Đồ án Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và hoạt tính kháng oxy hoá của cao chiết ethanol 70% từ cây bồ công anh (lactuca indica l.)

nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên cơ sở lý thuyết và dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm Minh Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 09 tháng 08 năm 2017 Sinh viên ĐOÀN LÊ THẢO TRANG i Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Sau quá trình học tập, nghiên cứu tại khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, em đã tiếp thu được rất nhiều kiến thức, kinh nghiệm quý báu nhờ sự giảng dạy, hướng dẫn tận tình của các thầy cô bộ môn. Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt, người đã giúp đỡ, định hướng và tận tình hướng dẫn em suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Cảm ơn thầy vì đã truyền đạt cho em rất nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu để hoàn thành bài khóa luận này. Em cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại Học HUTECH, quý thầy cô hiện đang giảng dạy và làm việc tại Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường đã truyền dạy rất nhiều kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và các anh chị đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ em vượt qua khó khăn trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Em xin chân thành cảm ơn. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 09 tháng 08 năm 2017 Sinh viên ĐOÀN LÊ THẢO TRANG ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii MỤC LỤC ................................................................................................................ iii DANH MỤC HÌNH ẢNH ....................................................................................... vi DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. ix MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 3 1.1. Giới thiệu về cây bồ công anh (Lactuca indica L) ............................................... 3 1.1.1. Nguồn gốc và phân bố ...................................................................................... 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây bồ công anh .................................................... 3 1.1.3. Thành phần hóa học của cây bồ công anh ........................................................ 4 1.1.4. Công dụng ...................................................................................................... 19 1.2. Tổng quan cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc thực vật .......... 20 1.2.1. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật .................. 20 1.2.2. Những hợp chất kháng khuẩn điển hình ở thực vật ....................................... 22 1.3. Đại cương một số nhóm vi khuẩn gây bệnh ....................................................... 27 1.3.1. Nhóm vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy ............................................................. 27 1.3.1.1. Các vi khuẩn thuộc nhóm Escherichia Coli ................................................ 27 1.3.1.2. Các vi khuẩn thuộc nhóm Samonella spp. ................................................... 29 1.3.1.3. Các vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio spp. .......................................................... 30 1.3.1.4. Các vi khuẩn thuộc nhóm Shigella spp. ....................................................... 31 1.3.1.5. Các vi khuẩn thuộc nhóm Listeria spp. ....................................................... 31 1.3.2. Nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da ........................................................ 32 1.4. Hoạt tính chống oxi hóa...................................................................................... 36 1.4.1. Khái niệm về gốc tự do .................................................................................. 36 1.4.2. Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể .............................................................. 36 iii Đồ án tốt nghiệp 1.4.3. Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể .............................................................. 37 1.4.4. Chất chống oxy hóa trong thực vật .............................................................. 38 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 39 2.1. Địa điểm và thời gian ......................................................................................... 39 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu ....................................................................................... 39 2.1.2. Thời gian nghiên cứu ...................................................................................... 39 2.2. Vật liệu ............................................................................................................... 39 2.2.1. Nguồn mẫu ...................................................................................................... 39 2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị ............................................................................................... 39 2.2.3. Hóa chất, dung môi ......................................................................................... 39 2.2.4. Thiết bị và dụng cụ .......................................................................................... 40 2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 41 2.3.1. Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu ............................................................ 41 2.3.2. Phương pháp tách chiết và thu nhận cao thực vật ........................................... 41 2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật ............................................. 41 2.3.4. Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật chỉ thị ................. 42 2.3.5. Phương pháp pha loãng mẫu ........................................................................... 43 2.3.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn ................................................ 43 2.3.7. Phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết. ................... 44 2.3.8. Phương pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết ...................... 46 2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................... 49 2.4. Bố trí thí nghiệm ................................................................................................ 50 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất thu hồi cao chiết từ bồ công anh. .................................................................................... 51 2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của LiEE. ............................. 53 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng oxy của LiEE ............................................ 54 2.4.4. Thí nghiệm 4: Định tính một số thành phần hóa học cơ bản của LiEE .......... 56 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 58 3.1. Kết quả hiệu suất thu hồi cao chiết EtOH 70% từ Bồ công anh (LiEE) ............ 58 iv Đồ án tốt nghiệp 3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của LiEE đối với vi khuẩn chỉ thị ..... 59 3.2.1. Kết quả hoạt tính kháng nhóm E.coli của LiEE .............................................. 59 3.2.2. Kết quả hoạt tính kháng nhóm Salmonella của LiEE ..................................... 60 3.2.3. Kết quả hoạt tính kháng nhóm Shigella của LiEE .......................................... 61 3.2.4. Kết quả hoạt tính kháng nhóm Vibrio spp. của LiEE ..................................... 63 3.2.5. Kết quả hoạt tính kháng nhóm vi khuẩn khác của LiEE ................................. 64 3.2.6. Tổng hợp kết quả kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ Bồ Công anh đối với vi khuẩn chỉ thị .......................................................................................................... 66 3.3. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá của cao chiết ethanol từ Bồ Công anh. ............................................................................................................................ 67 3.3.1. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá dựa trên sự loại bỏ gốc tự do DPPH của vitamin C ............................................................................................................ 67 3.3.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá của LiEE ...................................... 69 3.4. Kết quả xác định sơ bộ thành phần hoá học của LiEE....................................... 71 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 75 v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1: Thân và hoa của cây bồ công anh .............................................................. 4 Hình 1.2: Sơ đồ phân loại carbohydrate theo từng nhóm .......................................... 6 Hình 1.3: Một vài disaccharide tiêu biểu ................................................................... 7 Hình 1.4: Các polysaccharide thường gặp ở thực vật A) amylose, B) amylopectin, C) cellulose, D) chitin ................................................................................................. 8 Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của một số chất thuộc nhóm alkaloid .......................... 13 Hình 1.6: Sơ đồ phân loại saponin (Nguyễn Tấn Thịnh, 2013). .............................. 15 Hình 1.7: Một số euflavonoid thường gặp ............................................................... 17 Hình 1.8: Một số chất thuộc nhóm steroid thường gặp ............................................ 18 Hình 1.9: Sơ đồ phân loại tannin .............................................................................. 19 Hình 1.10: Vị trí các hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn tác động lên vi khuẩn ......................................................................................................................... 22 Hình 1.11: Cấu trúc hóa học của phân tử Solamargine ............................................ 23 Hình 1.12: Cấu trúc hóa học của phân tử: quinone (A); anthraquinone (B); hypericin (C) ............................................................................................................. 24 Hình 1.13: Cấu trúc hóa học của phân tử capsaicin ................................................. 26 Hình 1.14: Methol từ cây bạc hà (Nguyễn Tiến Thắng, 2012) ................................ 26 Hình 1.15: E.coli quan sát dưới kính hiển vi với kích thước 2 µm (Bact, 2005) ..... 28 Hình 1.16: Vi khuẩn Salmonella typhi (Nguyễn Thúy Hương, 2011). .................... 29 Hình 1.17: Vi khuẩn V. cholerae (Nguyễn Thúy Hương, 2011) ............................. 26 Hình 1.18: Hình thái của vi khuẩn Shigella spp. (Reynolds, 2011) ......................... 31 Hình 1.19: Vi khuẩn Listeria spp. ............................................................................ 32 Hình 1.20: Vi khuẩn Pseudomonas .......................................................................... 33 Hình 1.21: Vi khuẩn Enterococcus .......................................................................... 34 Hình 1.22: Vi khuẩn Staphylococus aureus ............................................................. 35 Hình 2.1: DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) ................................................... 44 Hình 2.2: Phản ứng trung hòa gốc DPPH ................................................................ 45 vi Đồ án tốt nghiệp Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ............................................................. 50 Hình 2.4: Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ cây Lactuca indica L ................... 51 Hình 2.5: Mẫu lá bồ công anh .................................................................................. 52 Hình 2.7: Quy trình đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa ............................................ 55 Hình 2.8: Quy trình định tính một số thành phần hóa học của LiEE ....................... 56 Hình 3.1: Mẫu cao chiết ethanol từ Bồ Công Anh (LiEE) ....................................... 58 Hình 3.2: Đường kính vòng ức chế của LiEE ở các nồng độ khác nhau đối với E.coli. ........................................................................................................................ 59 Hình 3.3: Đường kính vòng ức chế của LiEE ở các nồng độ khác nhau đối với Salmonella. ................................................................................................................ 61 Hình 3.4: Đường kính vòng ức chế của LiEE ở các nồng độ khác nhau đối với Shigella. ..................................................................................................................... 62 Hình 3.5: Đường kính vòng ức chế của LiEE ở các nồng độ khác nhau đối với Vibrio. ........................................................................................................................ 63 Hình 3.6: Đường kính vòng ức chế của LiEE ở các nồng độ khác nhau đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị khác. ..................................................................................... 65 Hình 3.7: Đường chuẩn khảo sát khả năng kháng oxy hoá của vitamin C ............. 68 Hình 3.8: Khả năng bắt gốc tự do DPPH của LiEE ở các nồng độ khác nhau ........ 69 vii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1: Chức năng sinh lý của một số amino acid trong quá trình trao đổi chất ... 9 Bảng 3.1: Kết quả đường kính vòng ức chế (mm) của LiEE từ các nồng độ khác nhau trên 20 chủng vi khuẩn gây bệnh ..................................................................... 66 Bảng 3.2: Hàm lượng chất kháng oxy hoá tương đương g/ml vitamin C ở các nồng độ cao chiết khảo sát ........................................................................................ 67 Bảng 3.3: Hiệu quả loại bỏ 50% gốc tự do của LiEE và vitamin C ......................... 71 Bảng 3.4: Kết quả định tính một số thành phần hóa học trong LiEE ....................... 72 viii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TSB: Trypticase Soya Broth TSA: Trypticase Soya Agar DMSO: Dimethyl sulfoxide LiEE: Lactuca indica L ethanolic extract NA: Non Activity DPPH: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl RNA: Ribonucleic Acid DNA: Deoxyribonucleic Acid ix Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng các loại cây cỏ thiên nhiên nhằm mục đích trị bệnh, vì đây là một liệu pháp an toàn, dễ tìm, đồng thời mang đến hiệu quả cao. Khi xã hội ngày càng phát triển cùng với những tiến bộ của khoa học kỹ thuật thì các nhà khoa học đã không ngừng nghiên cứu tạo ra các loại thuốc tây y giúp hỗ trợ điều trị bệnh tốt hơn, trong đó, phần lớn là các loại thuốc kháng sinh. Mặc dù kháng sinh giải quyết rất nhiều vấn đề liên quan đến trị bệnh và mang lại lợi ích rất lớn cho con người, nhưng cũng chính việc sử dụng kháng sinh cũng dẫn đến hiện tượng kháng thuốc xảy ra nhiều hơn. Nguyên nhân chủ yếu là do việc lạm dụng, sử dụng thuốc kháng sinh tùy tiện, tràn lan của con người. Dẫn đến hiện tượng xuất hiện ngày càng nhiều chủng vi khuẩn kháng kháng sinh, kể cả những loại kháng sinh thế hệ mới. Để giải quyết vấn đề này là sử dụng các nhóm chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ thực vật kết hợp với y học hiện đại để thay thế dần các loại kháng sinh hiện nay vì vừa có thể mang lại hiệu quả điều trị bệnh vừa đảm bảo an toàn đồng thời phòng ngừa hiện tượng kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh. Đất nước ta vốn nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới có nền thực vật vô cùng phong phú, nguồn dược liệu cùng với nền y học lâu đời. Chính vì điều đó nên việc ứng dụng các loại thực vật vào trong thuốc chữa bệnh là một thành phần không thể thiếu trong cuộc sống. Theo số liệu thống kê gần đây, hệ thực vật Việt Nam có trên 10000 loài và theo tác giả Võ Văn Chi nước ta có khoảng 3200 loài cây thảo dược. Không chỉ riêng ở Việt Nam mà cả trên thế giới, việc nghiên cứu về hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của các loài thực vật đã giúp các nhà khoa học tìm hiểu sâu hơn và sử dụng hiệu quả hơn nguồn dược liệu sẵn có, đồng thời phát hiện thêm các loại thảo dược mới, quý hiếm, có khả năng kháng được nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh hơn. Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ hiện đại việc nghiên cứu các loại thảo dược ở nước ta những năm gần đây đã có nhiều bước phát triển. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại thảo dược đã được nghiên cứu song song cùng việc xác định những thành phần các hoạt chất có trong thực vật. Các loại thảo dược 1 Đồ án tốt nghiệp điển hình như trầu không (Piper betle L.), sống đời (Kalanchoe pinnata), lô hội (Aloe barbadensis), dâu tằm (Morus acidosa Griff), khổ qua (Momordica charantia L.) đã được xác định là có hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh đối với nhiều loại vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp. Cây bồ công anh (Lactuca indica L.) là một cây thuốc mọc hoang ở khắp nước ta, dược liệu này rất dễ trồng trọt, thu hái, chế biến. Mặc dù bồ công anh đã được sử dụng từ lâu đời nhưng những công trình nghiên cứu về cây vẫn còn hạn chế. Việc đánh giá hoạt tính sinh học của bồ công anh là điều hết sức cần thiết, góp phần hoàn thiện một phương thuốc dân gian có tiềm năng sử dụng trong điều trị bệnh. Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hóa của cao chiết ethanol 70% từ cây bồ công anh (Lactuca indica L)”. Đề tài này được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết Lactuca indica L. - Khảo sát một số hoạt tính sinh học từ cao chiết từ ethanol của bồ công anh (Lactuca indica L). - Xác định sơ bộ thành phần hóa học của cao chiết ethanol từ bồ công anh. 3. Nội dung nghiên cứu - Tách chiết cao từ lá bồ công anh bằng ethanol 70%. - Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết. - Xác định sơ bộ thành phần hóa học của cao chiết. 4. Phạm vi nghiên cứu - Chỉ khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết ethanol 70% từ lá bồ công anh. - Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn trên một số chủng vi khuẩn chỉ thị Escherichia Coli, Samonella spp., Vibrio spp., Shigella spp., Listeria spp., Pseudomonas spp.. - Bước đầu định tính và định lượng thành phần hóa học của cao chiết. 2 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về cây bồ công anh (Lactuca indica L) 1.1.1. Nguồn gốc và phân bố 1.1.1.1. Nguồn gốc Cây bồ công anh Việt Nam có tên khoa học là Lactuca indica L, thuộc họ Cúc [3]. Hiện nay, Lactuca indica L được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia trên thế giới, ở Việt Nam bồ công anh còn được biết đến với nhiều tên gọi khác nhau như diếp dại; mót mét; rau mũi cày; rau chuôi; bồ công anh mũi mác theo Trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam (2008) hay cây mũi mác, diếp trời, rau bồ cóc, rau mét, phắc bao...[5] 1.1.1.2. Phân loại khoa học Giới : Plantae Ngành : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida Bộ : Asterales Họ : Asteraceae Chi : Lactuca Loài : Lactuca indica L 1.1.1.3. Phân bố Cây bồ công anh mọc hoang, phân bố chủ yếu ở các nước Châu Á như Nhật Bản, Indonesia, Philippinnes, Trung Quốc... Tại Việt Nam bồ công anh phân bố rải rác khắp mọi nơi. Từ miền núi như Đà Lạt, Sa Pa, Tam Đảo (thường ở độ cao dưới 1000m) trung du đến đồng bằng Bắc bộ [3,4,5,8,9]. 1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây bồ công anh Bồ công anh là cây thân thảo, thân nhẵn, thẳng không lông, có tuổi thọ trung bình từ 1 đến 2 năm, cao từ 60 cm đến 200 cm, thân thường đơn hoặc chẻ nhánh ở phần trên, ít phân cành. Lá mọc so le, gần như không đều. Phiến lá thuôn dài hoặc dạng hình mũi mác, kích thước phiến lá dài khoảng từ 13 – 25 cm, rộng từ 1,5 – 11 3 Đồ án tốt nghiệp cm, đầu lá nhọn, đuôi lá hình nêm hoặc men cuống, cuống lá thường ngắn hoặc men cuống tới tận nách lá. Mép lá nguyên hoặc xẻ thùy hoặc có răng cưa thô to. Mặt trên phiến lá màu xanh lục, mặt dưới có màu xanh xám. Các lá mọc ở phía trên gần đỉnh ngọn sinh hoa thường nhỏ hơn và thẳng. Hoa mọc ở đầu ngọn và đầu cành. Hoa tự hình chùy, đầu cụm hoa rộng khoảng 2 cm; cuống dài 10 – 25 mm, mọc thẳng. Kích thước chùm hoa thường cao 10 – 13 cm, rộng 5 – 6 mm, các lá ngoài hình trứng, dài 2 – 3 mm, các lá trong hình trứng – mũi mác. Hoa thường màu vàng, kích thước hoa 12 – 13 mm. Quả bế màu đen hình elip, phẳng, kích thước quả dài 4 – 4,5 mm, rộng 2,3 mm; mỏ quả dài 1 – 1,5 mm. Bồ công anh có số nhiễm sắc thể 2n = 18 (Peng & Hsu, 1978). Mùa hoa vào khoảng tháng 6 – 7 và mùa quả vào tháng 8 – 9. Hình 1.1: Thân và hoa của cây bồ công anh 1.1.3. Thành phần hóa học của cây bồ công anh Trong cây bồ công anh chứa nhựa, tinh dầu, acid béo (acid melissic) và sáp (ceryl palmitat) [4]. Ngoài ra còn có chứa flavonoid, saponin thuộc nhóm steroid, coumarin, serquiterpen lacton, tanin và sterol [10]. Lá tươi và hoa của cây có chứa khoảng 90,8% nước; 0,6% protein; 3,7% carbohydrate, và 73mg/100g vitamin C [4,7]. Năm 1995, Park Hee Juhn đã phát hiện trong cây Lactuca indica L. có 3 dạng sterol là β- sitosterol, compesterol, stigmasterol và 4 triterpen là β- amyrin, lupeol, pseudotarasterol, taraxasterol [22]. Trên thế giới một số nghiên cứu về cây cùng chi bồ công anh cho thấy trong rễ cây Lactuca virosa L. có serquiterpen lacton [23]. Cây Lactuca saligna L. và cây 4 Đồ án tốt nghiệp Lactuca savita L xác định có serquiterpen lacton, triterpen, sterol, coumarin, flavonoid [15, 21]. 1.1.3.1. Carbohydrate a) Định nghĩa Carbohydrate là hợp chất sinh học tham gia rộng rãi trong các cấu trúc sống của cơ thể sinh vật, được cấu tạo từ 3 nguyên tố là C, H, O với công thức cấu tạo chung Cm(H2O)n, thường có giá trị m = n. Hàm lượng carbohydrate ở động vật chiếm khoảng 2% ( Phùng Trung Hùng và ctv, 2013), thấp hơn thực vật và thường tồn tại ở dạng glycogen. Ở thực vật carbohydrate chiếm trên 75 %, tập trung chủ yếu ở thành tế bào, mô nâng đỡ và mô dự trữ. Tùy từng loài, từng giai đoạn sinh trưởng và sinh trưởng sẽ có hàm lượng carbohydrate khác nhau. Từ CO2 và H2O thực vật xanh có khả năng sử dụng năng lượng ánh sáng thực hiện quá trình quang hợp để tổng hợp carbohydrate. Ngày nay thường gọi là dẫn xuất polyhydroxyaldehyde hay polyhydroxycetone. b) Vai trò Carbohydrate đóng vai trò quan trọng trong hóa học hữu cơ kể từ khi khám phá của Emil Fischer (1884-1891). - Thành phần chính trong việc cấu trúc, tạo hình (ví dụ: cellulose, peptidglican...). - Đảm bảo cung cấp khoảng 60% năng lượng cho các quá trình sống. - Có vai trò bảo vệ (mucopolysaccharide). - Chống tạo thể cetone (mang tính acid gây độc cho cơ thể). Dựa vào cấu tạo, tính chất, số lượng carbon, và bản chất của nhóm carbonyl mà carbohuydrate được chia thành ba nhóm lớn. 5 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2: Sơ đồ phân loại carbohydrate theo từng nhóm Monosaccharide Nhóm các carbohydrate đơn giản nhất và không bị thủy phân nên còn được gọi là đường đơn. Chúng là các aldehyde (-CHO) hoặc keton (-C=O) có chứa một hoặc nhiều hơn hai nhóm hydroxyl (-OH). Công thức chung của nhóm monosaccharide là (CH2O)n với số n dao động từ 3 đến 7. Monosaccharide đơn giản nhất là các dihydroxyacetone và D- và L-glyceraldehyde có ít nhất 3 carbon. Đường 6 carbon là glucose, fuctose đóng vai trò quan trọng trong hoạt đông sống của tế bào. Oligosaccharide Còn gọi disaccharide là hợp chất trung gian giữa monosaccharide và polysaccharide. Oligosaccharide có từ 2 – 10 monosaccharide liên kết với nhau bằng các liên kết O –glycoside. Công thức hóa học của disaccharides là C12H22O11. Mặc dù có trong tự nhiên tồn tại nhiều dạng disaccharide nhưng chỉ một số ít được chú ý như sucrose, lactose,maltose , cellobiose. 6 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3: Một vài disaccharide tiêu biểu Polysaccharide Là một trong các chất phổ biến nhất trong cuộc sống. Trong thành phần của polysaccharide có rất nhiều monosaccharide. Các monosaccharide này được nối với nhau bởi các liên kết glycoside có thể là dạng α- hoặc β-glycoside. Tinh bột là polysaccharide dự trữ thực vật phổ biến nhất, là một hỗn hợp của amylose và amylopectin, trong đó amylopectin chiếm khoảng 80%. Polysaccharide trong động vật là glycogen tồn tại chủ yếu ở trong gan, trong mô và cơ có chức năng dự trữ. 7 Đồ án tốt nghiệp A) α-1,4-glycoside B) α-1,6-glycoside α-1,4-glycoside C) D) Hình 1.4: Các polysaccharide thường gặp ở thực vật A) amylose, B) amylopectin, C) cellulose, D) chitin 1.1.3.2. Amino acid a)Định nghĩa: Amino acid (acid amin) là đơn vị cấu trúc cơ bản của protein. Amino Acid là những hợp chất hữu cơ sinh học quan trọng chứa nhóm chức amin (-NH2) và acid cacboxylic (-COOH), cùng với một nhóm biến đổi (nhóm R) khác nhau cho mỗi animo acid. Các amino acid tồn tại chủ yếu trong tự nhiên đều thuộc loại α-amino acid có nhóm amine đứng ở bên trái trục, được gọi là amino acid dạng L. Ngoài các nhóm –NH2, −COOH, trong amino acid tự nhiên còn chứa các nhóm chức khác như: −OH, HS−, −CO− 8 Đồ án tốt nghiệp b)Vai trò - Thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp trao đổi chất. - Tăng tính hữu hiệu sinh học của các nguyên tố dinh dưỡng và vi lượng. - Tăng hiệu quả của thuốc bảo vệ thực vật. - Nâng cao khả năng thụ phấn và kéo dài thời gian sống của hạt phấn - Tăng khả năng ra hoa và tỷ lệ đậu trái. Bảng 1.1: Chức năng sinh lý của một số amino acid trong quá trình trao đổi chất Amino Acid Hoạt động sinh hóa Glycine Là tiền chất của cholorophyll. Giúp cân bằng sinh trưởng trong cây trồng. Proline và Proline có ích cho mạch dẫn và các mô liên kết, tạo nhiều Hydroxyproline năng lượng cho thân cành mập hơn và tạo thêm tế bào mới Điều chỉnh trạng thái cân bằng nước. Cấu tạo nên thành tế bào (nematostatic action). Thiết yếu để tạo phấn hoa (tốt cho đậu trái). Glutamic và Đạm hữu cơ dự trữ để tạo thành các amino acid khác và Glutamine protein thông qua phản ứng trao đổi. Glutamine cải thiện sự phát triển và sự tập trung. Đây là nguồn năng lượng quan trọng cho các cơ quan như mạch dẫn, thân và tế bào. Serine Điều chỉnh trạng thái cân bằng nước, rất quan trọng cho quá trình tổng hợp cholorophyll. Tái tạo năng lượng cho tết bào, giúp ích cho sự phát triển đồng bộ và cải thiện sự trao đổi chất nhanh và hiệu quả, giúp tăng khả năng miễn dịch. Arginine Là tiền chất của polyamine, rất quan trọng để để phân chia tế bào. Giúp ích cho cây tạo hormone tăng trưởng, cải thiện hệ miễn dịch, tạo ra tế bào mới và khỏe mạnh. 9 Đồ án tốt nghiệp Phenylalanine Tiền chất cấu tạonên lignine, tạo các chồi gỗ khỏe hơn Alanine Vai trò rất quan trọng trong việc tạo hoocmon trao đổi chất và kháng virus Tryptophan Tiền tố của indol-acetic acid, các chất kích thích sinh trưởng tự nhiên. Aspartic Chuyển hóa (tinh bột) thành năng lượng cho cây trồng. Tăng cường sức đề kháng và hạn chế lượng độc tố trong cây sau mỗi năm. Cystine Tăng sức đề kháng và giúp cải thiện quá trình tự phục hồi cây, tái tạo cho cây trồng già nua và kém phát triển. Hạn chế tác hại của vô cơ và thuốc bảo vệ thức vật, giúp tạo diệp lục tố. Ornithine Tạo hormone tăng trưởng, hỗ trợ quá trình tái tạo, tăng cường sức miễn dịch và hỗ trợ cây tăng đề kháng sâu bệnh và các lọai nấm. Tyrosine Tiền thân của dopamine và epinephrine. Kéo dài sự sống cho hạt phấn, giúp tạo hormone tăng trưởng. Leucine Làm lành và tái tạo vùng da tổn thương cho cây trồng. Lysine Giúp phát triển các cành và thân cây nhờ làm tăng lượng collagen. Histadine Vai trò quan trọng trong việc tái tạo các mô và tế bào mới cho cây trồng. c)Phân loại Trong tự nhiên có khoảng 150 loại acid amin khác nhau nhưng chỉ có 22 loại acid amin đóng vai trò quan trọng. E. coli, tảo và hầu hết thực vật có khả năng tổng hợp tất cả amino acid từ các tiền chất. Trong đó, cơ thể người có thể tự tổng hợp từ các nguyên liệu sẵn có (các acid béo, amiac, amid) thành 14 loại acid amin (arginin, taurin, cystein, tyrosin), còn 8 acid amin (leucin, isoleucin, lysine, phenylalanine, threonin, tryptophan, valin, methionon) rất cần thiết cho cơ thể để 10 Đồ án tốt nghiệp cho quá trình sinh trưởng và phát triển nhưng cơ thể không tự tổng hợp được và phải thường xuyên đưa từ bên ngoài vào. Dựa vào cấu tạo của gốc R các amino acid cơ bản chia thành 4 nhóm (Hồ Chí Tuấn, 2009): - Các amino acid có gốc R không phân cực kị nước: Glysine (G), Alanine (A), Valine (V), Leucine (L), Isoleucine (I), Proline (P). - Các amino acid có gốc R là nhân thơm: Phenylanine (F), Tyrosine (Y), Tryptophan (W). - Các amino acid có gốc R bazơ, tích điện dương: Lysine (K), Arginine (R), Histidine (H). Tích điện âm: Aspartate (D), Glutamate (E). - Các amino acid có gốc R phân cực, không tích điện: Serine (S), Threonine (T), Cysteine (C), Methionine (M), Asparagine (N), Glutamine (Q). ...ặc điểm Listeria spp. là nhóm trực khuẩn Gram dương, kị khí tùy nghi phát triển ở nhiệt độ 1- 450C, hình que mảnh có kích thước 0,5µm ×1-2 µm, không sinh bào tử, có khả năng di động, và phát triển ở pH rộng 4,3 - 9,6. 31 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.19 : vi khuẩn Listeria spp. b) Khả năng gây bệnh Bệnh do Listeria spp. gây ra là bệnh hiếm gặp ở người với các triệu chứng rất nguy hiểm và có tỷ lệ tử vong cao. Người nhiễm bệnh sẽ có các dấu hiệu cận lâm sàng nhẹ như sốt, viêm dạ dày-ruột. Đồng thời L. monocytogenes là tác nhân gây chết đặc biệt ở trẻ em dưới 1 tháng tuổi, phụ nữ mang thai, những người nhận mô cấy ghép và có hệ miễn dịch kém. Ở phụ nữ mang thai khi người mẹ bị nhiễm Listeria spp. thì có triệu chứng rõ ràng hoặc có những triệu chứng giống như bị cảm cúm nhưng bào thai và thai nhi sẽ bị ảnh hưởng nghiêm trọng bao gồm sảy thai, chết non, viêm màng não ở trẻ sơ sinh hay nhiễm trùng. Listeria spp. gây bệnh cho động vật: bệnh do Listeria spp. tác động chuyên biệt trên gia súc, cừu và dê với các dấu hiệu lâm sàng như viêm não, viêm màng não, nhiễm trùng máu, sảy thai, đẻ non. 1.3.2. Nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da 1.3.2.1. Các vi khuẩn thuộc nhóm Pseudomonas spp. a) Đặc điểm Pseudomonas spp. là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc; có hình thẳng, hai đầu tròn, dài 1–5 µm, rộng 0,5 – 1 µm. Trực khuẩn ít khi có vỏ, có một tiêm 32 Đồ án tốt nghiệp mao đơn cực, di động, không sinh bào tử, tồn tại ở dạng đơn, bắt cặp hoặc tạo thành chuỗi ngắn. Trực khuẩn mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ phát triển tối ưu ở 370C, phát triển được ở nhiệt độ 50C – 420C. Trên môi trường đặc, thường có hai loại khuẩn lạc, một loại to, nhẵn, dẹt, trung tâm hơi lồi; một loại nhỏ, xù xì, lồi. Hình 1.20 : vi khuẩn Pseudomonas b) Khả năng gây bệnh Pseudomonas spp. gây bệnh cho người - Trực khuẩn Pseudomonas spp. gây bệnh có điều kiện như khi cơ thể bị suy giảm miễn dịch, bị bệnh ác tính hoặc mãn tính, khi dùng corticoid lâu dài, sử dụng các dụng cụ thăm khám hoặc bị các vết bỏng, các vết thương hở, - Tại chỗ, trực khuẩn gây viêm mủ (mủ có màu xanh). Khi có điều kiện thuận lợi, chúng gây bệnh toàn thân như nhiễm trùng hệ thống hô hấp, nhiễm trùng máu hoặc nhiễm trùng đường tiểu, viêm phế quản, viêm phổi, viêm tai giữa, viêm màng não, viêm tủy xương Pseudomonas spp. gây bệnh thực nghiệm: súc vật cảm nhiễm là chuột lang, tiêm vào màng bụng chuột 0,1 –0,5 ml canh khuẩn, khoảng 50% chuột chết sau vài giờ, những con chuột sống dần dần được hình thành những ổ mủ. 33 Đồ án tốt nghiệp 1.3.2.2. Các vi khuẩn thuộc nhóm Enterococcus spp. a) Đặc điểm Enterococcus spp. là nhóm cầu khuẩn Gram dương thuộc nhóm vi khuẩn lactic acid, có hình cầu hoặc oval kéo dài, không di động, không sinh bào tử, một số dòng có tạo vỏ nhày. Enterococcus spp. phát triển tốt trong điều kiện kị khí, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển 30-350C, pH = 4,5-10, nồng độ NaCl cao. Hình 1. 21: Vi khuẩn Enterococcus b) Khả năng gây bệnh Một số bệnh do Enterococcus spp. gây ra: viêm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng vết thương, các bệnh nhiễm trùng khác ảnh hưởng đến van tim, viêm nội tâm mạc và bộ não với các triệu chứng thường gặp như sốt, mẩn đỏ da, tiêu chảy, nôn mửa. 1.3.2.3. Các vi khuẩn thuộc nhóm Staphylococcus spp. a) Đặc điểm Tụ cầu đã được R. Koch mô tả từ năm 1878. Sau đó, Pasteur (1880) và Ogston (1881) gọi vi khuẩn này là tụ cầu khuẩn và xếp vào loài Staphylococcus. Tụ cầu khuẩn có dạng hình cầu, đường kính 0,8 – 1µm, đứng tụ lại với nhau thành từng đám như chùm nho, có thể đứng lẻ tẻ hoặc thành từng đôi hay thành từng chuỗi ngắn. Staphylococcus spp. là nhóm vi khuẩn Gram dương, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi, không có vỏ, không di động, không sinh bào tử và có khả năng sinh nội độc 34 Đồ án tốt nghiệp tố. Chúng phát triển được trong điều kiện nhiệt độ và pH chênh lệch nhiều (nhiệt độ từ 100C – 450C). - Trong môi trường lỏng , sau 5– 6 giờ vi khuẩn đã làm đục môi trường, sau 24 giờ môi trường đục rõ, vi khuẩn phát triển nhiều. - Trên môi trường thạch thường, sau 24 giờ vi khuẩn đã phát triển mạnh, khuẩn lạc dạng S, có sắc tố vàng nhạt hoặc vàng thẫm. - Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc đục, dạng S, thường gây tan huyết và có sắc tố vàng. Hình 1.22 : vi khuẩn Staphylococus aureus b) Khả năng gây bệnh Tụ cầu khuẩn có nhiều loại: có loại gây bệnh, thường gặp nhất là tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và có loại bình thường sống trên da và niêm mạc, không gây bệnh. Tuy nhiên, trong một số điều kiện nhất định, loại không gây bệnh có thể trở nên gây bệnh. Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus spp.) gây bệnh cho người - Các bệnh ngoài da: gây nhiều bệnh nhiễm trùng như bệnh mụn nhọt, chốc lở, viêm da, đầu đinh, đinh râu - Nhiễm khuẩn huyết do tụ cầu: thường xảy ra ở những người có sức đề kháng yếu hoặc trẻ em. Bệnh thường nặng, có thể gây chết người hoặc trở thành mãn tính gây nên viêm xương, viêm khớp, viêm phổi, viêm cơ tim, viêm màng trong tim, viêm màng ngoài tim, viêm màng não, đường tiết niệu, hệ thần kinh trung ương, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng vết thương hậu phẫu. 35 Đồ án tốt nghiệp - Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp tính: bệnh xảy ra nhanh, trầm trọng với các dấu hiệu nôn mữa dữ dội. Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus spp.) gây bệnh thực nghiệm: thỏ là động vật dễ cảm nhiễm nhất. Ngoài ra, có thể dùng mèo non, chuột non để tìm độc tố ruột. 1.4. Hoạt tính chống oxi hóa 1.4.1. Khái niệm về gốc tự do Trong tự nhiên oxy được xem như một nguyên tố quan trọng giúp con người duy trì quá trình hô hấp ở tế bào, sản sinh năng lượng cung cấp cho mọi hoạt động sống. Ngày nay các nghiên cứu khoa học dần chứng tỏ rằng oxy vào cơ thể tham gia nhiều quá trình sinh hóa và trong các quá trình đó oxy tạo ra những tiểu phân trung gian gọi là các gốc tự do. Các gốc tự do có nguồn gốc oxy này có hoạt tính cao, kém bền vững và được gọi chung là các gốc dạng oxy hoạt động (ROS: Reactive oxygen species). Ban đầu oxygen nhận một điện tử tạo ra gốc superoxyde (O), đây là gốc tự do quan trọng nhất của tế bào. Từ superoxyde nhiều gốc tự do và các phân tử khác của oxy có khả năng phản ứng cao được tạo ra như hydroxyl, hydroperoxyl, peroxyl, alkoxyl, lipoperoxyde, H2O2 . Các dạng oxy hoạt động này do có năng lượng cao, kém bền nên dễ dàng phản ứng với những đại phân tử như protein, lipid, DNA, gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng thời, khi một phân tử sống bị các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng dây chuyền. Gốc tự do được tạo ra bằng nhiều cách. Nó có thể là sản phẩm của những căng thẳng tâm thần, bệnh hoạn thể xác, mệt mỏi, ô nhiễm môi trường, thuốc lá, dược phẩm, tia phóng xạ mặt trời, thực phẩm có chất màu tổng hợp, nước có nhiều chlorine và ngay cả oxy. 1.4.2. Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể Không phải là gốc tự do nào cũng có hại đối với cơ thể. Nếu được kiểm soát, nó là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể, tạo ra chất màu melamine cần cho thị 36 Đồ án tốt nghiệp giác, góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngăn ngừa nhiễm trùng, tăng cường hệ miễn dịch. 1.4.3. Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể Ngay từ lúc con người mới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày. Nếu không được kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa như: ung thư, xơ vữa động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận ở người cao niên, phá rách màng tế bào khiến chất dinh dưỡng thất thoát, tế bào không tăng trưởng. Chúng tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da khiến ta có những vết đồi mồi trên mặt, trên mu bàn tay. Ngoài ra, chúng còn tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp các phân tử protein, đường bột, lipid, enzyme trong tế bào, gây đột biến ở gene, ở DNA, RNA, làm chất collagen, và elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc. Trong tiến trình hóa già, gốc tự do cũng góp phần và có thể là nguy cơ gây tử vong. Hóa già được coi như một tích tụ những đổi thay trong mô và tế bào Theo bác sĩ Denham Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây ra sự hóa già và sự chết của các sinh vật. Ông cho là gốc tự do phản ứng lên ty lạp thể, gây tổn thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc, khiến chúng trở nên vô dụng và mất khả năng sản xuất năng lượng. Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh, đáng kể nhất gồm có: bệnh xơ vữa động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thủy tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan. Các nghiên cứu cũng phát hiện rằng các gốc dạng oxy hóa hoạt động (ROS) sẽ được loại bỏ bằng các chất chống oxy hóa tự nhiên có sẵn trong cơ thể như enzyme superoxid dismutase (SOD), enzyme glutathion peroxidase (GSP-Px), enzyme catalase (CAT) để tạo sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống oxy hóa trong cơ thể con người. Đó là một trạng thái cơ bản của cân bằng nội mô (homeostasis). Ngày nay, do ảnh hưởng của điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường, tiếng ồn, căng thẳng, lo lắng hay sử dụng các thực phẩm chứa nhiều chất oxy hóa đã tạo 37 Đồ án tốt nghiệp điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau đó là sự gia tăng các dạng oxy hoạt động. Các dạng oxy hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ứng bất lợi, tổn thương cho cơ thể và là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nan y. Do đó cần có những nghiên cứu, tìm hiểu về các chất có khả năng chống oxy hóa mang lại những tác dụng tốt, có lợi cho sức khỏe của con người. Bên cạnh đó, chúng ta cũng cần khảo sát thêm những quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa tối ưu và dễ thực hiện để phục vụ cho việc nghiên cứu. 1.4.4. Chất chống oxy hóa trong thực vật Chất kháng oxy hóa tự nhiên có trong ngũ cốc, rau, quả. Các chất kháng oxy hóa có nguồn gốc thực vật như vitamin E, vitamin C, carotenoid, acid phenolic, phytate và estrogen đã được chứng minh làm giảm nguy cơ mắc các bệnh liên quan đến quá trình lão hóa như ung thư, bệnh tim mạch và bệnh Alzheimer (Moskovitz and Yim, 2002). Một nghiên cứu khác cũng cho thấy chất kháng oxy hóa có trong trái cây, trà, rau quả và rượu vang làm giảm nguy cơ mắc các bệnh mãn tính (Prakash et al., 2000). Ngày nay, nhu cầu sử dụng các loại thuốc chống lão hóa ngày càng tăng cao nhưng các loại thuốc làm đảo ngược đồng hồ sinh học này chưa có những bằng chứng đáng tin cậy về tác dụng của nó cũng như tác dụng phụ có thể có. Các chất kháng oxy hóa có nguồn gốc từ thực vật có tác dụng ngăn chặn quá trình oxy hóa không mong muốn trong cơ thể như các chất carotenoid, flavonoid, phenol, vitamin C, vitamin E,... đang trở thành mối quan tâm của nền khoa học hiện đại (Đỗ Thị Túy Phượng, 2007). 38 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM. 2.1.2. Thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ 02/2017 đến 07/2017. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Nguồn mẫu Mẫu lá bồ công anh được thu tại hộ nông dân xã Cộng Hòa, huyện Hưng Hà , tỉnh Thái Bình 2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị Vi khuẩn chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu là 20 chủng vi khuẩn được cung cấp bởi Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh và Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II, bao gồm: - Nhóm vi khuẩn Escherichia coli: E. coli, ETEC, E.coli 0208, E.coli O157:H7. - Nhóm vi khuẩn Salmonella: S. enteritidis, S. typhii, S. typhimurium, S. dublin. - Nhóm vi khuẩn Shigella: S. sonnei, S. boydii, S. flexneri. - Nhóm vi khuẩn Vibrio: V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. harveyi, V.cholerae. - Nhóm vi khuẩn Listeria: L. monocytogenes, L. innocua. - Các vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da: E. feacalis, S. aureus, P. aeruginosa. 2.2.3. Hóa chất, dung môi a) Hóa chất: - Môi trường TSB (HiMedia - Ấn Độ). - Môi trường TSA (HiMedia - Ấn Độ). - NaCl tinh khiết 39 Đồ án tốt nghiệp - Một số loại thuốc thử: Molisch, Fehling A, Fehling B, Barfoed, Mayer, Dragendroff, Hager, Wagner, Ninhydrin, Natri nitro prusside. - DPPH (Đức) b) Dung môi: - Methanol - Ethanol 50%, 70%, 90% (Việt Nam) - DMSO (Trung Quốc) 2.2.4. Thiết bị và dụng cụ a) Dụng cụ - Đĩa petri - Dụng cụ đục lỗ (d = 6 mm) - Ống nghiệm lớn, nhỏ. - Thước đo - Becher 100 ml, 250 ml, 500 ml - Bông thấm và bông không thấm nước - Ống đong 100 ml, 250 ml, 500 ml - Đũa thuỷ tinh - Pipet 1 ml, 10 ml - Các loại đầu típ - Eppendoff 2 ml - Micropipette 100 µL, 1000 µL, 5000 - Chai nắp xanh 250 ml, 500 ml, µL 1000 ml - Các loại dụng cụ khác như: bao chịu - Que cấy trang nhiệt, kéo, giấy giói, kẹp gấp, muỗng, - Đèn cồn dao, thun,... b) Thiết bị - Autoclave (Huxky Đài Loan) - Máy đo UV – VIS (Hach) -Tủ ấm 300C, 370C (Memmert - Cân phân tích (Orbital Germany) mermany) - Bếp từ (Billy – England) - Máy ly tâm (Tuttligen Germany) - Máy nước cất (Branstead USA) - Máy cô cách thủy - Thiết bị cô quay chân không 40 Đồ án tốt nghiệp 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu Mẫu thực vật được thu một lượng lớn toàn bộ các bộ phận thân, lá và cành mang đi rửa sạch và sấy ở nhiệt độ 400C đến khi khối lượng không đổi. Mẫu khô được tiến hành cắt nhỏ và xay nhuyễn thành dạng bột. Lượng bột mẫu thu được sẽ được đóng gói trong túi nhựa và bảo quản ở nhiệt độ 40C để tách chiết cao sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo. 2.3.2. Phương pháp tách chiết và thu nhận cao thực vật Mẫu thực vật được tách chiết trong dung môi ethanol 70 % bằng phương pháp ngấm kiệt ở nhiệt độ phòng và thu nhận cao chiết bằng cách cho bay hơi, loại bỏ lượng dung môi của dịch chiết. Nguyên tắc: Mẫu thực vật được ngấm kiệt trong lượng lớn dung môi (w/v) trong khoảng thời gian nhất định để các chất tan trong mẫu hòa tan vào dung môi, đây là quá trình di chuyển vật chất trong hệ hai pha rắn – lỏng gồm 3 giai đoạn: thâm nhập dung môi vào dược liệu, hoà tan các chất trong mẫu, khuếch tán các chất tan (khuếch tán nội bào, khuếch tán phân tử, khuếch tán đối lưu). Tiến hành: Ngâm một lượng bột mẫu vào dung môi (tỷ lệ 1:20 (w/v)) trong một bình kín để ở nhiệt độ phòng. Mẫu được ngâm trong thời gian xác định; thỉnh thoảng có khuấy trộn hoặc lắc sau đó đem đi lọc hoặc ly tâm, thu nhận dịch chiết. Phần dịch chiết được cô đặc, thu hồi cao bằng phương pháp cô quay chân không (đối với dung môi methanol) và cô cách thủy (đối với dung môi ethanol, nước). Tiếp tục cho thêm lượng dung môi mới vào phần bã bột thực vật và chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu. Sau khi thu hồi mẫu cao được bảo quản ở nhiệt độ -40C. 2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 2.3.3.1. Phương pháp cấy chuyền vi sinh vật Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, dễ thực hiện, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thạch nghiêng và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng này được chuyển vào tủ mát (từ -30C 41 Đồ án tốt nghiệp đến -50C) để bảo quản. Quá trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Tùy từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyền khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyền một lần. Cách tiến hành: Giống vi sinh vật thuần khiết, được bảo quản trong ống thạch nghiêng và giữ ở nhiệt độ 40C. Sau 1 đến 3 tháng phải cấy truyền vi sinh vật qua ống thạch nghiêng mới bằng cách dùng que cấy vòng lấy sinh khối vi sinh vật trong ống thạch nghiêng cũ ria vào ống thạch nghiêng mới, sau đó đem ống thạch nghiêng mới đi ủ, tùy từng loại vi sinh vật mà quyết định nhiệt độ ủ, nhiệt độ ủ dao động từ 48 – 72 giờ. Ống thạch nghiêng chứa vi sinh vật được bảo quản trong tủ lạnh ở - 40C. (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.3.3.2. Phương pháp bảo quản lạnh sâu Nguyên tắc: Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol. Cách tiến hành: Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút 1ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu cặn có chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -150C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.3.4. Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật chỉ thị Mục đích: Hoạt hoá các chủng vi khuẩn được giữ giống phát triển lại bình thường vì trong quá trình bảo quản ở nhiệt độ thấp trong thời gian dài chúng có thể bị suy yếu. Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật, đảm 42 Đồ án tốt nghiệp bảo có đủ các điều kiện hoá lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trường. Đối với các giống vi khuẩn chỉ thị được giữ trong glycerol 40%, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trường TSB trong điều kiện vô trùng. Sau đó tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy (Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013). Mật độ tế bào vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang OD ở bước sóng 600nm. Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (công thức McFahrland): 9 Mật độ = OD600nm x 1,02 x 10 (cfu/ml). 2.3.5. Phương pháp pha loãng mẫu Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng có vai trò quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lượng cũng như phân tích vi sinh vật. Phương pháp pha loãng mẫu (mẫu lỏng và mẫu rắn) chỉ được sử dụng trong trường hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu. Cách tiến hành: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi được nồng độ cần thiết. (Phạm Minh Nhựt, 2013). 2.3.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết được đánh giá bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch dựa trên phương pháp của Anonymous (1996) và Hadacek, ctv (2000) có sự điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm . Nguyên tắc: Dịch cao chiết ở các giếng sẽ khuếch tán vào môi trường thạch và tác động lên các chủng khuẩn chỉ thị. Nếu cao chiết có khả năng ức chế các chủng 43 Đồ án tốt nghiệp vi khuẩn thì sẽ xuất hiện quầng trong bao quanh các giếng thạch (vòng ức chế). Từ đó, đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết bằng cách đo đường kính vòng ức chế (mm). Tiến hành: - Các chủng vi khuẩn được hoạt hóa từ ống giống gốc trong môi trường lỏng TSB, lắc qua đêm. Cấy trang 100 µL dịch khuẩn (mật độ tế bào tương đương 106 cfu/ml) lên bề mặt đĩa petri có chứa môi trường TSA và tiến hành đục giếng với đường kính 6 mm. Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần. - Đối chứng là dung dịch kháng sinh Ciprofloxacin. 2.3.7. Phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết. 2.3.7.1. Phương pháp DPPH Nguyên tắc: DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là một gốc tự do bền, dung dịch có màu tím, bước sóng cực đại hấp thu tại 517 nm. Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu ánh sáng của các gốc tự do tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt [6]. Hoạt tính chống oxi hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy so màu ở bước sóng 517nm (Pisoschi and Negulescu, 2012). Hình 2.1: DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 44 Đồ án tốt nghiệp chất kháng oxy hóa DPPH DPPHH Hình 2.2: Phản ứng trung hòa gốc DPPH Khả năng kháng oxy hóa của một chất được biểu hiện bằng giá trị EC50, nồng độ chất kháng oxy hóa để có thể ức chế 50% gốc tự do DPPH. Giá trị EC50 càng nhỏ, hoạt tính kháng oxy hóa càng mạnh. EC50 là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát. EC50 (Effective Concentration of 50%) được định nghĩa là nồng độ (µg/mL) của chất kháng oxy hoá mà tại đó nó có thể loại bỏ 50% gốc tự do, tế bào hoặc enzyme, mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị EC50 sẽ càng thấp. Giá trị EC50 được xác định bằng phương pháp lập phương trình đường chuẩn y = ax + b. Với các giá trị x bao gồm nhiều nồng độ khác nhau. Khi phần trăm (%) ức chế tuyến tính với nồng độ mẫu, cho y = 50% và thay vào phương trình đã có, từ đó được giá trị x chính là EC50. Tiến hành Chuẩn bị mẫu chiết ở các nồng độ khác nhau trong DMSO. Mẫu đối chứng được sử dụng là axit ascorbic. Sau đó, 1,0 ml DPPH với nồng độ thích hợp được pha trong methanol vào 0,2 ml dung dịch của mẫu chiết và mẫu đối chứng. Để yên và ủ ở nhiệt độ phòng trong buồng tối khoảng 30 phút. Sự thay đổi màu sắc từ màu tím đậm sang vàng sau đó được đo ở 517 nm [18]. 45 Đồ án tốt nghiệp Khả năng ức chế gốc tự do DPPH được xác định thông qua phần trăm ức chế Q (%) được tính theo công thức sau Q% = Với ODtrắng: giá trị mật độ quang của mẫu trắng (control) ODmẫu: giá trị mật độ quang của mẫu thử (sample). 2.3.8. Phương pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết Các nhóm hợp chất hữu cơ có trong mẫu cao chiết được định tính cơ bản bằng phương pháp tiến hành một số thử nghiệm hóa học của chúng với các loại hóa chất, thuốc thử đặc trưng (N.Raaman, 2006). Nguyên tắc: Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết bằng các phản ứng hóa học theo các phương pháp thông dụng trong phòng thí nghiệm đã được chuẩn hóa để sơ bộ hóa thành phần hoạt chất. (Lương Văn Tiến và ctv, 2015). Cách tiến hành: Cao chiết được đem ngâm trong dung môi thích hợp, tiến hành lọc và thu dịch lọc. Sau đó dùng dịch cao chiết này tiến hành định tính các thành phần hóa học với các loại hóa chất, thuốc thử đặc trưng. 2.3.8.1. Định tính thành phần carbohydrate - Thử nghiệm Molisch: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm và thêm 5-6 giọt thuốc thử Molisch. Sau đó, nhỏ từ từ 1 ml H2SO4 đậm đặc trên thành ống nghiệm và quan sát hiện tượng. Nếu hình thành vòng màu đỏ - tím ở lớp ngăn cách cho thấy có sự hiện diện của carbohydrates. - Thử nghiệm Fehling: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm sau đó thêm lần lượt 1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B. Ống nghiệm được đun cách thủy trong 5 phút và đọc kết quả. Quan sát phần đáy ống nghiệm nếu xuất hiện kết tủa màu đỏ của Cu2O chứng tỏ có sự hiện diện của carbohydrate. - Thử nghiệm Barfoed: 2 ml dịch mẫu được cho vào ống nghiệm, tiến hành thêm 2 ml thuốc thử Barfoed. Sau đó, đun cách thủy ống nghiệm chứa hỗn hợp trong 5 phút, làm lạnh và quan sát kết quả. Thử nghiệm Barfoed dương tính (+) khi đáy ống nghiệm có sự hình thành kết tủa màu đỏ gạch. 46 Đồ án tốt nghiệp 2.3.8.2. Định tính thành phần alkaloid - Thử nghiệm Mayer: Cho vài giọt thuốc thử Meyer vào ống nghiệm có chứa 2 ml dịch mẫu, quan sát hiện tượng và đọc kết quả. Thử nghiệm Mayer dương tính (+) khi kết tủa màu trắng hoặc trắng đục được tạo thành. - Thử nghiệm Dragendorff: Hút 2 ml dịch lọc mẫu cho vào ống nghiệm sau đó thêm 1 hoặc 2 ml thuốc thử Dragendorff và quan sát hiện tượng. Nếu hình thành kết tủa màu vàng cam chứng tỏ có sự hiện diện của nhóm alkaloid trong mẫu cao, thử nghiệm dương tính (+). - Thử nghiệm Hager: Thêm 2 ml thuốc thử Hager vào ống nghiệm chứa 2 ml dịch mẫu. Nếu kết tủa màu vàng được tạo thành dưới đáy ống nghiệm thì cho biết thử nghiệm Hager dương tính (+). - Thử nghiệm Wagner: Tiến hành hút 2 ml dịch cao mẫu cho vào ống nghiệm, sau đó thêm 2ml thuốc thử Wagner và đọc kết quả.Thử nghiệm Wagner dương tính (+) khi phần đáy ống nghiệm có sự hình thành kết tủa màu nâu đỏ. 2.3.8.3. Định tính thành phần saponin - Thử nghiệm Foam (xà phòng): Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm và lắc mạnh. Sau 10 - 15 phút, nếu lớp bọt hình thành sau khi lắc vẫn còn, cho thấy sự hiện diện của saponin, thử nghiệm Foam (xà phòng) dương tính (+). 2.3.8.4. Định tính thành phần cardiac glycoside - Thử nghiệm Legal: 2 ml dịch cao mẫu được cho vào ống nghiệm, sau đó thêm lần lượt 1 ml pyridine và 1 ml Natri nitro prusside, và tiếp tục nhỏ 5 – 6 giọt NaOH 10% vào ống nghiệm, sau đó quan sát và đọc kết quả. Nếu dung dịch trong ống nghiệm xuất hiện màu hồng đến đỏ đậm thì chứng tỏ có sự hiện diện của cardiac glycoside, thử nghiệm Legal dương tính (+). - Thử nghiệm Keller Killiani: Thêm 2 ml acid acetic glacial vào ống nghiệm chứa 2 ml dịch mẫu và tiếp tục thêm 1 ml dung dịch FeCl3. Sau đó cho từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc vào ống nghiệm trên và quan sát hiện tượng. Thử nghiệm Keller Killiani dương tính (+) khi ống nghiệm xuất hiện màu xanh trong lớp acid acetic. 47 Đồ án tốt nghiệp 2.3.8.5. Định tính thành phần anthraquinone glycoside - Thử nghiệm Bontrager: Hút 2 ml dịch cao mẫu cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml H2SO4 loãng và đun sôi ống nghiệm, tiến hành lọc nóng và để nguội dịch lọc. Tiếp tục thêm vào dung dịch trên 3 ml benzene và lắc đều rồi để yên.Tiến hành tách lấy lớp benzene và thêm vào 2 ml ammonia và quan sát. Nếu màu trong lớp ammonia chuyển sang màu đỏ chứng tỏ có sự hiện diện của Anthraquinone glycoside, thử nghiệm Bontrager dương tính (+). 2.3.8.6. Định tính thành phần flavonoid - Thử nghiệm Alkaline: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm và thêm vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng. Sau đó, tiếp tục thêm vào vài giọt HCl loãng và quan sát. Nếu dung dịch trong ống nghiệm xuất hiện màu vàng khi bổ sung NaOH và mất màu khi cho HCl chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid. Nên thực hiện mẫu cao với đối chứng nước cất để so sánh. - Thử nghiệm Ferric chloride: Thêm 2 ml dịch cao mẫu và vài giọt thuốc thử Ferric chloride 10% cho vào ống nghiệm. Nếu trong ống nghiệm xuất hiện màu xanh hoặc tím thì chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid. 2.3.8.7. Định tính hợp chất phenolic - Thử nghiệm Chì acetate: Cho 1,5 ml Chì acetate 10% vào ống nghiệm chứa 2 ml dịch mẫu và quan sát hiện tượng. Nếu có xuất hiện kết tủa trắng ở phần đáy ống nghiệm thì chứng tỏ sự hiện diện của hợp chất phenolic. - Thử nghiệm Gelatin: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm và thêm một vài giọt gelatin 1% và đọc kết quả. Thử nghiệm Gelatin dương tính (+) nếu trong ống nghiệm có xuất hiện kết tủa trắng. 2.3.8.8. Định tính thành phần tannin - Thử nghiệm Ferric chloride: 2 ml dịch cao được cho vào ống nghiệm. Sau đó thêm lần lượt 2 ml NaCl 10% và 4 giọt ferric chloride 10%. Quan sát hiện tượng nếu dung dịch trong ống chuyển sang màu xanh chứng tỏ có sự hiện diện của tannin. 48 Đồ án tốt nghiệp - Thử nghiệm Chì acetate: 2 ml dịch cao được cho vào ống nghiệm. Sau đó thêm lần lượt 2 ml NaCl 10% và 4 giọt chì acetate 10%. Quan sát hiện tượng nếu trong ống có xuất hiện kết tủa màu vàng thì chứng tỏ có sự hiện diện của tannin. 2.3.8.9. Định tính thành phần steroid - Thử nghiệm Salkowski: 2 ml dịch mẫu được cho vào ống nghiệm và thêm vào 2 ml chloroform. Sau đó, nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc,và lắc mạnh ống nghiệm rồi để yên cho tách thành 2 lớp. Tiến hành đọc kết quả ở mặt phân cách. Nếu trong ống xuất hiện màu đỏ ở lớp dưới cho thấy sự hiện diện của sterol. Nếu hình thành màu vàng ở lớp dưới cho thấy sự hiện diện của triterpenoid. - Thử nghiệm Libermann Burchard: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm và thêm vào 2 ml acetic anhydride. Ống nghiệm được đem đi đun sôi và làm nguội nhanh. Sau đó, nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm và quan sát, đọc kết quả. Nếu trong ống xuất hiện màu đỏ ở mặt phân cách cho thấy sự hiện diện của sterol. Nếu hình thành vòng màu nâu đỏ đậm cho thấy sự hiện diện của triterpenoid. 2.3.8.10. Định tính thành phần amino acid - Thử nghiệm Ninhydrin: Thêm vào ống nghiệm 1 ml dịch mẫu và một vài giọt thuốc thử Ninhydrin. Đun sôi cách thủy ống nghiệm trong 5 phút và đọc kết quả. Thử nghiệm dương tính khi dung dịch trong ống nghiệm xuất hiện màu tím. 2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2007 và phần mềm SAS version 9.4 với trắc nghiệm Tukey. Dữ liệu phân tích theo phương sai One- way ANOVA (P < 0,05) có ý nghĩa thống kê. 49 Đồ án tốt nghiệp 2.4. Bố trí thí nghiệm Các thí nghiệm tiến hành đánh giá sự ảnh hưởng của dung môi EtOH 70% đến hoạt tính của cây Lactuca indica L được trình bày ở hình 2.3. Mẫu lá bồ công anh Ngâm trong dung môi EtOH 70% Tách chiết và thu hồi cao Cao chiết bồ công anh (LiEE) Khảo sát hoạt tính Khảo sát khả năng Định tính một số kháng khuẩn kháng oxy hóa thành phần hóa học Định lượng một số thành phần hóa học Đánh giá kết qu...00 ± 0,00b 11.83± 0.29a NA S. flexneri NA 9,50 ± 0,71c 14,50 ± 2.29a 13,17 ± 0,29b S. sonnei 10,00 ± 0,00c 9,67 ± 0,29c 11,17 ± 0,76b 33,00 ± 0,50a V. alginolyticus NA NA 12,00 ± 2,65b 16,17 ± 0,29a V.cholerae NA NA NA 13,33 ± 0,58a V. harveyi NA 10,00 ± 1,00c 13,17 ± 0,76b 18,00 ± 0,50a V. parahaemolyticus NA 11,33 ± 1,15b 13,67 ± 1,53a 11,33 ± 0,29a P. aeruginosa NA 10,50 ± 1,32a 11,00 ± 0,50a 12,17 ± 0,58a S. aureus NA 11,00 ± 0,50b 13,33 ± 1,53a 12,17 ± 0,29b a b E. feacalis NA NA 16,17 ± 1,76 12,00 ± 0,50 NA: non activity 66 Đồ án tốt nghiệp Dựa vào kết quả tổng hợp hoạt tính ức chế được trình bày ở bảng 3.1, chúng tôi nhận thấy rằng khả năng ức chế vi khuẩn chỉ thị của LiEE phụ thuộc vào nồng độ khảo sát. Ở nồng độ 50 mg/ml, LiEE chỉ kháng được S. sonnei (đường kính vòng ức chế 10,00 mm), nồng độ 100 mg/ml kháng 12/20 chủng vi khuẩn khảo sát, và nồng độ 200 mg/ml thể hiện hoạt tính ức chế đối với 16/20 chủng vi khuẩn khảo sát với đường kính vòng ức chế từ 10,00 mm đến 16,50 mm. Mặc dù, phần lớn vòng ức chế vi khuẩn chỉ thị của LiEE thấp hơn một cách có ý nghĩa thống kê so với ciprofloxacin nhưng LiEE vẫn thể hiện phổ kháng khuẩn rộng. Các chủng vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm này đều thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột, (ngoại trừ S. aureus, P. aeruginosa và E. feacalis). S. typhii gây ra bệnh sốt thương hàn; S. enteritidis, S. flexneri gây tiêu chảy; S. sonnei, S. boydii gây bệnh kiết lỵ với những triệu chứng rất nguy hiểm; E. coli gây ra tiêu chảy; Vibrio spp. gây ra rất nhiều bệnh nghiêm trọng ở người như dịch tả (V. cholerae), viêm dạ dày ruột (V. parahaemolyticus) và những chủng này bị ức chế bởi LiEE. Kết quả này cho thấy rằng LiEE là một liệu pháp rất có tiềm năng trong việc điều trị các bệnh do vi khuẩn đường ruột gây ra. Việc sử dụng các loại thảo dược nói chung và Bồ Công anh nói riêng sẽ là một giải pháp toàn diện trong việc điều trị các bệnh do vi khuẩn gây ra nhằm hạn chế tình trạng kháng thuốc đồng thời thay thế cho kháng sinh sử dụng hiện nay. 3.3. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá của cao chiết ethanol từ Bồ Công anh. 3.3.1. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá dựa trên sự loại bỏ gốc tự do DPPH của vitamin C DPPH là phương pháp được sử dụng rộng rãi để kiểm tra khả năng làm sạch gốc tự do và các nhóm cho hydro, phương pháp này cũng được sử dụng để định lượng các chất oxy hóa. Những electron lẻ có trong gốc tự do DPPH cho sự hấp thu mạnh nhất ở bước sóng 517 nm và hợp chất này có màu tím. Khi các electron lẻ này kết hợp với hydro của chất kháng oxy hóa để hình thành dạng DPPH-H, hợp chất sẽ chuyển từ màu tím sang vàng tương ứng với lượng electron kết hợp với DPPH 67 Đồ án tốt nghiệp (Prakash, 2000). Vì vậy, khả năng làm sạch gốc tự do của một chất càng cao thì sự hấp thu quang phổ được đo ở bước sóng 517 nm của phản ứng DPPH có giá trị càng thấp và ngược lại. Khả năng kháng oxy hóa của LiEE được khảo sát dựa trên hàm lượng chất kháng oxy hóa có trong LiEE được tính tương đương μg/mL vitamin C dựa vào phương trình đường chuẩn y = - 0,0261x + 1,0294 (R2 = 0,997) trình bày trong Hình 3.7. 1.4 1.2 ) m n 7 1 1 y = -0.0261x + 1.2094 5 D R² = 0.99679 O 0.8 ( g n a Mật độ quang 0.6 u q Linear (Mật độ quang) ộ đ t 0.4 ậ M 0.2 0 0 10 20 30 40 50 Nồng độ vitamin C (ug/ml) Hình 3.7: Đường chuẩn khảo sát khả năng kháng oxy hoá của vitamin C (g/ml) Vitamin C được biết là chất kháng oxy hóa nên trong phản ứng với DPPH, một electron của vitamin C sẽ kết hợp với DPPH tạo thành DPPH-H, nên lượng gốc tự do DPPH trong phản ứng giảm. Kết quả là mật độ quang (OD) của DPPH ở bước sóng 517 nm giảm. Tỷ lệ giảm giá trị OD được xem nhu hiệu suất kháng oxy hóa của một chất. Theo kết quả ở Hình 3.7 cho thấy mật độ quang giảm khi tăng nồng độ chất kháng oxy hóa là vitamin C. 68 Đồ án tốt nghiệp 3.3.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá của LiEE Kết quả đánh giá hoạt tính kháng oxy hoá của LiEE thông qua việc bắt giữ gốc tự do DPPH được trình bày ở Hình 3.8. 80.00% 70.00% ) % ( 60.00% o d ự t 50.00% c ố g ỏ 40.00% b i ạ o l t 30.00% ấ u s u 20.00% ệ i H 10.00% 0.00% 1 (mg/ml) 0.8 (mg/ml) 0.6 (mg/ml) 0.4 (mg/ml) 0.2 (mg/ml) 0.1 (mg/ml) Nồng độ cao chiết Hình 3.8: Khả năng bắt gốc tự do DPPH của LiEE ở các nồng độ khác nhau Dựa vào kết quả đánh giá khả năng bắt gốc tự do DPPH của LiEE ở các nồng độ khảo sát đươc trình bày ở hình 3.8, nhận thấy rằng LiEE có hiệu quả kháng oxy hoá với tỷ lệ loại bỏ gốc tự do khá cao. Hiệu quả loại bỏ gốc tự do của LiEE phụ thuộc vào nồng độ khảo sát, nồng độ LiEE càng cao thì hiệu quả bắt gốc tự do càng mạnh. Ở nồng độ khảo sát thấp nhất là 100 μg/ml thì hiệu quả kháng oxy hoá đạt 38,05%. Từ kết quả này, tiến hành xác định hàm lượng chất kháng oxy hoá có trong LiEE theo vitamin C dựa vào phương trình đường chuẩn y = - 0,0261x + 1,2094 (R2 = 0,9967). Kết quả được trình bày ở bảng 3.2. 69 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2: Hàm lượng chất kháng oxy hoá tương đương g/ml vitamin C ở các nồng độ cao chiết khảo sát Nồng độ cao chiết Hàm lượng chất kháng oxy hoá tương đương (g/ml) g/ml vitamin C 1000 34,74  0,54 800 31,16  0,59 600 30,19  0,37 400 24,96  0,33 200 21,98  0,31 100 20,07  0,79 Kết quả này cho thấy rằng, hàm lượng chất chống oxy hoá tương đương với vitamin C hiện diện trong mẫu cao chiết LiEE khá cao. Khi so sánh hiệu quả loại bỏ gốc tự do DPPH và hàm lượng chất kháng oxy hoá tương đương với vitamin C của LiEE với cao chiết methanol từ lá Cỏ mực (Đái Thị Xuân Trang, 2016) khảo sát ở nồng độ 100 g/ml – 700 g/ml với hiệu quả loại bỏ gốc tự do đạt 38,76% ở nồng độ 700 g/ml và hàm lượng chất kháng oxy hoá tương đương với vitamin C là 13,39 g/ml, cho thấy rằng LiEE có hiệu quả kháng oxy hoá cao hơn rất nhiều, cụ thể ở nồng độ 100 g/ml đạt 38,05% và hàm lượng chất kháng oxy hoá tương đương với vitamin C là 20,07 g/ml. Trong một nghiên cứu khác của Đái Thị Xuân Trang và ctv (2015) về hoạt tính kháng oxy hoá của cao chiết methanol từ lá Hà Thủ ô trắng ở nồng độ 400 g/ml thì hoạt tính khử gốc tự do đạt 63,39% và hàm lượng chất kháng oxy hoá tương đương với vitamin C là 29,18 g/ml, kết quả này cao hơn so với hoạt tính của LiEE ở nồng độ 400 g/ml. Từ kết quả khảo sát hiệu quả kháng oxy hoá của LiEE thông qua việc loại bỏ gốc tự do DPPH, chúng tôi xác định hiệu quả loại bỏ 50% gốc tự do (Effective concentration of 50% - EC50) (Prakash, 2000; Nguyễn Quang Vinh, 2011). Giá trị EC50 dựa vào phương trình hồi quy của LiEE và trình bày ở bảng 3.3. 70 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.3: Hiệu quả loại bỏ 50% gốc tự do của LiEE và vitamin C Nghiệm thức Giá trị EC50 (g/ml) LiEE 542,35 Vitamin C 35,25 Hiệu quả loại bỏ 50% gốc tự do (EC50) của LiEE được trình bày trong bảng 3.3 cho thấy rằng giá trị EC50 của LiEE đạt 542,35 g/ml. Xem xét giá trị EC50 của cao chiết methanol từ cây Cỏ mực, đạt 564,83 g/ml (Đái Thị Xuân Trang, 2016) thì LiEE thấp hơn, có nghĩa là hoạt tính kháng oxy hoá của LiEE cao hơn cao methanol từ Cỏ mực. Nhưng khi so sánh với giá trị EC50 từ Hà Thủ ô trắng (349,35 g/ml) thì LiEE cao hơn nên hoạt tính kháng oxy hoá thấp hơn so với cao chiết methanol từ Hà thủ ô trắng. Mặc dù hoạt tính kháng oxy hoá khá tốt nhưng lại thấp hơn rất nhiều so với vitamin C (35,25 g/ml) 3.4. Kết quả xác định sơ bộ thành phần hoá học của LiEE Kết quả các định thành phần hóa học của cao chiết ethanol 70% từ cây Bồ Công anh được trình bày ở bảng 3.4. 71 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4: Kết quả định tính một số thành phần hóa học trong LiEE Nhóm hợp chất Thử nghiệm Kết quả Thử nghiệm Molisch + Carbohydate Thử nghiệm Fehling +++ Thử nghiệm Barfoed +++ Thử nghiệm Mayer + Thử nghiệm Dragendorff ++ Alkaloid Thử nghiệm Hager +++ Thử nghiệm Wagner ++ Saponin Thử nghiệm xà phòng + Thử nghiệm Legal ++ Cardiac Glycoside Thử nghiệm Keller Killiani + Anthraquinone Glycoside Thử nghiệm Bontrager - Thử nghiệm Alkaline + Flavonoid Thử nghiệm Shinoda + Thử nghiệm Ferric chloride +++ Thử nghiệm Chì acetate - Phenolics Thử nghiệm Gelatin - Thử nghiệm Ferric chloride + Tannin Thử nghiệm Chì acetate + Thử nghiệm Salkowski Triterpen Steroid Thử nghiệm Libermann Burchard Triterpen Amino Acid Thử nghiệm Ninhydrin +++ (-): không có; (+): ít; (++): vừa; (+++): nhiều. Dựa vào kết quả định tính thành phần hóa học của cao chiết EtOH 70% từ Bồ Công anh được trình bày ở bảng 3.2, chúng tôi nhận thấy rằng trong dung môi EtOH 70% có khả năng tách chiết được rất nhiều hợp chất từ cây Bồ Công anh bao gồm các hợp chất thông thường và cả những hợp chất có hoạt tính sinh học. Các hợp chất thông thường được tìm thấy trong cao chiết EtOH 70% của cây Bồ Công 72 Đồ án tốt nghiệp anh thấy có sự hiện diện của hầu hết các nhóm carbohydrate (thử nghiệm Molisch, Fehling và Barfoed đều dương tính) và có sự hiện diện của amino acid. Trong cao chiết EtOH 70% của cây Bồ Công anh có sự hiện diện của nhiều nhóm các hợp chất có hoạt tính sinh học bao gồm các loại hợp chất trong alkaloid, saponin, cardiac glycoside, anthraquinone glycoside, flavonoid, tannin, nhóm steroid và nhóm các hợp chất phenol. Hoạt tính kháng khuẩn của thực vật nói chung và của cao chiết Bồ Công anh nói riêng là do chúng có các thành phần alkaloids, flavonoid, hợp chất phenolic, tannin. Theo nghiên cứu của Cowan (1999), xét cụ thể ở hợp chất alkaloids có thể thấy tồn tại dẫn chất berberine và dẫn chất piperrine có chức năng xen vào thành tế bào hoặc DNA của vi sinh vật phá hủy và tiêu diệt chúng. Trong khi đó, trên hợp chất phenolic thấy sự tồn tại của các dẫn chất như catechol, epicatechin, cinnamic acid, hypericin warfarin hay trong hợp chất của flavonoids có dẫn chất flavone và flavonols, ngoài ra còn có hợp chất tannin có dẫn chất ellagitannin, ở hợp chất terpennoids, tinh dầu thì có dẫn chất là capsaicin. Tất cả các dẫn chất trên đều có chức năng phá vỡ màng tế bào, liên kết bám dính, tạo phức hợp với thành tế bào, khử hoạt tính enzyme và bám dính protein, các chức năng trên giúp tiêu diệt vi sinh vật. 73 Đồ án tốt nghiệp KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Hàm lượng cao chiết ethanol 70% từ mẫu lá cây bồ công anh cho kết quả là 13,62 %. - Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của LiEE trên 20 chủng gây bệnh tiêu chảy và bệnh cơ hội trên da cho thấy cao chiết lá bồ công anh có phổ hoạt động rộng và có ức chế 18/20 chủng vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm cho người ở nồng dộ 200 mg/ml. - Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của LiEE cho thấy hiệu quả loại bỏ gốc tự do khá cao. Hiệu quả kháng oxy hóa ở nồng độ khảo sát thấp nhất là 100 μg/ml đạt 38,05% và cao nhất đạt 72,62% ở nồng độ 1000 μg/ml. Hiệu quả EC50 của LiEE đạt 542,35 μg/ml. - Qua các thử nghiệm định tính sơ bộ thành phần hóa học có thể kết luận mẫu cao chiết lá bồ công anh từ EtOH 70% có chứa các hoạt chất kháng khuẩn quan trọng gồm có flavonoid, alkaloid, hợp chất của glycosisde, tannin, amino acid và steroid. Kiến nghị - Đánh giả khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ lá bồ công anh trên nhiều loại dung môi với nhiều vi sinh vật gây bệnh khác. - Đánh giá khả năng kháng oxy hóa của các loại cao chiết khác nhau từ lá cây bồ công anh. - Định lượng các thành phần hóa học chủ yếu khác của cao chiết từ lá cây bồ công anh. 74 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt 1. Đái Thị Xuân Trang, Lâm Hồng Bảo Ngọc, Võ Thị Tú Anh; Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hóa của cao chiếc methanol cây hà thủ ô trắng; tập chí khoa học trường đại học Cần thơ; 2015 2. Đào Thị Kim Nhung, Một số đặc tính hóa học và sinh học của flavonoid trong cây thuốc thanh nhiệt Smilax glabra Roxb.,Lactuca indica L.,Lonicera japonica., 1996. 3. Đỗ Huy Bích, Bùi Xuân Chương, Sổ tay cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản y học, tr. 61, 1980. 4. Đỗ Huy Bích, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Kim Mãn, và một số tác giả khác, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr. 235-237, 2004. 5. Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản y học, tr. 92- 94, 1999. 6. Lê Thanh Tâm, Nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa và độc tính tế bào của một số hợp chất lignan và stilbene, 2010. 7. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản Montréal, quyển 3 tập 1, tr. 387, 1993. 8. Tài nguyên cây thuốc Việt Nam (1993), Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr. 92-96, 1993. 9. Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản y học, tr. 112, 1997. 10. Vũ Văn Điền, Hoàng Kim Huyền, Nguyễn Thị Hải Yến, Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học, thăm dò một số tác dụng dược lý của cây bồ công anh Việt nam, Tạp chí dược liệu Số 2, tr. 5, 2000. 11. Phạm Thanh Kỳ, Bài giảng dược liệu, NXB Trung tâm thông tin thư viện - ĐH dược Hà nội, 1998 12. Nguyễn Thị Hằng và ctv, Hoạt tính kháng khuẩn và kháng ung thư của loài Tầm gửi 5 nhụy (Dendropthoe pentadra), 2015. 75 Đồ án tốt nghiệp 13. Huỳnh Ngọc, Flavonoid - bảo vệ sức khỏe an toàn. NXB Trung tâm thông tin KHCN tp.HCM, 2013. 14. Đỗ Thị Túy Phượng, Xây dựng quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn và chống oxy hóa của một số hợp chất thứ cấp từ lá cây Xuân Hoa. Khóa luận tốt nghiệp ĐH Nông Lâm Tp.HCM, 2007 Tiếng anh 15. Aliyu, Ibrahim, Ibrahim, Musa, Lawal, Oshanimi, Usman, Abdulkadir, Oyewale, Amupitan, Free radical scavenging and total antioxidant capacity of methanol extract of Ethulia conyzoides growing in Nigeria, Romanian Biotechnological Letters, Vol.17, No.4, 2012. 16. A.T.Khali, H.Abd El - Fattah and E.S.Mansour, GuaianoUdes from Lactuca saligna ỊL, Planta Med 57, 190 – 191, 1991 17. Ara, n., Nur, h., In vitro antioxidant activity of methanolic leaves and flowers extracts of Lippia alba. Res. J. Med. Medical Sci., 4(1): 107-110, (2009). 18. Burda, S. and Oleszek, W., Antioxidant and Antiradical Activities of Flavonoids. J. Agric. Food Chem., 49, 2774-2779 (2001). 19. Hou CC , Lin ST, Cheng JT, Hsu F, Antidiabetic dimeric guianolides and a lignan glycoside from Lactuca indica L ., Jnat Prod. 66(5), 625-629, 1996. 20. Lin Y., Tsai Y., Tsai J., Lin J., Factors affecting the levels of tea polyphenols and caffeine in tea leaves, J. Agric. Food. Chem. 51 (2003) 1864–1873. 21. Naomi Ishi Hara, Toshio Miyase and Akira Ueno, Sercfuiterpenglvcosides from Lactuca Santa L., Chem Pharm Bull, Vol 35, 3905-3908, 1987. 22. Park Hee Juhn, Lee Myung Sum, Serum cholesterol-Lowering effects and triterpenoids of the herbs of Lactuca indica L, 63 Pharmaceutical vol 123, 671, 65634n, 1995 23. Stojakowska, Anna, Malarz, Janusz, Haịrỵ rooj culture of Lactuca virosa L., Chemical Abstracts 11-Plant biochemistry Vol .124, No 23, 703, 312379c, 1996. 24. Vadakkemuriyil Divya Nair, Rajaram Panneerselvam, Ragupathi Gopi, Studies on methanolic extract of Rauvolfia species from Southern Western Ghats of 76 Đồ án tốt nghiệp India – In vitro antioxidant properties, characterisation of nutrients and phytochemicals, Industrial Crops and Products, Vol. 39, pp. 17-25, 2012. 25. Wang SY, Chang HN, Lin KT, Lo CF, Yang NS, Anti oxidant properties of extracts from Lactuca indica L., J Agric food Chemm, 51(5), 1506-1512, 2003. 77 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT TỪ LÁ BỒ CÔNG ANH ĐỐI VỚI CÁC NHÓM VI KHUẨN GÂY BỆNH A.1. Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn của LiEE từ các nồng độ khác nhau và Ciproffloxacin (500 µg/ml) trên nhóm vi khuẩn Escherichia coli (d = 6 mm) Vi khuẩn Ciproffloxacin 50 mg/ml 100 mg/ml 200 mg/ml chỉ thị (500 µg/ml) E. coli O157:H7 - - - 10 10,5 11 15 15 14.5 13 13 13,5 E. coli 0208 - - - 10 11 11 11 9 10 12,5 12 12,5 E.coli - - - - - - 10 12 10 13 13 13,5 ETEC - - - 11 10 11 10 10 10 30,5 31 31,5 A.2. Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn của LiEE từ các nồng độ khác nhau và Ciproffloxacin (500 µg/ml) trên nhóm vi khuẩn Listeria spp. (d = 6 mm) Ciproffloxacin Vi khuẩn chỉ thị 50 mg/ml 100 mg/ml 200 mg/ml (500 µg/ml) L. innocua - - - 9 9,5 10 10,5 10,5 10,5 11,5 12 12,5 L. monocytogenes - - - 10 10,5 10,5 11 11 10 12 12 12,5 A.3. Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn của LiEE từ các nồng độ khác nhau và Ciproffloxacin (500 µg/ml) trên nhóm vi khuẩn Salmonella spp. (d = 6mm) Vi khuẩn Ciproffloxacin 50 mg/ml 100 mg/ml 200 mg/ml chỉ thị (500 µg/ml) S. dublin - - - - - - - - - 12 11,5 13 S. enteritidis - - - - - - 10 9 11 13,5 13 12,5 S. typhii - - - - - - 17 17,5 15 13 12 12,5 S. typhimurium - - - - - - - - - 11 11 11 1 Đồ án tốt nghiệp A.4. Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn của LiEE từ các nồng độ khác nhau và Ciproffloxacin (500 µg/ml) trên nhóm vi khuẩn Shigella spp. (d = 6 mm) Ciproffloxacin Vi khuẩn chỉ thị 50 mg/ml 100 mg/ml 200 mg/ml (500 µg/ml) S. boydii - - - 10 10 10 12 11.5 12 - - - S. flexneri - - - 9 10 10 17 14 12,5 13 13 13,5 S. sonnei - - - 9,5 10 9,5 12 10,5 11 33,5 33 32,5 A.5. Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn của LiEE từ các nồng độ khác nhau và Ciproffloxacin (500 µg/ml) trên nhóm vi khuẩn Vibrio spp. (d = 6 mm) Ciproffloxacin Vi khuẩn chỉ thị 50 mg/ml 100 mg/ml 200 mg/ml (500 µg/ml) V. alginolyticus - - - - - - 11 10 15 16,5 16 16 V.cholerae - - - - - - - - - 13 13 14 V. harveyi - - - 9 10 11 14 12,5 13 17,5 18 18,5 V. parahaemolyticus - - - 10 12 12 12 14 15 11,5 11,5 11 A.6. Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn của LiEE từ các nồng độ khác nhau và Ciproffloxacin (500 µg/ml) trên nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da (d= 6 mm) Vi khuẩn Ciproffloxacin 50 mg/ml 100 mg/ml 200 mg/ml chỉ thị (500 µg/ml) P. aeruginosa - - - 9 11 11,5 10,5 11,5 11 12.5 11.5 12.5 S. aureus - - - 11 11,5 10,5 15 12 13 12 12 12.5 E. feacalis - - - - - - 14,5 16 18 12 11.5 12.5 2 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B. KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU THỐNG KÊ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT LÁ BỒ CÔNG ANH ĐỐI VỚI CÁC NHÓM VI KHUẨN GÂY BỆNH B.1. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của LiEE đối với các nhóm vi khuẩn Escherichia coli. B.1.1. E.coli O157:H7 The ANOVA Procedure Table for KK by E0157H7 Source Sum of Squares DF Mean Square F Value Pr>F Model 399.2291667 3 133.0763889 1277.53 <.0001 Error 0.83333 8 0.1041667 Total (Corr.) 400.062500 11 Tukey's Studentized Range (HSD) for 0157H7.KK by E0157H7 Means with the same letter are not significantly differen. E0157H7 Count Mean Tukey Grouping ND200 3 14.8333 A CIP 3 13.1667 B ND100 3 10.5000 C ND50 3 0.0000 D B.1.2. E. coli 0208 The ANOVA Procedure Table for E0208.KK by E0208 Source Sum of Squares DF Mean Square F Value Pr>F Model 280.9166667 3 93.6388889 264.39 <.0001 Error 2.8333333 8 0.3531667 Total (Corr.) 283.75000 11 3 Đồ án tốt nghiệp Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for E0208.KK by E0208 Means with the same letter are not significantly different E0208 Count Mean Tukey Grouping CIP 3 12.3333 A ND100 3 10.6667 AB ND200 3 10.0000 B ND50 3 0.0000 C B.1.3. E. Coli The ANOVA Procedure Table for ECOLI.KK by ECOLI Source Sum of Squares DF Mean Square F Value Pr>F Model 435.395833 3 145.1319444 409.78 <.0001 Error 2.833333 8 0.3541667 Total (Corr.) 438.2291667 11 Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for ECOLI.KK by ECOLI Means with the same letter are not significantly different ECOLI Count Mean Tukey Grouping CIP 3 13.1667 A ND200 3 10.6667 B ND100 3 0.0000 C ND50 3 0.0000 D 4 Đồ án tốt nghiệp B.1.4. ETEC The ANOVA Procedure Table for ETEC.KK by ETEC Source Sum of Squares DF Mean Square F Value Pr>F Model 1522.250000 3 507.416667 3579.43 <.0001 Error 1.166667 8 0.145833 Total (Corr.) 1523.416667 11 Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for ETEC.KK by ETEC Means with the same letter are not significantly different ETEC Count Mean Tukey Grouping CIP 3 31.0000 A ND200 3 10.6667 B ND100 3 10.0000 B ND50 3 0.0000 C B.2. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của LiEE đối với các nhóm vi khuẩn Listeria spp. B.2.1. L. innocua The ANOVA Procedure Table for LISINNO.KK by LISINNO Source Sum of Squares DF Mean Square F Value Pr>F Model 265.5000000 3 88.5000000 708.00 <.0001 Error 1.0000000 8 1.0000000 Total (Corr.) 266.5000000 11 5 Đồ án tốt nghiệp Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for KK by LISINNO Means with the same letter are not significantly different LISINNO Count Mean Tukey Grouping CIP 3 12.0000 A ND200 3 10.5000 B ND100 3 9.5000 B ND50 3 0.0000 C B.2.2. L. Monocytogene Source Sum of Squares DF Mean Square F Value Pr>F Model 280.7291667 3 93.5763889 748.61 <.0001 Error 1.0000000 8 0.1250000 Total (Corr.) 281.7291667 11 Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for LISMONO.KK by LISMONO Means with the same letter are not significantly different LISMONO Count Mean Tukey Grouping CIP 3 12.1667 A ND200 3 10.6667 B ND100 3 10.3333 B ND50 3 0.0000 C 6 Đồ án tốt nghiệp B.3. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của LiEE đối với các nhóm vi khuẩn Salmonella spp. B.3.1. S. enteritidis The ANOVA Procedure Table for SENTER.KK by SENTER Source Sum of Squares DF Mean Square F Value Pr>F Model 410.2500000 3 136.7500000 437.60 <.0001 Error 2.5000000 8 0.3125000 Total (Corr.) 412.7500000 11 Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for SENTER.KK by SENTER Means with the same letter are not significantly different SENTER Count Mean Tukey Grouping CIP 2 13.0000 A ND200 2 10.0000 B ND100 2 0.0000 C ND50 3 0.0000 C B.3.2. S. typhii The ANOVA Procedure Table for STYPHI(K).KK by STYPHI Source Sum of Squares Df Mean Square F Value Pr>F Model 654.7500000 3 218.2500000 436.50 <.0001 Error 4.0000000 8 0.5000000 Total (Corr.) 658.7500000 11 7 Đồ án tốt nghiệp Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for STYPHI(K).KK by STYPHI Means with the same letter are not significantly different STYPHI Count Mean Tukey Grouping ND200 3 16.5000 A CIP 3 12.5000 B ND100 3 0.0000 C ND50 3 0.0000 C B.4. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của LiEE đối với các nhóm vi khuẩn Shigella spp. B.4.1.S. boydii The ANOVA Procedure Table for SHIBOYDII.KK by SHIBOYDII Source Sum of Squares DF Mean Square F Value Pr>F Model 225.0000000 3 75.0000000 Infty <.0001 Error 0.0000000 8 0.0000000 Total (Corr.) 225.0000000 11 Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for SHIBOYDII.KK by SHIBOYDII Means with the same letter are not significantly different SHIBOYDII Count Mean Tukey Grouping ND100 3 10.0000 A ND200 3 0.0000 B ND50 3 0.0000 B CIP 3 0.0000 B 8 Đồ án tốt nghiệp B.4.2. S. flexneri The ANOVA Procedure Table for SHIFLEXNERI.KK by SHIFLEX Source Sum of Squares DF Mean Square F Value Pr>F Model 385.8333333 3 128.6111111 90.78 <.0001 Error 11.3333333 8 1.4166667 Total (Corr.) 397.1666667 11 Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for SHIFLEXNERI.KK by SHIFLEX Means with the same letter are not significantly different SHIFLEX Count Mean Tukey Grouping ND200 3 14.5000 A CIP 3 13.1667 AB ND100 3 9.6667 B ND50 3 0.0000 C B.4.3. S. sonnei The ANOVA Procedure Table for SHISONNEI.KK by SHISONNEI Source Sum of Squares DF Mean Square F Value Pr>F Model 1165.395833 3 388.465278 1695.12 <.0001 Error 1.833333 8 0.229167 Total (Corr.) 1167.229167 11 Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for SHISONNEI.KK by SHISONNEI Means with the same letter are not significantly different SHISONNEI Count Mean Tukey Grouping CIP 3 33.0000 A ND200 3 11.1667 B ND50 3 10.0000 B 9 Đồ án tốt nghiệp ND100 3 9.6667 B B.5. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của LiEE đối với các nhóm vi khuẩn Vibrio spp. B.5.1. V. algino The ANOVA Procedure Table for VALGINO.KK by VALGINO Source Sum of Squares DF Mean Square F Value Pr>F Model 621.0625000 3 207.0208333 116.91 <.0001 Error 14.1666667 8 1.7708333 Total (Corr.) 635.2291667 11 Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for VALGINO.KK by VALGINO Means with the same letter are not significantly different VALGINO Count Mean Tukey Grouping CIP 3 16.1670 A ND200 3 12.0000 B ND100 3 0.0000 B ND50 3 0.0000 B B.5.2. V. Harveyi The ANOVA Procedure Table for VHARVEYI.KK by VHARVEYI Source Sum of Squares DF Mean Square F Value Pr>F Model 521.0625000 3 173.6875000 378.95 <.0001 Error 3.6666667 8 0.4583333 Total (Corr.) 524.7291667 11 10 Đồ án tốt nghiệp Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for VHARVEYI.KK by VHARVEYI Means with the same letter are not significantly different VHARVEYI Count Mean Tukey Grouping CIP 3 18.0000 A ND200 3 13.1667 B ND100 3 10.0000 C ND50 3 0.0000 D B.5.3.V.para The ANOVA Procedure Table for VPARA.KK by VPARA Source Sum of Squares DF Mean Square F Value Pr>F Model 340.9166667 3 113.6388889 121.21 <.0001 Error 7.50000 8 0.9375000 Total (Corr.) 348.4166667 11 Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for VPARA.KK by VPARA Means with the same letter are not significantly different VPARA Count Mean Tukey Grouping ND200 3 13.6667 A ND100 3 11.3333 A CIP 3 11.3333 A ND50 3 0.0000 B 11 Đồ án tốt nghiệp B.6. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của LiEE đối với các nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da. B.6.1. P. aeruginosa The ANOVA Procedure Table for PSEU.KK by PSEU Source Sum of Squares DF Mean Square F Value Pr>F Model 287.7500000 3 95.9166667 164.43 <.0001 Error 4.6666667 8 0.5833333 Total (Corr.) 292.4166667 11 Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for PSEU.KK by PSEU Means with the same letter are not significantly different PSEU Count Mean Tukey Grouping CIP 3 12.1667 A ND200 3 11.0000 A ND100 3 10.5000 A ND50 3 0.0000 B B.6.2. S. aureus The ANOVA Procedure Table for SAUREUS.KK by SAUREUS Source Sum of Squares DF Mean Square F Value Pr>F Model 341.2291667 3 113.7430556 170.61 <.0001 Error 5.3333333 8 0.6666667 Total (Corr.) 346.5625000 11 12 Đồ án tốt nghiệp Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for SAUREUS.KK by SAUREUS Means with the same letter are not significantly different SAUREUS Count Mean Tukey Grouping ND200 3 13.3333 A CIP 3 12.1667 A ND100 3 11.0000 A ND50 3 0.0000 B B.6.3. E.feacalis The ANOVA Procedure Table for EFEACALIS.KK by EFEACALIS Source Sum of Squares DF Mean Square F Value Pr>F Model 621.0625000 3 207.0208333 248.43 <.0001 Error 6.6666667 8 0.8333333 Total (Corr.) 627.7291667 11 Tukey's Studentized Range (HSD) Tests for EFEACALIS.KK by EFEACALIS Means with the same letter are not significantly different EFEACALIS Count Mean Tukey Grouping ND200 3 16.1667 A CIP 3 12.0000 B ND100 3 0.0000 C ND50 3 0.0000 C 13 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C. CÁCH PHA CÁC LOẠI THUỐC THỬ C.1. Thuốc thử Molisch Hòa tan 5g α- napthol vào ethanol 95% và pha loãng thành 100 ml. C.2. Thuốc thử Fehling - Thuốc thử Fehling A: 34,6 g CuSO4.5H2O được hòa tan hoàn toàn vào nước cất, sau đó tiếp tục định mức đến 500ml . - Thuốc thử Fehling B: Hòa tan 125g KOH và 173g Kali Natri tartrate.7H2O vào nước cất và định mức cho đến 500ml. C.3. Thuốc thử Barfoed Cân 66,5g Copper (II) acetate monohydrate hòa tan vào dung dịch gồm 10 ml acid acetic glacial và 1000ml nước cất. Hỗn hợp trên được mang đi đun và khuấy đến khi tan hoàn toàn. C.4. Thuốc thử Mayer: Hòa tan 1,358g HgCl2 trong 60ml nước cất. Tiếp tục cân 5g KI hòa tan trong 10ml nước cất. Sau đó tiến hành trộn 2 dung dịch trên lại với nhau và định mức bằng nước cất đến 100 ml. C.5. Thuốc thử Dragendorff: Gồm 2 dung dịch: - Dung dịch A: hòa tan 0,5 g Bismuth nitrate (Bi(NO3)3.5H2O) trong 20 ml acid acetic 20%. - Dung dịch B: dung dịch KI 40% hòa tan trong nước cất. Khi sử dụng, trộn 20 ml dung dịch A với 5 ml dung dịch B và 70ml nước cất. C.6. Thuốc thử Hager Hòa tan 1 g acid picric vào 100ml nước cất, sau đó tiến hành lọc dung dịch trên và thu dịch lọc. C.7. Thuốc thử Wagner Hòa tan 2g I2 và 6g KI vào nước cất và định mức đến 100ml. Thuốc thử là dung dịch tan hoàn toàn, tránh sự tiếp xúc ánh sáng. C.8. Natri nitro prusside Hòa tan 1g Natri nitroferricyanide vào 10 ml nước cất. 14 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC D. MỘT SỐ HÌNH ẢNH KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC D.1. Thử nghiệm xác định carbohydrate: Molisch Fehling Barfoed A B C D.2. Thử nghiệm xác định alkaloid và saponin: Xác định alkaloid Xác định saponin Wagner Hager Dragendorff Tạo bọt D E 15 Đồ án tốt nghiệp D.3. Thử nghiệm xác định flavonoid Xác định flavonoid Alkaline Ferric chloride F G D.4. Thử nghiệm xác định các hợp chất phenolic và steroid: Xác định steroid Xác định amino acid Libermann-Burchard Ninhydrin I H 16 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC E. MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM KHÁNG KHUẨN E.1. Vòng kháng khuẩn ở nồng độ 100 mg/ml A B C D A: Vibiro harveyi B: Listeria innocua C: Escheriachia coli O157:H7 D: Shigella flexneri E.2. Vòng kháng khuẩn ở nồng độ 200 mg/ml E F 17 Đồ án tốt nghiệp G H I K E: Vibiro alginolyticus F: Listeria monocytogenes G: Escheriachia coli 0208 H: Salmonella enteritidis I: Pseudomonas aeruginosa K: Shigella sonnei 18