Đồ án Khả năng sử dụng một số vi khuẩn lab phân lập trong khoang miệng ức chế sự tạo thành màng sinh học của lactobacillus fermentum

g trình nghiên cứu của tơi dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Hồi Hương Giảng viên Khoa Cơng Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Mơi trường của trường Đại Học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Những kết quả này hồn tồn khơng sao chép từ các nghiên cứu khoa học khác dưới bất kì hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án này đều hồn tồn trung thực. Tơi xin chịu trách nhiệm tồn bộ về đồ án của mình. Tp.HCM, ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Đặng Vân Anh i Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Để hồn thành được đồ án “Khả năng sử dụng một số vi khuẩn LAB phân lập trong khoang miệng ức chế sự tạo thành màng sinh học của Lactobacillus fermentum” trong suốt quá trình học tập, rèn luyện và trau dồi kiến thức em đã gặp phải khơng ít lần khĩ khăn nhưng nhờ cĩ sự quan tâm, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của TS. Nguyễn Hồi Hương, Giảng viên Khoa Cơng nghệ Sinh học - Thực phẩm - Mơi trường trường Đại học Cơng nghệ TPHCM, cùng những kiến thức và kỹ năng cần thiết Cơ truyền dạy mà em cĩ thể đạt được thành quả của ngày hơm nay. Em xin chân thành cảm ơn cơ. Bên cạnh đĩ, em cũng xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến các Thầy Cơ giảng viên và Ban lãnh đạo Khoa Cơng nghệ Sinh học – Thực phẩm – Mơi trường trường Đại học Cơng nghệ TPHCM đã tạo điều kiện giúp em tiếp cận được nhiều nguồn tài liệu để hồn thành đồ án tốt nghiệp đúng thời gian quy định. Dù đồ án đã hồn thành nhưng khơng tránh khỏi những sai sĩt nhất định do khả năng hiểu biết hạn hẹp và thơng tin tài liệu khơng mấy khả quan để phục vụ quá trình thực hiện đồ án. Kính mong nhận được sự gĩp ý và chỉ dạy của các Thầy Cơ để em học hỏi thêm những kinh nghiệm, tích lũy cho quá trình học tập rèn luyện và chuẩn bị hành trang bước sang một mơi trường làm việc mới sau này. Ngồi ra, con xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến ba mẹ, gia đình, những người đã bên con và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn! TP.HCM, ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Đặng Vân Anh ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................. i LỜI CÁM ƠN ..................................................................................................................ii MỤC LỤC ...................................................................................................................... iii PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MƠI TRƯỜNG ................................................................... v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ...........................................................................................ii DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................... iii DANH MỤC HÌNH ẢNH .............................................................................................. iv MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ....................................................................................... 1 2. Tình hình nghiên cứu ........................................................................................... 2 3. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................. 3 4. Nhiệm vụ nghiên cứu ........................................................................................... 4 5. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 4 6. Các kết quả đạt được ............................................................................................ 5 7. Kết cấu đồ án ........................................................................................................ 5 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................................ 6 1.1. Tổng quan về vi khuẩn Lactic (LAB) .............................................................. 6 1.2. Tổng quan về Probiotic .................................................................................. 19 1.3. Màng sinh học ................................................................................................ 31 1.4. Sâu răng .......................................................................................................... 37 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 44 2.1. Địa điểm nghiên cứu ...................................................................................... 44 2.2. Thời gian thực hiện ........................................................................................ 44 2.3. Vật liệu và thiết bị .......................................................................................... 44 2.4. Phương pháp luận ........................................................................................... 45 2.5. Phương pháp thí nghiệm ................................................................................ 47 iii Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ................................................................. 64 3.1. Kết quả thử nghiệm sinh lý ............................................................................ 64 3.2. Kết quả thử nghiệm sinh hĩa ......................................................................... 67 3.3. Kết quả khả năng sinh enzyme ...................................................................... 71 3.4. Kết quả khả năng kháng khuẩn ...................................................................... 75 3.5. Kết quả khả năng kháng kháng sinh .............................................................. 77 3.6. Kết quả khảo sát khả năng ức chế màng sinh học của các vi khuẩn lactic sau khi qua xử lý nhiệt ................................................................................................... 81 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................... 84 1. Kết luận .............................................................................................................. 84 2. Kiến nghị ............................................................................................................ 84 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 85 PHỤ LỤC XỬ LÝ SỐ LIỆU ......................................................................................... 94 iv Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MƠI TRƯỜNG  Thành phần mơi trường de Man, Rogosa, Sharpe agar (MRS agar):  Tween 80 1ml  MgSO4.7H2O 0.2g  Cao thịt 10g  MgSO4.4H2O 0.2g  Pepton 5g  K2PO4 2g  Yest Extract 5g  Nước cất 1000ml  D-glucose 10g  Agar 2%  Diamonium Citrate 2g  Điều chỉnh pH = 6.5 ± 0.2 tại 25oC.  Thành phần mơi trường de Man, Rogosa, Sharpe broth (MRS broth):  Tween 80 1ml  Diamonium Citrate 2g  Cao thịt 10g  MgSO4.7H2O 0.2g  Pepton 5g  MgSO4.4H2O 0.2g  Yest Extract 5g  K2PO4 2g  D-glucose 10g  Nước cất 1000ml  Điều chỉnh pH = 6.5 ± 0.2 tại 25oC.  Thành phần nước muối sinh lí:  NaCl 9g  Nước cất 1000ml  Thành phần mơi trường Glucose Phosphate broth (MR – VP broth):  Peptone 7g  Dextrose 5g  K2HPO4 5g  Nước cất 1000ml v Đồ án tốt nghiệp  Thành phần mơi trường Simmon citrate agar (SCA)  MgSO4.7H2O 0,2g  NH4H2PO4 1g  K2HPO4 1g  Na3C6H5O7 2g  NaCl 5g  Bromothymol blue 0,08g  Agar 15g  Nước cất 1000ml  Điều chỉnh pH = 6.8 ± 0.2 tại 25oC.  Thành phần mơi trường canh tryptone:  Tryptone 10g  NaCl 5g  Nước cất 1000ml  Điều chỉnh pH = 7.5 ± 0.2 tại 25oC  Thành phần mơi trường Triple sugar iron agar (TSI):  Cao thịt 3g  NaCl 5g  Peptone 20g  Na2S2O3 0,3g  Yeast extract 3g  Phenol red 0,024g  Lactose 10g  Agar 15g  Sucrose 10g  Nước cất 1000ml  Dextrose 1g  Điều chỉnh pH = 7.0 ± 0.2 tại o  FeSO4 0,2g 25 C. ii Đồ án tốt nghiệp  Thành phần mơi trường Blood agar:  Beef heart infusion 500g  Tryptose 10g  NaCl 5g  Agar 15g  Máu cừu 50ml  Nước cất 950ml  Điều chỉnh pH = 7.3 ± 0.2 tại 25oC.  Thành phần mơi trường Skim milk agar:  Bột sữa gầy 28g  Casein enzymic hydrolysate 5g  Cao nấm men 2,5g  Dextrose 1g  Agar 15g  Điều chỉnh pH = 7.0 ± 0.2 tại 25oC.  Thành phần mơi trường Lactobacillus biofilm medium (LBM):  Peptone 5g  CH3COONa.H2O 2,5g  Cao nấm men 2,5g  MgSO4 0,05g  K2HPO4 3g  MnSO4 0,025g  (NH4)3C6H5O7 1g  CaCl2 0,1g  Dextrose 10g  Nước cất 1000ml  Cao thịt 5g  Tween 80 0,5g  Điều chỉnh pH = 7.0 ± 0.2 tại 25oC. ii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT LAB Lactic acid bacteria /Lactobacillales MRS de Man, Rogosa and Sharpe SCA Simmon citrate agar SAS Statistical Analysis Systems TSI Triple sugar iron TN Thí nghiệm VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật ii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Tổng hợp các nghiên cứu khảo sát một số chủng probiotic trong việc bảo vệ răng miệng ....................................................................................................................... 3 Bảng 1.1. Đặc điểm sinh lý của một số chủng vi khuẩn lactic ..................................... 11 Bảng 1.2. Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB ....... 19 Bảng 2.1. Phân loại khả năng kháng kháng sinh dựa vào đường kính vịng kháng ..... 62 Bảng 3.1. Kết quả thử nghiệm sinh lý .......................................................................... 64 Bảng 3.2. Kết quả thử nghiệm sinh hĩa ........................................................................ 67 Bảng 3.3. Kết quả thử nghiệm lên men carbohydrate .................................................. 69 Bảng 3.4. Kết quả khả năng sinh enzyme của các chủng lactic ................................... 71 Bảng 3.5. Tỉ lệ kháng khuẩn của các chủng lactic (%) ................................................ 76 Bảng 3.6. Kết quả kháng kháng sinh của các chủng lactic ........................................... 77 Bảng 3.7. Kết quả ức chế khả năng tạo màng sinh học của vi khuẩn lactic sau khi xử lý nhiệt ............................................................................................................................... 82 iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Mơṭ sớ vi khuẩn lactic điển hình .................................................................... 8 Hình 1.2. Sơ đồ các con đường lên men lactose của vi khuẩn lactic ........................... 13 Hình 1.3. Cơ chế tác động của Lactobacillus spp. lên những vi khuẩn trong khoang miệng ............................................................................................................................. 28 Hình 1.4. Các dạng sản phẩm từ sữa cĩ chứa probiotic ............................................... 29 Hình 1.5. Các giai đoạn hình thành màng sinh học ...................................................... 32 Hình 1.6. Mạng lưới EPS cùng tế bào vi khuẩn trong màng sinh học, hình thành dưới đáy một chai thủy tinh được chụp dưới kính hiển vi điện tử ........................................ 32 Hình 1.7. Vi sinh vật, bùn đất bám dưới đáy tàu thơng qua sự hình thành màng sinh học ......................................................................................................................... 35 Hình 1.8. Vi khuẩn chịu nhiệt hình thành màng sinh học dày khoảng 20 mm trong hồ nước nĩng Mickey, Oregon .......................................................................................... 36 Hình 1.9. Đốm trắng – dấu hiệu đầu tiên của sự khử khống ở men răng .................... 39 Hình 1.10. Răng bị tổn thương nghiêm trọng do quá trình khử khống ....................... 39 Hình 1.11. Giản đồ mơ tả lý thuyết nguyên nhâu gây sâu răng .................................... 40 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu .......................................................................................... 46 Hình 2.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế màng sinh học sau khi vi khuẩn lactic bị xử lý nhiệt ........................................................................................................ 63 Hình 3.1. Kết quả nhuộm bào tử bằng Malachite green của các chủng lactic ............. 66 Hình 3.2. Kết quả thử nghiệm sinh dưỡng kỵ khí. Dưới đáy ống nghiệm cĩ xuất hiện sinh khối, chứng tỏ các chủng đều tăng trưởng bình thường khi khơng cĩ khí O2 ....... 67 Hình 3.3. Kết quả thử nghiệm Citrate (+: Salmonella typhimurium) ........................... 68 Hình 3.4. Kết quả thử nghiệm H2S ............................................................................... 68 Hình 3.5. Kết quả thử nghiệm Indole (+:Escherichia coli) .......................................... 69 Hình 3.6. Kết quả lên men carbohydrate của các chủng lactic .................................... 70 Hình 3.7. Kết quả thử nghiệm tan huyết của các chủng lactic ..................................... 72 iv Đồ án tốt nghiệp Hình 3.8. Kết quả khả năng sinh enzyme thủy phân Casein ........................................ 73 Hình 3.9. Kết quả khả năng sinh enzyme thủy phân Gelatin ....................................... 73 Hình 3.10. Tất cả các chủng đều chuyển sang màu vàng cho kết quả dương tính với thử nghiệm β- galactosidase ........................................................................................... 74 Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ kháng khuẩn của các chủng lactic ........................... 75 Hình 3.12. Kết quả kháng kháng sinh của các chủng lactic ......................................... 80 Hình 3.13. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ ức chế khả năng tạo màng sinh học của các vi khuẩn lactic sau khi xử lý nhiệt ............................................................................................... 81 v Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Song song với sự phát triển về kinh tế, chính trị và xã hội thì các nghiên cứu khoa học thuộc lĩnh vực Cơng nghệ sinh học cũng ngày càng phát triển. Ngày nay con người đã ứng dụng các thành tựu khoa học cơng nghệ vào trong cuộc sống, từ cơng nghiệp, nơng nghiệp, an ninh quốc phịng cho đến giải trí, v.v... Các nhà khoa học cùng với các nhà nghiên cứu đã ứng dụng các kiến thức từ các tài liệu trên tồn thế giới và áp dụng các biện pháp kỹ thuật mới để cho ra đời các giống cây trồng, vật nuơi, vi sinh vật cĩ tính năng ưu việt hơn các giống hiện cĩ. Bên cạnh đĩ người ta cịn tạo ra những loại thức ăn mới, nghiên cứu ra các loại thuốc, các bộ kit xác định bệnh, những nhân tố mới cĩ giá trị phục vụ đời sống, phát triển kinh tế - xã hội và bảo vệ mơi trường. Ngồi ra, đã cĩ nhiều kết quả nghiên cứu khoa học áp dụng cho lĩnh vực cơng nghệ thực phẩm. Từ những nghiên cứu đĩ chúng ta cho ra đời các loại vi sinh vật dùng trong chế biến nhằm làm tăng giá trị dinh dưỡng, cảm quan và bảo quản thực phẩm, làm cho thực phẩm khơng đơn giản chỉ là bổ sung năng lượng mà cịn cĩ thể giúp con người phịng chống một số bệnh, tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể. Đi đơi với sự phát triển khơng ngừng của xã hội, nhu cầu sử dụng các chế phẩm, thực phẩm cũng như việc sinh hoạt lành mạnh để cĩ được sức khỏe tốt luơn là mục tiêu của rất nhiều người đang hướng tới. Thời gian gần đây, chúng ta thường nghe nhiều về khái niệm “Probiotics” mà khơng phải ai cũng hiểu Probiotics là gì. Probiotics trên thực tế chính là các vi khuẩn sống cĩ lợi đường ruột, khi ăn vào đem lại các lợi ích sức khoẻ con người nhờ cải thiện hệ vi sinh đường ruột và chức năng của ruột. Hai lồi vi khuẩn probiotics thơng dụng hiện này Bifidobacteria và Lactobacillus. Vi khuẩn probiotic giúp tăng cường hệ miễn dịch, ngăn ngừa ung thư... Ngồi ra, việc cĩ thể phát hiện được một lồi vi khuẩn cĩ khả năng ức chế sự tạo thành màng sinh học của các vi khuẩn cĩ hại trong khoang miệng để hạn chế khả năng gây sâu răng đồng thời mang 1 Đồ án tốt nghiệp tính an tồn như một chủng vi khuẩn Probiotic cũng được khá nhiều nhà khoa học quan tâm và đĩ là lý em em chọn thực hiện đề tài này. Em muốn mình cĩ thể tìm hiểu cụ thể hơn về loại vi khuẩn này cũng như hy vọng rằng cĩ thể vận dụng những điều mình biết được vào thực tế, cụ thể là khi làm việc sau này. 2. Tình hình nghiên cứu Trong nhiều năm qua, đã cĩ nhiều nghiên cứu in vivo và in vitro nhằm tìm ra tác động của vi khuẩn lactic trong khoang miệng. Các nhà khoa học cũng mong muốn khi vi khuẩn lactic được sử dụng dưới dạng probiotic sẽ cĩ khả năng tồn tại một thời gian nhất định trong nước bọt. Năm 2006, Haukioja và cộng sự đã tìm được một số chủng probiotic cĩ khả năng này [43], khiến cho việc sử dụng vi khuẩn lactic nĩi chung và probiotic nĩi riêng để bảo vệ răng miệng trở nên khả quan hơn. Bussher và cộng sự đã xác định được rằng L. acidophilus và L. casei cĩ trong sữa chua đã làm giảm tỷ lệ của các Lactobacillus spp. khác và Streptococcus mutans trong nước bọt và mảng bám răng của các đối tượng nghiên cứu xuống sau một tuần sử dụng [48]. Ahola và cộng sự cũng khảo sát tương tự nhưng trong sản phẩm lên men pho mát, LGG và Lactobacillus rhamnosus LC 705 cĩ trong pho mát cĩ thể làm giảm tỷ lệ sâu răng ở trẻ nhỏ [49]. Hallstrom và cộng sự cũng đã chứng minh được việc sử dụng chủng probiotic L. reuteri ATCC 55730 và ATCC PTA 5289 khơng gĩp phần hình thành mảng bám trong khoang miệng [44]. Hầu hết các nghiên cứu lâm sàng của probiotic trong việc bảo vệ răng miệng đều thơng qua việc định lượng tổng vi khuẩn mutans streptococci (MS) trong khoang miệng. Các thành quả nghiên cứu trong những năm gần đây được tổng hợp ở bảng 1. 2 Đồ án tốt nghiệp Bảng 0. Tổng hợp các nghiên cứu khảo sát một số chủng probiotic trong việc bảo vệ răng miệng [50]. Độ tuổi – Thời Tổng MS Tình số đối gian trong trạng Tác giả Chủng probiotic tượng nghiên khoang sâu nghiên cứu miệng răng cứu Nase và cs, 2001 L. rhamnosus GG 7 m 1–6, 594   Ahola và cs, 2002 Lactobacillus spp. 3 w 18–35, 74  - Nikawa và cs, 2004 L. reuteri ATCC 55730 2 w 20, 40  - Montalto và cs, 2004 Lactobacillus spp. 45 d 23–37, 35  - Caglar và cs, 2005 Bifidobacterium animalis ssp. 2 w 21–24, 21  - lactis DN-173010 Caglar và cs, 2006 L. reuteri ATCC 55730 2 w 21–25, 120  - Caglar và cs, 2007 L. reuteri ATCC 55730 3 w 21–24, 80  - Caglar và cs, 2008 Bifidobacterium lactis BB-12 10 d 20–24, 40  - Caglar và cs, 2009 L. reuteri ATCC 55730, L. reuteri 10 d 20, 20  - ATCC PTA 5289 Cildir và cs, 2009 Bifidobacterium animalis ssp. 2 w 12–16, 24  - lactis DN-173010 Stecksen-Blicks và cs, L. rhamnosus LB21 21 m 1–5, 174   2009 Lexner và cs, 2010 L. rhamnosus LB21 2 w 12–15, 20  - Singh và cs, 2011 L. acidophilus La5 10 d 12–14, 40  - Bifidobacterium lactis Bb-12 Jindal và cs, 2011 L. rhamnosus, Bifidobacterium 14 d 7–14, 150  - longum, Saccharomyces cerevisae Marttinen và cs, 2012 L. rhamnosus GG, L. reuteri 2 w 20–30, 13  - SD2112, L. reuteri PTA 5289 Chuang và cs, 2011 L. paracasei GMNL- 33 2 w 20–26, 70  - Cildir và cs, 2012 L. reuteri ATCC PTA 5289, L. 25 d 4–12, 19  - reuteri DSM 17938 Petersson và cs, 2011 L. rhamnosus LB21 15 m 58–84, 160   Taipale và cs, 2012 Bifidobacterium animalis BB-12 2 tháng 15 m tuổi đến 2   tuổi, 106 Juneja và Kakade, 2012 L. rhamnosus hct 70 9 w 12-15, 40  - Sudhir và cs, 2012 L. acidophilus 3 w 10-12, 40  - (d, ngày; w, tuần; m, tháng;, giảm;  , khơng thay đổi; -, âm tính) 3. Mục tiêu nghiên cứu Sử dụng các chủng vi khuẩn lactic đã được phân lập từ khoang miệng. Mục tiêu cuối cùng sau khi thực hiện các thử nghiệm khảo sát là xác định xem chúng cĩ khả 3 Đồ án tốt nghiệp năng ức chế sự tạo thành màng sinh học của Lactobacillus fermentum khơng và cĩ đủ an tồn để bổ sung vào các sản phẩm sử dụng cho con người và động vật khơng. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu _ Tiến hành các thử nghiệm sinh lý, sinh hĩa. _ Khảo sát khả năng kháng khuẩn. _ Khảo sát khả năng kháng kháng sinh. _ Xác định độ an tồn và khả năng ức chế màng sinh học của Lactobacillus fermentum. 5. Phương pháp nghiên cứu a) Phương pháp luận _ Tiến hành các thử nghiệm sinh lý: khả năng chịu nhiệt ở 10oC, 45oC, 60oC; khả năng chịu mặn: 3,5% NaCl và 6,5% NaCl; khả năng sinh bào tử; khả năng sinh dưỡng trong điều kiện kỵ khí. _ Tiến hành các thử nghiệm sinh hĩa: khả năng lên men carbohydrate; thử nghiệm MR – VP; thử nghiệm Citrate; Thử nghiệm Indole; khả năng sinh H2S. _ Khảo sát khả năng sinh enzyme: enzyme thủy phân Gelatin; enzyme thủy phân Casein; thử nghiệm tan huyết; thử nghiệm 훽 – Galactosesidase. _ Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp đo độ đục. _ Khả năng kháng kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Agar Diffusion Test). _ Khả năng ức chế tạo màng sinh học của Lactobacillus fermentum sử dụng các vi khuẩn lactic sau xử lý nhiệt. b) Phương pháp xử lý số liệu - Sử dụng phần mềm excel để vẽ đồ thị. - Sử dụng phần mềm SAS 9.4 để xử lý số liệu. 4 Đồ án tốt nghiệp 6. Các kết quả đạt được _ Chọn được chủng vi khuẩn lactic an tồn và cĩ thể ứng dụng để ức chế sự hình thành màng sinh học của Lactocbacillus fermentum. 7. Kết cấu đồ án Mở đầu Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án. Chương 3: Kết quả và biện luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề tài thực hiện được và đưa ra những biện luận cho kết quả thu được. Chương 4: Kết luận và kiến nghị – nội dung chương tĩm lại những kết quả mà đề tài đạt được và đề nghị cho những hướng cải thiện thêm trong đề tài. 5 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về vi khuẩn Lactic (LAB) 1.1.1. Giới thiệu chung Vi khuẩn lactic (LAB) cĩ vai trị rất quan trọng trong cuộc sống của chúng ta. Chúng tạo ra các thực phẩm lên men và bảo quản thực phẩm khỏi bị hư hỏng. Từ đầu thế kỷ 20, Elie Metchnikoff (1845-1916) đã đề xuất sử dụng các LAB cho mục đích chữa bệnh. Từ đĩ, lĩnh vực nghiên cứu probiotic đã ra đời và phát triển. Đến nay, những nghiên cứu về probiotic đã khơng ngừng cung cấp những bằng chứng cĩ tính khoa học về hiệu quả thực sự của probiotic đối với sức khỏe con người. Từ lâu vi khuẩn lactic đã được con người ứng dụng rộng rãi để chế biến các loại thực phẩm lên men (sữa chua, muối dưa, muối cà,...), ủ chua thức ăn cho gia súc hoặc để sản xuất acid lactic và các loại muối của acid lactic. Từ năm 1780, lần đầu tiên nhà hĩa học người Thụy Điển Scheele đã tách được acid lactic từ sữa bị lên men chua. Năm 1875, L. Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một nhĩm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. 21 năm sau đĩ (1878), Lister đã phân lập được vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococcus lactic) và đến năm 1881 ngành cơng nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic đã được hình thành. Vi khuẩn lên men lactic gọi là vi khuẩn lactic, hiện nay chúng được cơng nhận là an tồn sinh học (generally recognized as safe - GRAS), được sử dụng thường xuyên trong thực phẩm và cĩ đĩng gĩp trong hệ vi sinh vật cĩ ích của con người. Một đặc tính quan trọng khác của vi khuẩn lactic là chúng cĩ khả năng tạo ra bacteriocin (chất kháng khuẩn) như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin, plantacin,... cĩ tác dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển của các nguồn bệnh trong thực phẩm [2] [3]. 6 Đồ án tốt nghiệp Vi khuẩn lactic cĩ hoạt tính kháng khuẩn diện rộng do cĩ khả năng sản xuất ra các chất ức chế: như một số acid hữu cơ, hydrogen peroxide, diacetyl, các chất cĩ khối lượng phân tử thấp và bacteriocin là chất cĩ khả năng ức chế cả vi khuẩn gram (+) và vi khuẩn gram (-). Các chủng vi khuẩn lactic cĩ khả năng sản sinh acid hữu cơ, đặc biệt là acid lactic trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Đối với hydroxy peroxide thì khả năng kháng khuẩn là do việc tạo ra các chất oxy hĩa mạnh như oxygen nguyên tử, các gốc tự do superoxide và các gốc tự do hydroxyl. Đối với bacteriocin, cơ chế kháng khuẩn do vi khuẩn lactic tổng hợp đã được nghiên cứu đầu tiên ở nisin, bacteriocin gram (+) [4]. 1.1.2. Đăc̣ điểm hình thá i của vi khuẩn lactic. Các tế bào cĩ hình dáng đa dạng: từ hình que dài, mảnh đến hình que ngắn uốn cong, thường tạo thành chuỗi. Khơng cĩ khả năng di động (ngoại trừ một số chủng cĩ tiên mao hoặc lơng roi trên bề mặt cơ thể), khơng sinh bào tử, gram dương. Một số chủng thể hiện tính lưỡng cực, xuất hiện các chấm nhỏ hoặc các đường kẻ dọc (quan sát qua kính hiển vi) khi nhuộm vi khuẩn với thuốc nhuộm gram hoặc methylene blue. [51] Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic trịn nhỏ, trong bề măṭ bĩng, màu trắng đục hoặc màu vàng kem, hoặc khuẩn lạc cĩ kính thước to hơn trịn lồi trắng đục. Đặc biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid. Về kích thước tế bào thì đối với các dạng cầu khuẩn là từ 0.5 – 1.5μm. Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi cĩ chiều dài khác nhau. Cịn với trực khuẩn thì từ 1 - 8μm. Trực khuẩn đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi.  Đặc điểm hình thái giống vi khuẩn lactic điển hiǹ h: Trong sớ các vi khuẩn lactic, giớng Lactobacillus đươc̣ xem là đaị diêṇ cho chủng vi khuẩn này. 7 Đồ án tốt nghiệp Tùy thuộc vào hình thái tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành 2 dạng : hình cầu và hình que. Kích thước của chúng thay đổi tùy theo từng lồi. _ Giống Lactobacillus  Giới : Vi khuẩn  Ngành : Firmicutes  Lớp: Bacilli  Bộ: Lactobacillales  Họ: Lactobacillacea  Giống: Lactobacillus a) c) b) d) Hình 1.1. Mơṭ sớ vi khuẩn lactic điển hình a) Lactobacillus casei b) Latobacillus brevis c) Lactobacillus bulgaricus d) Lactobacillus plantarum 8 Đồ án tốt nghiệp Chi Lactobacillus hiện bao gồm hơn 125 lồi như: L. acidophilus, L. brevis, L. casei, L. fermentum, L. plantarum, L. bulgaricus Tế bào cĩ dạng hình que nhưng hình dạng của chúng cĩ thể thay đổi tùy vào điều kiện của mơi trường sống, cĩ thể là dạng que ngắn hoặc dài, xếp thành chuỗi hay đứng riêng lẻ hoặc ở dạng que kép. Lactobacillus là vi khuẩn Gram dương, khơng di động, khơng sinh bào tử, âm tính với catalase, kỵ khí chịu oxy, cĩ khả năng chịu được mơi trường cĩ pH thấp. Một số lồi cĩ thể phát triển ở mơi trường nghèo chất dinh dưỡng, và chịu được nhiệt độ cao. Ngoại trừ lồi L. plantarum thì những lồi khác khơng cĩ khả năng chuyển hĩa nitrate khi ở điều kiện nhất định. Các lồi Lactobacillus thường được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật, đặc biệt là trong các sản phẩm sữa, trong hệ tiêu hĩa, hệ bài tiết và hệ sinh dục người. Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng cũng cĩ chứa các vi khuẩn này như: Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, Lactobacillus plantarum. Sự phân chia của vi khuẩn lactic dựa theo các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của chúng. Vì vậy cĩ thể chia các lồi Lactobacillus thành 3 nhĩm như sau: - Nhĩm I (Lên men đồng hình bắt buộc): Chúng được gọi là Thermobacterium, cĩ fructose - 1,6 - diphosphate aldolase (FDP aldolase) nhưng khơng cĩ phosphoketolase. Chúng lên men được hexose để tạo acid lactic nhưng khơng lên men được pentose, thường phát triển ở 45oC. - Nhĩm II (Lên men dị hình tùy nghi): Chúng được gọi là Streptobacterium (cĩ FDP aldolase và cảm ứng phosphoketolase). Tuy nhiên, hexose là lên men đồng hình và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acid acetic. 9 Đồ án tốt nghiệp - Nhĩm III (Lên men dị hình bắt buộc): Chúng được gọi là Betabacterium (cĩ phosphoketolase nhưng khơng cĩ FDP aldolase), quá trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị hình. Trên thực tế, đã cĩ nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng Lactobacillus rất hữu ích trong việc điều trị hoặc ngăn ngừa nhiễm nấm, nhiễm trùng đường ruột, hội chứng ruột kích thích, tiêu chảy do dùng thuốc kháng sinh, tiêu chảy do nhiễm khuẩn Clostridium difficile, cơ thể khơng phân giải được lactose, bệnh về da như: ban đỏ do sốt, chàm, viêm loét da và ngăn ngừa nhiễm trùng đường hơ hấp. 1.1.3. Đặc điểm sinh lý – sinh hĩa 1.1.3.1. Đăc̣ điểm sinh lý , sinh trưởng Sinh dưỡng ở điểu kiện kỵ khí tùy nghi, thường tăng trưởng trên bề mặt mơi trường rắn kèm theo các điều kiện: kỵ khí, giảm áp suất oxy, 5-10% CO2. Cĩ thể bị ức chế tăng trưởng trong điều kiện hiếu khí, một số lồi thuộc nhĩm sinh vật kỵ khí bắt buộc. Cĩ nhu cầu dinh dưỡng phức tạp đối với các amino acid, peptide, dẫn xuất acid nucleic, vitamin, khống, acid béo, ester acid béo và carbohydrate. Các yêu cầu dinh dưỡng đặc trưng cho từng lồi, thường là các chủng đặc biệt. Nhiệt độ tăng trưởng từ 2 – 53oC, nhiệt độ tối ưu khoảng 30 – 40oC. Tăng trưởng tốt trong điều kiện mơi trường acid, pH tối ưu khoảng 5.5 – 6.2, thường tăng trưởng ở mức pH 5.0 hoặc thấp hơn, tốc độ tăng trưởng giảm trong điều kiện pH mơi trường trung tính hoặc kiềm. 10 Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1. Đặc điểm sinh lý của một số chủng vi khuẩn lactic Nhiệt Khả năng Hình Lên độ tăng pH tăng chịu Lactic aicd Chi thái tế men trưởng, trưở...n nay như Antibio (Hàn Quốc), Probio (Việt Nam), Acidophilus (Mỹ), Biolactyl (Việt Nam), Lactéol (Pháp), Bio - acimin (Việt Nam), Biolactyl (liên doanh Pháp), L – bio - 3D (Việt Nam), Bioflora (Pháp), Các chế phẩm này được sử dụng nhằm khắc phục: các chứng bệnh về đường tiêu hĩa, một số hạn chế do điều trị bằng KS dài ngày mang lại, điều trị tiêu chảy cấp, tăng cường khả năng miễn dịch, 1.3. Màng sinh học 1.3.1. Sự hình thành Các tế bào vi khuẩn sinh sống trơi nổi trong mơi trường lỏng (dạng phù du) vơ tình bám vào một bề mặt nào đĩ, và nếu sau một thời gian chúng khơng chịu tác động di chuyển đi nơi khác, quá trình sinh trưởng vẫn cứ tiếp tục, dần sẽ hình thành một kiểu khuẩn lạc trên bề mặt đĩ, đây là giai đoạn đầu của sự hình thành màng sinh học. Kế đến vi khuẩn sẽ bắt đầu thay đổi thay đổi kiểu hình, khả năng sinh hĩa mới để thuận lợi hơn trong việc tổng hợp nên cơ chất ngoại bào - extracellular polymeric substance (EPS). Phân tích về mặt hình thái học kết hợp với di truyền học, người ta xác định rằng các tế bào xuất hiện cấu trúc tua, nhung mao hoặc tiên mao sẽ tăng thêm độ vững chắc của màng sinh học. Giai đoạn cuối của sự hình thành màng sinh học, các tế bào sẽ một lần nữa biến đổi quay lại dạng phù du, tách ra khỏi màng sinh học để tìm địa điểm định cư khác, giai đoạn này gọi là giai đoạn phát tán [11]. 31 Đồ án tốt nghiệp Hình 0.5. Các giai đoạn hình thành màng sinh học Hình 0.6. Mạng lưới EPS cùng tế bào vi khuẩn trong màng sinh học, hình thành dưới đáy một chai thủy tinh được chụp dưới kính hiển vi điện tử [12]. 32 Đồ án tốt nghiệp 1.3.2. Mạng lưới polymer ngoại bào (EPS) EPS là các polymer sinh học cao phân tử được vi sinh vật tiết ra ngồi mơi trường sống xung quanh chúng. EPS là thành phần chính, đồng thời quyết định tính hĩa lý của màng sinh học [13]. EPS chiếm từ 50 – 90% tổng lượng chất hữu cơ của một màng sinh học [14]. EPS chủ yếu là polysaccharide và một số protein. Ngồi ra cịn cĩ một lượng nhỏ các thành phần khác như: DNA, lipid, mùn đất. EPS là vật liệu giúp cho tế bào vi khuẩn bám dính lên một bề mặt nào đĩ và đồng thời liên kết với các tế bào khác. Đa số các lồi trong chi Lactobacillus đều cĩ khả năng tổng hợp EPS, nhưng chia thành hai dạng. Homopolysaccharides là dạng EPS được tổng hợp từ carbohydrate chủ yếu là dextran, glucan và levan. Trong khi dạng Heteropolysaccharides được tổng hợp từ nucleotide. Homopolysaccharides chủ yếu được tổng hợp từ lồi lên men dị hình như L. pontis, L. frumenti, L. sanfranciscensis, và L. reuteri. Heteropolysaccharides được tổng hợp với số lượng ít, khoảng 0.1 – 1.5 g/l bởi những lồi lên men đồng hình như L. kefiranofaciens, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. paracasei, L. rhamnosus, L. helveticus, và L. sakei [47]. 1.3.3. Tính chất Màng sinh học cĩ thể là cả một quần thể vi khuẩn cùng nhau sinh trưởng và phát triển, quan hệ hợp tác hay cạnh tranh đều cĩ thể diễn ra trong màng, phụ thuộc vào những lồi cĩ mặt trong đĩ [15]. Tính kỵ nước cĩ một phần ảnh hưởng đến khả năng tạo màng sinh học của vi khuẩn. Vì nếu tế bào cĩ tính kỵ nước thì lực tác động của các phân tử ngoại bào hoặc các tế bào khác lên chúng sẽ giảm đáng kể [16]. Một số vi khuẩn khơng cĩ khả năng bám trực tiếp lên một bề mặt nào đĩ, nhưng lại cĩ khả năng liên kết với mạng lưới cơ chất ngoại bào hoặc với tế bào vi khuẩn khác. Những vi khuẩn khơng cĩ khả năng di động sẽ kéo theo hạn chế về khả năng bám dính [16]. 33 Đồ án tốt nghiệp Trong màng sinh học, các tế bào liên kết với nhau bằng mạng lưới do chúng tự tổng hợp nên EPS. EPS khơng chỉ bao gồm polysaccharides do tế bào tổng hợp ra, mà cịn các thành phần từ mơi trường xung quanh như các ion khống, bụi bẩn, hồng cầu, fibrin, protein và các acid nucleic [16]. Xen kẽ với mạng lưới EPS cịn cĩ các kênh nước, giúp vận chuyển chất dinh dưỡng và tín hiệu giữa các tế bào [17]. EPS sẽ bao phủ tế bào vi khuẩn, nhưng vẫn tạo điều kiện cho các tế bào trao đổi tín hiệu sinh hĩa cũng như trao đổi gen với nhau. EPS chính là chìa khĩa quan trọng cho việc sự hình thành, phát triển của màng sinh học. EPS cịn cĩ chức năng giữ cho các enzyme ngoại bào gần với tế bào, giúp hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn ổn định hơn [18]. Dù cùng lồi nhưng nếu sinh trưởng trong màng sinh học thì vi khuẩn sẽ cĩ một số đặc tính khác biệt rõ ràng hơn so với dạng phù du. Một nghiên cứu đã cho thấy trong một số trường hợp khả năng kháng các chất diệt khuẩn, chất kháng sinh của vi khuẩn trong màng sinh học cao hơn gấp 1000 lần so với dạng phù du [19]. Mức độ hình thành màng sinh học phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: mật độ vi khuẩn, hàm lượng chất dinh dưỡng, độ bão hịa, pH, thành phần dinh dưỡng trong mơi trường, độ tĩnh và hệ gen của vi khuẩn [22]. 1.3.4. Phân bố 1.3.4.1. Trong tự nhiên Màng sinh học cĩ ở khắp nơi trong mọi cơ thể sống. Ngồi ra màng sinh học cịn cĩ thể hình thành trong cả những mơi trường cực kỳ khắc nghiệt: dưới dịng chảy mạnh, nhiệt độ cao trong suối nước nĩng, mơi trường độ kiềm/acid cao, các hồ đơng lạnh. Ta cĩ thể dễ dàng tìm thấy màng sinh học cĩ thể trên các tảng đá, sỏi ở những con sơng. Màng sinh học cũng nằm trong chuỗi thức ăn của động vật dưới nước. Màng sinh học hình thành trên hoặc trong thân cây thì lại gĩp phần gây bệnh cho cây, ngoại trừ 34 Đồ án tốt nghiệp trường hợp màng sinh học của vi khuẩn Rhizobium (vi khuẩn nốt sần) ở rễ cây họ đậu. Một số bệnh ở cây trồng do sự hình thành màng sinh học: Citrus Canker (bệnh thối quả ở chi cam chanh); Pierce (nho héo lá); bệnh đốm trắng cà chua, ớt [20]. Màng sinh học cịn được tìm thấy bên trong các đường ống nước, đặc biệt là ống nước thải, gây tắc nghẽn và ăn mịn. Trường hợp xuất hiện trong đường ống dẫn nước lạnh/nĩng thì sẽ giảm khả năng truyền nhiệt đáng kể [21]. Màng sinh học xuất hiện trên vỏ của các con tàu sẽ hỗ trợ cho sự neo bám của các sinh vật khác và bùn đất. Điều này kiến cho vận tốc di chuyển của tàu giảm đi một phần đáng kể, bên cạnh đĩ cịn phát sinh khoảng chi phí vệ sinh đáy tàu (cạo bỏ sinh vật biển). Hình 0.7. Vi sinh vật, bùn đất bám dưới đáy tàu thơng qua sự hình thành màng sinh học 35 Đồ án tốt nghiệp Hình 0.8. Vi khuẩn chịu nhiệt hình thành màng sinh học dày khoảng 20 mm trong hồ nước nĩng Mickey, Oregon [47]. 1.3.4.2. Trong cơ thể sống a) Đường ruột Trong cơ thể người, màng sinh học được tìm thấy nhiều nhất trong đường ruột, một trong những mơi trường ẩm ướt nhưng ấm áp, cực kỳ thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn. Một nghiên cứu gần đây đã cho rằng hệ miễn dịch trong cơ thể chúng ta đang hỗ trợ cho vi khuẩn trong ruột già tạo mảng bám. Từ phát hiện này người ta đã đưa ra một số giả thuyết về chức năng của ruột thừa. Trong ruột thừa chứa một lượng lớn mảng bám vi khuẩn, vì thế khi ruột già bị tổn thương, hệ vi sinh vật trong ruột đang mất cân bằng thì vi khuẩn trong ruột thừa cĩ thể giúp hồi phục lại hệ vi khuẩn trong đường ruột [23]. b) Khoang miệng Khi xuất hiện trong khoang miệng, màng sinh học được gọi là mảng bám răng. Chúng hình thành ở mọi nơi trong khoang miệng kể cả trên răng giả. Phần nước chiếm 36 Đồ án tốt nghiệp khoảng 80 – 90% trong mảng bám, trong khi 70% phần khơ là vi khuẩn, cịn lại là các hợp chất polysaccharides và glycoproteins [24]. Các yếu tố sinh thái trong khoang miệng gĩp phần thúc đẩy sự hình thành của mảng bám răng. Phổ pH bình thường trong miệng là 6 – 7, trong khi màng sinh học được hình thành trong phổ pH 6.7 – 8.3 [25]. Và ngồi vai trị như là một chất đệm, nước bọt cịn chứa một số yếu tố dinh dưỡng như acid amin, protein và glycoprotein. Chế độ ăn uống chỉ đĩng một vai trị nhỏ trong việc cung cấp nơi cư trú cho vi khuẩn [31]. Sự oxy hĩa-khử của vi khuẩn hiếu khí đã gĩp phần cho lượng oxy trong khoang miệng ở trạng thái bán ổn định, tạo điều kiện cho tồn quần thể vi khuẩn tồn tại. 1.4. Sâu răng 1.4.1. Bệnh học 1.4.1.1. Định nghĩa Sâu răng là hiện tượng các tổ chức cứng của răng (men, ngà và cement) bị tổn thương, đặc trưng bởi sự khử khống ở men răng, ngà răng tạo thành các lỗ sâu và khơng hồn nguyên được. Cĩ nhiều định nghĩa về bệnh sâu răng, dựa trên những nghiên cứu và nhận xét khác nhau về nguyên nhân cũng như tiến trình của bệnh, sâu răng cĩ thể được định nghĩa như sau: - Bệnh sâu răng là một quá trình động, diễn ra trong mảng bám vi khuẩn dính trên mặt răng, đưa đến mất cân bằng giữa mơ răng với chất dịch xung quanh và theo thời gian, hậu quả là sự mất khống của mơ răng [27]. - Là bệnh nhiễm trùng của mơ răng biểu hiện đặc trưng bởi các giai đoạn mất và tái khống xen kẽ nhau [28]. 1.4.1.2. Lịch sử Sâu răng là một bệnh phổ biến trên tồn thế giới, xảy ra ở mọi lứa tuổi, giới tính, dân tộc. Bệnh đã cĩ từ rất lâu đời, nhưng chỉ thực sự nghiêm trọng khi đồ ngọt trở 37 Đồ án tốt nghiệp thành thứ khơng thể thiếu trong chế độ ăn uống của con người. Trong các bệnh thường gặp ở trẻ em, sâu răng đứng thứ hai sau bệnh hen suyễn [29]. Suốt một thể kỷ qua người ta tin rằng mọi quần xã vi sinh vật cĩ trong miệng đều cĩ thể gây sâu răng và việc chữa trị duy nhất đĩ là đánh răng – loại bỏ các mảng bám vi khuẩn. Trong thế chiến thức I, II và chiến tranh Triều Tiên, lý do bị từ chối đi nghĩa vụ quân sự nhiều nhất đĩ là sâu răng. Cuối thế kỷ 19, với dự đốn: nếu một người sống đủ lâu thì sau này chắc chắn sẽ khơng cịn răng, người ta đã phân ra nhánh mới riêng biệt trong nền y học lúc bấy giờ - nha khoa, với mức đầu tư 34 tỷ đơ la (năm 1990). Tới những năm cuối thế kỷ 20 thì bệnh sâu răng cĩ thể kiểm sốt và phịng ngừa. Gần 50% trẻ nhỏ khơng bị sâu răng và tỷ lệ sún răng ở người cao tuổi giảm từ 50% xuống cịn 20% [30]. Dù khơng nguy hiểm đến tính mạng nhưng sự khĩ chịu khi sâu răng và chi phí cho việc chữa trị/phịng ngừa là khơng hề nhỏ (đứng thứ 3 sau tim mạch và ung thư). 1.4.1.3. Dấu hiệu và triệu chứng Dấu hiệu sớm nhất của bệnh là sự xuất hiện các đốm phấn trắng trên bề mặt răng, đây là vùng men răng đang bị khử khống [31]. Khi các thương tổn tiếp tục diễn ra thì lúc này vùng men sẽ chuyển sang màu nâu và bắt đầu lõm xuống, gọi là lỗ sâu. Ở giai đoạn đốm trắng, men răng vẫn cĩ thể tái khống hĩa bởi các ion Ca2+ cĩ trong nước bọt. Ở giai đoạn hình thành lỗ sâu thì men răng hồn tồn khơng cĩ khả năng tái khống hĩa nhưng quá trình khử khống vẫn cĩ thể bị dừng lại [32]. 38 Đồ án tốt nghiệp Hình 0.9. Đốm trắng – dấu hiệu đầu tiên của sự khử khống ở men răng. Khi cả men răng và ngà răng đồng thời bị khử khống thì lỗ sâu càng dễ nhìn thấy bằng mắt thường, và khơng cứng chắc như trước. Lúc này tủy răng và mạch máu cĩ thể bị hở ra, chịu tác động bởi lực bên ngồi nhiều hơn, dẫn đến các cảm giác đau nhĩi khi nhai hoặc tiếp xúc với đồ ăn nĩng/lạnh và kể cả ngọt. Hình 0.10. Răng bị tổn thương nghiêm trọng do quá trình khử khống. Răng sâu cịn là một trong những nguyên nhân gây hơi miệng. Trường hợp xấu hơn là nhiễm trùng lan sang vùng mơ mềm (nướu). Biến chứng cĩ thể xảy ra là nghẽn mạch hang xoang, viêm họng Ludwig, đe dọa đến tính mạng của người bệnh. 39 Đồ án tốt nghiệp 1.4.1.4. Nguyên nhân Cần cĩ bốn yếu tố chính đồng thời xuất hiện để gây nên triệu chứng sâu răng: men răng hoặc ngà răng, vi khuẩn gây sâu răng, nguồn carbohydrates (thường là sucrose) và thời gian [33]. Mức độ sâu răng thì lại phụ thuộc vào hình dáng của răng, thĩi quen vệ sinh răng miệng, thành phần nước bọt, Sự sâu răng cĩ thể xảy ra ở bất kỳ nơi nào trên răng. Sâu răng là do sự xuất hiện và phát triển của mảng bám (màng sinh học) trên răng. Các vi khuẩn trong mảng bám sinh acid khi cĩ sự hiện diện của các nguồn carbohydrates khác nhau như sucrose, fructose và glucose. Hình 0.11. Giản đồ mơ tả lý thuyết nguyên nhâu gây sâu răng. a) Vi khuẩn Khoang miệng của người chứa vơ số vi khuẩn, nhưng chỉ một số ít trong đĩ cĩ khả năng gây sâu răng, đáng nĩi đến nhất là Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus và một số lồi trong chi Lactobacillus. Đặc tính để quyết định vi khuẩn cĩ khả năng gây sâu răng hay khơng bao gồm: khả năng tạo nên màng sinh học trên bề mặt răng, sinh ra một lượng acid lactic cao khi lên men đường, khả năng sinh trưởng trong mơi trường pH thấp [34]. 40 Đồ án tốt nghiệp Những vi khuẩn này đa số đều cĩ mặt trong mảng bám răng miệng, nhưng chỉ với mật độ rất thấp, chưa đủ để gây nên sự khử khống men răng. Nhưng nếu khơng trực tiếp vệ sinh mảng bám thường xuyên hoặc lượng đường trong miệng liên tục cao, thì sẽ diễn ra sự mất cân bằng mật độ vi khuẩn trong mảng bám. Lúc này mật độ của những vi khuẩn gây sâu răng sẽ tăng cao, dẫn đến sự mất cân bằng pH trong khoang miệng và gây sâu răng. Mảng bám thường hình thành ở những nơi chịu ít tác động của quá trình nhai nghiền thức ăn và vệ sinh răng miệng. Những vi khuẩn gây sâu răng, thường lây từ người lớn sang trẻ nhỏ thơng qua việc bú sữa mẹ, hành động mớm ăn và hơn của người chăm sĩc trẻ [35]. b) Nguồn carbohydrates Vi khuẩn cĩ khả năng lên men đường glucose, fructose và nhất là sucrose (đường ăn) thành acid (thường là acid lactic). Khi acid tiếp xúc với răng sẽ diễn ra quá trình khử khống, gây sâu răng. Dù vậy nhưng acid sinh ra bởi quá trình lên men đường của vi khuẩn cĩ thể bị trung hịa bởi nước bọt hoặc nước súc miệng. Đối với mơi trường cĩ 2 nguồn đường glucose và fructose thì khả năng gây sâu răng khơng cao so với mơi trường chỉ cĩ một nguồn đường sucrose. Dù rằng sucrose là đường đơi được cấu thành từ 1 đơn vị đường đơn glucose và fructose. Lý do là vì vi khuẩn gây sâu răng cần sử dụng năng lượng của liên kết saccharide giữ glucose và fructose trong phân tử sucrose để tạo ra một hợp chất kết dính dextran polysaccharide bởi enzyme dextransucranase. n sucrose  (glucose)n + n fructose c) Thời gian Thời gian răng bị phơi nhiễm trong mơi trường acid sẽ quyết định sự sâu răng. Sau những bữa ăn, vi khuẩn sẽ bắt đầu lên men đường và sinh acid làm giảm pH. Trong khoảng thời gian nước bọt cĩ thể trung hịa lại pH mơi trường trong khoang 41 Đồ án tốt nghiệp miệng, thì một lượng khống trên men răng đã bị trung hịa. Vì thế sự khử khống gây sâu răng phụ thuộc khá nhiều vào tần suất phơi nhiễm trong mơi trường pH thấp. d) Răng Hàm lượng khống chiếm đến 96% trong men răng. Sự khử khống bắt đầu xảy ra khi pH mơi trường đạt 5.5 [36]. Ngà và lớp cementum dễ bị tổn thương hơn vì chúng cĩ hàm lượng khống thấp hơn men răng [37]. Cĩ một số bệnh rối loạn ở răng nhất định ảnh hưởng đến mức độ gây sâu răng của cá thể. Bệnh hụt khống răng ngày càng phổ biến [38]. Nguyên nhân cĩ thể là do yếu tố di truyền hoặc chế độ dinh dưỡng. Ngồi ra các trường hợp khác như nồng độ dioxins, polychlorinated biphenyl (PCB) cao trong sữa mẹ; trẻ sinh non, thiếu oxy trong lúc sinh; các rối loạn nhất định trong 3 năm đầu đời của trẻ như bệnh quai bị, bạch hầu, sốt xuất huyết, sởi, suy giáp, suy dinh dưỡng, cũng ảnh hưởng đáng kể đến mật độ khống của răng [39] [40]. Nhưng dù sao rối loạn do bệnh tật cũng khơng phải là nguyên chính gây sâu răng. Trường hợp thức ăn bị mắc lại trong các lỗ sâu, chân răng, kẽ răng cũng là nguyên nhân dẫn đến gây sâu răng. e) Yếu tố khác Khả năng tiết nước bọt thấp sẽ tăng mức độ sâu răng, do tốc độ trung hịa pH trong mơi trường khoang miệng diễn ra chậm. Một số hiệu thuốc lá khơng khĩi chứa hàm lượng đường cao, làm tăng khả năng gây sâu răng [41]. Việc hút thuốc cĩ thể dẫn đến bệnh nha chu, khiến nướu co lại, để hở chân răng và tạo khoảng trống thuận lợi cho sự hình thành mảng bám. 42 Đồ án tốt nghiệp 1.4.2. Điều trị Nên kết hợp giữa đánh răng và dùng chỉ nha khoa thường xuyên để loại bỏ triệt để mảng bám vi khuẩn. Khám răng định kỳ mỗi 6 tháng để chuẩn đốn trạng thái của răng vì các dấu hiệu ban đầu của bệnh sâu răng rất khĩ nhận thấy. Hơn nữa chỉ cĩ nha sĩ mới cĩ đầy đủ phương tiện và khả năng chuyên mơn để chẩn đốn, điều trị và đưa ra những lời khuyên cần thiết cho hàm răng của bạn. Nếu đợi đến khi răng đau rồi mới đi gặp nha sĩ thì việc điều trị sẽ trở nên phức tạp hơn, cĩ khi phải chữa tủy răng, mổ nướu răng hay phải nhổ răng vì đã quá muộn. Phương pháp phủ Sealant cũng nên được cân nhắc đến. Phương pháp này thường dành cho trẻ em và thanh thiếu niên, những chất liệu nha khoa phủ trên bề mặt nhai của răng che phủ đi tâm tinh thể HA, hạn chế được quá trình khử khống. Những nghiên cứu khoa học cho thấy ngồi việc Florua đĩng vai trị ức chế sự khử khống của acid lên men răng, với một nồng độ cao nhất định Florua cịn cĩ khả năng diệt khuẩn [42]. Do vậy, Florua trong các sản phẩm răng miệng là một vũ khí vơ cùng lợi hại trong việc phịng ngừa sâu răng. Chỉ nên đáp ứng nhu cầu năng lượng của cơ thể bằng những nguồn carbohydrates cĩ trong trái cây, rau đậu, ngũ cốc, tinh bột. Hạn chế tối đa dùng những thực phẩm được chế biến từ sucrose (bánh kẹo, syrups, nước ngọt). Ngồi ra trái cây, rau quả cịn cĩ nhiều chất xơ (fiber) tác động làm sạch răng. Bên cạnh đĩ cĩ thể dùng đường xylitol thay thế các loại đường ăn thơng thường để tăng khẩu vị trong thực phẩm, vì vi khuẩn khơng thể lên men được xylitol. Tránh những thức ăn dẻo, loại thức ăn này rất dễ bám quanh răng, tạo điều kiện cực kỳ thuận lợi cho mảng bám vi khuẩn phát triển. Từ bỏ thĩi quen ăn ngọt giữa các bữa ăn. Ăn vặt sẽ làm tăng các khoảng thời gian men răng phơi nhiễm trong mơi trường cĩ pH thấp. Nếu phải uống soda, cam, chanh thì nên dùng ống hút, tránh để chúng tiếp xúc với răng (cam chanh cĩ tính acid sẽ khử khống men răng). Nên súc miệng ngay sau khi ăn ngọt hoặc dùng xong các loại nước uống cĩ tính acid. 43 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm nghiên cứu Phịng thí nghiệm khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trường trường Đại học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. 2.2. Thời gian thực hiện Đề tài được thực hiện trong 15 tuần, từ ngày 03/04/2017 đến ngày 16/07/2017. 2.3. Vật liệu và thiết bị 2.3.1. Thiết bị - Dụng cụ - Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 genesis (USA) - Máy đo pH Horiba (Nhật Bản) - Autoclave (Memmmert – Đức) - Kính hiển vi quang học Olympus – Nhật Bản - Cân phân tích, cân kỹ thuật - Tủ cấy vơ trùng, tủ ấm (Memmmert – Đức), tủ sấy (Memmmert – Đức) - Lị vi sĩng (Microwave) - Pipetteman 100 – 1000 µl - Bếp điện - Bơng thấm nước, bơng khơng thấm nước - Giấy lọc, lame, lamell - Các dụng cụ thí nghiệm: becher, erlen, que cấy, đèn cồn, bình định mức, ống đong, pipette, .. 2.3.2. Hĩa chất Các hĩa chất dùng để pha các loại thuốc nhuộm, thuốc thử, chất chỉ thị màu: 44 Đồ án tốt nghiệp _ Safranine _ Ethanol 95% _ Chất chỉ thị màu Bromoresol green, Bromocresol purple _ Chất chỉ thị màu Methyl red, Phenol red _ Malachite green _ Phenolphthalein _ NaOH, KOH _ NaCl _ H2O2 2.3.3. Giống vi khuẩn lactic Sử dụng giống đã phân lập được từ đồ án “Phân lập vi khuẩn Lactic trong khoang miệng cĩ khả năng ức chế sự tạo màng sinh học của một số Lactobacillus spp.” của bạn Nguyễn Tuấn Anh – 1311100138 – 13DSH02. Năm chủng vi khuẩn gây bệnh: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium do bạn Nguyễn Tuấn Anh – 1311100138 – 13DSH02 cung cấp. 2.4. Phương pháp luận  Mục tiêu: Khảo sát các vi khuẩn lactic phân lập từ khoang miệng cĩ khả năng ức chế sự tạo thành màng sinh học Lactobacillus fermentum hay khơng.  Nội dung: _ Tiến hành các thử nghiệm sinh lý, sinh hĩa. _ Khảo sát khả năng kháng khuẩn. _ Khảo sát khả năng kháng kháng sinh. _ Xác định độ an tồn và khả năng ức chế màng sinh học của Lactobacillus fermentum. 45 Đồ án tốt nghiệp LAB cĩ khả năng ức chế sự tạo màng sinh học của L. fermentum Sinh dưỡng Chịu mặn Citrate Sinh H2S VP - MR kị khí 3.5 - 6.5% NaCl Thử nghiệm Khả năng lên men sinh hĩa carbohydrates Thử nghiệm Sinh dưỡng sinh lý 10oC, 45oC, 60oC Vịng indole Lactobacillus spp. Khảo sát Gelatinase β-galactosidase E.coli Staphylococcus aureus Hệ enzyme Kh ả năng kháng khuẩn Bacillus subtilis Caseinase Thủy phân Salmonella typhimurium Pseudomonas aeruginosa hồng cầu 0oC Ampicilli Chloramphenicol n Khả năng ức chế sự tạo màng Khả năng kháng kháng sinh sinh học của L. fermentum sau 80oC khi bị xử lý nhiệt Penicillin Streptomycin 100oC Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu 46 Đồ án tốt nghiệp 2.5. Phương pháp thí nghiệm 2.5.1. Thử nghiệm sinh lý 2.5.1.1. Khả năng sinh dưỡng ở 10oC, 45oC, 60oC trong 48 giờ _ Bước 1: Chuẩn bị 200ml mơi trường MRS broth, phối mơi trường vào các ống nghiệm mỗi ống 10ml, hấp tiệt trùng. _ Bước 2: Cấy giống vi khuẩn lactic vào các ống nghiệm chứa mơi trường đã tiệt trùng, sau đĩ ủ ở nhiệt độ 10oC, 45oC, 60oC trong 24 giờ và 48 giờ _ Bước 3: Quan sát kết quả. Kết luận 2.5.1.2. Khả năng chịu mặn: NaCl 3,5% và 6,5% trong 48 giờ _ Bước 1: Chuẩn bị 100ml mơi trường MRS broth, NaCl 3,5% và 100ml mơi trường MRS broth, NaCl 6,5%, phối mơi trường vào các ống nghiệm mỗi ống 10ml, hấp tiệt trùng. _ Bước 2: Cấy giống vi khuẩn lactic vào các ống nghiệm chứa mơi trường đã tiệt trùng, sau đĩ ủ ở nhiệt độ 37oC trong 48 giờ. _ Bước 3: Quan sát kết quả. Kết luận. 47 Đồ án tốt nghiệp 2.5.1.3. Khả năng sinh bào tử Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử (dày, chắc, khĩ bắt màu, chứa nhiều lipid). Đầu tiên xử lý để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và acid. Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm cĩ hoạt tính mạnh. Tẩy màu tế bào chất của tế bào và nhuộm nĩ bằng thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đĩ tế bào chất của bào tử và tế bào chất của tế bào bắt màu phân biệt. Trong đĩ bào tử sẽ cĩ màu xanh và tế bào cĩ màu hồng. Sử dụng sinh khối vi khuẩn khi đã già (khoảng 7 ngày) để nhuộm bào tử. Từ kết quả thu được ta loại bỏ các chủng cĩ bào tử, do LAB là vi khuẩn Gram dương khơng sinh bào tử. Tiến hành: dùng phương pháp Schaeffer-Fulton - Nuơi cấy vi khuẩn ở 37oC, 5 – 7 ngày. - Làm vết bơi và cố định tế bào trên lame như đối với nhuộm Gram. - Nhuộm bằng dung dịch Malachite green trong 10 phút, đặt trên 1 cốc nước đun sơi, rửa nước, thấm khơ. - Nhuộm lại bằng dung dịch Safranine trong 30 – 90 giây, rửa nước, thấm khơ. - Soi kính: dùng vật kính dầu 100x Kết quả: Bào tử cĩ màu lục, tế bào sinh dưỡng cĩ màu đỏ. 2.5.1.4. Khả năng sinh dưỡng kỵ khí _ Bước 1: Chuẩn bị 100ml mơi trường MRS broth, phối mơi trường vào các ống nghiệm mỗi ống 10ml, hấp tiệt trùng. _ Bước 2: Cấy giống vi khuẩn lactic vào các ống nghiệm chứa mơi trường đã tiệt trùng, bơm 1 lớp parafin cĩ độ dày 1cm, sau đĩ ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. _ Bước 3: Quan sát kết quả. Kết luận. 48 Đồ án tốt nghiệp 2.5.2. Thử nghiệm sinh hĩa Các phương pháp sinh hĩa sau đây được thực hiện như trong mơ tả của cuốn: Microbiological Methods” C.H. Collins, P.M. Lyne, J.M. Grange & J.O. Falkinham III (2004). 2.5.2.1. Thử nghiệm lên men carbohydrate Thử nghiệm này nhằm kiểm tra xem vi sinh vật cĩ khả năng lên men các loại đường nào. Các loại đường được sử dụng là: Arabinose, Cellobiose, Galactose, Glucose, Lactose, Maltose, Mannitol, Mannose, Ribose, Salicin, Sorbitol, Sorbose, Sucrose, Glycerol. Kết quả từ thí nghiệm này giúp ta định danh đến cấp giống các chủng vi khuẩn lactic phân lập được dựa theo khĩa phân loại của Bergey. Mơi trường và thuốc thử: _ Peptone 10g _ NaCl 5g _ Cao thịt 1g _ Bromocresol purple 0,17g _ Carbohydrate 1% (Arabinose, Cellobiose, Galactose, Glucose, Lactose, Maltose, Mannitol, Mannose, Ribose, Salicin, Sorbitol, Sorbose, Sucrose, Glycerol) _ Nước cất 1000ml _ Điều chỉnh pH = 7.0 ± 0.2 tại 25oC. Tiến hành: - Chuẩn bị mơi trường test đường: Phối mơi trường cơ bản (khơng chứa đường) vào trong các lọ thủy tinh, sau đĩ đem hấp khử trùng. Đường được cân riêng lẻ trong các eppendorf vơ trùng và được phơi dưới tia UV trong 20 phút (khoảng cách với đèn là 10cm). Sau khi hấp khử trùng mơi trường cơ bản, tiến hành hịa đường vào từng lọ 49 Đồ án tốt nghiệp chứa mơi trường. Dùng micropipette phối 500휇l các loại mơi trường vào các giếng trong đĩa giếng 48. - Dùng micropipette cấy 20휇l giống vào trong các giếng, ủ 37oC trong 24 giờ. Kết quả: Dương tính: Nếu vi khuẩn cĩ khả năng lên men đường (sinh acid) thì mơi trường chuyển sang màu vàng. Việc mơi trường chuyển màu khơng hồn tồn cũng được đánh giá là dương tính yếu. Âm tính: Nếu mơi trường vẫn giữ nguyên màu tím, nghĩa là vi khuẩn khơng cĩ khả năng lên men đường. 2.5.2.2. Thử nghiệm VP (Voges proskauer) Acid pyruvic là một hợp chất quan trọng trong quá trình lên men glucose, được tạo thành thơng qua các quá trình trao đổi chất khác nhau, phụ thuộc vào các hệ thống enzyme của các vi khuẩn khác nhau. Trong số đĩ sẽ cĩ một con đường trao đổi chất sản xuất ra acetion (acetyl methyl carbinol), một sản phẩm tạo thành của con đường butylene glycol (sản phẩm cuối cùng của phản ứng trung hịa). Các chủng sinh vật thuộc các nhĩm Klebsiella-Enterobacter-Hafnia-Serratia sẽ sản xuất acetoin như là sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi chất glucose và tạo thành một lượng nhỏ acid hỗn hợp. Trong điều kiện tiếp xúc với oxy trong khí quyển và 40% kali hydroxyde, acetoin chuyển hĩa thành diacetyl, alpha-naphthol đĩng vai trị là chất xúc tác để tạo ra một phức hợp màu đỏ. Mơi trường và thuốc thử: _ Mơi trường: MR – VP broth _ Thuốc thử:  훼 – naphthol: 5g 훼 – naphthol + 100ml cồn tuyệt đối  KOH 40%: 40g KOH + 100ml nước cất 50 Đồ án tốt nghiệp Tiến hành: - Chuẩn bị 100ml mơi trường MR – VP, phối mơi trường vào các ống nghiệm mỗi ống 10ml, hấp tiệt trùng - Cấy giống vi khuẩn lactic vào các ống nghiệm chứa mơi trường đã được tiệt trùng, ủ ở 37oC trong 24 giờ. - Hút 1ml dịch nuơi cấy cho vào ống nghiệm sạch. Bổ sung 0,6ml 훼 – naphthol 5% và 0,2ml KOH 40% (Lưu ý: Bổ sung thuốc thử theo trình tự này sẽ cho kết quả tốt nhất). - Lắc nhẹ và giữ cố định các ống nghiệm trong 10 – 15 phút. Quan sát kết quả và kết luận. Kết quả: Dương tính: ống nghiệm xuất hiện màu đỏ sau 15 phút cho thuốc thử vào. Điều này cho thấy sự của mặt của diacetyl, do quá trình oxy hĩa acetoin tạo thành. Âm tính: màu khơng đổi sau khi cho thuốc thử 15 phút.  Lưu ý: Khơng nên đọc kết quả sau khi cho thuốc thử hơn 1 giờ, vì khi đĩ mơi trường MR – VP sẽ cĩ màu đỏ đồng do các chủng vi khuẩn âm tính VP hình thành, gây sai lệch kết quả. 2.5.2.3. Thử nghiệm MR (Methyl red) Xét nghiệm Methyl Red (MR) xác định xem vi khuẩn cĩ lên men glucose tạo hỗn hợp acid hay khơng. Các loại và tỉ lệ của các sản phẩm lên men là một trong những đặc tính phân loại chính giúp phân biệt các loại vi khuẩn đường ruột khác nhau. Trong quá trình lên men tạo hỗn hợp acid, ba acid (acetic, lactic và succinic) được tạo thành với số lượng đáng kể. Mỗi mol glucose được lên men sẽ cho ra 4 mol các sản phẩm cĩ tính acid (acid lactic và chủ yếu là acetic), 1 mol các sản phẩm lên men trung tính (ethanol), 1 mol CO2 và 1 mol H2. 51 Đồ án tốt nghiệp Lượng lớn acid tạo thành làm giảm đáng kể độ pH của mơi trường đến dưới 4,4. Điều này được phát hiện bằng cách sử dụng chỉ thị pH, methyl red (p- dimethylaminoaeobenzene-O-carboxylic acid), nếu pH trên 5.1 sẽ cho màu vàng hoặc cam và màu đỏ khi pH 4.4. Methyl red cĩ phổ pH phát hiện axit thấp hơn đáng kể so với các loại thuốc thử khác được sử dụng trong mơi trường nuơi cấy vi khuẩn. Do đĩ, để tạo ra sự thay đổi màu sắc, vi khuẩn thử nghiệm phải sản xuất một lượng lớn acid khi lên men carbohydrate đang được sử dụng. Tiến hành: - Sử dụng các ống nghiệm nuơi cấy chủng vi khuẩn lactic trong mơi trường MR – VP của thử nghiệm Voges proskauer ủ tiếp ở 37oC trong 4 ngày. Sau đĩ, hút 1ml dịch nuơi cấy cho vào ống nghiệm sạch. Thêm vào mỗi ống 5 giọt Methyl red. Kết quả: Dương tính: xuất hiện màu đỏ sau khi thêm thuốc thử. Màu đỏ là do vi khuẩn lên men glucose, sản xuất acid làm pH mơi trường giảm xuống cịn 4.4 hoặc thấp hơn. Âm tính: khơng cĩ màu đỏ xuất hiện hoặc cĩ màu cam sau khi thêm thuốc thử. Màu cam xuất hiện là do vi khuẩn sản xuất ít acid nên pH mơi trường cao hơn 4.4. 2.5.2.4. Thử nghiệm Citrate Thử nghiệm Citrate được sử dụng để xác định khả năng của vi khuẩn sử dụng Natri citrate như nguồn carbon duy nhất và là nguồn nitơ cố định duy nhất (NH4H2PO4) Khi một acid hữu cơ như citrate (trong chu trình Krebs) được sử dụng như một nguồn cacbon và năng lượng, carbonate cĩ tính kiềm và bicarbonate được tạo ra. Ngồi ra, NH4OH được sản xuất khi muối amoni trong mơi trường được sử dụng làm nguồn nitơ. Việc sử dụng citrate ngoại sinh địi hỏi sự hiện diện của các protein vận chuyển citrate (permeases: protein mang). Khi tế bào hấp thu, citrate được tách bằng cytrate 52 Đồ án tốt nghiệp lyase thành oxaloacetate và acetate. Oxaloacetate sau đĩ được chuyển hĩa thành pyruvate và CO2 . Quá trình chuyển hĩa phụ thuộc vào độ pH của mơi trường.  Trong mơi trường kiềm: pyruvate được chuyển hĩa thành acetate và formate.  Ở pH 7.0 và thấp hơn: lactate và acetoin cũng được sản xuất. CO2 được giải phĩng sẽ phản ứng với nước và ion natri trong mơi trường để tạo ra natri cacbonate, hợp chất kiềm sẽ làm tăng pH. Ngồi ra, NH4OH được sản xuất khi muối amoni trong mơi trường được sử dụng làm nguồn nitơ. Quá trình tăng trưởng của vi khuẩn thường dẫn đến phản ứng làm bromothymol blue chuyển màu từ xanh lá sang xanh dương. Chỉ thị pH bromothymol blue cĩ màu xanh lá đậm ở pH trung tính. Khi tăng pH đến trên 7.6, bromothymol blue chuyển sang màu xanh dương. Tiến hành: ...n to histologic changes.," Community Dent Oral Epidemiol . [28] N. W. J. J. M. H. R. A. D. W. L. M. Silverstone (1981), in “Dental caries, Aetiology, Pathology and Prevention. 1st ed.” , London, Macmillan Pres, p. 26–27. [29] P. J. Rees J (1995), ABC of asthma. 3 rd ed, London: BMJ Publishing Group. [30] History of Dentistry: Ancient Origins, American Dental Association website, January 9, 2007. [31] R. S. King (2011), "An incipient carious lesion is the initial stage of structural damage to the enamel, usually caused by a bacterial infection that produces tooth- dissolving acid.," A Closer Look at Teeth May Mean More Fillings. [32] C. Johnson (2007), Biology of the Human Dentition. [33] S. J. Southam JC (1993), "2. Dental Caries," in Oral pathology (2nd ed.), Oxford Univ. Press. [34] H. JM (1982), "The microbiology of dental caries," in Dent Update, pp. 199–200, 202–4, 206–8. 87 Đồ án tốt nghiệp [35] J. Douglass, Y. Li and N. Tinanoff (2008), "Association of mutans streptococci between caregivers and their children.," in Pediatric Dentistry, p. 375–87. [36] D. C (2003), " What is the critical pH and why does a tooth dissolve in acid?," in J Can Dent Assoc, p. 69 (11): 722–4. [37] M. JR (1986), "Demineralization and remineralization of root surface caries," in Gerodontology, p. 5 (1): 25–31. [38] R. M. D. L. K. I. Mast P (2013), "Understanding MIH: definition, epidemiology, differential diagnosis and new treatment guidelines," Eur J Paediatr Dent (Review), p. 14 (3): 204–8. [39] Z. M. A. A. L. H. Rashid M (2010), "Oral manifestations of celiac disease: a clinical guide for dentists," in J Can Dent Assoc, 2011, p. 77: b39. C. G. G. F. G. P. Giuca MR, "Oral signs in the diagnosis of celiac disease: review of the literature," in Minerva Stomatol (Review), p. 59 (1–2): 33–43. [40] C. G. G. F. G. P. Giuca MR (2010), "Oral signs in the diagnosis of celiac disease: review of the literature," in Minerva Stomatol (Review), p. 59 (1–2): 33–43. [41] B. D. D. C. A. J. B. Neville (2002), in Oral & Maxillofacial Pathology 2nd edition, p. 347. [42] D. A, J. Jeevarathan, M. Muthu, R. Prabhu V and Chamundeswari (2008), "Effect of Fluoride Varnish on Streptococcus mutans Count in Saliva of Caries Free Children Using Dentocult SM Strip Mutans Test: A Randomized Controlled Triple Blind Study," in International Journal of Clinical Pediatric Dentistry, p. 1 (1): 1–9. [43] A. L. V. &. T. J. HAUKIOJA (2008), " Probiotic bacteria affect the composition of salivary pellicle and streptococcal adhesion in vitro," Oral Microbiol Immunol, pp. 23, 336-43. [44] H. L. S. Y.-L. T. D. G. HALLSTROM (2013), "Effect of probiotic lozenges on inflammatory reactions and oral biofilm during experimental gingivitis.," Acta Odontol Scand. 88 Đồ án tốt nghiệp [45] D. A. W. (1990), "Microbial exopolymer secretion in ocean environment:," Oceanography and Marine, pp. 73-153. [46] P. G. G. J. D. K. N. L. W. R. F. S. K.-H. W. W. (. Hammes W.P. and Hertel C. (2009) Editors: Vos, "Lactobacillus" in “Bergey's Manual of Systematic Bacteriology”. Volume 3: The Firmicutes, pp. 465 - 511. [47] "Wikipedia," 11 July 2017. [Online]. Available: https://en.wikipedia.org/wiki/Biofilm. [Accessed 04 08 2009]. [48] M. A. v. d. M. H. Busscher HJ, "In vitro adhesion to enamel and in vivo colonization of tooth surfaces by lactobacilli from a bio-yoghurt.," in Caries Res., 1999, p. 33(5):403–404. [49] Y.-K. H. S. T. e. a. Ahola AJ, "Short-term con-sumption of probiotic-containing cheese and its effect on dental caries risk factors Arch Oral," in Biol, 2002, p. 47(11):799–804. [50] P. Hasslưf, "Use of probiotics in the oral cavity," Probiotic Lactobacilli in the context of dental caries as a biofilm-mediated disease , pp. 13 - 17, 2013. [51] Paul De Vos, George M. Garrity, Dorothy Jones, Noel R. Krieg, Wolfgang Ludwig, Fred A. Rainey, Karl-Heinz Schleifer and William B. Whitman (2009), “Bergey’s manual of systematic bacteriology” Second Edition, vol 3. [52] Ellie J. C. Goldstein, Kerin L. Tyrrell, Diane M. Citron (2015) “Lactobacillus Species: Taxonomic Complexity and Controversial Susceptibilities” “ Clinical Infectious Diseases” vol 60. [53] Ibourahema C, Dauphin RD, Jacqueline D, Thonart P. (2008) “Characterization of lactic acid bacteria isolated from poultry farms in Senegal” Afr J Biotechnol 7: 2006–2012 [54] Karimi O. and Pena A.S. (2003), “Probiotic: isolated bacteria strain or mixture of different strain?”. Drug of Today, vol 39, pp. 565-597. 89 Đồ án tốt nghiệp [55] Kos B., Suskovic J., Vukovic S., Simpraga M., Frece J. and Matosic S., (2003), “Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus M92”. Journal of Applied Microbiology, vol 94, pp. 981-987. [56] Lin, M., Savaiano, D. And Harlender (1991) “S. Influence of nonfermented dairy products containing bacterial starter cultures on lactose maldigestion in humans”. Journal of Dairy Science. 1991; 74: 87-95. [57] Young Ju Kim, Ji Hee Kang, Ji Sunlee & Myung Suklee (2001), “Study on the bacteriocin produced by Lactobacillus sản phẩm GM 7311”. Department of Microbiology college of nature Science Pukyong National University. [58] S. Oh, S. H. Kim, and R. W. Worobo (2000), “Characterization and purification of a bacteriocin produced by a potential probiotic culture, Lactobacillus acidophilus 30SC”, J Dairy Sci, pp.2747-2752. [59] Mohd Adnan AF, Tan IK. (2007). Isolation of lactic acid bacteria from Malaysian foods and assessment of the isolates for industrial potential. Bioresour Technol 98: 1380–1385 [60] Ouwehand A.C., Salminen S.,Isolauri E.,(2002), “Probiotics: an overview of beneficial effects”. Antonie van Leeuwenhoek, vol 82, pp 279 -289. [61] Pairat Sornplang and Sudthidol Piyadeatsoontorn (2016). Probiotic isolates from unconventional sources: a review. J Anim Sci Technol. 58: 26. [62] Rattanachaikunsopon P, Phumkhachorn P. 2010. Lactic acid bacteria: their antimicrobial compounds and their uses in food production. Ann Biol Res 1: 218–228 [63] Yeung P.S.M ., M. E. Sanders, C.L. Kitts, R. Cano and P.S.Tong. “Species- Species-Specific indentification of Commercial Probiotic”. Strains. J. Dairy Sci. pp. 1039 – 1051. [64] Carbonelle, F Denneis, A. Marmonier, G Pion, R Vargues (1987), “Bacteriologie medicale techniques usuelles”, SIMEP SA Paris, France . 90 Đồ án tốt nghiệp [65] Frank J. C and Nino M (2002), “The Lactic Acid Bacteria”. Microbiology, vol 28, pp. 281-370. [66] Klein G., (2003), “Taxonomy, ecology and antibiotic resistance of enterococci from food and the gastro – intestinal tract”. International Journal of Food Microbiology, vol 88, pp. 123-131. [67] Kakinuma Y., (1998), “Inorganic cation transpost and energy transduction in Enterococcus hirae and other streptococci”. Microbiology and Molecular Biology, vol 62, pp. 1021 -1045. [68] Kos B., Suskovic J.,Vukovic S., Simpraga M., Frece J. and Matosic S., (2003), “Adhesion and aggregation ability of probiotic strains Lactobacillus acidophilus M92”. Journal of Applied Microbiology, vol 94, pp. 981-987. [69] Liong Min Tze (2006), “In-vivo and in-vitro cholesterol removal by Lactobacilli and Bifidobacteria”, A thesis submitted for the degree of Doctor of Philosophy, School of Molecu. [70] M. T. Liong and N. P. Shah (2005), “Acid and bile tolerance and cholesterol removal ability of Lactobacillus strains”, American Dairy Science Association, pp. 55- 56. [71] Song J.,Lee S –C, Kang J. –W.,Beak H-J, Suh J –W. (2004), “Phylogenetic analysis of Streptomyces spp. Isolated from potato scab lesions in Korea on basis of 16S rDNA gen and 16S-23S rDNA internally transceibed spacer seuqnces”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, vol.54, pp. 203- 209. [72] Saarela M.,Mogensen G., Fonde R.,(2000), “Probiotic bacteria: safety functional and technological properties”. Journal of Biotechnology, vol 84, pp 197-215. [73] Song J., Lee S.-C, Kang J.-W., Beak H.-J, Suh J.-W. (2004), “Phylogenetic analysis of Streptomyces spp. Isolated from potato scab lesion in Korea on basis of 16S 91 Đồ án tốt nghiệp rDNA gen and 16S -23S rDNA internally transceibed spacer seuqnces”, International Journal of Systermatic and Evolutionnary Microbiology, vol.54, pp. 203-209. Tài liệu trong nước [74] Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng, Lê Ngọc Mỹ (1995), “Bệnh đường tiêu hĩa ở lợn”, Nxb Nơng nghiệp Hà Nội. [75] Trần Linh Thước, Đặng Thị Phương Thảo, Đỗ Anh Tuấn (2004), “Giáo trình thực tập Bioinformatic”, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Tp. Hồ Chí Minh, Lưu hành nội bộ. [76] Lê Ngọc Tú, La Văn Chú, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng (1982), “Enzyme vi sinh vật”. Nxb Khoa học và Kỹ thuật. [77] Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Vũ Tường Vy, Trần Thu Hoa (2007), “Khảo sát khả năng chịu đựng acid, muối mật và KS của một số vi sinh vật là nguyên liệu sản xuất probiotic đường uống”, Tạp chí dược học (378). [78] Trần Thị Mỹ Trang (2006), “Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic để sản xuất chế phẩm probiotic phịng và trị bệnh đường ruột cho heo”, Luận văn Thạc sỹ.Sinh học Đại học Sư phạm Tp. HCM. [79] Lương Đức Phẩm (2004), “Nấm men cơng nghiệp”, Trung Tâm Khoa Học Tự Nhiên Và Cơng Nghệ Quốc Gia Hà Nội [80] Lưu Đaị Kim Phươṇ g (2016) “Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống cĩ khả năng kháng nấm mốc sinh Aflatoxin Aspergillus spp.”. Trường Đaị hoc̣ Cơng nghê ̣TP.HCM. Tài liệu online [81] http:// www.enterococcus.ouhssc.edu0T [82] http:// www.fao.org/es/ESN/Probio.htm [83] http:// en.wikipedia.org/wiki/Probiotic.html0 92 Đồ án tốt nghiệp [84] http:// www.baomoi.com [85] [86] methods/examples-of-antibiotic-sensitivity-tesing-methods [87] https://microbeonline.com [88] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4568587/ [89] [90] https://vi.wikipedia.org/wiki/Probiotic [91] tu-sua-2027/ 93 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC XỬ LÝ SỐ LIỆU Kháng khuẩn Bacillus subtilis TY LE KK Bacillus subtilis The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values CHUNG 8 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2 Number of Observations Read 24 Number of Observations Used 24 TY LE KK Bacillus subtilis The ANOVA Procedure Dependent Variable: TYLEKK Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 24019.40133 3431.34305 9215.64 <.0001 Error 16 5.95743 0.37234 Corrected Total 23 24025.35876 R-Square Coeff Var Root MSE TYLEKK Mean 0.999752 0.915458 0.610196 66.65471 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F CHUNG 7 24019.40133 3431.34305 9215.64 <.0001 TY LE KK Bacillus subtilis The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for TYLEKK Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 16 Error Mean Square 0.372339 94 Đồ án tốt nghiệp Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 Critical Range 1.455 1.518 1.559 1.588 1.611 1.628 1.643 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N CHUNG A 93.5131 3 8R2 B 91.1437 3 26R1 B B 90.8218 3 7B2 C 88.3008 3 21B2 D 78.7288 3 21R2 E 53.6601 3 23B1 F 37.0694 3 8B G 0.0000 3 23B2 E.Coli TY LE KK E.Coli The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values CHUNG 8 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2 Number of Observations Read 24 Number of Observations Used 24 95 Đồ án tốt nghiệp TY LE KK E.Coli The ANOVA Procedure Dependent Variable: TYLEKK Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 20702.25382 2957.46483 8578.05 <.0001 Error 16 5.51634 0.34477 Corrected Total 23 20707.77016 R-Square Coeff Var Root MSE TYLEKK Mean 0.999734 0.876959 0.587172 66.95552 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F CHUNG 7 20702.25382 2957.46483 8578.05 <.0001 TY LE KK E.Coli The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for TYLEKK Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 16 Error Mean Square 0.344771 Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 Critical Range 1.400 1.461 1.500 1.528 1.550 1.567 1.581 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N CHUNG A 93.6382 3 8R2 A A 92.5211 3 26R1 B 88.9260 3 7B2 96 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N CHUNG C 82.9240 3 21B2 D 64.4096 3 21R2 D D 63.4689 3 8B E 49.7563 3 23B1 F 0.0000 3 23B2 Pseudomonas pseudomonas TY LE KK Pseudomonas pseudomonas The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values CHUNG 8 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2 Number of Observations Read 24 Number of Observations Used 24 TY LE KK Pseudomonas pseudomonas The ANOVA Procedure Dependent Variable: TYLEKK Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 16361.10803 2337.30115 9358.04 <.0001 Error 16 3.99622 0.24976 Corrected Total 23 16365.10425 R-Square Coeff Var Root MSE TYLEKK Mean 0.999756 0.877805 0.499764 56.93338 97 Đồ án tốt nghiệp Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F CHUNG 7 16361.10803 2337.30115 9358.04 <.0001 TY LE KK Pseudomonas pseudomonas The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for TYLEKK Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 16 Error Mean Square 0.249764 Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 Critical Range 1.192 1.243 1.277 1.301 1.319 1.334 1.345 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N CHUNG A 80.3109 3 8R2 A A 79.3622 3 26R1 B 77.9828 3 7B2 C 71.3350 3 21B2 D 62.9657 3 21R2 E 44.5031 3 23B1 F 39.0073 3 8B G 0.0000 3 23B2 98 Đồ án tốt nghiệp Salmonella typhimurium TY LE KK Salmonella typhimurium The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values CHUNG 8 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2 Number of Observations Read 24 Number of Observations Used 24 TY LE KK Salmonella typhimurium The ANOVA Procedure Dependent Variable: TYLEKK Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 21471.56860 3067.36694 10541.4 <.0001 Error 16 4.65571 0.29098 Corrected Total 23 21476.22431 R-Square Coeff Var Root MSE TYLEKK Mean 0.999783 0.876488 0.539427 61.54419 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F CHUNG 7 21471.56860 3067.36694 10541.4 <.0001 TY LE KK Salmonella typhimurium The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for TYLEKK Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 16 Error Mean Square 0.290982 Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 Critical Range 1.286 1.342 1.378 1.404 1.424 1.439 1.452 99 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N CHUNG A 91.8911 3 8R2 B 86.7677 3 26R1 C 82.9528 3 7B2 D 79.7682 3 21B2 E 70.9150 3 21R2 F 42.0682 3 8B G 37.9906 3 23B1 H 0.0000 3 23B2 Staphylococcus aureus TY LE KK Staphylococcus aureus The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values CHUNG 8 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2 Number of Observations Read 24 Number of Observations Used 24 TY LE KK Staphylococcus aureus The ANOVA Procedure Dependent Variable: TYLEKK 100 Đồ án tốt nghiệp Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 25612.99748 3658.99964 6858.86 <.0001 Error 16 8.53552 0.53347 Corrected Total 23 25621.53301 R-Square Coeff Var Root MSE TYLEKK Mean 0.999667 1.242746 0.730390 58.77230 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F CHUNG 7 25612.99748 3658.99964 6858.86 <.0001 TY LE KK Staphylococcus aureus The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for TYLEKK Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 16 Error Mean Square 0.53347 Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 Critical Range 1.742 1.817 1.866 1.901 1.928 1.949 1.966 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N CHUNG A 90.2502 3 8R2 B 83.3566 3 7B2 B B 82.1591 3 26R1 C 76.7286 3 21B2 C 101 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N CHUNG C 75.0431 3 21R2 D 51.8985 3 23B1 E 10.7423 3 8B F 0.0000 3 23B2 Khả năng ức chế màng sinh học sau xử lý nhiệt Ức chế 1B ở 00C UC CHE 1B O 0DO The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NBG 9 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 UC CHE 1B O 0DO The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 8 4746.776658 593.347082 5.17 0.0018 Error 18 2067.391963 114.855109 Corrected Total 26 6814.168621 R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean 0.696604 88.61963 10.71705 12.09331 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NBG 8 4746.776658 593.347082 5.17 0.0018 102 Đồ án tốt nghiệp UC CHE 1B O 0DO The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square 114.8551 Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9 Critical Range 18.38 19.29 19.86 20.26 20.54 20.76 20.93 21.06 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N NBG A 35.659 3 23B1 A B A 32.900 3 21B2 B B C 14.260 3 8B B C B C 14.149 3 7B2 C C 11.871 3 21R2 C C 0.000 3 16B C C 0.000 3 23B2 C C 0.000 3 26R1 C C 0.000 3 8R2 103 Đồ án tốt nghiệp Ức chế 1B ở 800C UC CHE 1B O 80DO The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NBG 9 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 UC CHE 1B O 80DO The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 8 1851.200732 231.400092 4.79 0.0028 Error 18 869.677465 48.315415 Corrected Total 26 2720.878197 R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean 0.680369 138.3042 6.950929 5.025828 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NBG 8 1851.200732 231.400092 4.79 0.0028 UC CHE 1B O 80DO The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square 48.31541 Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9 Critical Range 11.92 12.51 12.88 13.14 13.32 13.47 13.58 13.66 104 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N NBG A 26.282 3 21B2 B 11.482 3 8B B B 3.834 3 21R2 B B 2.317 3 7B2 B B 1.318 3 23B1 B B 0.000 3 16B B B 0.000 3 23B2 B B 0.000 3 26R1 B B 0.000 3 8R2 Ức chế 1B ở 1000C UC CHE 1B O 100DO The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NBG 9 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 105 Đồ án tốt nghiệp UC CHE 1B O 100DO The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 8 93.5157741 11.6894718 1.08 0.4207 Error 18 195.2819830 10.8489991 Corrected Total 26 288.7977571 R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean 0.323811 238.1836 3.293782 1.382875 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NBG 8 93.51577407 11.68947176 1.08 0.4207 UC CHE 1B O 100DO The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square 10.849 Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9 Critical Range 5.650 5.928 6.104 6.225 6.314 6.381 6.433 6.474 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N NBG A 4.978 3 26R1 A A 4.396 3 8B A A 1.918 3 23B2 A A 0.695 3 8R2 A A 0.300 3 21B2 106 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N NBG A A 0.158 3 16B A A 0.000 3 21R2 A A 0.000 3 23B1 A A 0.000 3 7B2 Ức chế 12R2 ở 00C UC CHE 12R2 O 0DO The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NBG 9 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 UC CHE 12R2 O 0DO The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 8 7.66898483 0.95862310 0.96 0.4927 Error 18 17.89930657 0.99440592 Corrected Total 26 25.56829140 R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean 0.299941 272.5161 0.997199 0.365923 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NBG 8 7.66898483 0.95862310 0.96 0.4927 107 Đồ án tốt nghiệp UC CHE 12R2 O 0DO The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square 0.994406 Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9 Critical Range 1.711 1.795 1.848 1.885 1.912 1.932 1.948 1.960 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N NBG A 1.4085 3 21B2 A A 0.9677 3 23B1 A A 0.9171 3 8B A A 0.0000 3 16B A A 0.0000 3 21R2 A A 0.0000 3 23B2 A A 0.0000 3 7B2 A A 0.0000 3 26R1 A A 0.0000 3 8R2 108 Đồ án tốt nghiệp Ức chế 12R2 ở 800C UC CHE 12R2 O 80DO The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NBG 9 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 UC CHE 12R2 O 80DO The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 8 70.3853638 8.7981705 2.00 0.1051 Error 18 78.9899259 4.3883292 Corrected Total 26 149.3752897 R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean 0.471198 366.9740 2.094834 0.570840 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NBG 8 70.38536383 8.79817048 2.00 0.1051 UC CHE 12R2 O 80DO The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square 4.388329 Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9 Critical Range 3.593 3.770 3.882 3.959 4.016 4.059 4.092 4.117 109 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N NBG A 5.138 3 8B B 0.000 3 16B B B 0.000 3 21R2 B B 0.000 3 21B2 B B 0.000 3 23B2 B B 0.000 3 26R1 B B 0.000 3 7B2 B B 0.000 3 23B1 B B 0.000 3 8R2 Ức chế 12R2 ở 1000C UC CHE 12R2 O 100DO The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NBG 9 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 110 Đồ án tốt nghiệp UC CHE 12R2 O 100DO The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 8 727.633897 90.954237 2.57 0.0459 Error 18 637.074597 35.393033 Corrected Total 26 1364.708495 R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean 0.533179 233.2837 5.949204 2.550202 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NBG 8 727.6338972 90.9542371 2.57 0.0459 UC CHE 12R2 O 100DO The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square 35.39303 Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9 Critical Range 10.20 10.71 11.02 11.24 11.40 11.53 11.62 11.69 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N NBG A 16.117 3 26R1 A B A 6.414 3 23B2 B B 0.421 3 16B B B 0.000 3 23B1 B 111 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N NBG B 0.000 3 21R2 B B 0.000 3 21B2 B B 0.000 3 7B2 B B 0.000 3 8B B B 0.000 3 8R2 Ức chế 30B2 ở 00C UC CHE 30B2 O 0DO The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NBG 9 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 UC CHE 30B2 O 0DO The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 8 16738.71301 2092.33913 8.45 <.0001 Error 18 4458.11878 247.67327 Corrected Total 26 21196.83179 R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean 0.789680 25.04463 15.73764 62.83838 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NBG 8 16738.71301 2092.33913 8.45 <.0001 112 Đồ án tốt nghiệp UC CHE 30B2 O 0DO The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square 247.6733 Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9 Critical Range 27.00 28.32 29.16 29.74 30.17 30.49 30.74 30.93 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N NBG A 92.45 3 8B A B A 85.20 3 21B2 B A B A 84.31 3 21R2 B A B A C 79.78 3 23B1 B A C B A C 66.31 3 7B2 B C B C 60.70 3 8R2 C C 52.73 3 26R1 D 23.69 3 23B2 D D 20.37 3 16B 113 Đồ án tốt nghiệp Ức chế 30B2 ở 800C UC CHE 30B2 O 80DO The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NBG 9 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 UC CHE 30B2 O 80DO The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 8 13200.58602 1650.07325 10.39 <.0001 Error 18 2858.41696 158.80094 Corrected Total 26 16059.00298 R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean 0.822005 20.20968 12.60162 62.35440 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NBG 8 13200.58602 1650.07325 10.39 <.0001 UC CHE 30B2 O 80DO The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square 158.8009 Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9 Critical Range 21.62 22.68 23.35 23.82 24.16 24.41 24.61 24.77 114 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N NBG A 92.10 3 8B A A 89.22 3 23B1 A B A 79.42 3 21B2 B A B A 72.59 3 21R2 B B C 63.36 3 7B2 B C B C D 57.39 3 8R2 C D E C D 46.70 3 26R1 E D E D 35.69 3 16B E E 24.72 3 23B2 Ức chế 30B2 ở 1000C UC CHE 30B2 O 100DO The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NBG 9 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 115 Đồ án tốt nghiệp UC CHE 30B2 O 100DO The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 8 10561.68298 1320.21037 24.13 <.0001 Error 18 985.01321 54.72296 Corrected Total 26 11546.69619 R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean 0.914693 66.35841 7.397497 11.14779 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NBG 8 10561.68298 1320.21037 24.13 <.0001 UC CHE 30B2 O 100DO The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square 54.72296 Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 9 Critical Range 12.69 13.31 13.71 13.98 14.18 14.33 14.45 14.54 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N NBG A 64.243 3 16B B 18.488 3 26R1 B C B 12.146 3 8B C C 4.690 3 23B2 C C 0.764 3 7B2 116 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N NBG C C 0.000 3 21B2 C C 0.000 3 21R2 C C 0.000 3 23B1 C C 0.000 3 8R2 117