Đồ án Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cao chiết nước từ thực vật tại vườn quốc gia bidoup Núi bà, tỉnh Lâm Đồng

ội dung tôi viết trong đồ án này đều do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của ThS Phạm Minh Nhựt khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo. Ngoài ra, trong đồ án còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc. Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn của mình. Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Trần Thị Tú Vy Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời tri ân đến thầy Phạm Minh Nhựt đã tận tình chỉ dạy em trong suốt quá trình thực hiện đồ án. Xin cảm ơn thầy về những buổi học trên lớp, những buổi nói chuyện, thảo luận, nhờ đó em đã củng cố thêm sự đam mê và định hướng được nghiên cứu khoa học của mình. Ngoài ra, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã tận tình truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm cho em trong suốt quãng thời gian học tập tại Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM. Những kiến thức và kinh nghiệm này không chỉ giúp em thực hiện đồ án tốt nghiệp mà còn là nền tảng kiến thức cho công việc sau này. Em cũng xin cảm ơn thật nhiều những giúp đỡ và hỗ trợ từ các bạn cùng thực hiện đề tài trong phòng thí nghiệm – những người luôn sát cánh, động viên em hoàn thành đồ án tốt nghiệp. Cuối cùng, em xin cảm ơn các thầy cô trong Hội đồng phản biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án. Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến thầy cô. Do kiến thức và kinh nghiệm còn hạn chế nên đồ án tốt nghiệp của em sẽ có nhiều sơ sót, mong thầy cô chỉ bảo để em được hoàn thiện đồ án này thật tốt cũng như củng cố kiến thức cho công việc sau này. Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Trần Thị Tú Vy Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 1. Đăṭ vấ n đề ........................................................................................................ 1 2. Tınh̀ hınh̀ nghiên cứ u ...................................................................................... 2 3. Mục tiêu nghiên cứu ....................................................................................... 2 4. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 3 5. Phạm vi nghiên cứu ........................................................................................ 3 6. Kết cấ u củ a Đồ á n tố t nghiêp̣ .......................................................................... 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................... 4 1.1. Vai trò của cây thuốc dân gian trong đời sống ........................................ 4 1.1.1 Vai trò của cây thuốc nam trong đời sống ................................................ 4 1.1.2 Lơị ı́ch của viêc̣ sử dung̣ thuốc ................................................................. 5 1.1.3 Tı̀nh hı̀nh sử dung̣ cây thuốc nam ............................................................ 6 1.2 Thành phần hóa học của thực vật ............................................................ 7 1.2.1 Carbohydrate ........................................................................................... 7 1.2.1.1 Khái niệm ......................................................................................... 7 1.2.1.2 Tính chất .......................................................................................... 7 1.2.1.3 Vai trò .............................................................................................. 8 1.2.2 Amino acid .............................................................................................. 8 1.2.2.1 Khái niệm ......................................................................................... 8 1.2.2.2 Tính chất .......................................................................................... 9 1.2.2.3 Vai trò .............................................................................................. 9 1.2.3 Glycosides ............................................................................................... 9 1.2.3.1 Khái niệm ......................................................................................... 9 1.2.3.2 Tính chất ........................................................................................ 10 1.2.3.3 Tác dung̣ ......................................................................................... 11 1.2.4 Alkaloid ................................................................................................. 11 1.2.4.1 Khái niệm ....................................................................................... 11 1.2.4.2 Tính chất ........................................................................................ 11 1.2.4.3 Vai trò ............................................................................................ 12 1.2.5 Steroids .................................................................................................. 12 1.2.5.1 Khái niệm ....................................................................................... 12 i Đồ án tốt nghiệp 1.2.5.2 Tính chất ........................................................................................ 12 1.2.5.3 Vai trò ............................................................................................ 12 1.2.6 Tannin ................................................................................................... 14 1.2.6.1 Khái niệm ....................................................................................... 14 1.2.6.2 Tı́nh chất ........................................................................................ 14 1.2.6.3 Vai trò ............................................................................................ 15 1.2.7 Isoprenoid (Terpene) .............................................................................. 15 1.2.7.1 Khái niệm ....................................................................................... 15 1.2.7.2 Tính chất ........................................................................................ 16 1.2.7.3 Vai trò ............................................................................................ 16 1.3 Tổng quan về kháng khuẩn thực vật ...................................................... 16 1.3.1 Khái niệm .............................................................................................. 16 1.3.2 Cơ chế kháng khuẩn............................................................................... 16 1.3.3 Một số hợp chất kháng khuẩn thực vật .................................................. 18 1.3.3.1 Alkaloids ........................................................................................ 18 1.3.3.2 Terpenoids và tinh dầu ................................................................... 20 1.3.3.3 Phenol đơn và acid phenolic ........................................................... 21 1.3.3.4 Saponin .......................................................................................... 24 1.3.3.5 Lectin và polypeptide ..................................................................... 25 1.4 Một số vi sinh vật gây bệnh điển hình .................................................... 25 1.4.1 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy ..................................................... 25 1.4.1.1 Escherichia coli .............................................................................. 25 1.4.1.2 Shigella .......................................................................................... 26 1.4.1.3 Salmonella ...................................................................................... 27 1.4.1.4 Vibrio ............................................................................................. 28 1.4.1.5 Listeria ........................................................................................... 29 1.4.2 Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da .............................................. 30 1.4.2.1 Pseudomonas aeruginosa ................................................................ 30 1.4.2.2 Staphylococcus aureus .................................................................... 32 1.4.2.3 Enterococcus feacalis ..................................................................... 33 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 34 ii Đồ án tốt nghiệp 2.1 Địa điểm và thời gian .............................................................................. 34 2.1.1 Địa diểm ................................................................................................ 34 2.1.2 Thời gian ............................................................................................... 34 2.2 Vật liệu ..................................................................................................... 34 2.2.1 Nguồn mẫu phân tích ............................................................................. 34 2.2.2 Vi sinh vật chỉ thị ................................................................................... 35 2.2.3 Hóa chất, môi trường ............................................................................. 36 2.2.4 Dụng cụ, thiết bị .................................................................................... 36 2.3 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 37 2.3.1 Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu .................................................... 37 2.3.2 Phương pháp tăng sinh VSV chı ̉ thi ................................̣ ....................... 37 2.3.3 Phương pháp định lượng tế bào vi sinh vật bằng phương pháp đo OD ... 38 2.3.4 Phương pháp bảo quản và giữ giống ...................................................... 39 2.3.5 Phương pháp tách chiết cao.................................................................... 39 2.3.6 Chuẩn bi dung̣ dicḥ cao thuốc kháng sinh .............................................. 39 2.3.7 Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method) . 39 2.3.8 Phương pháp xác định thành phần hóa học ............................................ 41 2.3.8.1 Carbohydrate .................................................................................. 41 2.3.8.2 Alkaloid.......................................................................................... 41 2.3.8.3 Saponin (thử nghiệm Foam) ........................................................... 42 2.3.8.4 Cardiac glycosides .......................................................................... 42 2.3.8.5 Anthaquinone glycosides (thử nghiệm Bontrager) .......................... 43 2.3.8.6 Flavonoid ....................................................................................... 43 2.3.8.7 Phenolic.......................................................................................... 43 2.3.8.8 Tannin ............................................................................................ 45 2.3.8.9 Steroid ............................................................................................ 45 2.3.8.10 Amino acid .................................................................................. 45 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................... 46 2.4 Sơ đồ bố trı́ thı́ nghiêṃ tổng quá t ........................................................... 47 2.4.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá hiêụ quả chiết cao chủa dung môi nướ c đối vớ i các mẫu cây .................................................................................................... 48 2.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết nước .. 50 iii Đồ án tốt nghiệp 2.4.2.1 Thuyết minh quy trình .................................................................... 51 2.4.2.2 Đọc kết quả .................................................................................... 51 2.4.3 Thí nghiệm 3: Xác định thành phần hóa học của các cao chiết. .............. 52 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 54 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết cao 54 3.2 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cá c mẫu cao chiết nướ c 55 3.2.1 Kết quả đánh giá hoaṭ tı́nh kháng khuẩn đối vớ i nhóm vi khuẩn E. coli . 55 3.2.2 Kết quả đánh giá hoaṭ tı́nh kháng khuẩn đối vớ i nhóm vi khuẩn Listeria 37 3.2.3 Kết quả đánh giá hoaṭ tı́nh kháng khuẩn đối vớ i nhóm vi khuẩn Salmonella ...................................................................................................... 39 3.2.4 Kết quả đánh giá hoaṭ tı́nh kháng khuẩn đối vớ i nhóm vi khuẩn Shigella ........................................................................................................... 40 3.2.5 Kết quả đánh giá hoaṭ tı́nh kháng khuẩn đối vớ i nhóm vi khuẩn Vibrio . 42 3.2.6 Kết quả đánh giá hoaṭ tı́nh kháng khuẩn đối vớ i nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hôị trên da .......................................................................................... 44 3.2.7 Tổng hơp̣ kết quả các kết quả kháng khuẩn ............................................ 45 3.3 Kết quả thử nghiêṃ đinḥ tı́nh xác định thành phần hóa học củ a cá c mẫu cao chiết nướ c ....................................................................................... 48 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................. 52 4.1 Kết luận ................................................................................................... 52 4.2 Đề nghị ..................................................................................................... 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 53 iv Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Aco: cây thuốc Acorus sp. Cal: cây thuốc Calamus sp. CIP 8: kháng sinh Cirproflaxacin 8mg/ml CIP 500: kháng sinh Cirproflaxacin 500mg/ml Ele: cây thuốc Elephatopus sp. Euo: cây thuốc Euodia sp. Eup: cây Eupatorium sp. Lan: cây thuốc Lantana sp. Med: cây thuốc Medinilla sp. Pod: cây thuốc Podocarpus sp. Pol: cây thuốc Polygala sp. Ste: cây thuốc Streptocaulon sp. Xid: cây thuốc Xidi klung VSV: vi sinh vâṭ v Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 1.1 Môṭ số Glycoside phổ biến ....................................................................... 9 Bảng 3.1 Kết quả kháng khuẩn của các cao chiết khác nhau trên tổng số 20 chủng vi sinh vật khảo sát .................................................................................................... 47 Bảng 3.2 Bảng kết quả thành phần hóa hoc̣ của các mẫu cao chiết nướ c ................ 49 vi Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THI ̣ Hình 1.1 Một số cây thuốc nam phổ biến ................................................................. 4 Hình 1.2 Cấu trúc phân tử của các loại Carbonhydrate ............................................ 8 Hı̀nh 1.3 Alanine – Môṭ amino acid ......................................................................... 8 Hı̀nh 1.4 Cardenolic và Bufadiennolid ................................................................... 11 Hı̀nh 1.5 Ephedrin và Hyoscyamin ....................................................................... 11 Hı̀nh 1.6Testosteron .............................................................................................. 12 Hı̀nh 1.7 Mô ̣t số tannin .......................................................................................... 14 Hı̀nh 1.8 Limonene và Ocimene ............................................................................ 15 Hình 1.9 Các cơ chế kháng sinh ............................................................................. 17 Hình 1.10 Solamargine .......................................................................................... 19 Hình 1.11 Berberine .............................................................................................. 20 Hình 1.12 Một số Terpenenes và Terpenoid .......................................................... 21 Hình 1.13 Một số Quinones thông thường ............................................................. 22 Hình 1.14 Gallotannin và Gallic acid ..................................................................... 23 Hình 1.15 Một số Flavonoid .................................................................................. 24 Hı̀nh 1.16 Saponin ................................................................................................. 24 Hı̀nh 1.17 Các cấu trúc của peptide........................................................................ 25 Hình 1.18 Hình ảnh Escherichia coli O157: H7 dưới kính hiển vi ......................... 26 Hình 1.19 Hı̀nh ảnh của Shigella sp. ...................................................................... 27 Hình 1.20 Hình ảnh của Salmonella typhii và Salmonella typhimurium ................ 28 Hình 1.21 Hình ảnh vi khuẩn Vibrio cholerae và Vibrio harveyi ........................... 29 Hình 1.22 Hình ảnh của Listeria monocytogenes ................................................... 30 Hình 1.23 Hình ảnh Pseudomonas aeruginosa ...................................................... 31 Hình 1.24 Cấu trúc hiển vi Staphylococcus aureus ................................................ 32 Hı̀nh 2.1 Môṭ số dung̣ cu ̣và thiết bi thı̣ ́ nghiêṃ ..................................................... 36 Hình 2.2. Quy trình xử lý mẫu ............................................................................... 37 Hı̀nh 2.3 Hı̀nh ảnh về kết quả kháng khuẩn của môṭ mẫu vi khuẩn chı̉ thi ̣(bên trái là không có kết quả kháng khuẩn và và bên phải là có kết quả kháng khuẩn) ............ 41 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ............................................................ 47 vii Đồ án tốt nghiệp Hình 2.5. Quy trình khảo đánh giá hiêụ quả chiết cao của dung môi nướ c đối vớ i các mẫu cây. .......................................................................................................... 49 Hình 2.6. Dịch lọc qua các lần ngâm của các mẫu cây Xidi klung ......................... 49 Hình 2.7. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn hoạt tính kháng khuẩn ........... 50 Hình 2.8. Quy trình xác định thành phần hóa học .................................................. 52 Hı̀nh 3.1. Hiêụ suất tách chiết các cao chiết nướ c .................................................. 54 Hı̀nh 3.2. Kết quả hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của các loaị cao chiết đối vớ i nhóm vi khuẩn nhóm Escherichia coli. ................................................................................ 37 Hı̀nh 3.3. Kết quả hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của các loaị cao chiết đối vớ i nhóm vi khuẩn nhóm Listeria spp. ...................................................................................... 38 Hı̀nh 3.4. Kết quả hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của các loaị cao chiết đối vớ i nhóm vi khuẩn nhóm Salmonella spp. ................................................................................. 39 Hı̀nh 3.5. Kết quả hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của các loaị cao chiết đối vớ i nhóm vi khuẩn nhóm Shigella spp. ...................................................................................... 41 Hı̀nh 3.6. Kết quả hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của các loaị cao chiết đối vớ i nhóm vi khuẩn nhóm Vibrio spp. ......................................................................................... 43 Hı̀nh 3.7. Kết quả hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của các loaị cao chiết nướ c đối vớ i các vi khuẩn gây bênḥ về da ............................................................................................ 44 viii Đồ án tốt nghiệp ix Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đăṭ vấ n đề Được đánh giá là bước ngoặc trong lịch sử Y học về điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, kháng sinh ra đời không chỉ được sử dụng trong y học mà còn được sử dụng rộng rãi trong trồng trọt, chăn nuôi gia súc, gia cầm và thủy sản nhằm mục đích tăng trưởng. Việc sử dụng kháng sinh là hết sức cần thiết để điều trị cho người bệnh. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh không hợp lý, lạm dụng kháng sinh, điều trị kháng sinh khi không mắc bệnh lý nhiễm khuẩn đã làm gia tăng tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh. Viêc̣ laṃ dung̣ thuốc kháng sinh để laị các tác haị rất lớn. Môṭ trong những tác haị lớn nhất đó là các VSV không còn nhaỵ cảm vớ i thuốc, dẫn đến viêc̣ điều tri ̣ngày càng khó khăn hơn. Ngoài ra, viêc̣ sử dung̣ kháng sinh liều cao trong môṭ thờ i gian dài se ̃ làm ảnh hưở ng đến chứ c năng của các cơ quan trong cơ thể, chẳng haṇ như sử dung̣ chloraphicol vớ i liều cao se ̃ gây suy tủy. Thực tế, kháng sinh có phổ rộng tiêu diệt cả vi khuẩn xấu và tốt vì vậy nếu dùng không đúng hướng dẫn, lạm dụng sẽ tiêu diệt cả khuẩn có lợi có trong đường ruột, làm mất cân bằng mang tính tự nhiên của cơ thể. Một khi bị mất cân bằng, khuẩn xấu hoành hành, dễ phát sinh nhiều bệnh nan y, như rối loạn dạ dày, làm cho các chứng bệnh nghiêm trọng hơn và làm giảm hiệu quả của thuốc kháng sinh. Vấn đề về thực trạng kháng kháng sinh đã mang tính toàn cầu và đặc biệt nổi trội ở các nước đang phát triển với gánh nặng của các bệnh nhiễm khuẩn và những chi phí bắt buộc cho việc thay thế các kháng sinh cũ bằng các kháng sinh mới, đắt tiền. Các bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hoá, đường hô hấp, các bệnh lây truyền qua đường tình dục và nhiễm khuẩn bệnh viện là các nguyên nhân hàng đầu có tỉ lệ mắc và tỉ lệ tử vong cao ở các nước đang phát triển. Việc kiểm soát các loại bệnh này đã và đang chịu sự tác động bất lợi của sự phát triển và lan truyền tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn. Có thể nói rằng, vi khuẩn càng phơi nhiễm nhiều với kháng sinh thì “sức ép về thuốc” càng lớn các chủng kháng thuốc càng có nhiều cơ hội để phát triển và lây lan. Đăc̣ biêṭ ở Viêṭ Nam, tình trạng kháng thuốc diễn ra 1 Đồ án tốt nghiệp trầm trọng hơn do việc sử dụng kháng sinh tùy tiện khi không có đơn của bác sỹ, người dân có thể tự ý mua kháng sinh ở các hiệu thuốc. Không ít dược sỹ bán thuốc không đúng quy định, các bác sỹ điều trị kê đơn thuốc lạm dụng kháng sinh, chỉ định kháng sinh không phù hợp. Do đó việc phát hiện ra các hợp chất kháng khuẩn mới có nguồn gốc tự nhiên để thay thế kháng sinh tổng hơp̣ trở thành một hướng nghiên cứu rất đáng quan tâm. Vận dụng điều đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cao chiết nước từ thực vật tại vườn quốc gia Bidoup Núi Bà, tı̉nh Lâm Đồng”. 2. Tınh̀ hınh̀ nghiên cứ u Từ thờ i xa xưa, cao chiết nước đa ̃ đươc̣ ngườ i dân sử dung̣ rông̣ raĩ trong các bài thuốc tri ̣bênḥ dân gian. Tuy nhiên, những bài thuốc dân gian đó chı̉ dưạ trên kinh nghiêṃ trải qua nhiều đờ i, chưa đươc̣ chứ ng minh bằng thưc̣ nghiêṃ khoa hoc.̣ Thờ i gian gần đây, nhu cầu tı̀m kiếm về môṭ hơp̣ chất kháng sinh mớ i đa ̃ thúc đẩy sư ̣ nghiên cứ u về các công dung̣ của các cây thuốc dân gian ngày càng nhiều hơn. Đa ̃ có rất nhiều công trı̀nh nghiên cứ u về tác dung̣ ứ c chế VSV của các cao chiết nướ c. Parekh và ctv (2006) đa ̃ thưc̣ hiêṇ công trı̀nh nghiên cứ u về tiềm năng của môṭ số mẫu cao chiết nước từ cây thuốc truyền thống ở Ấ n Đô ̣ để làm thuốc kháng khuẩn và từ kết quả nghiên cứ u đa ̃ choṇ ra đươc̣ cây Bauhinia variegata tiếp tuc̣ nghiên cứ u taọ thành chế phẩm thuốc. Bassam Abu-Shanneb và ctv (2006) đa ̃ cũng đa ̃ nghiên cứ u về khả năng ứ c chế chủng Staphylococcus aureus kháng methicillin của cao chiết nướ c từ 4 cây thuốc dân gian ở Palestine. Ngoài ra, môṭ số công trı̀nh nghiên cứ u khác về khả năng kháng khuẩn của cao chiết nướ c của Antara Sen và Amila Batra (2012); Akinvemi và ctv (2006), 3. Mục tiêu nghiên cứu - Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của một số cây thuốc dân gian với dung môi là nước. 2 Đồ án tốt nghiệp - Xác định thành phần hóa học có trong một số loại cao chiết nước từ các cây thuốc dân gian. 4. Nội dung nghiên cứu - Đánh giá ảnh hưởng của dung môi nước đến hiệu suất thu hồi từ các cây thuốc dân gian. - Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước của các cây thuốc dân gian. - Xác định thành phần hóa học của cao chiết nước của một số cây thuốc dân gian. 5. Phạm vi nghiên cứu Tiến hành thử nghiệm và khảo sát một số mẫu cây thuốc dân gian đươc̣ lấy từ vườn quốc gia Bidoup, Núi Bà, tı̉nh Lâm Đồng. 6. Nô ̣i dung Đồ á n tốt nghiê ̣p Nôị dung Đồ án tốt nghiêp̣ gồm có 4 chương: Chương 1: Tổng quan – Tóm tắ t tà i liêụ có liên quan đến đồ á n tốt nghiêp.̣ Chương 2: Phương phá p và nôị dung nghiên cứ u Chương 3: Kết quả và thảo luâṇ Chương 4: Kết luâṇ và đề nghi ̣ 3 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Vai trò của cây thuốc dân gian trong đời sống 1.1.1 Vai trò của cây thuố c nam trong đời số ng Thuốc nam được coi như những di sản quý báu của dân tộc Việt Nam, danh y Tuệ Tĩnh từng nói “Nam dược trị nam nhân” (thuốc nam chữa bệnh cho người Nam). Từ xa xưa, cây thuốc nam gắn liền với cuộc sống của các gia đình người Việt và có giá trị quý báu trong điều trị bệnh. Chỉ là những cỏ cây gần gũi thân quen xung quanh con người cũng được sử dụng làm bài thuốc chữa bệnh đơn giản, thông thường cho người Việt Nam. Ví dụ, ban đầu củ gừng, củ tỏi... chỉ được dùng với mục đích nấu nướng để làm thay đổi và đa dạng hóa mùi vị, tạo ra những thức ăn ngon miệng, nhưng dần dần về sau người ta nhận thấy chúng còn có khả năng làm ấm bụng và dễ tiêu, làm hết đi lỏng do ăn phải những đồ sống lạnh..., Hình 1.1 Một số cây thuốc nam phổ biến (từ trái sáng, trên xuống: lô hội, atiso, tía tô, mã đề) 4 Đồ án tốt nghiệp Trong dân gian thuốc nam có từ hơn 3.000 năm trước, cùng với sự phát triển của y học cổ truyền. Nước ta có nhiều dược liệu, kể cả cỏ cây, động vật và khoáng vật, trong đó có những thứ rất quý, cần được sưu tầm nghiên cứu và sử dụng để phòng bệnh, chữa bệnh cho nhân dân. Trải qua kinh nghiệm quý báu của cha ông, những bài thuốc nam có tác dụng trong chữa bệnh được lưu truyền từ đời này sang đời khác và được áp dụng hiệu quả. 1.1.2 Lơị ı́ch của viêc̣ sử dung̣ thuố c Trái với Tây y, Đông y xem toàn bộ thân thể người là một hệ thống hoàn chỉnh. Học thuyết về kinh lạc, tử ngọ lưu chú đồ, học thuyết âm dương ngũ hành, đều nhấn mạnh vào chỉnh thể. Từ góc nhìn ấy, Đông y tinh vi hơn Tây y. Tất cả được khái quát lại bằng 7 lợi ích trọng yếu như sau: - Trị bệnh theo các bài thuốc Đông y, tuy thời gian khỏi bệnh có tiến triển chậm hơn, nhưng khi khỏi bệnh thì tỷ lệ tái phát rất thấp hơn so với những phương pháp khác. - Chữa bệnh Đông y trị bệnh từ gốc, Tây y trị bệnh ở ngọn. - Tây y dùng chiết xuất từ dược liệu tự nhiên nhưng thành phần chủ yếu là tinh chất và hàm lượng rất lớn nguyên liệu. Trong khi đó, các hoạt chất tồn tại trong mỗi cây thuốc Đông y là phức hợp và liều lượng phù hợp. Vì vậy, khi dùng thuốc từ cây cỏ hoa lá tự nhiên ngoài tác dụng chữa bệnh sẽ ít những phản ứng phụ gây hại cho con người. - Không gây tổn hại gan, thận như thuốc Tây bởi thuốc Đông y không sản sinh độc tố nên ít gây tổn hại cho cơ thể. - Nền y học phương Tây mặc dù có nhiều tiến bộ hơn châu Á và châu Phi, nhưng khả năng đề kháng với các loại bệnh tật của họ lại yếu hơn người ở hai châu lục này. Điều này chứng tỏ thói quen dùng thuốc Tây làm giảm đi khả năng miễn dịch của cơ thể. Còn dùng thuốc từ cỏ cây hoa lá giúp cho hệ miễn dịch tốt hơn. 5 Đồ án tốt nghiệp - Người dùng thuốc Tây nhiều có khả năng bị ung thư cao hơn gần 10 lần so với người có thói quen dùng thuốc Đông y. - Thuốc Tây tuy tiện lợi nhưng thời gian sử dụng là hữu hạn. Thuốc Đông y dễ trồng, dễ tìm: Xung quanh chúng ta đâu đâu cũng là cây thuốc, vị thuốc hữu ích. 1.1.3 Tı̀nh hı̀nh sử dung̣ cây thuố c nam Ngay từ thời xa xưa khi con người còn sống trong xã hội nguyên thủy, người ta đã biết lựa chọn và sử dụng các loại cây cỏ sẵn có để làm thuốc chữa bệnh và bảo vệ sức khỏe. Vốn kinh nghiệm này ngày càng được tích lũy, sàng lọc và bổ sung thêm để tạo dựng nên một nền Y – Dược học cổ truyền có bản sắc riêng trong cộng đồng các dân tộc Việt Nam. Và trên thực tế, nền Y học cổ truyền (YHCT) đó đã đảm nhận vai trò chăm sóc và bảo vệ sức khỏe của nhân dân và đồng hành cho đến khi có Y học hiện đại (YHHĐ) du nhập vào nước ta. Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, thích hợp cho sự phát triển của cây trồng nói chung. Một số vùng cao lại có khí hậu á nhiệt ... Hınh̀ 2.1 Hınh̀ ảnh môṭ số cây thuốc: Lantana sp., Medimilla sp., Elephamtopus sp., Podocarpus sp. (từ trá i qua, trên xuống) 2.2.2 Vi sinh vật chỉ thị - 4 chủng Escherichia: Escherichia coli, Enterotoxigenic Escherichia coli – ETEC, Escherichia coli 0517:H7, Escherichia 0208 - 4 chủng Salmonella: Salmonella typhii, Salmonella typhimurium, Salmonella dublin, Salmonella enteritidis - 4 chủng Vibrio: Vibrio alginolyticus, Vibrio cholera, Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus - 3 chủng Shigella: Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei - 2 chủng Listeria: Listeria monocytogenes, Listeria innocua - Pseudomonas aeruginosa - Staphylococcus aureus - Enterococcus feacalis 35 Đồ án tốt nghiệp 2.2.3 Hóa chất, môi trường - Dung môi Dimethysulfoside - Nước cất (DMSO) - NaCl - Methanol - Môi trường TSA, TSB - Ethanol - Agar - Cồn 2.2.4 Dụng cụ, thiết bị - Tủ cấy vô khuẩn - Giấy lọc - Autoclave - Bình tam giác - Tủ ấm, Tủ lạnh - Pipette loại 100 – 1000 μl. - Tủ sấy - Đầu típ loại 100- 1000 μl - Máy lắc - Ống nghiệm - Máy đo OD - Que cấy trang, que cấy vòng - Cân điện tử, Cân phân tích - Đèn cồn, đĩa petri - Bếp điện - Parafilm - Phễu Hınh̀ 2.1 Môṭ số dung̣ cu ̣và thiết bi thı̣ ́ nghiêṃ 36 Đồ án tốt nghiệp 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu Mẫu cây Rửa sạch Phơi khô đến trọng lượng không đổi Xay mẫu thành bột mịn Hình 2.2. Quy trình xử lý mẫu Lá, thân, cành của các cây sau khi được thu thập sẽ được đem về phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại Học Công Nghệ Tp.HCM. Mẫu cây được rửa sạch và phơi khô trong phòng thí nghiệm tới khi trọng lượng không đổi. Các mẫu phơi khô được nghiền thành bột mịn. Bột mẫu được đựng trong túi nhựa và được bảo quản ở 400C. 2.3.2 Phương pháp tăng sinh VSV chı̉ thi ̣  Mục đích: tăng sinh khối vi sinh vật chỉ thị đến số lượng cần thiết, giúp hoạt hóa vi khuẩn trở về trạng thái bình thường sau khi bị suy yếu trong quá trình bảo quản.  Nguyên tắc: nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng phải chứa thành phần đa lượng và vi lượng để vi sinh vật phát triển, đảm bảo có đủ điều kiện lý hóa thích hợp để vi sinh vật trao đổi chất với môi trường.  Tiến hành: 37 Đồ án tốt nghiệp - Chuẩn bị chai chứa 10ml môi trường tăng sinh (môi trườ ng TSB). - Dùng pipette hút 100µl sinh khối vi sinh vật từ ống eppendort cho vào chai môi trường. - Lắc 150 vòng/phút, 18 – 24 giờ ở nhiệt độ phòng (sinh khối vi sinh vật tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy). 2.3.3 Phương pháp định lượng tế bào vi sinh vật bằng phương pháp đo OD  Nguyên tắc: - Đô ̣ đuc̣ của huyền phù tỷ lê ̣ thuâṇ vớ i số lương̣ VSV hiêṇ diêṇ trong môi trườ ng. Trong môṭ thời gian nhất đinh,̣ mối quan hê ̣giữa số lương̣ VSV trong nướ c tı̉ lê ̣tuyến tı́nh với đô ̣đuc̣ môi trường. - Đinḥ lương̣ VSV trong môi trườ ng bằng máy đo đô ̣đuc̣ hay máy so màu ở bướ c sóng 550 – 610nm. - Trong phương pháp này cần xây dưng̣ biểu đồ tương quan tuyến tı́nh giữa đô ̣ đục và số lượng VSV trong môi trườ ng bằng phương pháp đếm trực tiếp.  Tiến hành: - Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào:  Pha loãng một huyền phù tế bào cần kiểm định có mật độ tế bào bất kì thành các huyền phù khác nhau có độ đục ở OD 600nm đạt các giá trị lân cận 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5. Đo OD ở 600nm của các huyền phù vừa pha được, ghi nhận các số liệu.  Dùng phương pháp đếm trực tiếp dưới kinh hiển vi (buồng đếm hồng cầu) xác định mật độ tế bào (cfu/ml) của các huyền phù này. Tính giá trị log (N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tương ứng với độ đục. vẽ đường biển diễn của log (N/ml) theo OD ở 600nm. - Xác định mật độ tế bào theo độ đục: đo độ đục của một huyền phù tế bào cần xác định mật độ. Từ giá trị OD ở bước sóng 600nm đo được, suy ra số log (N/ml) và trị số mật độ (cfu/ml) từ đường chuẩn. 38 Đồ án tốt nghiệp 2.3.4 Phương pháp bảo quản và giữ giống - Giữ giống thạch nghiêng: lấy giống VSV cấy vào ống thạch nghiêng, ủ cho VSV phát triển, đem trữ lạnh ở nhiệt độ 40C. Giống này thường được sử dụng cho sản xuất. Thời gian sử dụng từ 7 – 10 ngày. - Giữ giống trong glycerol 20% ở nhiệt độ -40C: vi khuẩn sau khi tăng sinh, hút vào eppendorf và ly tâm 5000 v/p trong thời gian 15 phút. Loại bỏ dịch và giữ cặn. Bổ sung 1 ml glycerol 20% và đồng nhất rồi bảo quản ở nhiệt độ -40C. Giống này được sử dụng để cấy chuyển qua thạch nghiêng. Thời gian sử dụng từ 1 – 3 tháng. 2.3.5 Phương pháp tách chiết cao  Mục đích: tách chiết hợp chất kháng khuẩn thực vật để nghiên cứu  Nguyên tắc: sử dụng dung môi nước để tách chiết các hợp chất trong thực vật nhờ lực liên kết hóa học.  Tiến hành: - Cân 50g mẫu cao + 1000ml dung môi cho vào erlen, ngâm 4 giờ, lọc, thu dịch lần 1. - Bã + 1000ml dung môi ngâm 4 giờ, lọc, thu dịch lần 2. - Ngâm tiếp tục cho đến khi dịch trong, lặp lại khoảng 3 lần. 2.3.6 Chuẩn bi ̣dung dicḥ cao thuố c khá ng sinh Cao thuốc khô: cân 1,5g cao thuốc khô, hòa tan vớ i 13,5ml dung dicḥ DMSO 1% và nướ c cất (nồng đô ̣ DMSO 1% không vươṭ quá 10%. Thu đươc̣ dicḥ cao chiết nồng đô ̣cao thuốc đaṭ 100mg/ml. Dicḥ cao chiết nồng đô ̣ 100mg/ml (cao khô đã hò a tan sẵn trong dung môi DMSO 1%): hòa tan 1ml cao vớ i 9ml nướ c cất. Thu đươc̣ dicḥ cao chiết nồng đô ̣ 2.3.7 Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method)  Nguyên tắc 39 Đồ án tốt nghiệp Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng của cao chiết với vi khuẩn chỉ thị trên môi trường nuôi cấy. Cao chiết có khả năng khuếch tán trong môi trường agar và tác động lên vi khuẩn. Khi kháng được vi khuẩn sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch.  Tiến hành - Các chủng vi khuẩn sau khi đã tăng sinh được tiến hành pha loãng bằng nước muối sinh lý. Pha loãng đến nồng độ 106 cfu/ml. - Hút 100 µl từ dịch pha loãng vào đĩa petri chứa sẵn môi trường TSA. Tiến hành cấy trang. - Sau đó, tạo những giếng nhỏ có đường kính 8 mm với thanh kim loại vô trùng. Mỗi đĩa thạch trung bình từ 6 – 9 giếng thạch. - Nhỏ 100l dung dịch cao chiết (nồng độ 100 mg/ml) vào mỗi giếng của đĩa thạch đã ấy trang. - Để yên đĩa trong vòng 2 giờ. - Ủ 37oC trong 24 giờ cho vi khuẩn phát triển. - Đọc kết quả  Hoạt tính kháng khuẩn được tính bằng vòng kháng khuẩn quanh miệng giếng trên đĩa: - Không có vòng kháng khuẩn: không có hoạt tính kháng khuẩn. - Đường kính vòng kháng khuẩn từ 8 đến 10mm: tính kháng trung bình. - Đường kính vòng kháng khuẩn > 10mm: tính kháng mạnh. 40 Đồ án tốt nghiệp Hınh̀ 2.3 Hı̀nh ảnh về kết quả kháng khuẩn của môṭ mẫu vi khuẩn chı̉ thi (bêṇ trái là không có kết quả kháng khuẩn và và bên phải là có kết quả kháng khuẩn) 2.3.8 Phương pháp xác định thành phần hóa học 2.3.8.1 Carbohydrate a. Thí nghiệm Molisch - Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm. - Thêm vào 5-6 giọt thuốc thử Molisch. - Nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc trên thành ống nghiệm. - Kết quả: Hình thành phức hợp màu đỏ - tím ở lớp ngăn cách. b. Thí nghiệm Feling - Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. - Cho lần lượt 1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B vào 100mg cao chiết. - Đun cách thủy trong 5 phút và đọc kết quả. - Kết quả: Quan sát kết tủa màu đỏ của CuO. c. Barfoed - Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. - Thêm 2 ml thuốc thử Barfoed. - Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, làm lạnh và đọc kết quả.  Kết quả: Hình thành kết tủa màu đỏ gạch. 2.3.8.2 Alkaloid a. Mayer - Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Cho vài giọt thuốc thử Meyer.  Kết quả: Quan sát kết tủa màu đục tạo thành. b. Dragendroff - Hút 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm. - Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendroff. - Kết quả: Hình thành kết tủa màu vàng cam. 41 Đồ án tốt nghiệp c. Hager - Tiến hành: - Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. - Thêm 2 ml thuốc thử Hager. - Kết quả: Hình thành kết tủa màu vàng. d. Wagner - Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. - Thêm 2 ml thuốc thử Wagner. - Kết quả: Hình thành kết tủa màu nâu đỏ. 2.3.8.3 Saponin (thử nghiệm Foam) - Hút 5 ml mẫu cho vào ống nghiệm. - Lắc mạnh. - Kết quả: Hình thành bọt ổn định. 2.3.8.4 Cardiac glycosides a. Legal - Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. - Thêm 1 ml pyridine và 1 ml Na nitro prusside. - Nhỏ 5 – 6 giọt NaOH 10%. - Kết quả: Xuất hiện màu đỏ đậm. b. Keller Killiani - Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. - Thêm 2 ml acid acetic glacial và 1 ml dung dịch FeCl3. - Cho từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc vào ống nghiệm. - Kết quả: Xuất hiện màu xanh trong lớp acid acetic. 42 Đồ án tốt nghiệp 2.3.8.5 Anthaquinone glycosides (thử nghiệm Bontrager) - Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. - Thêm 2 ml H2SO4 loãng và đun sôi. - Tiến hành lọc nóng và để nguội dịch lọc. - Thêm 3 ml benzene và lắc đều rồi để yên. - Tách lấy lớp benzene. - Thêm 2 ml ammonia và quan sát màu trong lớp ammonia. - Kết quả: Xuất hiện màu đỏ. 2.3.8.6 Flavonoid a. Alkaline - Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm rồi cho vào vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng. Thực hiện với đối chứng là mẫu và nước cất để so sánh. - Thêm vài giọt HCl loãng  mất màu chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid - Kết quả: Xuất hiện màu vàng khi bổ sung NaOH và mất màu khi cho HCl. b. Shinoda - Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. - Cho dịch mẫu bột Magnesium và một vài giọt HCl đậm đặc vào ống nghiệm. - Bổ sung 5 ml cồn 95%. - Kết quả: Nếu mẫu có màu cam, hồng, đỏ đến tím chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid. c. Ferric chloride - Lấy 2 ml cho vào ống nghiệm. - Thêm vài giọt thuốc thử Ferric chloride 10%. - Kết quả: Xuất hiện màu xanh hoặc tím. 2.3.8.7 Phenolic a. Lead acetate - Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm - Cho 1,5 ml Chì acetate 10% 43 Đồ án tốt nghiệp - Kết quả: Xuất hiện kết tủa trắng. b. Gelatin - Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm - Thêm một vài gelatin 1% - Kết quả: Xuất hiện kết tủa trắng. 44 Đồ án tốt nghiệp 2.3.8.8 Tannin a. Ferric chloride - Hút 2 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%. - Cho vào 4 giọt ferric chloride 10%. - Kết quả: Xuất hiện màu xanh. b. Lead acetate - Hút 2 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%. - Cho vào 4 giọt Chì acetate. - Kết quả: Xuất hiện kết tủa màu vàng. 2.3.8.9 Steroid a. Salkowski - Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. - Thêm 2 ml chloroform và nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc. - Lắc mạnh rồi để yên cho tách thành 2 lớp. - Đọc kết quả ở mặt phân cách. - Kết quả:  Xuất hiện màu đỏ ở lớp dưới: sterol.  Hình thành màu vàng ở lớp dưới: triterpenoid. b. Libermann Burchard - Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. - Thêm 2 ml acetic anhydride, đun sôi và làm nguội nhanh. - Nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm. - Kết quả:  Xuất hiện vòng màu đỏ ở mặt phân cách: steroid.  Hình thành vòng màu nâu đỏ đậm: triterpenoid. 2.3.8.10 Amino acid 45 Đồ án tốt nghiệp - 1 ml dịch chiết, sau đó cho vào một vài giọt thuốc thử Ninhydrin. - Đun sôi cách thủy trong 5 phút. - Kết quả: Xuất hiện màu tím. 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu Sừ dụng phần mềm Statgraphics Centurion XV version 15.1.02 và phần mềm Microsoft Excel 2007 để xử lý số liệu. 46 Đồ án tốt nghiệp 2.4 Sơ đồ bố trı́ thı́ nghiêṃ tổng quá t Nguồn mâũ Ngâm trong dung môi nước (tỉ lệ 1:20 w/v) Chiết và cô cao Cao chiết nư ớc Xác định thành phần hóa học Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Xác định chỉ số MIC Đọc kết quả Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 47 Đồ án tốt nghiệp 2.4.1 Thí nghiệm 1: Đá nh giá hiêụ quả chiết cao chủa dung môi nướ c đố i vớ i cá c mẫu cây Mẫu cây Phơi khô, xay nhuyễn Podo- Poly- Medi- Eupa- Ele- Lan- Aco- Euo- Cala Xidi Strep- carpus gala nilla toriu phant tana rus dia -mus klun tocaul sp. sp. sp. m sp. opus sp. sp. sp. sp. g on sp. sp. Ngâm trong nước (tỉ lệ 1:20 w/v) trong 4 giờ Lọc chân không Ngâm lần 2, loc̣ Ngânm lần 3, loc̣ Ba ̃ Cô cách thủy 700C Thu cao Cao chiết từ n ước 48 Đồ án tốt nghiệp Hình 2.5. Quy trình khảo đánh giá hiêụ quả chiết cao của dung môi nướ c đối với các mẫu cây.  Tiến hành: Cân 5g mẫu cao + 100ml dung môi nước (tỉ lệ 1:20, w/v) cho vào erlen, ngâm trong 4 giờ, lọc, thu dịch lần 1. Ba ̃ loc̣ sau đó se ̃ đươc̣ đổ thêm 100ml nướ c cất vào, tiếp tuc̣ ngâm 4 giờ, sau đó tiến hành loc,̣ thu dicḥ loc̣ lần 2. Tiếp tuc̣ tiến hành ngâm ba ̃ và loc̣ khoảng 3,4 lần cho đến khi dicḥ loc̣ trong. Sau đó toàn bô ̣ dicḥ loc̣ cao se ̃ đươc̣ cô cách thủy ở nhiêṭ đô ̣700C đến khi thu đươc̣ cao khô hoàn toàn.  Hiệu suất tách chiết cao: mcao thu được (g): khối lượng cao thu được sau khi cô cách thủy mcao ban đầu (g): khối lượng bột cao ban đầu Hình 2.6. Dịch lọc qua các lần ngâm của các mẫu cây Xidi klung 49 Đồ án tốt nghiệp 2.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết nước Giống vi khuẩn Tăng sinh trong TSB và TSB+NaCl 1.5% Lắc 150 v/p,nhiệt độ phòng, 18 – 24 giờ Đo OD 600nm 6 Nước muối Pha loãng vi sinh vật nồng độ 10 cfu/ml sinh lý Hút 100µl vào đĩa petri chứa TSA/TSA+NaCl 1.5%, trang đều Đục lỗ(d=6mm) trên môi trường TSA Cao chiết Dịch cao (100mg/ml) DMSO 1% Nhỏ 100l dịch chiết vào giếng trên môi trường TSA Ủ 370C, 24h Kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn bằng đường kính vòng kháng Hình 2.7. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn hoạt tính kháng khuẩn 50 Đồ án tốt nghiệp 2.4.2.1 Thuyết minh quy trình Chuẩn bị 20 chai có chứa 10ml môi trường tăng sinh, sau đó tiến hành thao tác cấy các chủng VSV chı̉ thi ̣vào chai môi trường đa ̃ chuẩn bi. ̣ Sau khi tăng sinh, lắc các chai môi trườ ng trên khoảng 150 vòng/phút trong 18- 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Thu di ̣ch chứ a VSV. Dịch VSV sau khi được tăng sinh, tiến hành đo OD ở 600 nm để xác đinḥ mâṭ đô ̣ VSV trong dicḥ chiết. Khi đa ̃ xác đinḥ đươc̣ mâṭ đô ̣ vi khuẩn, tiến hành pha loãng các chủng vi sinh vật theo công thức: C.V=C’.V’ để được mật độ 106 cfu/ml. Dùng pipette hút 1ml từ dicḥ VSV đa ̃ pha loang̃ cho vào ống chứa 9ml nước muối sinh lý, lắc manh.̣ Tiếp theo, dùng pippete hút 100l cho vào đĩa petri (chứa sẵn môi trường TSA vô trùng), trang đều đĩa cho đến khi khô hoàn toàn thı̀ đục lỗ trên đĩa. Dùng pippêt hút 100l dịch cao (cao + DMSO 1%) nồng độ 100 mg/ml cho vào từng giếng thạch, để đĩa yên trong 2 giờ. Ủ các đıã petri ở 37oC trong 24 giờ . Đọc kết quả, đo vòng kháng khuẩn. 2.4.2.2 Đọc kết quả Tiến hành đo vòng kháng khuẩn của mẫu cao trong các đıã petri đa ̃ ủ. So sánh vòng kháng khuẩn của mẫu cao và kháng sinh. Nếu lỗ nào có vòng kháng khuẩn xung quanh chứng tỏ cao có kháng khuẩn chủng vi khuẩn đó. Ta sử dụng chủng vi khuẩn này tiếp tục thử nghiệm xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC). 51 Đồ án tốt nghiệp 2.4.3 Thí nghiệm 3: Xác định thành phần hóa học của các cao chiết. Mẫu cao chiết nước Ngâm trong H2SO4 Ngâm trong DMSO 1% 10% Lọc Lọc Alkloid Carbon- Saponnin, Flavonoid, Steroid, hydrate althraquinone, phenolic acid cardiac compound, amin glycoside tannin Hình 2.8. Quy trình xác định thành phần hóa học Đối với chỉ tiêu alkaloid: mẫu cao được ngâm trong H2SO4 10% trong khoảng 30 phút đến 60 phút. Sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc. Thu phần dịch trong để tiến hành thử nghiệm. Đối với các chỉ tiêu còn lại: mẫu cao được pha trong DMSO cho đến khi tan hoàn toàn. Sau đó, tiến hành pha loãng và lọc qua giấy lọc để thu dịch trong để tiến hành thử nghiệm.  Tiến hành các thử nghiệm để xác định thành phần hóa học trong cây thuốc gồm:  Carbohydrate: thử nghiệm Molisch, thử nghiệm Feling, thử nghiệm Barfoed.  Alkaloid: thử nghiệm Mayer, Dragendorff, thử nghiệm Hager, thử nghiệm Wagner.  Saponin: thử nghiệm Foam.  Cardiac glycosides: thử nghiệm Legal, thử nghiệm Keller Killiani. 52 Đồ án tốt nghiệp  Anthaquinone glycosides: thử nghiệm Bontrager.  Flavonoid: thử nghiệm Alkaline, thử nghiệm Shinoda, thử nghiệm Ferric chloride.  Phenolic: thử nghiệm Lead acetate, thử nghiệm Gelatin.  Tannin: thử nghiệm Ferric chloride, thử nghiệm Lead acetate.  Steroid: thử nghiệm Salkowski, thử nghiệm Libermann Burchard.  Amino acid: thử nghiệm xác định Amino acid. 53 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết cao Để có thể đánh giá hiệu quả tách chiết cao của dung môi nướ c đối với các mẫu cây thuốc thì hiệu suất tách chiết là một trong những tiêu chí cần xác định. Kết quả đánh giá hiệu suất tách chiết cao của cao chiết nướ c từ các cây thuốc đươc̣ thử nghiêṃ đươc̣ trı̀nh bày trong hı̀nh 3.1 Hınh̀ 3.1. Hiêụ suất tách chiết các cao chiết nướ c Hı̀nh 3.1 thể hiêṇ kết quả hiêụ suất tách chiết cao từ dung môi nướ c từ các cây thuốc. Kết quả trên cho thấy rằng hiệu suất tách chiết cao nướ c từ các cây thuốc khác nhau có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Kết quả tách chiết cao của cây Euodia sp. cho hiệu suất trung bình cao nhất 30%, kế đến là các cây Arcorus sp., 54 Đồ án tốt nghiệp Eupatoriium sp., Xidi klung, Calamus sp., Polygala sp., Medinilla sp. vớ i hiệu suất tách chiết trung bình lần lượt là 26%; 25,46%; 21%, 21% 20,53% và 20,18%. Bên canḥ đó, các cao nướ c cây Streptocaulon sp., Elephatorium sp., Podocarpus sp., cho hiêụ suất tách chiết tương đối thấp (< 20%) vớ i hiêụ suất thu hồi trung bı̀nh lần lươṭ là 16%, 15,15%, 11,99% và cuối cùng cây Lantana sp. cho hiêụ suất thu hồi thấp nhất vớ i giá tri trung̣ bı̀nh 11%. Kết quả đánh giá hiêụ suất thu hồi của các mẫu cao chiết nướ c từ các loaị cây cho thấy rằng nướ c là môṭ dung môi có thể sử dung̣ đươc̣ trong quá trı̀nh tách chiết các hơp̣ chất có trong thưc̣ vâṭ do hiêụ suất thu hồi tốt. Trong cao chiết có khả năng thu nhâṇ đươc̣ các hơp̣ chất có hoaṭ tı́nh sinh hoc̣ như alkaloid, flavonoid, tannin và các hơp̣ chất phenolic. Hơn nữa, viêc̣ sử dung̣ nướ c là dung môi tách chiết cũng phù hơp̣ vớ i cách sử dung̣ cây thuốc trong các bài thuốc dân gian, đồng thờ i nó cũng là dung môi phổ biến, rẻ tiền và nhất là không đôc̣ haị đối với ngườ i sử dung.̣ Tuy nhiên, để đánh giá nướ c có thưc̣ sư ̣ là môṭ dung môi tách chiết tốt hay không thı ̀ ngoài hiêụ suất tách chiết, hoa ̣t tı́nh sinh ho ̣c cũng đóng mô ̣t vai trò quan tro ̣ng. Do đó, cần phải khảo sát hoaṭ tı́nh sinh hoc̣ mà trong đề tài này là hoaṭ tı́nh kháng khuẩn để có thể đánh giá chı́nh xác nướ c có phải là dung môi tách chiết tốt nhất hay không. 3.2 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cá c mẫu cao chiết nướ c Các mẫu cao chiết nướ c sau khi đươc̣ pha loang̃ ở nồng đô ̣100mg/ml đươc̣ tiến hành đánh giá hoaṭ tı́nh kháng khuẩn đối vớ i 20 chủng vi khuẩn gây bênḥ bao gồm 4 chủng E. coli, 2 chủng Listeria, 4 chủng Salmonella, 3 chủng Shigella, 4 chủng Vibrio và các vi khuẩn gây bênḥ cơ hôị trên da bao gồm Pseudomonas aerusginosa, Staphylococcus aureus, Enterococcus feacalis. 55 Đồ án tốt nghiệp 3.2.1 Kết quả đá nh giá hoaṭ tı́nh khá ng khuẩn đố i vớ i nhóm vi khuẩn Escherichia coli Kết quả đánh giá hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của 11 loaị cao chiết nướ c đối vớ i nhóm vi khuẩn Escherichia coli đươc̣ thể hiêṇ trong hı̀nh 3.2. Hınh̀ 3.2. Kết quả hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của các loaị cao chiết đối vớ i nhóm vi khuẩn nhóm Escherichia coli. Dựa vào hı̀nh 3.2 nhận thấy rằng cao chiết nướ c từ các cây thuốc Medinilla sp., Xidi klung, Polygala sp., và Streptocaulon sp. có khả năng kháng laị sư ̣ phát triển của nhóm vi khuẩn E. coli khảo sát, trong đó cao chiết nướ c cây Medinilla sp. thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn tốt nhất khi kháng cả 4 chủng vi khuẩn E. coli khảo sát với đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh từ 9,83mm đến 11mm. Cao chiết nước từ cây Xidi klung cũng thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn ở 3/4 chủng vi khuẩn nhóm E. coli 37 Đồ án tốt nghiệp là E. coli O157:H7, E. coli và ETEC vớ i đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh từ 9,17mm đến 11,67mm. Thêm vào đó, cao chiết nướ c Polygala sp. cũng thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn ở 2/4 chủng vi khuẩn E. coli là E. coli và ETEC vớ i đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh lần lươṭ là 8,17mm và 8,75mm. Ngoài ra, cao chiết nước cây Streptocaulon sp. cũng thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn ở vi khuẩn E. coli O157:H7 vớ i đường kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh là 9,2mm. Các cao chiết nướ c còn laị không thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng vi khuẩn nhóm E. coli. Kết quả trên cho thấy rằng cao chiết nướ c từ cây Medinilla sp. và cây Xidi klung có khả năng ứ c chế nhóm vi khuẩn E. coli tốt hơn so vớ i các loaị cao chiết nướ c từ các cây thuốc còn laị trong đề tài. Tuy nhiên, kết quả kháng khuẩn E. coli của 2 mẫu này khi so sánh với Ciprofloxacin nồng đô ̣ 500mg/ml thı̀ vẫn còn thấp hơn môṭ cách có ý nghıã thống kê (p < 0,05). Thử nghiêṃ của Thilza và ctv (2010) về hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của cao chiết nướ c cây Moringa oleifera với nồng đô ̣ 200mg/ml trên chủng E. coli cho kết quả vòng kháng khuẩn trung bı̀nh là 7mm. Trong thử nghiêṃ này, mẫu cao nước nồng đô ̣ 100mg/ml của cây Medinilla sp. cho vòng kháng khuẩn trung bı̀nh là 10,17mm và mẫu cao nướ c nồng đô ̣ 100mg/ml của cây Xidi klung cho vòng kháng khuẩn trung bı̀nh là 9,33mm, cao hơn vòng kháng của nghiên cứ u nêu trên. 3.2.2 Kết quả đá nh giá hoaṭ tı́nh khá ng khuẩn đố i vớ i nhóm vi khuẩn Listeria spp. Sau khi tiến hành thử nghiêṃ đánh giá hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của 11 loaị cao chiết nướ c đối vớ i nhóm vi khuẩn Listeria, kết quả thu được từ thử nghiê ̣m được thể hiê ̣n trong hı̀nh 3.3. 37 Đồ án tốt nghiệp Hınh̀ 3.3. Kết quả hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của các loaị cao chiết đối vớ i nhóm vi khuẩn nhóm Listeria spp. Từ kết quả thu đươc̣ ở hı̀nh 3.3, nhận thấy rằng cao chiết nướ c từ các cây thuốc khác nhau thể hiện hoạt tính ứ c chế khác nhau đối với 2 chủng vi khuẩn Listeria khảo sát. Cao chiết nước từ cây Medinilla sp. thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn tốt nhất vớ i cả 2 chủng vi khuẩn Listeria khảo sát, đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh lần lươṭ là 10,2mm và 12,8mm. Đối vớ i chủng L. monocytogenes, cao chiết nướ c từ cây Polygala sp. và cây Streptocaulon sp. thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn tốt tương đương vớ i kháng sinh đối chứ ng Ciprofloxacin ở nồng đô ̣ 500mg/ml, đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn lần lươṭ là 10mm và 11,3mm. Đối vớ i chủng L. innocua, cao chiết từ cây Xidi klung thể hiêṇ hoaṭ tı́nh tốt nhất và tương đương vớ i kháng sinh đối chứ ng Ciprofloxacin ở nồng đô ̣500mg/ml, đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh 10mm. 38 Đồ án tốt nghiệp Các kết quả trên cho thấy rằng nhóm vi khuẩn nhóm Listeria khảo sát bi ̣ứ c chế sư ̣ phát triển bởi cao chiết nướ c từ cây Medinilla sp. cao hơn so với các loại cao chiết nướ c từ các cây thuốc khác trong đề tài. Khi so sánh với hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của đối chứ ng Ciprofloxacin 500mg/ml, hoaṭ tı́nh ứ c chế vi khuẩn nhóm Listeria của cao chiết nướ c từ cây Medinilla sp. tốt tương đương về phương diêṇ thống kê (p < 0,05). 3.2.3 Kết quả đá nh giá hoaṭ tı́nh khá ng khuẩn đối vớ i nhóm vi khuẩn Salmonella spp. Kết quả quả thử nghiêṃ đánh giá hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của 11 loaị cao chiết nướ c từ các cây thuốc đối vớ i nhóm vi khuẩn Salmonella đươc̣ thể hiêṇ trong hı̀nh 3.4. Hınh̀ 3.4. Kết quả hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của các loaị cao chiết đối vớ i nhóm vi khuẩn nhóm Salmonella spp. Kết quả hoaṭ tı́nh kháng khuẩn thu đươc̣ ở hı̀nh 3.4 cho thấy rằng 7/11 loaị cao chiết nướ c từ các cây thuốc không kháng laị sư ̣ phát triển của vi khuẩn nhóm Salmonella 39 Đồ án tốt nghiệp khảo sát, trong khi đó các cao chiết nướ c từ các cây còn laị là Medinilla sp., Xidi klung, Polygala sp., Podocarpus sp. có khả năng kháng laị vi khuẩn nhóm Salmonella. Cao chiết nướ c cây Medinilla sp. thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn tốt nhất khi kháng cả 4 chủng vi khuẩn Salmonella khảo sát, đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh từ 9,7mm đến 11mm và cao thuốc nướ c cây Xidi klung cũng thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn tốt ở 2 chủng vi khuẩn S. typhii và S. typhimurium vớ i đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh của 2 chủng vi khuẩn lần lươṭ là 11mm và 11,5mm. Cao chiết nước cây Podocarpus sp. và cây Polygala sp., ứ c chế vi khuẩn S. typhii vớ i đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh là 9,8mm và 3,8mm. Từ kết quả trên nhâṇ thấy rằng cao chiết nước cây Medinilla sp. ứ c chế sư ̣ phát triển của nhóm vi khuẩn Salmonella tốt hơn các loại cao chiết nướ c từ các cây thuốc khác khi kháng đươc̣ 4/4 chủng vi khuẩn Salmonella. Khi so sánh hoaṭ tı́nh kháng khuẩn vớ i Ciprofloxacin 500mg/ml, hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của cao chiết nước từ cây Medinilla sp. cho kết quả tốt tương đương môṭ cách có ý nghıã thống kê (p < 0,05). Khi so sánh vớ i thử nghiêṃ của Adebolu và Oladimeji về hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của cao chiết nước từ lá cây Ocimum gratissimum đươc̣ chần nướ c sôi, kết quả thử nghiêṃ này laị thấp hơn khi vòng kháng khuẩn trong thử của Adebolu và Oladimeji đối vớ i vi khuẩn S. typhii là 30mm và đối vớ i vi khuẩn S. typhimurim là 39mm. Tương tư,̣ trong môṭ thı́ nghiêṃ của Doughari (2006) về hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của cao nướ c chiết xuất từ vỏ cây Tamarindus indica Linn, vớ i nồng đô ̣ 100mg/ml, vòng kháng khuẩn ghi nhâṇ đươc̣ 24mm, cao hơn so vớ i trong kết quả trong thử nghiêṃ này. 3.2.4 Kết quả đá nh giá hoaṭ tı́nh khá ng khuẩn đố i vớ i nhóm vi khuẩn Shigella spp. Tiến hành thử nghiêṃ đánh giá hoaṭ tı́nh kháng khuẩn đối vớ i nhóm vi khuẩn Shigella của 11 loaị cao chiết nướ c, kết quả thu đươc̣ từ thử nghiêṃ đươc̣ thể hiêṇ trong hı̀nh 3.5. 40 Đồ án tốt nghiệp Hınh̀ 3.5. Kết quả hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của các loaị cao chiết đối vớ i nhóm vi khuẩn nhóm Shigella spp. Dựa vào kết quả từ hı̀nh 3.5 nhận thấy rằng 5/11 mẫu cao chiết nướ c gồm Pococarpus sp., Eupatorium sp., Medinilla và Xidi klung có hoạt tính kháng 3 chủng vi khuẩn Shigella, trong đó cao chiết nướ c từ cây Medinilla sp. thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn tốt nhất khi cho kết quả vòng kháng khuẩn ở cả 3 chủng vi khuẩn với đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh từ 9,3mm đến 11,3mm Bên canḥ đó, cao chiết nướ c cây Xidi klung cũng thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn ở 2 chủng vi khuân Shi. flexneri và Shi. sonnei, đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh đối vớ i 2 chủng vi khuẩn lần lươṭ là 9,3mm và 8,5mm. Đối vớ i vi khuẩn Shi. flexneri, cao thuốc nướ c từ cây Elephatopus sp. thể hiêṇ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn tốt nhất với vòng kháng khuẩn 11,2mm, tương đương vớ i hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của Ciprofloxacin ở nồng độ 500mg/ml. Đối vớ i vi khuẩn Shi. boydii, cao chiết từ cây Eupatorium sp. cho kết quả tốt nhất, đường kı́nh vòng kháng 13,2mm trong khi đối chứ ng dương Ciprofloxacin 500mg/ml laị không thể 41 Đồ án tốt nghiệp hiêṇ kết quả kháng. Ở vi khuẩn Shi. sonnei, cao thuốc từ cây Medinilla sp. cho kết quả tốt nhất, tuy nhiên laị thấp hơn so vớ i đối chứ ng dương Ciprofloxacin 500mg/ml. Kết quả này cho thấy rằng nhóm vi khuẩn Shigella bi ̣ứ c chế bở i cao chiết nướ c cây Medinilla sp. cao nhất khi kháng đươc̣ cả 3 chủng vi khuẩn Shigella và cho kết quả vòng phân giải lớ n nhất so vớ i các cao chiết nước từ các mẫu cây khác trong thı ́ nghiêm.̣ Hơn nữa, hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của cao chiết nướ c từ cây Medinilla sp. cũng thể hiêṇ kết quả tốt tương đương với đối chứ ng Ciprofloxacin 500mg/ml. Trong môṭ thử nghiêṃ tương tư ̣ của Doughari (2006) về cao nướ c chiết xuất từ vỏ cây và lá cây Tamarindus indica Linn, cao chiết từ vỏ cây vớ i nồng đô ̣ 100mg/ml cho kết quả vòng kháng khuẩn trên vi khuẩn Shi. flexneri là 18mm, cao hơn so vớ i trong kết quả trong thử nghiêṃ này. Tuy nhiên, kết quả vòng kháng khuẩn của mẫu cao chiết từ lá cây laị ghi nhâṇ kết quả thấp hơn vớ i vòng kháng khuẩn trung bı̀nh chı̉ 3mm. 3.2.5 Kết quả đá nh giá hoaṭ tı́nh khá ng khuẩn đối vớ i nhóm vi khuẩn Vibrio spp. Kết quả ghi nhâṇ đươc̣ trong quá trı̀nh thưc̣ hiêṇ thử nghiêṃ đánh giá hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của cao chiết nước từ 11 mẫu cây đối với nho...ptocaulon sp. đều không có sư ̣ hiêṇ diêṇ của alkaloid. Tuy nhiên, cây Medinilla sp. cũng không cho kết quả có sự hiê ̣n diê ̣n của alkaloid măc̣ dù hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của cây tốt nhất trong số các cây thuốc đươc̣ khảo sát đánh giá. Có thể hoaṭ tı́nh của cây Medinilla sp. là do các hoaṭ tı́nh kháng khuẩn khác hiêṇ diêṇ trong cây như flavonoid, hợp chất phenolic, tannin. Các cây thuốc khác cũng cho kết quả kháng khuẩn tốt là Xidi klung, Polygala sp. đều có sư ̣ hiêṇ của alkaloid, chứ ng tỏ hoaṭ tı́nh kháng khuẩn của các cây thuốc này có thể do alkaloid, flavonoid, hợp chất phenolic, tannin góp phần taọ thành. 50 Đồ án tốt nghiệp Từ kết quả của các thử nghiêṃ trên, ta nhâṇ thấy cao chiết nướ c từ cây Polygala sp., Xidi klung và Medinilla sp. là những loại cây thuốc có hoạt tính sinh học khá cao, đặc biệt là hoạt tính kháng khuẩn khi cho kết quả kháng đươc̣ nhiều loaị vi khuẩn gây bênh,̣ đăc̣ biêṭ là bênḥ tiêu chảy. Măc̣ dù hiêụ suất tách chiết cao không cao (≥ 21%) nhưng không thể không đề cao chất có hoaṭ tı́nh sinh hoc̣ tốt như alkaloid, flavonoid, hơp̣ chất phenolic, tanin có trong cao chiết nướ c của các cây kể trên. Chı́nh những hơp̣ chất này hı̀nh thành nên hoaṭ tı́nh sinh hoc̣ của các cao chiết ấy. Với những nghiên cứu cơ bản về hoạt tính sinh học của các cây này sẽ làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về khả năng trị bệnh của chúng đặc biệt là khả năng trị bệnh tiêu chảy – một trong những bệnh phổ biến nhất hiện. 51 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận - Khi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến quá trình tách chiết cao từ các cây thuốc dân gian thì cao chiết từ nướ c cất có hiệu suất thu hồi cao nhất (30%) là cây Euodia sp. - Trong các thử nghiêṃ về hoaṭ tı́nh kháng khuẩn, cao chiết nướ c có hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất là cây Medinilla sp. (cho kết quả ứ c chế hoăc̣ đối kháng 20/20 chủng). Ngoài ra, các cây Polygala sp. và Xidi klung cũng cho kết quả ứ c chế hoăc̣ đối kháng tốt ở môṭ số chủng vi khuẩn gây bênḥ tiêu chảy. Cây Polygala sp. kháng đươc̣ 8/20 chủng vi khuẩn, cây Xidi klung đối kháng hoăc̣ ứ c chế đươc̣ 8/20 chủng vi khuẩn. - Kết quả thành phần hóa hoc̣ trong các cao chiết từ các cây thuốc cho sư ̣ hiêṇ diêṇ nhiều thành phần hóa hoc̣ như: carbonhydrate, alkaloids, saponin, cardiac glycosides, flavonoid, phenolic compound, tannin, steroid. 4.2 Đề nghị - Tiến hành định danh loài cho cây Polygala sp., Xidi klung và Medinilla sp. - Xác đinḥ giá tri MIC̣ của các cao chiết nướ c từ các cây Polygala sp., Xidi klung và Medinilla sp. - Khảo sát khả năng trị tiêu chảy của cây Polygala sp., Xidi klung và Medinilla sp trên mô hình động vật. - Đinh lượng các thành phần hóa học có trong cây Polygala sp., Xidi klung và Medinilla sp. 52 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Andrew Chevallier Fnimh (2006), Dược thảo toàn thư, NXBTHTPHCM. Hà Minh Hiển (2014), Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả mù u để ứng dụng trong kiểm nghiệm, Luận án tiến sĩ dược học, Đại học y dược TPHCM. nhHien-LA.pdf TS. Đặng Văn Hoài (2009 – 2010), Hóa hữu cơ NK Bài 2: steroid và cholesterol, Đại học Y dược TPHCM. BS Nguyễn Văn Minh Hoàng (2013), Đặc Điểm Shigella.sp gây tiêu chảy tại bệnh viện Nhiệt Đới TP HCM, Bệnh viện Nhiệt Đới TP HCM. chay-cap-tai-benh-vien-nhiet-doi-thanh-pho-ho-chi-minh-40933/ Phùng Trung Hùng và cộng tác viên (2013), Đại cương carbohydrate. Đỗ Tấn Lợi (1992), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXBKHKT TPHCM. Nguyễn Hữu Liêm (2013), Tìm hiểu về vi khuẩn Salmonella, Khóa luận tốt nghiệp 2010 – 2013, Đại học công nghệ TPHCM. Hoàng Ngân (2013), Bệnh tả và cách điều trị bệnh tả hiệu quả, Tạp chí sức khỏe và đời sống. Quỳnh Ngọc (2013), Flavonoid – Bảo vệ sức khỏe an toàn, NXB Trung tâm thông tin KH&CN TPHCM. Trần Kim Hùng Nguyên (2005), Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kháng một số chủng vi sinh vật đường ruột của cây Xuân Hoa (Pseudranthemum palatiferum), Khóa luận tốt nghiệp 2001-2005, Trường đại học Nông Lâm. nang-khang-mot-so-chung-vi-sinh-vat-duong-ruot-cua-cay-xuan-hoa-38059/ Dương Văn Sĩ (2010), Tìm hiểu về vi khuẩn Streptococcus faecalis (Enterococcus faecalis), Chyên đề tốt nghiệp, Trường đại học Nông Lâm TPHCM. enterococcus-faecalis-mon-kiem-nghiem-chat-luong-thuc-pham-ban-trinh-chieu- 29121/ 53 Đồ án tốt nghiệp Vũ Xuân Tạo (2011), Nghiên cứu alkaloid & quy trình tách chiết một số chất có bản chất là alkaloid, Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên TPHCM Lương Văn Tiến và ctv (2015), Kết quả nghiên cứu bước đầu về thành phấn hóa học của dầu hạt lai (Aleurites moluccana), Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam. Nguyễn Tấn Thịnh (2013), Tìm hiểu thành phần hợp chất thứ cấp trong cây lược vàng, Trường đại học công nghệ TPHCM. cay-luoc-vang-callisia-fragrans-lindl-wood-52390/ Ngô Văn Thu (1998), Bài giảng dược liệu, tập I, Trường đại học Dược Hà Nội Ngô Văn Thu (2011), Bài giảng dược liệu, tập I, Trường đại học Dược Hà Nội. Hồ Chí Tuấn (2009), Bài giảng Amino acid, Trường Đại học Y Hà Nội Đào Thị Thùy (2009), Nghiên cứu ảnh hưởng của chế biến cổ truyền đến thành phần hóa học và tác dụng kháng khuẩn của vị thuốc viễn chí (Radix Polygalae), Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 2004-2009, Trường đại học Y Dược Hà Nội. 54 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU TIẾNG ANH Abba D., Inabo, H. I., Yakubu, S. E. and Olonitola, O. S. (2009), Phytochemical analysis and antibacterial activity of some powered herbal preparations marketed in Kaduna metropolis, Full Lengh Research Article. Harborne B. (1989) Plant Phenolics. Academic Press, UK p: 6 Harborne B. (1998) Phytochemical Methods: A guide to modern techniques of plant analysis. Chapman & Hall Pub. London, UK pp: 40-42; 49; 84. James Hamuel Doughari (2010), Phytochemicals: Extraction Methods, Basic Structures and Mode of Action, Potential Chemotherapeutic Agents. James Hamuel Doughari (2012), Phytochemical: extraction methods, basic structures and mode of action as potential chemotherapeutic agents. Department of Microbiology, School of Pure and Applied Sciences, Federal Univercity of Technology, Yola Nigeria. Jean B. (1995), Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants - Technique & Documentation, Lavoisier. JH Doughari (2006), Antimicrobial Activity of Tamarindus indica Linn. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, December 2006; 5 (2): 597-603. Jigna Parekh, Nehal Karathia and Sumitra Chanda (2006), Screening of some traditionally used medicinal plants for potential antibacterial activity, International Journal of Engineering and Applied Sciences Karkare S., Adou E, Cao S., Brodie P., Miller J. S., Andrianjafy N. M., Razafitsalama J., Andriantsiferana R., Rasamison V. E., Kingston D. G. I. (2007), Cytotoxic cardenolide glycosides of Roupellina (Strophanthus) boivinii, The Madagascar rainforest, J Nat Prod, pp:70:1766 – 1770. Mon M. M.,Maw S. S. and Oo Z. K. (2011), Screening of antioxidant, anti-tumor and antimicrobial herbal drugs/diets from some Myanmar traditional herbs, International Journal of Bioscience, Biochemitry and Bioinformatics. Nicholson R., Vermerris W. (2008), Phenolic Compound Biochemistry, Springer USA, pp: 2; 40-151. Rayes A. A.H. (2012), Screening of some natural and cultivated plants in sudia arabia fight infections and inhibit growth of pathogenic bacteria, Faculty of Applied Sciences, Umm A1 – Qura University Makkah Saudi Arabia. Rozman T., Jersek B. (2009), Antimicrobial activity of rosemary extracts (Rosmarimus officinalis L.) against diferent species of Listeria, Acta agriculturae Slovenica. Salami Olufunmilayo Olamide, Afolabi Qasim Olaitan (2014), Antimicrobial activities of hot water extract and phytochemical screening of Acalypha wilkesiana (Red 55 Đồ án tốt nghiệp acalypha) on some selected organisms causing infection, International Journal of Engineering and Applied Sciences. Salem W. M., Sayed W. F., Haridy M. and Hassan N. H. (2014), Antibacterial activity of Calotropis procera and Ficus sycomorus extracts on some pathogenic microorganisms, African Journal of Biotechnology. Satheesh K. B., Sachetha K. N., Vadisha S. B., Sharmila K.P., Mahesh P. B. (2012) Preliminary phytochemical screening of various extracts of punica granatum peel, whole fruit and seeds, Nite University Journal of Health Science. Saxena Mamta and Saxena Jyoti (2012), Phytochemical screening of Acorus calamus and Lantana Camara, Interational Research Journal of Pharmacy. Silva N. C. C., Fermandes J. A. (2010), Biological properties of medicinal plants: a review of their antimicrobial activity, The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. Thilza I.B. , Sanni S., Zakari Adamu Isah , F.S. Sanni, Muhammed Talle, Musa Bamaiyi Joseph (2010), In vitro Antimicrobial activity of water extract of Moringa oleifera leaf stalk on bacteria normally implicated in eye diseases, Academia Arena, 2010;2(6):80-82 Valgas C., Souza S. M., Smania E. F. A., Smania Jr A. (2006), Screening methods to determine antibacterial activity of natural products, Brazillian Journal ò Microbiology. Venketeshwer Rao (2012), Phytochemicals – A global perspective of their role in nutrition and health. Wendakoon C., Calderon P., Gagnon D. (2012), Evaluation of selected medicinal plants extracted in different ethanol concentrations for antibacterial activity against human pathogens, Journal of Medicinally Active Plants. Wilfred Vermerris and Ralph Nicholson (2006), Phenolic compound biochemistry, Published, Springer, Netherlands. Witkowska A. M., Hickey. D. K., Alonso-Gomez M.. and Wilkinson M. (2013), Evaluation of antimicrobial activities of commercial herb and Spice extracts against selected food-borne bacteria, Journal of Food Research. Yadav P. D., Bharadwaj N. S. P.,Yedukondalu M., Methushala C. H., Ravi K. (2013), Phytochemical evaluation of nyctanthes arbortristis, nerium oleander and catharathnus roneus, Indian Journal of Research in Pharmacy and Biotechnology. Yusuf A. Z., Zakir A., Shemau Z., Abdullahi M., and Halima S. A. (2014) Phytochemical analysis of the methanol leaves extract of Paullinia pinnata linn, Journal of Pharmacognosy and Phytotherapy. 56 Đồ án tốt nghiệp 57 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC PHU ̣ LUC̣ A: CÁ CH PHA MÔṬ SỐ DUNG DICḤ THUỐ C THỬ A.1. Cá c thử nghiêṃ đinḥ tı́nh carbonhydrate  Thuốc thử Molisch: Hòa tan 5g α- napthol vào ethanol 95% và pha loãng thành 100 ml  Thuố c thử Feling:  Thuốc thử Fehling A: hòa tan 34,6 g CuSO4.5H2O vào 500ml nước cất.  Thuốc thử Fehling B: Hòa tan 125g KOH và 173g Kali Natri tartrate.7H2O vào 500 ml nước cất.  Thuốc thử Barfoed:  Thêm 10 ml acid acetic glacial vào 1000ml nước cất  Cân 66,5 g Copper (II) acetate monohydrate  Đun và khuấy đến khi tan hoàn A.2. Cá c thử nghiêṃ đinḥ tı́nh Alkaloids  Thuố c thử Mayer: Hòa tan 1,358g HgCl2 trong 60ml nước, sau đó đổ vào trong dung dịch này 5 g KI được pha trong 10ml nước. Sau đó định mức lên 100 ml.  Thuốc thử Dragendroff gồm 2 dung dịch:  Dung dịch A: hòa tan 0,5 g Bismuth nitrate (Bi(NO3)3.5H2O) trong 20 ml acid acetic 20%.  Dung dịch B: dung dịch KI 40% pha trong nước. Khi sử dụng, trộn 20 ml dung dịch A với 5 ml dung dịch B và 70ml nước.  Thuốc thử Hager: Hòa tan 1 g acid picric vào 100ml nước cất  Thuốc thử Wagner: Hòa tan 2g iodine và 6g KI vào 100ml nước. A.3. Cá c thử nghiêṃ đinḥ tı́nh Cardiac glycosides  Thuốc thử Na nitro prusside (trong phản ứ ng Legal): 1g Na nitrofer-ricyanide và bổ sung 10 ml nước cất. A.4. Cá c thử nghiêṃ đinḥ tı́nh Cardiac glycosides  Thuốc thử Ninhydrin: 0,5 g ninhydrin và bổ sung 10 ml n – butanol. Gia nhiệt 70 – 800C, khuấy đều bằng cá từ cho tới khi tan hoàn toàn. Định mức bằng n – butanol lên 100 ml. 58 Đồ án tốt nghiệp PHU ̣ LUC̣ B: XỬ LÝ THỐNG KÊ KẾT QUẢ MỨC ĐỘ KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC LOẠI CAO CHIẾT KHÁC NHAU TRÊN CÁC NHÓM VI SINH VẬT CHỈ THỊ B.1. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn E. coli O157:H7 Bả ng one way ANOVA Source Sum of Squares Mean F-Ratio P-Value Square Between groups 718.5 102.643 1970.74 0.0000 Within groups 0.833333 0.0520833 Total (Corr.) 719.333 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD Homogeneous CAY Count Mean Groups Elephantopus sp. 3 0.0 X Xidi klung 3 0.0 X Polygala sp. 3 0.0 X Podocarpus sp. 3 0.0 X Calamus sp. 3 0.0 X Euodia sp. 3 0.0 X Lantana sp. 3 0.0 X Acorus sp. 3 0.0 X Eupatorium sp. 3 0.0 X Streptocaulon sp. 3 9.16667 X Medinilla sp. 3 11.0 X Ciprofloxacin 3 13.1667 X B.2. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn E. coli 0208 Bả ng one way ANOVA Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 661.74 7 94.5342 432.16 0.0000 groups Within 3.5 16 0.21875 groups Total (Corr.) 665.24 23 59 Đồ án tốt nghiệp Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD Homogeneous CAY Count Mean Groups Elephantopus sp. 3 0.0 X Streptocaulon sp. 3 0.0 X Polygala sp. 3 0.0 X Podocarpus sp. 3 0.0 X Calamus sp. 3 0.0 X Euodia sp. 3 0.0 X Lantana sp. 3 0.0 X Acorus sp. 3 0.0 X Eupatorium sp. 3 0.0 X Xidi klung 3 9.16667 X Medinilla sp. 3 10.6667 X Ciprofloxacin 3 12.3333 X B.3 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn E. coli (K) Bảng one way ANOVA Sum of Mean Source Df F-Ratio P-Value Squares Square Between 669.458 7 95.6369 483.22 0.0000 groups Within 3.16667 16 0.197917 groups Total (Corr.) 672.625 23 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD Homogeneous CAY Count Mean Groups Eupatorium sp. 3 0.0 X Streptocaulon sp. 3 0.0 X Elephantopus sp. 3 0.0 X Podocarpus sp. 3 0.0 X Calamus sp. 3 0.0 X Euodia sp. 3 0.0 X Lantana sp. 3 0.0 X Acorus sp. 3 0.0 X Polygala sp. 3 8.33333 X Xidi klung 3 9.33333 XX 60 Đồ án tốt nghiệp Medinilla sp. 3 10.1667 X Ciprofloxacin 3 13.1667 X B.4 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn ETEC Bảng one way ANOVA Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 2387.41 7 341.058 102.96 0.0000 groups Within 53.0 16 3.3125 groups Total (Corr.) 2440.41 23 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Eupatorium sp. 3 0.0 X Elephantopus sp. 3 0.0 X Streptocaulon sp. 3 0.0 X Podocarpus sp. 3 0.0 X Calamus sp. 3 0.0 X Euodia sp. 3 0.0 X Lantana sp. 3 0.0 X Acorus sp. 3 0.0 X Polygala sp. 3 5.83333 X Medinilla sp. 3 9.83333 X Xidi klung 3 10.8333 X Ciprofloxacin 3 31.0 X 61 Đồ án tốt nghiệp B.5 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn Listeria innocua Bảng one way Anova Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 608.156 7 86.8795 26.82 0.0000 groups Within 51.8333 16 3.23958 groups Total (Corr.) 659.99 23 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD Homogeneous CAY Count Mean Groups Eupatorium sp. 3 0.0 X Streptocaulon sp. 3 0.0 X Elephantopus sp. 3 0.0 X Podocarpus sp. 3 0.0 X Calamus sp. 3 0.0 X Euodia sp. 3 0.0 X Lantana sp. 3 0.0 X Acorus sp. 3 0.0 X Polygala sp. 3 5.83333 X Xidi klung 3 10.0 XX Medinilla sp. 3 10.3333 XX Ciprofloxacin 3 12.0 X B.6 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn Listeria monocytogenes Bảng one way Anova Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 763.458 7 109.065 25.79 0.0000 groups Within 67.6667 16 4.22917 groups Total (Corr.) 831.125 23 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD 62 Đồ án tốt nghiệp CAY Count Mean Homogeneous Groups Eupatorium sp. 3 0.0 X Xidi klung 3 0.0 X Elephantopus sp. 3 0.0 X Podocarpus sp. 3 0.0 X Calamus sp. 3 0.0 X Euodia sp. 3 0.0 X Lantana sp. 3 0.0 X Acorus sp. 3 0.0 X Polygala sp. 3 6.66667 X Streptocaulon sp. 3 11.3333 XX Ciprofloxacin 3 12.1667 XX Medinilla sp. 3 12.8333 X B.7 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn Salmonella dublin Bảng one way Anova Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 605.823 7 86.5461 830.84 0.0000 groups Within 1.66667 16 0.104167 groups Total (Corr.) 607.49 23 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Elephantopus sp. 3 0.0 X Xidi klung 3 0.0 X Polygala sp. 3 0.0 X Podocarpus sp. 3 0.0 X Eupatorium sp. 3 0.0 X Calamus sp. 3 0.0 X Euodia sp. 3 0.0 X Lantana sp. 3 0.0 X Acorus sp. 3 0.0 X Streptocaulon sp. 3 0.0 X Medinilla sp. 3 11.0 X Ciprofloxacin 3 12.1667 X 63 Đồ án tốt nghiệp B.8 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn Salmonella enteritidis Bảng one way Anova Sum of Mean Source Df F-Ratio P-Value Squares Square Between 508.573 7 72.6533 14.97 0.0000 groups Within 77.6667 16 4.85417 groups Total (Corr.) 586.24 23 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Elephantopus sp. 3 0.0 X Xidi klung 3 0.0 X Polygala sp. 3 0.0 X Podocarpus sp. 3 0.0 X Eupatorium sp. 3 0.0 X Calamus sp. 3 0.0 X Euodia sp. 3 0.0 X Lantana sp. 3 0.0 X Acorus sp. 3 0.0 X Streptocaulon sp. 3 0.0 X Medinilla sp. 3 7.16667 X Ciprofloxacin 3 13.0 X 64 Đồ án tốt nghiệp B.9 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn Mẫu Salmonella typhii (K) Bảng one way Anova Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 639.656 7 91.3795 26.42 0.0000 groups Within 55.3333 16 3.45833 groups Total (Corr.) 694.99 23 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Streptocaulon sp. 3 0.0 X Elephantopus sp. 3 0.0 X Eupatorium sp. 3 0.0 X Polygala sp. 3 3.0 X Calamus sp. 3 0.0 X Euodia sp. 3 0.0 X Lantana sp. 3 0.0 X Acorus sp. 3 0.0 X Podocarpus sp. 3 9.83333 X Medinilla sp. 3 9.83333 X Xidi klung 3 11.0 X Ciprofloxacin 3 12.5 X B.10 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn Mẫu Salmonella typhimurium Bảng one way Anova Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 695.167 7 99.3095 733.36 0.0000 groups Within 2.16667 16 0.135417 groups Total (Corr.) 697.333 23 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD 65 Đồ án tốt nghiệp CAY Count Mean Homogeneous Groups Elephantopus sp. 3 0.0 X Streptocaulon sp. 3 0.0 X Polygala sp. 3 0.0 X Podocarpus sp. 3 0.0 X Eupatorium sp. 3 0.0 X Calamus sp. 3 0.0 X Euodia sp. 3 0.0 X Lantana sp. 3 0.0 X Acorus sp. 3 0.0 X Medinilla sp. 3 10.8333 X Ciprofloxacin 3 11.0 X Xidi klung 3 11.5 X B.11. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn Mẫu Shigella boydii Bảng one way Anova Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 582.125 7 83.1607 13.81 0.0000 groups Within 96.3333 16 6.02083 groups Total (Corr.) 678.458 23 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Polygala sp. 3 0.0 X Elephantopus sp. 3 0.0 X Ciprofloxacin 3 0.0 X Podocarpus sp. 3 0.0 X Calamus sp. 3 0.0 X Euodia sp. 3 0.0 X Lantana sp. 3 0.0 X Acorus sp. 3 0.0 X Xidi klung 3 0.0 X Streptocaulon sp. 3 0.0 X Medinilla sp. 3 7.83333 X Eupatorium sp. 3 13.8333 X 66 Đồ án tốt nghiệp B.12. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn Mẫu Shigella flexneri Bảng one way Anova Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 696.49 7 99.4985 29.12 0.0000 groups Within 54.6667 16 3.41667 groups Total (Corr.) 751.156 23 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Podocarpus sp. 3 0.0 X Eupatorium sp. 3 0.0 X Polygala sp. 3 0.0 X Streptocaulon sp. 3 3.0 X Calamus sp. 3 0.0 X Euodia sp. 3 0.0 X Lantana sp. 3 0.0 X Acorus sp. 3 0.0 X Xidi klung 3 9.33333 X Medinilla sp. 3 9.83333 X Elephantopus sp. 3 12.1667 X Ciprofloxacin 3 13.1667 X B.13. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn Mẫu Shigella sonnei Bảng one way Anova Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 2560.79 7 365.827 65.28 0.0000 groups Within 89.6667 16 5.60417 groups Total (Corr.) 2650.46 23 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Streptocaulon sp. 3 0.0 X 67 Đồ án tốt nghiệp sp. Eupatorium sp. 3 0.0 X Polygala sp. 3 0.0 X Calamus sp. 3 0.0 X Euodia sp. 3 0.0 X Lantana sp. 3 0.0 X Acorus sp. 3 0.0 X Podocarpus sp. 3 3.83333 XX Xidi klung 3 9.33333 XX Medinilla sp. 3 9.33333 XX Elephantopus sp. 3 12.1667 X Ciprofloxacin 3 33.0 X B.14. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn Mẫu Vibrio alginolyticus Bảng one way Anova Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 891.5 7 127.357 679.24 0.0000 groups Within 3.0 16 0.1875 groups Total (Corr.) 894.5 23 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Streptocaulon sp. sp. 3 0.0 X Calamus sp. 3 0.0 X Euodia sp. 3 0.0 X Lantana sp. 3 0.0 X Acorus sp. 3 0.0 X Xidi klung 3 0.0 X Elephantopus sp. 3 0.0 X Podocarpus sp. 3 0.0 X Eupatorium sp. 3 0.0 X Polygala sp. 3 9.16667 X Medinilla sp. 3 10.6667 X Ciprofloxacin. 3 16.1667 X B.15. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn Mẫu Vibrio cholerae Bảng one way Anova 68 Đồ án tốt nghiệp Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 629.167 7 89.881 539.29 0.0000 groups Within 2.66667 16 0.166667 groups Total (Corr.) 631.833 23 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Elephantopus sp. 3 0.0 X Xidi klung 3 0.0 X Polygala sp. 3 0.0 X Podocarpus sp. 3 0.0 X Calamus sp. 3 0.0 X Euodia sp. 3 0.0 X Lantana sp. 3 0.0 X Acorus sp. 3 0.0 X Eupatorium sp. 3 0.0 X Streptocaulon sp. 3 0.0 X Medinilla sp. 3 10.0 X Ciprofloxacin 3 13.3333 X 69 Đồ án tốt nghiệp B.16. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn Mẫu Vibrio harveyi Bảng one way Anova Source Sum of Squares Df Mean F-Ratio P-Value Square Between groups 1087.16 7 155.308 16.26 0.0000 Within groups 152.833 16 9.55208 Total (Corr.) 1239.99 23 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Elephantopus sp. 3 0.0 X Xidi klung 3 0.0 X Streptocaulon sp. 3 0.0 X Calamus sp. 3 0.0 X Euodia sp. 3 0.0 X Lantana sp. 3 0.0 X Acorus sp. 3 0.0 X Polygala sp. 3 8.0 XX Eupatorium sp. 3 10.0 XX Medinilla sp. 3 10.3333 XX Podocarpus sp. 3 15.8333 XX Ciprofloxacin sp. 3 18.0 X B.17. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn Mẫu Vibrio parahaemolyticus Bảng one way Anova Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 568.458 7 81.2083 519.73 0.0000 groups Within 2.5 16 0.15625 groups Total (Corr.) 570.958 23 70 Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Streptocaulon sp. 3 0.0 X Xidi klung 3 0.0 X Elephantopus sp. 3 0.0 X Podocarpus sp. 3 0.0 X Calamus sp. 3 0.0 X Euodia sp. 3 0.0 X Lantana sp. 3 0.0 X Acorus sp. 3 0.0 X Eupatorium sp. 3 0.0 X Polygala sp. 3 8.16667 X Medinilla sp. 3 9.83333 X Ciprofloxacin 3 11.6667 X B.18. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn Mẫu Pseudomonas (K) Bảng one way Anova Source Sum of Squares Df Mean F-Ratio P-Value Square Between groups 587.0 7 83.8571 335.43 0.0000 Within groups 4.0 16 0.25 Total (Corr.) 591.0 23 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Streptocaulon sp. 3 0.0 X Xidi klung 3 0.0 X Elephantopus sp. 3 0.0 X Podocarpus sp. 3 0.0 X Calamus sp. 3 0.0 X Euodia sp. 3 0.0 X Lantana sp. 3 0.0 X Acorus sp. 3 0.0 X Eupatorium sp. 3 0.0 X Polygala sp. 3 8.16667 X Medinilla sp. 3 9.66667 X Ciprofloxacin 3 12.1667 X 71 Đồ án tốt nghiệp B.19. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn Mẫu Staphylococcus aureus Bảng one way Anova Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between groups 591.823 7 84.5461 23.26 0.0000 Within groups 58.1667 16 3.63542 Total (Corr.) 649.99 23 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Streptocaulon sp. 3 0.0 X Xidi klung 3 0.0 X Polygala sp. 3 0.0 X Elephantopus sp. 3 0.0 X Calamus sp. 3 0.0 X Euodia sp. 3 0.0 X Lantana sp. 3 0.0 X Acorus sp. 3 0.0 X Eupatorium sp. 3 6.16667 X Podocarpus sp. 3 9.66667 XX Medinilla sp. 3 9.83333 XX Ciprofloxacin 3 12.1667 X B.20. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn Mẫu E.feacalis Bảng one way Anova Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 691.125 7 98.7321 287.22 0.0000 groups Within groups 5.5 16 0.34375 Total (Corr.) 696.625 23 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Streptocaulon sp. 3 0.0 X Xidi klung 3 0.0 X Elephantopus sp. 3 0.0 X 72 Đồ án tốt nghiệp Podocarpus sp. 3 0.0 X Calamus sp. 3 0.0 X Euodia sp. 3 0.0 X Lantana sp. 3 0.0 X Acorus sp. 3 0.0 X Eupatorium sp. 3 0.0 X Medinilla sp. 3 9.5 X Polygala sp. 3 11.5 X Ciprofloxacin 3 12.0 X 73 Đồ án tốt nghiệp PHU ̣ LUC̣ C: KẾ T QUẢ HIÊỤ SUẤ T THU HỒ I CAO Tên cây Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Podocarpus 12,45 11,92 11,6 11,99 sp. Eupatorium 26,55 23,1 26,73 25,46 sp. Elephantopus 14,73 15,64 15,09 15,15333 sp Lantana sp 10,08 10,98 11,94 11 Acorus sp 25,87 27,98 24,15 26 Calamus sp 21,15 21,98 19,87 21 Medinilla sp. 21,18 18,86 20,51 20,18333 Polygala sp. 20 21,78 19,8 20,52667 Xidi klung 18,79 23,43 20,78 21 Streptocaulon 14,56 17,72 15,72 16 sp. Euodia sp 32,78 29,08 28,14 30 ANOVA Table for GIA TRI by CAY Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1063.53 10 106.353 49.14 0.0000 Within groups 47.6189 22 2.1645 Total (Corr.) 1111.15 32 Multiple Range Tests for GIA TRI by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD CAY Count Mean Homogeneous Groups Lantana sp. 3 11.0 X Podocarpus sp. 3 11.99 XX Elephatopus sp. 3 15.1533 XX Streptocaulon sp. 3 16.0 XX Medinilla sp. 3 20.1833 XX Polygala sp. 3 20.5267 X 74 Đồ án tốt nghiệp Calamus sp. 3 21.0 X Xidi klung 3 21.6633 XX Eupatorium sp. 3 25.46 XX Acorus sp. 3 26.0 XX Euodia sp. 3 30.0033 X 75 Đồ án tốt nghiệp PHU ̣ LUC̣ D: KẾ T QUẢ HOAṬ TÍNH KHÁ NG KHUẨ N CỦ A CÁ C CAO CHIẾ T NƯỚ C D.1. Kết quả hoaṭ tı́nh khá ng vi khuẩn nhóm E. coli m E. colim E. ́ n nho n ̉ ng khuâ ng vi ́ nh nh kha ́ ̣ t t tı hoa ̉ Kết Kết qua ng ̉ Ba 76 Đồ án tốt nghiệp D.2. Kết quả hoaṭ tı́nh khá ng vi khuẩn nhóm E. coli Listeria m ́ nho n ̉ ng ng vi khuâ ́ nh kha ́ ̣ t t tı hoa ̉ Kết Kết qua ng ̉ Ba 77 Đồ án tốt nghiệp D.3. Kết quả hoaṭ tı́nh khá ng vi khuẩn nhóm Salmonella Salmonella m ́ n nho n ̉ ng ng vi khuâ ́ nh nh kha ́ ̣ t t tı hoa ̉ Kết Kết qua ng ̉ Ba 78 Đồ án tốt nghiệp D.4. Kết quả hoaṭ tı́nh khá ng vi khuẩn nhóm Vibrio Vibrio m ́ n nho n ̉ ng khuâ ng vi ́ h h kha n ́ ̣ t t tı hoa ̉ Kết Kết qua ng ̉ Ba 79 Đồ án tốt nghiệp D.5. Kết quả hoaṭ tı́nh khá ng vi khuẩn nhó m Shigella Shigella m ́ n nho n ̉ ng khuâ ng vi ́ nh nh kha ́ ̣ t t tı hoa ̉ Kết Kết qua ng ̉ Ba 80 Đồ án tốt nghiệp D.6. Kết quả hoaṭ tı́nh khá ng vi khuẩn nhó m Shigella ̣ i i trên da n gây bênh cơ bênh gây hô n ̉ ng ng vi khuâ ́ nh nh kha ́ ̣ t t tı hoa ̉ Kết Kết qua ng ̉ Ba 81 Đồ án tốt nghiệp 82