Đồ án Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩn bacillus subtilis natto

ứu của riêng tôi và được sự hướng dẫn khoa học của ThS. Nguyễn Như Nhứt và ThS. Phan Trung Hải. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kì hình thức nào trước đây. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo. Ngoài ra, trong đồ án còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc. Nếu phát hiện có bất kì gian lận nào Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung đồ án của mình. TP. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 08 năm 2016 Sinh viên thực tập NGUYỄN THỊ MINH TRANG LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập tại trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, được sự quan tâm giúp đỡ tận tình của quý thầy cô đã không quản công lao khó nhọc trang bị những kiến thức cần thiết cho chúng em, tạo điều kiện cho chúng em có cơ hội được áp dụng những kiến thức đó vào thực tiễn thông qua đợt thực tập này. Tuy thời gian thực tập ngắn ngủi nhưng đã trang bị cho em nhiều kiến thức thực tiễn bổ ích cho công việc sau này. Em xin chân thành biết ơn: - Ban giám hiệu cùng toàn thể giáo viên giảng dạy của trường Đại học Công Nghệ TP.HCM nói chung và thầy cô khoa Công nghệ sinh học nói riêng đã cho em có cơ hội được đi thực tập. - Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Nguyễn Như Nhứt, người đã tạo điều kiện, hướng dẫn và giúp em hoàn thành tốt bài đồ án của mình. - Em xin cảm ơn ThS. Phan Trung Hải đã hướng dẫn và hỗ trợ em hoàn thành đồ án này. Em xin tri ân sự giúp đỡ tận tình của: Các anh, chị phòng thí nghiệm Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương cùng toàn thể các anh, chị các phòng ban của Công ty đã tạo mọi điều kiện hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập để hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn đến những người bạn của tôi, đã chia sẻ, giúp đỡ và động viên tôi trong học tập và ngoài cuộc sống. Sinh viên thực tập NGUYỄN THỊ MINH TRANG Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC ................................................................................................................ i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... iv DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... v DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH ........................................................... vi MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1 1. Tính cấp thiết .................................................................................................. 1 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .................................................... 2 3. Mục tiêu nghiên cứu ....................................................................................... 2 4. Nhiệm vụ nghiên cứu ..................................................................................... 3 5. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 3 6. Kết quả đạt được ............................................................................................. 3 7. Kết cấu đề tài nghiên cứu ............................................................................... 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 5 1.1. Sơ lược về Bacillus subtilis Natto .................................................................. 5 1.1.1. Hệ thống phân loại Bacillus subtilis Natto ............................................. 5 1.1.2. Lịch sử phát hiện .................................................................................... 5 1.1.3. Phân bố ................................................................................................... 7 1.1.4. Đặc điểm của Bacillus subtilis Natto...................................................... 7 1.2. Enzyme protease ........................................................................................... 10 1.2.1. Khái niệm về protease ........................................................................... 10 1.2.2. Phân loại ................................................................................................ 11 1.2.3. Nguồn thu nhận ..................................................................................... 12 1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp protease của Bacillus subtilis ......... 14 1.4. Ứng dụng của protease .................................................................................. 18 1.5. Tình hình nghiên cứu và sản xuất protease ................................................... 19 i Đồ án tốt nghiệp 1.5.1.Trên thế giới ........................................................................................... 19 1.5.2. Tại Việt Nam ......................................................................................... 20 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 22 2.1. Địa điểm và thời gian thực hiện thí nghiệm .................................................. 22 2.1.1. Địa điểm ................................................................................................ 22 2.1.2. Thời gian nghiên cứu ............................................................................. 22 2.2. Vật liệu thí nghiệm ........................................................................................ 22 2.2.1. Nguồn vi sinh vật ................................................................................... 22 2.2.2. Cơ chất dùng trong thí nghiệm .............................................................. 22 2.2.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng .................................................................. 23 2.3. Môi trường nuôi cấy...................................................................................... 23 2.3.1. Môi trường nước chiết giá đậu đường pepton agar (MT1) ................... 23 2.3.2. Môi trường nước chiết giá đậu đường pepton (MT2) ........................... 23 2.3.3. Môi trường định tính khả năng sinh tổng hợp protease (MT3) ............ 24 2.3.4. Môi trường bán rắn sinh tổng hợp protease (MT4) ............................... 24 2.4. Phương pháp tiến hành ................................................................................. 25 2.4.1. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật .............................................. 25 2.4.2. Phương pháp tăng sinh .......................................................................... 25 2.4.3. Phương pháp xác định mật độ tế bào .................................................... 25 2.4.4. Phương pháp định tính khả năng tổng hợp protease ............................. 26 2.4.5. Phương pháp nuôi cấy bán rắn .............................................................. 27 2.4.6 Phương pháp thu nhận dịch chiết từ nuôi cấy bán rắn ........................... 27 2.4.7. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease .................................. 27 2.4.8. Phương pháp tủa enzyme protease ........................................................ 30 2.4.9. Phương pháp xử lý thống kê .................................................................. 30 2.5. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 30 2.5.1. Sàng lọc chủng Bacillus subtilis Natto có khả năng tổng hợp enzyme protease cao ..................................................................................................... 30 ii Đồ án tốt nghiệp 2.5.2. Khảo sát khả năng tổng hợp enzyme protease của các chủng Bacillus subtilis Natto trên môi trường bán rắn có thành phần cơ chất khác nhau ....... 30 2.5.3. Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp enzyme protease của chủng Bacillus subtilis Natto ..................................................... 31 2.5.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng xúc tác protease của chủng Bacillus subtilis Natto ...................................................................................... 32 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 33 3.1. Sàng lọc chủng B. subtilis Natto có khả năng tổng hợp protease cao .......... 33 3.2. Khảo sát hoạt độ protease của chủng B. subtilis Natto BN2.1 trên môi trường bán rắn có thành phần cơ chất khác nhau ............................................................ 35 3.3. Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh protease của chủng B. subtilis Natto BN2.1 ........................................................................................ 37 3.3.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất trong môi trường bán rắn lên khả năng tổng hợp protease ..................................................................................................... 37 3.3.2. Ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp protease ........................ 39 3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tổng hợp protease ..... 41 3.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng xúc tác protease của chủng B.subtilis Natto BN2.1 ......................................................................................... 43 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................... 45 4.1. Kết luận ......................................................................................................... 45 4.2. Kiến nghị ....................................................................................................... 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 46 PHỤ LỤC iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A. candidus Aspergillus candidus A.oryzae Aspergillus oryzae B. Bacillus B. subtilis Bacillus subtilis BDN Bã đậu nành CB Cám bắp CG Cám gạo CM Cám mì CFU Colony Foming Unit DX Đậu xanh kDa kiloDalton nKat nanoKatal OD Optical Density pI Điểm đẳng điện của protein P. roquerti Penicillium roqueforti UI Đơn vị hoạt độ SPSS Phần mềm xử lý thống kê (Statistical Package for the Social Science) TLPT Trọng lượng phân tử iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Kết quả phản ứng sinh hóa của chủng B. subtilis ................................... 8 Bảng 1.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon lên hoạt độ protease của chủng Bacillus licheniformis N-2 ................................................................................... 15 Bảng 1.3. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen vô cơ lên hoạt độ protease của chủng Bacillus licheniformis N-2 ..................................................................... 16 Bảng 1.3. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen hữu cơ lên hoạt độ protease của chủng Bacillus licheniformis N-2 ..................................................................... 17 Bảng 2.1. Danh sách các chủng nghiên cứu ............................................................ 22 Bảng 2.2. Dựng đường chuẩn Tyrosine ................................................................... 28 Bảng 2.3. Xác định lượng Tyrosine trong dung dịch nghiên cứu ........................... 29 Bảng 2.4. Thành phần khối lượng của các cơ chất trong môi trường bán rắn ........ 31 Bảng 3.1. Kích thước đường kính vòng phân giải casein của các chủng B. subtilis Natto ..................................................................................... 34 Bảng 3.2. Hoạt độ enzyme protease của chủng BN2.1 khi sử dụng các thành phần nuôi cấy khác nhau ................................................................................. 35 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ BDN:CB trong môi trường bán rắn lên hoạt độ protease ................................................................................................... 38 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp protease ......................... 40 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tổng hợp protease ....... 41 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của pH phản ứng lên khả năng xúc tác protease .................. 43 v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1. Sản phẩm Natto ....................................................................................... 6 Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis Natto .................................................. 7 Hình 1.3. Phản ứng thủy phân liên kết peptide. ................................................... 10 Hình 1.4. Cấu trúc không gian enzyme protease ................................................... 11 Hình 3.1. Khả năng phân giải casein trên môi trường thạch đĩa của các chủng Bacillus subtilis Natto ........................................................................... 33 Biểu đồ 3.1. Kích thước đường kính vòng phân giải casein của các chủng B. subtilis Natto. ............................................................................... 34 Biểu đồ 3.2. Hoạt độ enzyme protease của chủng B. subtilis Natto BN2.1 khi sử dụng các thành phần nuôi cấy khác nhau. ........................................ 36 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ BDN:CB trong môi trường bán rắn lên hoạt độ protease. ............................................................................................ 38 Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp protease. ................... 40 Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy trong môi trường bán rắn lên hoạt độ protease. ....................................................................................... 42 Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của pH phản ứng lên khả năng xúc tác protease. ........... 43 vi Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết Một trong số các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease và được ứng dụng nhiều là vi khuẩn thuộc chi Bacillus[40]. Bacillus subtilis Natto là một chủng vi khuẩn có ích, rất phổ biến trong tự nhiên. Chúng có khả năng phát triển rất nhanh và sinh tổng hợp nhiều loại enzyme thủy phân như amylase, protease, phytase, hemicellulase, glucannase Chủng vi khuẩn này đã được sử dụng trong món ăn truyền thống của Nhật Bản từ lâu. Khi ủ ấm với hạt đậu nành, chúng sẽ sản sinh ra enzyme nattokinase hoạt huyết mạnh, có khả năng phòng và chữa các bệnh chống viêm, ngừa bệnh tả[54]... Nhiều nghiên cứu về B. subtilis Natto đã được tiến hành và kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này có khả năng sinh ra nhiều enzyme nhóm protease như nattokinase[33], elastase[32], bacillopeptidase F [45] Chủng vi khuẩn này có thể đáp ứng nhu cầu lớn về protease của ngành chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản trong lĩnh vực chế biến thức ăn chăn nuôi, bổ sung men tiêu hóa, giúp vật nuôi nâng cao sức đề kháng, tăng trọng nhanh... Tuy nhiên, việc nghiên cứu ứng dụng chủng vi khuẩn này tạo sản phẩm protease ở Việt Nam chưa nhiều. Do đó nhóm nghiên cứu tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩn Bacillus subtilis Natto”. Ý nghĩa đề tài nghiên cứu: - Về khoa học: Cung cấp thông tin về khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus subtilis Natto trên môi trường nuôi cấy bán rắn với thành phần là các phế phụ liệu của ngành nông nghiệp Việt Nam. - Về thực tiễn: Góp phần xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm giàu protease, giúp đa dạng hóa sản phẩm. 1 Đồ án tốt nghiệp 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước Do có những ưu điểm vượt trội, chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Natto vẫn luôn được quan tâm, nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên thế giới cũng như tại Việt Nam, một số công trình và ứng dụng tiêu biểu: - Đinh Thu Hương (2013) nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và chiết enzyme protease từ vi khuẩn B. subtilis Natto. Kết quả cho thấy, môi trường kết hợp có 2% maltose, 0,5% casein, CaCl2 0,05% giúp tăng tiết enzyme protease 21,7% so với môi trường canh thang , nồng độ amoni sulfat 60% bão hòa là nồng độ tối ưu để thu được tủa enzyme có hoạt độ protease cao nhất: 172,5 nKat. Sau khi tinh chế bằng phương pháp sắc kí lọc gel Sephadex G – 75, lựa chọn được phân đoạn 10 là phân đoạn có hoạt độ protease cao nhất 27,2 nKat. Đã xác định được phân đoạn này có khả năng phân giải mạnh cơ chất fibrin và có trọng lượng phân tử khoảng 29 kDa nên có thể là enzyme nattokinase, hoạt độ enzyme khoảng 300 FU/5 ml [5]. - Junguo Liu và cộng sự (2005) nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện dinh dưỡng cho sinh tổng hợp nattokinase sử dụng chủng B. subtilis Natto NLSSE. Kết quả nguồn carbon tốt nhất là maltose 2%, nguồn nitơ tốt nhất là pepton đậu nành[27]. - LiHui Rong (2011) xác định môi trường tối ưu cho sản xuất nattokinase từ vi khuẩn B. subtilis Natto gồm: MgSO4 0,02%, K2HPO4 0,02%, KH2PO4 0,01%, [24] CaCl2 0,05%, maltose 3%, pepton từ đậu nành: 3% . - Ứng dụng khả năng làm tan và chống hình thành máu đông của chủng B. subtilis Natto vào các lọai thực phẩm chức năng trên thị trường Việt Nam như: Nattospes của Công ty TNHH dược phẩm Á Âu; Đậu tương Lên Men Natto Kinaza của công ty TNHH Khoa Học Xanh Đức Thanh Mai; DOSAKA của Công ty cổ phần xuất nhập khẩu y tế DOMESCO 3. Mục tiêu nghiên cứu Chọn được chủng Bacillus subtilis Natto có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease cao từ các chủng nghiên cứu. 2 Đồ án tốt nghiệp Xác định một số điều kiện nuôi cấy bán rắn để chủng B. subtilis Natto sinh tổng hợp enzyme protease có hoạt tính cao nhất. Xác định ảnh hưởng của pH lên khả năng phản ứng protease của chủng B. subtilis Natto. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu Sàng lọc chủng Bacillus subtilis Natto có khả năng sinh protease cao. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của chủng Bacillus subtilis Natto khi được nuôi cấy trên môi trường bán rắn ở các điều kiện khác nhau như thành phần cơ chất, tỉ lệ cơ chất, độ ẩm và thời gian nuôi cấy. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng phản ứng protease của chủng Bacillus subtilis Natto. 5. Phương pháp nghiên cứu Thu thập thông tin từ sách báo và các trang mạng điện tử. Sử dụng phần mềm thống kê SPSS 16.0. Các phương pháp nghiên cứu thực hiện trong đề tài: - Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật. - Phương pháp tăng sinh. - Phương pháp xác định mật độ tế bào (Phương pháp đếm khuẩn lạc). - Phương pháp định tính khả năng tổng hợp protease. - Phương pháp nuôi cấy bán rắn. - Phương pháp thu nhận dịch chiết từ nuôi cấy bán rắn. - Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease (Phương pháp Anson). - Phương pháp tủa enzyme protease. 6. Kết quả đạt được Đề tài với mục đích nghiên cứu thu nhận protease từ chủng cho hoạt độ enzyme protease cao nhất trong năm chủng nghiên cứu là BN1, BN2.1, BN2.2, BN2.3 và BN3. Kết quả thí nghiệm cho thấy chủng Bacillus subtilis Natto BN2.1 có khả năng sinh tổng hợp protease cao hơn so với các chủng còn lại. Môi trường nuôi cấy thích 3 Đồ án tốt nghiệp hợp cho hoạt độ protease tốt nhất là bã đậu nành và cám bắp. Với các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp protease cao của chủng BN2.1 như: tỉ lệ cơ chất bã đậu nành: cám bắp là 5:5, thời gian nuôi cấy là 60 giờ và độ ẩm môi trường ban đầu thích hợp nhất là 60%. Chế phẩm enzyme protease tinh sạch sơ bộ từ chủng Bacillus subtilis Natto BN2.1 có khả năng xúc tác tốt nhất tại pH 7. 7. Kết cấu đề tài nghiên cứu Đề tài nghiên cứu bao gồm 3 chương: Chương 1: TỔNG QUAN - Sơ lược về chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Natto và enzyme protease. - Giới thiệu ứng dụng và tình hình nghiên cứu, sản xuất enzyme protease trong và ngoài nước. Chương 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU - Trình bày địa điểm, thời gian thí nghiệm, vật liệu thí nghiệm, môi trường nghiên cứu, các phương pháp tiến hành và các phương pháp nghiên cứu. Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN - Trình bày kết quả đạt được và nêu ý kiến thảo luận về đề tài nghiên cứu. Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ - Nêu kết luận và kiến nghị của nhóm thực hiện đề tài. 4 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lược về Bacillus subtilis Natto 1.1.1. Hệ thống phân loại Bacillus subtilis Natto Giới Bacteria Ngành Firmicutes Lớp Bacilli Bộ Bacillales Họ Bacillaceae Giống Bacillus Loài subtilis Phân loài Bacillus subtilis Natto. “Nguồn: Keith H. Steinlraus (2004)” 1.1.2. Lịch sử phát hiện B. subtilis Natto được sử dụng trong sản xuất thương mại thực phẩm Natto của Nhật Bản. Chúng được tìm thấy bởi tiến sĩ Sawamura vào năm 1906 và được đặt tên là Bacillus Natto Sawamura. Kể từ đó B. subtilis Natto được chấp thuận để dùng cho việc nghiên cứu và sản xuất thuốc tác dụng lên hệ thần kinh vào năm 1968, thuốc thú y vào năm 1990, phụ gia dinh dưỡng vào năm 1996. Và hiện đang thu hút sự chú ý vì gần đây đã bắt đầu được sử dụng làm thực phẩm dành cho sức khỏe[55]. Khi mới được phát hiện ra, B. subtilis Natto được coi như là một loài vi sinh vật mới. Hiện nay, dựa trên kết quả phân tích ADN nhiễm sắc thể B. subtilis của Seki năm 1975 và Tamang năm 2002 [28], [50], các khóa phân loại đã xếp B. subtilis Natto là một dòng thuộc loài B. subtilis nhưng phân biệt với các dòng khác nhờ khả năng lên men tạo sản phẩm Natto [40]. Trong dòng B. subtilis Natto còn có nhiều loại như B. subtilis Natto B – 12 [21], B. subtilis Natto OK2 [47], B. subtilis Natto NRRL 3666 [39] 5 Đồ án tốt nghiệp Natto là một món ăn truyền thống của Nhật Bản, những hạt đậu nành đã luộc chín và lên men với vi khuẩn B. subtilis Natto ở nhiệt độ khoảng 40oC trong vòng 14 - 18 giờ[25],[46]. Năm 1905, tiến sĩ Shin Sawamura (đại học Tokyo) đã tách được hai loại vi khuẩn từ Natto gồm vi khuẩn B. subtilis Natto có vai trò lên men hạt đậu, gây ra mùi hương đặc biệt và vi khuẩn B. mesentericus vulgaris tạo chất chất nhớt đặc trưng và vị ngọt. Năm 1913, Sawamura công bố kết quả nghiên cứu của mình qua nhiều mẫu Natto và kết luận vi khuẩn chủ yếu trong các mẫu chính là B. subtilis Natto. Ông đã đưa ra mô tả chi tiết về đặc điểm vi khuẩn, enzyme và nhu cầu dinh dưỡng của nó. Ngày nay, các sản phẩm Natto trên thị trường được lên men với vi khuẩn B. subtilis Natto[46]. Hình 1.1. Sản phẩm Natto. (Nguồn: healthplus.vn) Chức năng của B. subtilis Natto[55]: - Tăng cường vi khuẩn có lợi. - Ức chế vi khuẩn đường ruột có hại. - Sản xuất các enzyme phân hủy protein và tinh bột - Xây dựng hệ thống vitamin nhóm B 6 Đồ án tốt nghiệp 1.1.3. Phân bố B. subtilis Natto được giáo sư Sawamura tìm thấy trong Natto, một món ăn truyền thống có từ hàng ngàn năm trước của người Nhật. B. subtilis Natto có nhiều trong rơm rạ, cỏ khô... và phát triển tốt trong các loại đậu, đặc biệt là đậu tương. Vi khuẩn này cũng phát triển trên thực phẩm có nguồn gốc động vật và thực vật khác như: tảo biển, cá, thịt, tôm, cua... [40]. 1.1.4. Đặc điểm của Bacillus subtilis Natto 1.1.4.1. Đặc điểm hình thái B. subtilis Natto là trực khuẩn hiếu khí bắt màu tím khi nhuộm Gram, nội bào tử hình que có kích thước dưới 1μm. Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với nhau thành chuỗi. Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, có kích thước lớn và hình dạng bất định. Bề mặt hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan rộng trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch [22],[23]. Bào tử Tế bào vi khuẩn Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis Natto (độ phòng đại 100 lần). “Nguồn: Đinh Thu Hương (2013)[7]” 1.1.4.2. Đặc điểm sinh lý B. subtilis Natto là sinh vật hiếu khí bắt buộc, cần oxy để sinh trưởng và có thể phát triển ở nồng độ oxy lớn hơn 3%. B. subtilis Natto phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng (30 – 50oC), tối thích là 37oC. Ở 55oC, vi khuẩn ngừng phát triển và sự ly 7 Đồ án tốt nghiệp giải tế bào sinh dưỡng diễn ra. Nhiệt độ tối ưu cho sự nảy mầm của bào tử là 40oC, bào tử vẫn có thể nảy mầm sau khi bảo quản ở 0oC. B. subtilis Natto phát triển ở pH trung tính hoặc hơi kiềm, khoảng pH tối ưu cho sự sinh trưởng là 7,2 - 7,6. Sự nảy chồi và phát triển bị ức chế ở pH ≤ 4,5 [23]. 1.1.4.3. Đặc điểm sinh hoá B. subtilis Natto là sinh vật dị dưỡng, có khả năng sử dụng nhiều nguồn hydratcarbon: đường đơn như glucose, fructose..., đường đôi như maltose, lactose, saccharose..., polysaccharid như tinh bột... Nguồn nitơ cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn là protein và amino acid. B. subtilis Natto có thể sử dụng dễ dàng acid glutamic, arginin, acid aspartic... nhưng không sử dụng được threonin, tryptophan, phenylalanin và methionin [23]. Bảng 1.1. Kết quả phản ứng sinh hóa của chủng B. subtilis Phản ứng sinh hóa Kết quả Hoạt tính catalase + Sinh indol - MR + VP + Sử dụng citrate + Khử nitrate + Tan chảy gelatin + Phân giải tinh bột + Arabinose + Xylose + Saccharose + 8 Đồ án tốt nghiệp Mannitol + Glucose + Lactose - Maltose + (Theo Holt, 1992) 1.1.4.4. Sản phẩm trao đổi chất của B. subtilis Natto Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, B. subtilis Natto có khả năng sinh tổng hợp nhiều nhóm enzyme ngoại bào khác nhau như: Nhóm enzyme γ– transpeptidase theo Noda năm 1989[30] và Ogawa năm 1991[52]; amylase theo Yamane K năm 1974 [31]; phytase theo Kerovuo J năm 1998 [29], Shimizu M năm 1992 [36]; cellulase theo Sun Yan năm 2011 [48]; và nhóm enzyme được nghiên cứu nhiều nhất là protease [21],[ [33],[34],[50],[53]. Đặc điểm của một số protease ngoại bào của B. subtilis Natto như sau: o Nattokinase: là một enzyme thuộc họ subtilisin; tên khác: subtilisin NAT hay subtilisin BSP. Kí hiệu: EC 3.4.21.62. Cấu tạo gồm một chuỗi polypeptid đơn có 275 gốc acid amin và không có cầu nối disulfua trong phân tử. TLPT: 27,7 kDa đến 29 kDa [21],[33]. Nattokinase là protease ngoại bào có ý nghĩa nhất và đang được nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y dược học. o Elastase: Theo nghiên cứu của Sumi, elastase có TLPT: 20 kDa, pI = 8,7 [42]. Elastase mới do Muramatsu nghiên cứu có TLPT: 29,8 kDa, pI = 8,5; ổn định hoạt tính trong khoảng pH từ 8 – 9; nhiệt độ 50oC; bị bất hoạt bởi diisopropyl fluorophosphat, phenyl methyl sulphonyl fluorid và ion kim loại [32]. o Bacillopeptidase F: có TLPT khoảng 34 kDa. Trung tâm hoạt động là bộ ba xúc tác: Ser, His, Asp[45]. o Protease serin: có TLPT khoảng 90 kDa; pH 10 và nhiệt độ tối thích cho hoạt động của enzyme là 55oC, pI = 3,9. Trung tâm hoạt động là bộ ba xúc tác: Asp33, His81, Ser259 [49],[53]. 9 Đồ án tốt nghiệp 1.2. Enzyme protease 1.2.1. Khái niệm về protease[1] Protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (CO - NH) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự. Hình 1.3. Phản ứng thủy phân liên kết peptide. “Nguồn: Đinh Thu Hương (2013)[7]” Nhóm enzym protease (peptit – hydrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein,“ polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các amino acid. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển amino acid. Theo phân loại quốc tế các enzyme thuộc nhóm này chia thành 4 phân nhóm phụ:  Aminopeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu nitơ của mạch polypeptit  Cacboxypeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu cacbon của mạch polypeptit. Cả hai phân nhóm enzyme trên đều là các exo – peptidase.  Dipeptihydrolase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết dipepit.  Proteinase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ dày bê...). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc 10 Đồ án tốt nghiệp điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng. Hình 1.4. Cấu trúc không gian enzyme protease. “Nguồn: Tống Ngọc Triêm(2010)[16]” 1.2.2. Phân loại [9] Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nòi vi sinh vật cũng có thể khác nhau về tính chất. Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động thích hợp các nhà khoa học đã phân loại các proteinase vi sinh vật thành bốn nhóm như sau: o Protease – xerin o Protease – thiol o Protease – kim loại o Protease – acid Một số tác giả khác chia protease ra ba nhóm dựa vào pH hoạt động của chúng bao gồm: o Protease acid: pH < 3 được ứng dụng trong sản xuất bia và công nghiệp bánh kẹo. 11 Đồ án tốt nghiệp o Protease trung tính: proteinase trung tính là metalloenzyme, chúng có pH hoạt động 6 - 7, chúng thường được sản xuất từ Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteolyticus. o Protease kiềm: chúng có khoảng pH hoạt động 9 - 11, trong trung tâm hoạt động của chúng có serine. Trong bốn protease kể trên, các protease - xerin và protease - thiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của amino acid. Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase của các dẫn suất của amino acid. Nhiều protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứu tương đối kỹ về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng. Kết quả nghiên cứ...ng pháp Anson với giá trị pH thay đổi từ 6,0 – 8,0. Lựa chọn pH thích hợp để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. 32 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Sàng lọc chủng B. subtilis Natto có khả năng tổng hợp protease cao Cấy 5 chủng Bacillus subtilis Natto vào môi trường thạch đĩa casein. Ủ ở nhiệt độ phòng (30 - 33oC). Sau 48 giờ, tráng lugol và quan sát đĩa thạch. Kết quả được trình bày theo hình 3.1, bảng 3.1 và biểu đồ 3.1. Hình 3.1. Khả năng phân giải casein trên môi trường thạch đĩa của các chủng Bacillus subtilis Natto. A: Chủng BN1; B: Chủng BN2.1; C: Chủng BN2.2; D: Chủng BN2.3; E: Chủng BN3; F: Mẫu đối chứng. 33 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1. Kích thước đường kính vòng phân giải casein của các chủng B. subtilis Natto Chủng D trung bình (mm) BN1 7,00  1,73c BN2.1 20,3  0,58a BN2.2 12,3  0,58b BN2.3 12,7  1,53b BN3 13,0  1,73b Mẫu đối chứng 0,00  0,00d Các giá trị theo sau bởi chữ cái khác nhau không cùng kí tự biểu hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 0,05. 25,00 20,3 20,00 15,00 12,3 12,7 13,0 10,00 ∆Dtb (mm) ∆Dtb 7,00 5,00 0,00 0,00 BN1 BN2.1 BN2.2 BN2.3 BN3 Mẫu đối chứng Chủng Biểu đồ 3.1. Kích thước đường kính vòng phân giải casein của các chủng B. subtilis Natto. Dựa vào kích thước vòng phân giải, nhận thấy các đĩa có chủng B. subtilis Natto so với mẫu đối chứng không chứa khuẩn, tất cả đều có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease. Trong đó chủng BN1 cho khả năng phân giải casein thấp hơn các chủng còn lại với đường kính vòng phân giải là 7,00 mm. Các chủng BN2.2, 34 Đồ án tốt nghiệp BN2.3 và BN3 có khả năng phân giải casein cao hơn BN1 nhưng không khác biệt về mặt thống kê. Chủng BN2.1 cho khả năng phân giải casein mạnh với đường kính vòng phân giải là 20,3mm, cao hơn khoảng 36 - 39% so với các chủng BN2.2, BN2.3, BN3. Kết quả trên cho thấy, mỗi chủng B. subtilis Natto có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease khác nhau. Trong đó, chủng BN 2.1 có khả năng sinh enzyme protease cao nhất, do đó được lựa chọn để tiến hành những thí nghiệm tiếp theo. 3.2. Khảo sát hoạt độ enzyme protease của chủng B. subtilis Natto BN2.1 trên môi trường bán rắn có thành phần cơ chất khác nhau Thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Mục đích của thí nghiệm này nhằm khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của chủng BN2.1 trên các môi trường nuôi cấy có sự kết hợp giữa các nguồn cơ chất khác nhau. Bảng 3.2. Hoạt độ enzyme protease của chủng BN2.1 khi sử dụng các thành phần nuôi cấy khác nhau Thành phần môi trường Hoạt độ trung bình (UI/g) BDN:CB 0,80  0,13a BDN:CG 0,66  0,03abc BDN:CM 0,68  0,08abc DX:CB 0,62  0,08bc DX:CG 0,52  0,12c DX:CM 0,77  0,03ab Các giá trị theo sau bởi chữ cái khác nhau không cùng kí tự biểu hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 0,05. 35 Đồ án tốt nghiệp 0,90 0,80 0,77 0,80 0,66 0,68 0,70 0,62 0,60 0,52 0,50 0,40 0,30 Hoạt độ Hoạt(UI/g) 0,20 0,10 0,00 BDN:CB BDN:CG BDN:CM DX:CB DX:CG DX:CM Môi trường Biểu đồ 3.2. Hoạt độ enzyme protease của chủng B. subtilis Natto BN2.1 khi sử dụng các thành phần nuôi cấy khác nhau. Theo kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, với mỗi môi trường nuôi cấy khác nhau thì chủng vi khuẩn BN2.1 cho khả năng sinh tổng hợp protease khác nhau. Ở môi trường DX:CG, chủng BN2.1 cho hoạt độ enzyme thấp hơn các môi trường còn lại đạt 0,52 UI/g. Trong khi đó, môi trường BDN:CB cho hoạt độ protease cao nhất đạt 0,80 UI/g. Với ba môi trường nuôi cấy chứa thành phần là bã đậu nành thì môi trường BDN:CG cho hoạt độ protease thấp nhất chỉ đạt 0,66 UI/g, môi trường BDN:CB cho hoạt độ protease cao hơn 2 môi trường còn lại. Bên cạnh đó, những môi trường chứa thành phần là đậu xanh thì môi trường DX:CG cho hoạt tính enzyme protease thấp hơn môi trường DX:CB và DX:CM. Môi trường DX:CM cho hoạt tính cao hơn 2 môi trường còn lại với 0,77 UI/g. Qua đó cho thấy, hai môi trường BDN:CB và DX:CM là môi trường thích hợp để chủng BN2.1 sinh tổng hợp enzyme protease cao. Môi trường BDN:CB cho hoạt độ protease cao hơn môi trường DX:CM, tuy nhiên không khác biệt về mặt thống kê. Kết quả nghiên cứu tương tự với báo cáo của Abdelnaser S.S. Ibrahim và cộng sự (2009) khi chủng Bacillus halodurans tổng hợp protease trên môi trường đậu nành cao hơn trên môi trường cám mì. Một nghiên cứu khác của U.O.George-Okafor và cộng sự (2012) 36 Đồ án tốt nghiệp cho thấy, chủng Bacillus sp. Sw-2 khi nuôi cấy trên đậu nành cũng cho hoạt độ protease cao hơn so với các môi trường còn lại. Sự chênh lệch hoạt độ giữa các môi trường này có thể là do sự kết hợp giữa độ thoáng khí và nguồn dưỡng chất của các thành phần cơ chất khác nhau. Đậu xanh là nguồn nguyên liệu tương đối đắt tiền, trong khi đó bã đậu nành là nguồn phế phụ liệu có giá thành rẻ hơn. Vì vậy, để tiết kiệm chi phí sản xuất và tận dụng nguồn phế phụ liệu nông nghiệp là bã đậu nành, thông qua kết quả thí nghiệm, nhóm thực hiện lựa chọn bã đậu nành và cám bắp là nguồn cơ chất tối ưu để thu nhận enzyme protease từ chủng BN2.1. 3.3. Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh protease của chủng B. subtilis Natto BN2.1 3.3.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất trong môi trường bán rắn lên khả năng tổng hợp protease Chủng BN2.1 được nuôi cấy trên môi trường bán rắn đã chọn là BDN:CB, với các tỉ lệ khối lượng thành phần cơ chất thay đổi lần lượt: 2:8; 3:7; 4:6; 5:5; 6:4; 7:3 và 8:2. Kết quả thu được thể hiện trong bảng 3.3 và biểu đồ 3.3. 37 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ BDN:CB trong môi trường bán rắn lên hoạt độ protease Tỉ lệ Hoạt độ trung bình (UI/g) 2:8 0,39  0,05c 3:7 0,50  0,13bc 4:6 0,58  0,04abc 5:5 0,75  0,10a 6:4 0,61  0,10ab 7:3 0,57  0,16abc 8:2 0,48  0,12bc bc Các giá trị theo sau bởi chữ cái khác nhau không cùng kí tự biểu hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 0,05. 0,80 0,75 0,70 0,58 0,61 0,60 0,57 0,50 0,48 0,50 0,39 0,40 0,30 Hoạt độ Hoạt(UI/g) 0,20 0,10 0,00 2:8 3:7 4:6 5:5 6:4 7:3 8:2 Tỉ lệ BDN:CB Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ BDN:CB trong môi trường bán rắn lên hoạt độ protease. 38 Đồ án tốt nghiệp Quan sát kết quả ở bảng 3.3, nhận thấy hoạt độ enzyme có sự thay đổi theo thành phần cơ chất của môi trường nuôi cấy. Cụ thể, khi ở tỉ lệ 2:8 hoạt độ protease đạt 0,39 UI/g, ở tỉ lệ 3:7 thì tăng lên mức 0,50 UI/g. Tuy nhiên, từ tỉ lệ 4:6 đến tỉ lệ 7:3 hoạt độ protease không chênh lệch vê mặt thống kê. Khi tăng lượng bã đậu nành đến tỉ lệ 8:2, hoạt độ protease chỉ đạt 0,48 UI/g. Nghiên cứu của Trần Ngọc Hùng (2013) cho thấy chủng B. subtilis Ba-15 tổng hợp protease tốt nhất khi nuôi cấy trên môi trường bán rắn chứa nguồn cơ chất bã đậu nành và bột bắp với tỉ lệ 2:8. Theo Nguyễn Đức Lượng (2012), tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng về carbon và nitơ có ý nghĩa lớn đối với sinh tổng hợp sinh khối của vi sinh vật và sự tạo thành các enzyme thuỷ phân. Chỉ khi nào môi trường có đủ lượng carbon, nitơ cần thiết mới tích luỹ được lượng enzyme lớn. Bã đậu nành không chỉ là nguồn cung cấp nitơ chính mà còn tạo độ thoáng khí cần thiết cho môi trường bán rắn. Có thể thấy bã đậu nành là một nguồn cơ chất kích thích sự sinh tổng hợp enzyme protease. Nhưng khi nồng độ cơ chất quá cao sẽ ảnh hưởng đến khả năng kết hợp giữa enzyme và cơ chất, gây ra sự ức chế quá trình sinh tổng hợp enzyme này. Như vậy, mỗi loài vi khuẩn đều có nhu cầu khác nhau về độ thoáng khí cũng như nguồn dinh dưỡng từ thành phần môi trường nuôi cấy. Tỷ lệ 4:6 đến 7:3 tuy hoạt tính không khác biệt về thống kê nhưng xét về năng suất thu được canh trường thì tỷ lệ 5:5 cho năng suất cao hơn so với 3 tỷ lệ phối trộn còn lại. Vì vậy đối với chủng đối với chủng BN2.1, tỉ lệ 5:5 của BDN:CB cho hoạt độ protease cao nhất được lựa chọn để tiến hành thí nghiệm tiếp theo. 3.3.2. Ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp protease Thực hiện nghiên cứu độ ẩm môi trường bán rắn với điều kiện nuôi cấy đã chọn ở trên, trong đó độ ẩm môi trường thay đổi 40, 50, 60 và 70%. Kết quả được trình bày theo bảng 3.4 và biểu đồ 3.4. 39 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp enzyme protease Độ ẩm (%) Hoạt độ trung bình (UI/g) 40 0,02  0,01d 50 0,38  0,07c 60 0,79  0,14a 70 0,57  0,10b Các giá trị theo sau bởi chữ cái khác nhau không cùng kí tự biểu hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 0,05. 0,90 0,79 0,80 0,70 0,57 0,60 0,50 0,38 0,40 0,30 0,20 Hoạt độ Hoạt(UI/g) 0,10 0,02 0,00 40 50 60 70 Độ ẩm (%) Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp protease. Theo Ramesh (1990), độ ẩm ban đầu ảnh hưởng đến sự sản sinh các loại enzyme thủy phân khi nuôi ở môi trường bán rắn vì nó ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của sinh vật. Từ kết quả cho thấy, độ ẩm có ảnh hưởng đáng kể đến hoạt độ protease, độ ẩm 40% cho hoạt độ thấp nhất là 0,02 UI/g, hoạt độ tăng dần đến độ ẩm 60% thì chủng BN2.1 cho hoạt độ protease mạnh hơn đạt 0,79 UI/g, cao gấp đôi so với ở độ ẩm 50%. Tuy nhiên sự gia tăng này không kéo dài, với 70% ẩm, hoạt độ protease giảm đáng kể, chỉ đạt 0,57 UI/g. Độ ẩm của môi trường nuôi cấy là một 40 Đồ án tốt nghiệp trong những yếu tố chính trong nuôi cấy bán rắn và thường quyết định sự thành công của cả quá trình (Narahara và cộng sự, 1982; Lonsane và cộng sự, 1985; Renu và cộng sự, 2001). Báo cáo về độ ẩm trung bình (50 - 63%) bởi George và cộng sự (1995) cho thấy, khi độ ẩm vượt quá mức, không có sự tăng thêm hoạt độ enzyme, thậm chí làm giảm sự tăng trưởng và sản xuất enzyme. Qua đó cho thấy việc giữ ẩm cho môi trường ở mức tối thích là sự cần thiết đối với các chủng vi sinh vật và độ ẩm thích hợp để chủng BN2.1 tổng hợp protease cao nhất là 60%. 3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tổng hợp protease Tiến hành cấy chủng B. subtilis Natto theo điều kiện đã xác định ở các thí nghiệm trên, sau đó đem ủ ở nhiệt độ phòng trong các khoảng thời gian khác nhau: 12, 24, 36, 48, 60, 72 vả 84 giờ. Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tổng hợp protease Thời gian nuôi cấy (giờ) Hoạt độ trung bình (UI/g) 12 0,84  0,02d 24 0,89  0,01cd 36 0,93  0,02bc 48 0,96  0,04b 60 1,01  0,04a 72 1,04  0,02a 84 1,04  0,03a Các giá trị theo sau bởi chữ cái khác nhau không cùng kí tự biểu hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 0,05. 41 Đồ án tốt nghiệp 1,20 1,04 1,04 0,96 1,01 1,00 0,93 0,84 0,89 0,80 0,60 0,40 Hoạt độ Hoạt(UI/g) 0,20 0,00 12 24 36 48 60 72 84 Thời gian nuôi cấy (giờ) Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy trong môi trường bán rắn lên hoạt độ protease. Theo thời gian nuôi cấy, hoạt độ protease của chủng BN2.1 tăng đều trong khoảng thời gian nuôi cấy từ 12 đến 72 giờ. Ở thời điểm 12 giờ hoạt độ protease chỉ đạt 0,84 UI/g, đến 60 giờ thì tăng đến 1,01 UI/g. Sau 72 giờ thì hoạt độ protease không tăng nữa và duy trì ở mức ổn định với 1,04 UI/g. Kết quả tương tự với nghiên cứu của U.O.George-Okafor và E.E.Mike-Anosike (2012) khi chủng Bacillus sp. Sw-2 cho hoạt độ protease cao nhất ở 72 giờ (2,697 UI/ml). Khi kéo dài thời gian nuôi cấy thì các thành phần trong môi trường thay đổi do sự hình thành các hợp chất mới của quá trình trao đổi chất của vi khuẩn, dẫn đến hàm lượng các chất dinh dưỡng giảm, làm cho tế bào vi khuẩn suy thoái, enzyme bị bất hoạt. Chủng BN2.1 sinh tổng hợp enzyme mạnh và lượng protease tích luỹ trong canh trường cao nhất trong khoảng thời gian từ 60 đến 84 giờ. Vì vậy để tiết kiệm thời gian nuôi cấy, thời điểm 60 giờ sẽ được chọn làm thời điểm để thu nhận canh trường và tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. 42 Đồ án tốt nghiệp 3.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng xúc tác protease của chủng B. subtilis Natto BN2.1 Tiến hành tinh sạch sơ bộ enzyme từ canh trường cho hoạt độ cao theo các điều kện tối ưu ở trên và khảo sát sát ảnh hưởng của pH phản ứng lên khả năng xúc tác enzyme protease của chủng BN2.1 với pH phản ứng thay đổi từ 6 đến 8. Bảng 3.6. Ảnh hưởng của pH phản ứng lên khả năng xúc tác protease pH Hoạt độ trung bình (UI/g) 6 59,7  2,42b 6,5 61,6  1,15b 7 67,9  2,27a 7,5 67,2  4,28a 8 66,7  1,43a Các giá trị theo sau bởi chữ cái khác nhau không cùng kí tự biểu hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 0,05. 70 67,9 68 67,2 66,7 66 64 61,6 62 59,7 60 58 Hoạt độHoạt (UI/g) 56 54 6 6,5 7 7,5 8 pH Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của pH phản ứng lên khả năng xúc tác protease. Kết quả khảo sát cho thấy, mỗi pH khác nhau cho khả năng xúc tác enzyme protease khác nhau. Chủng BN2.1 sinh tổng hợp protease tăng dần từ pH 6 đến 7. Trong đó, hoạt độ protease thấp nhất ở pH 6 đạt 59,7 UI/g và cao nhất ở pH 7 với 43 Đồ án tốt nghiệp hoạt độ đạt 67,9 UI/g, ổn định trong khoảng pH từ 7 đến 8. Kết quả tương tự với nghiên cứu của E. M. El-Safey and U. M. Abdul-Raouf (2004) trên B. subtilis, khi hoạt độ protease của chủng này mạnh nhất ở pH 7 của bộ đệm phosphate. Bên cạnh đó, một số nghiên cứu về ảnh hưởng của pH lên đặc tính của enzyme cho thấy sự khác biệt như Ishtiaq Ahmed và cộng sự (2011), lựa chọn pH 10 cho protease của chủng B. subtilis; Sun và cộng sự (1997) lựa chọn khoảng pH 11 cho hoạt độ tối ưu của protease từ chủng Bacillus sphaericus C3 - 41, protease này ổn định ở mức pH từ 5 đến12. Theo nghiên cứu của Sadia Almas và cộng sự (2009) thì chủng Bacillus SAL1 cho protease hoạt độ tối ưu ở pH 9 và ổn định trong khoảng pH 7 đến 10. Như vậy, enzyme từ mỗi chủng khác nhau chịu ảnh hưởng khác nhau của pH lên hoạt độ protease của chúng. Từ kết quả khảo sát trên nhận thấy, pH 7 là pH tối ưu đối với protease của chủng BN2.1. 44 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Qua quá trình nghiên cứu nhóm thực hiện rút ra được kết luận như sau: - Sàng lọc được chủng Bacillus subtilis Natto BN2.1 cho hoạt độ protease cao từ năm chủng Bacillus subtilis Natto nghiên cứu. - Các điều kiện tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp protease cao của chủng BN2.1 là hỗn hợp môi trường bán rắn BDN:CB, với tỉ lệ thích hợp là 5:5; thời gian nuôi cấy tốt nhất là 60 giờ và độ ẩm môi trường ban đầu thích hợp nhất để nuôi cấy là 60%. - Khảo sát được ảnh hưởng của pH phản ứng tối ưu lên khả năng xúc tác enzyme protease của chủng BN2.1 là pH 7. 4.2. Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu một số thông số khác trong quá trình nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme của chủng BN2.1 như: nhiệt độ, điều kiện cấp khí, pH môi trường... từ đó đưa ra được môi trường nuôi cấy tổng hợp tối ưu giúp chủng BN2.1 tăng tiết enzyme đích protease, đồng thời hạn chế được các enzyme amylase và cellulase để thuận lợi hơn trong quá trình tinh chế sau này. - Nghiên cứu về hoạt độ enzyme amylase, phytase, nattokinase cùa chủng BN2.1. - Phân lập các dòng vi khuẩn từ sản phẩm Natto và định danh để tiếp tục nghiên cứu cho ra những chủng Bacillus subtilis Natto có hoạt độ protease cao. 45 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998). Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh. 2. Lâm Thị Kim Châu (2004). Thực tập lớn sinh hoá, Đại học Khoa học tự nhiên, TP Hồ Chí Minh. 3. Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn (2006). Nghiên cứu thu nhận chế phẩm protease từ ruột cá Basa (pangasius bocourti),Tạp chí Phát Triển KH&CN, tập9, số11. 4. Hin Vireak (2012). Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng tạo enzym protease của vi khuẩn Bacillus subtilis natto, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội 5. Trần Ngọc Hùng (2006). Khảo sát khả năng sinh tổng hợp và tính chất của α-amylase từ một số chủng Bacillus subtilis, Khoá luận tốt nghiệp ngành sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP Hồ Chí Minh. 6. Trần Ngọc Hùng (2010). Nghiên cứu tạo chế phẩm protease từ Bacillus subtilis sử dụng trong chế biến thức ăn gia cầm, Luận văn thạc sĩ sinh học, trường Đại học Khoa học tự nhiên, TP Hồ Chí Minh. 7. Đinh Thu Hương (2013). Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và chiết enzym protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis natto, Luận văn thạc sĩ dược học, trường Đại học Dược, Hà Nội. 8. Đinh Thị Kim Loan (2006). Khảo sát khả năng tổng hợp enzyme protease từ một số chủng Bacillus sp. phân lập từ các chế phẩm sinh học dung trong chăn nuôi ở Việt Nam, Khoá luận cử nhân khoa học, trường Đại học Khoa học tự nhiên, TP Hồ Chí Minh. 9. Nguyễn Đức Lượng (2004). Công Nghệ Enzyme, Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh. 46 Đồ án tốt nghiệp 10. Nguyễn Đức Lượng (2012). Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Đại học quốc gia, TP Hồ Chí Minh. 11. Đặng Lê Minh (2006). Khảo sát khả năng thuỷ phân một số dạng cơ chất của một số chủng Bacillus phân lập từ các sản phẩm thuốc thú y và thuỷ sản, Báo cáo thực tập tốt nghiệp, chuyên ngành sinh hoá. 12. Trương Thị Hồng Nhung, Hoàng Minh Nguyệt (2013). Phân lập và xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt ứng dụng trong xử lý môi trường, Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học sinh viên, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. 13. Lê Thị Bích Phượng, Võ Thị Hạnh, Trần Thạnh Phong, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân và Lê Thị Hương (2012). Phân lập và tuyển chọn một số chủng Bacillus sinh tổng hợp Nattokinase, Tạp chí sinh học, 34(3), tr. 99 – 104. 14. Nguyễn Thị Thảo, Quyền Đình Thi, Lê Thị Thu Hương (2006). Xác định một số tính chất hóa lý của protease chủng Serratia sp. DT3, Tạp chí sinh học - tập4(2), Trường ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH Quốc Gia Hà Nội. 15. Trần Linh Thước (2005). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong thực phẩm và mỹ phẩm, Nhà xuất bản Khoa học kĩ thuật, Hà Nội. 16. Tống Ngọc Triêm(2010). Tổng quan về enzyme ngoại bào Bacillus subtilis, khóa luận tốt nghiệp, ĐH Công Nghệ TPHCM. 17. Lê Ngọc Tú, La Văn Chử, Phạm Trân Châu (1982). Enzyme vi sinh vật tập 1, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội. 18. Bùi Ngọc Xuân (2012). Khảo sát khả năng sinh tổng hợp và một số đặc tính enzyme α-amylase của chủng Bacillus stearothermophilus, Luận văn tốt nghiệp, trường Đại học, Bình Dương. 47 Đồ án tốt nghiệp Tài liệu nước ngoài 19. Ishtiaq Ahmed, Muhammad Anjum Zia and Hafiz Muhammad Nasir Iqbal (2011). Purification and Kinetic Parameters Characterization of an Alkaline Protease Produced from Bacillus subtilis through Submerged Fermentation Technique, World Applied Sciences Journal 12 (6): 751-757. 20. Sadia Almas, Abdul Hameed, Dennis Shelly and Priya Mohan (2009). Purification and characterization of a novel protease from Bacillus strain SAL1, African Journal of Biotechnology, Vol. 8 (15), pp. 3603 - 3609 21. Wang C, Du M (2009). Purification and characterization of Nattokinase from Bacillus subtilis natto B – 12, Journal of Agricultural and food chemistry article, 57, p. 9722 – 9729. 22. Qiu D, Fujita K et al (2004). Comparative analysis of physical maps of four Bacillus subtilis (natto) genomes, Appl Environ Microbiol (70), pp. 6247 – 6256. 23. Keith H. Steinkraus (2004). Industrialization of indigenous fermented foods, pp.227 - 230. 24. Rong L.H (2011).The optimization, extraction and purification of Nattokinase and genetic cloning, Master's thesis, Hebei Union University (China). 25. Yiu H. Hui, Lisbeth Meunier - Goddik, Jiste Josephsen, Wai-Kit Nip (2005). Handbook of Food and Beverage Fermentation Technology, pp.612 - 620. 26. Abdelnasser S.S. Ibrahim, Ali A. Al-Salamah (2009). Optimization of media and cultivation conditions for alkaline protease production by Alkaliphilic Bacillus halodurans, Research journal of microbiology 4 (7): 251 - 259. 27. Liu J, Xing J, Chang T, Ma Z and Liu H (2005). Optimization of nutritional conditions for Nattokinase production by Bacillus natto NLSSE using statistical experimental methods, Process Biochemistry, vol.40(8), pp. 2757– 2762. 48 Đồ án tốt nghiệp 28. Tamang J, Thapa S. (2002). Phylogenetic analysis of Bacillus strains isolated from fermented soybean foods of Asian: Kinema, Chungkokjang and Natto, Journal of Hill Research, 15(2), pp.56 - 62. 29. Kerovuo J et al (1998). Isolation, characterization, molecular gene cloning and sequencing of a novel phytase from Bacillus subtilis, American society for microbiology Appl. Environ. Microbiol, vol. 64 no. 6 p 2079 – 2085. 30. Noda K, Igata K (1989). Synthesis of γ – glytamyl peptides catalyzed by transamidase from Bacillus natto, Agricultural Biology and Chemistry, 44, p. 2419 – 2423. 31. Yamane K, Hiroshi M (1974). Hybrid α – amylase produced by transformants of Bacillus subtilis – Purification and characterization of extracellular α – amylase produced by the parental strains and trasformants, Biochimica et Biophysica Acta, 365, p. 235 – 247. 32. Muramatsu K, Yamawake K (2000). Purification and crystallization of a new Bacillus subtilis elastase, Journal of Home Economics of Japan, 51(12), p. 1127 – 1135. 33. Fujita M et al (1993). Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme (Nattokinase) in the vegetable cheese natto, a popular soybean fermented food in Japan, Biochemical and Biophysical research communication, p. 1340 – 1347. 34. Fujita M, Hong K (1995). Thrombolytic effect of nattokinase on a chemically induced thrombosis model in rat, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 18(10), p. 1387 – 1391. 35. Weng M, Zheng Z, Bao W, Cai Y, Yin Y, Zou G (2009). Enhancement of oxidative stability of the subtilisin Nattokinase by site-directed mutagenesis expressed in Escherichia coli, Biochim Biophys Acta, 1794(11):1566 - 72 49 Đồ án tốt nghiệp 36. Shimizu M (1992). Purification and Characterization of Phytase from Bacillus subtilis (natto) N – 77, Bioscience biotechnology and biochemistry, 56(8), p. 1266 – 1269. 37. Muhammad Nadeem, Javed Iqbal Qazi, Shahjahan Baig, Qurat-ul-Ain Syed (2008). Effect of Medium Composition on Commercially Important Alkaline Protease Production by Bacillus licheniformis N-2, Food Technol. Biotechnol, 46 (4): 388 – 394 38. U.O.George-Okafor and E.E.Mike-Anosike (2012). Screening and optimal protease production by Bacillus sp. Sw-2, using low cost substrate medium, Research journal of microbiology 7 (7): 327 - 336. 39. Mahajan P, Sagar V (2010). Production of Nattokinase using Bacillus natto NRRL 3666: media optimization, scale up and kinetic modeling, Food Science and Biotechnology, 19(6), p. 1593 – 1603. 40. Gupta R, Beg Q.K (2002). Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications, Applied Microbiology and Biotechnology, 59, p. 15 – 32. 41. R. Sindhu, G. N. Suprabha and S. Shashidhar (2009). Optimization of process parameters for the production of alkaline protease from Penicillium godlewskii SBSS 25 and its application in detergent industry, African Journal of Microbiology Research Vol. 3(9) pp. 515 - 522. 42. Hiroyuki S, Misako Y (1999). Elastase activity in Natto and its relation to nattokinase, Nippon Nogeikagaku Kaishi, 73(11), p. 1187 – 1190. 43. Joo H.S., Kumar C.G., Park G.C., Paik S.R., Chang C.S. (2002). Optimization of the production of an extracellular alkaline protease from Bacillus horikoshii, Process Biochemistry, 38, 155 – 159. 44. S Vijayalaksmi, J Ranjitha, V Devi Rajeswari (2013). Enzyme production ability by Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis – A comparative study, Asian journal of pharmaceutical and clinical research, Vol 6, Issue 4, 2013. 50 Đồ án tốt nghiệp 45. Tokudome S, Omura K (2005). A newly derived protein from Bacillus subtilis natto with both antithrombotic and fibrinolytic effects, Journal of Pharmacological Sciences , 99, p. 247 – 251. 46. William Shurtleff, Akiko Aoyagi (2012). History of Natto and Its Relatives, Soyinfo Center. 47. Ashikaga S, Nanamiya H (2000). Natural genetic competence in Bacillus subtilis natto OK2, Journal of Bacteriology, 182(9), p. 2411 – 2415. 48. Yan S, JiaQi W (2011). Screening of protease and cellulase producing Bacillus subtilis natto strain and its growth characteristics, Dongbei Nongye Daxue Xuebao Journal, 42(3), p. 39 – 43. 49. Kato T et al (1992). Purification of a new extracellular 90 – kDa serine proteinase with isoelectric point of 3.9 from Bacillus subtilis (natto) and elucidation of its distinct mode of action, Bioscience biotechnology and biochemistry, 56 (7), p. 1166 – 1168. 50. Seki T., Oshima T. (1975). Taxonomic study of Bacillus by deoxyribonucleic acid – deoxyribonucleic acid hybridization and interspecific transformation, International Journal of Systematic Bacteriology, 25(3), pp.258 - 270. 51. Deepak V et al (2008). Optimization of media composition for Nattokinase production by Bacillus subtilis using response surface methodology, Bioresource Technology (99), pp.8170 - 8174. 52. Ogawa Y, Hosoyama H, Hamano M, Motai M (1991). Purification and properties of γ – glutamyltranspeptidase from Bacillus subtilis (natto), Agricultural Biology and Chemistry, 55, p. 2971 – 2977. 53. Yamagata Y, Abe R (1995). Molecular cloning and nucleotide sequence of the 90k serine protease gene, hspK, from Bacillus subtilis (natto) No. 16, Current Microbiology, 31(6), p. 340 – 344. 51 Đồ án tốt nghiệp Tài liệu Internet 54. Báo điện tử Sahifa (2016). NATTOKINASE là gì? - Những điều cần biết., 15/8/2016: doi-voi-suc-khoe/.html 55. Japan NattoKinase Associasion (online). Bacillus subtilis Natto, 5/7/2016: 56. Lorie Kramer (2011). Resen(online). The Bacillus subtilis Story, 5/9/2015: 52 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC PHỤ LỤC A. Bảng độ ẩm nguyên liệu ban đầu Nguyên liệu Độ ẩm (%) Bã đậu nành 9,6 Đậu xanh 11 Cám bắp 10,65 Cám gạo 9,8 Cám mì 10 PHỤ LỤC B. Đường chuẩn Tyrosine theo phương pháp Anson. OD trung bình 0,0163 0,2320 0,5546 0,694 1,0767 1,2966 Lượng Tyrosine 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 (µM) OD 0 0,2157 0,5383 0,6777 1,0604 1,2803 Đồ thị phụ lục B. Đường chuẩn Tyrosine. 1 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C. Khảo sát khả năng phân giải casein trên môi trường thạch đĩa của các chủng B. subtilis Natto ONEWAY HD BY NT /STATISTICS DESCRIPTIVES /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN DUNNETT ALPHA(0.05). Oneway [DataSet0] Descriptives HD 95% Confidence Interval for Mean Std. Std. Lower Upper N Mean Deviation Error Bound Bound Minimum Maximum 1 3 7.0000 1.73205 1.00000 2.6973 11.3027 6.00 9.00 2 3 20.3333 .57735 .33333 18.8991 21.7676 20.00 21.00 3 3 12.3333 .57735 .33333 10.8991 13.7676 12.00 13.00 4 3 12.6667 1.52753 .88192 8.8721 16.4612 11.00 14.00 5 3 13.0000 1.73205 1.00000 8.6973 17.3027 11.00 14.00 6 3 .0000 .00000 .00000 .0000 .0000 .00 .00 Total 18 10.8889 6.48880 1.52943 7.6621 14.1157 .00 21.00 ANOVA HD Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 697.778 5 139.556 93.037 .000 Within Groups 18.000 12 1.500 Total 715.778 17 2 Đồ án tốt nghiệp Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:HD 95% Confidence Interval Mean Lower Upper (I) NT (J) NT Difference (I-J) Std. Error Sig. Bound Bound Dunnett t 1 6 7.00000* 1.00000 .000 4.0987 9.9013 a (2-sided) 2 6 20.33333* 1.00000 .000 17.4321 23.2346 3 6 12.33333* 1.00000 .000 9.4321 15.2346 4 6 12.66667* 1.00000 .000 9.7654 15.5679 5 6 13.00000* 1.00000 .000 10.0987 15.9013 a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. *. The mean difference is significant at the 0.05 level. Homogeneous Subsets HD Subset for alpha = 0.05 NT N 1 2 3 4 Duncana 6 3 .0000 1 3 7.0000 3 3 12.3333 4 3 12.6667 5 3 13.0000 2 3 20.3333 Sig. 1.000 1.000 .538 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. 3 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC D. Khảo sát hoạt độ enzyme protease của chủng B. subtilis Natto trên môi trường bán rắn có thành phần cơ chất khác nhau ONEWAY HD BY NT /STATISTICS DESCRIPTIVES /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN DUNNETT ALPHA(0.05). Oneway [DataSet0] Descriptives HD 95% Confidence Interval for Mean Std. Std. Lower Upper N Mean Deviation Error Bound Bound Minimum Maximum 1 3 .7980 .13258 .07654 .4687 1.1273 .72 .95 2 3 .6600 .02606 .01504 .5953 .7247 .64 .69 3 3 .6797 .07950 .04590 .4822 .8772 .63 .77 4 3 .6160 .08271 .04775 .4105 .8215 .56 .71 5 3 .5220 .11988 .06921 .2242 .8198 .40 .64 6 3 .7713 .02948 .01702 .6981 .8446 .74 .79 Total 18 .6745 .12077 .02847 .6144 .7346 .40 .95 ANOVA HD Sum of df Mean F Sig. Squares Square Between .155 5 .031 3.977 .023 Groups Within Groups .093 12 .008 Total .248 17 4 Đồ án tốt nghiệp Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:HD 95% Confidence Mean Interval Difference Std. Lower Upper (I) NT (J) NT (I-J) Error Sig. Bound Bound Dunnett t 1 6 .02667 .07200 .995 -.1822 .2356 (2- 2 6 -.11133 .07200 .432 -.3202 .0976 sided)a 3 6 -.09167 .07200 .599 -.3006 .1172 4 6 -.15533 .07200 .176 -.3642 .0536 5 6 -.24933* .07200 .019 -.4582 -.0404 a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other group