Đồ án Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình tăng trưởng và tạo chồi của cây bạc hà á mentha arvensis l

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN QUÁ TRÌNH TĂNG TRƯỞNG VÀ TẠO CHỒI CỦA CÂY BẠC HÀ Á MENTHA ARVENSIS L. Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh SVTH: Phạm Thụy Ngọc Trân Lớp: 12DSH02 TP.HCM, tháng 8/2016 Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC .................................................................................................................... i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................ iv DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... v DANH MỤC BIỂU ĐỒ ............................................................................................. vi DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................vii LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1 1. Lý do chọn đề tài ...................................................................................................... 1 2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................................ 2 3. Nội dung đề tài ......................................................................................................... 3 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................................. 3 5. Kết quả đạt được của đề tài ...................................................................................... 3 6. Kết cấu của đồ án ..................................................................................................... 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 5 1.1. Giới thiệu sơ lược kỹ thuật nuôi cấy in vitro ........................................................ 5 1.1.1. Khái niệm ........................................................................................................... 5 1.1.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô ở Việt Nam ................................................ 5 1.1.3. Kỹ thuật nuôi cấy mô ......................................................................................... 6 1.1.4. Ưu và nhược điểm của kỹ thuận nhân giống in vitro ........................................ 8 1.1.5. Thành phần các chất khoáng vô cơ .................................................................... 9 1.1.5.1. Các nguyên tố đa lượng .................................................................................. 9 1.1.5.2. Các nguyên tố vi lượng ................................................................................. 11 1.1.6. Dinh dưỡng hữu cơ........................................................................................... 12 1.1.7. Các hợp chất tự nhiên ....................................................................................... 14 1.1.8. Carbon và nguồn năng lượng ........................................................................... 17 1.1.9. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật............................................................ 18 1.1.10. Các thành phần khác ...................................................................................... 18 i Đồ án tốt nghiệp 1.1.11. Sự phát sinh hình thái thực vật ....................................................................... 20 1.2. Giới thiệu sơ lược về Bạc hà ............................................................................... 21 1.2.1. Tình hình nghiên cứu Bạc hà trên thế giới và Việt Nam ................................. 21 1.2.2. Giới thiệu sơ lược về giống Bạc Hà Á Mentha arvensis L. ............................ 23 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 31 2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài ................................................................ 31 2.2. Vật liệu ................................................................................................................ 31 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 31 2.2.2. Môi trường nuôi cấy ......................................................................................... 31 2.2.3. Điều kiện thí nghiệm ........................................................................................ 31 2.3. Phương pháp ........................................................................................................ 31 2.4. Bố trí thí nghiệm.................................................................................................. 32 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L .............................................. 32 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát hàm lượng của nước dừa đến khả năng sinh trưởng và phát triển của Bạc hà Á Mentha arvensis L. .................................. 33 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của đậu đen lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. .......................................................................................... 33 2.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của đậu xanh lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. .......................................................................................... 34 2.5. Chỉ tiêu theo dõi .................................................................................................. 35 2.6. Thống kê và xử lý số liệu .................................................................................... 35 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 37 3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy. ............................... 37 ii Đồ án tốt nghiệp 3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của hàm lượng của nước dừa đến khả năng sinh trưởng và phát triển của Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy .............................................................................................................. 45 3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của đậu đen lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy ............................................................................................ 52 3.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của đậu xanh lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy ............................................................................................ 60 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................... 67 4.1. Kết luận................................................................................................................ 67 4.2. Kiến nghị ............................................................................................................. 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 68 iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic Acid ACC 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid ACS ACC synthase AND Acid deoxiribonucleic AOA Aminooxyacetic acid ARN Acid ribonucleic AVG Aminoethoxyvinylglycine B1 Thiamine B3 Nicotinic Acid B6 Pyridoxine BAP 6-benzylaminopurin IBA Indole-3-butyric acid MET Methionine MS Murashige và Skoog, 1962 NAA Alpha-naphtalenacetic acid PVP Polyvinylpyrolidone SAM S-adenosine-methionine TDZ Thidiazuron 2,4,5-T Acid Trichlorophenoxyacetic 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của nước dừa ...................................................... 15 Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng của 100 g đậu xanh ............................................ 16 Bảng 1.3. Thành phần dinh dưỡng của 100 g đậu đen .............................................. 17 Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. ................................................................................................. 32 Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nước dừa lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. .. 33 Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của đậu đen lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. ........ 34 Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của đậu xanh lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. ........ 35 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của các nồng độ than hoạt tính khác nhau lên quá trình hình thành rễ và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy ......................................................................................... 38 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của các nồng độ nước dừa khác nhau lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy ............................................................................................. 46 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các nồng độ bột đậu đen khác nhau lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy ............................................................................................. 53 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của các nồng độ bột đậu xanh khác nhau lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy .................................................................................. 60 v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy ......... 39 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của than hoạt tính đến số lá, số chồi và số rễ của Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy ................................................. 39 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến đường kính lá, chiều dài lá, chiều cao cây và chiều dài rễ của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy ................................................................... 40 Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của nước dừa đến trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy ................ 47 Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của nước dừa đến số lá, số chồi và số rễ của Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy ..................................................... 47 Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của nước dừa đến đường kính lá, chiều dài lá, chiều cao cây và chiều dài rễ của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy ...................................................................................... 48 Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của đậu đen đến trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy ................ 54 Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của đậu đen đến số lá, số chồi và số rễ của Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy ..................................................... 54 Biểu đồ 3.9. Ảnh hưởng của đậu đen đến đường kính lá, chiều dài lá, chiều cao cây và chiều dài rễ của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy ............................................................................................... 55 Biểu đồ 3.10. Ảnh hưởng của đậu xanh đến trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy ................ 61 Biểu đồ 3.11. Ảnh hưởng của đậu xanh đến số lá, số chồi và số rễ của Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy ..................................................... 61 Biểu đồ 3.12. Ảnh hưởng của đậu xanh đến đường kính lá, chiều dài lá, chiều cao cây và chiều dài rễ của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy ...................................................................................... 62 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Bạc Hà Á Mentha arvensis L. ............................................................................ 23 Hình 3.1. Ảnh hưởng của các nồng độ than hoạt tính khác nhau lên quá trình hình thành rễ và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy ........................................................................................................................ 41 Hình 3.2. Ảnh hưởng của các nồng độ nước dừa khác nhau lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy ........................................................................................................................ 49 Hình 3.3. Ảnh hưởng của các nồng độ bột đậu đen khác nhau lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy ................................................................................................................ 56 Hình 3.4. Ảnh hưởng của các nồng độ bột đậu xanh khác nhau lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy ................................................................................................................ 63 vii Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Việt Nam có điều kiện tự nhiên, khí hậu thuận lợi nên là nước có hệ thực vật rất phong phú và đa dạng. Tổng số loài thực vật ở Việt Nam được ước tính có khoảng 12.000 loài. Trong số này, nguồn tài nguyên dược liệu rất phong phú và đa dạng, chiếm một phần lớn đáng kể. Qua các số liệu điều tra đã thống kê được trên 4.000 loài thực vật được dùng làm thuốc. Từ lâu, cộng đồng các dân tộc Việt Nam đã biết dùng cây thuốc để chữa bệnh, với kinh nghiệm điều trị nhiều loại bệnh khác nhau. Hàng năm, nước ta có nhu cầu từ 40.000 - 60.000 tấn dược liệu và công tác phát triển dược liệu đã được Nhà nước quan tâm. Nhiều địa phương đã đầu tư các vùng trồng dược liệu bền vững, góp phần tăng thu nhập cho người dân và đáp ứng nhu cầu nguyên liệu đảm bảo chất lượng. Hiện nay người ta có xu hướng quay trở về với cây thuốc và thuốc có nguồn gốc thiên nhiên tạo ra. Xu hướng này đã tác động đến việc sản xuất, thu hái, chế biến, lưu thông, tiêu thụ và sử dụng dược liệu thảo mộc. Trước nhu cầu về dược liệu thiên nhiên, do sự tác động của người thu mua, nhận thức và ý thức của người dân, công tác quản lý chưa đáp ứng yêu cầu,... nên việc khai thác tài nguyên dược liệu thường diễn ra bừa bãi, không chú ý đến khả năng tái sinh của các loài. Do vậy đã làm nguồn tài nguyên dược liệu của Việt Nam suy giảm nghiêm trọng. Trong số các loài thảo dược phổ biến, thì cây Bạc hà Mentha arvensis L. thuộc họ hoa môi (Lamiaceae) là một trong những loài thảo mộc quý đang rất được ưa chuộng, đóng vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp dược liệu, có giá trị kinh tế, sử dụng rộng rãi cả trong Tây y và Đông y ở nước ta và trên thế giới. Cây Bạc hà tuy được sử dụng rộng rãi, có tác dụng dược lý cao trong Đông y và Tây y ở hầu hết các nước trên thế giới nhưng các nghiên cứu về chúng còn ít so với nhiều cây trồng và cây dược liệu khác. Theo Khotin (1963), nhiều loài Bạc hà để lấy tinh dầu có nguồn gốc ở một số nước phía Tây châu Âu; điều này phù hợp 1 Đồ án tốt nghiệp với các nghiên cứu về phân loại thực vật bậc cao là bộ, họ Hoa môi phân bố tập trung ở vùng Địa Trung Hải, Tiểu Á và Trung Á,... (Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến, 1978). Ở Việt Nam theo GS.TS Đỗ Tất Lợi, cây Bạc hà mọc hoang dại và được trồng ở nhiều vùng, chúng mọc hoang dại cả ở đồng bằng, trung du và miền núi như ở Sa Pa (Lào Cai); Tam Đảo (Vĩnh Phúc); Ba Vì (Hà Nội) và Bắc Kạn, Sơn La, Hải Dương, Hưng Yên, Hà Nội, Bắc Ninh, Bắc Giang,... Từ năm 1955 nước ta đã trồng Bạc hà, đến năm 1972 cả nước đã tự sản xuất được khoảng 60 tấn tinh dầu Bạc hà và 1 tấn menthol tinh thể. Hầu hết cây Bạc hà được nhân giống chủ yếu bằng các phương pháp truyền thống như giâm cành, gieo hạt, Trong những nơi khô hạn, việc nhân giống của Bạc hà gặp nhiều khó khăn. Vì vậy, kỹ thuật vi nhân giống được coi là phương pháp hữu hiệu cho phép nhân nhanh và bảo tồn các loài thực vật, trong đó có loài dược thảo quan trọng như Bạc hà Mentha arvensis L. Nhân giống in vitro đã được chứng minh là công nghệ tiềm năng cho sản xuất quy mô lớn các loài thực vật (Wawrosch et al., 2001; Martin, 2003; Azad, 2005; Hassan và Roy, 2005; Hassan et al., 2009). Hiện nay, các công trình nghiên cứu về nhân nhanh giống cây trồng đã đạt nhiều thành tựu trên các loài thực vật có giá trị như Lan, Cúc, Lily, tuy nhiên về cây Bạc hà vẫn còn hạn chế. Một số công trình nghiên cứu nổi bật về Bạc hà như: nhân giống in vitro Mentha arvensis L. thông qua nuôi cấy mô sẹo (Maity, 2013), Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình tăng trưởng và tạo chồi của cây bạc hà Á Mentha arvensis L.”. Với mục đích ứng dụng công nghệ sinh học trong việc phát triển nông nghiệp bền vững, vừa tăng năng suất cây trồng, giống không bị thoái hoá,không sâu, bệnh. 2. Mục đích nghiên cứu Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính, bột từ đậu đen, đậu xanh, và nước dừa lên khả năng tăng trưởng của cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. 2 Đồ án tốt nghiệp Xây dựng môi trường cải tiến để nhân giống cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. tốt nhất bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào in vitro. 3. Nội dung đề tài  Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L.  Khảo sát bổ sung nước dừa vào môi trường nhân nhanh cây Bạc hà Á Mentha arvensis L.  Khảo sát ảnh hưởng của bột đậu đen lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L.  Khảo sát ảnh hưởng của bột đậu xanh lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu sẽ đưa ra một biện pháp kỹ thuật nhân giống Bạc hà Á Mentha arvensis L. bằng phương pháp in vitro để đánh giá hoạt tính kích thích tăng trưởng khi bổ sung hoặc thay thế các yếu tố trong môi trường nuôi cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. Duy trì hình thái và khắc phục các trường hợp hay gặp trong nuôi cấy mô khi môi trường đặc biệt sử dụng agar, cấy chuyền mẫu nhiều lần. Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả của nghiên cứu là cơ sở để tạo môi trường nuôi cấy thích hợp nhân nhanh giống Bạc hà Á Mentha arvensis L. ở quy mô lớn, cây sạch bệnh nhằm cung cấp nguồn nguyên liệu liên tục và ổn định để thu hồi các hợp chất có giá trị cao dùng làm thuốc, góp phần bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng. 5. Kết quả đạt được của đề tài  Xác định được nồng độ thích hợp của than hoạt tính lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L.  Xác định được nồng độ thích hợp của nước dừa lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L. 3 Đồ án tốt nghiệp  Xác định được nồng độ bột đậu đen thích hợp lên khả năng tăng trưởng của cây Bạc hà Á Mentha arvensis L.  Xác định được nồng độ bột đậu xanh thích hợp lên khả năng tăng trưởng của cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. 6. Kết cấu của đồ án Đồ án bao gồm các chương sau: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 4 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy in vitro 1.1.1. Khái niệm Nuôi cấy mô (tissue culture) là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy vô trùng in vitro các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền (giống cây trồng), sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý, Nhân giống vô tính in vitro được tiến hành trên nguyên tắc cắt nuôi đoạn thân có mang chồi ở nách lá, đoạn rễ hay mảnh củ, cánh hoa, có kích thước nhỏ phù hợp với điều kiện vô trùng của ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng với các mục đích khác nhau. Môi trường có chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, các phytohormone, vitamin và đường. 1.1.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô ở Việt Nam Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật du nhập vào nước ta từ năm 1960 ở miền Nam và đầu những năm 1970 ở miền Bắc, nhưng thực sự phát triển từ năm 1980. Lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng. Nhiều tỉnh thành trong cả nước đã xây dựng nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu công nghệ cao để phát triển lĩnh vực nuôi cấy mô này và đã mang lại nhiều thành tựu nổi bật: Ở miền Bắc, nhân giống vô tính ở thực vật được ứng dụng ở hầu hết các loài thực vật nông, lâm sản, bảo tồn thành công các loại gỗ quý như: Vù hương (loại gỗ tiết tinh dầu dùng trong dược phẩm, mỹ phẩm), cây Đăng lấy gỗ, Chè vang (một loại chè rất khó trồng). Kỹ thuật này giúp lai tạo thành công giống Lúa chịu hạn DR1, nhân giống nhiều loại khoai tây, mía,... Từ năm 2001 đến nay, Sở Khoa học Công nghệ Lạng Sơn, hàng năm cung cấp hàng vạn cây giống Bạch đàn Eucalyptus urophylla. 5 Đồ án tốt nghiệp Trung tâm ứng dụng và chuyển giao tiến bộ công nghệ tỉnh Vĩnh Phúc ứng dụng thành công công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân giống cây Lô hội, một loài dược liệu quý ở địa phương. Việt Nam có thể trở thành quốc gia sản xuất Phong lan lớn trong khu vực. Chỉ với 3 người, phòng nuôi cấy mô – trung tâm giống và kỹ thuật cây trồng Phú Yên có thể tạo 500.000 cây lan cấy mô theo yêu cầu của khách hàng. Hiện nay 100% nông dân Đà Lạt sử dụng cây giống từ nuôi cấy mô. Năm 2002, Lê Thị Kim Đào và cộng sự tại Trung tâm Ứng dụng Khoa học Kỹ thuật Bình Định đã nhân giống thành công 4 loại cây Trầm hương, Bạch đàn Urophylla, cây Hông, Giổi xanh bằng phương pháp nuôi cấy mô cho chất lượng cây giống tốt và hiệu quả kinh tế cao. Năm 2008, công nghệ nuôi cấy mô đã có những bước đột phá mới: nhân giống thành công giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) quý hiếm từ một số tế bào gốc của sâm Ngọc Linh bằng công nghệ sinh khối tế bào, nhóm nghiên cứu học viện Quân y đã thành công trong việc nuôi cấy thành số lượng lớn, toàn bộ quy trình chỉ mất 10 đến 20 ngày, trong khi bình thường phải mất khoảng 6 năm sâm mới cho thu hoạch. Đã khôi phục nhiều loài lan rừng quý hiếm khỏi nguy cơ tuyệt chủng, đặc biệt là loài lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) – loài lan duy nhất có hương thơm trên thế giới, 1.1.3. Kỹ thuật nuôi cấy mô Các bước nhân giống: Giai đoạn 1: chọn lọc cây mẹ và khử trùng mô nuôi cấy. Cây mẹ phải là cây sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu nuôi cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống sinh trưởng của mẫu nuôi cấy. Tuỳ thuộc vào mục đích khác nhau, loại cây khác nhau để nuôi cấy phù hợp. Khi lấy mẫu cần chọn đúng mô, đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá. 6 Đồ án tốt nghiệp Giai đoạn 2: tái sinh mẫu nuôi cấy. Mục đích của các giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin, cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, bên cạnh điều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy. Thường mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành đã chuyên hoá sâu. Người ta cũng còn nhận thấy rằng mẫu cấy trong thời gian sinh trưởng nhanh của cây trong mùa sinh trưởng cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi. Giai đoạn 3: nhân nhanh. Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình. Ở giai đoạn này bao gồm nhiều lần cấy chuyền mô lên các môi trường nhân nhanh nhằm kích thích tạo cơ quan phụ hoặc cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh. Để tăng hệ số nhân, người ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hoà sinh trưởng thực vật như: auxin, cytokynin, gibberellin, và các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm men, kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Giai đoạn 4: tạo cây hoàn chỉnh. Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường 2 – 3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin là nhóm hormone thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Giai đoạn 5: đưa cây ra vườn ươm. Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra vườn ươm là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất. Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ, ánh sáng, ẩm độ, giá thể,) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như ở đồng ruộng. 7 Đồ án tốt nghiệp 1.1.4. Ưu và nhược điểm của kỹ thuật nhân giống in vitro Ưu điểm  Phương pháp nhân giống in vitro có những ưu điểm vượt trội so với các phương pháp nhân giống truyền thống (giâm, chiết, ghép,) như:  Cây con đồng nhất về mặt di truyền;  Cây có hệ số nhân cao, sản xuất được số lượng cây giống trong một thời gian ngắn nhằm đáp ứng nhu cầu thương mại;  Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và cơ quan khác nhau của cây như: trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, hoa, chồi phát hoa, hạt phấn, mà ngoài tự nhiên không thể thực hiện được;  Tạo cây sạch virus thông qua xử lý nhiệt hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng;  Tạo dòng toàn cây cái (cây Chà là) hoặc toàn cây đực (cây Măng tây) theo mong muốn;  Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm,  Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm;  Dễ dàng tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chuyển gen;  Ngoài ra, phương pháp nhân giống in vitro còn giảm được nhiều công sức chăm sóc, nguồn mẫu dự trữ lâu dài và chiếm ít không gian so với phương pháp nhân giống truyền thống. Nhược điểm:  Dễ xảy ra đột biến do tác dụng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được bổ sung vào môi trường nuôi cấy;  Quá trình nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan và cần khoảng thời gian dài trước khi có thể thích ứng trồng ngoài vườn ươm;  Sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống rất hạn chế, nghĩa là cây con tạo ra thường ít đồng nhất về mặt kiểu hình; 8 Đồ án tốt nghiệp  Nhân giống trên môi trường bán rắn có giá thành sản xuất vẫn còn cao (do sử dụng agar) và thời gian cấy chuyền dài. Khi sản xuất ở quy mô công nghiệp, chi phí cho năng lượng và nhân công vẫn còn rất lớn. 1.1.5. Thành phần các chất khoáng vô cơ: Cho đến nay, đã có nhiều loại môi trường dinh dưỡng được tìm ra: môi trường Murashige và Skoog (1962) viết tắc là MS, môi trường Linsmainer và Skoog (1963), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974),... Trong số đó, môi trường MS được đánh giá là phù hợp nhất cho đa số các loài thực vật (Smith và Gould) và chính Murashige (1974) đã dùng môi trường này để nuôi cấy nhiều loại cây trồng. Theo Lê Văn Hòa và cộng sự (1999) khoáng đa lượng rất cần cho cây, có ảnh hưởng rất tốt cho sự hấp thu của mô cấy và chúng không gây độc. Các nguyên tố khoáng đa lượng gồm các nguyên tố được sử dụng ở nồng độ trên 30 mg/l. Các nguyên tố khoáng vi lượng là các nguyên tố được sử dụng với nồng độ thấp hơn 30 mg/l. Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của các enzyme (Nguyễn Xuân Linh, 1998). 1.1.5.1. Các nguyên tố đa lượng: Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật không khác nhiều so với cây trồng trong tự nhiên. Trong nhóm này gồm 3 nguyên tố chính: N, P, K. Nitrogen (N) Nitrogen là thành phần cấu tạo nên nucleotide, acid amine, protein, diệp lục và một số hormone thực vật nên nitrogen là nguyên tố dinh dưỡng hàng đầu trong + môi trường nuôi cấy, được cung cấp dưới dạng muối ammononium (NH4 ) và dạng - nitrate (NO3 ). Các muối phổ biến dùng cung cấp nguồn nitrate là: KNO3: Potassium nitrate (14% N) NH4NO3: Ammonium nitrate (34% N) NaNO3: Sodium nitrate (16,4% N) Ca(NO3)2: Calcium nitrate (15,5% N) 9 Đồ án tốt nghiệp Các muối phổ biến dùng cung cấp nguồn ammononium là: CO(NH2)2: Urea (46% N) (NH4)2SO4: Ammonium sunfate (22% N) Phosphosrus (P) Có tác dụng quan trọng đối với việc phân chia tế bào, tích lũy và chuyển hóa năng lượng trong quá trình quang hợp, hô hấp, đồng thời là thành phần cấu tạo nên acid nucleid, protein và nhiều hợp chất có tính sinh học quan trọng. - 2- Dạng phosphorus mô thường hấp thu là H2PO4 và HPO4 có tác dụng như một hệ đệm làm ổn định pH của môi trường nuôi cấy. Các dạng muối thường gặp: • (NH4)2HPO4: Diammonium hydrogen phosphate (46% P2O5) • (NH4)3HPO4.3H2O:...êu đánh giá chất lượng tinh dầu. Điều kiện sinh thái • Nhiệt độ Cây bạc hà sinh trưởng tốt trong điều kiện nhiệt độ mát mẻ từ 18 – 27oC, trong thời kỳ ra hoa nhiệt độ thích hợp nhất là 25 – 27oC. Tuy nhiên trong điều kiện nhiệt độ >10oC cây vẫn có thể sinh trưởng được. Trong thời kỳ tiềm sinh, bạc hà có thể chịu được nhiệt độ rất thấp dưới -1oC. 27 Đồ án tốt nghiệp • Độ ẩm Cây Bạc hà không yêu cầu ẩm độ một cách nghiêm ngặt, tuy nhiên trồng để đạt năng suất cao về chất xanh và tỷ lệ tinh dầu nên chú ý và coi trọng vấn đề tưới tiêu nước, do rễ cây Bạc hà phát triển ở trên tầng đất mặt nên sức hút nước và dinh dưỡng kém hơn so với các loại cây trồng khác. Tưới tiêu, giữ ẩm là cơ sở cho việc tạo năng suất cao của cây Bạc hà quá trình sinh trưởng phát triển của cây cần đảm bảo đủ độ ẩm đất, ẩm độ biến động lớn sẽ gây rụng lá và tích lũy tinh dầu kém. Ẩm độ đất thích hợp là 70 – 75 %, ẩm độ không khí từ 75 – 80 %. • Ánh sáng Cây Bạc hà rất mẫn cảm với thời gian chiếu sáng (ngày dài, ngày ngắn) và cường độ chiếu sáng mạnh, đầy đủ. Để cây sinh trưởng và phát triển bình thường thì yêu cầu độ chiếu sáng trong ngày ≤ 12h. Độ dài ngày chiếu sáng 8 – 10 h, cây sẽ sinh trưởng yếu và không nở hoa, hầu hết các dạng thân ngầm không chuyển sang dạng thân khí sinh, số cây trên đơn vị diện tích sẽ làm giảm năng suất chất xanh và lượng tinh dầu. Cây Bạc hà là cây ưa sáng và phát triển tốt trong điều kiện ánh sáng trực xạ. Trong quá trình trồng bạc hà phải chú ý đến thời vụ trồng mật độ, không trồng xen để đảm bảo ánh sáng hợp lý cho chúng sinh trưởng và phát triển tốt. Ở nước ta thời vụ trồng thích hợp nhất là vụ xuân hàng năm. • Đất đai: Cây bạc hà ưa đất tơi xốp, có thành phần cơ giới nhẹ, giàu dinh dưỡng, giữ nước và thoát nước tốt. Các loại đất phù sa ven sông suối, các loại đất đen có tầng canh tác tương đối dày, mực nước ngầm thấp thích hợp cho bạc hà. Các loại đất có thành phần cơ giới nặng như đất sét, đất không có cấu tượng như đất cát không thích hợp với bạc hà. Độ pH thích hợp cho bạc hà là 6 – 7,5, trên các loại đất trồng liên tục từ 2 – 3 năm nên phá đi để trồng lại, nên tiến hành luân canh với các loại cây trồng khác để giảm tỷ lệ sâu bệnh hại, không ảnh hưởng đến năng suất. 28 Đồ án tốt nghiệp • Dinh dưỡng: Trong từng giai đoạn sinh trưởng Bạc hà cần lượng dinh dưỡng khác nhau. Chú ý bón phân vào các thời kỳ: khi cây cao 10 cm, khi phân cành và khi nụ hoa bắt đầu phát sinh. Nguyên tố potassium cần bón kết thúc sớm (vào lúc cây phân cành) để không ảnh hưởng tới tích lũy tinh dầu. Giá trị kinh tế và tình hình sản xuất Bạc Hà Á Mentha arvensis L. a) Giá trị kinh tế: Tinh dầu Bạc hà là nguyên liệu cho công nghiệp dược, chủ yếu trong sản xuất các loại thuốc kháng vi khuẩn (như thuốc đánh răng, thuốc chữa viêm xoang mũi, trán), các loại thuốc làm tan vết bầm dập trên cơ thể, đau xương khớp và thuốc chống cảm lạnh, thuốc chữa loét dạ dày. Tinh dầu Bạc hà còn là nguồn nguyên liệu, nguyên liệu phụ cho công nghiệp thực phẩm (như làm rượu, bia, bánh kẹo) và công nghệ chế biến mỹ phẩm. Bã dầu khi chưng cất có khối lượng lớn, người ta để thật hoai mục làm phân bón cho cây lúa nước. Diện tích trồng Bạc hà chỉ có một số nước trên thế giới, nhưng nhu cầu để duy trì thì hầu hết có ở các nước nên tinh dầu và dạng hoạt chất của tinh dầu luôn có giá trị nên thị trường ổn định ít mất giá. b) Tình hình sản xuất  Trên thế giới: Trên thế giới có nhiều nước trồng Bạc hà để thoả mãn nhu cầu trong nước và xuất khẩu. Châu Mỹ trồng nhiều bạc hà nhất, Brazil có diện tích lớn. Tỷ trọng xuất khẩu của châu lục này chiếm 70 – 90% của thế giới, sản lượng tinh dầu Bạc hà trên thế giới ước đạt 3000 tấn/năm. Châu Á ít trồng chỉ có Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam trồng bạc hà và có mặt hàng xuất khẩu,...  Ở Việt Nam: Cây Bạc hà Châu Á mọc hoang ở nước ta rất nhiều nhưng tập trung nhiều ở các vùng như: Hoàng Liên Sơn, Tam Đảo, Ba Vì. Cây Bạc hà Châu Á được trồng thành vùng ở đồng bằng Bắc Bộ như Hưng Yên, Nam Định, Hà Nam, các vùng ở ngoại thành Hà Nội,... Các chủng loại được nhập và trồng phổ biến ở nước ta mang 29 Đồ án tốt nghiệp mã số 701, 974, 976,... Các chủng này có thể đạt 60 – 100 lít tinh dầu/ha/năm. Điều kiện nước ta rất thích hợp cho trồng Bạc hà, đầu ra của sản phẩm có triển vọng nhưng chính sách và các nghiên cứu về Bạc hà chưa được chú trọng. Công dụng Cây Bạc hà, tinh dầu và hoạt chất menthol trong cây Bạc hà được người ta sử dụng với nhiều cách khác nhau như:  Lá Bạc hà giúp cho tiêu hóa, trừ co thắt, trị nôn (do có tinh dầu). Các Flavonid có tác dụng lợi mật. Dạng dùng là chè thuốc. Trong y học cổ truyền người ta dùng bạc hà làm thuốc chữa cảm nóng, nhức đầu, ho, viêm khí quản, mụn nhọt, lở ngứa.  Tinh dầu Bạc hà và menthol bốc hơi nhanh, tinh dầu Bạc hà là thành phần của Cao Sao Vàng và các Cao, dầu xoa khác để chữa cảm lạnh, nhức đầu, chóng mặt, say tàu xe,Nó còn là chất thơm dùng trong công nghiệp thuốc lá, kem đánh răng, kẹo, mỹ phẩm,  Menthol có tính sát khuẩn, tiếp xúc với da gây cảm giác mát và tê tại chỗ (do hiện tượng bay hơi).  Thuốc bôi chữa đau răng (có tên là thuốc lỏng Bonain) gồm có một phần Menthol, một phần phenol và một phần cocain.  Nhu cầu hàng năm trong nước khoảng 50 tấn tinh dầu. 30 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài Địa điểm: Đề tài được tiến hành tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học, Khoa CNSH – TP – MT, trường Đại Học Công nghệ Tp.HCM Thời gian tiến hành Đề tài từ tháng 11 / 2015 đến tháng 8 / 2016. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu: Nguồn mẫu được sử dụng trong đề tài được tạo từ các đoạn thân in vitro, của giống Bạc hà Á Mentha arvensis L. in vitro ở phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh. 2.2.2. Môi trường nuôi cấy Các thí nghiệm sử dụng môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) bổ sung thêm đường sucrose, agar, than hoạt tính và bột từ các loại ngũ cốc, nước dừa tuỳ theo từng thí nghiệm. 2.2.3. Điều kiện thí nghiệm  Nhiệt độ: 25 ± 2oC  Cường độ sáng từ 2500 – 3000 1ux.  Thời gian chiếu sáng 16 giờ / ngày.  Ẩm độ không khí: từ 30 – 40%. 2.3. Phương pháp Pha môi trường a. Chuẩn bị dung dịch mẹ Sử dụng môi trường MS: môi trường này được coi là môi trường thích hợp với nhiều loại cấy do giàu và cân bằng về mặt dinh dưỡng. Để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy khi không cần cân hóa chất mỗi lần pha mà thường chuẩn bị trước dưới dạng các dung dịch đậm đặc, sau đó chỉ cần pha loãng khi sử dụng. Các stock này thường được bảo quản dài ngày trong tủ lạnh nhiệt độ thường. 31 Đồ án tốt nghiệp b. Môi trường nuôi cấy: Môi trường có bổ sung than hoạt tính: MS có bổ sung 1 mg/l NAA, 2 mg/l BA, 9 g/l agar, 30 g/l sucrose, và nồng độ than hoạt tính tương ứng 0; 0,125; 0,25; 0,375; 0,5; 0,625 g/l. Môi trường có bổ sung nước dừa: MS có bổ sung 1 mg/l NAA, 2 mg/l BA, 9 g/l agar, 30 g/l sucrose và nồng độ nước dừa tương ứng 0; 25; 50; 75; 100 ml. Môi trường có bổ sung đậu đen: MS có bổ sung 1 mg/l NAA, 2 mg/l BA, 9 g/l agar, 30 g/l sucrose và hàm lượng đậu đen tương ứng 0; 3; 6; 9; 12; 15 g/l. Môi trường có bổ sung đậu xanh: MS có bổ sung 1 mg/l NAA, 2 mg/l BA, 9 g/l agar, 30 g/l sucrose và hàm lượng đậu xanh tương ứng 0; 3; 6; 9; 12; 15 g/l. Tất cả đều được định mức tới 1000 ml và điều chỉnh pH bằng NaOH và HCl. 2.4. Bố trí thí nghiệm 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính lên khả năng tăng trưởng cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. • Mục đích thí nghiệm Thí nghiệm này nhằm xác định nồng độ than hoạt tính thích hợp lên khả năng tăng trưởng của đoạn cắt thân cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. • Tiến hành thí nghiệm Đoạn cắt cây Bạc hà được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng 1 mg/l NAA, 2 mg/l BA, 30 g/l sucrose và hàm lượng than hoạt tính thay đổi theo từng nghiệm thức như bảng 2.1. Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. Nghiệm thức Nồng độ (g/l) A0 0 A1 0,125 A2 0,25 A3 0,375 32 Đồ án tốt nghiệp A4 0,5 A5 0,625 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát hàm lượng của nước dừa đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. • Mục đích thí nghiệm Thí nghiệm này nhằm xác định hàm lượng nước dừa thích hợp lên khả năng tăng trưởng của đoạn cắt thân cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. • Tiến hành thí nghiệm Đoạn cắt cây Bạc hà được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng 1 mg/l NAA, 2 mg/l BA, 30 g/l sucrose và hàm lượng nước dừa thay đổi theo từng nghiệm thức như bảng 2.2. Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nước dừa lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. Nghiệm thức Nồng độ (ml) B0 0 B1 25 B2 50 B3 75 B4 100 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của bột đậu đen lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. • Mục đích thí nghiệm Thí nghiệm này nhằm xác định hàm lượng đậu đen thích hợp cho quá trình nhân nhanh chồi, hình thành rễ ở cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. 33 Đồ án tốt nghiệp • Tiến hành thí nghiệm Đoạn cắt cây Bạc hà được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng 1 mg/l NAA, 2 mg/l BA, 30 g/l sucrose và thêm hàm lượng đậu đen thay đổi theo từng nghiệm thức như bảng 2.3. Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của đậu đen lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. Nghiệm thức Nồng độ (g/l) C0 0 C1 3 C2 6 C3 9 C4 12 C5 15 2.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của bột đậu xanh lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. • Mục đích thí nghiệm Thí nghiệm này xác định hàm lượng đậu xanh thích hợp lên khả năng tăng trưởng của đoạn cắt thân cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. • Tiến hành thí nghiệm Đoạn cắt cây Bạc hà được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng 1 mg/l NAA, 2 mg/l BA, 30 g/l sucrose và thêm hàm lượng đậu xanh thay đổi theo từng nghiệm thức như bảng 2.4. 34 Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của đậu xanh lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. Nghiệm thức Nồng độ (g/l) D0 0 D1 3 D2 6 D3 9 D4 12 D5 15 2.5. Chỉ tiêu theo dõi  Trọng lượng tươi (g)  Trọng lượng khô (g)  Số lá (lá/cây)  Đường kính lá (mm)  Chiều dài lá (mm)  Số rễ (rễ/mẫu)  Chiều dài rễ (mm)  Số chồi (chồi/mẫu)  Chiều cao cây (mm)  Đặc điểm hình thái của mẫu 2.6. Thống kê và xử lý số liệu Tiến hành bố trí thí nghiệm theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố. Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Kết quả ghi nhận số liệu là giá trị trung bình. Xử lý số liệu thu được bằng phần mềm Microsoft Execel 2013® và SAS 9.1. Tất cả các số liệu sau khi thu thập ứng với từng chỉ tiêu theo dõi, được thống kê và 35 Đồ án tốt nghiệp biểu diễn dưới dạng các số liệu giá trị trung bình cùng kí tự a, b thì không có sự sai khác về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a,b,) chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. 36 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L sau 8 tuần nuôi cấy Đoạn cắt thân mẫu cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. có chiều dài 1,5 – 2 cm được dùng làm mẫu in vitro được cấy trực tiếp vào môi trường thạch MS có bổ sung 1 mg/l NAA, 2 mg/l BA, 9 g/l agar, 30 g/l sucrose, và nồng độ than hoạt tính tương ứng (0; 0,125; 0,25; 0,375; 0,5; 0,625 g/l) dưới điều kiện chiếu sáng 16 giờ / ngày. Sau 1 tuần nuôi cấy, các mẫu cấy không có nhiều sự khác biệt về hình thái. Sau 2 tuần, các mẫu cấy bắt đầu phát triển chồi. Sau 3 tuần, ở các đốt thân xuất hiện nhiều chồi hơn và kích thước tăng dần theo thời gian nuôi cấy nhờ nuôi trong điều kiện ánh sáng liên tục. Đến tuần thứ 4 và thứ 5, các mẫu cấy ở nghiệm thức có sự khác biệt về hình thái rõ rệt. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành khảo sát than hoạt tính ở các nồng độ khác nhau trong môi trường in vitro Bạc hà nhằm tìm ra nồng độ thích hợp cho sự hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh. Các kết quả thí nghiệm thu được và trình bày ở bảng 3.1; đồ thị 3.1, 3.2, 3.3 và hình 3.1. 37 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1. Ảnh hưởng của các nồng độ than hoạt tính lên quá trình hình thành rễ và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy Trọng Trọng Đường Chiều Chiều Chiều Số lá Số chồi Số rễ NT lượng lượng kính lá dài lá cao cây dài rễ Đặc điểm (lá/mẫu) (chồi/mẫu) (rễ/mẫu) tươi (g) khô (g) (mm) (mm) (mm) (mm) Mẫu cấy phát triển bình thường lá ít, A0 1,9250b 0,1226bc 78,66b 5,33ab 6,00c 4,33d 61,00d 22,33ab 47,33b và nhỏ, thân chồi mảnh, ốm, rễ dài Mẫu cấy xanh tốt, cây cao, đốt thân A1 1,8123b 0,1406b 56,66c 4,66b 5,33c 4,33d 93,66b 16,33ab 21,66d dài, rễ ngắn và ít chồi, ít lá Cây phát triển tốt, rễ ít ngắn, số chồi A2 1,1297bc 0,0840c 84,00b 4,66b 6,33c 6,66c 96,66b 26,33ab 19,66d ít, cây cao, thân mảnh, đốt thân dài Cây phát triển rất tốt, nhiều cây và A3 4,7627 a 0,3010a 139,33a 6,33a 11,66a 8,66b 76,00c 31,00a 51,33a chồi, thân mảnh lá nhiều, rễ nhiều nhưng ngắn. Cây phát triển bình thường lá ít, kích A4 0,3667c 0,0330d 26,33d 4,33b 6,66c 1,00e 109,00a 0,25ab 20,33d thước lá nhỏ, ít chồi nhưng cây cao. Cây phát triển chậm, cây thấp, ốm, đốt A5 1,9017b 0,1253bc 52,33c 4,33b 9,00b 10,66a 55,33e 7,67b 30,00c thân ngắn, lá nhỏ, nhiều chồi. Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau chỉ sai khác thống kê với p < 0,05. 38 Đồ án tốt nghiệp Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ than hoạt tính lần lượt là 0; 0,125; 0,25; 0,375; 0,5; 0,625 g/l) Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của than hoạt tính đến số lá, số chồi và số rễ của Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ than hoạt tính lần lượt là 0; 0,125; 0,25; 0,375; 0,5; 0,625 g/l) 39 Đồ án tốt nghiệp Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến đường kính lá, chiều dài lá, chiều cao cây và chiều dài rễ của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ than hoạt tính lần lượt là 0; 0,125; 0,25; 0,375; 0,5; 0,625 g/l) 40 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.1. Ảnh hưởng của các nồng độ than hoạt tính lên quá trình hình thành rễ và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ than hoạt tính lần lượt là 0; 0,125; 0,25; 0,375; 0,5; 0,625 g/l) 41 Đồ án tốt nghiệp • Nhận xét và thảo luận Từ kết quả ở bảng 3.1, biểu đồ 3.1, 3.2, 3.3 và hình 3.1 cho thấy khi bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy, việc bổ sung 0,375 (g/l) than hoạt tính cho sự tăng trưởng của chồi và cây là tốt nhất. Ở nghiệm thức A3 nồng độ than hoạt tính 0,375 (g/l) cho trọng lượng tươi là tốt nhất (4,7627 g) gấp 2,4 lần so với A0 (1,9250 g). Cũng ở nghiệm thức A3 cho số lá cây là nhiều nhất (139,333 lá/mẫu), Cây phát triển rất tốt, nhiều cây và chồi, thân mảnh lá nhiều, rễ nhiều nhưng ngắn. Nghiệm thức A0 cho số rễ (22,33 rễ/mẫu) và chiều dài rễ là cao nhất (47,333 cm). Nồng độ than hoạt tính 0,625 (g/l) (A5) cho số chồi tạo nhiều nhưng cây phát triển chậm, cây thấp, ốm, đốt thân ngắn, lá nhỏ. Nồng độ than hoạt tính 0,125 (g/l) (A1) mẫu cấy xanh tốt, cây cao, đốt thân dài, rễ ngắn và ít chồi, ít lá. Nồng độ than hoạt tính 0,25 (g/l) (A2) mẫu phát triển tốt, rễ ít ngắn, số chồi ít, cây cao, thân mảnh, đốt thân dài. Nồng độ than hoạt tính 0,5 (g/l) (A4) mẫu cây phát triển bình thường lá ít, kích thước lá nhỏ, ít chồi nhưng cây cao. Ở các nồng độ than hoạt tính khác nhau thì hình thái của cây cũng khác nhau, cụ thể: • Ở nghiệm thức A0: không bổ sung than hoạt tính thì cây vẫn phát triển bình thường nhưng không đều giữa các mẫu. Lá cây xanh nhưng mau chóng ngả vàng, ít chồi, lá và cho số rễ và chiều dài là cao nhất. • Ở nghiệm thức A1: môi trường bổ sung than hoạt tính với nồng độ 0,125 (g/l) thì số lượng cây và chồi tạo ra nhiều hơn, nhưng cây sau khoảng 3 tuần tăng trưởng ổn định thì bắt đầu tăng trưởng chậm. Chiều cao giữa các cây không đều. Lá cây không được xanh và tốt. • Ở nghiệm thức A2: khi tăng nồng độ than hoạt tính lên 0,25 g/l thì cây phát triển chậm lại ở tuần thứ 4, số chồi ít và ngắn, thân ốm cao, lá nhỏ, số rễ ít. 42 Đồ án tốt nghiệp • Ở nghiệm thức A3: nồng độ than hoạt tính khi được tăng lên 0,375 g/l cây phát triển hơn. Cây xanh, tươi, chồi, lá, rễ là tốt nhất, cây cao, lá to và nhiều. Cây tăng trưởng nhanh và ổn định trong 8 tuần nuôi cấy. • Ở nghiệm thức A4: nồng độ than hoạt tính là 0,5 g/l cây phát triển bất thường, thân cây ốm, rễ ít và ngắn, lá nhỏ và ít, ngả màu vàng trong tuần thứ 8. • Ở nghiệm thức A5: nồng độ than hoạt tính tăng lên 0,625 g/l cây phát triển chậm, lá cây xanh tốt, cây thấp, ốm, lá nhỏ, nhiều chồi. Theo đó, than hoạt tính có tác dụng hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi thứ cấp Và đặc biệt,than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng do làm cho môi trường sẫm màu, nên có thể kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ (Vũ Văn Vụ, 2006). Than hoạt tính có tác dụng khử độc, kích thích sự tăng trưởng. Khả năng kích thích sự tăng trưởng của tế bào mô thực vật là do than hoạt tính kết hợp với các hợp chất phenol độc do mô tiết ra trong suốt thời gian nuôi cấy. Than hấp thu các hợp chất ức chế sự phát triển của cây, hấp thu các hợp chất hữu cơ, tăng khả năng hình thành phôi và tăng việc hình thành rễ (George,1993). Kết quả ở Bảng 3.1 cho thấy, bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy rõ ràng là có ảnh hưởng tích cực hơn đến sự hình thành của rễ cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. Ở tất cả các môi trường bổ sung than hoạt tính đều cho tỷ lệ tạo rễ là 100%. Bổ sung than hoạt tính ở nồng độ 0,375g/l cho số lượng rễ nhiều nhất (31,00 rễ/chồi). Trong khi đó ở các nồng độ khác thì số lượng rễ thấp hơn. Chất lượng rễ của mẫu cấy ở môi trường có bổ sung 0,375g/l than hoạt tính là dài và rất khỏe, ở các nồng độ khác thì rễ ngắn và yếu hơn. Theo Trần Thanh Huyền và cộng sự (2014) môi trường MS bổ sung nồng độ BA 1,0 mg/l thích hợp cho việc nhân chồi dưa hấu tam bội, số chồi khỏe, không bị thủy tinh thể. Đồng thời, nồng độ BA 1,0 mg/l cùng than hoạt tính 2,0 g/l cho số lá, chiều cao cây tốt sau 3 tuần nuôi cấy. Môi trường bổ sung IBA 0,5 mg/l và than hoạt tính 2,0 g/l thích hợp cho việc ra rễ với số rễ, chiều dài rễ cũng như số lá và 43 Đồ án tốt nghiệp chiều cao cây dưa hấu tam bội tốt nhất. Các kết quả thu được cho thấy, so với môi trường không có than hoạt tính, các cây sinh trưởng và phát triển trên môi trường có than hoạt tính cho các chỉ tiêu về số lượng chồi, chiều cao, số lá, đường kính lá, chiều dài rễ và số rễ đều vượt trội hơn khi môi trường không bổ sung than hoạt tính. Nguyễn Thị Nhật Linh và cộng sự (2012) đã chỉ ra kết quả so với môi trường không có than hoạt tính, các cây sinh trưởng và phát triển trên môi trường có than hoạt tính cho các chỉ tiêu về khối lượng chồi, chiều cao chồi, khối lượng rễ, chiều dài rễ và số rễ đều vượt trội hơn khi môi trường không bổ sung than hoạt tính. Đối với sự sinh trưởng và phát triển cây in vitro, nồng độ than thích hợp nhất bổ sung vào môi trường MS cho sự sinh trưởng phát triển chồi với mật độ khí khổng gia tăng đáng kể và sự hình thành rễ của chồi Hồng môn là 2 g/l và Cúc là 3 g/l. Vị trí lớp than hoạt tính nằm dưới với thể tích 20 ml là tối ưu cho sự sinh trưởng, phát triển của cây Hồng môn và Cúc nuôi cấy in vitro. Đối với sự định hướng rễ in vitro, sự phát triển và kéo dài của đa số các rễ đều phụ thuộc vào vị trí lớp than hoạt tính và hầu hết các rễ của hai loại cây trồng này đều chỉ tăng trưởng trong lớp than hoạt tính [Hồng môn (trên 95%), Cúc (trên 80%)]. Ngoài ra, ở Hồng môn thì vị trí lớp than hoạt tính nằm dưới cho thấy hệ thống mạch dẫn tăng kích thước rõ ràng hơn Cúc. Hơn nữa, ở rễ Cúc khi thay đổi vị trí lớp than hoạt tính sẽ ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của lông hút và tại vị trí lớp môi trường nằm dưới cho thấy số lượng lông hút hầu như không giảm so với ở môi trường không có than hoạt tính. Tóm lại, qua thí nghiệm này, chúng tôi thấy rằng, than hoạt tính ở nồng độ 0,375g/l than hoạt tính (nghiệm thức A3) là có tác dụng kích thích sự hình thành và phát triển rễ Bạc hà Á Mentha arvensis L. tốt nhất. 44 Đồ án tốt nghiệp 3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L sau 8 tuần nuôi cấy Đoạn cắt thân mẫu cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. có chiều dài 1,5 – 2 cm được dùng làm mẫu in vitro được cấy trực tiếp vào môi trường thạch MS có bổ sung 1 mg/l NAA, 2 mg/l BA, 9 g/l agar, 30 g/l sucrose, và nồng nước dừa tương ứng (0; 25; 50; 75; 100 ml) dưới điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ ngày. Sau 1 tuần nuôi cấy, các mẫu cấy không có nhiều sự khác biệt về hình thái. Sau 3 tuần, các mẫu cấy bắt đầu phát triển chồi. Sau 4 tuần, ở các đốt thân xuất hiện nhiều chồi hơn và kích thước tăng dần theo thời gian nuôi cấy nhờ nuôi trong điều kiện ánh sáng liên tục. Đến tuần thứ 5 và thứ 6, các mẫu cấy ở nghiệm thức có sự khác biệt về hình thái rõ rệt. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành khảo sát nước dừa ở các nồng độ khác nhau trong môi trường in vitro Bạc hà nhằm tìm ra nồng độ thích hợp cho sự hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh. Các kết quả thí nghiệm thu được và trình bày ở bảng 3.2; đồ thị 3.4, 3.5, 3.6 và hình 3.2. 45 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2. Ảnh hưởng của các nồng nước dừa lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy Trọng Trọng Đường Chiều Chiều Chiều Số lá Số chồi Số rễ NT lượng lượng kính lá dài lá cao cây dài rễ Đặc điểm (lá/mẫu) (chồi/mẫu) (rễ/mẫu) tươi (g) khô (g) (mm) (mm) (mm) (mm) Mẫu cấy phát triển bình thường lá ít, B0 2,4787b 0,1570b 78,66b 7,33b 7,66c 4,33b 61,00bc 22,33d 47,33ab xanh và nhỏ, thân mảnh, ốm, rễ ngắn. Mẫu cấy phát triển bình thường lá ít, B1 1,5987c 0,1250b 80,33b 6,66b 9,66b 3,33c 56,00cd 37,66c 35,33c xanh và nhỏ, thân mảnh, ốm, rễ ngắn, đốt thân dài. Mẫu cấy phát triển tốt, lá thưa, xanh và B2 4,7627a 0,3010a 98,33a 10,33a 12,00a 4,66b 75,00a 71,00a 36,33c to, thân mảnh, ốm, rễ nhiều nhưng ngắn, đốt thân dài. Mẫu cấy phát triển chậm, lá ít nhưng to, B3 2,0450bc 0,1626b 94,66a 7,33b 10,00b 3,00c 51,33d 57,00b 42,33b xanh và nhỏ, thân mảnh, ốm, rễ dài Mẫu cấy phát triển chậm lá xanh nhiều B4 1,9717bc 0,1566b 87,00ab 10,66a 13,00a 7,33a 64,33b 65,33ab 52,33a nhưng nhỏ, thân mảnh, ốm, rễ dài Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau chỉ sai khác thống kê với p < 0,05. 46 Đồ án tốt nghiệp Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của nước dừa đến trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4; tương ứng với nồng độ nước dừa lần lượt là 0; 25; 50; 75; 100 ml) Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của nước dừa đến số lá, số chồi và số rễ của Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4; tương ứng với nồng độ nước dừa lần lượt là 0; 25; 50; 75; 100 ml) 47 Đồ án tốt nghiệp Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của nước dừa đến đường kính lá, chiều dài lá, chiều cao cây và chiều dài rễ của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4; tương ứng với nồng độ nước dừa lần lượt là 0; 25; 50; 75; 100 ml) 48 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.2. Ảnh hưởng của các nồng nước dừa lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4; tương ứng với nồng độ nước dừa lần lượt là 0; 25; 50; 75; 100 ml) 49 Đồ án tốt nghiệp • Nhận xét và thảo luận Từ bảng 3.2, biểu đồ 3.4, 3.5, 3.6 và hình 3.3, 3.4 cho thấy khi bổ sung nước dừa vào môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và hình thái của cây. Nghiệm thức B2 50 (ml) nước dừa cây phát triển xanh tốt với các chỉ tiêu về số chồi, số lá và số rễ là tốt nhất, trọng lượng tươi đạt (4,7627 g) gấp 1,9 lần so với B0 (2,4787 g), trọng lượng khô đạt (0,3010g) gấp 1,9 lần so với B0 (0,1570g). Mẫu cấy phát triển ổn định trong 8 tuần nuôi cấy. Ở các nghiệm thức B3, B4 cây phát triển chậm hơn, số lượng cây gần bằng B2, cây ốm, thấp, lá nhỏ bị uốn cong. Từ tuần nuôi cấy thứ 5 trở đi sức sống của cây giảm dần. Ở nghiệm thức B1 cây phát triển bình thường, số lượng cây và chồi ít, cây cao, lá ít, đốt thân dài ngắn không đều, rễ ít và ngắn, lá nhỏ và bị cong xuồng. Ở các nồng độ nước dừa khác nhau thì hình thái của cây cũng khác nhau, cụ thể: • Ở nghiệm thức B0: không bổ sung nước dừa thì cây vẫn phát triển bình thường nhưng chậm, than chồi mảnh, ít lá và nhỏ, rễ ngắn. Sau khoảng 3 tuần nuôi cấy số lượng chồi ở mẫu vẫn rất ít, đến tuần thứ 4 số lượng chồi ở mẫu bắt đầu tăng lên nhưng không đáng kể, cây tăng trưởng ổn định nhưng chậm, rễ cây ít và ngắn chiều cao cây thấp. • Ở nghiệm thức B1: môi trường bổ sung nước dừa với nồng độ 25 (ml) cây phát triển bình thường. Cây xanh, thân chồi mảnh, đốt than dài, lá ít và cong, cây cao hơn ở nghiêm thức B0 nhưng rễ ít và ngắn. Cây sau khoảng 5 tuần tăng trưởng ổn định thì bắt đầu tăng trưởng chậm về số lá, số rễ, thân chồi mảnh. • Ở nghiệm thức B2: khi tăng nồng độ lên 50 (ml) nước dừa thì số lượng chồi được tạo ra nhiều hơn, cây phát triển rất tốt, lá to và nhiều nhưng rễ ngắn. Sau 3 tuần nuôi cấy số lượng chồi ở mẫu rất nhiều, đến tuần thứ 4 số lượng chồi ở mẫu vẫn bắt đầu tăng lên, cây tăng trưởng nhanh. Đến tuần thứ 5 và thứ 6 mẫu vẫn tiếp tục tạo thêm chồi, thân cây mập hơn, lá cây phát triển lớn hơn. 50 Đồ án tốt nghiệp • Ở nghiệm thức B3: nồng độ nước dừa khi được tăng lên 75 (ml) cây phát triển chậm lại, số lượng chồi tạo ra ít, cây mập hơn B0 và B1 nhưng lại thấp hơn, rễ cây nhiều và dài. Sau 3 tuần nuôi cấy số lượng chồi ở mẫu nhiều, nhưng đến tuần thứ 4 số lượng chồi ở mẫu bắt đầu giảm dần, cây tăng trưởng ổn định, rễ cây phát triển nhiều và dài. Đến tuần thứ 5, thứ 6 mẫu ít sinh chồi, cây phát triển chậm, rễ bắt đầu phát triển nhiều và tốt hơn. • Ở nghiệm thức B4: khi nồng độ nước dừa tăng lên 100 (ml) thì mẫu cấy phát triển kém, số lượng cây và chồi được tạo ra ít hơn, lá ít, nhỏ, đốt thân thưa, rễ cây phát triển rất tốt. Sau khoảng 3 tuần nuôi cấy số lượng chồi ở mẫu rất ít, đến tuần thứ 4 số lượng chồi tăng ít, cây tăng trưởng chậm, rễ cây dài, ít. Ở tuần nuôi cấy thứ 5 và thứ 6, cây phát triển về chiều cao, các đốt thân dài, lá nhỏ và rất ít, mẫu không phát triển thêm chồi mới, rễ cây bắt đầu dài ra. Kết quả thu được cho thấy nước dừa có tác dụng tốt lên quá trình hình thành chồi và sinh trưởng của cây. Các nồng độ nước dừa khác nhau, sự hình thành chồi và sinh trưởng chồi cây cũng khác nhau. Trong nước dừa non rất giàu clorua, kali, magie, vitamin A, E, đồng thời, chứa một lượng muối, đường, protein phù hợp cho sự tạo thành chồi và sinh trưởng chồi cây (Nguyễn Văn Uyển, 1984). Nước dừa được sử dụng trong nuôi cấy in vitro cho nhiều loại cây trồng, môi trường nuôi cấy có bổ sung nước dừa làm tăng hiệu quả nhân giống in vitro. Theo nghiên cứu nhân giống in vitro cây hoa lan Miltonia sp. (Phan Xuân Huyên và cộng sự , 2004). Sau 90 ngày nuôi cấy trên môi trường 1/2MS bổ sung các nồng độ nước dừa khác nhau, kết quả thu được cho thấy nước dừa có tác dụng tốt lên quá trình hình thành chồi và sinh trưởng của cây. Các nồng độ nước dừa khác nhau, sự hình thành chồi và sinh trưởng chồi cây cũng khác nhau. Với hàm lượng bổ sung nước dừa 50 ml này tuy khác với hàm lượng bổ sung trong nuôi cấy mô nhiều cây khác như dó bầu (Aquiliria crassna Pierre ex. Lecomte) (Đinh Trung Chánh, 1998), cây nhãn (Euphoria longan L.) (Trần Văn Minh, 2004), Caribê (Pinus caribaea) (Hà Thị Loan, 2003) nhưng đều cho kết quả 51 Đồ án tốt nghiệp tốt khi bổ sung hàm lượng nước dừa phù hợp. Mặt khác, một số loài cây không cần bổ sung nước dừa trong nuôi cấy vẫn cho kết quả tốt như cây xoài (Mangifera india L.), cây sầu riêng (Duriozibethinus Mur) (Trần Văn Minh, 2004). Qua thí nghiệm này, chúng tôi thấy rằng nước dừa thích hợp cho sự nhân nhanh mẫu cấy cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. từ đốt thân. Nồng độ nước dừa 50 (ml) (nghiệm thức B2) là thích hợp nhất với các chỉ tiêu của cây cao nhất. 3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của bột đậu đen lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy Đoạn cắt thân mẫu cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. có chiều dài 1,5 – 2 cm được dùng làm mẫu in vitro được cấy trực tiếp vào môi trường thạch MS có bổ sung 1 mg/l NAA, 2 mg/l BA, 9 g/l agar, 30 g/l sucros...i đối chứng. Chúng tôi thấy rằng nồng độ đậu xanh 6 (g/l) thích hợp cho sự nhân nhanh mẫu cấy cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. từ đốt thân với các chỉ tiêu của cây cao nhất. 66 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận  Khi nuôi cấy đoạn cắt thân cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. môi trường MS có bổ sung 1 mg/l NAA + 2 mg/l BA + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar + 0,375 g/l than hoạt tính thích hợp cho sự tăng trưởng, hình thành rễ của Bạc hà Á Mentha arvensis L.  Khi nuôi cấy đoạn cắt thân cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. môi trường MS có bổ sung 1 mg/l NAA + 2 mg/l BA + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar + 50 ml nước dừa thích hợp cho sự tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L.  Khi nuôi cấy đoạn cắt thân cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. môi trường MS có bổ sung 1 mg/l NAA + 2 mg/l BA + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar + 9 g/l đậu đen thích hợp cho sự tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L.  Khi nuôi cấy đoạn cắt thân cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. môi trường MS có bổ sung 1 mg/l NAA + 2 mg/l BA + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar + 6 g/l đậu xanh thích hợp cho sự tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L. 4.2. Kiến nghị Do thời gian tiến hành đồ án có hạn, thiết bị và hóa chất còn hạn chế nên chúng tôi chưa thể thực hiện nhiều nghiên cứu sâu hơn, vì vậy chúng tôi có những kiến nghị sau:  Tiếp tục nghiên cứu, khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính, nước dừa đến khả năng nhân nhanh cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. từ các bộ phận khác của cây như mô sẹo, lá,  Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ bột từ ngũ cốc lên khả năng sinh trưởng của Bạc hà Á Mentha arvensis L.  Nghiên cứu thêm tỷ lệ giữa đậu và agar bổ sung vào môi trường nuôi cấy. 67 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu Tiếng Việt [1]. Vũ Lan Anh (2006), Hoàn thiện quy trình nhân nhanh hoa Lilium topgum bằng phương pháp nuôi cấy lát cắt mỏng vảy củ trong nhân giống in vitro. Báo cáo khoá luận tốt nghiệp. [2]. Tạ Thục Như Anh (2007), Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát sinh hình thái của mô lá cây Hoắc hương (Pogostemon cablin (Blaco) Benth) nuôi cấy in vitro. Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ, 24, 44 – 49. [3]. Ngô Xuân Bình và Nguyễn Thuý Hà, (2000), Giáo trình công nghệ sinh học (giáo trình bậc đại học). NXB Nông nghiệp - Hà nội. [4]. Nguyễn Thị Cúc, Nguyễn Văn Kết, Dương Tấn Nhật và Nguyễn Thị Kim Lý – Nghiên cứu ảnh hưởng của một số hợp chất hữu cơ lên quá trình sinh trưởng và phát triển cây Lan Hài hồng in vitro – Tạp chí sinh học 2014, 36(1se): 250 -256. [5]. Dương Công Kiên (2006), Nuôi cấy mô. NXB Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh. [6]. Trần Văn Minh, (1995), Nuôi cấy mô tế bào thực vật. Giáo trình Đại học, Viện Đại Học mở bán công TP. Hồ Chí Minh. [7]. Dương Tấn Nhựt (2011), Công nghệ sinh học thực vật, tập 1. NXB Nông Nghiệp. [8]. Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y Học. [9]. Nguyễn Trung Tín, Nguyễn Phương Vỹ (2008), Khảo sát hàm lượng tinh dầu, menthol và menthone trong cây Bạc hà (Mentha arvensis L.) bằng các phương pháp khác nhau. Luận văn Kỹ sư Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. [10]. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh và Nguyễn Thị Phương Thảo, 2005), Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp. NXB Nông nghiệp Hà Nội . 68 Đồ án tốt nghiệp [11]. Nguyễn Văn Uyển (1999), Các chất sinh trưởng trong nông nghiệp. NXB Tp.HCM. [12]. Đỗ Năng Vịnh, (2005), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng. NXB Nông Nghiệp. [13]. Đỗ Năng Vịnh, (2002), Công nghệ sinh học cây trồng. NXB Nông Nghiệp. [14]. Vũ Ngọc Phương (2001), Nhân giống vô tính phong lan in vitro ở điều kiện ánh sáng tự nhiên, viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. [15]. Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật ứng dụng. NXB Giáo dục. [16]. Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng và Lê Hồng Điệp (2006), Công nghệ sinh học. NXB Giáo dục. [17]. Dương Tấn Nhật, Hồng Ngọc Trâm, Nguyễn Phúc Huy, Định Văn Khiêm (2009), Ảnh hưởng của nước dừa và sucroza lên sự tăng sinh mô sẹo và hình thành phôi vô tính ở loài lan hồ điệp. [18]. ThS. Lê Thị Kim Đào và cộng sự (2002), Nhân giống thành công cây trầm hương (Aquilaria crassna Pierre) bằng phương pháp nuôi cấy mô. 2. Tài liệu Tiếng Anh [19]. Dung N. A., Thang N. T. (2004), Effect of oligoglucosamine on the gowtrh and development of peanut (Arachis hypogea L.). In Proceedings of The 6th Asia-Pacific on Chitin, Chitosan Symposium. Ed. E. Khor, D.Hutmacher and L. L. Yong. Singapore, ISBN: 981-05-0904-9. [20]. Maity (2013), In vitro clonal propagation of Mentha arvensis through callus culture, Interntion Journal of Advanced Research in Engineering and Applied Sciences, 2, 1-9. [21]. Suwalee and Chandrkrachang (2002), Study on utilization of chitinous materials, Advances in Chitin Science, Vol. 5: 458-462. [22]. Rostami F. and Ehsanpour A. A (2010), The effect of silver thiosulfate (STS) onchlorophyll content and the antioxidant enzymes activity of potato (Solanum tuberosum L.), Journal of Cell and Molecular Research 2 (1), 29- 34. 69 Đồ án tốt nghiệp [23]. Kanjilal, Datta (2008), Rapid micropropagation of Geodorum denisflorum (Lam) Schltr. in liquid culture. Indian J Exp Biol. 38(11):1164-1167. [24]. Kazi Muhammad Ahasanul Hoque*, Z.A. Azdi and Shamsul H. Prodhan (2013), Development of Callus Initiation and Regeneration System of Different Indigenous indica Rice Varieties 3. Tài liệu Internet [25]. [26]. duoc-cua-dich-triet-tu-hat-dau-xanh-vigna-radiata-l-wilczeck.htm?page=7 [27]. duoc-cua-dich-chiet-tu-hat-dau-den-vigna-cylindrica-lv-01304.htm [28]. cung-crinum-latifolium-l-chiet-xuat-alcaloid-tu-chung-va-thu-doc-tinh- 30269/ [29]. [30]. [31]. re-bat-dinh-in-vitro-tu-khuc-cat-than-cay-dau-vigna-angularis-willd-ohwi- 44025/ [32]. [33]. cochinchinensis-achev-10313/ [34]. https://journal.hcmuaf.edu.vn/data/file/So3-2014/6-ABSTRACT.pdf [35].hthtttp://www.pubhort.org/members/showdocument?lidvan=ishs&series=jhsb &vid=68&iid=6&article=5&action=showdocument [36]. vjs.ac.vn/index.php/vjbio/article/viewFile/4403/4189 [37]. htttp://www.vnua.edu.vn:85/tc_khktnn/download.asp?ID=1151 [38]. 70 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC Phụ lục A: Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) Thành phần mg/1 NH NO 1650 4 3 KNO 1900 3 Mg2SO4.7H2O 370 Khoáng đa lượng CaCl2.2H2O 440 KH9PO4 170 MnSO4.4H2O 22,3 ZnSO4.7H2O 8,6 CUSO4.5H2O 0,025 KI 0,83 Khoáng vi lượng COC12.6H2O 0,025 H3PO3 6,2 Na2MoO4.2H2O 0,025 Na .EDTA 37,3 2 FeSO .7H O 27,8 4 2 Myo-Inositol 100 Nicotinic acid 0,5 Các vitamin và các Pyridoxine HC1 0,5 chất hữu cơ khác Thiamine HC1 0,1 Glycine 2 71 Đồ án tốt nghiệp Phụ lục B: Thống kê và xử lý số liệu bằng chương trình SAS 9.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L. KHOILUONGTUOI ; RUN;DATA; INPUT KHOILUONGTUOI$ Y; CARDS;A0 5.513A0 4.572A0 4.203A1 2.215A 3 01:13 Friday, August 10, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.243305 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 0.8775 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N KHOILUONGTUOI A 4.7627 3 A3 B 1.9250 3 A0 B 1.9017 3 A5 B 1.8123 3 A1 C B 1.1297 3 A2 C 0.3667 3 A4 KHOILUONGKHO ; RUN;DATA; INPUT KHOILUONGKHO$ Y; CARDS;A0 0.297A0 0.316A0 0.29A1 0.153A1 59 23:35 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.000546 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 0.0416 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N KHOILUONGKHO A 0.30100 3 A3 B 0.14067 3 A1 C B 0.12533 3 A5 C B 0.12267 3 A0 C 0.08400 3 A2 D 0.03300 3 A4 72 Đồ án tốt nghiệp CHIEUCAO ; RUN;DATA; INPUT CHIEUCAO$ Y; CARDS;A0 63A0 61A0 59A1 74A1 75A1 79A2 91A2 11 15:01 Thursday, August 10, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 7 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 4.7068 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N CHIEUCAO A 109.000 3 A4 B 96.667 3 A2 B 93.667 3 A1 C 76.000 3 A3 D 61.000 3 A0 E 55.333 3 A5 CHIEUDAILA ; RUN;DATA; INPUT CHIEUDAILA$ Y; CARDS;A0 6A0 6A0 6A1 5A1 5A1 6A2 6A2 6A2 83 23:35 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.888889 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 1.6773 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N CHIEUDAILA A 11.6667 3 A3 B 9.0000 3 A5 C 6.6667 3 A4 C 6.3333 3 A2 C 6.0000 3 A0 C 5.3333 3 A1 73 Đồ án tốt nghiệp CHIEUDAIRE ; RUN;DATA; INPUT CHIEUDAIRE$ Y; CARDS;A0 45A0 47A0 50A1 21A1 22A1 22A2 18 35 23:35 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 4.444444 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 3.7504 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N CHIEUDAIRE A 51.333 3 A3 B 47.333 3 A0 C 30.000 3 A5 D 21.667 3 A1 D 20.333 3 A4 D 19.667 3 A2 DUONGKINHLA ; RUN;DATA; INPUT DUONGKINHLA$ Y; CARDS;A0 5A0 6A0 5A1 5A1 4A1 5A2 4A2 5 75 23:35 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.5 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 1.2579 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N DUONGKINHLA A 6.3333 3 A3 B A 5.3333 3 A0 B 4.6667 3 A2 B 4.6667 3 A1 B 4.3333 3 A4 74 Đồ án tốt nghiệp SOCHOI ; RUN;DATA; INPUT SOCHOI$ Y; CARDS;A0 5A0 4A0 4A1 4A1 5A1 4A2 7A2 6A2 7A3 9A 7 15:01 Thursday, August 10, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.277778 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 0.9376 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N SOCHOI A 10.6667 3 A5 B 8.6667 3 A3 C 6.6667 3 A2 D 4.3333 3 A0 D 4.3333 3 A1 E 1.0000 3 A4 SOLA ; RUN;DATA; INPUT SOLA$ Y; CARDS;A0 76A0 81A0 79A1 58A1 55A1 57A2 78A2 85A2 89A 3 15:01 Thursday, August 10, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 66.11111 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 14.465 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N SOLA A 139.333 3 A3 B 84.000 3 A2 B 78.667 3 A0 C 56.667 3 A1 C 52.333 3 A5 D 26.333 3 A4 75 Đồ án tốt nghiệp SORE ; RUN;DATA; INPUT SORE$ Y; CARDS;A0 22A0 21A0 24A1 15A1 18A1 16A2 25A2 27A2 27 91 23:35 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 168.2778 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 23.077 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N SORE A 31.00 3 A3 B A 26.33 3 A2 B A 25.67 3 A4 B A 22.33 3 A0 B A 16.33 3 A1 B 7.67 3 A5 76 Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 2: Khảo sát hàm lượng của nước dừa đến khả năng sinh trưởng và phát triển của Bạc hà Á Mentha Arvensis L. KHOILUONGTUOI ; RUN;DATA; INPUT KHOILUONGTUOI$ Y; CARDS;B1 1.527B1 1.438B1 1.831B2 2.144 55 23:35 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.147555 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 0.6988 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N KHOILUONGTUOI A 4.7627 3 B2 B 2.4787 3 B0 C B 2.0450 3 B3 C B 1.9717 3 B4 C 1.5987 3 B1 KHOILUONGKHO ; RUN;DATA; INPUT KHOILUONGKHO$ Y; CARDS;B1 0.194B1 0.102B1 0.079B2 0.181B2 63 23:35 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.001009 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 0.0578 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N KHOILUONGKHO A 0.30100 3 B2 B 0.16267 3 B3 B 0.15700 3 B0 B 0.15667 3 B4 B 0.12500 3 B1 77 Đồ án tốt nghiệp CHIEUCAO ; RUN;DATA; INPUT CHIEUCAO$ Y; CARDS;B1 55B1 59B1 54B2 48B2 51B2 55B3 78B3 113 23:35 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 8.533333 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 5.3144 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N CHIEUCAO A 75.000 3 B2 B 64.333 3 B4 C B 61.000 3 B0 C D 56.000 3 B1 D 51.333 3 B3 CHIEUDAILA ; RUN;DATA; INPUT CHIEUDAILA$ Y; CARDS;B1 9B1 9B1 11B2 9B2 11B2 10B3 13B3 87 23:35 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.933333 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 1.7576 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N CHIEUDAILA A 13.0000 3 B4 A 12.0000 3 B2 B 10.0000 3 B3 B 9.6667 3 B1 C 7.6667 3 B0 78 Đồ án tốt nghiệp CHIEUDAIRE ; RUN;DATA; INPUT CHIEUDAIRE$ Y; CARDS;B1 38B1 33B1 35B2 38B2 43B2 46B3 5 109 23:35 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 7.933333 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 5.1242 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N CHIEUDAIRE A 52.333 3 B4 B A 47.333 3 B0 B 42.333 3 B3 C 36.333 3 B2 C 35.333 3 B1 DUONGKINHLA ; RUN;DATA; INPUT DUONGKINHLA$ Y; CARDS;B1 7B1 6B1 7B2 7B2 8B2 7B3 11B3 79 23:35 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.533333 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 1.3286 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N DUONGKINHLA A 10.6667 3 B4 A 10.3333 3 B2 B 7.3333 3 B3 B 7.3333 3 B0 B 6.6667 3 B1 79 Đồ án tốt nghiệp SOCHOI ; RUN;DATA; INPUT SOCHOI$ Y; CARDS;B1 3B1 3B1 4B2 3B2 3B2 3B3 4B3 5B3 5B4 7 43 23:35 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.266667 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 0.9395 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N SOCHOI A 7.3333 3 B4 B 4.6667 3 B2 B 4.3333 3 B0 C 3.3333 3 B1 C 3.0000 3 B3 SOLA ; RUN;DATA; INPUT SOLA$ Y; CARDS;B1 84B1 80B1 77B2 103B2 96B2 85B3 99B3 88B3 1 71 23:35 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 41.66667 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 11.743 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N SOLA A 98.333 3 B2 A 94.667 3 B3 B A 87.000 3 B4 B 80.333 3 B1 B 78.667 3 B0 80 Đồ án tốt nghiệp SORE ; RUN;DATA; INPUT SORE$ Y; CARDS;B1 37B1 35B1 41B2 54B2 49B2 68B3 68B3 75B3 70 95 23:35 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 29.4 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 9.8644 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N SORE A 71.000 3 B2 B A 65.333 3 B4 B 57.000 3 B3 C 37.667 3 B1 D 22.333 3 B0 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết đậu đen lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha Arvensis L. KHOILUONGTUOI ; RUN;DATA; INPUT KHOILUONGTUOI $ Y; CARDS;C1 1.769C1 2.059C1 1.583C2 2.252 3 22:58 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.076045 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 0.4906 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N KHOILUONGTUOI A 3.3903 3 C3 B 2.4017 3 C2 C 1.8123 3 C0 C 1.8037 3 C1 C 1.5843 3 C5 D 1.0783 3 C4 81 Đồ án tốt nghiệp KHOILUONGKHO ; RUN;DATA; INPUT KHOILUONGKHO $ Y; CARDS;C1 0.104C1 0.129C1 0.112C2 0.154C2 3 23:02 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.000194 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 0.0248 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N KHOILUONGKHO A 0.22267 3 C3 B 0.16267 3 C0 B 0.15167 3 C2 B 0.14067 3 C5 C 0.11500 3 C1 D 0.07767 3 C4 CHIEUCAO ; RUN;DATA; INPUT CHIEUCAO$ Y; CARDS;C1 54C1 50C1 51C2 60C2 62C2 59C3 53C3 19 15:01 Thursday, August 10, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 4.611111 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 3.8201 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N CHIEUCAO A 60.333 3 C2 B 53.000 3 C3 B 51.667 3 C1 B 49.333 3 C4 C 33.667 3 C0 D 11.667 3 C5 82 Đồ án tốt nghiệp CHIEUDAILA ; RUN;DATA; INPUT CHIEUDAILA $ Y; CARDS;C1 10C1 11C1 10C2 11C2 10C2 11C3 10 3 23:09 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.333333 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 1.0271 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N CHIEUDAILA A 10.6667 3 C2 A 10.3333 3 C1 A 10.3333 3 C4 A 10.3333 3 C3 B 8.6667 3 C0 C 7.3333 3 C5 CHIEUDAIRE ; RUN;DATA; INPUT CHIEUDAIRE$ Y; CARDS;C1 34C1 31C1 29C2 40C2 42C2 43C3 42 17 02:06 Friday, August 10, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 43.33333 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 11.711 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N CHIEUDAIRE A 44.333 3 C3 B A 41.667 3 C2 B A C 35.667 3 C0 B D C 31.333 3 C1 D C 28.333 3 C5 D 22.667 3 C4 83 Đồ án tốt nghiệp DUONGKINHLA ; RUN;DATA; INPUT DUONGKINHLA $ Y; CARDS;C1 9C1 10C1 10C2 12C2 12C2 11C3 1 3 23:08 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.333333 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 1.0271 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N DUONGKINHLA A 11.6667 3 C2 A 11.3333 3 C4 B A 10.6667 3 C3 B C 9.6667 3 C1 C 8.6667 3 C0 D 5.6667 3 C5 SOCHOI ; RUN;DATA; INPUT SOCHOI$ Y; CARDS;C1 4C1 5C1 4C2 6C2 4C2 4C3 8C3 9C3 9C4 3 15 15:01 Thursday, August 10, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.611111 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 1.3907 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N SOCHOI A 8.6667 3 C3 B 6.3333 3 C0 C B 6.0000 3 C4 C D 4.6667 3 C2 D 4 .3333 3 C1 E 2.3333 3 C5 84 Đồ án tốt nghiệp SOLA ; RUN;DATA; INPUT SOLA $ Y; CARDS;C1 32C1 37C1 35C2 47C2 45C2 48C3 53C3 55C3 52 3 23:05 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 3 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 3.0813 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N SOLA A 53.333 3 C3 B 46.667 3 C2 C 42.667 3 C4 D 34.667 3 C1 D 33.667 3 C5 E 28.667 3 C0 SORE ; RUN;DATA; INPUT SORE $ Y; CARDS;C1 28C1 26C1 32C2 50C2 45C2 48C3 47C3 49C3 51 3 23:13 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 9.777778 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 5.5628 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N SORE A 61.667 3 C3 A 58.333 3 C0 B 49.000 3 C1 B 47.667 3 C2 C 28.667 3 C4 D 22.333 3 C5 85 Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết đậu xanh lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha Arvensis L. KHOILUONGTUOI ; RUN;DATA; INPUT KHOILUONGTUOI$ Y; CARDS;D0 2.215D0 1.496D0 1.726D1 2.985 21 02:06 Friday, August 10, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.087935 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 0.5275 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N KHOILUONGTUOI A 3.2473 3 D2 A 3.2247 3 D1 B 2.6937 3 D3 C 1.9493 3 D4 C 1.8123 3 D0 C 1.6127 3 D5 KHOILUONGKHO ; RUN;DATA; INPUT KHOILUONGKHO$ Y; CARDS;D0 0.181D0 0.168D0 0.139D1 0.24D1 25 02:06 Friday, August 10, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.000885 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 0.0529 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N KHOILUONGKHO A 0.22567 3 D1 A 0.22033 3 D2 A 0.21767 3 D5 B A 0.18400 3 D3 B A 0.18000 3 D4 B 0.16267 3 D0 86 Đồ án tốt nghiệp CHIEUCAO ; RUN;DATA; INPUT CHIEUCAO$ Y; CARDS;D0 34D0 32D0 35D1 36D1 32D1 38D2 39D2 31 23:35 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 4 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 3.558 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N CHIEUCAO A 38.333 3 D2 B A 35.333 3 D1 B 33.667 3 D0 C 29.333 3 D3 D 22.667 3 D4 E 15.333 3 D5 CHIEUDAILA ; RUN;DATA; INPUT CHIEUDAILA $ Y; CARDS;D0 9D0 8D0 9D1 9D1 10D1 10D2 11D2 15 23:35 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.333333 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 1.0271 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N CHIEUDAILA A 11.3333 3 D3 B 9.6667 3 D1 B 9.6667 3 D4 B 9.6667 3 D2 C B 8.6667 3 D0 C 7.6667 3 D5 87 Đồ án tốt nghiệp CHIEUDAIRE ; RUN;DATA; INPUT CHIEUDAIRE$ Y; CARDS;D0 35D0 39D0 33D1 41D1 39D1 33D2 41 23 23:35 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 6.166667 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 4.4177 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N CHIEUDAIRE A 42.333 3 D2 B 37.667 3 D0 B 37.667 3 D3 B 35.667 3 D1 B 33.333 3 D4 C 28.667 3 D5 DUONGKINHLA ; RUN;DATA; INPUT DUONGKINHLA $ Y; CARDS;D0 9D0 9D0 8D1 9D1 10D1 9D2 10D2 11 23:35 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.333333 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 1.0271 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N DUONGKINHLA A 10.6667 3 D3 B 9.3333 3 D1 B 9.3333 3 D2 B 8.6667 3 D0 C 7.3333 3 D4 C 6.3333 3 D5 88 Đồ án tốt nghiệp SOCHOI ; RUN;DATA; INPUT SOCHOI$ Y; CARDS;D0 6D0 7D0 6D1 6D1 7D1 6D2 6D2 8D2 9D3 6 27 23:35 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.555556 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 1.326 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N SOCHOI A 7.6667 3 D3 B 6.3333 3 D1 B 6.3333 3 D0 B 5.3333 3 D2 C 4.0000 3 D4 C 3.0000 3 D5 SOLA ; RUN;DATA; INPUT SOLA $ Y; CARDS;D0 28D0 29D0 29D1 26D1 29D1 24D2 47D2 45D2 48 7 23:35 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 5.666667 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 4.2349 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N SOLA A 53.333 3 D2 B 46.667 3 D3 C 38.333 3 D4 D 28.667 3 D0 D 26.333 3 D1 E 15.333 3 D5 89 Đồ án tốt nghiệp SORE ; RUN;DATA; INPUT SORE$ Y; CARDS;D0 56D0 67D0 62D1 65D1 67D1 62D2 61D2 57D2 52 19 23:35 Thursday, August 9, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 14.33333 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 6.7352 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N SORE A 64.667 3 D2 B A 62.333 3 D3 B A 61.667 3 D1 B C 56.667 3 D4 C 52.667 3 D0 D 27.667 3 D5 90