có đến 95% bệnh nhân bị đột biến ở exon 16 (codon M918T) và 5% ở exon 15 (codon A883F). Tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh MEN2B phổ biến ở độ tuổi 20 cho đến 30. Tại Bệnh viện Chợ Rẫy (2005 – 2010), theo khảo sát ở 74 bệnh nhân về đặc điểm 6 Đồ án tốt nghiệp lâm sàng và cận lâm sàng các trường hợp u sắc bào tuỷ thượng thận, chúng tôi nhận thấy rằng độ tuổi mắc bệnh trung bình từ 40 – 49 tuổi (chiếm 39,2%). Đặc điểm thường gặp ở các khối u được thống kê như sau: · U có ở 2 tuyến: 4,1% · U ở 1 tuyến phải: 70,3% · U ở 1 tuyến trái: 25,6% Kích thước trung bình của khối u: 5,86 ± 4,14 cm · Kích thước thường gặp: 3 → 5 cm (37,3%) · U bên trái: 7,79 → 5,11 cm · U bên phải: thường nhỏ hơn u bên trái và có kích thước khoảng 5,38 ± 3,65 cm · U ở cả 2 bên: 3 ± 0,82 cm và nhỏ hơn so với những trường hợp chỉ có 1 u (6,02 ± 4,19 cm) Một công trình khảo sát các yếu tố di truyền liên quan PCCs cho thấy: - Khảo sát trên 2499 đối tượng trong khoảng thời gian 10 năm (2001 – 2010), có 1620 trường hợp riêng lẻ và 879 trường hợp liên quan đến di truyền gia đình [5]. - Trong 363 trường hợp riêng lẻ (22,4%) có 269 đột biến ở hệ gen SDHx (137 – SHDB, 100 – SDHD, 30 – SHDC, 2 – SHDA), 64 đột biến xảy ra ở gen VHL, 23 – RET và 7 – TMEM127 [5]. - Xét theo tỷ lệ 363/1620 trường hợp đột biến riêng lẻ (22,4%; 23,5% là các bệnh nhận bị hội chứng NF1). Các gen SDHB, SDHD và gen VHL là những gen đột biến xảy ra ở phần lớn các bệnh nhân, mà trong đó đột biến SDHB chiếm 37,7%; 27,5% ở SDHD; 17,6% ở VHL; 8,26% ở SDHC; 6,3% ở RET; 1,93% ở TMEM127 và 0,55% ở SDHA. Không phát hiện đột biến ở gen SDHAF2 [5]. - 137 bệnh nhân đột biến gen SDHB (119 đột biến điểm, bao gồm: đột biến thay thế, nhân đôi, cắt hoặc chèn 1 điểm nhỏ và 18 trường hợp đột biến vùng) [5]. - Ở gen VHL có 64 bệnh nhân (63 trường hợp đột biến điểm và 1 đột biến vùng). - Bệnh nhân mang gen đột biến SDHD có 100 người (95 trường hợp đột biến điểm và 5 trường hợp đột biến vùng). - Đột biến SDHC có 30 bệnh nhân (25 trường hợp đột biến điểm và 5 trường hợp 7 Đồ án tốt nghiệp đột biến vùng) [5]. - Theo tỷ lệ đột biến gen riêng lẻ · Đột biến gen SDHB – 8,46% · Đột biến gen SDHD – 6,2% · Đột biến gen VHL – 3,95% · Đột biến gen SDHC – 1,85% · Đột biến gen RET – 1,42% · Đột biến gen TMEM127 – 0,43% · Đột biến gen SDHA – 0,12% 1.3. Các bệnh và hội chứng liên quan 1.3.1. Hội chứng NF1 NF1 là một rối loạn di truyền đa chức năng được đặc trưng bởi các phát hiện về da, đặc biệt là các điểm hạt cà phê và tàn nhang, do loạn sản xương và do sự phát triển của hệ thống khối u thần kinh lành tính và ác tính, đáng chú ý nhất là các mô thần kinh lành tính [17]. Hình 1.2: Bé trai 4 tuổi có biểu hiện điểm hạt cà phê và tàn nhang 1.3.2. Hội chứng VHL Hội chứng VHL có liên quan đến PCCs. PCCs thường không gây ung thư, chúng có thể không gây triệu chứng, nhưng trong một số trường hợp, chúng có liên quan đến nhức đầu, các cơn hoảng loạn, đổ mồ hôi quá nhiều hoặc huyết áp cao nguy 8 Đồ án tốt nghiệp hiểm và có thể không đáp ứng với thuốc. PCCs đặc biệt nguy hiểm nếu chúng phát triển trong thai kỳ [18]. 1.3.3. Hội chứng MEN Đa u tuyến nội tiết là một nhóm rối loạn ảnh hưởng đến mạng lưới sản sinh hormones của cơ thể được gọi là hệ thống nội tiết. Hormones là những chất hoá học được phóng thích vào máu, điều chỉnh chức năng của tế bào và các mô khắp cơ thể. Đa u tuyến nội tiết thường liên quan đến khối u ở ít nhất hai tuyến nội tiết, khối u cũng có thể phát triển ở các cơ quan và mô khác. Những sự tăng trưởng này có thể không ung thư (lành tính) hoặc ung thư (ác tính). Nếu khối u trở thành ung thư, tình trạng có thể đe dọa tính mạng [19]. Các đột biến gen MEN1 gây ra nhiều loại đa u tuyến nội tiết loại 1. Gen này mã hóa cho việc sản xuất một protein gọi là menin. Menin hoạt động như một chất ức chế khối u, có nghĩa là nó giữ cho tế bào không tăng trưởng và phân chia quá nhanh hoặc phân chia không kiểm soát được. Mặc dù chức năng của menin không rõ ràng, nhưng nó có thể tham gia vào chức năng khác của tế bào như sao chép và sửa chữa DNA và điều chỉnh hoạt động của các gen khác. Khi đột biến làm vô hiệu hóa cả hai bản sao của gen MEN1, menin không còn khả dụng để kiểm soát sự tăng trưởng và phân chia tế bào, sự mất mát của protein này làm cho các tế bào phân chia quá nhiều, dẫn đến sự hình thành các khối u đặc trưng của đa u tuyến nội tiết loại 1 [19, 23]. Dấu hiệu phổ biến nhất của đa u tuyến nội tiết loại 2 là một dạng ung thư tuyến giáp được gọi là ung thư tuyến giáp dạng tủy. Một số người bị rối loạn này cũng đồng mắc PCCs dẫn đến cao huyết áp. Đa u tuyến nội tiết loại 2 được chia thành ba phân típ: loại 2A, loại 2B và ung thư tuyến giáp dạng tủy mang tính gia đình (FMTC). Những phân nhóm này khác nhau về dấu hiệu, triệu chứng đặc trưng và nguy cơ của các khối u cụ thể. Ví dụ, cường giáp xảy ra chỉ ở loại 2A và ung thư tuyến giáp là đặc điểm duy nhất của FMTC. Các dấu hiệu và triệu chứng của đa u tuyến nội tiết loại 2 là tương đối phù hợp trong bất kỳ một gia đình nào [19, 23]. Các đột biến trong gen RET gây ra đa u tuyến nội tiết loại 2. Gen này mã hóa cho 9 Đồ án tốt nghiệp việc sản xuất một protein liên quan đến tín hiệu trong tế bào. Protein RET kích hoạt các phản ứng hóa học hướng dẫn tế bào phản ứng với môi trường của chúng, ví dụ bằng cách phân chia hoặc sinh trưởng. Các đột biến trong gen RET kích hoạt chức năng báo hiệu của protein, có thể kích hoạt sự tăng trưởng và phân chia tế bào khi không có các tín hiệu từ bên ngoài tế bào. Sự phân chia tế bào không kiểm soát này có thể dẫn đến sự hình thành các khối u ở các tuyến nội tiết và các mô khác [19, 23]. 1.4. Cấu trúc, đột biến, chức năng của gen RET Gen RET được tìm thấy sau khi gây nhiễm dòng tế bào nguyên bào sợi 3T3 với DNA lấy từ các tế bào lymphoma của người. Gen RET nằm trên nhiễm sắc thể số 10, nhánh dài, vùng 1, băng 1, băng phụ 2 (10q11.2) và gồm 20 exon [10, 20]. Hình 1.3: Vị trí gen RET trên nhiễm sắc thể số 10 Sự nối ghép tự nhiên của gen RET tạo ra 3 dạng đồng phân khác nhau của protein RET: RET51, RET43 và RET9 chứa 51, 43 và 9 Aa trong đuôi C cuối cùng của chúng [10]. RET là protein xuyên màng. Mỗi protein được chia thành ba miền: một miền ngoại bào N với bốn lần lặp đi lặp lại giống như cadherin (là một protein 2 thành phần, phần bên trong tế bào gắn với khung xương của tế bào và phần bên ngoài tế bào là polypeptide có 5 đồng phân gắn kết với nhau) và một vùng giàu Cystein, một miền màng xốp kẽm và một miền tyrosine kinase nội bào, được chia ra bởi sự chèn thêm 27 Aa. Trong miền tyrosine kinase nội bào, có 16 Tyrosines (Tyrs) trong RET9 và 18 trong RET51. Tyr1090 và Tyr1096 chỉ có ở dạng đồng vị RET51 [10, 15]. Miền ngoại bào của RET chứa chín vị trí N-glycosyl hóa. Protein RET được 10 Đồ án tốt nghiệp glycosyl hóa hoàn toàn được báo cáo có trọng lượng phân tử là 170 kDa mặc dù không rõ ràng là nó có cấu tạo nên trọng lượng phân tử này liên quan [10]. Gen RET mã hóa sản xuất một protein liên quan đến tín hiệu trong tế bào. Protein này dường như rất cần thiết cho sự phát triển bình thường của một số loại tế bào thần kinh, bao gồm hệ thống thần kinh tự trị, thần kinh ruột non. Protein RET cũng cần thiết cho sự phát triển bình thường của thận và sản sinh ra tinh trùng (sự hình thành tinh trùng). Protein RET có một đầu của protein nằm trong màng tế bào và đầu còn lại nằm ngoài màng tế bào. Chính vị trí này của protein cho phép nó tương tác với các yếu tố cụ thể bên ngoài tế bào và nhận các tín hiệu giúp tế bào phản ứng với môi trường của nó. Khi các phân tử kích thích sự phát triển và tăng trưởng (các yếu tố tăng trưởng) gắn với protein RET, một chuỗi các phản ứng hóa học phức tạp bên trong tế bào được kích hoạt. Những phản ứng này chỉ dẫn cho tế bào trải qua những thay đổi nhất định, chẳng hạn như phân chia hoặc trưởng thành để có các chức năng đặc biệt. Đột biến gen RET được biết là gây ra một dạng đa u tuyến nội tiết loại 2. Đa u tuyến nội tiết thường liên quan đến sự phát triển của các khối u ở hai hoặc nhiều tuyến sản sinh hormones của cơ thể, được gọi là tuyến nội tiết. Những khối u này có thể không ung thư hoặc ung thư. Đa u tuyến nội tiết loại 2 được chia thành ba phân típ: loại 2A, loại 2B, và carcinoma tuyến giáp dạng tủy mang tính chất gia đình. Những phân típ này được phân biệt bằng các dấu hiệu và triệu chứng đặc trưng và nguy cơ của các khối u đặc biệt [18]. Hầu hết các đột biến gen RET gây ra đa u tuyến nội tiết loại 2 làm thay đổi protein RET (thông qua thay đổi trình tự amino acid (Aa)). Loại 2A thường xuất phát từ đột biến thay thế Aa Cysteine bằng Arginine ở codon 634 (Cys634Arg hoặc C634R). Hơn 90% các trường hợp loại 2B là do đột biến thay thế Aa Methionine bằng Threonine ở codon 918 (Met918Thr hoặc M918T). Một số thay thế Aa có thể gây ra carcinoma tuyến giáp dạng tủy mang tính chất gia đình [5,9]. Thụ thể tyrosine kinase là một protein xuyên màng, trong điền kiện tự nhiên các thụ thể này được kích hoạt khi có sự phối hợp của các đồng thụ thể (co-receptor) để 11 Đồ án tốt nghiệp tiến hành chuyển nhóm phosphate của phân tử Aa Tyrosine cao năng thành các phân tử đặc hiệu phục vụ chuyển hóa năng lượng cho hoạt động sống bình thường. Khi bị đột biến gen, các thụ thể này hoạt động không kiểm soát, sinh ra các bệnh và có thể là ung thư [10]. Hình 1.4: Cơ chế phân tử của đột biến gen RET Gen RET mã hóa cho thụ thể tyrosine kinase là thành phần của yếu tố dẫn xuất dòng tế bào thần kinh (GDNF) có nguồn gốc tín hiệu ngoại bào, đột biến gen RET có liên quan đến sự phát triển của nhiều loại ung thư ở người, bao gồm phình đại tràng bẩm sinh (Hirschsprung disease), ung thư phổi, ung thư tuyến giáp, đa u tuyến nội tiết loại 2A và 2B, tăng hồng cầu và tăng sản cận tử cung và một số ung thư khác [10]. Kích hoạt Kinase RET là thụ thể cho các phối tử nhóm Glial cell line Derived Neurotrophic Factor - GDNF (GFLs). Để kích hoạt RET, GFL đầu tiên cần phải tạo thành một phức hợp với đồng thụ thể glycosyl phosphatidyl inositol (GPI). Các đồng thụ thể được phân loại là các thành viên của họ protein receptor-α (GFRα) của receptor GDNF. Các thành viên 12 Đồ án tốt nghiệp khác nhau trong họ GFRα (GFRα1, GFRα2, GFRα3, GFRα4) có hoạt động ràng buộc cụ thể đối với một GFL cụ thể. Khi tạo phức GFL-GFRα, phức hợp sau đó sẽ kết hợp hai phân tử của RET, gây ra trans-autophosphorylation các dư lượng Tyrosine cụ thể trong miền tyrosine kinase của mỗi phân tử RET. Tyr900 và Tyr905 trong vòng lặp kích hoạt (vòng lặp A) của miền kinase đã được chứng minh là các vị trí tự quang phổ bằng quang phổ khối. Phosphoryl hóa Tyr905 ổn định cấu hình hoạt tính của kinase, do đó dẫn đến sự tự phospho hóa các dư lượng Tyrosine khác, chủ yếu nằm trong vùng đuôi C của phân tử [3, 15]. 1.5. Các phương pháp giải trình tự 1.5.1. Phương pháp hóa học Vào năm 1977, Maxam và Gilbert đã phát minh ra phương pháp hóa học để giải trình tự một đoạn DNA. Tuy nhiên, phương pháp giải trình tự của Maxam và Gilbert khó thực hiện vì phải xác định nhiều thông số cho thí nghiệm. Vì vậy, hiện nay người ta sử dụng phương pháp enzyme với nhiều ưu điểm vượt trội [21]. 1.5.2. Phương pháp enzyme Phương pháp enzyme được Sanger và cộng sự phát minh vào năm 1977. Nguyên tắc chung của phương pháp này là: - Trước hết chèn các đoạn DNA cần xác định trình tự vào một vector là phage hay plasmid tại một vị trí mà trình tự chuỗi của vị trí này đã được xác định rõ. - Dùng các đoạn mồi bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của vector tại vị trí chèn đoạn DNA. Thêm vào ống phản ứng DNA polymerase, bốn loại nucleotide tự do (gọi là dNTP: deoxynucleotide triphosphate) và các nucleotide tận cùng (terminat