Đồ án Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cao chiết ethanol 70% từ một số loại thực vật tại vườn quốc gia bidoup Núi bà, tỉnh Lâm Đồng

n tất cả nội dung trong đồ án này đều do tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của ThS Phạm Minh Nhựt khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực vào chưa được công bố dưới bất kì hình thức nào. Mọi tài liệu tham khảo dùng trong đồ án này đều được trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên công trình, thời gian, địa điểm công bố. Những số liệu của các bảng phân tích, biểu đồ, đánh giá được thu thập từ nhiều nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo và chú thích nguồn gốc. Tất cả nội dung, sao chép không hợp lệ, vi phạm quy chế đào tạo, không trung thực, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Trịnh Tuấn Anh Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Ban Gíam Hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh, cùng các thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học ­ Thực phẩm ­ Môi trường đã quan tâm và giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình học tập tại trường. Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em chân thành gửi đến thầy Phạm Minh Nhựt đã tận tâm hướng dẫn chúng em qua từng buổi học trên lớp cũng như những buổi nói chuyện, thảo luận về lĩnh vực sáng tạo trong nghiên cứu khoa học, định hướng nghiên cứu. Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy. Em cũng xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô khoa Công nghệ sinh học ­ Môi trường ­ Thực phẩm trường Đại học Công Nghệ Tp.HCM đã tận tình truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm cũng như niềm đam mê nghiên cứu khoa học cho em. Điều này không chỉ giúp em thực hiện đồ án này tốt nhất có thể mà còn là nền tảng kiến thức cho công như việc sau này. Em cảm ơn các bạn, anh, chị đã hỗ trợ và giúp đỡ em trong thời gian thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm. Cuối cùng, em xin cảm ơn các thầy cô trong Hội đồng phản biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án. Do kiến thức và kinh nghiệm còn hạn chế nên đồ án tốt nghiệp của em còn nhiều thiếu sót, mong các thầy cô chỉ dạy đề em hoàn thiện đồ án này tốt hơn cũng như thu nhận thêm được kiến thức. Em xin gửi lời chúc sức khoẻ đế các thầy cô. Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Trịnh Tuấn Anh Đồ án tốt nghiệp MUC̣ LUC̣ MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 4 1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 9 2. Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................... 10 3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 10 4. Phạm vi nghiên cứu ..................................................................................... 11 5. Nội dung Đồ án tốt nghiệp .......................................................................... 11 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................ 12 1.1. Giới thiệu.................................................................................................... 12 1.1.1. Vai trò của cây thuốc trong đời sống .................................................... 12 1.1.2. Lợi ích sử dụng cây thuốc .................................................................... 13 1.1.3 Tình hình sử dụng cây thuốc ................................................................. 13 1.2. Thành phần hóa học của thực vật ................................................................ 14 1.2.1 Carbohydrate ........................................................................................ 14 1.2.1.1 Khái niệm .................................................................................... 14 1.2.1.2 Tính chất ..................................................................................... 14 1.2.1.3 Vai trò ......................................................................................... 15 1.2.2 Amino acid ........................................................................................... 15 1.2.2.1 Khái niệm .................................................................................... 15 1.2.2.2 Tính chất ..................................................................................... 16 1.2.2.3 Vai trò ......................................................................................... 16 1.2.3 Alkaloid ................................................................................................ 16 1.2.3.1 Khái niệm .................................................................................... 16 1.2.3.2 Tính chất ..................................................................................... 16 1.2.3.3 Vai trò ......................................................................................... 17 1.2.4 Glycosides ............................................................................................ 17 1.2.4.1 Khái niệm .................................................................................... 17 1.2.4.2 Tính chất ..................................................................................... 18 1.2.4.3 Vai trò ......................................................................................... 18 1 Đồ án tốt nghiệp 1.2.5 Steroids ................................................................................................ 19 1.2.5.1 Khái niệm .................................................................................... 19 1.2.5.2 Tính chất ..................................................................................... 19 1.2.5.3 Vai trò ......................................................................................... 19 1.2.6 Tannin .................................................................................................. 19 1.2.6.1 Khái niệm .................................................................................... 19 1.2.6.2 Đặc điểm ..................................................................................... 20 1.2.6.3 Vai trò ......................................................................................... 20 1.2.7 Isoprenoid (Terpene) ............................................................................ 20 1.2.7.1 Khái niệm .................................................................................... 20 1.2.7.2 Tính chất ..................................................................................... 21 1.2.7.3 Vai trò ......................................................................................... 21 1.3 Tổng quan về hợp chất kháng khuẩn thực vật......................................... 21 1.3.1 Khái niệm hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn....................................... 21 1.3.2 Cơ chế kháng khuẩn ............................................................................. 22 1.3.3 Một số hợp chất kháng khuẩn thực vật ................................................. 23 1.3.3.1 Alkaloids ..................................................................................... 23 1.3.3.2 Terpenoids và tinh dầu ................................................................ 25 1.3.3.3 Phenol đơn và acid phenolic ........................................................ 25 1.3.3.4 Lectin và polypeptide .................................................................. 27 1.3.3.5 Saponin ....................................................................................... 27 1.4 Một số vi sinh vật gây bệnh điển hình ...................................................... 28 1.4.1 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy .................................................... 28 1.4.1.1 Escherichia coli ........................................................................... 28 1.4.1.2 Shigella ....................................................................................... 29 1.4.1.3 Salmonella .................................................................................. 30 1.4.1.4 Vibrio .......................................................................................... 31 1.4.1.5 Listeria ........................................................................................ 32 1.4.2 Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da ............................................. 33 2 Đồ án tốt nghiệp 1.4.2.1 Pseudomonas aeruginosa ............................................................ 33 1.4.2.2 Staphylococcus aureus ................................................................ 34 1.4.2.3 Enterococcus feacalis .................................................................. 35 CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 36 2.1 Địa điểm và thời gian ................................................................................ 36 2.1.1 Địa diểm ............................................................................................... 36 2.1.2 Thời gian .............................................................................................. 36 2.2 Vật liệu ....................................................................................................... 36 2.2.1 Nguồn mẫu phân tích ............................................................................ 36 2.2.2 Vi sinh vật chỉ thị ................................................................................. 37 2.2.3 Hóa chất, môi trường ............................................................................ 37 2.3 Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 38 2.3.1 Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu ................................................... 38 2.3.2 Phương pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị. ............................................. 38 2.3.3 Phương pháp định lượng tế bào VSV bằng đo mật độ quang ................ 39 2.3.4 Phương pháp bảo quản và giữ giống ..................................................... 39 2.3.5 Phương pháp tách chiết cao .................................................................. 40 2.3.6 Chuẩn bị dung dịch cao thuốc kháng sinh ............................................. 40 2.3.7 Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method) 40 2.3.8 Phương pháp xác định thành phần hóa học ........................................... 41 2.3.8.1 Carbohydrate ............................................................................... 41 2.3.8.2 Alkaloid ...................................................................................... 42 2.3.8.3 Saponin (thử nghiệm Foam) ........................................................ 42 2.3.8.4 Cardiac glycosides ...................................................................... 42 2.3.8.5 Anthaquinone glycosides (thử nghiệm Bontrager) ....................... 43 2.3.8.6 Flavonoid .................................................................................... 43 2.3.8.7 Phenolic ...................................................................................... 44 2.3.8.8 Tannin ......................................................................................... 44 2.3.8.9 Steroid ......................................................................................... 44 3 Đồ án tốt nghiệp 2.3.8.10 Amino acid .................................................................................. 45 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu .................................................................... 45 2.4 Bố trí thí nghiệm ........................................................................................ 46 2.4.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết ethanol 70% của các mẫu cây thuốc. ................................................................................................ 47 2.4.3 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết ethanol . ............................................................................................................. 49 2.4.5 Thí nghiệm 4: Xác định thành phần hóa học ......................................... 50 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 52 3.1 Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi .......................................................... 52 3.2 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% từ các mẫu cây khảo sát ....................................................................................... 53 3.2.1 Đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli ............................................... 53 3.2.2 Đối với nhóm vi khuẩn Listeria ............................................................ 54 3.2.3 Đối với nhóm vi khuẩn Salmonella ....................................................... 55 3.2.4 Đối với nhóm vi khuẩn Shigella ........................................................... 57 3.2.5 Đối với nhóm vi khuẩn Vibrio .............................................................. 58 3.2.6 Nhóm vi sinh vật gây bệnh khác ........................................................... 59 3.3 Kết quả xác định thành phần hoá học ..................................................... 63 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................... 65 1. Kết luận ....................................................................................................... 65 2. Đề nghị ......................................................................................................... 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 66 4 Đồ án tốt nghiệp DANH MUC̣ HÌNH Ả NH Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của các loại Carbonhydrate ........................................ 15 Hình 1.3.Alanine .................................................................................................. 15 Hình 1.4. Epherdin và Hyoscyamin ...................................................................... 16 Hình 1.5. Cardenolic và Bufadiennolid ................................................................ 18 Hình 1.6. Steroid .................................................................................................. 19 Hình 1.7. Tannin .................................................................................................. 20 Hình 1.8. Limonene và Ocimene .......................................................................... 21 Hình 1.9. Một số cơ chế kháng sinh ..................................................................... 22 Hình 1.10. Solamargine ....................................................................................... 24 Hình 1.11. Berberine ............................................................................................ 24 Hình 1.12.Một số Terpenenes và Terpenoid ......................................................... 25 Hình 1.13.Một số Quinones thông thường ............................................................ 26 Hình 1.14. Gallotannin ......................................................................................... 26 Hình 1.15. Một số Flavonoid ............................................................................... 27 Hình 1.16. Saponin .............................................................................................. 28 Hình 1.17. Hình ảnh Escherichia coli O15:H7 dưới kính hiển vi ......................... 28 Hình 1.18. Ảnh chụp của Shigella sp. trong một mẫu phân .................................. 29 Hình 1.19. Hình ảnh của S. typhii và S. typhimurium ........................................... 30 Hình 1.20. Hình ảnh Vibrio cholerae và Vibrio harvey ....................................... i 31 Hình 1.21. Hình ảnh Listeria monocytogenes ....................................................... 32 Hình 1.22. Hình ảnh Pseudomonas aeruginosa .................................................... 33 Hình 1.24. Hình ảnh Enterococcus feacalis .......................................................... 35 Hình 2.1. Quy trình xử lý mẫu ............................................................................. 38 Hình 3.1. Hiệu xuất tách chiết của ethanol 70% với các mẫu cây thuốc ............... 52 Hình 3.2. Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm Escherichia coli ................................................................................... 53 Hình 3.3. Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm Listeria ................................................................................................. 55 Hình 3.4. Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm Salmonella ............................................................................................ 56 5 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5. Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm Shigella ................................................................................................. 57 Hình 3.6. Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm Vibrio ................................................................................................... 58 Hình 3.7. Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm vi sinh vậy gây bệnh ............................................................................. 59 6 Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT MIC (Minimum Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế tối thiểu DMSO : Dung môi dimethysufoside TSA : môi trường Tryptone casein soy agar TSB : môi trường Trypticase Soy Broth 7 Đồ án tốt nghiệp DANH MUC̣ BẢ NG Bảng 1.1 Môṭ số Glycosides phổ biến .................................................................... 17 Bảng 3.1 Kết quả kháng khuẩn của các mẫu cao chiết ethanol 70% đối vớ i 20 chủng vi khuẩn ................................................................................................................. 64 Bảng 3.2 Kết quả xác đinḥ thành phần hóa hoc̣ ..................................................... 67 8 Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Nhân loại đã có những bước phát triển vượt bậc, tạo điều kiện chăm sóc sức khoẻ cộng đồng, phòng chống bệnh lây nhiễm, nhất là các bệnh do vi khuẩn gây ra. Tiếp nối sự thành công của một trong những phát hiện lớn nhất của y học trong trong thế kỉ 20 đó là việc tìm ra kháng sinh Penicillin vào năm 1928 của Alexander Fleming. Đến nay đã có nhiều loại thuốc kháng sinh được tạo ra. Hiện nay, ở Việt Nam, cũng như các nước trên thế giới việc sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh cũng trở nên phổ biến. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc kháng sinh chưa được quản lí chặt chẽ. “Phần lớn kháng sinh được bán mà không có đơn, 88% thành thị và 91% nông thôn. Mua kháng sinh để điều trị ho 31,6% thành thị và sốt 21,7% nông thôn. Ba loại kháng sinh được bán nhiều nhất là ampicillin/amoxicillin 29,1%, cephalexin 12,.2% và azithromycin 7,3%. Người dân thường yêu cầu được bán kháng sinh mà không có đơn 49,7% thành thị và 28,2% nông thôn.”( Khánh Linh, 2015). Đây là một thực trạng đáng báo động không chỉ ở Việt Nam mà trên toàn thế giới. Việc sử dụng thuốc kháng sinh không theo đơn của bác sĩ gây hậu quả nghiêm trọng khi bệnh nhân không chữa khỏi hoàn được bệnh mà nghiêm trọng hơn, điều này dẫn đến việc kháng thuốc kháng sinh. Hiện nay, đã xuất hiện nhiều chủng vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh. “Kháng với thuốc kháng sinh cephalosporin thế hệ ba, xảy ra ở Áo, Úc, Canada, Pháp, Nhật Bản, Na Uy, Slovenia, Nam Phi, Thụy Điển và Vương quốc Anh. Thuốc kháng sinh cephalosporin không còn hiệu nghiệm trong việc điều trị bệnh lậu trong khi mỗi ngày trên thế giới có hơn 1 triệu người nhiễm bệnh lậu. ;” ( Nguyễn Thị Hồng Mến, 2015). “Ở Việt Nam, các chủng Streptococcus pneumoniae ­ một trong những nguyên nhân thường gặp nhất gây nhiễm khuẩn hô hấp­ kháng penicillin (71.4%) và kháng erythromycin (92.1%) – có tỉ lệ phổ biến cao nhất trong số 11 nước trong mạng lưới giám sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORP) năm 2000­2001.” ( TS. Nguyễn Văn Kính, 2010). Điều này đặt ra gánh nặng về kinh tế trong điều trị bệnh khi thay thế bằng các loại 9 Đồ án tốt nghiệp kháng sinh mới đắt tiền hơn hoặc không có kháng sinh thích hợp trong điều tri bệnh. Trước thực trạng kháng thuốc kháng sinh hiện nay đã có nhiều hướng nghiên cứu được tiến hành. Trong đó, bắt nguồn từ việc phát hiện ra các hợp chất kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên. Cây thuốc từ lâu đã được sử dụng rộng rãi trong y học phương Đông và ở Việt Nam “Chúng thường là những cây cỏ rất quen thuộc, mọc hoang dại hoặc được trồng ngay trong vườn như: Hành, Tỏi, Hẹ, Kim ngân, Sâm đại hành, lá Móng tay, được nhân dân ta dùng làm thuốc tiêu độc, tiêu viêm, sát khuẩn, chữa các bệnh nhiễm khuẩn ngoài da, mụn nhọt, chốc lở, viêm họng, viêm phế quản và nhiều bệnh nhiễm khuẩn khác” (Liên Hồng,CTQ25,2016). Với khả năng kháng sinh, đặc biệt là ít gây ra các tai biến có hại như các loại thuốc kháng sinh tổng hợp trong qua trình điều trị và nhiều ưu điểm khác. Nắm được vấn đề đó, chúng tôi đã áp dụng tiến hành đề tài: “Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cao chiết ethanol 70% từ môṭ số loaị thực vật tại vườn quốc gia Bidoup - Núi Bà, Lâm Đồng”. 2. Mục tiêu nghiên cứu ­ Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cây thuốc dân gian với dung môi là ethanol 70%. ­ Xác định thành phần hoá học có trong một số loại cao chết ethanol 70% từ các cây thuốc dân gian. 3. Nội dung nghiên cứu ­ Đánh giá ảnh hưởng của dung môi ethanol 70% đến hiệu suất thu hồi từ các cây thuốc dân gian. ­ Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% của các cây thuốc dân gian ­ Xác định thành phần hoá học của cao chiết ethanol 70% của một số loại cây thuốc dân gian 10 Đồ án tốt nghiệp 4. Phạm vi nghiên cứu Tiến hành thử nghiệm và khảo sát trên một số cây thuốc dân gian. 5. Nội dung Đồ án tốt nghiệp Nội dung của Đồ án tốt nghiệp này gồm có 4 chương: ­ Chương 1: Tổng quan tài liệu ­ Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu ­ Chương 3: Kết quả và thảo luận ­ Chương 4: Kết luận và đề nghị 11 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu 1.1.1. Vai trò của cây thuốc trong đời sống Từ hơn 3000 năm trước, ông cha ta đã biết đến nguồn dược liệu phong phú, từ động vật, thực vật đến khoáng vật..trong khắp đất nước. Trong đó, phải kể đến các loại dược liệu có nguồn gốc từ thực vật. Qua thời gian, cây thuốc dần có vai trò quan trọng trong đời sống của nhân dân. Từ các gia vị như gừng, tỏi,..như một gia vị trong bếp, đã được sử dụng để trị các chứng bệnh thường gặp như hạ sốt, đầy hơi khó tiêu, hay sử dụng lá tía tô kèm cháo trắng có tác dụng giải cảm” Gừng tươi, lá tía tô cùng một số thảo dược khác rất có ích cho người bị ảnh hưởng của khí phong hàn (gió và lạnh), mắc một số bệnh mùa lạnh như: Cảm lạnh, ho, lạnh bụng, tiêu chảy, hoặc đau nhức xương khớp do phong hàn thấp.” (Huỳnh Châu,2014).“Cây vẩy ốc chữa phong thấp, kiết lị, quả chín bổ thận; cây mảnh trấu chữa u xơ tiền liệt tuyến; cây hẹ có tác dụng cầm máu, ăn thay rau thơm có tác dụng bổ dương”(Minh Hường, 2015) 1 2 3 4 Hình 1.1. Một số cây thuốc (1:Lantana sp., 2: Acorus sp., 3: Euodia sp., 4: Calamus sp) 12 Đồ án tốt nghiệp Với kinh nghiệm, kiến thức thu thập được qua nhiều thế hệ. Các bài thuốc từ cây thuốc ngày càng trở nên đa dạng và phong phú, góp phần vào kho tàng y học to lớn của dân tộc. 1.1.2. Lợi ích sử dụng cây thuốc Ngày nay, các cây thuốc có giá trị to lớn đối y học dân tộc cũng như đời sống nhân dân. Các cây thuốc thường là những cây dễ trồng, phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam. Việc chữa bệnh bằng các cây thuốc tuy chậm hơn các loại thuốc kháng sinh tổng hợp nhưng mang lại hiệu quả tốt hơn, không xuất hiện các tác dụng phụ. Bên cạnh đó, có thể sử dụng lâu dài các loại cây thuốc như một thực phẩm hỗ trợ và không gây hại cho cơ thể con người. Có thể sử dụng như nước giải khát: nước trà gừng, nước lô hội, nước lá vối “Lá vối có tác dụng kiện tỳ, giúp ăn ngon, tiêu hoá tốt. Mỗi khi ăn một bữa có nhiều thịt, mỡ, người ta thường nấu một nồi nước vối thật đặc để uống cả ngày. Chất đắng trong vối sẽ kích thích tiết nhiều dịch tiêu hóa, chất tanin bảo vệ niêm mạc ruột, còn chất tinh dầu có tính kháng khuẩn nhưng không hại vi khuẩn có ích trong ruột.” (Trần Thị Hải, 2015). 1.1.3 Tình hình sử dụng cây thuốc Việt Nam là một nước nhiệt đới, có diện tích rừng bao phủ trải dài khắp cả nước. Điều này tạo điều kiện cho thuận lợi cho các cây thuốc phát triển đa dạng và phong phú.”Ở nước ta có 3.948 loài cây thuốc thuộc 307 họ của 9 ngành thực vật bậc cao cũng như bậc thấp (kể cả nấm), cũng theo kết quả điều ta này, trong số 3.948 loài cây thuốc đã biết ở trên, phần lớn loài là được ghi nhận từ kinh nghiệm sử dụng cảu cồng đồng các dân tộc khắp các địa phương”.(Viện Dược Liệu­Bộ Y tế, 2004). “Việt Nam có hơn 12.000 loài thực vật thì có gần 4.000 loài thức vật cho công dụng làm thuốc, vùng phân bố rộng khắp cả nước, có nhiều loài dược liệu được xếp vào loài quý và hiếm trên thế giới, như: Sâm ngọc linh, Sâm vũ diệp, Tam thất hoang, Bách hợp, Thông đỏ, Vàng đắng, Hoàng liên ô rô, Hoàng liên gai, Thanh thiên quỳ, Ba gạc Vĩnh Phú” (Nguồn: Minh Tuấn, 2014.). Tuy nhiên việc chặt phá rừng bừa bãi và khai thác tràn lan đang làm cho nhiều loại cây thuốc tuyệt chủng.” Việc khai thác dược liệu quá mức mà không đi đôi với việc tái tạo, bảo tồn 13 Đồ án tốt nghiệp dược liệu đã dẫn đến số lượng loài cây dược liệu có khả năng khai thác tự nhiên còn rất ít (trên cả nước hiện chỉ còn khoảng 206 loài cây dược liệu có giá trị có thể khai thác tự nhiên), nhiều loài cây dược liệu quý hiếm trong nước đang đứng trước nguy cơ cạn kiệt”. (Minh Tuấn 2014). Để không lãng phí nguồn tài nguyên quý báu đó, chúng ta cần phải nhanh chóng có những biện pháp nghiên cứu để bảo tồn và phát triển giá trị của các cây thuốc. Đưa cây thuốc, kinh nghiệm dân gian vào nghiên cứu, áp dụng với khoa học công nghệ hiện đại để phục vụ sức khoẻ và đời sống con người. 1.2. Thành phần hóa học của thực vật 1.2.1 Carbohydrate 1.2.1.1 Khái niệm Carbohydrate là một phân tử sinh học được tạo nên từ các nguyên tố: carbon (C), hydro (H) và Oxy (O), thường tỷ lệ nguyên tử Hydro­oxi trong carbonhydrate là 2:1 Công thức cấu tạo chung Cm(H2O)n, thường m = n và là nhóm phổ biến nhất trong bốn nhóm phân tử sinh học chính. Ở thực vật carbohydrate tập trung chủ yếu ở thành tế bào, mô nâng đỡ và mô dự trữ. Một số trường hợp ngoại lệ tồn tại, ví dụ: deoxyribose, một thành phần đường DNA, có công thức C5H10O4. (John M Coulter, C. R. Barrnes, H. C. Cowles, 1930). Carbohydrate có thể chia thành 4 nhóm: ­ Monosaccharide: glucose, fructose ­ Disaccharide: saccharose, lactose, maltose ­ Oligosaccharide: rafinose, kestose, stachyose ­ Polysaccharide: tinh bột, cellulose 1.2.1.2 Tính chất Chúng có đặc tính chung là dễ hoà tan trong nước, đồng hoá và sử dụng nhanh để tạo glycogen. Các carbohydrate đơn giản đều có vị ngọt. Ở thực vật, carbohydrate chiếm khoảng 75% khối lượng, nằm trong hầu hết các bộ phận như: củ, quả, lá, thân, cành. 14 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của các loại Carbonhydrate 1.2.1.3 Vai trò ­ Cung cấp năng lượng cho tế bào và cơ thể thực vật ­ Vai trò cấu trúc, tạo hình (Cellulose,) ­ Bảo vệ (Mucopolysaccharide) ­ Chống tạo thể cetone (mang tính acid gây độc cho cơ thể). 1.2.2 Amino acid 1.2.2.1 Khái niệm Amino acid là một phân tử chứa cả nhóm amin và carboxylate. Công thức chung: (H2N)x – R – (COOH)y. Hình 1.3. Alanine 15 Đồ án tốt nghiệp 1.2.2.2 Tính chất Các amino acid là những chất rắn ở dạng tinh thể không màu, vị hơi ngọt, dễ tan trong nước (do tồn tại kiểu muối nội phân tử). Nhiệt độ nóng chảy khoảng từ 200 – 3000C. 1.2.2.3 Vai trò ­ Amino acid thiên nhiên (hầu hết là α­amino acid) là cơ sở để kiến tạo nên các loại protein của cơ thể sống. ­ Thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp trao đổi chất ở thực vật. ­ Tăng hiệu quả của thuốc bảo vệ thực vật. ­ Tăng khả năng ra hoa và quả (Trumbo P, 2013). 1.2.3 Alkaloid 1.2.3.1 Khái niệm Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được cung cấp bởi amino acid, đa số có nhân dị vòng. Alkaloid thường được tìm thấy trong thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong cơ thể đông vật. Một số dược liệu chứa akaloid: cà độc dược, cà phê, chè, trinh nữ hoàng cung. Hình 1.4. Epherdin và Hyoscyamin 1.2.3.2 Tính chất Đa số các alkaloid đều có tính base yếu, song cũng có chất có tác dụng như base mạnh có khả năng làm xanh giấy quỳ đỏ như nicotin, cũng có chất tính base rất 16 Đồ án tốt nghiệp yếu như caffein, piperin vài trường hợp ngoại lệ có những alkaloid không có phản ứng kiềm như colchicin, ricinin, theobromine và cá biệt cũng có chất có phản ứng acid yếu như arecaidin, guvacin. Do có tính base yếu nên có thể giải phóng alkaloid ra khỏi muối của nó bằng những kiềm trung bình và mạnh như: NH4OH, MgO, cacbonat kiềm, NaOH.. Khi định lượng với acid, alkaloid cho các muối tương ứng. Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pt..) tạo ra muối phức. 1.2.3.3 Vai trò ­ Alkaloid có tác dụng diệt khuẩn. ­ Tác động lên hệ thần kinh trung ương: morphin, codein, strychnin, cafein. ­ Hạ huyết áp: ajmalin, q...iệm Kết quả: Xuất hiện màu xanh trong lớp acid acetic. 2.3.8.5 Anthaquinone glycosides (thử nghiệm Bontrager) ­ Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm ­ Thêm 2 ml H2SO4 loãng và đun sôi ­ Tiến hành lọc nóng và để nguội dịch lọc. ­ Thêm 3 ml benzene và lắc đều rồi để yên. ­ Tách lấy lớp benzene ­ Thêm 2 ml ammonia và quan sát màu trong lớp ammonia Kết quả: Xuất hiện màu đỏ. 2.3.8.6 Flavonoid  Alkaline ­ Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm rồi cho vào vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng. Thực hiện với đối chứng là mẫu và nước cất để so sánh. ­ Thêm vài giọt HCl loãng  mất màu chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid Kết quả: Xuất hiện màu vàng khi bổ sung NaOH và mất màu khi cho HCl.  Shinoda ­ Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm ­ Cho dịch mẫu bột Magnesium và một vài giọt HCl đậm đặc vào ống nghiệm. ­ Bổ sung 5 ml cồn 95% Kết quả: Nếu mẫu có màu cam, hồng, đỏ đến tím chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid.  Ferric chloride 43 Đồ án tốt nghiệp ­ Lấy 2 ml cho vào ống nghiệm ­ Thêm vài giọt thuốc thử Ferric chloride 10% Kết quả: Xuất hiện màu xanh hoặc tím 2.3.8.7 Phenolic  Lead acetate ­ Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm ­ Cho 1,5 ml Chì acetate 10% Kết quả: Xuất hiện kết tủa trắng.  Gelatin ­ Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm ­ Thêm một vài gelatin 1% Kết quả: Xuất hiện kết tủa trắng. 2.3.8.8 Tannin  Ferric chloride ­ Hút 2 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%. ­ Cho vào 4 giọt ferric chloride 10%. Kết quả: Xuất hiện màu xanh.  Lead acetate ­ Hút 2 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%. ­ Cho vào 4 giọt Chì acetate Kết quả: Xuất hiện kết tủa màu vàng. 2.3.8.9 Steroid  Salkowski ­ Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm ­ Thêm 2 ml chloroform và nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc ­ Lắc mạnh rồi để yên cho tách thành 2 lớp ­ Đọc kết quả ở mặt phân cách Kết quả: ­ Xuất hiện màu đỏ ở lớp dưới: sterol 44 Đồ án tốt nghiệp ­ Hình thành màu vàng ở lớp dưới: triterpenoid  Libermann Burchard ­ Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm ­ Thêm 2 ml acetic anhydride, đun sôi và làm nguội nhanh ­ Nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm. Kết quả: ­ Xuất hiện vòng màu đỏ ở mặt phân cách: steroid ­ Hình thành vòng màu nâu đỏ đậm: triterpenoid 2.3.8.10 Amino acid ­ Thuốc thử Ninhydrin ­ 1 ml dịch chiết, sau đó cho vào một vài giọt thuốc thử Ninhydrin. ­ Đun sôi cách thủy trong 5 phút Kết quả: Xuất hiện màu tím. 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu Sừ dụng phần mềm Statgraphics Centurion XV version 15.1.02 và phần mềm Microsoft Excel 2007 để xử lý số liệu 45 Đồ án tốt nghiệp 2.4 Bố trí thí nghiệm Nguồn mẫu Ngâm trong dung môi ethanol 70% (tỉ lệ 1:20 w/v) Chiết và cô cao Cao chiết ethanol 70% Xác định thành phần hoá học Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Tổng hợp kết quả Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 46 Đồ án tốt nghiệp 1. 2.4.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết ethanol 70% của các mẫu cây thuốc. Mẫu cây Phơi khô, xay nhuyễn Lantana Acorus sp. Euodia Streptocaulon Calamus Xidi Klung sp. sp. sp. sp. Ngâm trong ethanol 70% ( tỉ lệ 1:20 w/v) trong 24 giờ Lọc chân không Bã Cô cách thuỷ 70OC Thu cao Cao chiết ethanol 70% Hình 2.3. Quy trình khảo sát ảnh hưởng của dung môi ethanol 70% đến hiệu suất tách chiết cao của các mẫu cây thuốc khác nhau 47 Đồ án tốt nghiệp  Tiến hành: Mẫu cây sau khi rửa sạch sẽ được phơi khô cho đến khi khối lượng không đổi, sau đó đem ra say nhuyễn thành bột. Đem ngâm bột trong dung môi ethanol 70%, đem lắc đều hỗn hợp trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Lọc hỗn hợp bằng phễu lọc chân không, bã thu được sẽ được ngâm tiếp tục cho đến khi dịch trong, khoảng 3 lần. Phần dung dịch thu được sẽ được cô cách thuỷ ở nhiệt độ 70O để đuổi hết dung môi và không làm mất hoạt tính của mẫu. Sau khi dung dịch cô cạn hoàn toàn sẽ được cao chiết ethanol. Hiệu suất tách chiết cao: % = đượ × 100% ẫ ạ ộ đượ(g):khối lượng mẫu cao thu được sau khi cô cách thuỷ ẫ ạ ộ(g): khối lượng bột mẫu ban đầu 2. 3. 48 Đồ án tốt nghiệp 2.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết ethanol Chủng vi khuẩn Tăng sinh trong TSB và TSB+ NaCl 1,5% Lắc 150v/p, nhiệt độ phòng, 18­24 giờ Đo OD 600nm Môi trường chứa Pha loãng vi sinh vật nồng độ 106 Nước muối TSA/TSA+ NaCl 1,5% cfu/ml sinh lý Hút 100µl vào đĩa petri chứa Đổ đĩa TSA/TSA+ NaCl 1,5%, cấy trang Cao chiết Đục lỗ (d=6mm) trên môi trường Dịch cao DMSO 1% Nhỏ 100µl dịch cao chiết và giếng trên môi trường Ủ 37OC, 24 giờ Đo đường kính vòng kháng khuẩn Hình 2.4. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn hoạt tính kháng khuẩn 49 Đồ án tốt nghiệp  Tiến hành Chủng vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường TSB và TSB + NaCl 1,5%, ủ ở nhiệt độ phòng 18­24 giờ, lắc 150 vòng/phút. Dịch vi sinh vật sau khi tăng sinh được đo ở OD ở bước sóng 600nm để tiến hành pha loãng ở mật độ 106 cfu/ml. Sau đó cấy trang trên đĩa petri chứa môi trường TSA vô trùng. Đục lỗ trên đĩa đã cấy trang. Hút 100µl dịch cao vào từng giếng thạch. Để yên trong 2 giờ, đem đi ủ ở nhiệt độ 37OC trong 24 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo vòng kháng khuẩn.  Đọc kết quả Đo vòng kháng khuẩn của mẫu cao đối với từng chủng vi sinh vật. So sánh vòng kháng khuẩn của mẫu cao và kháng sinh. Nếu giếng nào có vòng kháng khuẩn xung quanh chứng tỏ cao có kháng khuẩn chủng vi khuẩn đó. Ta sử dụng chủng vi khuẩn này tiếp tục thử nghiệm xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC). 2.4.3 Thí nghiệm 4: Xác định thành phần hóa học Mẫu cao chiết Ethanol Ngâm trong H2SO4 10% Ngâm trong DMSO 1% Lọc Lọc Alkaloid Carbohydrate Saponnin, Flavonoid, Steroid, cardiac phenolic amino acid glycoside, compound, althraquinone tannin Hình 2.6. Quy trình xác định thành phần hóa học 50 Đồ án tốt nghiệp Đối với chỉ tiêu alkaloid: mẫu cao được ngâm trong H2SO4 10% trong khoảng 30 phút đến 60 phút. Sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc. Thu phần dịch trong để tiến hành thử nghiệm. Đối với các chỉ tiêu còn lại: mẫu cao được pha trong DMSO cho đến khi tan hoàn toàn. Sau đó, tiến hành pha loãng và lọc qua giấy lọc để thu dịch trong để tiến hành thử nghiệm. Tiến hành các thử nghiệm để xác định thành phần hoá học trong cây thuốc, gồm: ­ Carbohydrate: thử nghiệm Molish, thử nghiệm Fehling, thử nghiệm Barfoed. ­ Alkaloid: thử nghiệm Mayer, Dragendorff, thử nghiệm Hager, thử nghiệm Wagner. ­ Saponin: thử nghiệm Foam. ­ Cardiac glycosides: thử nghiệm Legal, thử nghiệm Keller Killiani. ­ Anthaquinone glycosides: thử nghiệm Bontranger. ­ Flaconoid thử nghiệm Alkaline, thử nghiệm Shinoda, thử nghiệm Ferric chloride. ­ Phenlic: thử nghiệm Lead acetate, thử nghiệm Gelatin. ­ Tannin: thử nghiệm Ferric chloride, thử nghiệm Lead acetate. ­ Steoid: thử nghiệm Salkowski, thử nghiệm Libermann Burchard. ­ Amino acid: thử nghiệm Ninhydrin. 51 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết Ethanol 70% từ các mẫu cây. Một trong những tiêu chí đánh giá hiệu quả của dung môi đến việc tách chiết cao là hiệu suất thu hồi cao. Sử dụng dung môi có hiệu suất thu hồi cao kết hợp với hoạt tính sinh học tốt sẽ là lựa chọn tối ưu. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao của các cây thuốc ở các dung môi ethanol 70% được trình bày ở hình 3.1 25 20 15 10 Hiệu suất thu hồi cao % hồicao suất thu Hiệu 5 0 Latana sp Acorus sp Euodia sp Calamus sp Xidi Klung Streptocaulon sp Mẫu cây Hình 3.1. Hiệu xuất tách chiết của ethanol 70% với các mẫu cây thuốc Dựa vào kết quả hình 3.1 cho thấy mỗi loại cây khác nhau khi tách chiết cao bằng dung môi ethanol 70% sẽ thu được lượng cao khác nhau, trong đó hiệu suất thu hồi cao chiết ethanol 70% từ cây Acorus sp là cao nhất với hiệu suất lên đến 22%, hiệu suất thu hồi cao chiết ethanol 70% từ cây Euodia thấp nhất chỉ đạt 9,5%. Ethanol 70% là dung môi phân cực vạn năng có khả năng hoà tan rất nhiều các hợp chất có hoạt tính sinh học như glycosides, alkaloids, saponins hay các chất flavonoids, tannin..Đồng thời ethanol 70% cũng là dung môi có khả năng bay hơi nhanh nên trong quá trình cô mẫu cũng giúp cho quá trình thu hồi cao nhanh hơn. Hơn nữa, việc sử dụng dung môi phân cực trong quá trình tách chiết an toàn hơn so với các dung môi không phân cực (Ngô Văn Thu, 2011). 52 Đồ án tốt nghiệp Kết quả này cho thấy rằng, cao chiết ethanol 70% từ cây Acorus sp chứa nhiều hợp chất nhất. Tuy nhiên, những hợp chất này có chứa hoạt tính sinh học hay không thì cần phải tiến hành những thí nghiệm tiếp theo để có thể đánh giá chính xác. Một trong những tiêu chí khảo sát là hoạt tính kháng khuẩn. 3.2 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% từ các mẫu cây khảo sát Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn là một trong các tiêu chí đánh giá hoạt tính sinh học của các mẫu cây khảo sát cũng như đánh giá hiệu quả của dung môi đến việc tách chiết cao từ các mẫu cây này. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu cao chiết ethanol 70% trên các nhóm vi khuẩn Escherichia coli, Listeria spp., Salmonella spp., Shigella spp., Vibriospp. và các chủng vi sinh vật gây bệnh khác. 3.2.1 Đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli Sau khi tiến hành đánh hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu cao chiết ethanol 70% từ các mẫu cây trên nhóm vi khuẩn Escherichia coli, kết quả được trình bày ở hình 3.3 35 a 30 25 20 ab a a 15 b b a c b b b khuẩn khuẩn (mm) 10 c c 5 Đường kính trung bình vòng kháng 0 Lantana sp Acorus sp Euodia sp Streptocaulon Calamus sp Xidi Klung Ciproflocaxin Mẫu cây sp E.coli O157:H7 E.coli 0208 E.coli ETEC Hình 3.2. Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm Escherichia coli 53 Đồ án tốt nghiệp Dựa vào kết quả hình 3.3 nhận thấy rằng 3/6 mẫu cao chiết có khả năng ức chế 4 chủng vi khuẩn E.coli trong đó mẫu cao chiết Lantana sp chỉ ức chế 1/4 chủng vi khuẩn là E.coli O157:H7, nhưng có đường kính trung bình vòng kháng khuẩn lớn nhất là 15mm. Mẫu cao chiết Xidi Klung có khả năng ức chế cả 4/4 chủng vi khuẩn, đường kính trung bình vòng kháng khuẩn 10 – 12.8mm. Mẫu cao chiết Calamus sp khả năng ức chế 3/4 chủng vi khuẩn gồm là E.coli O157:H7, E.coli và ETEC đường kính trung bình vòng kháng khuẩn 8.8 – 9.5mm và mẫu cao chiết Euodia sp khả năng ức chế 2/4 chủng là E.coli O157:H7, E.coli 0208 có đường bình trung bình vòng kháng khuẩn là 8.6mm và 12.,3mm. Kết quả trên cho thấy, mẫu cao chiết Lantana sp có đường kính trung bình vòng kháng khuẩn lớn nhất là 15mm cao hơn so với đối chứng dương là ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Mẫu cao chiết Xidi Klung thể hiện khả năng ức chế với cả 4/4 chủng vi khuẩn và có đường kính trung bình vòng kháng khuẩn lớn nhất thể hiện đối với chủng E.coli O157:H7 là 12,8mm nhưng vẫn thấp hơn so với đối chứng dương là Ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Từ kết quả nhận thấy rằng mẫu cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung thể hiện khả năng ức chế đối với 4/4 chủng vi khuẩn trong nhóm E.coli, cho thấy nhóm E.coli khảo sát nhạy cảm với mẫu cao chiết ethanol 70% của cây Xidi Klung. Trong nghiên cứu của Mosafa và cộng tác viên (2013) về hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% từ lá cây Salvia officinalis ở nồng độ 100mg/ml trên chủng E.coli là 6,6mm, đối với cao chiết ethanol 70% của cây Xidi Klung trên chủng E.coli là 10,3mm. 3.2.2 Đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu cao chiết ethanol 70% từ các mẫu cây trên nhóm vi khuẩn Listeria spp. gồm 2 chủng vi khuẩn là L.innocua và L.monocytogenes được thể hiện ở hình 3.4 54 Đồ án tốt nghiệp 14.0 a a a 12.0 b 10.0 8.0 ung bình ung bình vòng kháng uẩn (mm) 6.0 kh 4.0 2.0 Đường kính Đườngkính tr 0.0 Mẫu cây Lantana sp Acorus sp Euodia sp Streptocaulon Calamus sp Xidi Klung Ciproflocaxin sp L.innocua L.monocytogenes Hình 3.3. Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm Listeria spp. Từ kết quả trên hình 3.4, nhận thấy rằng mẫu cao chiết ethanol 70% từ mẫu cây Xidi Klung có khả năng ức chế đối với cả 2 chủng vi khuẩn với đường kính trung bình vòng kháng khuẩn lần lượt là 9.8mm với vi khuẩn L.innocua và 11.6mm đối với vi khuẩn L.monocytogenes. Các mẫu cao chiết còn lại không xuất hiện khả năng ức chế đối với 2 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Listeria spp. trong khảo sát. Kết quả này cho thấy, mẫu cao chiết Xidi Klung có hoạt tính kháng khuẩn tốt đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp, đây là nhóm vi khuẩn gây bệnh rất nguy hiểm cho con người qua thực phẩm, đặc biệt là phụ nữ mang thai, trẻ em. Khả năng ức chế của mẫu cao chiết Xidi Klung đối với 2 chủng thuộc nhóm Listeria thấp hơn so với đối chứng dương là Ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). 3.2.3 Đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu cao chiết ethanol 70% từ các mẫu cây trên nhóm vi khuẩn Salmonella spp. được trình bày ở hình 3.5 55 Đồ án tốt nghiệp 16 a 14 a a b a 12 a a a a b c a 10 c 8 ng bình vòngkháng ẩn (mm) 6 khu 4 2 Đường kính Đường kính tru 0 Mẫu cây Lantana sp Acorus sp Euodia sp Streptocaulon Calamus sp Xidi Klung Ciproflocaxin sp S.dublin S.enteritidis S.typhi S.typhimurium Hình 3.4. Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm Salmonella spp. Kết quả thu được trên hình 3.5 cho thấy rằng 4/6 mẫu cao chiết có hoạt tính đối kháng với chủng vi khuẩn Salmonella spp. Mẫu cao chiết Xidi Klung có khả năng ức chế với cả 4/4 chủng vi khuẩn tiến hành khảo sát với đường kính trung bình vòng kháng khuẩn thay đổi từ 9.8mm đến 11.5mm. Các mẫu cao chiết từ các cây Calamus sp, Euodia sp, Lantana sp đều thể hiện khả năng ức chế với 1/4 chủng vi khuẩn là S.typhimirium. Đường kính trung bình vòng kháng khuẩn của cả 4 mẫu cao chiết đối với chủng S.typhimurium tương đương với với đối chứng dương là Ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Các mẫu cao chiết Acorus sp và Stretocaulon sp không thể hiện khả năng ức chế đối với nhóm vi khuẩn Salmonella. Trong các mẫu cao chiết tiến hành khảo sát trên vi khuẩn Salmonella spp. , chỉ có mẫu cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung có khả năng ức chế với cả 4/4 chủng vi khuẩn trong nhóm Salmonella spp. Điều này cho thấy nhóm vi khuẩn Salmonella spp. khảo sát nhạy cảm với mẫu cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung. Nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ cây Khaya senegalensis với nồng độ 50mg/ml( Desr. A. Juss) của Ugoh SC và cộng cộng sự 56 Đồ án tốt nghiệp (2014) trên chủng S.typhii có đường kính vòng kháng khuẩn 14mm, trong khi đó mẫu cao chiết ethanol từ cây Xidi Klung ở nồng độ 100 mg/ml có kết quả vòng kháng khuẩn trung bình đối chủng vi khuẩn S.typhii là 10,3mm. 3.2.4 Đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu cao chiết ethanol 70% từ các mẫu cây trên nhóm vi khuẩn Shigella spp. gồm các chủng vi khuẩn S.boydii, S.flexneri, S.sonnei được thể hiện ở hình 3.6 40 35 a 30 25 20 a 15 b khuẩn khuẩn (mm) a c b 10 5 Đưuòng kính trung bình vòng kháng 0 Lantana sp Acorus sp Euodia sp Streptocaulon Calamus sp Xidi Klung Ciproflocaxin Mẫu cây sp S.boydii S.flexneri S.sonnei Hình 3.5. Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm Shigella spp. Kết quả trên hình 3.6 cho thấy rằng 4/6 mẫu cao chiết không có khả năng ức chế nhóm vi khuẩn Shigella spp. là từ các mẫu cây Lantana sp, Acorus sp, Stretocaulon sp và Calamus sp. Cao chiết từ mẫu cây Xidi Klung xuất hiện vòng kháng khuẩn với cả 3/3 chủng vi khuẩn tiến hành khảo sát với đường kính trung bình vòng kháng khuẩn thay đổi từ 10.5mm đến 11.6mm. Mẫu cao chiết Euodia sp xuất hiện vòng kháng khuẩn với 1/3 chủng vi khuẩn là chủng S. flexneri với đường kính trung bình vòng kháng khuẩn là 11mm. Kết quả trên cho thấy, đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp., mẫu đối chứng dương Ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml không thể hiện khả năng ức chế đối với 57 Đồ án tốt nghiệp chủng vi khuẩn S.boydii. Trong khi đó, mẫu cây Xidi Klung vẫn có khả năng ức chế với chủng S.boydii với đường kính trung bình vòng kháng là 11,1mm. Vi khuẩn S.boydii là chủng vi khuẩn nguy hiểm khi chỉ cần 100 tế bào vi khuẩn cũng có thể gây các bệnh như tiêu chảy, tổn thương đại tràng, buồn nôn..Khả năng ức chế 3/3 chủng thuộc nhóm vi khuẩn Shigella spp. đã cho thấy nhóm vi khuẩn Shigella spp. nhạy cảm đối với mẫu cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung. Nghiên cứu của M.Mashiar Rahman (2009) về hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ là cây Moringa oleifera lên chủng vi khuẩn S.sonnei có đường kính vòng kháng khuẩn là 21,5mm, với cùng chủng vi khuẩn ở mẫu cao chiết ethanol 70% từ mẫu cây Xidi Klung có đường kính kháng khuẩn trung bình 10,5mm. 3.2.5 Đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu cao chiết ethanol 70% từ các mẫu cây trên nhóm vi khuẩn Vibrio spp. được trình bày ở hình 3.5 20 a 18 a 16 14 a a 12 bc b b a a c b 10 b (mm) 8 6 4 2 Đường kính trung bình vòng kháng khuẩn khuẩn kháng vòng bình kính trung Đường 0 Mẫu cây Lantana sp Acorus sp Euodia sp Streptocaulon Calamus sp Xidi Klung Ciproflocaxin sp V.alginolyticus V.cholerae V.harveyi V.parahaemolyticus Hình 3.6. Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm Vibrio spp. 58 Đồ án tốt nghiệp Kết quả thu được trên hình 3.6 cho thấy rằng 3/6 các mẫu cao chiết từ các cây Acorus sp, Euodia sp, Stretocaulon sp không có khả năng ức chế vi khuẩn. Trong các mẫu cao chiết có khả năng ức chế chủng vi khuẩn Vibrio spp., nổi bật nhất là mẫu cao chiết Xidi Klung có khả năng ức chế cả 4/4 chủng vi khuẩn với đường kính trung bình vòng kháng khuẩn có sự thay đổi từ 10­13mm. Mẫu cao chiết Camalus sp xuất hiện vòng kháng khuẩn 1/4 chủng vi khuẩn là V.harveyi với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là 11mm và mẫu cây Lantana sp có vòng kháng khuẩn 3/4 chủng vi khuẩn là V.alginolytius, V.harveyi, V.chorlerae đường kính kháng trung bình vòng kháng lần lượt là 9.6mm, 10.8mm, 9.5mm . Mẫu cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung là mẫu cao chiết duy nhất có khả ức chế chủng vi khuẩn V.parahaemolytius trong 6 cây với đường kính là 11,3mm. Kết quả này tương đương với kết quả của đối chứng dương là Ciprofloxacin ở nồng độ 8µg/ml một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Với khả năng ức chế 4/4 chủng vi khuẩn Vibio spp. đã cho thấy, chủng vi khuẩn Vibro spp. nhạy cảm với của mẫu cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung hơn các loại cao chiết của các loại cây khác. 3.2.6 Nhóm vi sinh vật gây bệnh khác Kết quả khảo sát các chủng vi sinh vật gây bệnh khác thể hiện ở bảng 3.6 14 a a a b a a 12 10 8 6 4 kháng kháng khuẩn (mm) 2 ường kính trung bình vòng 0 Đ Mẫu cây Lantana sp Acorus sp Euodia sp Streptocaulon Calamus sp Xidi Klung Ciproflocaxin sp P. aeruginosa S.aureus E.feacalis Hình 3.7. Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm vi sinh vậy gây bệnh 59 Đồ án tốt nghiệp Dựa vào kết quả hình 3.6 cho thấy 5/6 mẫu cao chiết không có hoạt tính ức chế đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh P.aeruginosa, S.aureus, E.feacadis được tách chiết từ các cây Lantana sp, Acorus sp, Euodia sp, Stretocaulon sp và Camalus sp. Mẫu cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung thể hiện khả năng ức chế các chủng vi khuẩn với đường kính trung bình vòng kháng khuẩn từ 11,2mm đến 11,6 mm. Kết quả này cho thấy hoạt tính đối kháng của mẫu cao chiết ethanol 70% từ mẫu cây Xidi Klung là rất tốt. So sánh với kết quả với kết quả thu được từ cao Hà Thủ Ô nồng độ 64µg/l sử dụng dung môi methanol, có hoạt tính đối kháng với chủng vi khuẩn S.aureus và tạo vòng kháng khuẩn là 24,0mm (Đài Thị Xuân Trang, Lâm Hồng Bảo Ngọc và Võ Thị Tú Anh, 2015) so với đường kính trung bình vòng kháng khuẩn đối với cùng chủng S.aureus của mẫu cao chiết từ cây Xidi Klung là 11,6mm. Trong nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ cây Aristolochias sp ở nồng độ 100mg/ml của B.Venkatadri và các cộng sự (2015) có đường kính vòng kháng khuẩn đối với chủng vi khuẩn P.aeruginosa là 17mm và đối với chủng vi khuẩn S.aureus là 16mm. Đối với mẫu cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung có đường kính vòng kháng khuẩn trung bình lần lượt chủng vi khuẩn P.aeruginosa và chủng vi khuẩn S.aureus là 11,3mm và 11,6mm. Sau khi tiến hành các thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu cao chiết ethanol 70% từ các mẫu cây, kết quả được tổng hợp trình bày ở bảng sau 60 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1 Kết quả kháng khuẩn của các mẫu cao chiết ethanol 70% đối với 20 chủng vi sinh 61 Đồ án tốt nghiệp Kết quả từ bảng 3.1 cho thấy, mẫu cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung xuất hiện hoạt tính đối kháng 20/20 chủng vi khuẩn khảo sát,với đường kính trung bình vòng kháng khuẩn từ 9.8 – 12.8mm. Mẫu cao chiết từ cây Euodia sp xuất hiện hoạt tính đối kháng 7/20 chủng vi khuẩn khảo sát, đường kính trung bình vòng kháng khuẩn từ 8.7 – 12.3mm. Mẫu cao chiết ethanol 70% từ cây Calamus sp xuất hiện hoạt tính đối kháng với 4/20 chủng vi khuẩn khảo sát, đường kính trung bình vòng kháng khuẩn 8.8 – 9.7mm. Mẫu cao chiết ethanol 70% từ cây Lantana sp xuất hiện hoạt tính đối kháng với 3/20, đường kính trung bình vòng kháng khuẩn 6.2 – 10.5mm. Mẫu cao chiết ethanol 70% từ cây Acorus sp xuất hiện hoạt tính đối kháng 2/20 mẫu cây, đường kính trung bình vòng kháng khuẩn 9.3 – 11mm. Mẫu cây Streptocaulon sp không xuẩ hiện vòng kháng đối với bất kì chủng vi khuẩn khảo sát nào. Từ kết quả kháng khuẩn cho thấy, mẫu cao chiết ethanol 70% từ cây Xidi Klung có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất trong các mẫu cây tiến hành khảo sát. So sánh với dịch cao chiết từ cây Mò hoa trắng nồng độ 100mg/ml sử dụng dung môi tách chiết là ethanol 70% cho kết quả vòng kháng với chủng E.coli là 10mm.(Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Thanh Hải, 2014). Với chủng vi sinh vật là E.coli các mẫu cao chiết ethanol 70% khảo sát có kết quả kháng khuẩn tương đương như mẫu cây Camalus sp 9.7mm hay mẫu cây Xidi Klung 10mm. Từ kết quả đánh gia hoạt tính kháng khuẩn, các mẫu cao chiết từ dung môi ethanol 70% cho khả năng xuất hiện hoạt tính kháng khuẩn cao tiêu biểu như mẫu cao chiết từ cây Xidi Klung cho kết quả kháng khuẩn tốt nhất, một số mẫu cao chiết có kết quả ít hơn từ Camalus sp, Lantana sp, Euodia sp hay Acorus sp. Đặc biệt với mẫu cao chiết từ Streptocaulon sp hoàn toàn không xuất hiện hoạt tính đối kháng với các chủng vi khuẩn tiến hành khảo sát. Với kết quả như vậy, để có được đánh giá khách quan nhất về hoạt tính sinh học của cao chiết từ dung môi ethanol 70% và để chuẩn bị cho các công tác nghiên cứu sau này, cần tiến hành xác đinḥ thành phần hóa hoc̣ của các mẫu cao chiết. 62 Đồ án tốt nghiệp 3.3 Kết quả xác định thành phần hoá học Sau khi tiến hành các thử nghiệm đánh giá về hoạt tính kháng khuẩn, sẽ tiếp tục tiến hành khảo sát để xác định các thành phần hoá học của các mẫu cao chiết từ các mẫu cây. Dựa vào bảng kết quả phân tích thành phần hoá học của các mẫu cao chiết cho thấy sư ̣ khác nhau về thành phần hóa hoc̣ giữa các mẫu cao chiết. Dung môi ethanol 70% có khả năng tách chiết nhiều hợp chất chứa trong các mẫu cây. Các hợp chất thông thường như nhóm carbohydrate qua các thử nghiệm Molisch, Fehling và Barfoed đều cho kết quả dương tính. Một số mẫu cây cho kết quả tốt như Streptocaulon sp, Aucorus sp.. Trong thử nghiệm alkaloid, các mẫu cây Streptocaulon sp, Aucorus sp, Camalus sp cho kết quả âm tính thì ở mẫu cây Xidi Klung, Euodia sp, Lantana sp lại cho kết quả dương tính. Ở thực vật, hoạt tính kháng khuẩn chủ yếu do các thành phần alkaloid, flavonoid, hợp chất phenolic, tannin.. Trong 6 mẫu cao chiết ethanol 70% từ mẫu cây tiến hành khảo sát, mẫu cao chiết Xidi Klung cho kết quả dương tính nhiều nhất, kết quả này cho thấy mẫu cây Xidi Klung có chứa nhiều các hoạt chất khác nhau, bao gồm cả các hoạt chất kháng khuẩn như tannin hay flavonoidĐiều này giải thích cho khả năng kháng khuẩn tốt của cây. Theo nghiên cứu của Cowan (1999), xét cụ thể ở hợp chất alkaloids có thể thấy tồn tại dẫn chất berberine và dẫn chất piperrine có chức năng xen vào thành tế bào hoặc DNA của vi sinh vật phá hủy và tiêu diệt chúng. Nhiều nghiên cứu cho thấy, các flavonoid như swertifrancheside, glycyrrhizin có khả năng ức chế vi khuẩn. Trong 6 mẫu cây thuốc tiến hành khảo sát, mẫu cây Xidi Klung có hoạt tính sinh học tốt, đặc biệt là hoạt tính kháng khuẩn. Mẫu cao chiết ethanol 70% của mẫu cây Xidi Klung có khả năng kháng 20/20 chủng vi khuẩn khảo sát với hoạt tính tốt như các chủng vi khuẩn nguy hiểm như Escherichia coli, Listeria spp, Salmonella spp, so sánh với cây có hoạt tính kháng khuẩn xếp thứ 2 là Euodia sp chỉ có 6/20 chủng có xuất hiện khả năng kháng khuẩn. Những thử nghiệm cơ bản về hoạt tính sinh học của cây Xidi Klung cũng như các cây Euodia sp, Calamus sp, Aucorus sp, 63 Đồ án tốt nghiệp Lantana sp, Streptocaulon sp sẽ tạo tiền đề cho các nghiên cứu về sau trên các mẫu cây này. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.3. 64 Đồ án tốt nghiệp 65 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2 Kết quả xác đinḥ thành phần hóa hoc̣ Sapo- Cardiac Anthra Phenolic Thử nghiệm Carbohydrate Alkaloid Flavonoid Tannin Steroid AA nin glycosides quinone compound Drage Alka Lead Mo­ Feh­ Bene­ Ma­ Ha­ Wag­ Foam Leg Bon­ Shi­ Ferric Gela­ Ferric Lead Salkow­ Liber­ Nin­ Mẫu n­ Keller ­ aceat lisch ling dict yer ger ner test al trager noda clorid tin clorid acetate ski mann hydrin droff line e Xidi Klung + ++ ++ + + + + + + + ­ + + + ++ + + ++ + + ­ Euodia sp ++ + + + + + + + + + ­ + ­ + + ­ + + + + ­ Aucorus sp ++ ++ ++ ­ ­ ­ ­ + + + ­ + + + + ­ + + + + ­ Lantana sp ++ ++ ++ + + + + + + + ­ + + + + ­ + + + + ­ Calamus sp ++ + + ­ ­ ­ ­ + + + ­ + ­ + +++ + + + + + ­ Streptocaulon +++ ++ ++ ­ ­ ­ ­ + + + ­ + + + + ­ + + + + + sp Chú thích: +++: rất nhiều, ++: nhiều, +: dương tính; ­: âm tính. 64 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận Khi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của dung môi ethanol 70% đến hiếu xuất tách chiết cao từ 6 mẫu cây cho kết quả: mẫu cây thuốc có hiệu xuất thu hồi thấp nhất là Eudia sp 9.5%, tiếp đến là các cây Lantana sp 15.5%, cây Xidi Klung 17.5%, cây Streptocaulon sp 17.5%, Calamus sp 18% và cao nhất là Acorus sp 22%. Kết quả thử nghiệm kháng khuẩn của 6 mẫu cây : mẫu cây Xidi Klung xuất hiện vòng kháng khuẩn 20/20 chủng vi khuẩn khảo sát, mẫu cây Euodia sp xuất hiện vòng kháng khuẩn 7/20 chủng vi khuẩn khảo sát, mẫu cây Calamus sp xuất hiện vòng kháng khuẩn 4/20 chủng vi khuẩn khảo sát, mẫu cây Lantana sp xuất hiện vòng kháng khuẩn 3/20 chủng vi khuẩn khảo sát, mẫu cây Acorus sp xuất hiện vòng kháng khuẩn 2/20 chủng vi khuẩn khảo sát. Mẫu cây Streptocaulon sp không xuất hiện vòng kháng đối với bất kì chủng vi khuẩn khảo sát nào. Kết quả thành phần hóa học cho thấy trong 6 cây khảo sát đều chứa rất nhiều thành phần hóa học như Carbohydrate, hợp chất trong alkaloid, saponin, cardiac glycoside, flavonoid, tannin, nhóm steroid và nhóm các hợp chất phenol. Trong đó mẫu cây Xidi Klung có đầy đủ các thành phần hoá học nhất trong các cây tiến hành khảo sát 2. Đề nghị Khảo sát thêm các thử nghiệm đối với các mẫu cây Xidi Klung, Euodia sp, Calamus sp, Lantana sp, Acorus sp ở các nồng độ ethanol 50%, 90% hay các dung môi khác như methanol, nước. Tiến hành thử nghiệm nồng đô ̣ ứ c chế tối thiểu (MIC),định danh loài, đinḥ lương̣ thành phần hóa hoc̣ của cây Xidi Klung. Khảo sát khả năng điều trị các bệnh liên quan đến khả năng kháng các chủng vi khuẩn như Escherichia coli spp, Listeria spp, Salmonella spp ..của cây Xidi Klung trên mô hình động vật 65 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt Bài giảng Dược liệu Tập I, 1998, Trường đại học y dược TPHCM Cao Minh Nga, 2014. Thực tập vi sinh học. Nhà xuất bản giáo dục,67,68 Đài Thị Xuân Trang, Lâm Hồng Bảo Ngọc và Võ Thị Tú Anh (2015), “Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hoá của cao methanol cây Hà Thủ Ô Trắng”, (Streptocaulon juventas MERR.). Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ. Đỗ Tất Lợi, 2004. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học Ngô Văn Thu, 2011. Bài giảng dược liệu, tập I. Trường đại học Dược Hà Nội Nguyễn Văn Thanh , Nguyễn Thanh Hải (2014),”nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn In Vitro của dịch chiết cây Mò Hoa Trắng (Clerodendron fragrans Vent) trên vi khuẩn E.coli, Samonella spp. Phân lập từ phân lợn con theo mẹ mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy và thử nghiệm điều trị” Phạm Thanh Kỳ và cs, 1998. Bài giảng dược liệu, tập II. Trường đại học Dược Hà Nội Viện Dược liệu (2004), “Cây thuốc và động vật làm thuốc Việt Nam”, tập II, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật. Viện dược liệu, 2004. Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I. Nhà xuất bản khoa hoc kỹ thuật Võ Thị Mai Hương, Trần Thanh Phong (2014), “Một số đặc trưng hoá sinh và khả năng kháng khuẩ