Đồ án Đánh giá biến dị di truyền của nguồn tôm sú (penaeus monodon) bố mẹ thế hệ đầu tiên cho chương trình chọn giống

ự của tôi được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết, nghiên cứu thực nghiệm và dưới sự hỗ trợ từ người hướng dẫn khoa học là Thạc sĩ Bùi Thị Liên Hà, thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II. Các số liệu, hình ảnh, những kết quả trong bài báo cáo là trung thực. Đề tài có sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả, cơ quan tổ chức khác và cũng đã được thể hiện trong phần tài liệu tham khảo. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 8 năm 2015 Sinh viên Lê Thị Lý LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn thầy Th.s Phạm Minh Nhựt - Giảng viên khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường đã giới thiệu em vào làm đề tài ở Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II. Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường Đại học Công Nghệ TP. HCM đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian học tập tại trường. Và đồng gửi lời cảm ơn đến các thầy cô thuộc Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho em suốt thời gian qua. Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến chị Th.s Bùi Thị Liên Hà cùng các anh chị thuộc Phòng Sinh học thực nghiệm đã chỉ bảo ân cần và tận tình giúp đỡ em hoàn thành tốt thời gian làm đề tài. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè - những người đã luôn bên em, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em được học tập và đạt kết quả như ngày hôm nay. Trong quá trình nghiên cứu cũng như trong quá trình làm báo cáo, khó tránh khỏi những khiếm khuyết nhất định, em rất mong nhận được sự phê bình cũng như các ý kiến đóng góp của quý thầy cô giáo. Em xin chân thành cảm ơn ! Tp. Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 8 năm 2015 Sinh viên Lê Thị Lý Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC .............................................................................................................. i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ..................................................................... v DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................. vii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH .....................viii LỜI MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài .............................................................................................. 1 2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................................. 2 3. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................... 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 3 1.1. Giới thiệu về tôm sú ................................................................................................. 3 1.1.1. Phân loại .......................................................................................................... 3 1.1.2. Cấu tạo ............................................................................................................. 3 1.1.3. Phân bố ............................................................................................................ 4 1.1.4. Chu kì sống ...................................................................................................... 5 1.1.5. Sinh sản ........................................................................................................... 7 1.1.6. Đặc điểm sinh trưởng ...................................................................................... 8 1.2. Giới thiệu chung về đa dạng di truyền ..................................................................... 9 1.2.1. Đa dạng di truyền ............................................................................................ 9 1.2.2. Quần thể ......................................................................................................... 10 1.2.3. Sự đa dạng di truyền trong quần thể .............................................................. 11 1.2.4. Nguyên nhân dẫn đến sự đa dạng di truyền trong quần thể .......................... 11 1.2.5. Vai trò của di truyền và di truyền quần thể trong nuôi trồng thủy sản.......... 12 1.3. Kỹ thuật Microsatellite .......................................................................................... 14 1.3.1. Định nghĩa về Microsatellite ......................................................................... 14 1.3.2. Giới hạn của Microsatellite ........................................................................... 15 1.3.3. Các loại Microsatellite ................................................................................... 16 1.3.4. Sự phát triển của Primer Microsatellites ....................................................... 17 1.3.5. Cơ chế hình thành Microsatellite .................................................................. 17 i Đồ án tốt nghiệp 1.3.6. Vai trò của Microsatellite .............................................................................. 19 1.3.7. Các phương pháp phát hiện Microsatellite .................................................... 20 1.4. Tình hình nghiên cứu ............................................................................................. 24 1.4.1. Những nghiên cứu đa dạng di truyền trong nước .......................................... 25 1.4.2. Những nghiên cứu đa dạng di truyền trên thế giới ......................................... 26 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................. 28 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................................... 28 2.2. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................ 28 2.2.1. Nguyên liệu ................................................................................................... 28 2.2.2. Hóa chất thí nghiệm....................................................................................... 30 2.2.3. Các hóa chất ly trích DNA ............................................................................ 31 2.2.4. Hóa chất chạy PCR ........................................................................................ 32 2.2.5. Hóa chất chạy điện di agarose ....................................................................... 32 2.2.6. Hóa chất chạy điện di mao quản ................................................................... 32 2.2.7. Dụng cụ và thiết bị ........................................................................................ 32 2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................... 33 2.3.1. Phương pháp thu mẫu .................................................................................... 33 2.3.2. Phương pháp ly trích DNA tổng số ............................................................... 33 2.3.3. Phương pháp kiểm tra độ tinh sạch và định lượng DNA .............................. 35 2.3.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ......................................... 36 2.3.5. Phương pháp điện di ...................................................................................... 43 2.3.6. Phân tích thống kê đa dạng di truyền của bốn quần đàn mẫu tôm sú bằng các phần mềm Cervus, Fstat. .................................................................................... 46 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 48 3.1. Kết quả trích ly DNA ............................................................................................. 48 3.2. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp các cặp mồi Microsatellite ........................................... 50 3.2.1. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite W10 trên 4 mẫu tôm sú AA4, TT1, GT3, NG12, đại diện cho 16 phép phối. ................................... 50 ii Đồ án tốt nghiệp 3.2.2. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite P1 trên 4 mẫu tôm sú AA4, TT1, NG12, GT3 đại diện cho 16 phép phối. .................................... 52 3.2.3. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite L1 trên 4 mẫu tôm sú AA4, TT1, NG12, GT3 đại diện cho 16 phép phối. .................................... 53 3.3. Khảo sát nồng độ MgCl2 ........................................................................................ 54 3.3.1. Microsatellite W10 với các nồng độ MgCl2 trong phản ứng PCR ................ 55 3.3.2. Microsatellite P1 với các nồng độ MgCl2 trong phản ứng PCR .................... 55 3.3.3. Microsatellite L1 với các nồng độ MgCl2 trong phản ứng PCR ................... 57 3.4. Khảo sát hàm lượng DNA ..................................................................................... 58 3.4.1. Khảo sát hàm lượng DNA khuôn tối ưu cho cặp mồi Microsatellite W10 ... 58 3.4.2. Khảo sát hàm lượng DNA khuôn tối ưu cho cặp mồi Microsatellite P1 ...... 59 3.5. Khảo sát tính hoạt động của phản ứng PCR và sàng lọc các cặp mồi Microsatellite . ................... 60 3.5.1. Khảo sát tính hoạt động của phản ứng PCR .................................................. 60 3.5.2. Sàng lọc các các cặp mồi Microsatellite ....................................................... 62 3.6. Khảo sát đa dạng di truyền của mười sáu phép phối tôm sú đàn con phân tích. ... 64 3.6.1. Tính đa dạng di truyền của mười sáu phép phối tôm sú đàn con .................. 64 3.6.2. Kiểm tra cân bằng Hardy - Weinberg ........................................................... 69 3.6.3. Sự khác biệt di truyền của các phép phối trong mẫu phân tích ..................... 69 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 73 4.1. Kết luận ...................... 73 4.2. Kiến nghị ....................... 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 75 Tài liệu Tiếng Việt ......................................................................................................... 75 Tài liệu Tiếng Anh ......................................................................................................... 76 Tài liệu từ Internet .......................................................................................................... 77 PHỤ LỤC .............................................................................................................. 1 PHỤ LỤC A. Kết quả xử lý số liệu trên hai phần mềm Fstat và cervus ......................... 1 A.1. Chỉ số phong phú alen của 16 phép phối trên 10 microsatellite loci .................. 2 iii Đồ án tốt nghiệp A.2. Chỉ số cận huyết giữa 16 phép phối trên 10 microsatellite loci ......................... 2 A.3. Sự khác biệt di truyền của 16 phép phối trong mẫu phân tích ........................... 3 A.4. Các chỉ số đánh giá biến dị di truyền của 16 phép phối ..................................... 6 PHỤ LỤC B. Một số hình ảnh phân tích DNA từ máy điện di mao quản ...................... 7 B.1. Microsatellite P1: Mẫu D9, đồng hợp tử 134 - 134 ............................................ 7 B.2. Microsatellite P4: Mẫu E9, đồng hợp tử 211 - 211 ............................................ 8 B.3. Microsatellite W10: Mẫu A10, dị hợp tử 116 - 112 ........................................... 8 B.4. Microsatellite L1: Mẫu A8, dị hợp tử 165 - 179................................................. 9 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ***: Không cân bằng di truyền Hardy - Weinberg với mức ý nghĩa sau khi hiệu chuẩn với Bonferroni p < 0,0042. µg: Microgram µl: Microlite µM: Micromol/lite AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism Ar: Allelic richness (mức độ phong phú alen) Bp: Base pair CE: Capillary Electropherosis (Điện di mao quản) DMS: Dimethyl sulfoxide DNA: Deoxyribonucleic acid dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate EBV: Estimated Breeding Value (giá trị chọn giống ) EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid EFF: Electric Field Force EOF: Electro - Osmotic Flo Fis: Chỉ số cận huyết Fst: Sự sai khác di truyền GTE: Glucose - Tris - EDTA He: Expected heterozygosity (dị hợp tử mong đợi) Ho: Observed heterrozygosity (dị hợp tử phát hiện) HWE: Cân bằng Hardy - Weinberg ISSR: Inter Simple Sequence Repeats M: Ladder DNA Marker: Chỉ thị mM: Milimolar (milimol/lite) Na: Number of alleles per locus (số lượng alen trên locus) NS: Không khác biệt có ý nghĩa v Đồ án tốt nghiệp NST: Nhiễm sắc thể PCR: Polymerase chain reaction PIC: Polymorphic Information Content (thông tin đa hình) RAPD: Randomly Amplified Polymorphic DNA RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism SDS: Sodium Dodecyl Sulphate SSR: Single sequence repeat - Microsatellite STE: Sodium Chloride - Tris - EDTA Ta: Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp) TBE: Tris Borate EDTA Tm: Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy) VNCNTTS I: Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản I VNCNTTS II : Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II VNTR : Variable Number Tamdem Repeat vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Danh sách 69 gia đình mẫu tôm sú đàn con ............................................. 28 Bảng 2.2. Thông tin các cặp mồi microsatellite ....................................................... 30 Bảng 2.3. Gradient nhiệt độ lai cho từng cặp mồi microsatellite ............................. 40 Bảng 2.4. Nồng độ MgCl2 khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite ...................... 41 Bảng 2.5. Hàm lượng DNA khuôn khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite ......... 41 Bảng 2.6. Thành phần buffer, dNTP, cặp mồi Microsatellite (Primer), DNA, Taq polymerase cho một phản ứng PCR. ......................................................................... 42 Bảng 3.1. Kết quả đo OD kiểm tra độ tinh sạch và xác định nồng độ DNA ............ 48 Bảng 3.2. Nhiệt độ bắt cặp (Ta) thích hợp cho các cặp mồi microsatellite .............. 54 Bảng 3.3. Nồng độ MgCl2 tối ưu của các cặp mồi microsatellite cho một phản ứng PCR ........................................................................................................................... 57 Bảng 3.4. Hàm lượng DNA khuôn tối ưu của các cặp mồi microsatellite cho một phản ứng PCR ........................................................................................................... 60 Bảng 3.5. Hiệu suất PCR và số alen của 19 cặp mồi microsatellite trên 28 mẫu ..... 60 DNA tôm sú. ............................................................................................................. 60 Bảng 3.6. Đặc điểm đa dạng di truyền chung trên microsatellite của 16 tổ hợp tôm sú đàn con trong nghiên cứu. .................................................................................... 64 Bảng 3.7. Biến động hệ số dị hợp tử mong đợi (He) của 16 tổ hợp tôm sú đàn con 67 Bảng 3.8. Chỉ số phong phú alen (Allelic richness) ................................................. 68 Bảng 3.9. Giá trị Fst được phân tích các tổ hợp tôm sú đàn con ............................... 70 Bảng 4.1. Kết quả khảo sát về nhiệt độ bắt cặp tối ưu, nồng độ MgCl2 và nồng độ DNA cho 10 cặp mồi microsatellite .......................................................................... 73 vii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1. Tôm sú (Penaeus monodon) ....................................................................... 3 Hình 1.2. Bản đồ phân bố tôm sú (Fao.org) ............................................................... 5 Hình 1.3. Vòng đời của tôm sú Penaeus monodon .................................................... 6 Hình 1.4. Các giai đoạn phát triển của tôm sú Penaeus monodon ............................. 7 Hình 1.5. Quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân .................................... 18 Hình 1.6. Mô tả quá trình trượt lỗi trong sao mã (replication slippage) .................. 18 Hình 1.7. Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số.................................................. 22 Hình 1.8. Vùng flanking (vùng sườn) ở hai bên trình tự microsatellite ................... 22 Hình 2.1. Thang chuẩn 100bp .................................................................................. 31 Hình 2.2. Quy trình tách chiết DNA Salt extraction ................................................ 34 Hình 2.3. Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR ..................................................... 38 Hình 2.4. Chu trình nhiệt của máy PCR sau khi tối ưu nhiệt độ bắt cặp mồimicrosatellite ....................................................................................................... 43 Hình 2.5. Điện di trên Agarose ................................................................................. 44 Hình 2.6. Mô tả hệ điện di mao quản dạng đơn giản ............................................... 46 Hình 3.1. Kết quả ly trích DNA các mẫu chân bơi tôm ngẫu nhiên đại diện cho 16 phép phối ................................................................................................................... 48 Hình 3.2. Tối ưu nhiệt độ bắt ở cặp mồi Microsatellite W10 khi tiến hành phản ứng PCR theo gradient nhiệt độ. ...................................................................................... 51 Hình 3.3. Tối ưu nhiệt độ bắt ở cặp mồi Microsatellite P1 khi tiến hành phản ứng PCR theo gradient nhiệt độ. ...................................................................................... 52 Hình 3.4. Tối ưu nhiệt độ bắt ở cặp mồi Microsatellite L1 khi tiến hành phản ứng PCR theo gradient nhiệt độ. ...................................................................................... 53 Hình 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 với cặp mồi microsatellite W10 ............ 55 Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 với cặp mồi microsatellite P1 ............... 56 Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 với cặp mồi microsatellite L1 ............... 57 Hình 3.8. Khảo sát hàm lượng DNA khuôn tối ưu của cặp mồi microsatellite W10 ................................................................................................................................... 58 viii Đồ án tốt nghiệp Hình 3.9. Khảo sát hàm lượng DNA khuôn tối ưu của cặp mồi microsatellite P1 .. 59 Hình 3.10. Biểu đồ thể hiện hiệu suất PCR của 19 cặp mồi microsatellite .......... 61 Hình 3.11. Biểu đồ thể hiện số alen của mỗi cặp mồi microsatellite. ...................... 62 Hình 3.12. Khảo sát tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi Microsatellite L1 ................................................................................................................................... 63 Hình 3.13. Khảo sát tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi Microsatellite P4 ................................................................................................................................... 63 Hình 3.14. Khảo sát tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi Microsatellite P1 ................................................................................................................................... 64 Hình 3.15. Đồ thị so sánh giá trị đa hình các alen trên mỗi locus ............................ 66 ix Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Trong những năm gần đây, nghành nuôi trồng thủy sản là một trong những nghành trọng điểm phát triển tại Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung. Hằng năm, lĩnh vực này đã mang lại một giá trị kim ngạch xuất khẩu lớn cho đất nước và tạo thu nhập ổn định cho người nuôi trồng thủy sản. Theo Tổng cục Thủy sản Thống kê, ước tính giá trị sản xuất thủy sản năm 2014 (tính theo giá so sánh 2010) ước đạt 188 nghìn tỷ đồng, tăng 6,5% so với cùng kì năm 2013, trong đó giá trị nuôi trồng thủy sản ước đạt hơn 115 nghìn tỷ đồng (chiếm 61,2%). Các đối tượng nuôi trồng thủy sản phổ biến bao gồm: cá tra, cá rô phi, tôm sú, tôm càng xanh, cá chép Ấn Độ, ốc hương, rong câuTrong đó nghề nuôi tôm được nuôi trồng rộng rãi nhất và ngày càng thu hút mạnh sự đầu tư của các hộ dân đặc biệt là tôm sú (Penaeus monodo), loài tôm có giá trị kinh tế lớn được liệt kê bởi tổ chức nông nghiệp thế giới (Food Agriculture Organization - FAO), tính đến cuối tháng 11/2013, giá trị xuất nhập khẩu tôm 10 tháng năm 2013 đạt gần 2,5 tỷ USD, tăng gần 32,7% so với cùng kì năm 2012, chiếm 44% tổng giá trị xuất khẩu thủy sản đất nước ( Hiện nay, nghành nuôi trồng sản xuất tôm sú ngày càng mở rộng và phát triển thì nhu cầu tôm giống càng tăng cao. Để đáp ứng một lượng lớn tôm giống, nhiều trại sản xuất tôm giống đã được hình thành và thực hiện trên quy mô lớn. Tuy nhiên, tôm sú bố mẹ cung cấp cho các trại sản xuất tôm giống hiện nay hoàn toàn phụ thuộc vào nguồn bố mẹ từ tự nhiên và nhập nội. Sử dụng nguồn tôm bố mẹ còn thụ động, tự nhiên, chủ quan và phụ thuộc vào các yếu tố khác do điều kiện sản xuất, kinh doanh tại các trại tôm giống này là khác nhau dẫn tới chất lượng của tôm sú giống không được đảm bảo, có dấu hiệu suy giảm sinh trưởng sau các thế hệ nuôi, mang các mầm bệnh tiềm tàng, tiềm ẩn rủi ro lớn cho người nuôi tôm. Để có được nguồn giống tăng trưởng tốt, sức chống chịu, kháng bệnh tốt cung cấp cho người nuôi trồng tôm sú, không phải phụ thuộc vào nguồn tự nhiên hay nhập nội thì việc nghiên cứu sản xuất giống tôm sú cung cấp cho người nuôi 1 Đồ án tốt nghiệp sản phẩm giống tốt, có tốc độ sinh trưởng nhanh, chống chịu tốt là điều hết sức cần thiết. Trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu chú ý đến nâng cao chất lượng di truyền, tăng khả năng chống chịu ở tôm sú đã được thực hiện nhằm đặt ra cơ sở khoa học, kỹ thuật để có thể nâng cao chất lượng của loài thủy sản giá trị cao này. Mục tiêu có được sản phẩm giống tôm sú tốt đòi hỏi vào những nghiên cứu cải thiện di truyền sản phẩm giống, tập trung cao vào các tính trạng kinh tế quan trọng là sức sinh trưởng, kháng bệnh, chống chịu và phải đa hình di truyền. Để giải quyết các vấn đề trên, các nghiên cứu xác định biến dị di truyền phải kết hợp với so sánh các biến dị hình thái thể hiện về sinh trưởng, sức sống với các chỉ thị ở mức độ phân tử của các quần thể tôm sú, giữa các cá thể trong cùng một quần đàn là hướng nghiên cứu phù hợp cần thiết, ứng dụng cao. Vì thế nhóm nghiên cứu tham gia vào đề tài “Đánh giá biến dị di truyền của nguồn tôm sú (Penaeus monodon) bố mẹ thế hệ đầu tiên cho chương trình chọn giống” nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho chương trình chọn giống tôm sú quốc gia. Đề tài được thực hiện ở Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II dưới sự hướng dẫn của Thạc sĩ Bùi Thị Liên Hà. 2. Mục đích nghiên cứu Chương trình chọn giống truyền thống dựa vào kiểu hình kết hợp với chỉ thị sinh học phân tử được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền hỗ trợ trong việc chọn lọc giống bố mẹ, hoặc xác định con cái của chúng có tiềm năng tạo ra những con giống tốt, có năng suất cao. Tích lũy những gia đình mang tính đa dạng di truyền cao cho mục đích chọn lọc nhiều tính trạng phù hợp trong những điều kiện khác nhau. 3. Mục tiêu nghiên cứu - Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi Microsatellite qua quy trình PCR. - Phân tích đa dạng di truyền của các tổ hợp phối đàn con tôm sú trong chọn giống thông qua chỉ thị Microsatellite. 2 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về tôm sú 1.1.1. Phân loại Tôm sú (tên khoa học: Penaeus monodon) là một loài động vật giáp xác đại dương nuôi để dùng làm thực phẩm. Theo Hothuis (1980) và Bames trích dẫn bởi Trần Ngọc Hải và cộng sự (1999) thì tôm sú được định loại như sau: Nghành: Arthropoda Lớp: Crustacea Bộ: Decapoda Họ chung: Penaeidea Họ: Penaeus Fabricius Giống: Penaeus Loài: Penaeus Monodo (Fabricius , 1798) Tên khoa học: Penaeus monodon Fabricius Tên tiếng anh: Tiger Shrimp Tên tiếng việt: Tôm sú, tôm cỏ Hình 1.1. Tôm sú (Penaeus monodon) 1.1.2. Cấu tạo Cơ thể tôm sú chia 2 phần: Phần đầu ngực và phần bụng. 3 Đồ án tốt nghiệp Phần đầu ngực gồm có: - Chủy: Dạng lưỡi kiếm, cứng, có răng cưa. Chủy cong xuống rất ít, phía trên chủy có 7 - 8 răng, dưới chủy có 3 răng. - Mũi khứu giác và râu: Cơ quan nhận biết và giữ thăng bằng cho tôm. - 3 cặp chân hàm: Giúp tôm lấy thức ăn và bơi lội. - 5 cặp chân ngực (chân bò): Đây là cơ quan giúp lấy thức ăn và di chuyển của tôm sú (bò). Phần bụng gồm có: 6 đốt bụng và 1 đốt đuôi, mỗi đốt có 1 vùng vỏ, có 5 đôi chân bơi giúp tôm bơi lội dễ dàng trong thủy lực. Tôm sú thuộc loại dị hình phái tính, con cái có kích thước to hơn con đực. Khi tôm trưởng thành phân biệt rõ đực cái, thông qua cơ quan sinh dục phụ bên ngoài. - Con đực: Cơ quan sinh dục chính của tôm đực nằm ở phía trong phần đầu ngực, bên ngoài có cơ quan giao phối phụ nằm ở nhánh ngoài đôi chân ngực thứ 2, lỗ sinh dục đực mở ra hốc háng đôi chân ngực số 5. Tinh trùng thuộc dạng chứa trong túi. - Con cái: Buồng trứng nằm dọc theo mặt lưng phía trên, hai ống dẫn trứng mở ra ở khớp háng đôi chận ngực số 3. Bộ phận chứa túi tinh gồm 2 tấm phồng lên ở đôi chân ngực thứ 4 và thứ 5 dưới bụng tôm. 1.1.3. Phân bố Phạm vi phân bố của tôm sú khá rộng, vùng nhiệt đới đến cận nhiệt đới, từ Ấn Độ Dương qua hướng Nhật Bản, Đài Loan, phía Đông Tahiti, phía Tây Châu Phi và phía Nam Châu Úc (Motoh, 1981). Nhìn chung loài này phân bố hầu hết vùng Đông Nam Á từ 30 kinh độ Đông đến 155 kinh độ Đông và từ 35 vĩ độ Bắc đến 35 vĩ độ Nam xung quanh các vùng xích đạo đặc biệt như: Philipines, Malaysia, Indonesia và Việt Nam. Tại Việt Nam tôm sú xuất hiện dọc theo bờ biển Đông và vùng Đảo Phú Quốc nhưng tập trung chủ yếu ở các vùng Miền Trung và Nam Bộ. Tôm sú (Post Larvae), tôm giống (Juvenile) và tôm gần trưởng thành có tập tính sống gần bờ biển 4 Đồ án tốt nghiệp và rừng ngập mặn ven bờ. Khi tôm trưởng thành sẽ di chuyển ra xa bờ vì chúng thích sống vùng nước sâu hơn Hình 1.2. Bản đồ phân bố tôm sú (Fao.org) 1.1.4. Chu kì sống Tuổi thọ tôm sú con đực khoảng 1,5 năm và con cái khoảng 2 năm. Có 2 đặc điểm cần chú ý đến vòng đời tôm sú: - Tăng trưởng từ hậu ấu trùng đến lúc trưởng thành xảy ra vùng cửa sông (đặc trưng ở vùng nước lợ). - Sự chín sinh dục, kết cặp, đẻ trứng và sự phát triển ấu trùng đều xảy ra ở ngoài khơi nơi có nồng độ muối dao động trong khoảng 18 - o 32 /oo và ổn định. 5 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3. Vòng đời của tôm sú Penaeus monodon Vòng đời tôm sú được chia làm các giai đoạn: Phôi, ấu trùng, hậu ấu trùng, tôm giống, tôm tiền trưởng thành và trưởng thành (Nguyễn Thanh Phương và cộng sự, 1999). Giai đoạn phôi: Bắt đầu giai đoạn từ khi trứng thụ tinh và phân cắt thành 2, 4, 8, 16, 32, 64 tế bào, phôi dâu, phôi nang, phôi vị đến khi nở. Thời gian hoàn tất giai đoạn này khoảng 12 đến 15 giờ tùy thuộc vào điều kiện nhiệt độ nước. Nauplli: Gồm 6 giai đoạn, giai đoạn phụ kéo dài từ 36 - 51 giờ, các Nauplli bơi từng đoạn ngắn rồi nghĩ, lột vỏ 4 lần, mỗi lần khoảng 7 giờ, tự sống bằng noãn hoàn không cần thức ăn. Giai đoạn đầu có chiều dài 0,4 mm và chiều dài tăng dần đến giai đoạn cuối đạt 0,61 mm, bề dày 0,2 mm. Zoea: Gồm 3 giai đoạn kéo dài 105 - 120 giờ, các Zoea bơi liên tục gần mặt nước, lột vỏ 2 lần, mỗi lần khoảng 36 giờ, ăn thực vật phiêu sinh. Giai đoạn bắt đầu xuất hiện hai phần đầu và bụng rõ rệt, dài khoảng 1mm, giai đoạn kế tiếp xuất hiện mặt và chủy dài 1,9 mm, khi đạt chiều dài 2,7 mm thì thấy xuất hiện gai trên bụng dày 0,45 mm. Mysis: Gồm 3 giai đoạn kéo dài 72 giờ, các Mysis bơi hướng sâu, đuôi đi trước, đầu đi sau. Tôm có hình dạng của tôm trưởng thành dài 3,4 mm xuất hiện các cặp chân bụng, đuôi và quạt đuôi, các gai bụng thu nhỏ lại. Đến khi tôm đạt chiều 6 Đồ án tốt nghiệp dài khoảng 4,4 mm chân bụng dài hơn, phân thành đốt nhỏ, xuất hiện răng trên chủy. Postlarvae (giai đoạn hậu ấu trùng): Giai đoạn ấu trùng mất khoảng 9 - 10 ngày, sau đó biến thái sang giai đoạn hậu ấu trùng. Giai đoạn này tôm bám thành bể, sống đáy, có hình dạng giống như tôm trưởng thành. Tôm ăn động vật, mùn bã hữu cơ, sinh vật đáy: Oligochaeta, Polychaeta, Bivalvia, 5 - 6 tuần sau trở thành tôm giống. Juvenile (giai đoạn trưởng thành): Tôm giống 6 - 8 tháng sau đạt tiêu chuẩn tôm trưởng thành và có thể tham gia sinh sản (Nguyễn Thanh Phương và cộng sự, 1999). Hình 1.4. Các giai đoạn phát triển của tôm sú Penaeus monodon 1.1.5. Sinh sản Tuổi thành thục sinh dục của tôm đực và tôm cái từ tháng thứ 8 trở đi. Xác định sự thành thục của tôm cái dễ hơn, chỉ cần quan sát có túi tinh ở cơ quan sinh dục phụ. Phương pháp xác định thành thục ở con đực khó hơn, thường dựa vào trọng lượng để xác định khi con đực nặng từ 50 g trở lên, chỉ khi nào tìm thấy được tinh trùng ở cuối ống dẫn tinh. 7 Đồ án tốt nghiệp Hormone điều khiển sự thành thục sinh dục (GIH - Gonal Inhibiting Hormone) được sản xuất bởi tế bào thần kinh trong cơ quan X của cuống mắt, vận chuyển tới tuyến giáp synap đưa vào kho dự trữ và khi cần thì tiết ra. Sự thành thục sinh dục của tôm sú thông qua tác động của tuyến nội tiết, khi cắt mắt tức là thúc đẩy chu kì lột xác, đem lại sự thành thục mau chóng hơn. Số lượng trứng đẻ của tôm cái nhiều hay ít phụ thuộc vào chất lượng buồng trứng và trọng lượng cá thể, trọng lượng lớn cho trứng nhiều hơn. Khi con cái thành thục ngoài tự nhiên có trọng lượng từ 100 - 300 g cho 300...y rất đặc hiệu, có độ chính xác cao, có khả năng nhân bản ổn định. Tương đối đơn giản, dễ thực hiện. Có độ lặp lại rất cao, có thể phân tích hàng loạt, tự động. Chúng là chỉ thị di truyền hoàn hảo, chuyên biệt locus và đồng trội (co - dominant), cho phép xác định thể đồng và dị hợp tử và có khả năng lặp lại (Satoni và cộng sự, 2000). Chỉ thị mồi microsatellite có các ưu điểm nổi bật sau: 23 Đồ án tốt nghiệp - Di truyền đa alen và đồng trội. - Có tính chỉ thị cao (non - abundant). - Có ở tận hai đầu của bộ gien (tính chỉ thị rộng). Microsatillite (Simple Sequence Repeats, SSRs) có độ đa hình cao, chỉ thị đồng trội, hiệu quả này đã được chứng minh qua nhiều mục đích ứng dụng bao gồm kỹ thuật finger - printing (Smith và Devey, 1994), nghiên cứu di truyền quần thể (Haymer 1994; Tsumura và cộng sự, 1996; Thomas và cộng sự, 1999), kiểm tra sự phân bố di truyền cho đời sau (Dow và cộng sự, 1995), kiểm tra sự thuần hóa (Morchen và cộng sự, 1996). Khi so sánh với các phương pháp khác thì SSR dễ dàng sử dụng hơn sự đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphisms, RFLPs) chỉ giải quyết được số lượng nhỏ DNA, sự đa hình cao và khả năng phân tích nhanh. SSR phân tích nhanh hơn sự khuếch đại đa hình ngẫu nhiên DNA (Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD) và sự chuyển đổi tốt hơn AFLP. SSR hiện giờ thay thế cho RFLP trong lập bản đồ di truyền các cây trồng trong nông nghiệp. Sự kết hợp của SSR với AFLP tạo nên bản đồ di truyền chi tiết. Sự đồng trội tự nhiên của SSR cũng là điểm mạnh trong lập bản đồ di truyền. Trong khi đó, chỉ thị RAPD thì dễ dàng phát triển nhưng giới hạn trong nhiều mục đích ứng dụng (Haymer, 1994). Tuy nhiên, việc xác định những đoạn mồi bọc chuyên biệt là một công việc khá nặng nề đòi hỏi người thực hiện phải có kỹ thuật cao. Hơn nữa kỹ thuật này đòi hỏi chi phí rất cao (Gupta và cộng sự, 1999). 1.4. Tình hình nghiên cứu Trong lĩnh vực nghiên cứu đa dạng di truyền trên động vật thủy sản trong nước và thế giới. Trước những yêu cầu cấp thiết về nguy cơ mất dần sự đa dạng nguồn lợi sinh vật, sự thoái hóa giống vật nuôi, cây trồng .v.v Vấn đề cấp bách đặt ra cho các nhà nghiên cứu di truyền là phải nhanh chóng tìm hiểu và giải quyết các vấn đề trên. Ngoài ra, còn phải đưa ra những giải pháp công nghệ nâng cao chất lượng con giống, tăng nguồn lợi thực phẩm cho cả hai mặt chất và lượng. Đã có rất 24 Đồ án tốt nghiệp nhiều nghiên cứu đi sâu tìm hiểu cấu trúc phân tử của vật liệu di truyền và một số đã mang lại thành công ngoài mong đợi. Tuy nhiên, vấn đề phục hồi nguồn đa dạng sinh học đã bị mất đi thì còn phải cần nhiều thời gian. Dưới đây là một số ứng dụng sinh học phân tử vào lĩnh vực di truyền chọn giống. 1.4.1. Những nghiên cứu đa dạng di truyền trong nước Trong phạm vi nước ta, có những nghiên cứu đa dạng di truyền đã được thực hiện như: Trường Đại học quốc gia TP HCM, Viện NCNTTS I và Viện NCNTTS II - “Khảo sát đa dạng di truyền một số quần thể đàn tôm sú (Penaeus monodon) bằng hai kỹ thuật RAPD và mtDNA PCR - RFLP”. Theo đó, kết quả chỉ đánh giá khả năng ứng dụng từng kỹ thuật vào các mục đích tìm hiểu khác nhau, nhưng đây là một nỗ lực trong đánh giá di truyền một số quần thể tự nhiên. Để đánh giá sự khác biệt di truyền giữa hai quần đàn tôm càng xanh Việt Nam và Trung Quốc và làm cơ sở cho việc quản lý, bảo tồn nguồn gien tôm càng xanh tại Việt Nam. Nghiên cứu “So sánh sự đa dạng di truyền giữa tôm càng xanh Việt Nam và tôm càng xanh Trung Quốc sử dụng phương pháp Microsatellite và RAPD” nhằm kiểm tra sự khác biệt di truyền của hai quần đàn tôm càng xanh Việt Nam và Trung Quốc cùng với 6 cặp mồi Microsatellite và 5 mồi ngẫu nhiên RAPD (Nguyễn Thành Tâm và Phạm Thanh Liêm, 2012). Nghiên cứu “Đánh giá tính đa hình của ba quần đàn tôm sú nuôi ở Việt Nam bằng phương pháp Microsatellite” đã phân tích tính đa hình trên 83 cá thể với số lượng quần đàn: quần đàn I (n = 30) thu ở Rạch Gốc, quần đàn II (n = 32) thu ở Phú Yên, quần đàn 3 (n = 21) có nguồn gốc ở Singapore. 8 locus microsatellite lấy từ ngân hàng gien (CSCUP mo1, CSCUP mo2, CSCUP mo3, CSCUP mo4, CSCUP mo6, CSCUP mo7, CSCUP mo18, CSCUP mo386). Kết quả mà tác giả phân tích cho thấy 6 locus đầu tiên có tính đa hình bên trong mỗi quần đàn đang rất cao với giá trị thông tin đa hình PIC > 0,5 (Nguyễn Thị Thảo và cộng sự, 2004). Một số các nghiên cứu thăm dò khác: “Microsatellite nghiên cứu biến dị về màu sắc thịt trắng và thịt vàng của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)” (Nguyễn Hữu Ninh, 2003); “Bước đầu thăm dò, ứng dụng một số chỉ thị DNA phân 25 Đồ án tốt nghiệp tích đa dạng di truyền cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)” (Bùi Thị Liên Hà, 2004); “25 Microsatellite loci khảo sát QTL (Quantitative Trait Loci) trên tính trạng tăng trưởng ở đàn cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)” (Nguyễn Điền, 2005).v.v 1.4.2. Những nghiên cứu đa dạng di truyền trên thế giới Hiện nay trên thế giới, có những đề tài nghiên cứu về đa dạng di truyền đã được thực hiện như: Nghiên cứu “Genetic diversity of intensive cultured and wild tiger shrimp Penaeus monodon (Fabricius) in Malaysia using microsatellite markers” (Nahavandi và cộng sự, 2011). Các tác giả sử dụng 6 cặp mồi tham khảo trong báo cáo của Pongsomboom và cộng sự (2000) cũng cho kết quả đánh giá đa dạng di truyền quần đàn tôm sú hoang dã và nuôi tự nhiên ở Malaysia khả quan. Đề tài “Development of microsatellite markers in black tiger shrimp” (Wuthi và cộng sự, 2003), được đăng trên tạp chí khoa học ngành thủy sản số 224 vào tháng 5/2003. Trong nghiên cứu của mình, các tác giả đã tổng hợp được 30 cặp mồi microsatellite đặc hiệu cho loài tôm sú (penaeus monodon) dựa trên 9 trình tự lặp lại (AG)10, (TG)10, (GAA)10, (GAC)10, (CAT)10, (TAC)10, (GACA)8, (GATA)8, (TCAG) và thực nghiệm trên 30 mẫu tôm. Sau đó các tác giả tiến hành đánh giá đa dạng di truyền của quần đàn tôm sú hoang dã tại Thái Lan, cho kết quả chỉ số thông tin đa hình (PIC) dao động từ 0,4275 - 0,9264. Báo cáo khoa học “Isolation and characterization of 23 polymorphic microsatellite markers for diversity and stock analysis in tiger shrimp (penaeus monodon)” (Pan và cộng sự, 2004). Với việc sử dụng các công cụ gần giống như (Wuthi và cộng sự, 2003), các tác giả đã phân lập được 23 cặp mồi microsatellite đặc hiệu để phân tích đa dạng di truyền trên 30 mẫu tôm sú (Penaeus monodon). Kết quả cho thấy, số alen dao động cao từ 15 - 31, số dị hợp tử mong đợi trung bình Ho = 0,936. Báo cáo này đã được bảo vệ trước Hội đồng Học viện động vật học và phát triển khoa học Đài Loan, và đăng lên tạp chí Molecular Ecology Notes vào tháng 7/2004. 26 Đồ án tốt nghiệp “Development of two microsatellite multiplex systems for black tiger shrimp Penaeus monodon and its application in genetic diversity study for two populations” ( Li và cộng sự, 2007). Trong nghiên cứu này các tác giả sử dụng 90 trình tự gien của tôm sú có kích thước 100 - 350 bp từ ngân hàng gien và thiết kế 13 cặp mồi microsatellite bao gồm 3 và 4 đơn vị lặp lại bằng cách sử dụng primer v.3 (Rozen và Skatetsky, 2000) để đánh giá đa dạng di truyền của 2 quần đàn tôm sú ở Australia và Thái Lan. Kết quả cho thấy, số alen của quần đàn tôm sú ở Australia khá cao dao động từ 7 - 27, số dị hợp tử quan sát dao động lớn được từ 0,16 - 0,91. Đối với quần đàn tôm sú ở Thái Lan số alen từ 6 - 15, số dị hợp tử quan sát dao động lớn từ 0,09 - 0,90. Báo cáo này được đăng trên tạp chí Aquaculture vào 1/2007. Khảo sát ban đầu nhận thấy sự ổn định và chất lượng cao của các cặp mồi từ những bài báo tin cậy trên nhóm nghiên cứu đã chọn ra được 19 cặp mồi: W2, W3, W4, W5, W6, W10 (Wuthi và cộng sự, 2003), P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7 (Pan và cộng sự, 2004), L1, L2, L3, L4, L5, L6 (Li và cộng sự, 2007), tiếp tục khảo sát và sàng lọc ra những cặp mồi có tính đặc hiệu cao nhất để phân tích đánh giá biến dị đa dạng di truyền có độ tin cậy cao cho 16 phép phối tôm sú đàn con trong chương trình chọn giống. 27 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian: Từ ngày 02/02/2015 đến ngày 30/06/2015. Các thí nghiệm được tiến hành ở phòng thí nghiệm di Truyền Phân Tử thuộc Phòng Sinh Học Thực Nghiệm của Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Nguyên liệu Bảng 2.1. Danh sách 69 gia đình mẫu tôm sú đàn con STT Tên mẫu STT Tên mẫu STT Tên mẫu 1 AA4 24 NA10 47 GT4 2 AA5 25 NG9 48 TA1 3 AA6 26 NG10 49 TA2 4 AA7 27 NG11 50 TA3 5 AA8 28 NG12 51 TA4 6 AA9 29 NG13 52 TG1 7 AG4 30 NG14 53 TG2 8 AG5 31 NN5 54 TG3 9 AG6 32 NN6 55 TG4 10 AG7 33 NN7 56 TN1 11 AG8 34 NN8 57 TN2 12 AN3 35 NN9 58 TN3 13 AN4 36 NN10 59 TN1 14 AN5 37 NT4 60 TN2 15 AN6 38 NT5 61 TN3 16 AT2 39 NT6 62 TN4 17 AT3 40 NT7 63 TT1 18 AT4 41 NT8 64 TT2 19 AT5 42 GG6 65 TT3 28 Đồ án tốt nghiệp 20 NA7 43 GG7 66 TT4 21 NA8 44 GN8 67 TT5 22 NA9 45 GN9 68 TT6 23 GA6 46 GA7 69 AN3 Mẫu: 69 gia đình mẫu chân bơi đã được thực hiện trên 16 phép phối với nhau qua các quần thể Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Gia Hóa, Nội Địa (AA, AG, AN, AT, GA, GN, GG, GT, TA, TN, TG, TT, NA, NG, NT, NN). Mẫu được bảo quản trong cồn 70o, được cung cấp bởi chương trình tích hợp các dòng Tôm sú khác nhau cho chương trình chọn giống Tôm sú thuộc Trung tâm Quốc Gia Giống Hải sản Nam Bộ ( TTQGGHSNB) và tương ứng với số lượng như sau: 6 gia đình AA: Phối giữa mẹ Ấn Độ Dương với bố Ấn Độ Dương 5 gia đình AG: Phối giữa mẹ Ấn Độ Dương với bố Gia Hóa 5 gia đình AN: Phối giữa mẹ Ấn Độ Dương với bố Nội Địa 4 gia đình AT: Phối giữa mẹ Ấn Độ Dương với bố Thái Bình Dương 4 gia đình NA: Phối giữa mẹ Nội Địa với bố Ấn Độ Dương 6 gia đình NN: Phối giữa mẹ Nội Địa với bố Nội Địa 6 gia đình NG: Phối giữa mẹ Nội Địa với bố Gia Hóa 5 gia đình NT: Phối giữa mẹ Nội Địa với bố Thái Bình Dương 2 gia đình GG: Phối giữa mẹ Gia hóa với bố Gia Hóa 2 gia đình GN: Phối giữa mẹ Gia Hóa với bố Nội Địa 2 gia đình GA: Phối giữa mẹ Gia hóa với bố Ấn Độ Dương 3 gia đình GT: Phối giữa mẹ Gia hóa với bố Thái Bình Dương 4 gia đình TA: Phối giữa mẹ Thái Bình Dương với bố Ấn Độ Dương 4 gia đình TN: Phối giữa mẹ Thái Bình Dương với bố Nội Địa 4 gia đình TG: Phối giữa mẹ Thái Bình Dương với bố Gia hóa 6 gia đình TT: Phối giữa mẹ Thái Bình Dương với bố Thái Bình Dương 29 Đồ án tốt nghiệp 2.2.2. Hóa chất thí nghiệm 2.3.5.1. Mồi Mười cặp mồi microsatellite sử dụng cho nghiên cứu có chiều dài từ 18 - 27 bp được sàng lọc ra từ 19 cặp microsatellites (hãng Sigma) phân tích đặc hiệu cho 69 gia đình tôm sú, có kí hiệu L1, L3, L4, P1, P2, P4, P5, P7, W10, W2. Trong đó, các cặp mồi L1, L2, L3 được tham khảo từ Li (Li và cộng sự, 2007), các cặp mồi P1, P2, P4, P5, P7 được tham khảo từ Pan (Pan và cộng sự, 2004) và các cặp mồi W10, W2 được tham khảo từ Wuthi (Wuthi và cộng sự, 2003). Thông tin về trình tự và kích thước của mồi được trình bày ở bảng 2.2. Bảng 2.2. Thông tin các cặp mồi microsatellite Tác giả Kí hiệu Trình tự mồi F 5’TGCAGCTTCACACACCCATACACG3’ L1 R 5’TATGACAGGCAGTTGCGCCAGGTA3’ Li và Lion F 5’GAAGGAGAAGGAGGAGGATTACAAGGA3’ (2007) L3 R 5’TCGGGCGGAGAATATGCAAATTAAA3’ F 5’GTCTGTCCATCCTTCCGTCTGACC3’ L4 R 5’TGGGAGTAAACAAAGCGTTTGAGATTG3’ F 5’GTGTTATTTTCCACGGGTGC3’ P1 R 5’GCTGCAGGAAGTGTAGGGAG3’ F 5’GTTGCGACGGGTTGATTC3’ P2 R 5’TTTATGGCTATGGCTGACAC3’ F 5’ TAATGGGCGTAAGTCTTCGG3’ P4 R 5’TGAAAGGAGTCGGGATATGC3’ Pan (2004) F 5’CTTTTTGAAATCGCCCTGTT3’ P5 R 5’CATTCATCCCGCTCTTCTGT3’ 30 Đồ án tốt nghiệp F 5’AAAAGCCAGAGGAAACGTG3’ P7 R 5’ACAGTGCACGTACCCACAAA3’ F 5’TCTATTGTCTGCCAGTTTGTCC3’ W10 R 5’TAGCACGGGATTTATGAAGTGA3’ Wuthi F 5’TTATCCGTATAGCCGCGTTATC3’ (2003) W2 R 5’TTACAGGACCTGCATTTGTGTC3’ 2.2.2.2. Thang Sử dụng thang M (Ladder) DNA để làm chỉ thị xác định kích thước phân tử DNA các mẫu tôm khảo sát. Kích thước thang M sử dụng trong thí nghiệm là 100 bp DNA ladder - Promega. Hình 2.1. Thang chuẩn 100bp 2.2.3. Các hóa chất ly trích DNA - Dung dịch ly trích 1 (Solution 1): 50 mM Tris - HCl pH 8; 20 mM EDTA pH 8; 2% SDS. - Dung dịch ly trích 2 (Solution 2): dung dịch NaCl bão hòa 6 M. - Proteinase K (bảo quản - 24oC) - Ethanol 70% lạnh (bảo quản ở - 24oC) - Ethanol tuyệt đối lạnh (bảo quản ở - 24oC) 31 Đồ án tốt nghiệp - Nước cất 2 lần, hấp khử trùng 2.2.4. Hóa chất chạy PCR - 10 X PCR buffer (Fermentas) - 25 mM MgCl2 (Fermentas) - 10 mM dNTP mix (Fermentas) - Taq DNA polymerase 5 u/µl (Fermentas) - Primer 100 M (Sigma) - DNA mẫu (ly trích từ mẫu chân bơi tôm sú) 2.2.5. Hóa chất chạy điện di agarose - Agarose (Bio basic) - TBE 0,5 X - 6 X DNA Loading Dye (Promega) - 100 bp DNA Ladder (Promega) 2.2.6. Hóa chất chạy điện di mao quản - QIAxcel DNA Sreening Kit (Qiagien) - QX DNA Size Marker 50 - 800 bp (50 ul) (Qiagien) - QX Aligment Marker 15 bp/1 kb (1,5 ml) (Qiagien) - QX DNA Dilution Buffer (Quiagien) - QX Separation Buffer (Qiagien) - QX Wash Buffer (Qiagien) - QX Nitrogien Cylinder (Quigien) 2.2.7. Dụng cụ và thiết bị - Eppendorf 0,2 ml; 0,5 ml; 1,5 ml; 2,0 ml. - Đầu tip các loại (Eppendorf) - Plates 96 well PCR (Eppendorf) - Máy đo OD SmartSpecTMPlus (Bio - rad) - Bồn ủ nhiệt (block heater Bio - rad) - Lò viba (Electrolux - Thụy Điển) - Máy hút và tủ cấy vô trùng (Astec Microflow). 32 Đồ án tốt nghiệp - Micropipet các loại: 100 - 1000 µl; 0,5 - 10 µl; 10 -100 µl; (Bio - rad) - Máy ly tâm lạnh. - Máy PCR (Bio - rad) - Bồn điện di Agarose (Bio - rad) - Máy chụp ảnh điện di Geldoc X (Bio - rad) - Lò vi sóng (Electrolux - Thụy Điển) - Tủ mát, tủ âm (- 2oC, - 80oC) (Sanyo - Nhật) - Máy điện di mao quản - QX 0,2 ml tube trip (Qiagien) - QX 0,2 ml tube trip caps (Qiagien) - QX Color 0,2 ml tube Strip (Quiagien) - Các vật dụng trong tách chiết: chày, crack . 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp thu mẫu Mẫu tôm sú được chọn là những cá thể trưởng thành, khỏe mạnh, đã tham gia sinh sản trong quần thể, thu tại hiện trường được cố định ngay bằng cồn 70o theo tỉ lệ tôm: cồn = 1: 3. Mẫu được thu bằng cách dùng vợt vớt ngẫu nhiên ít nhất tại 5 vị trí khác nhau ở cùng một bể giống và mỗi cá thể tôm sú chọn lấy 1 chân bơi (có cả phần vây và phần thịt), sau đó cho chân bơi vào từng eppendorf 1,5 ml riêng biệt có chứa sẵn cồn 70o và được đánh kí hiệu tên cụ thể cho từng con, đem lưu giữ mẫu trong tủ lạnh phòng thí nghiệm. 2.3.2. Phương pháp ly trích DNA tổng số Tách chiết DNA dựa vào quy trình tách chiết DNA Salt extraction (Miller và cộng sự, 1988). 33 Đồ án tốt nghiệp Mẫu chân bơi Cắt nhỏ mẫu cho vào efpendorf 1,5 ml 5µl Protein K + 500µl dung dịch 1 và lắc mạnh Ủ 550C trong 2 giờ hoặc qua đêm ở 37oC Để lạnh 10 phút và hút 250 µl dung dịch 2 Để lạnh 5 phút rồi Ly tâm 8000 vòng/phút trong 15 phút (bỏ cặn) Thu 500 µl dịch nổ i và thêm 1 ml ethanol 100% để lạnh sau đó ủ - 4oC /2 giờ Ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút (bỏ dịch) Hút 500 µl ethanol 70% lạnh Ly tâm 11000 vòng/phút trong 5 phút (bỏ dịch) Làm khô tủa bằng block heater ở 50oC và cho 100 µl dung dịch TE Dung dịch DNA Hình 2.2. Quy trình tách chiết DNA Salt extraction Hóa chất: dung dịch 1 (50 mM Tris HCl pH 8, 20 mM EDTA pH 8, 2% SDS); dung dịch 2 (saturated NaCl solution 6 M). 34 Đồ án tốt nghiệp Sử dụng mẫu chân bơi có kích thước xấp xỉ 5 x 5 mm. Rửa trong STE hoặc GTE nếu cần (nếu mẫu được cất giữ trong một khoảng thời gian dài trong cồn hoặc dung dịch DMSO). Tiến hành ly trích DNA bằng cách cắt nhỏ mẫu chân bơi cho vào eppendorf 1,5 ml và thêm 500 µl dung dịch 1. Sau đó, thêm 5 µl proteinase K, vortex nhanh. Ủ các eppendorf trên ở 55oC trong 2 giờ (hoặc qua đêm ở nhiệt độ phòng). Sau 2 giờ (qua đêm), các eppendorf được chuyển sang để lạnh 10 phút. Tiếp theo, thêm 250 µl dung dịch 2 và trộn đều dung dịch, để lạnh 5 phút. Sau 5 phút, tiến hành ly tâm 8000 vòng/phút trong vòng 15 phút. Sau khi ly tâm, cẩn thận thu 500 µl dịch trong tránh cặn cho vào eppendorf 1,5 ml mới có dán nhãn, thêm 1000 µl Ethanol tuyệt đối được giữ lạnh. Sau đó, các eppendorf mới này được giữ lạnh ở - 4oC trong 2 giờ. Sau 2 giờ, tiến hành ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút. Sau khi ly tâm, tiến hành loại bỏ dịch nổi và rửa DNA trong eppendorf với 500 µl Ethanol 70%. Tiếp tục ly tâm 11000 vòng/phút trong 5 phút. Cẩn thận loại bỏ dịch nổi và làm khô eppendorf bằng máy gia nhiệt ở 55oC hoặc để qua đêm ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng, thêm 50 - 200 µl TE (nước cất vô trùng) vào mỗi eppendorf (trung bình là 100 µl). Dán nhãn và bảo quản lạnh - 25oC. Quy trình ly trích DNA đạt hiệu quả nhờ sử dụng Protinase K và dung dịch 1 có vai trò như một dung dịch đệm gồm: Tris HCl, EDTA, SDS, phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường, phân hủy các protein liên kết với DNA. Đồng thời, việc sử dụng hai lần Ethanol 70% và 100% cho hiệu quả rửa giải và loại bỏ tạp chất cao, hiệu quả kết tủa DNA cao, không bị lẫn tạp và nồng độ đủ lớn đảm bảo cho phản ứng PCR diễn ra. 2.3.3. Phương pháp kiểm tra độ tinh sạch và định lượng DNA Sau khi tách chiết DNA tiến hành kiểm tra độ tinh sạch và xác định hàm lượng của DNA bằng máy đo quang phổ (SmartSpec Plus - Bio rad). Hút 5 µl dung dịch DNA sau khi tách chiết pha loãng với 495 µl nước cất để đạt độ pha loãng là 100 lần. Sau khi pha loãng tiến hành cho mẫu vào cuvet và đưa vào máy đo quang phổ, chỉnh bước sóng 260/280 nm, đợi máy hiển thị và đọc kết quả. Máy đo quang 35 Đồ án tốt nghiệp phổ sẽ hiển thị hai kết quả là tỷ lệ giữa bước sóng 260/280 nm và số OD 260 nm để tính hàm lượng DNA. Nếu tỷ lệ bước sóng 260/280 nm nằm trong khoảng 1,8 - 2 thì DNA được xem là không bị lẫn tạp chất đủ tiêu chuẩn để sử dụng cho các thí nghiệm sau. Xác định hàm lượng DNA để tiến hành pha loãng DNA thành hàm lượng mong muốn để tiến hành các thí nghiệm tiếp. 2.3.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) là kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E.coli hay nấm men. Ưu và nhược điểm của kỹ thuật PCR. Ưu điểm: Cho kết quả nhanh, nhạy, chỉ cần một lượng nhỏ DNA là có thể thực hiện được. Nhược điểm: Do quá nhạy nên kỹ thuật PCR có thể cho kết quả dương tính giả. Trong một số trường hợp vi sinh vật gây bệnh đã chết hoặc chưa đủ lượng gây bệnh thì phản ứng PCR vẫn cho kết quả dương tính. Nguyên tắc: Phương pháp PCR dựa trên nguyên tắc của một phản ứng sinh hóa: tổng hợp nhiều bản sao DNA từ trình tự DNA xác định nhờ enzyme. Một phản ứng khuếch đại đặc trưng bao gồm: trình tự DNA cần quan tâm, một enzyme tổng hợp DNA chịu nhiệt, hai đoạn nucleotid mồi, 4 loại deoxynucleotide triphosphate (dNTP), dịch đệm cho phản ứng và magnesium. Các thành phần phản ứng nói trên được trộn đều và phản ứng được đặt vào máy luân nhiệt. Máy luân nhiệt kiểm soát phản ứng thông qua một chuỗi các nhiệt độ khác nhau trong những lượng thời gian khác nhau. Sự hài hòa giữa chuỗi nhiệt độ và thời gian do các bước trong chu kỳ khuếch đại quyết định. Hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn do các enzyme tổng hợp DNA (DNA Polymerase) với sự hiện diện của những mồi chuyên biệt thực hiện. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. DNA polymerase đến, gắn vào và nối dài mồi để hình thành 36 Đồ án tốt nghiệp mạch mới. Nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt gắn vào hai đầu của một trình tự DNA quan tâm, ta sẽ tổng hợp được đoạn DNA nằm giữa hai mồi, một mồi xuôi (sense primer) và mồi ngược (antisense primer). Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR: Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR bao gồm: DNA mẫu, taq polymerase, mồi, nhiệt độ lai, dNTP, MgCl2, số chu kì của phản ứng PCR. Mẫu DNA: Mẫu DNA được ly trích từ nhiều bộ phận khác nhau của đối tượng nghiên cứu bằng nhiều phương pháp khác nhau. Trong kỹ thuật PCR, yêu cầu về độ tinh sạch của DNA mẫu không cần cao. Tuy nhiên để thu được kết quả tốt nhất nên sử dụng DNA mẫu thực sự tinh khiết. Số lượng DNA cần cho một phản ứng PCR khoảng 5 - 10 ng DNA thuần khiết. Mồi (Primer): Là một đoạn acid nucleid có trình tự liên kết đặc hiệu với đoạn DNA cần khuếch đại. Phản ứng PCR sử dụng một cặp primer đặc hiệu bao gồm F - primer (mồi xuôi) và R - primer (mồi ngược). Cặp primer quyết định sự thành công của kỹ thuật PCR. Mồi phải đạt được sự khuếch đại đặc trưng, chuyên biệt và cho hiệu quả cao. Để đạt được các chỉ tiêu trên mồi phải đạt được các đặc điểm sau: - Mồi được tổng hợp hóa tự động, khoảng 18 - 24 base. - Mồi xuôi và mồi ngược không bắt cặp với nhau. - Nhiệt độ nóng chảy của mồi xuôi và mồi ngược không quá chênh lệch. - Khi sử dụng enzyme thông dụng như hiện nay (Taq polymerase) trình tự nằm giữa hai mồi là không quá lớn (>3 kb). Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lập lại trên gien. Nồng độ Mg 2+: cũng là nhân tố ảnh hưởng lớn đến quá trình PCR, Mg2+ cần cho DNA polymerase chức năng, nếu nồng độ Mg2+ thấp thì không được hoạt hóa thành công, nồng độ Mg2+ cao làm phản ứng PCR mất tính đặc hiệu và quá nhiều sản phẩm tạo ra. Không có quy luật chung cho nồng độ Mg2+ trong phản ứng PCR. Do đó, nồng độ Mg2+ phải được xác định cho từng phản ứng qua các thử nghiệm. 37 Đồ án tốt nghiệp dNTP: thường sử dụng trong khoảng 20 - 200 µM/ mỗi loại nucleotide. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “kí sinh”. Ngoài ra, theo kết quả tham khảo từ nghiên cứu của các tác giả Muhammad, Barry Jaquish và Khasa, các yếu tố: nồng độ mồi, Taq polymerase khá ổn định và việc tăng các yếu tố trên cũng không làm tăng chất lượng của phản ứng PCR. Đối với điện di cũng cần khảo sát nồng độ phần trăm (%) agarose, hiệu điện thế và thời gian thích hợp để sản phẩm khuếch đại và thang phân tách rõ ràng. Từ những vấn đề nêu trên, yếu tố nhiệt độ bắt cặp, nồng độ MgCl2 và hàm lượng DNA khuôn được chọn để tiến hành tối ưu hoá phản ứng PCR. Quy trình PCR: PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kỳ (cycle) kế tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 giai đoạn: giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp và giai đoạn kéo dài. Hình 2.3. Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR (1) Đầu tiên nhiệt độ sẽ được đưa lên 94oC, ở nhiệt độ này các liên kết hydro của mạch DNA sẽ bị mất đi, nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành các mạch đơn, giai đoạn nhiệt độ này được gọi là giai đoạn biến tính. 38 Đồ án tốt nghiệp (2) Kế đó nhiệt độ sẽ được hạ đến 55 - 65oC là nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi tìm đến cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích, giai đoạn nhiệt độ này được gọi là giai đoạn bắt cặp. (3) Cuối cùng, nhiệt độ được đưa lên 72oC là nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của enzyme Taq polymerase để kéo các dNTP lại đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích để bắt nguồn cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung. Như vậy qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản sao và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 - 40 lần thì từ một DNA đích đã nhân bản được thành 230 đến 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao. Tiến hành kiểm tra tính hoạt động của 19 cặp mồi microsatellite và tối ưu hóa các phản ứng PCR cho chỉ thị microsatellite bằng cách chọn ngẫu nhiên 4 mẫu DNA (AA4, TT1, GT3, NG12), trong 28 mẫu đã ly trích (AA4, AA6, AG5, AG7, AN3, AN4, AT4, AT6, GA6, GG7, GN8, GT3, GT4, NA9, NA10, NG12, NG13, NN6, NT5, NT6, TT1, TT6, TA3, TA4, TN2, TN3, TG2, TG3) để chạy phản ứng PCR với 4 mẫu đã chọn lọc theo gradient nhiệt độ bắt cặp, nồng độ MgCl2 và hàm lượng DNA mạch khuôn để kiểm tra hoạt động của các cặp microsatellite. Đồng thời, phân tích và chọn ra nhiệt độ bắt cặp, nồng độ MgCl2 và hàm lượng DNA mạch khuôn phù hợp cho các cặp mồi microsatellite để phản ứng PCR đạt điều kiện ổn định hơn. Tiếp theo thực hiện phản ứng PCR với 28 mẫu DNA ly trích ở nhiệt độ, nồng độ MgCl2, và hàm lượng DNA mạch khuôn tối ưu đã chọn ra cho các cặp mồi microsatellite. Từ đó đánh giá tính ổn định của phản ứng PCR, sàng lọc chọn ra các cặp mồi cho tỉ lệ khuếch đại sản phẩm cao và đa hình cao. 2.3.4.1. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite Để cho cặp mồi có thể bắt cặp một cách hoàn toàn đặc hiệu trên sợi DNA khuôn thì phải duy trì giai đoạn bắt cặp của chu kỳ nhiệt ở nhiệt độ tối ưu cho sự bắt cặp của mồi, gọi là nhiệt độ bắt cặp (Ta). Vì vậy việc khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi là cần thiết để phản ứng PCR. 39 Đồ án tốt nghiệp Đề tài sử dụng 19 cặp mồi Microsatellite đặc hiệu cho loài tôm sú từ ba nhóm tác giả (Li và cộng sự, 2007; Pan và cộng sự, 2004; Wuthi và cộng sự, 2003), đã khảo sát và công bố nhiệt độ tối ưu cho từng cặp mồi. Tuy nhiên đề tài này được thực hiện ở điều kiện hóa chất, máy luân nhiệt.v.v Khác với điều kiện mà ba nhóm tác giả thực hiện, vì vậy việc khảo sát lại nhiệt độ bắt cặp cho các cặp mồi từ nhiệt độ tối ưu của ba tác giả đã đưa ra là cần thiết để phù hợp với điều kiện hóa chất, máy luân nhiệt của phòng thí nghiệm mà đề tài thực hiện. Bảng 2.3. Gradient nhiệt độ lai cho từng cặp mồi microsatellite Dãy nhiệt độ khảo sát. Nhóm 1 2 3 4 5 6 7 8 tác giả Nhiệt độ tối ưu (theo tác giả) Wuthi 55oC 58,5 58,2 57,5 56,4 54,9 53,8 53,0 52,5 (2003) Pan 52oC 55,0 54,6 53,8 52,5 50,8 49,5 48,6 48,0 (2004) 56oC 61,0 60,7 60,0 58,9 57,4 56,3 55,5 55,0 Li 60oC 64,0 63,6 62,7 61,2 59,1 57,7 56,7 56,0 (2007) 40 Đồ án tốt nghiệp 2.3.4.2. Khảo sát nồng độ MgCl2 Đối với nồng độ MgCl2, tiến hành thay đổi thể tích MgCl2 trong khoảng 1 - 3 µl với nồng độ gốc của MgCl2 là 25 mM, được thể hiện trong bảng 2.4. Bảng 2.4. Nồng độ MgCl2 khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite Phản ứng 1 2 3 4 5 Thể tích MgCl2 (µl) 1 1,5 2 2,5 3 Nồng độ MgCl2 (mM) 1,25 1,875 2,5 3,125 3,75 Phản ứng được tiến hành trên máy luân nhiệt iCycle (Bio - rad) đã được cài đặt sẵn chu trình nhiệt. Các thành phần phản ứng PCR là không đổi, chỉ thay đổi thể tích MgCl2 tương ứng với nồng độ MgCl2 gốc, hiệu chỉnh thể tích H2O sao cho tổng thể tích của phản ứng PCR là 20 µl/1 phản ứng. 2.3.4.3. Khảo sát hàm lượng DNA khuôn Hàm lượng DNA quá cao hay quá thấp cũng ảnh hưởng đến sản phẩm khuếch đại PCR. Hàm lượng DNA quá cao sẽ làm cho khuếch đại “kí sinh” tạo những sản phẩm phụ không muốn, hàm lượng quá thấp thì sản phẩm sau khi khuếch đại sẽ mờ và không được rõ (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997). Vì vậy tiến hành khảo sát hàm lượng DNA là cần thiết để phản ứng PCR được tối ưu. Bảng 2.5. Hàm lượng DNA khuôn khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite Phản ứng 1 2 3 4 Thể tích DNA (µl) 0,5 1,0 1,5 2,0 Hàm lượng DNA khuôn trong 20 µl thể tích phản ứng (ng) 25 50 75 100 Phản ứng được tiến hành trên máy luân nhiệt iCycle (Bio - rad ) đã được cài đặt sẵn chu trình nhiệt. Các thành phần phản ứng PCR là không đổi, chỉ thay đổi thể tích của phản ứng là 20 µl/l phản ứng. 41 Đồ án tốt nghiệp 2.3.4.4. Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite sau khi đã tối ưu các yếu tố nhiệt độ bắt cặp, nồng độ Mg2+ và nồng độ DNA Sau khi đã có kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các mồi, nồng độ Mg2+ tối ưu và hàm lượng DNA tối ưu cho mỗi cặp mồi của phản ứng PCR, tiếp tục thực hiện phản ứng PCR của các cặp mồi microsatellite đặc trưng cho loài tôm sú trên 28 mẫu DNA (AA4, AA6, AG5, AG7, AN3, AN4, AT4, AT6, GA6, GG7, GN8, GT3, GT4, NA9, NA10, NG12, NG13, NN6, NT5, NT6, TT1, TT6, TA3, TA4, TN2, TN3, TG2, TG3) nhằm tiếp tục kiểm tra độ hoạt động của primer microsatellite, kiểm tra tính ổn định của phản ứng sau khi đã tối ưu hóa. Phản ứng PCR cho từng cặp mồi được tiến hành trên các Plates 96 well PCR và thực hiện trên thiết bị luân nhiệt PCR iCycle (Bio - rad). Tổng thể tích cho mỗi phản ứng là 20 µl, bao gồm các thành phần: buffer, dNTP, primer, Taq polymerase, MgCl2, DNA khuôn và nước cất 2 lần tiệt trùng, nồng độ và thể tích của từng thành phần được thể hiện dưới bảng 2.6. Bảng 2.6. Thành phần buffer, dNTP, cặp mồi Microsatellite (Primer), DNA, Taq polymerase cho một phản ứng PCR. Thành phần Thể tích (µl) PCR buffer 10 X 2,5 dNTP 10 mM 1 MgCl2 25 mM Nồng độ tối ưu Forward Primer 10 µM 1 Reverse Primer 10 µM 1 Taq polymerase 5 U/µl 0,25 DNA khuôn 50 ng/µl Hàm lượng tối ưu 42 Đồ án tốt nghiệp Nước cất 2 lần tiệt trùng Định mức đủ 20 Phản ứng PCR được thực hiện trong máy luân nhiệt PCR iCycle (Bio - rad) với chu kỳ nhiệt. Hình 2.4. Chu trình nhiệt của máy PCR sau khi tối ưu nhiệt độ bắt cặp mồimicrosatellite 2.3.5. Phương pháp điện di 2.3.5.1. Điện di trên Agarose Điện di là kỹ thuật dùng để phân tích và tinh sạch các đại phân tử đặc biệt là protein và các nucleic acid trên cơ sở kích thước, khối lượng, điện tích và cấu hình của chúng. 43 Đồ án tốt nghiệp Hình 2.5. Điện di trên Agarose Nguyên tắc: Dựa vào sự tích điện nhất định và khối lượng khác nhau của các phân tử protein hay nucleic nên khi đặt chúng trong một điện trường chúng sẽ di chuyển. Các phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm, các phân tử có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn. Nhờ có chất nhuộm thích hợp như ethidium bromide và quan sát dưới tia UV mà có thể biết được vị trí các phân tử trên gel. Các bước thực hiện gel: Đổ gel agarose: Chuẩn bị lượng agarose và dung dịch điện đệm thích hợp  Gia nhiệt cho đến khi agarose tan...te dao động từ 3 - 5 alen. Các cặp mồi microsatellite được chọn để đánh giá biến dị di truyền cho các quần thể đòi hỏi các cặp mồi đó phải có tính đa hình cao (các cặp mồi có từ 5 alen trở lên). Vì vậy các cặp mồi microsatellite W10, W2, W6, P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, L1, L2, L3, L4, L5 là phù hợp cho việc phân tích đánh giá biến dị di truyền của quần thể. Tuy nhiên, trong phân tích di truyền nếu xuất hiện quá nhiều null alleles sẽ ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Vì thế ngoài tính đa hình cao thì hiệu suất PCR của các cặp mồi cũng ảnh hưởng tới kết quả phân tích di truyền. Từ đó chọn ra các cặp mồi vừa có tính đa hình cao (có 5 alen trở lên) vừa đạt hiệu suất PCR lớn như các cặp mồi W2, W10, L1, L3, L4, P1, P2, P4, P5, P7 để tiếp tục phân tích, đánh giá biến dị di truyền cho 69 gia đình mẫu tôm sú trên 16 phép phối nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho chương trình chọn giống tôm sú quốc gia. 3.5.2. Sàng lọc các các cặp mồi Microsatellite Mục đích sàng lọc là chọn ra các cặp mồi có tính đa hình cao và kết hợp đồng thời chỉ số hiệu suất PCR. Dựa vào bảng 3.5 nhóm nghiên cứu đã chọn ra 10 cặp mồi cho kết quả đa hình cao nhất tiếp tục phân tích hàng loạt trên 69 gia đình mẫu DNA tôm sú để phân tích biến dị di truyền của 16 phép phối. Kết quả minh họa được thể hiện trong hình 3.12, hình 3.13 và hình 3.14 dưới đây: 62 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.12. Khảo sát tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi Microsatellite L1 Hình 3.13. Khảo sát tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi Microsatellite P4 63 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.14. Khảo sát tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi Microsatellite P1 Từ kết quả ở hình 3.12, hình 3.13 và hình 3.14, các vạch PCR đều sáng và rõ nét, không có hiện tượng bị nhòe và tạo sản phẩm phụ nhiều, cho thấy tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite ổn định. Các kết quả về nhiệt độ bắt cặp tối ưu, nồng độ MgCl2 tối ưu và hàm lượng DNA tối ưu góp phần ổn định phản ứng PCR. 3.6. Khảo sát đa dạng di truyền của mƣời sáu phép phối tôm sú đàn con phân tích. 3.6.1. Tính đa dạng di truyền của mười sáu phép phối tôm sú đàn con Tính đa dạng di truyền được đánh giá qua các chỉ số như: giá trị đa hình các alen trên locus (Na), dị hợp tử phát hiện (Ho), dị hợp tử mong đợi (He), phong phú alen (Ar), thông tin đa hình (Polymorphic Information Content - PIC) và cân bằng di truyền Hardy - Weinberg. Sau khi xử lý bằng phần mềm Cevus và phần mềm Fstat thì các chỉ số trên được trình bày ở bảng 3.6 như sau. Bảng 3.6. Đặc điểm đa dạng di truyền chung trên microsatellite của 16 tổ hợp tôm sú đàn con trong nghiên cứu. Locus Na Ho He PIC Ar HWE P1 4 0,371 0,701 0,646 3,637 *** P2 3 0,242 0,608 0,530 2,865 *** P4 5 0,210 0,600 0,525 4,137 *** 64 Đồ án tốt nghiệp P5 4 0,215 0,651 0,582 3,861 *** P7 3 0,074 0,520 0,430 2,865 *** W2 4 0,244 0,734 0,688 3,199 *** W10 3 0,303 0,741 0,698 2,484 *** L1 3 0,272 0,563 0,500 2,860 *** L3 3 0,285 0,613 0,536 2,800 *** L4 4 0,153 0,574 0,511 3,026 *** Trung bình 3,6 ± 0,7 0,24 ±0,08 0,63 ±0,07 0,56 ±0,09 3,17±0,53 Chú thích: ***: Không cân bằng di truyền Hardy - Weinberg với mức ý nghĩa sau khi hiệu chuẩn với Bonferroni p < 0,0042, số lượng alen trên locus (Na), dị hợp tử phát hiện (Ho), dị hợp tử mong đợi (He, thông tin đa hình (Polymorphic Information Content - PIC, phong phú alen (Ar). Có thể thấy ở bảng 3.6 giá trị về số lượng alen trên locus (Na), hệ số dị hợp tử phát hiện (Ho), hệ số dị hợp tử mong đợi (He), thông tin đa hình (Polymorphic Information Content - PIC), phong phú alen (Ar) và giá trị alen trung bình trên mỗi locus không có nhiều biến động giữa 16 phép phối trên mẫu tôm sú phân tích. Trên tổng số mẫu phân tích, với 10 microsatellite loci khảo sát cho kết quả 36 alen. Đa phần các locus đều thể hiện tính đa hình, Na dao động từ 3 - 5 alen trong đó chỉ có locus P4 đạt mức trung bình (5 alen), các locus còn lại dao động từ 3 - 4 alen (P1, P2, P5, P7, W2, W10, L1, L3, L4), trung bình số alen của 10 microsatelite loci là 3,6 ± 0,7; chỉ số này thấp hơn so với số alen trung bình mà các tác giả trước khảo sát là 9,6 ± 0,6 (Li và cộng sự, 2007). Giá trị đa hình các alen trên locus được so sánh trong đồ thị hình 3.15 sau: 65 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.15. Đồ thị so sánh giá trị đa hình các alen trên mỗi locus Chỉ số thông tin đa hình (PIC) có giá trị trung bình là 0,565 ± 0,09 - chỉ số này đánh giá thông tin đa hình chung của từng locus, nhìn chung thì giá trị này tương đối đồng đều trên 10 microsatellite loci khảo sát và cũng đạt giá trị ở mức trung bình. Hệ số dị hợp tử phát hiện (Ho) phân bố không đồng đều trong khoảng giá trị thấp nhất 0,07 (locus P7) đến cao nhất ở giá trị 0,371 (locus P1). Hai giá trị dị hợp tử phát hiện của hai locus này mặc dù đã được hiệu chỉnh lại theo trên cơ sở đánh giá sự hiện diện của các số alen trơ (null alleles) nhưng chỉ số cũng không được cải thiện nhiều nên có thể những giá trị quá cao hoặc quá thấp như vậy ở những locus này hoặc cần được thay thế bởi locus có các giá trị đa dạng di truyền tốt hơn trong phân tích sau này hoặc phải khảo sát thêm mẫu nếu cần thiết. Bảng 3.6 cho thấy hệ số dị hợp tử mong đợi (He) tương đối đồng đều giữa 10 microsatellite loci với khoảng giá trị 0,520 - 0,741. 66 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.7. Biến động hệ số dị hợp tử mong đợi (He) của 16 tổ hợp tôm sú đàn con Locus P1 P2 W2 W10 P4 P5 P7 L1 L3 L4 Tổ hợp AA 0,645 0,586 0,798 0,624 0,301 0,663 0,661 0,594 0,653 0,159 AT 0,659 0,563 0,737 0,741 0,475 0,562 0,484 0,588 0,500 0,522 AN 0,739 0,571 0,748 0,634 0,624 0,731 0,575 0,510 0,632 0,384 AG 0,531 0,322 0,709 0,764 0,468 0,636 0,437 0.539 0,581 0,510 GG 0,530 0,644 0,674 0,572 0,000 0,300 0,485 0,341 0,000 0,295 GA 0,111 0,691 0,727 0,595 0,530 0,583 0,530 0,446 0,556 0,614 GT 0,572 0,248 0,778 0,722 0,000 0,496 0,471 0,462 0,540 0,552 GN 0,300 0,159 0,697 0,750 0,000 0,523 0,409 0,289 0,576 0,621 NN 0,634 0,548 0,667 0,717 0,586 0,585 0,842 0,841 0,650 0,142 NA 0,630 0,299 0,609 0,607 0,431 0,507 0,540 0,484 0,545 0,312 NG 0,615 0,339 0,743 0,706 0,498 0,603 0,562 0,461 0,567 0,614 NT 0,591 0,667 0,732 0,482 0,663 0,631 0,401 0,575 0,503 0,066 TT 0,715 0,480 0,724 0,544 0,682 0,567 0,474 0,595 0,602 0,490 TA 0,727 0,120 0,554 0,689 0,632 0,594 0,236 0,322 0,595 0,694 TN 0,299 0,255 0,589 0,657 0,636 0,683 0,431 0,505 0,674 0,475 TG 0,528 0,517 0,522 0,721 0,650 0,560 0,466 0,324 0,561 0,630 Ta thấy ở bảng 3.7 giá trị biến động hệ số dị hợp tử mong đợi của 16 tổ hợp tôm sú đàn con được dao động trong khoảng 0,547. Tuy nhiên trong đó có 4 tổ hợp phối của nhóm mẫu có con mẹ gốc Gia hóa thì chỉ số đa dạng gien thấp hơn, trung bình khoảng 0,451. 67 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.8. Chỉ số phong phú alen (Allelic richness) Locus P1 P2 W2 W10 P4 P5 P7 L1 L3 L4 Tổ hợp AA 3,311 2,804 4,605 3,183 1,927 3,498 2,969 2,737 2,951 1,691 AT 2,968 2,775 4,117 3,759 1,998 2,694 1,999 2,909 2,765 2,000 AN 3,850 2,600 4,286 3,167 2,908 3,760 2,851 2,803 2,952 1,979 AG 2,362 2,410 3,682 3,891 1,998 3,212 2,342 2,853 2,729 2,000 GG 2,754 2,891 3,521 2,500 1,000 2,000 1,999 1,981 1,000 1,953 GA 1,667 2,971 2,998 2,947 2,000 2,760 2,754 2,000 2,849 2,761 GT 2,562 1,887 3,940 3,804 1,000 3,273 1,998 2,661 2,874 2,863 GN 2,000 1,761 3,761 3,752 1,000 2,754 1,993 2,453 2,500 2,947 NN 2,924 2,867 4,002 3,751 2,887 2,736 1,998 2,416 2,960 1,725 NA 2,954 2,367 3,126 3,322 1,992 2,000 2,440 1,999 2,835 1,994 NG 2,882 2,466 4,309 3,587 2,787 2,910 2,525 2,512 2,561 2,888 NT 2,754 2,960 3,945 2,196 2,960 2,885 2,325 2,699 2,616 1,363 TT 3,745 2,659 3,972 2,729 2,988 3,144 1,997 2,891 2,806 3,063 TA 3,837 1,587 2,441 3,540 2,918 2,902 2,139 1,952 2,908 3,582 TN 2,283 1,887 3,842 3,594 2,886 2,988 1,992 2,579 2,971 2,973 TG 2,776 2,619 2,000 3,654 2,930 2,441 2,658 1,952 2,892 2,871 Giá trị phong phú alen (Ar) trung bình của AN (Ấn Độ Dương tổ hợp phối với Nội Địa) ở bảng 3.8 là 3,116 chúng tôi nhận thấy giá trị này lớn hơn so giá trị phong phú alen trung bình của 15 tổ hợp còn lại lần lượt là 2,778 (AT), 2,968 (AA), 2,748 (AG), 2,156 (GG), 2,571 (GA), 2,686 (GT), 2,492 (GN), 2,827 (NN), 2,503 (NA), 2,943 (NG), 2,670 (NT), 2,999 (TT), 2,781 (TA), 2,699 (TN), 2,679 (TG). Chỉ số Ar được xác định bằng cách chuẩn hóa biến dị alen về nhóm mẫu có số lượng thấp nhất. Đối 68 Đồ án tốt nghiệp với bảng 3.6 chỉ số trung bình alen phong phú ở 10 microsatelite loci là 3,17 ± 0,53 - nhận thấy rằng giá trị trung bình phong phú alen thấp hơn giá trị trung bình alen gần một đơn vị. Như vậy, có thể căn cứ vào chỉ số Ar ta thấy trong bốn nhóm thực hiện phép phối thì nhóm mẫu có con mẹ gốc là Ấn Độ Dương có giá trị alen phong phú cao nhất nhưng giá trị alen phong phú ở con mẹ có nguồn gốc Gia Hóa lại có giá trị thấp. Đồng thời dựa vào Ar để nhận xét các microsatellite khảo sát chưa cho tính đa hình cao trong nghiên cứu. Ví dụ: ở locus P4, P5 mặc dù kết quả băng hình cho thấy hai locus này có số lượng alen tương ứng là 5 và 4 alen nhưng giá trị alen thực sự thấp hơn chỉ 4,137 và 3,861 (bảng 3.6). Tuy nhiên, giá trị số lượng alen trên một locus trong khảo sát này cũng gần với kết quả của các nghiên cứu có liên quan của hai nhóm tác giả (Hà Phước Hùng và cộng sự, 2008: Ar = 4,1 - 5,06). 3.6.2. Kiểm tra cân bằng Hardy - Weinberg Kiểm định chính xác Fisher về sự cân bằng di truyền của từng locus thể hiện ở bảng 3.6, nhóm nghiên cứu nhận thấy tất cả các locus ở 16 tổ hợp đàn con tôm sú đều có sự thiếu hụt dị hợp tử mong đợi có ý nghĩa (p < 0,05) căn cứ vào giá trị dị hợp tử quan sát (Ho) và dị hợp tử mong đợi (He). Cụ thể, giá trị Ho trung bình của P1 là 0,371 và của L1 là 0,272; giá trị He trung bình P1là 0,701 và L1 là 0,563. Giá trị dị hợp tử quan sát (Ho) thấp hơn so với dị hợp tử mong đợi (He) trong 16 tổ hợp đàn con tôm sú. Kết quả lệch khỏi cân bằng Hardy - Weinberg có thể do lỗi chưa phân tích trên gel cartrige có độ phân giải cao để phát hiện các alen có kích thước khác biệt nhỏ dẫn đến có nhiều cá thể đồng hợp tử hay dị hợp tử. 3.6.3. Sự khác biệt di truyền của các phép phối trong mẫu phân tích Giá trị Fst thể hiện sự khác biệt di truyền của 16 tổ hợp đàn con tôm sú. Nếu Fst < 0,05 được cho là sai khác nhỏ; 0,05 < Fst < 0,15 là giá trị sai khác trung bình; Fst > 0,15 là sai khác lớn (Nei, 1978). 69 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.9. Giá trị Fst được phân tích các tổ hợp tôm sú đàn con AG GG GN NN NG TT TN TG 0,1244 0,3246 0,1780 0,0805 0,1168 0,0931 0,2119 0,1965 A *(P<0,0 *(P<0, *(P<0,0 *(P<0,0 *(P<0,0 *(P<0, *(P<0,0 *(P<0,0 A 0042) 00042) 0042) 0042) 0042) 00042) 0042) 0042) 0,0510 0,1763 0.2144 0,0918 0,0670 0,0860 0,1921 0,1277 A NS(P<0, *(P<0, *(P<0,0 *(P<0,0 *(P<0,0 *(P<0, *(P<0,0 *(P<0,0 T 00042) 00042) 0042) 0042) 0042) 00042) 0042) 0042) 0,0873 0,1654 0,1735 0,1574 0,0932 0,1121 0,1540 0,1047 A *(P<0,0 *(P<0, *(P<0,0 *(P<0,0 *(P<0,0 *(P<0, *(P<0,0 *(P<0,0 N 0042) 00042) 0042) 0042) 0042) 00042) 0042) 0042) 0,0000 0,2068 0,2244 0,0700 0,0385 0,0405 0,1635 0,1090 A *(P<0, *(P<0,0 *(P<0,0 *(P<0,0 *(P<0, *(P<0,0 *(P<0,0 G 00042) 0042) 0042) 0042) 00042) 0042) 0042) 0,0000 0,4145 0,2766 0,2224 0,2106 0,3252 0,2165 G NS(P<0, *(P<0,0 *(P<0,0 *(P<0, *(P<0,0 *(P<0,0 G 00042) 0042) 0042) 00042) 0042) 0042) 0,1939 0,1817 0,1619 0,1121 0,1652 0,0936 G NS(P<0, *(P<0,0 NS(P<0, *(P<0, *(P<0,0 NS(P<0, A 00042) 0042) 00042) 00042) 0042) 00042) 0,2774 0,2276 0,2345 0,2050 0,1948 0,1071 G *(P<0,0 NS(P<0, *(P<0,0 *(P<0, *(P<0,0 *(P<0,0 T 0042) 00042) 0042) 00042) 0042) 0042) 70 Đồ án tốt nghiệp 0,0000 0,1488 0,1575 0,2113 0,1889 0,1590 G (P<0,00 NS(P<0, *(P<0, NS(P<0, NS(P<0, N 042) 00042) 00042) 00042) 00042) 0,0000 0,0268 0,0695 0,1370 0,1235 N NS(P<0, *(P<0, *(P<0,0 *(P<0,0 N 00042) 00042) 0042) 0042) 0,0936 0,1039 0,2279 0,1766 N *(P<0,0 *(P<0, *(P<0,0 *(P<0,0 A 0042) 00042) 0042) 0042) 0,0000 0,0738 0,1429 0,1036 N *(P<0, *(P<0,0 *(P<0,0 G 00042) 0042) 0042) 0,0583 0,1719 0,1787 N *(P<0, *(P<0,0 *(P<0,0 T 00042) 0042) 0042) 0,0000 0,1321 0,1049 T *(P<0,0 *(P<0,0 T 0042) 0042) 0,0000 0,0713 T *(P<0,0 N 0042) Chú thích: *: Mức ý nghĩa sau khi hiệu chuẩn với Bonferroni P < 0,00042, 71 Đồ án tốt nghiệp NS: không khác biệt có ý nghĩa. Sai khác di truyền của 16 tổ hợp tôm sú đàn con được liệt kê theo bảng 3.9. Hầu hết các phép phối đều có giá trị khác biệt với nhau, Fst của các phép phối có cùng mẹ có giá trị sai khác di truyền < 15% cụ thể: AA với AG (cùng con mẹ là Ấn Độ Dương) hay NN với NG (cùng con mẹ là Nội Địa) có sự sai khác lần lượt là 0,1244 (12,44%) và 0,0268 (2,68%) với P < 0,00042. Giá trị Fst các phép phối nhóm con mẹ của Ấn Độ Dương, Nội Địa và Thái Bình Dương cũng nằm trong mức sai khác nhỏ < 15% cụ thể: AT với AG (cùng con mẹ là Ấn Độ Dương), NA với NG ( cùng con mẹ là Nội Địa) và TN với TG (cùng con mẹ là Thái Bình Dương) có sự sai khác lần lượt là: 0,0510 (5,1%), 0,0936 (9,36%), 0,0713 (7,13%) với P < 0,00042. Tuy nhiên, nhóm phép phối thuần của mẹ và bố Gia Hoá thì chỉ số sai khác di truyền của nó với các phép phối khác khá cao từ 17 - 41% cụ thể: GG ( con bố và mẹ là Gia Hóa) với GN, GG với TN và AN với GG có sự sai khác lần lượt là: 0,4145 (41,45%), 0,3252 (32,52%), 0,1654 (16,54%) với P < 0,00042. Các phép phối còn lại có nguồn gốc từ con mẹ Gia Hóa cũng có chỉ số sai khác di truyền với các phép phối khác là cao > 15% cụ thể: GA (có mẹ là Gia Hóa) với NN, GN với TN có sự sai khác lần lượt là 0,1817 (18,17%), 0,1889 (18,89%) với P < 0,00042. 72 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Bảng 4.1. Kết quả khảo sát về nhiệt độ bắt cặp tối ưu, nồng độ MgCl2 và nồng độ DNA cho 10 cặp mồi microsatellite Hàm lượng DNA o Tên mồi Nồng độ MgCl2 khuôn (ng) trong 20 Nhiệt độ ( C) (mM) µl thể tích phản ứng PCR P1 1,875 75 57,4 P2 1,875 75 57,4 P4 1,875 75 49,4 P5 1,875 75 49,4 P7 1,875 75 49,4 L1 2,5 75 61,2 L3 2,5 75 61,2 L4 2,5 75 61,2 W2 2,5 50 53 W10 2,5 50 53 Kết quả đánh giá biến dị di truyền dựa trên 10 microsatellite loci khảo sát cho thấy: Giá trị đa dạng di truyền của nhóm tôm sú đàn con được phối ghép từ con mẹ có nguồn gốc Gia hóa là thấp nhất và sự sai khác di truyền của nhóm tôm này cũng khá cao so với các nhóm tôm sú đàn con được phối ghép từ ba nhóm tôm mẹ của Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương và Nội Địa vì thế các nhà quản lý chọn giống cần chú ý hạn chế việc cho lai giữa hai vùng đàn này để tránh xảy ra cận huyết. Điều này phần nào hỗ trợ cho nhà quản lý yên tâm hơn về chương trình chọn giống. Tuy nhiên, cần thận trọng với những giải pháp bắt cặp gia đình đối với các phép phối trong nhóm chọn giống có chỉ số cận huyết cao và chỉ số khác biệt di 73 Đồ án tốt nghiệp truyền thấp; hạn chế việc cho phối cặp với các cá thể có quan hệ gần để tránh hiện tượng lai gần làm suy giảm giá trị biến dị di truyền. 4.2. Kiến nghị Microsatellite (SSR) là chỉ thị phân tử triển vọng để phân tích đa dạng di truyền. Tuy nhiên, trong phạm vi của đề tài sử dụng số lượng các cặp mồi microsatellite còn hạn chế. Do đó cần tiếp tục nghiên cứu, phát triển thêm nhiều cặp mồi microsatellite hơn nữa để đánh giá đa dạng di truyền với độ tin cậy cao hơn, phục vụ cho công tác chọn giống. Vì thời gian và điều kiện của đề tài không cho phép nên nhóm nghiên cứu chưa có điều kiện để tiến hành phân tích sản phẩm PCR một lần nữa trên gel cartrige có độ phân giải cao, do đó không phân biệt được nếu các alen có kích thước khác biệt chỉ từ 1 - 3 nucleotide. Vì vậy đề nghị nên phân tích sản phẩm PCR trên gel cartrige có độ phân giải cao để đánh giá chính xác hơn số alen trên mỗi locus. 74 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (1999). Di truyền phân tử - Những nguyên tắc căn bản trong chọn giống cây trồng, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Thành Phố Hồ Chí Minh. 2. Hồ Huỳnh Thùy Dương (1997). Sinh học phân tử, Nhà xuất bản Giáo Dục, Thành Phố Hồ Chí Minh. 3. Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (2007). Cơ sở di truyền học, Nhà xuất bản Giáo Dục, Hà Nội. 4. Lưu Hoàng Ly (1991). Thực nghiệm một số biện pháp kỹ thuật sản xuất giống tôm thẻ Gành Hào - Giá Rai - Minh Hải, Luận văn tốt nghiệp đại học, Đại học Cần Thơ, Cần thơ. 5. Nguyễn Thanh Phương, Thạch Thanh, Trương Trọng Nghĩa (1999). Cải thiện và nâng cao hiệu quả sản xuất giống tôm sú (Penaeus monodon) trong hệ thống lọc sinh học, Nông Nghiệp Phần II, Tuyển tập công trình nghiên cứu Khoa Học, Đại học Cần Thơ, Cần Thơ: 185 - 190. 6. Nguyễn Thành Tâm, Phạm Thanh Liêm (2012). So sánh sự đa dạng di truyền giữa tôm càng xanh Việt Nam và tôm càng xanh Trung Quốc sử dụng phương pháp Microsatellite và RAPD, Tạp chí Khoa học 6: 135 - 142. 7. Nguyễn Thị Thảo, Quyền Đình Thi, Đào Thị Tuyết, Lê Thị Thu Giang, Phạm Anh Tuấn (2004). Đánh giá tính đa dạng của ba quần đàn tôm sú (Penaeus monodon) nuôi ở Việt Nam bằng phương pháp Microsatellite, Tạp chí Công nghệ Sinh học 2 (3): 315 - 324. 8. Nguyễn Văn Chung, Lê Thị Hồng, Lê Đức Minh, Nguyễn Thanh Tùng, Trần Văn Trọng, Hà Lê Thị Lộc, Nguyễn Thị Kim Bích (1997). Nghiên cứu khả năng sinh sản của tôm sú (Penaeus monodon Fabricius) từ nguồn nuôi trong ao đìa, Tuyển tập báo cáo khoa học hội nghị sinh học biển toàn quốc lần thứ nhất, 425 - 430. 9. Phạm Văn Tình (2004). Kỹ thuật sản xuất giống tôm sú chất lượng cao, Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Thành Phố Hồ Chí Minh. 75 Đồ án tốt nghiệp 10. Phạm Thành Hổ (2007). Di truyền học, Nhà xuất bản Giáo dục, Thành Phố Hồ Chí Minh. 11. Trần Ngọc Hải, Trần Thị Thanh Hiền (1999). Giáo trình kỹ thuật nuôi thức ăn tự nhiên, Đại học Cần Thơ, Cần Thơ. Tài liệu Tiếng Anh 12. Falconer D.S., (1989). Introduction to Quantitative Gienetics, Ed. 3. Longmans Green/John Wiley & Sons, Harlow, Essex, UK/New York. 13. Griffiths Anthony JF (2000). An Introduction to Gienetic Analysis, 7th edition, Publisher New York: Harper & Row. 14. Gjedrem T., (2005). Selection and Breeding Programs in Aquaculture, Springer ISBN - 101 - 4020 - 3341 - 9.364 p. 15. Hansen L.P., Windsor M.L., Youngson A.F., (1997). Interactions between salmon culture and wild stocks of Atlantic salmon, The scientific and management issues, ICES Journal of Marine Science 54: 963 - 1225. 16. Hartl DL, Clark AG (1997). Principles of Population Gienetics, 3rd ed., Sinauer Associates Inc., Sunderland, Massachusets, ISBN: 0 - 87893 - 306 - 9. 17. Jeremy J. Agresti, Shingo Seki, Avner Cnaani, Supawadee Poompuang, Eric M. Hallerman, Nakdimon Umiel, Gideon Hulata, Graham A.E.Gall, Bernie May (2000). Breeding new strains of tilapia: development of an artificial center of origin and linkage map based on AFLP and microsatellite loci, Aquaculture 185: 43 - 56. 18. Kottelat M., Whitten T., (1996). Freshwater biodiversity in Asia with special reference to fish, Work band technical paper No, 343, Washington, 59 pp. 19. Li, ctv, (2007). Development of two microsatellite multiplex systems for black tiger shrimp Penaeus monodon and its application in gienetic diversity study for two. Aquaculture 266: 279 - 288. 20. Miller, S. A. Dykes, D. D. Polesky (1988). A simple salting out procedure for extracting, Nucleic Acids Research 16, 31 - 215. 21. Motoh H., (1981). Aquaculture Department Southeast Asian Fisheries, 76 Đồ án tốt nghiệp Development Center, Iloilo, Philippine, 128 p. 22. Mustafa S., (2003). Stock enhancement and sea ranching: objectives and potential. Reviews in Fish Biology and Fisheries 13(2), 141 - 149. 23. Pan, ctv, 2004. Isolation andcharacterization of 23 polymorphic microsatellite markers for diversity and stock analysis in tiger shrimp (Penaeus monodon), Molecular Ecology Notes 4, 345 - 347. 24. Raymond, M., Rousset, F., 199 Powell W; Morgante M; Andre C; Hanafey M; Vogel J; Tingey S; Rafalski A (2004). The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (Microsatellite) markers for germplasm analysis. Genetics and Molecular Biology, 27, 4: 579 - 588. 25. Ridley M., (1993). Evolution, Blackwell Scientific Publishing, Boston. 26. Suzuki DT, Griffiths AJF, Miller JH, Lewontin RC (1989). An Introduction to Gienetic Analysis, 4th ed., W - H Freeman and Company, New York. 27. Wuthisuthimethavee S, Lumubol P, Vanavichit A, Tragoonrung S (2003). Development of microsatellite markers in black tiger shrimp (Penaeus monodonFabricius), Aquaculture, 224, 39 - 50. 28. Xu Z, Dhar AK, Wyrzykowski J, Alcivar - Warren A (1999). Identification of abundant and informative microsatellites fromshrimp (Penaeus monodon) gienome, Animal Gienetics, 30, 150 - 156 Yablokov. 29. V.A (1986). Population Biology: Progress and Problems on Natural Populations, Mir Publishers, Moscow. Tài liệu từ Internet 30. Đỗ Văn Thông. Kinh nghiệm áp dụng tiêu chuẩn ASC, 2/2013, chuanasc.htm 31. Theo công văn 4276/BNN-TCTS (14/12/2012). Báo cáo tình hình sản xuất và giải pháp tháo gỡ khó khăn cho Tôm, cá Tra. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 3/2013, 77 Đồ án tốt nghiệp san-xuat-va-giai-phap-thao-go-kho-khan-vb153232.aspx 32. Powell W; Morgante M; Andre C; Hanafey M; Vogel J; Tingey S; Rafalski A: Gienetics and Molecular Biology, 27, 4, 579 - 588. Copyright by the Brazilian Society of Gienetics, Printed in Brazilwww.sbg.org.br. 78 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC PHỤ LỤC A. Kết quả xử lý số liệu trên hai phần mềm Fstat và cervus ******************************************************************* ******************************************************************* ****** * The following results were generated the 7/15/2015 at 2:32:25 PM with Fstat for windows, V2.9.3 2 (Feb. 2002) from file CCGENEPOP.dat. * ******************************************************************* ******************************************************************* ****** pop1 pop2 pop3 pop4 pop5 pop6 pop7 pop8 pop9 pop10 pop11 pop12 pop13 pop14 pop15 pop16 Pop1: Phối giữa mẹ Ấn Độ Dương với bố Ấn Độ Dương Pop2: Phối giữa mẹ Ấn Độ Dương với bố Gia Hóa Pop3: Phối giữa mẹ Ấn Độ Dương với bố Nội Địa Pop4: Phối giữa mẹ Ấn Độ Dương với bố Thái Bình Dương Pop5: Phối giữa mẹ Nội Địa với bố Ấn Độ Dương Pop6: Phối giữa mẹ Nội Địa với bố Nội Địa Pop7: Phối giữa mẹ Nội Địa với bố Gia Hóa Pop8: Phối giữa mẹ Nội Địa với bố Thái Bình Dương Pop9: Phối giữa mẹ Gia hóa với bố Gia Hóa Pop10: Phối giữa mẹ Gia Hóa với bố Nội Địa Pop11: Phối giữa mẹ Gia hóa với bố Ấn Độ Dương Pop12: Phối giữa mẹ Gia hóa với bố Thái Bình Dương Pop13: Phối giữa mẹ Thái Bình Dương với bố Ấn Độ Dương Pop14: Phối giữa mẹ Thái Bình Dương với bố Nội Địa Pop15: Phối giữa mẹ Thái Bình Dương với bố Gia hóa Pop16: Phối giữa mẹ Thái Bình Dương với bố Thái Bình Dương ************************************************ 1 Đồ án tốt nghiệp A.1. Chỉ số phong phú alen của 16 phép phối trên 10 microsatellite loci Allelic Richness per locus and population based on min. sample size of: 6 diploid individuals. P2 2.804 2.775 2.600 2.410 2.891 2.971 1.887 1.761 2.867 2.367 2.466 2.960 2.659 1.587 1.887 2.619 2.865 W2 4.605 4.117 4.286 3.682 3.521 2.998 3.940 3.761 4.002 3.126 4.309 3.945 3.972 2.441 3.842 2.000 4.137 W10 3.183 3.759 3.167 3.891 2.500 2.947 3.804 3.752 3.751 3.322 3.587 2.196 2.729 3.540 3.594 3.654 3.861 P4 1.927 1.998 2.908 1.998 1.000 2.000 1.000 1.000 2.887 1.992 2.787 2.960 2.988 2.918 2.886 2.930 2.865 P5 3.498 2.694 3.760 3.212 2.000 2.760 3.273 2.754 2.736 2.000 2.910 2.885 3.144 2.902 2.988 2.441 3.199 P7 2.969 1.999 2.851 2.342 1.999 2.754 1.998 1.993 1.998 2.440 2.525 2.325 1.997 2.139 1.992 2.658 2.484 L1 2.737 2.909 2.803 2.853 1.981 2.000 2.661 2.453 2.416 1.999 2.512 2.699 2.891 1.952 2.579 1.952 2.860 L3 2.951 2.765 2.952 2.729 1.000 2.849 2.874 2.500 2.960 2.835 2.561 2.616 2.806 2.908 2.971 2.892 2.880 L4 1.691 2.000 1.979 2.000 1.953 2.761 2.863 2.947 1.725 1.944 2.888 1.363 3.063 3.582 2.973 2.871 3.026 ************************************************ A.2. Chỉ số cận huyết giữa 16 phép phối trên 10 microsatellite loci Fis Per population : P1 0.053 0.431 -0.218 -0.067 1.000 0.000 0.709 -0.111 0.857 0.310 0.639 0.155 0.611 0.083 0.721 0.918 P2 0.197 -0.037 0.708 0.380 0.612 1.000 0.329 -0.048 0.583 0.303 0.508 0.850 0.465 -0.045 0.184 0.209 2 Đồ án tốt nghiệp W2 0.338 0.604 0.465 0.577 0.753 1.000 0.357 0.880 0.750 0.714 0.663 0.863 0.578 1.000 0.505 1.000 W10 0.542 0.707 0.436 0.639 0.417 0.019 0.462 0.444 0.768 0.588 0.542 0.931 0.847 -0.088 0.206 0.538 P4 0.169 0.737 0.840 -0.568 NA 1.000 NA NA 1.000 1.000 0.833 0.648 0.364 0.143 0.803 0.487 P5 0.623 0.703 0.818 0.004 -0.111 0.714 0.763 0.681 0.668 1.000 0.678 0.525 0.706 1.000 0.329 0.851 P7 0.914 0.483 0.400 0.924 1.000 1.000 1.000 1.000 0.942 1.000 0.852 0.751 0.883 1.000 1.000 0.821 L1 0.392 0.556 0.477 0.425 -0.222 -0.400 0.381 0.654 0.769 0.731 0.938 0.160 0.512 0.055 0.093 0.329 L3 0.192 0.217 0.472 0.426 NA 0.820 0.456 0.855 0.956 0.442 0.626 0.787 0.414 0.020 0.691 0.321 L4 -0.079 0.913 0.392 0.391 0.436 0.728 0.899 1.000 0.792 0.064 0.907 - 0.018 0.943 0.339 0.737 0.567 All 0.382 0.536 0.474 0.328 0.566 0.674 0.592 0.688 0.810 0.639 0.716 0.619 0.617 0.336 0.523 0.606 ************************************************ A.3. Sự khác biệt di truyền của 16 phép phối trong mẫu phân tích pop2 pop3 pop4 pop5 pop6 pop7 pop8 pop9 pop10 pop11 pop12 pop13 pop14 pop15 pop16 pop1 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 pop2 0.00042 0.00083 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 pop3 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 3 Đồ án tốt nghiệp pop4 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 pop5 0.00250 0.00042 0.00167 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 pop6 0.00083 0.00208 0.00042 0.00042 0.00083 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00500 pop7 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 pop8 0.00083 0.00042 0.00125 0.00042 0.00042 0.00292 0.00125 0.00167 pop9 0.00042 0.00208 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 pop10 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 pop11 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 pop12 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 pop13 0.00042 0.00042 0.00042 pop14 0.00042 0.00042 pop15 0.00083 P-values obtained after : 2400 permutations Indicative adjusted nominal level (5%) for multiple comparisons is : 0.000417 pop2 pop3 pop4 pop5 pop6 pop7 pop8 pop9 pop10 pop11 pop12 pop13 pop14 pop15 pop16 pop1 * * * * * * * * * * * 4 Đồ án tốt nghiệp * * * * pop2 * NS * * * * * * * * * * * * pop3 * * * * * * * * * * * * * pop4 * * * * * * * * * * * * pop5 NS * NS * * * * * * * * pop6 NS NS * * NS * * * * NS pop7 * * * * * * * * * pop8 NS * NS * * NS NS NS pop9 * NS * * * * * pop10 * * * * * * pop11 * * * * * pop12 * * * * pop13 * * * pop14 * * pop15 NS 5 Đồ án tốt nghiệp A.4. Các chỉ số đánh giá biến dị di truyền của 16 phép phối Cervus 3.0.7 - (c) Copyright Tristan Marshall 1998 - 2014 Licensed for non - commercial use only Allele frequency analysis completed 7/15/2015 2:30:31 PM **** Summary statistics **** Locus k N HObs HExp PIC NE-1P NE-2P NE-PP NE-I NE-SI HW F(null) P1 4 394 0.371 0.701 0.646 0.727 0.558 0.385 0.144 0.436 *** 0.3114 P2 3 401 0.242 0.608 0.530 0.815 0.679 0.532 0.231 0.504 *** 0.4353 W2 5 406 0.244 0.734 0.688 0.678 0.503 0.321 0.116 0.412 *** 0.5192 W10 4 400 0.303 0.746 0.698 0.677 0.501 0.328 0.112 0.405 *** 0.4222 P4 3 390 0.210 0.600 0.525 0.821 0.682 0.535 0.235 0.509 *** 0.4687 P5 4 395 0.215 0.651 0.582 0.779 0.628 0.469 0.191 0.473 *** 0.5012 P7 3 406 0.074 0.520 0.430 0.865 0.760 0.636 0.321 0.570 *** 0.7487 L1 3 386 0.272 0.563 0.500 0.842 0.698 0.548 0.254 0.532 *** 0.3373 L3 3 389 0.285 0.613 0.536 0.813 0.674 0.527 0.227 0.501 *** 0.3599 L4 4 399 0.153 0.574 0.511 0.831 0.685 0.527 0.244 0.524 *** 0.5812 Number of individuals: 408 Number of loci: 1 0 6 Đồ án tốt nghiệp Mean number of alleles per locus: 3.600 Mean proportion of loci typed: 0.9721 Mean expected heterozygosity: 0.6310 Mean polymorphic information content (PIC): 0.5646 Combined non - exclusion probability (first parent): 0.08543091 Combined non - exclusion probability (second parent): 0.01002873 Combined non - exclusion probability (parent pair): 0.00052084 Combined non - exclusion probability (identity): 0.00000009 Combined non - exclusion probability (sib identity): 0.00070491 PHỤ LỤC B. Một số hình ảnh phân tích DNA từ máy điện di mao quản B.1. Microsatellite P1: Mẫu D9, đồng hợp tử 134 - 134 7 Đồ án tốt nghiệp B.2. Microsatellite P4: Mẫu E9, đồng hợp tử 211 - 211 B.3. Microsatellite W10: Mẫu A10, dị hợp tử 116 - 112 8 Đồ án tốt nghiệp B.4. Microsatellite L1: Mẫu A8, dị hợp tử 165 - 179 B.5. Microsatellite L4: Mẫu H3, đồng hợp tử 209 - 209 9