Đồ án Định danh vùng gene 16S DNA chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở hồ Dầu Tiếng

p này là do người thực hiện đề tài làm tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM, dưới sự hướng dẫn của TS.Hoàng Quốc Khánh và HVCH.Ngô Đức Duy. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong đồ án này là trung thực, không sao chép từ bất cứ bài báo cáo nào đã được công bố trước đây. Nội dung luận văn có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các tác phẩm, tạp chí khoa học và các trang web theo danh mục tài liệu của đồ án. Nếu sai người thực hiện đề tài xin chịu hoàn toàn trách nhiệm và mọi kỷ luật của khoa và nhà trường đề ra. Sinh viên thực hiện Khưu Văn Quang LỜI CẢM ƠN Trong thời gian làm đồ án tốt nghiệp ở Viện Sinh Học Nhiệt Đới TPHCM, được sự hướng dẫn tận tình của các Thầy Cô, các anh chị và các bạn, em đã hoàn thành tốt bài báo cáo này. Em xin chân thành cảm ơn đến: Thầy Ngô Đức Duy phòng vi sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới TPHCM. đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Thầy Hoàng Quốc Khánh và thầy Nguyễn Hoàng Dũng phòng vi sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới TPHCM đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em làm đồ án tốt nghiệp tại đây, nhiệt tình hướng dẫn và hỗ trợ để em thực hiện tốt đồ án tốt nghiệp. Chị Lê Quỳnh Loan đã luôn bên cạnh giúp đỡ, chia sẽ kiến thức, kinh nghiệm và tất cả các anh chị, các bạn đang nghiên cứu ở phòng Vi Sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM đã nhiệt tình giúp đỡ và chỉ dạy cho em nhiều điều trong suốt quá trình nghiên cứu. Toàn thể các Thầy Cô khoa CNSH-TP-MT trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh là những người đã tận tâm dạy dỗ và truyền đạt kiến thức cho em được ngày hôm nay. Các bạn trong lớp 13SH06 đã quan tâm, giúp đỡ và chia sẽ mọi thứ với tôi trong suốt quãng đường thời sinh viên. Cuối cùng, con xin cảm ơn Ba Mẹ đã nuôi nấng, chăm sóc, dạy dỗ và cho con ăn học thành người có ích cho xã hội. Sinh Viên Thực Hiện Khưu Văn Quang 1 MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC CÁC BẢNG MỞ ĐẦU...1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................ 5 1.1. Tổng quan về tin sinh học ................................................................................ 5 1.1.1. Sự ra đời của tin sinh học ............................................................................. 5 1.1.2. Khái niệm Tin sinh học ................................................................................. 5 1.1.3. Vai trò và xu hướng phát triển của tin sinh học ............................................ 6 1.1.4. Cây phát sinh loài ......................................................................................... 6 1.1.5. Công cụ và cách tiến hành ............................................................................ 7 1.1.6. Đánh giá kết quả ........................................................................................... 8 1.2. Tổng quan về định danh sinh học phân tử ....................................................... 8 1.2.1. Các phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số ................................... 9 1.2.2. Phương pháp PCR và ứng dụng.................................................................. 11 1.3. Tổng quan về vi khuẩn lam ............................................................................ 13 1.3.1. Giới thiệu về vi khuẩn lam ......................................................................... 13 1.3.2. Hình thái và cấu trúc tế bào ........................................................................ 14 1.3.3. Phân loại vi khuẩn lam ............................................................................... 15 1.3.4. Hiện tượng nở hoa của vi khuẩn lam .......................................................... 16 1.3.5. Độc tố microcystins .................................................................................... 17 1.3.6. Hai hợp chất gây mùi hôi geosmin và 2-methylisoborneol ........................ 20 1.3.7. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn lam và độc tố của vi khuẩn lam ........... 21 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 25 2.1. Thời gian và địa điểm ..................................................................................... 25 i 2.2. Vật liệu, thiết bị và hóa chất........................................................................... 25 2.2.1. Dụng cụ và thiết bị ...................................................................................... 25 2.2.2. Nguồn mẫu .................................................................................................. 25 2.2.3. Hóa chất ...................................................................................................... 25 2.3. Phương pháp thu mẫu .................................................................................... 27 2.3.1. Phương pháp phân lập ................................................................................ 27 2.3.2. Phương pháp nuôi tăng sinh khối và thu sinh khối vi khuẩn lam ............... 27 2.3.3. Định danh chủng vi khuẩn lam bằng sinh học phân tử............................... 28 Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR: .............................................. 32 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ...................................................... 35 3.1. Kết quả ly trích và thu nhận DNA bộ gene của hình thái vi khuẩn lam ........ 35 3.2. Kết quả đo nồng độ DNA bộ gene sau khi ly trích và thu nhận .................... 36 3.3. Kết quả khuếch đại đoạn gen 16S DNA bằng kỹ thuật PCR ......................... 37 3.3.1. PCR với cặp mồi CYA371F, 373R ............................................................ 37 3.3.2. PCR với cặp mồi CYA-F, CYA-R ............................................................. 38 3.4. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn lam ..................... 39 3.5. Kết quả giải trình tự vùng gen 16S DNA của các chủng vi khuẩn lam ......... 39 3.5.1. Mẫu 2 (chủng Microsystis) ......................................................................... 39 3.5.2. Mẫu 10 (chủng Anabaena) .......................................................................... 40 3.5.3. Mẫu 29 (chủng Cylindropermopsis) ........................................................... 40 3.5.4. Mẫu 31(chủng plantothrix) ......................................................................... 41 3.6. Kết quả so sánh trình tự gen trên ngân hàng NCBI và xây dựng cây phát sinh loài ......................................................................................................................... 41 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................... 44 4.1. Kết luận .......................................................................................................... 44 4.2. Đề nghị ........................................................................................................... 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 46 PHỤ LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DNA Deoxyribo Nucleic Axit RNA Ribonucleic Acid EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase chain reaction UV Ultraviolet TAE Tris acetate ethylenediaminetetraacetic acid MCs Microcystins MIB Methylisoborneol ITB Institute of Tropical Biology CTAB Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide Cs Cộng sự SDS Sodium dodecyl sulfate Bp Base pairs UV Ultra violet iii DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Vi khuẩn lam nở hoa ở Hồ Dầu Tiếng ........................................... ..........17 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của 3 loại độc tố microcystins thường gặp ................... 18 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của Geosmin và 2-methylisoborneol MIB .................... 21 Hình 2.1. Sinh khối vi khuẩn lam ............................................................................. 28 Hình 2.2. Quy trình phản ứng PCR ........................................................................... 31 Hình 3.1. Kết quả thu nhận DNA bộ gene của vi khuẩn lam gồm 4 chủng trên gel agarose 1,5 ................................................................................................................. 35 Hình 3.2. Kết quả điện di trên gel agarose của các sản phẩm PCR với cặp mồi CYA371F, 373R ....................................................................................................... 37 Hình 3.3. Kết quả điện di trên gel agarose của các sản phẩm PCR với cặp mồi CYA-F, CYA-R ........................................................................................................ 38 Hình 3.4. Kết quả điện di trên gel agarose của các chủng vi khuẩn lam sau khi tinh sạch ............................................................................................................................ 39 Hình 3.5. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gene 16S DNA của các chủng Microcystis, Anabaena, Plantothrix, Cylindropermopsis với vi khuẩn lam trên ngân hàng NCBI....42 iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Chu trình nhiệt của cặp mồi CYA371F và 373R ................................... 32 Bảng 2.2.Chu trình nhiệt của cặp mồi CYA-F và CYA-R ..................................... 33 Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ DNA bộ gene sau thu nhận .................................... 36 v Đồ Án Tốt Nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Việc gia tăng dân số, phát triển các ngành công nghiệp, nông nghiệp đã và đang làm gia tăng nguồn dinh dưỡng (chủ yếu là ni tơ và phốt pho) đáng kể vào các thủy vực. Ô nhiễm dinh dưỡng diễn ra ngày càng quan trọng tại các thủy vực như sông, hồ, đầm nuôi trồng thủy sản...luôn đi kèm với hiện tượng nở hoa nước mà thực chất là sự phát triển mạnh mẽ của quần xã thực vật nổi trong đó chủ yếu do vi khuẩn lam (VKL). Vi khuẩn lam là một trong những sinh vật xuất hiện đầu tiên trên trái đất cách đây hàng tỷ năm và tồn tại cho đến ngày nay. Cùng với vi tảo, vi khuẩn lam đóng một vai trò quan trọng trong sinh thái thủy vực như cung cấp nguồn năng lượng sơ cấp cho các chuỗi thức ăn trong thủy vực, đồng thời giải phóng một lượng oxy vào không khí thông qua quá trình quang hợp. Tuy nhiên, bên cạnh những đóng góp tích cực thì hiện tượng tăng trưởng bùng phát hay còn gọi là nở hoa của vi khuẩn lam gây nhiều ảnh hưởng xấu lên chất lượng môi trường nước, tài nguyên thủy sản và cân bằng hệ sinh thái. Trong đó một số loài nhóm vi sinh này có khả năng sản sinh độc tố. Ở nước ta, vi khuẩn lam sinh độc và độc tố của chúng thường xuất hiện trong các thủy vực nước ngọt. Chúng có khả năng sản sinh ra các loại độc tố như neurotoxin (độc tố thần kinh) và hepatotoxin (độc tố gan). Độc tố nhóm vi sinh này tác động nguy hiểm tới sinh vật thủy sinh và sức khỏe con người. Do đó Tổ chức Y tế thế giới (WHO) quy định nồng độ giới hạn trong nước uống không được vượt quá là 1 µg/L. Ngoài ra một số chủng này còn sinh ra các hợp chất gây mùi hôi trong nước. Ở Việt Nam ô nhiễm môi trường nước mà chủ yếu là ô nhiễm chất hữu cơ, chất dinh dưỡng, kéo theo bùng nổ thực vật nổi, trong đó có tảo độc đang diễn ra rất phổ biến do tác động của các hoạt động con người trong các lưu vực sông, hồ....Tại các hồ như hồ Ba Bể, hồ Tây, hồ hoàn Kiếm, hồ Dầu Tiếng, hồ Trị An, hồ Núi Cốc... 1 Đồ Án Tốt Nghiệp đều quan sát thấy sự hiện diện của vi khuẩn lam độc chủ yếu là các loài thuộc Microcystis, Anabaena, Plantothrix, Cylindropermopsis... Hồ Dầu Tiếng là hồ chứa nước nhân tạo có chức năng như ngăn lũ, cấp nước sinh hoạt, tưới tiêu, rửa mặn, cải thiện chất lượng nước và nuôi trồng thủy sản. Là nguồn cung cấp trực tiếp hoặc gián tiếp nước sinh hoạt và tưới tiêu cho hàng triệu dân ở Tây Ninh, Bình Dương và TP.Hồ Chí Minh. Hiện nay, các nghiên cứu đã cho thấy thành phần vi khuẩn lam tại hồ Dầu Tiếng rất đa dạng và hiện tượng nở hoa tại đây đang là một vấn đề quan trọng và mang tính cấp bách. Vi khuẩn lam nở hoa và độc tố của chúng sinh ra sẽ gây ảnh hưởng rất lớn tới sinh vật thủy sinh, động vật sống xung quanh hồ và sức khỏe con người. Phần lớn các nghiên cứu ở nước ta hiện nay chỉ tập trung vào đánh giá sự đa dạng của nhóm vi sinh này tại các thủy vực, đặc điểm hình thái cũng như chỉ nghiên cứu độc tính trên thực vật hoặc động vật thủy sinh. Chưa có nhiều nghiên cứu tập trung về định danh vùng gene 16S DNA chủng vi khuẩn lam. Và đây là đề tài khảo sát về sự hiện diện của các chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở hồ Dầu Tiếng hiện nay. 2. Mục đích nghiên cứu Mục đích của đề tài là định danh vùng gene 16S DNA chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở Hồ Dầu Tiếng. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập một số loài vi khuẩn lam tại hồ Dầu Tiếng. Định danh vi khuẩn lam tới chi dựa theo hình thái học và sinh học phân tử. Khảo sát sự hiện diện có mặt chủ yếu của loài vi khuẩn lam ở hồ Dầu Tiếng. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu Phương pháp thu mẫu, phân lập mẫu và nuôi tăng sinh khối, thu sinh khối vi khuẩn lam. 2 Đồ Án Tốt Nghiệp Phương pháp tách chiết và thu nhận bộ gene DNA (theo phương pháp CTAB). Phương pháp PCR dựa trên đoạn mồi 16S DNA. Sử dụng phương pháp sinh học phân tử giải trình tự đoạn gene 16S DNA loài vi khuẩn lam. Đề tài có sử dụng các phần mềm như ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview 4.32.0.0. Ngân hàng gene https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Các tài liệu phục vụ nghiên cứu được tham khảo từ các nghiên cứu, các bài báo khoa học, các luận văn khoa học được sưu tầm trên internet. 5. Các kết quả đạt đƣợc Sau quá trình nghiên cứu đề tài đã tách chiết được 4 chủng vi khuẩn lam dựa vào các bước định danh sinh học phân tử, dựa trên các nghiên cứu trong và ngoài nước thì cả 4 loài vi khuẩn lam này đều có khả năng gây bệnh nguy hiểm trên thực vật, động vật nguyên sinh và cả con người. Và đã chọn lọc được đoạn mồi thích hợp để định danh 4 chủng vi khuẩn lam là Microcystis, Anabaena, Plantothrix, Cylindropermopsis. 6. Kết cấu đề tài Đề tài gồm 4 chương Chương 1: Tổng quan Trình bày về sự ra đời, khái niệm, vai trò và xu hướng phát triển của tin sinh học để dựng cây phát sinh loài. Giới thiệu về kỹ thuật PCR và các ứng dụng chủ yếu của PCR để sử dụng trong định danh vi khuẩn lam. Giới thiệu tổng quan về vi khuẩn lam, hình thái, cấu trúc tế bào, phân loại và hiện tượng nở hoa của loài vi khuẩn lam, tình hình nghiên cứu vi khuẩn lam trong và ngoài nước. Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3 Đồ Án Tốt Nghiệp Trình bày thời gian và địa điểm thu mẫu, những hóa chất, máy móc thiết bị phục vụ nghiên cứu và toàn bộ các quy trình, thao tác thực hiện các phương pháp nghiên cứu như thu mẫu, phân lập, nuôi tăng sinh khối, thu sinh khối, định danh, phương pháp ly trích DNA, đo OD, điện di, tinh sạch DNA và giải trình tự gene. Chương 3: Kết quả và biện luận Trình bày và biện luận những kết quả chi tiết của toàn bộ quá trình thực hiện nghiên cứu. Chương 4: Kết luận và đề nghị Tổng kết lại những kết quả nghiên cứu đã đạt được và đưa ra những đề nghị liên quan nhằm hoàn thiện đề tài. 4 Đồ Án Tốt Nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về tin sinh học 1.1.1. Sự ra đời của tin sinh học Do sự xuất hiện của các thông tin về cấu trúc, chức năng và trình tự protein, DNA từ đó dẫn tới nhu cầu quản lý, so sánh và dự đoán cấu trúc và chức năng của chúng. Ngoài ra, sự phát triển của các ngành khoa học khác như là công nghệ thông tin, máy tính đã hình thành môn khoa học mới đó là Tin sinh học (bioinformatics). 1.1.2. Khái niệm Tin sinh học Tin sinh học (bioinformatics) là môn học về cách sử dụng máy tính để giải quyết những vấn đề của khoa học sự sống, chủ yếu là vấn đề cơ sở dữ liệu phong phú của bộ gen, trình tự protein Tin sinh học (bioinformatics) là một lĩnh vực khoa học sử dụng các công nghệ của các ngành toán học ứng dụng, tin học, thống kê, khoa học máy tính, trí tuệ nhân tạo, hóa học và hóa sinh (biochemistry) để giải quyết các vấn đề sinh học. Một thuật ngữ thường được dùng thay thế cho tin sinh học là sinh học tính toán (computational biology). Tuy nhiên, tin sinh học thiên về việc phát triển các giải thuật, lý thuyết và các kĩ thuật thống kê và tính toán để giải quyết các bài toán bắt nguồn từ nhu cầu quản lý và phân tích dữ liệu sinh học. Trong khi đó, sinh học tính toán thiên về kiểm định các giả thuyết (hypothesis) được đặt ra của một vấn đề trong sinh học nhờ máy tính thực nghiệm trên dữ liệu mô phỏng, với mục đích chính là phát hiện và nâng cao tri thức về sinh học (ví dụ: dự đoán mối quan hệ tương tác giữa các protein, dự đoán cấu trúc bậc 2 phân tử của protein, v.v.). Ngoài ra nó còn giải quyết những vấn đề về kỹ thuật như mô hình cấu trúc ba chiều của phân tử và các hệ thống sinh học. 5 Đồ Án Tốt Nghiệp Các ngành của Tin sinh học bao gồm: tin sinh học genome, tin sinh học protein, tin sinh học tiến hóa, tin sinh học nông nghiệp, tin sinh học y học, phát triển các công cụ và cơ sở nền. Thuật ngữ bioinformatics có thể định nghĩa một cách ngắn gọn là sự kết hợp giữa công nghệ sinh học và công nghệ thông tin với mục tiêu giúp hiểu biết và khám phá những nguyên lý trong sinh học (National Center for Biotechnology Information). 1.1.3. Vai trò và xu hướng phát triển của tin sinh học 1.1.3.1. Vai trò của Tin sinh học - Tập hợp, lưu trữ, sắp xếp, truy xuất cơ sở dữ liệu. - Hỗ trợ cho việc tìm kiếm, phân tích, xử lý và dự đoán các kết quả nghiên cứu. - Hỗ trợ trong các nghiêm cứu về cấu trúc không gian phân tử. - Hỗ trợ trong nghiên cứu đa dạng và tiến hóa của sinh vật 1.1.3.2. Xu hướng phát triển của Tin sinh học Những lĩnh vực của Tin sinh học đang được tập trung nghiên cứu: + Quản lí cơ sở dữ liệu. + Phân tích, biên dịch dữ liệu. + Phát triển các thuật toán. + Các cấu trúc cơ sở dữ liệu. + Thiết kế các giao diện và hiển thị. 1.1.4. Cây phát sinh loài Cây phát sinh loài là (tiếng Anh: phylogenic tree) miêu tả lịch sử tiến hóa của một nhóm các loài (species) với những đặc tính khác nhau nhưng cùng có mối quan hệ họ hàng với nhau và cùng hình thành từ một tổ tiên chung trong quá khứ. Có nhiều hướng nghiên cứu khác nhau để chứng minh đặc điểm phát sinh chủng loại này. Trước hết, người ta có thể so sánh trình tự các đoạn DNA (thuộc sinh học phân 6 Đồ Án Tốt Nghiệp tử hay hệ gene học (genomics); hoặc so sánh các hóa thạch (fossil) hoặc các di chỉ (record) của cổ sinh vật học (thuộc khảo cổ học - paleontology). Các nhà sinh học tổ chức và phân tích các mối quan hệ tiến hóa thông qua các phương pháp khác nhau, bao gồm phát sinh chủng loài học (phylogenetics), ngoại hình học (phenetics) và miêu tả theo nhánh học (cladistics). Các sự kiện chính xảy ra trong quá trình tiến hóa của sự sống được xây dựng thành biểu đồ thời gian của tiến hóa (evolutionary timeline) dựa trên các hiểu biết hiện nay của khoa học. Chúng ta có thể tạo cây phát sinh loài từ các trình tự đoạn gene có được so sánh với những trình tự trong ngân hàng dữ liệu gene bằng cách sử dụng chương trình BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) cho kết quả những loài nào có số trình tự tương đồng cao nhất với chủng đang khảo sát. Sau đó sử dụng các phần mềm tin sinh học như ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview 4.32.0.0 để xây dựng cây phát sinh loài, tập hợp những thông tin có liên quan đến tiến hóa. Một cây phát sinh loài gồm các thành phần sau: - Một nhánh (một đơn vị huyết thống) là một nhóm vi sinh vật hay nhóm gene bắt nguồn từ tổ tiên chung. Trong phân tích cây phát sinh loài, chiều dài nhánh phát sinh diễn tả mức độ phân hóa giữa các loài. - Nút giao điểm của các nhánh. - Hệ thống phát sinh loài dựa trên các phân tử mà đặc biệt là trình tự gene được sử dụng phổ biến trong định danh phân loại. 1.1.5. Công cụ và cách tiến hành Seaview 4 là một phần mềm (giao diện Windows) dùng để so sánh tương đồng nhiều trình tự DNA và protein. Nó mô tả kết quả bằng hệ thống các màu sắc và làm nổi bậc những nét đặc trưng trong những đoạn tương đồng. MEGA5 5.0.1.120 là một phần mềm dùng để vẽ cây phát sinh loài. Phần mềm này thực hiện đọc kết quả so sánh từ những tập tin dạng PHYLIP hoặc MEGA của chương trình seaview 4.32.0.0. 7 Đồ Án Tốt Nghiệp Mở chương trình seaview 4 trên desktop.  Lựa chọn chức năng Multiple Alignment Mode.  Từ menu File, chọn Load Sequences. Trong hộp Open, chọn các tập tin chứa các trình tự cần so sánh. Nhấn nút Open.  Chọn Do Complete Alignment trong Menu Alignment. Xác định vị trí cho tập tin xuất rồi nhấn nút Align. 1.1.6. Đánh giá kết quả Kết quả xuất hiện các trình tự so sánh tương đồng. Các vị trí trình tự giống nhau sẽ được thể hiện cùng một màu sắc (mỗi loại nucleotide một màu) và được đánh dấu *. Vị trí giống nhau. Ta có thể nhận xét mức độ tương đồng của các trình tự thông qua sự tương đồng về màu sắc và dạng đồ thị bên dưới. Để tạo cây phát sinh loài dạng PHYLIP chúng ta cần thực hiện các bước: + Trong menu Trees, chọn chức năng Draw N-J Trees. + Trong hộp DRAW TREE ta chọn nút OK để lưu tập tin dạng *.ph + Mở chương trình Tree View trên desktop. Từ menu File, chọn Open. + Trong hộp Open chọn tập tin *.ph và File of type là All tree files. Một trang kết quả cây phát sinh loài bằng cách nhấn vào các nút Phylogram, Rectanglar Cladogram, Cladogram, Radial tree. 1.2. Tổng quan về định danh sinh học phân tử Có nhiều cách để định danh sinh học phân tử như: PCR, southern blotting, northern blotting, western blotting, immunohistochemistry, microarray nhưng phương pháp chủ yếu định danh đối với loài vi khuẩn lam là PCR. 8 Đồ Án Tốt Nghiệp 1.2.1. Các phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số 1.2.1.1. Nguyên tắc và yêu cầu Ly trích và thu nhận DNA tổng số là nhu cầu cần thiết bởi các thực nghiệm của công nghệ gene đều tiến hành với DNA (hay RNA). Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lượng nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. DNA là phân tử có kích thước lớn, do đó mối quan tâm hàng đầu của các kĩ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ). Các nucleic acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (desoxyribonuclease - DNase và ribonuclease - RNase). 1.2.1.2. Một số phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng, mức độ đa dạng của vi sinh vật thay đổi theo từng môi trường. Những vi sinh vật tìm thấy thường là những tế bào đơn hoặc là những quần thể vi sinh vật. Sự phức tạp tính di truyền của cộng đồng vi sinh vật được đánh giá thông qua việc xác định bởi sự tổ hợp DNA, chưa kể sự có mặt của những bộ gene hiếm và những vi sinh vật chưa được khám phá. Sự ra đời của kỹ thuật dựa trên phân tử acid nucleic đã dẫn tới sự thay đổi lớn trong việc phát hiện vi sinh vật trong môi trường tự nhiên. Với những kỹ thuật này đã phát hiện một số thay đổi lớn về việc tìm hiểu cấu trúc và sự vận động của các vi sinh vật cộng đồng trong môi trường tự nhiên. Ly trích DNA thường bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như không ly trích hoàn toàn tế bào vi khuẩn hoặc DNA bị hư hỏng. Rõ ràng việc áp dụng một quy trình ly trích DNA phù hợp với các mẫu cụ thể là rất cần thiết cho việc đánh giá đúng đa dạng vi sinh vật. Phương pháp ly trích DNA cần 9 Đồ Án Tốt Nghiệp phải đơn giản, nhanh chóng và hiệu quả. Chất lượng DNA là rất quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả khuếch đại DNA về sau. Do đó ly trích DNA được coi như một bước phân tích độc lập trong phân tích đa dạng vi sinh vật. Việc ly trích thường kết hợp với các chất tẩy, các tác nhân vật lý, các dung môi và enzyme để thu được nucleic acid (Haruta và cộng sự (2002); Tomoyukihori và cộng sự (2006). Do đó, việc tách chiết DNA vi sinh vật để phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng là rất cần thiết. Quá trình ly trích DNA cần phải đảm bảo về độ tinh khiết và độ nguyên vẹn về cấu trúc để có thể thực hiện được các khâu nghiên cứu tiếp theo. Có rất nhiều phương pháp ly trích DNA tổng số, tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà lựa chọn các phương pháp ly trích DNA tổng số cho phù hợp. Những phương pháp ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên thường được sử dụng: - Phương pháp Sodium Dodecyl Sulfate (SDS): Được xem là phương pháp thích hợp nhất, đơn giản và nhanh chóng thu nhận DNA của vi sinh vật với hiệu quả cao, phục vụ cho quá trình PCR tiếp theo. J Zhou và cộng sự (1996) đã sử dụng phương pháp ly trích với nồng độ muối cao (1,5 M NaCl) và ủ mẫu trong 2 - 3 giờ trong sự hiện diện của SDS, hexadecyl trimethyl ammonium bromide, và proteinase K. - Phương pháp Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide (CTAB): Đây là phương pháp dùng trong chiết xuất acid nucleic có hiệu quả cao, CTAB là một dung môi có khả năng hòa tan cao acid nucleic, vì vậy mà CTAB được dùng với vai trò là chất chính trong tách chiết acid nucleic. Ly trích DNA của vi khuẩn sử dụng phương pháp CTAB được mô tả bởi Ausubel và cộng sự (1992). Ly trích DNA cần phải có cả hai yếu tố là hiệu suất và độ tinh khiết. Trong nghiên cứu của Jara C. (2008), phương pháp ly trích tốt nhất là phương pháp CTAB. - Phương pháp Benzyl chloride: Đây là phương pháp ly trích DNA tương đối hiệu quả. Nó có thể phá vỡ thành tế bào vi khuẩn kết hợp với việc gia 10 Đồ Án Tốt Nghiệp nhiệt đến 650C. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, nhanh chóng và mang lại kết quả khá cao. Phương pháp này được Zhu và cộng sự (1993) sử dụng để ly trích DNA của cả thực vật, nấm và vi khuẩn. - Phương pháp đóng băng và tan băng: Là phương pháp do Ellingsue và cộng sự (2002). Phương pháp này sử dụng kỹ thuật đóng băng và tan băng ở - 65oC trong ba chu kỳ nhằm ức chế phá vỡ vách tế bào, giải phóng các thành phần bên trong tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho việc ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên. 1.2.2. Phương pháp PCR và ứng dụng 1.2.2.1. Kỹ thuật PCR Phương pháp PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh (1985) tạo nên bước tiến nhảy vọt trong sinh học phân tử và kỹ thuật gene. Đây là một kĩ thuật sinh hóa và sinh học phân tử hiện đại cho sự khuếch đại nhanh đoạn DNA thông qua con đường sao chép của enzyme bên ngoài sinh vật sống. Hiện nay, PCR đã trở thành một kĩ thuật thông dụng được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm sinh học và y dược để phát hiện các bệnh di truyền, tạo ra các đột biến gene, chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm, tạo dòng gene. PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao mà không qua tạo dòng, nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược. 11 Đồ Án Tốt Nghiệp Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới. Mồi xuôi (forward primer): Bắt cặp với mạch khuôn DNA và kéo dài theo chiều phiên mã. Mồi ngược (reverse primer): Bắt cặp mạch mã của DNA và kéo dài ngược chiều phiên mã. Thành phần cơ bản của phản ứng PCR gồm có: DNA mẫu, mồi xuôi, mồi ngược, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR buffer, MgCl2, Taq polymerase. 1.2.2.2. Các ứng dụng chủ yếu của PCR Có thể nói sinh học hiện đại nói chung, sinh học phân tử nói riêng không thể thiếu ứng dụng của kỹ thuật PCR. Trong kỹ thuật gene, PCR sử dụng thường xuyên trong tách dòng gene, xây dựng ngân hàng gene, lập bản đồ gene và giải trình tự bộ gene. PCR được dùng trong chẩn đoán bệnh do virus, vi khuẩn và các đột biến di truyền. PCR được dùng để tạo đột biến invitro, trong công nghệ protein tái tổ hợp, tạo ra nhiều protein có tính năng vượt trội mà trong tự nhiên chưa hề có. Nghiên cứu nguồn gốc phát sinh loài và phân loại phân tử. 1.2.2.3. Đoạn gene 16S rDNA Gene rDNA (ribosomal DNA) là nhóm gene mã hóa RNA của ribosome, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát. rDNA được quan tâm nghiên cứu vì nó là một gene có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho bất kì protein nào. Các bản sao của gene nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa. Hơn nữa, ribosome hầu như tồn tại ở mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa. Phần lớn phân tử rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ 12 Đồ Án Tốt Nghiệp sở để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau. Các primer thiết kế dựa trên những oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh. Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng được thiết kế dựa trên các vùng trình tự ...tối ưu 70 - 74oC, trong hầu hết trường hợp nhiệt độ thường được dùng là 72oC. Nối hydrogen giữa đoạn mồi và DNA khuôn phải đủ bền để chịu đựng được nhiệt độ cao. Mồi đã lai với vùng DNA có nhiều base sai sẽ bị tách ra từ khuôn mẫu và không được kéo dài. Thời gian kéo dài phụ thuộc vào DNA polymerase được sử dụng và chiều dài đoạn DNA mục tiêu cần được khuếch đại. Bước kéo dài cuối cùng kéo dài khoảng 5 - 15 phút (phụ thuộc vào chiều dài mỗi đoạn DNA mẫu), chu kì cuối cùng này được dùng để chắc chắn phần còn lại của chuỗi DNA có thể được kéo dài hoàn toàn. Hình 2.2. Quy trình phản ứng PCR. 31 Đồ Án Tốt Nghiệp Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR:  Cặp mồi CYA371F và 373R Thành phần: Tổng 25 μL gồm: 12.5 μL Master mix, 1 μL primer F, 1 μL primer R, 1-2 μL DNA mẫu, 8,5 - 9,5 μL H2O. Chu trình nhiệt được thiết lập theo phương pháp của Savichtcheva (2011) như mô tả ở bảng 2.1 Bảng 2.1. Chu trình nhiệt của cặp mồi CYA371F và 373R Chu kỳ lặp lại Nhiệt độ Thời gian 1 94°C 5 phút 94°C 1 phút 30 60°C 1 phút 72°C 1 phút 1 72°C 7 phút  Cặp mồi CYA-F và CYA-R Thành phần: Tổng 25 μL gồm: 12.5 μL Master mix, 1 μL primer F, 1 μL primer R, 1-2 μL DNA mẫu, 8.5-9.5 μL H2O. Chu trình nhiệt được thiết lập theo phương pháp của Pham và cộng sự (2015) như mô tả ở bảng 2.2 32 Đồ Án Tốt Nghiệp Bảng 2.2. Chu trình nhiệt của cặp mồi CYA-F và CYA-R Chu kỳ lặp lại Nhiệt độ Thời gian 1 95°C 10 phút 94°C 30 giây 30 60°C 1 phút 72°C 1 phút 1 72°C 7 phút 2.3.3.4. Tinh sạch sản phẩm PCR Trước khi giải trình tự đoạn gen đã được khuếch đại, ta phải tinh sạch mẫu nhằm loại bỏ các tạp chất còn lại trong lúc thực hiện phản ứng PCR và các bước thực hiện như sau: Bước 1: Lấy eppendorf có chứa DNA mẫu (mẫu đã PCR và điện di) cho buffer PB vào (tỷ lệ 1:5). Bước 2: Sau đó vortex, short spring. Nếu có màu cam hoặc tím ta cho vào 10 μL 3M sodium acetate pH 5.0 để chuyển sang màu vàng nhạt, còn nếu có màu vàng nhạt thì không cần thêm. Bước 3: Cho dung dịch ở bước 1 vào cột QIA, sau đó ly tâm lạnh 13000 vòng/1 phút, hút bỏ dịch dưới đáy giữ lại cột. Bước 4: Thêm 700-750 μL buffer PE vào cột QIA. Bước 5: Ly tâm lạnh 13000 vòng/1 phút, bỏ dịch thu cột. Bước 6: Tiếp tục ly tâm lạnh 13000 vòng/1 phút, sau đó bỏ dịch giữ lại cột. Bước 7: Lấy cột cho vào eppendorf mới, cho vào 30 μL O vào cột QIA. 33 Đồ Án Tốt Nghiệp Bước 8: Để khoảng 10 phút. Bước 9: Đem đi ly tâm lạnh 13000 vòng/1 phút, thu được DNA tinh sạch. 2.3.3.5. Xử lý kết quả giải trình tự vùng gene 16S DNA Mẫu sau khi tinh sạch, điện di trên gel agarose xem kết quả thì được gửi mẫu qua công ty Nam Khoa, địa chỉ 793/58 Trần Xuân Soạn, phường Tân Hưng, Quận 7 – Thành Phố Hồ Chí Minh để giải trình tự. Sau khi giải trình tự thì kết quả sẽ được gửi về và được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng như ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview 4.32.0.0 và Ngân hàng gene https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ để định danh loài và xây dựng cây phát sinh loài. 34 Đồ Án Tốt Nghiệp 3 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Kết quả ly trích và thu nhận DNA bộ gene của hình thái vi khuẩn lam Chủng vi khuẩn lam sau khi phân lập được quan sát trên kính hiển vi quang học. Phân loại vi sinh vật này dựa trên cơ sở hình thái học theo hệ thống phân loại của Dương Đức Tiến (1996), Komárek và Anagnostidis (1999; 2005), Cronberg (2006) và từ khoảng 30 mẫu đã qua sơ bộ xác định hình thái học, trong nghiên cứu này chọn ra 4 loài đại diện cho loài sau: 2: Microsystis, 10: Anabaena, 29: Cylindropermopsis, 31: Plantothrix. Sau khi phân loại, tiến hành tách chiết và thu nhận DNA của 4 chủng. Kết quả thu nhận được thể hiện trong hình 3.1. 2 10 29 31 Hình 3.1. Kết quả thu nhận DNA bộ gene của vi khuẩn lam gồm 4 chủng trên gel agarose 1,5%. (2: Microsystis, 10: Anabaena, 29: Cylindropermopsis và 31: Plantothrix). Dựa vào hình 3.1, cho thấy kết quả tách chiết và thu nhận DNA của 4 chủng Cylindropermopsis, Plantothrix, Microsystis và Anabaena khá tốt. Kết quả ly trích trên có thể dùng cho phản ứng nhân bản vùng gene định loại loài. 35 Đồ Án Tốt Nghiệp 3.2. Kết quả đo nồng độ DNA bộ gene sau khi ly trích và thu nhận Mẫu số 2, 10, 29 và 31 được pha loãng và đo nồng độ DNA, kết quả được thể hiện trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ DNA bộ gene sau thu nhận Mẫu 2 1,429 0,724 1,974 10 1,358 0,729 1,863 29 1,017 0,508 2,002 31 2,003 1,188 1,686 Tỷ lệ đo nằm trong khoảng 1,7-2,0 là có độ tinh khiết tốt nhất. Kết quả đo nồng độ DNA: = 1,429 x 50 x 10 = 714,5 ng/ml = 1,358 x 50 x 10 = 679,0 ng/ml = 1,017 x 50 x 10 = 508,5 ng/ml = 2,003 x 50 x 10 = 1001,5 ng/ml Qua kết quả từ bảng 3.1 cho thấy nồng độ DNA trong mẫu 2, 10, 29, 31 thu được là cao. Tỷ lệ 260nm/280nm của mẫu 2 và 10 lần lượt là 1,974 và 1,863 nằm trong khoảng 1,7-2,0 chứng tỏ lượng DNA thu được có độ tinh sạch tốt. Mẫu 29 và 31 có tỷ lệ là 2,002 và 1,686 chênh lệch không quá cao so với khoảng 1,7-2,0 chứng tỏ lượng DNA thu được khá sạch. 36 Đồ Án Tốt Nghiệp 3.3. Kết quả khuếch đại đoạn gene 16S DNA bằng kỹ thuật PCR 3.3.1. PCR với cặp mồi CYA371F, 373R 10 29 T 2 31 Hình 3.2. Kết quả điện di trên gel agarose của các sản phẩm PCR với cặp mồi CYA371F, 373R (2: Microsystis, 10: Anabaena, 29: Cylindropermopsis và 31: Plantothrix ). Dựa vào hình 3.2 sau khi khuếch đại đoạn gene 16S DNA của 4 mẫu (2, 10, 29 và 31) bằng phương pháp PCR với cặp mồi CYA371F, 373R. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy 2 mẫu số 2 và 31 cho kết quả dương tính, mẫu số 10 và 29 cho kết quả âm tính, điều này cho thấy cặp mồi CYA371F, 373R là cặp mồi có độ nhạy cao hơn khi sử dụng nhân bản đoạn gene cho 2 chủng Microsystis và Plantothrix, kết quả này phù hợp với công bố kết quả nghiên cứu của Savichtcheva và cộng sự với kích thước khoảng 1500 bp (Savichtcheva và công sự, 2011). Từ kết quả khuếch đại đoạn gene 16S DNA chứng tỏ rằng đoạn mồi CYA371F, 373R thích hợp để khuếch đại đoạn gene đối với chủng Microsystis và Plantothrix. 37 Đồ Án Tốt Nghiệp 3.3.2. PCR với cặp mồi CYA-F, CYA-R T 10 29 2 31 Hình 3.3. Kết quả điện di trên gel agarose của các sản phẩm PCR với cặp mồi CYA-F, CYA-R (2: Microsystis, 10: Anabaena, 29: Cylindropermopsis và 31: Plantothrix ). Theo hình 3.3 trong nghiên cứu này cho thấy rằng sau khi khếch đại đoạn gene 16S DNA của 4 mẫu (2, 10, 29, 31) bằng phương pháp PCR với cặp mồi CYA-F, CYA-R. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy cả 4 mẫu đều dương tính, điều này cho thấy cặp mồi CYA-F, CYA-R là cặp mồi được sử dụng để khuếch đại một đoạn 1200 bp của đoạn gene 16S DNA phổ biến cho hầu hết các chủng vi khuẩn lam theo công bố kết quả nghiên cứu (Urbach và cộng sự, 1992; Hotto và cộng sự, 2005; Pham và cộng sự, 2015). Từ kết quả khuếch đại đoạn gene 16S DNA chứng tỏ rằng đoạn mồi CYA-F, CYA-R thích hợp để khuếch đại đoạn gene đối với hầu hết các chủng vi khuẩn lam, nhưng so về độ nhạy thì chủng Microsystis, Anabaena, Cylindropermopsis nhạy hơn so với chủng Plantothrix. 38 Đồ Án Tốt Nghiệp 3.4. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn lam 2 10 29 31 1500 1000 Hình 3.4. Kết quả điện di trên gel agarose của các chủng vi khuẩn lam sau khi tinh sạch (2: Microsystis, 10: Anabaena, 29: Cylindropermopsis và 31: Plantothrix ). Theo hình 3.4 cho thấy kết quả tinh sạch DNA của các chủng vi khuẩn lam khá tốt. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với công bố kết quả nghiên cứu của (Urbach và ctv, 1992; Hotto và ctv, 2005; Pham và ctv, 2015) và (Savichtcheva và ctv, 2011). 3.5. Kết quả giải trình tự vùng gene 16S DNA của các chủng vi khuẩn lam 3.5.1. Mẫu 2 (chủng Microsystis) TCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTCAGCCAAGTCTGCCGTCAAATCA GGTTGCTTAACGACCTAAAGGCGGTGGAAACTGGCAGACTAGAGATCAGTAGGGGTAG CAGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTGGGAAGAACATCGGTGGCGA AAGCGTGCTACTGGGCTGTATCTGACACTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAAAGGG ATTAGATACCCCTGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGA CCCGAGCCGTGCCGAAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAG TGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAAT TCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGACTTGACATGTCGCGAACCCTGGTGAAAGC TAGGGGTGCCTTCGGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTC 39 Đồ Án Tốt Nghiệp GTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTTAGTTGCCAGCATT AAGTTGGGGACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACG TCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCTTGGGCGACACACGTACTACAATGGTCGGGACAAA GGGCAGCGAACTCGCGAG 3.5.2. Mẫu 10 (chủng Anabaena) GGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCG CGTGAGGGAGGAAGGCTCTTGGGTTGTAAACCTCTTTTCTCAGGGAAGAAAAAAATG ACGGTACCTGAGGAATAAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGG AGGATGCAAGCGTTATCCGGAATGATTGGGCGTAAAGGGTCCGCAGGTGGCATTGAA AGTCTGCTGTTAAAGAGTTTGGCTCAACCAAATAAAAGCAGTGGAAACTACAAAGCT AGAGTTTGGTCGGGGCAGAGGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCA GGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGCTCTGCTAGGCCGAGACTGACACTGAGGGACG AAAGCTAGGGGAGCGAATGGGATTAGATACCCCAGTAGTCCTAGCCGTAAACGATG GATACTAGGCGTAGCTCGTATCGACCCGAGCTGTGCCGGAGCTAACGCGTTAAGTAT CCCGCCTGGGGAGTACGCAGGCAACTGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCG CACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGC TTGACATGTCACGAATTCTGTGGAAACATAGGAGTGCCTTAGGGAGCGTGAACACAG GTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACG AGCGCAACCCTCGTTTTTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGGCACTCTAGAGAGACTGC CGGGTGACAAACCGGAGGAAGGGTGTGGGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCCTTT ACGTCTTGGGCTACACACGTACTACAATGCTACGGACAAAGGGCAGCTACACAGCTG AAG 3.5.3. Mẫu 29 (chủng Cylindropermopsis) AATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCGCGTGAGGGAGGAAGGC TCTTGGGTCGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAAGAAAGTGACGGTACTTGAGGAAT AAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCAAGCGTTAT CCGGAATGATTGGGCGTAAAGGGTCTGCAGGTGGAACTGAAAGTCTGCTGTTAAAGA GTTTGGCTTAACCAAATAAAAGCGGTGGAAACTACAGAACTAGAGTGTGGTAGGGGC AAAAGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCAGGAAGAACACCGGTG GCGAAAGCGTTTTGCTAGACCATAACTGACACTGAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCG AATGGGATTAGATACCCCAGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCT TGTATCGACCCGAGCCGTGCCGGAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTAC GCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTA TGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGACTTGACATCCTGCGAAT CCTGGTGAAAGCTGGGAGTGCCTTAGGGAGCGCAGAGACAGGTGGTGCATGGCTGTC GTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTTT 40 Đồ Án Tốt Nghiệp TTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGG AACGGTGAGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCCTTACGTCTTGGGCTACCACACGT ACTACAATGCTACGGACAGAGGGCAGCGAGCCAGGGTATG 3.5.4. Mẫu 31(chủng plantothrix) CCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAAAGATCGGGAAGAACACCAGTGGCGAAAGCG CTCTACTGGACTGCAACTGACACTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAACGAATGGGATTA AATACCCCAGTAATCCTAACCGTAAACGATGGATACTAAGTGTTGTCTGTATCGACCC AGACAGTGCCCCAGCTAACGCGATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTG TGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAATATGTGGTTTAATT CCATGCAACGCGAAAAACCTTACCAGGGCTTGACATGTCCCGAACCTCGCTGAAAGG TGAGGGTGCCTTCGGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGT CGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTTAGTTGCCATCA TTCAGTTGGGCACTCTAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATG ACGTCAAGTCATCATGCCCCTTACGTCCTGGGCTACACACGTACTACAATGGGTGGG ACAAAGGGCAGCGAACTCGCAAGAGCCAGCTAATCCCATAAACCCATCCTCAGTTCA GATTGCTCTCTGCAACTCGAGAGCATGAAGGAGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAG CATACTGCGGTGAATACGTTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGA AGTTGGCCATGCCCGAAGTCATTACTCTAACCCCTCGGGGAGGAGGATGCCGAAGGC AGGGCTGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGTGGC 3.6. Kết quả so sánh trình tự gene trên ngân hàng NCBI và xây dựng cây phát sinh loài Sau đó sản phẩm PCR được gửi giải trình tự tại công ty Nam Khoa Biotek Company. Sử dụng phần mềm ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview 4.32.0.0. và ngân hàng gene NCBI để phân tích dữ liệu đoạn gene và thiết lập cây phát sinh loài. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gene 16S DNA của các chủng vi khuẩn lam (2, 10, 29, 31) được phân lập ở hồ Dầu Tiếng và các loài vi khuẩn lam trong ngân hàng gene NCBI. Kết quả giải trình tự của các chủng đều có sự tương đồng cao khi so sánh với ngân hàng gene, sự tương đồng được thể hiện rõ qua cây phát sinh loài (Hình 3.5). Đồng thời kết quả giải trình tự hoàn toàn phù hợp với kết quả định danh hình thái. 41 Đồ Án Tốt Nghiệp Cylindrospermopsis raciborskii CHAB1351 Raphidiopsis mediterranea 07-04 73 Cylindrospermopsis catemaco CHAB148 29 53 Raphidiopsis curvata CHAB3413 2 Microcystis panniformis 51 98 Microcystis smithii CHAB1459 14591CHAB1459 99 Planktothricoides raciborskii T1-6-2 Phormidium cf. aerugineo-coeru 18 Oscillatoriales cyanobacterium 94 Lyngbya hieronymusii N-929 31 Microcystis aeruginosa LMECYA 147 100 Microcystis ichthyoblabe VN461 Sphaerocavum brasiliense CCIBt3094 66 10 87 Dolichospermum circinale 25 Anabaena ucrainica CHAB1431 27 Sphaerospermopsis kisseleviana CHAB332 10 Hình 3.5. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gene 16S DNA của các chủng Microcystis, Anabaena, Cylindrospermopsis, Plantothrix với các chủng vi khuẩn lam trên ngân hàng gene NCBI. Tiến hành so sánh vùng gene của các mẫu phân lập được với vùng gene 16S DNA của các chủng vi khuẩn lam trên ngân hàng NCBI, các đặc điểm hình thái học của các chủng tương đồng và có được kết quả như sau: 42 Đồ Án Tốt Nghiệp  Mẫu 2 có mối quan hệ gần nhất với chủng Sphaerocavum brasiliense CCIBt3094, Microcystis aeruginosa LMECYA 147, Microcystis ichthyoblabe VN461, Microcystis panniformis và Microcystis smithii CHAB1459 với mức độ gene tương đồng là 99%.  Mẫu 10 có mối quan hệ gần nhất với loài Dolichospermum circinale và Anabaena ucrainica CHAB1431 với mức độ gene tương đồng là 99%, còn với loài Sphaerospermopsis kisseleviana CHAB332 với mức độ gene tương đồng là 98%.  Mẫu 29 có mối quan hệ gần nhất với loài Cylindrospermopsis catemaco CHAB148, Cylindrospermopsis raciborskii CHAB1351, Raphidiopsis mediterranea 07-04 và Raphidiopsis curvata CHAB3413 với mức độ gene tương đồng là 99%.  Mẫu 31 có mối quan hệ gần nhất với loài Planktothricoides raciborskii T1-6-2 với mức độ gene tương đồng là 99%, với Phormidium cf. aerugineo-coeruleum, Oscillatoriales cyanobacterium Alignment_Isolate4 và Lyngbya hieronymusii N- 929 với mức độ gene tương đồng là 93%. 43 Đồ Án Tốt Nghiệp 4 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Sau khi so sánh các mẫu phân lập được và định danh vùng gene 16S DNA của các chủng vi khuẩn lam: Microcystis, Anabaena, Cylindrospermopsis, Plantothrix ở hồ Dầu Tiếng với các chủng vi khuẩn lam trên ngân hàng NCBI đã cho kết luận sau: - Mẫu 2 có mối quan hệ gần nhất với chủng Sphaerocavum brasiliense CCIBt3094, Microcystis aeruginosa LMECYA 147, Microcystis ichthyoblabe VN461, Microcystis panniformis và Microcystis smithii CHAB1459 với mức độ gene tương đồng là 99%. - Mẫu 10 có mối quan hệ gần nhất với loài Dolichospermum circinale và Anabaena ucrainica CHAB1431 với mức độ gene tương đồng là 99%, còn với loài Sphaerospermopsis kisseleviana CHAB332 với mức độ gene tương đồng là 98%. - Mẫu 29 có mối quan hệ gần nhất với loài Cylindrospermopsis catemaco CHAB148, Cylindrospermopsis raciborskii CHAB1351, Raphidiopsis mediterranea 07-04 và Raphidiopsis curvata CHAB3413 với mức độ gene tương đồng là 99%. - Mẫu 31 có mối quan hệ gần nhất với loài Planktothricoides raciborskii T1-6-2 với mức độ gene tương đồng là 99%, với Phormidium cf. aerugineo-coeruleum, Oscillatoriales cyanobacterium Alignment_Isolate4 và Lyngbya hieronymusii N-929 với mức độ gene tương đồng là 93%. Dựa trên các nghiên cứu trước nay và đề tài nghiên cứu này thì cho thấy rằng sự hiện diện của các chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố vẫn còn hiện diện trong hồ Dầu Tiếng. Định danh được 4 nhóm vi khuẩn lam. So sánh giữa hai cặp mồi CYA371F, 373R và CYA-F, CYA-R dùng trog khuếch đại đoạn gene của 4 chủng trên. 44 Đồ Án Tốt Nghiệp 4.2. Đề nghị Qua quá trình nghiên cứu và tìm hiểu các thông tin từ các nghiên cứu trong nước và trên thế giới về các loài vi khuẩn lam đã được định danh thì ngoài các chủng vi khuẩn lam trên còn có các chủng khác như: Gloeotrichia, Desmonostoc và Arthronema... Vì thời gian còn hạn chế nên có nhiều phương pháp và quy trình mà đồ án vẫn chưa tiến hành thử nghiệm hết được, cần có những nghiên cứu sau:  Cần xác định mức độ hiện diện của các nhóm vi khuẩn lam gây bệnh, nhằm có biện phát hạn chế sự phát triển của chúng trong nguồn nước cấp sinh hoạt cho người dân.  Khảo sát khả năng gây bệnh của các chủng vi khuẩn lam phân lập được.  Khảo sát khả năng gây độc tố của các chủng trên. 45 Đồ Án Tốt Nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tiếng việt [1] Dương Đức Tiến, 1996. Phân loại vi khuẩn lam ở Việt Nam. NXB Nông nghiệp. Hà Nội. [2] Dương Thị Hoàng Oanh, Vũ Ngọc Út và Nguyễn Thị Kim Liên, 2011. Nghiên cứu khả năng xử lý nước thải của tảo Spirulina platensis. Kỷ yếu Hội nghị Khoa học Thủy sản lần IV. Trường Đại học Cần Thơ, trang 15-27. [3] Đào Thanh Sơn, Bùi Bá Trung và Đỗ Hồng Lan Chi, 2013. Đa dạng sinh học vi khuẩn lam ở hồ Dầu Tiếng. Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần V. Nxb Nông nghiệp, trang 660-665. [4] Đặng Ngọc Thanh, Hồ Thanh Hải, Dương Đức Tiến, và Mai Đình Yên, 2002. Thủy sinh học ở các thủy vực nước ngọt nội địa Việt Nam. Nxb Khoa học và Kỹ thuật, 399 trang. [5] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến và Phạm Văn Ty, 2007. Vi sinh vật học. Nxb Giáo dục, 519 trang. [6] Đặng Đình Kim, Dương Thị Thủy. 2014. Vi khuẩn lam độc nước ngọt. Khoa học tự nhiên và công nghệ, Hà Nội. [7] Đào Thanh Sơn, Trần Trúc Ly, Phạm Thanh Lưu. 2013. Nguy cơ ngộ độc bởi độc tố vi khuẩn lam ở hồ Dầu Tiếng. Tạp chí STINFO số 1&2: 52-53. [8] Đào Thanh Sơn, Lê Thái Hằng, Phạm Thanh Lưu. 2013. Ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam từ hồ Dầu Tiếng. Tạp chí STINFO số 7: 28-36. [9] Trần Cẩm Xô (chủ biên), Nguyễn Thị Lan (2005), Cơ sở di truyền và công nghệ gen, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội.  Tiếng nƣớc ngoài [10] Baxevanis, A.D. and Ouellette, B.F.F., eds., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, third edition. Wiley, 2005. ISBN 0-471-47878-4. 46 Đồ Án Tốt Nghiệp [11] Claverie, J.M. and C. Notredame, Bioinformatics for Dummies. Wiley, 2003. ISBN 0-7645-1696-5. [12] World Health Organization (WHO), 1996. Guidelines for drinking water quality. Volume 2. World Health Organization, Geneva. [13] Komárek J., Anagnostidis K., 2005. Cyanoprokaryota 1. Teil: Oscillatoriales. In Büdel, B., Gärtner, G., Krienitz, L., Schagerl, M. (Eds): Süβwasserflora von Mitteleuropa. 19/2: 1-759. Gustav Fischer Verlag Jena. [14] Komárek J. & Anagnostidis K. 1999. Susswasserflora von Mitteleuropa,Cyanoprokaryota. 1. Teil: Chroococcales. Gustav Fischer Verlag Jena. 548p. [15] Chorus I., J. Bartram, 1999. Toxic cyanobacteria in water: A guide to their public health consequences, monitoring and management. Published on behalf of WHO, Spon Press, London, 416 pp. [16] Dao, T. S., G. Cronberg, J. Nimptsch, L. C. Do-Hong, C. Wiegand, 2010. Toxic cyanobacteria from Tri An Reservoir, Vietnam. Nova Hedwigia, 90: 433–448. [17] Sivonen K., Niemela S. I., Niemi R. M., Lepisto L., Luoma T. H. & Rasanenl L. A.. 1988. Toxic cyanobacteria (blue-green algae) in Finnish fresh and coastal waters. Hydrobiologi 190: 267-275. [18] Suvi Suurnakki, Gonzalo V. Gomez-Saez, Anne Rantala-Ylinen, Jouni Jokela, David P. Fewer, Kaarina Sivonen. 2014. Identification of geosmin and 2-methylisoborneol in cyanobacteria and molecular detection methods for the producers of these compounds. Water research 68: 56-66. [19] Thanh-Luu Pham, Thanh-Son Dao, Kazuya Shimizu, Do-Hong Lan-Chi and Motoo Utsumi. 2015. Isolation and characterization of microcystin- producing cyanobacteria from Dau Tieng Reservoir, Vietnam. Nova Hedwigia 101: 1–2, 3–20. 47 Đồ Án Tốt Nghiệp [20] Thanh-Luu Pham, Thanh-Son Dao, Ngoc-Dang Tran, Jorge Nimptsch, Claudia Wiegand and Utsumi Motoo. 2016. Influence of environmental factors on cyanobacterial biomass and microcystin concentration in the Dau Tieng Reservoir, a tropical eutrophic water body in Vietnam. Ann. Limnol. - Int. J. Lim. 0 (2016) 1–12. [21] Thanh-Son Dao, Jorge Nimptsch and Claudia Wiegand. 2016. Dynamics of cyanobacteria and cyanobacterial toxins and their correlation with environmental parameters in Tri An Reservoir, Vietnam. Journal of Water and Health 14.4: 699-712. [22] Duy T. N., Paul K. S. Lam, Glen R. Shaw, Des W. Connell. 2000. Toxicology and risk assessment of freshwater cyanobacterial (bluegreen algal) toxins in water, Rev. Environ. Contam. Toxicol 163: 113 –186. [23] Ena Urbach, Deborah L. Robertson, Sallie W. Chisholm. 1992. Multiple evolutionary origins of prochlorophytes within the cyanobacteria radiation. Nature Publishing Group 355: 1-4. [24] Kitching IJ, Forey PL., Humphries CJ., Williams DM. 1998. Clasdistics, the theory and practice of parsimony analysis. Oxford University Press. 228pp. Occurrence of the toxic cyanobacterium (blue-green alga) Microcystis aeruginosa in Central China. Arch. Hydrobiol 114: 21-30. [25] Page, R.D.M., Holmes, E.C. 1998. Molecular Evolution. Blackwell Publishing. 346pp. [26] Salemi M., Vandamme A-M. 2006. The phylogenetic handbook, a practical approach to DNA and protein phylogeny. Cambridge University Press. 398pp. [27] Ye SQ. 2008. Bioinformatics: A Practical Approach. CRC Press, Taylor & Francis Group. Amber Hotto, Mike Satchwell, Gregory Boyer. 2005. Seasonal Production and Molecular Characterization of Microcystins in Oneida Lake, New York, USA. Environ. Toxicol 20: 243–248.Carmichael, W.W., Yu, M. J., He, Z.R, He, J.W. and Yu, J-L.. 1988. 48 Đồ Án Tốt Nghiệp [28] Friedrich Jüttner, Susan B. Watson. 2007. Biochemical and Ecological Control of Geosmin and 2-Methylisoborneol in Source Waters. Appl. Environ. Microbiol 73: 4395-4406. [29] Olga Savichtcheva, Didier Debroas, Rainer Kurmayer, Clement Villar, Jean Philippe Jenny, Fabien Arnaud, Marie Elodie Perga, and Isabelle Domaizon. 2011. Quantitative PCR Enumeration of Total/Toxic Planktothrix rubescens and Total Cyanobacteria in Preserved DNA Isolated from Lake Sediments. Appl. Environ. Microbiol Vol. 77, No. 24: 8744–8753.6. [30] Amber Hotto, Mike Satchwell, Gregory Boyer. 2005. Seasonal Production and Molecular Characterization of Microcystins in Oneida Lake, New York, USA. Environ. Toxicol 20: 243–24. [31] Kurmayer, R., G. Christiansen, and I. Chorus. 2003. The abundance of microcystin-producing genotypes correlates positively with colony size in Microcystis and determines its microcystin net production in Lake Wannsee. Appl. Environ. Microbiol. 69:787–795. [32] Cronberg G., H. Annadotter, 2006. Manual on aquatic cyanobacteria: A photo guide and a synopsis of their toxicology. Kerteminde Tryk A/S, 106 pp. [33] Zhou J. et al (1996). DNA recovery from soils of diverse composition, Applied and Environmental Microbiology, 62 (2), 316 – 322. [34] Jara C. et al (2008). Analysis of several methods for the extration of high quality DNA from acetic acid bacteria in wine and vinegar for characterization by PCR-based methods, International Journal of Food Microbiology, 128 (2), 336 - 341. [35] Zhu H, Qu F, Zhu LH. Isolation of genomic DNAs from plants, fungi and bacteria using benzyl chloride. Nucleic Acids Res 1993; 21(22), 5279-80. [36] Haruta S. (2002). Construction of a stable microbial community with high cellulose – degradation ability, Appl Microbiol Biotechnol, 59 (4), 529 – 534. [37] Tomoyukihori, Shin Haura, Yohiyuki Ueno, Masaharuishii, Yasuo Igarashi (2006). Direct comparinson of singlesstand conformation 49 Đồ Án Tốt Nghiệp polymorphism (SSCP) and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) to characterize a microbial community on the basis of 16S RNA gene fragment, Journal of Microbiological Methods, 66, 165 – 169. [38] Friedrich Jüttner, Susan B. Watson. 2007. Biochemical and Ecological Control of Geosmin and 2-Methylisoborneol in Source Waters. Appl. Environ. Microbiol 73: 4395-4406.  Tài liệu từ Internet [1] https://voer.edu.vn/c/vi-khuan-lam/9b2ffb8d/6b311bf8 [2] https://vi.wikipedia.org/wiki/Tin_sinh_h%E1%BB%8Dc [3] luan-1672608.html 50 Đồ Án Tốt Nghiệp PHỤ LỤC A. Hình ảnh các trang thiết bị phục vụ nghiên cứu Máy li tâm lạnh MIKRO 220R Nguồn EC105 và Bể điện di QS-710 Hộp đèn soi UV Uvintec Máy PCR sprint thermo Cycler 1 Đồ Án Tốt Nghiệp B. Kết quả so sánh trình tự 16S DNA của loài vi khuẩn lam với ngân hàng gene NCBI. 1. Kết quả so sánh mẫu 2 với chủng Microcystis aeruginosa LMECYA 147 trên trình tự đoạn gene 16S DNA Score Expect Identities Gaps Strand 1602 bits (867) 0.0 884/891(99%) 6/891(0%) Plus/Plus Query 1 AATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTT 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 277 AATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTT 336 Query 61 GGATTGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAAGTTCTGACGGTACTTGAGGAATCAGCCTCG 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 337 GGATTGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAAGTTCTGACGGTACTTGAGGAATCAGCCTCG 396 Query 121 GCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGGGAGGCAAGCGTTATCCGGAATTATT 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 397 GCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGGGAGGCAAGCGTTATCCGGAATTATT 456 Query 181 GGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTCAGCCAAGTCTGCCGTCAAATCAGGTTGCTTAACGA 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 457 GGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTCAGCCAAGTCTGCCGTCAAATCAGGTTGCTTAACGA 516 Query 241 CCTAAAGGCGGTGGAAACTGGCAGACTAGAGATCAGTAGGGGTAGCAGGAATTCCCAGTG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 517 CCTAAAGGCGGTGGAAACTGGCAGACTAGAGATCAGTAGGGGTAGCAGGAATTCCCAGTG 576 Query 301 TAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTGGGAAGAACATCGGTGGCGAAAGCGTGCTACTGGGCT 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 577 TAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTGGGAAGAACATCGGTGGCGAAAGCGTGCTACTGGGCT 636 Query 361 GTATCTGACACTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCCTGTAGTC 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 637 GTATCTGACACTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCCTGTAGTC 696 Query 421 CTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGACCCGAGCCGTGCCGAAGCTA 480 2 Đồ Án Tốt Nghiệp |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 697 CTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGACCCGAGCCGTGCCGAAGCTA 756 Query 481 ACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGAC 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 757 ACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGAC 816 Query 541 GGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTAC 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 817 GGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTAC 876 Query 601 CAAGACTTGACATGTCGCGAACCCTGGTGAAAGCTAGGGGTGCCTTCGGGAGCGCGAACA 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 877 CAAGACTTGACATGTCGCGAACCCTGGTGAAAGCTAGGGGTGCCTTCGGGAGCGCGAACA 936 Query 661 CAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGGTTAAGTCCCGCAAC 720 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||| Sbjct 937 CAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT-GGGTTAAGTCCCGCAAC 995 Query 721 GAGCGCAACCCCTCGTTCTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGGGGACTCTAAGGAGACTGC 780 |||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||| Sbjct 996 GAGCGCAA-CCCTCGTTCTTAGTTGCCAGCATTAAGTT--GGGGACTCTAAGGAGACTGC 1052 Query 781 CGGTGACAAACCCGGAGGAAGGTGGGGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCTT 840 |||||||||| |||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1053 CGGTGACAAA-CCGGAGGAAGGT-GGGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCTT 1110 Query 841 GGGCGACACACGTACTACAATAGTCGGGACAAAGGGCAGCGAACTCGCGAG 891 ||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1111 GGGCGACACACGTACTACAATGGTCGGGACAAAGGGCAGCGAACTCGCGAG 1161 2. Kết quả so sánh mẫu 10 với chủng Anabaena ucrainica CHAB1431 trên trình tự đoạn gene 16S DNA. Score Expect Identities Gaps Strand 1624 bits (879) 0.0 899/907(99%) 8/907(0%) Plus/Plus 3 Đồ Án Tốt Nghiệp Query 1 GGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCGCGTG 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 222 GGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCGCGTG 281 Query 61 AGGGAGGAAGGCTCTTGGGTTGTAAACCTCTTTTCTCAGGGAAGaaaaaaaTGACGGTAC 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 282 AGGGAGGAAGGCTCTTGGGTTGTAAACCTCTTTTCTCAGGGAAGAAAAAAATGACGGTAC 341 Query 121 CTGAGGAATAAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCAAG 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 342 CTGAGGAATAAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCAAG 401 Query 181 CGTTATCCGGAATGATTGGGCGTAAAGGGTCCGCAGGTGGCATTGAAAGTCTGCTGTTAA 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 402 CGTTATCCGGAATGATTGGGCGTAAAGGGTCCGCAGGTGGCATTGAAAGTCTGCTGTTAA 461 Query 241 AGAGTTTGGCTCAACCAAATAAAAGCAGTGGAAACTACAAAGCTAGAGTTTGGTCGGGGC 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 462 AGAGTTTGGCTCAACCAAATAAAAGCAGTGGAAACTACAAAGCTAGAGTTTGGTCGGGGC 521 Query 301 AGAGGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCAGGAAGAACACCAGTGGCGA 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 522 AGAGGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCAGGAAGAACACCA