Đồ án Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi sắc tố prodigiosin từ canh trường

ình nghiên cứu của tơi đƣợc thực hiện tại phịng thí nghiệm khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trƣờng, trƣờng đại học Cơng nghệ TP.Hồ Chí Minh. Các số liệu và kết quả là trung thực, chƣa ai cơng bố. Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm về lời cam đoan của mình trƣớc quý thầy cơ và nhà trƣờng. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 8, năm 2015 Sinh viên thực hiện Hồ Thị Bích Phƣơng Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Tận đáy lịng con xin gửi vạn lời cảm ơn đến cha mẹ, cha mẹ đã gian lao nuơi dạy con thành ngƣời và là ngƣời thầy đầu đời của con. Cha mẹ luơn là chỗ dựa vững chắc nhất của con, là ngƣời giúp con đứng vững sau mỗi lần vấp ngã, là nguồn động viên, động lực để con tiếp tục phấn đấu trong cuộc sống. Với lịng biết ơn sâu sắc. Em xin chân thành cảm ơn tồn thể quý Thầy Cơ Khoa Cơng nghệ sinh học – Mơi trƣờng – Thực phẩm, cùng tồn thể Thầy Cơ Trƣờng Đại học Cơng nghệ TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quý báu về cơ sở ngành cũng nhƣ chuyên ngành từ ngày em bƣớc chân vào giảng đƣờng đại học. Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cơ Nguyễn Hồi Hƣơng ngƣời đã luơn tận tình chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hồn thành phần thực nghiệm của đồ án. Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và thầy Nguyễn Trung Dũng đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phịng thí nghiệm Khoa Cơng nghệ sinh học - Mơi trƣờng – Thực phẩm, Trƣờng Đại học Cơng nghệ TP. Hồ Chí Minh. Cảm ơn tất cả các bạn lớp 11DSH04 và các bạn làm đồ án tại phịng thí nghiệm Khoa Cơng nghệ sinh học - Mơi trƣờng – Thực phẩm đã luơn khích lệ, động viên và giúp đỡ mình trong suốt quá trình học tập tại trƣờng và trong quá trình làm đồ án tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn! TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015 SVTH: Hồ Thị Bích Phƣơng Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. v DANH MỤC HÌNH ẢNH ...................................................................................... vi MỤC LỤC BẢNG ................................................................................................ viii LỜI MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 9 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 12 1.1 Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật ........................................................... 12 1.1.1. Hợp chất thứ cấp .......................................................................................... 12 1.1.2. Triển vọng và tiềm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật .............. 12 1.2 Tổng quan prodigiosin ...................................................................................... 15 1.2.1. Khái niệm về prodigiosin ............................................................................. 15 1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin .......................................................... 16 1.2.3. Hoạt tính sinh học của prodigiosin .............................................................. 18 1.3. Tổng quan về Serratia marcescens .................................................................... 24 1.3.1. Phân loại Serratia marcescens ..................................................................... 24 1.3.2. Đặc điểm của Serratia marcescens ............................................................. 25 1.3.4 Một số hợp chất đƣợc tổng hợp bởi Serratia marcescens ............................ 29 1.3.5 Tổng quan về quorum sensing trong S. marcescens ..................................... 31 1.4. Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin ....................................................................... 32 1.4.1. Cơ chế tổng hợp prodigiosin ........................................................................ 32 1.4.2. Yếu tố ảnh hƣởng đến tổng hợp prodigiosin................................................ 34 i Đồ án tốt nghiệp 1.4.3. Điều kiện tổng hợp prodigiosin .................................................................... 38 1.4.4. Thu nhận, tinh sạch và định lƣợng prodigiosin............................................ 39 1.5 Tiềm năng sản xuất prodigiosin của Serratia marcescens ................................... 42 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU45 2.1. Thời gian và địa điểm .......................................................................................... 45 2.1.1. Thời gian ...................................................................................................... 45 2.1.2. Địa điểm ....................................................................................................... 45 2.2. Vật liệu ................................................................................................................ 45 2.2.1. Nguồn vi sinh vật ......................................................................................... 45 2.2.2. Mơi trƣờng nuơi cấy và hĩa chất sử dụng .................................................... 45 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................... 46 2.4 Bố trí thí nghiệm .................................................................................................. 47 2.5.1 Khảo sát chủng nuơi cấy ................................................................................... 49 2.5.1 Kiểm tra độ thuần khiết ................................................................................. 49 2.5.2 Kháng sinh đồ ............................................................................................... 49 2.6 Xác định điều kiện lên men .................................................................................. 49 2.7.1 Khảo sát vận tốc lắc trong nuơi cấy .............................................................. 52 2.7.2 Xác định pH tối ƣu cho mơi trƣờng lên men ................................................ 53 2.7.3 Khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ muối NaCl .......................................... 53 2.7.4 Khảo sát sự ảnh hƣởng của phƣơng pháp đồng nuơi cấy ............................ 54 2.7.5 Khảo sát sự ảnh hƣởng của sản phẩm Quorum sensing................................ 55 2.8 Thu hồi sản phẩm thơ ........................................................................................... 56 ii Đồ án tốt nghiệp 2.8.1 Xác định tỷ lệ trích ly dung mơi đồng thời khảo sát thể tích lên men .......... 56 2.8.2 Cải thiện quá trình trích ly nhờ gia tăng nhiệt độ ......................................... 56 2.9 Các phƣơng pháp phân tích .................................................................................. 56 2.9.1 Xác định protein cĩ trong mẫu ...................................................................... 57 2.9.2 Xác định lipid cĩ trong mẫu .......................................................................... 57 2.10 Sắc ký bản mỏng TLC........................................................................................ 57 2.11 Phƣơng pháp phân tích ....................................................................................... 59 2.11.1. Phƣơng pháp định lƣợng hợp chất prodigiosin .......................................... 59 2.11.2. Phƣơng pháp xử lý số liệu thống kê ........................................................... 59 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 60 3.1 Kết quả kiểm tra độ thuần khiết ........................................................................... 60 3.2 Xác định điều kiện lên men thu prodigiosin ........................................................ 65 3.2.1 Ảnh hƣởng của thể tích lên men lên hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp ........ 65 3.2.2 Xác định vận tốc lắc ...................................................................................... 67 3.2.3 Kết quả xác định pH tối ƣu cho mơi trƣờng MT3 ........................................ 69 3.2.4 Ảnh hƣởng của nồng độ muối lên hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp ............ 71 3.2.5 Kết quả thí nghiệm đồng nuơi cấy ................................................................ 73 3.2.6 Sử dụng dịch trong nuơi cấy ......................................................................... 76 3.3 Thu hồi sản phẩm lên men từ canh trƣờng ........................................................... 77 3.3.1 Ảnh hƣởng của tỷ lệ canh trƣờng: dung mơi trích ly lên hàm lƣợng prodigiosin thu hồi ................................................................................................. 77 3.3.2 Cải thiện quá trình trích ly nhờ gia nhiệt canh trƣờng .................................. 78 iii Đồ án tốt nghiệp 3.4 Xác định thành phần hĩa học trong mẫu .............................................................. 84 3.4.1. Phản ứng Biuret’s test .................................................................................. 84 3.4.2 Xác định lipid cĩ trong mẫu .......................................................................... 86 3.5 Sắc ký bản mỏng TLC .......................................................................................... 88 Chƣơng 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 91 4.1 Kết luận ............................................................................................................. 91 4.2 Kiến nghị .......................................................................................................... 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 93 PHỤ LỤC ................................................................................................................. 1 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT EPN: Entomopathogenic nematodes OD: mật độ quang (Optical Density) λmax : bƣớc sĩng hấp thụ cực đại TLC: Thin Layer Chromatogarphy v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) .............................................. 19 Hình 1.2 Cấu trúc hĩa học prodigiosin (Krishna,2008) ............................................... 20 Hình 1.3. Cơ chế kháng tế bào ung thƣ của prodigiosin (Chia-Che và cộng sự,2011) 23 Hình 1.4. Serratia marcescens dƣới kính hiển vi (Gillen and Gibbs, 2011) ................. 29 Hình 1.5. Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên mơi trƣờng nutrient agar ở 250C sau 48 giờ (David, 2012) ..................................................................................................... 28 Hình 1.6. So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) tử Serratia ATCC 39.600, Sma 274 và các cụm sunh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) tử Streptomyces coelicolor A3(2) (Cerdeno và cộng sự, 2001) ........................................ 35 Hình 1.7. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens (Sundaramoorthy và cộng sự, 2009) ........................................... 37 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ................................................................................... 51 Hình 2.2 Sơ đồ trích ly .................................................................................................. 54 Hình 2.3 Cách chuẩn bị giấy chạy sắc ký ..................................................................... 61 Hình 3.1 Khuẩn lạc chủng SH1 nuơi cấy trên mơi trƣờng NA ..................................... 63 Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc soi thằng và soi nghiêng dƣới kính hiển vi vật kính 10X ...................................................................................................................................... .64 Hình 3.3 Kết quả nhuộm Gram chủng SH1 .................................................................. 65 Hình 3.4 Kết quả kháng kháng sinh của chủng SH1 .................................................... 65 vi Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5. Ảnh hƣởng của thể tích lên men lên hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp ........ 69 Hình 3.6 Hàm lƣợng prodigiosin khi thay đổi vận tốc lắc ............................................ 71 Hình 3.7 Ảnh hƣởng của pH lên sự tổng hợp prodigiosin của S. marcescens SH1. .... 73 Hình 3.8 Kết quả hàm lƣợng prodigiosin khi bổ sung NaCl. ....................................... 75 Hình 3.9 Đồng nuơi cấy Serratia marcescens SH1 và Bacillus sp. .............................. 77 Hình 3.10 Kết quả đồng nuơi cấy E. coli ...................................................................... 78 Hình 3.11. Hàm lƣợng prodigiosin thu hồi sau trích ly nhờ tỷ lệ canh trƣờng: dung mơi khác nhau....................................................................................................................... 81 Hình 3.12 Canh trƣờng sau khi ly tâm .......................................................................... 82 Hình 3.13. Sắc tố đỏ sau khi trích ly với dung mơi Etanol:HCl (95:5) ........................ 83 Hình 3.14. Vi khuẩn S. marcescens đƣợc cấy trên mơi trƣờng NA. ............................. 84 Hình 3.15. Hàm lƣợng prodigiosin so với đối chứng. .................................................. 85 Hình 3.16. Kết quả quét quang phổ của sắc tố canh trƣờng khơng đun và đun 1000C 86 Hình 3.17 Biuret’s test đối với dịch trong sau ly tâm và dịch trích ly prodigiosin thơ 87 Hình 3.18 Ninhydrin test đối với dịch trong sau ly tâm và dịch trích ly prodigiosin thơ ở thí nghiệm đun và khơng đun canh trƣờng. ............................................................... 88 Hình 3.19. Kết quả mẫu phản ứng Coomassie brilliant blue trƣớc và sau khi phun thuốc thử. ................................................................................................................................. 90 Hình 3.20. Kết quả sắc ký bản mỏng sử dụng hệ dung mơi Petrolium ether: Ether : Acetic acid (70 : 40 : 2, v : v :v).................................................................................... 92 Hình 3.21 Sơ đồ quy trình S. marcescens SH1 tổng hợp prodigiosin...........................93 vii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC BẢNG Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chất thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật ............... 15 Bảng 1.2. Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) .. 19 Bảng 1.3. Các sản phẩm prodigiosin thƣơng mại hĩa (Santa Cruz Biotechnology, Merck Millipore, Biovision incorporated).....................................................................25 Bảng 1.4. Một số đặc điểm sinh hĩa của Serratia marcescens (Tariq và Jonh, 2010) 29 Bảng 1.5. So sánh quá trình tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens trong các mơi trƣờng và các nhiệt độ khác nhau ( Chidambaram và Perumalsamy, 2009). ....... 40 Bảng 2.1. Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của máy lắc và chế độ lắc. ........................ 55 Bảng 3.1 Kết quả kháng kháng sinh ............................................................................. 66 Bảng 3.2 % Hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp so với đối chứng (thí nghiệm A) ........ 69 Bảng 3.3. Hàm lƣợng prodigiosin khi thay đổi vận tốc lắc. ......................................... 70 Bảng 3.4 Kết quả hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu .................................................... 73 Bảng 3.5 Kết quả hàm lƣợng prodigiosin khi bổ sung muối NaCl ............................... 75 Bảng 3.6. % prodigiosin tổng hợp so với đối chứng ..................................................... 77 Bảng 3.7. Hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp khi bổ sung dịch nuơi cấy. ...................... 79 Bảng 3.8. % Ảnh hƣởng của tỷ lệ canh trƣờng : dung mơi trích ly .............................. 80 Bảng 3.9. Kết quả hàm lƣợng prodigiosin trong thí nghiệm ........................................ 84 Bảng 3.10. Kết quả xác định protein và lipid ............................................................... 91 viii Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Các nguồn tài nguyên thiên nhiên, chẳng hạn nhƣ thực vật, vi sinh vật, động vật cĩ xƣơng sống và khơng xƣơng sống là những nguồn cĩ giá trị của các hợp chất hoạt tính sinh học. Một số lƣợng lớn các loại thuốc đã đƣợc phát triển trong ngành y từ các sản phẩm tự nhiên. Kể từ khi phát hiện và thành cơng trong việc điều trị của peniciline, các vi sinh vật đã đƣợc sử dụng nhƣ một nguồn đặc biệt của các tác nhân hoạt tính sinh học cĩ cấu trúc đa dạng. Các ứng dụng điều trị của các chất chuyển hĩa của vi sinh vật cung cấp cơ hội cho việc phát hiện ra kháng sinh (ví dụ peniciline, erythromycin), ức chế miễn dịch trong cấy ghép, các tác nhân giảm cholesterol (ví dụ lovastain và mevastatin) và tác nhân chống ung thƣ (ví dụ doxorubicin, daunorubicin, bleomycin và pentostatin). Từ khi nền khoa học hiện đại bắt đầu, các hợp chất thứ cấp tự nhiên đƣợc chiết xuất từ trái cây, rau, hạt, rễ, đã đƣợc sử dụng trong việc làm thuốc đơng y, mỹ phẩm, thực phẩm,... Nhƣng sau đĩ, các hợp chất thứ cấp tự nhiên đã đƣợc nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc hĩa học cũng nhƣ cách tổng hợp bằng phƣơng pháp hĩa học, bởi ngƣời ta cho rằng chúng bền hơn, cĩ thể sản xuất trên quy mơ lớn và chi phí sản xuất thấp. Tuy nhiên, các vấn đề ơ nhiễm mơi trƣờng và ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe gây ra bởi các hợp chất tổng hợp hĩa học đã bắt đầu đƣợc chú ý đến. Chính vì thế so với các hợp chất thứ cấp từ thực vật và động vật thì các hợp chất từ vi sinh vật ngày càng đƣợc quan tâm và phát triển, vì vi sinh vật cũng là một yếu tố tự nhiên và an tồn dễ sử dụng, sản xuất đƣợc quanh năm trong các điều kiện địa lý khác nhau và do sự tăng trƣởng nhanh chĩng của vi sinh vật nên sẽ làm giảm thời gian sản xuất xuống cịn chỉ một vài ngày. So với các nguồn khác từ thực vật hoặc động vật thì hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật cĩ thể dễ dàng đƣợc kiểm sốt và dự đốn sản 9 Đồ án tốt nghiệp lƣợng (Francis, 1987; Taylor, 1984). Trong những sắc tố từ vi sinh vật thì hợp chất prodigiosin đƣợc biết đến với ý nghĩa quan trọng. Một số lồi Serratia, đặc biệt lồi Serratia marcenscens cĩ khả năng tổng hợp sắc tố đỏ (red pigment) prodigiosin (2-methyl-3-amyl-6-methoxyprodigiosene) (C20H25N30 = 323,44) (Williams và Qadri, 1980, Kobayashi và El-Barrad, 1996; Press và cộng sự, 1997; Someya và cộng sự, 2000; Roberts và cộng sự, 2005). Prodigiosin là sắc tố màu đỏ, và cĩ hoạt tính kháng vi sinh vật đã đƣợc bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1960, nay thu hút đƣợc nhiều quan tâm do khả năng sử dụng làm màu tự nhiên và ứng dụng trong lãnh vực bảo vệ thực vật cũng nhƣ hoạt chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u (D’Alessio và Rossi, 1996; Azuma và cộng sự, 2000; Bennet và Bentley, 2000; Melvin và cộng sự, 2000, Tsuji và cộng sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji, 1992; Songia và cộng sự, 1997). Sớm nhận thấy đƣợc lợi rất quan trọng của hợp chất prodigiosin đƣợc tách từ việc nuơi cấy vi khuẩn Serratia marcenscens, Nguyễn Hồng Anh Kha đã thu nhận sắc tố đỏ prodigiosin từ việc nuơi cấy trong mơi trƣờng peptone glycerol đạt 10,575 mg/ml sắc tố ( ĐATN Nguyễn Hồng Anh Kha, 2014). Sau đĩ ĐATN Trần Lâm Tú Quyên (2014) đã khảo sát trong quá trình lên men thu prodigiosin, mơi trƣờng huyền phù đậu phộng MT1 (10%) cho hàm lƣợng prodigiosin là 248,4% so với mơi trƣờng peptone glycerol là 100%. Cũng trong ĐATN Trần Lâm Tú Quyên (2014) kết luận mơi trƣờng MT3 chứa 10% huyền phù đậu phộng 5% pepton và 1% dầu hƣớng dƣơng, tỉ lệ cấy giống 3%, lắc 180 vịng phút trong 24 giờ đầu sau đĩ giảm cịn 150 vịng/phút là mơi trƣờng và điều kiện tối ƣu nhất để tổng hợp sắc tố đỏ prodigiosin. Nhƣng quá trình lên men cịn ở quy mơ sản xuất nhỏ 20 ml/bình và cịn nhiều yếu tố cần cải thiện. Dựa trên cơ sở này đề tài “CẢI THIỆN ĐIỀU KIỆN NUƠI CẤY Serratia mercescens SH1 VÀ PHƢƠNG PHÁP THU HỒI SẮC TỐ PRODIGIOSIN TỪ CANH TRƢỜNG” đƣợc tiến hành nhằm tăng nồng độ prodigiosin tổng hợp. 10 Đồ án tốt nghiệp 2. Mục tiêu đề tài Cải tiến điều kiện lên men Serratia marcescens tổng hợp prodigiosin, cũng nhƣ phƣơng pháp thu hồi sắc tố thơ. 3. Nội dung đề tài Khảo sát chủng Serratia marcescens xem xét độ thuần khiết, khảo sát kháng sinh đồ. Cải tiến điều kiện nuơi cấy Serratia marcescens tổng hợp prodigiosin: tăng thể tích lên men, ảnh hƣởng của vận tốc lắc, pH nuơi cấy, nồng độ muối % NaCl, thử áp dụng phƣơng pháp đồng nuơi cấy tăng hợp chất thứ cấp, thử áp dụng bổ sung dịch nuơi cấy vi khuẩn Gram âm chứa phân tử tín hiệu Quorum sensing. Thiết lập quy trình trích ly sắc tố thơ từ canh trƣờng nuơi cấy. 4. Ý nghĩa khoa học Áp dụng các kiến thức về cơng nghệ lên men sản xuất hợp chất thứ cấp vào tổng hợp prodigiosin. Xem xét khá năng sử dụng chủng Serratia marcescens SH1 phân lập từ tuyến trùng EPN vào sản xuất prodigiosin qua kháng sinh đồ khác biệt với chủng phân lập từ bệnh phẩm. Gĩp phần vào việc tăng quy mơ và nồng độ sản phẩm prodigiosin tổng hợp bằng phƣơng pháp lên men. 5. Ý nghĩa thực tiễn Cung cấp sản phẩm prodigiosin thơ cho nghiên cứu tinh sạch và khảo sát hoạt tính sinh học. 11 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật 1.1.1. Hợp chất thứ cấp Hợp chất thứ cấp là chất đƣợc tạo ra từ hợp chất sơ cấp, cĩ trọng lƣợng phân tử nhỏ, thƣờng đƣợc gọi là chất cĩ hoạt tính sinh học đĩng vai trị điều hịa quan hệ sinh thái của chủ thể với các tác động lên chủ thể của mơi trƣờng xung quanh. Hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật là những hợp chất đƣợc vi sinh vật tạo ra từ quá trình chuyển hĩa hợp chất sơ cấp. 1.1.2. Triển vọng và tiềm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật Vi sinh vật đã đƣợc sử dụng trong một thời gian dài cho sản xuất các phân tử sinh học nhƣ thuốc kháng sinh, enzyme, vitamine và các tác nhân chỉ thị. Cĩ sự quan tâm ngày càng tăng trong ngành cơng nghiệp thực phẩm trong việc sử dụng các thành phần tự nhiên. Các thành phần, chẳng hạn nhƣ hợp chất thứ cấp, đƣợc xem là tự nhiên khi xuất phát từ nguồn gốc sinh học nhƣ động vật, thực vật hoặc vi sinh vật. Hợp chất thứ cấp của vi sinh vật đƣợc sử dụng trong ngành cơng nghiệp chế biến cá, ví dụ nhƣ để tăng màu hồng của cá hồi nuơi. Hơn nữa, một số hợp chất tự nhiên cĩ tiềm năng thƣơng mại để sử dụng nhƣ chất chống oxy hĩa. Ngành cơng nghiệp hiện nay đã sản xuất một số hợp chất từ vi sinh vật ứng dụng trong thực phẩm, mỹ phẩm hoặc vật liệu dệt. Trong tự nhiên phong phú về hợp chất và vi sinh vật sản xuất hợp chất (nấm, nấm men và vi khuẩn). Trong các sắc tố tự nhiên thì vi sinh 12 Đồ án tốt nghiệp vật cung cấp một số lƣợng hợp chất rất lớn nhƣ: carotenoid, melanin, flavin, quinone, prodigiosin và cụ thể hơn là monascin, violacein hoặc indigo (Dufosse, 2009). Các loại hợp chất này cĩ tiềm năng khai thác cao, vì quá trình sản xuất đơn giản, sự đa dạng di truyền ở vi sinh vật, cũng nhƣ cĩ thể dễ dàng tối ƣu hĩa quy trình cơng nghệ (Juailova và cộng sự, 1997). Bên cạnh đĩ, một số vi sinh vật cĩ khả năng sản xuất hợp chất với hiệu suất cao, bao gồm các chi Monascus (Hajjaj và cộng sự, 2000) và Serratia (Williams và cộng sự, 1971a). Các chi vi sinh vật khác nhƣ: Rhodotorula, Bacillus, Achrombacter, Yarrowia và Phaffia cũng cĩ khả năng sản xuất số lƣợng lớn hợp chất thứ cấp (Krishna, 2008), trong đĩ kháng sinh, nhĩm hoạt chất cĩ khả năng gây chết hoặc kìm hãm vi sinh vật phát triển, đƣợc một số vi sinh vật nhƣ nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn tạo ra, là một trong những thành tựu quan trọng của việc sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật. Mỗi kháng sinh cĩ phổ tác động riêng của mình. Bảng 1.1 tĩm tắt về một số hợp chất thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật. Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chất thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật Vi sinh vật Hợp chất thứ cấp Ứng dụng Kiểu tác động ức chế Penicillium Penicillin Ức chế tụ cầu khuẩn, Ức chế tạo polymer notatum, nhiễm trùng kỵ khí, vách tế bào vi khuẩn, giang mai, hen suyễn. ức chế hấp thu amino Penicillium acid và protein, ức chế chrysogenum tạo enzyme 13 Đồ án tốt nghiệp Streptomyces Streptomycin Ức chế vi khuẩn Ức chế ghép nối một griceus Gram âm và ram số amino acid vào dƣơng. Trị bệnh lao, protein, tác động lên bệnh viêm màng não, hệ enzyme của vi ho gà khuẩn tham gia chuyển pyruvate vào chu trình Creb Steptomyces Chloramphenicol Ức chế đối với bệnh Ức chế đặc hiệu sinh venezuelae lỵ, sốt cao, sốt phát tổng hợp protein vi ban khuẩn liên quan đến peptidyl transferase trong tiểu đơn vị Ribosome 50s, ngăn khơng cho tạo liên kết peptide Streptomyces Tetracilin Ức chế phổ rộng vi Ức chế tổng hợp aureomycin khuẩn Gram âm, protein Gram dƣơng Streptomyces Erythromycin Chữa bệnh do tụ cầu ức chế vi khuẩn Gram erythraeus khuẩn streptococcal âm và Gram dƣơng gây ra 14 Đồ án tốt nghiệp Streptomyces Neomycin Tác dụng vi khuẩn Hơi độc fradiae Gram âm và Gram dƣơng Streptomyces Kanamycin Điều trị lao, ức chế vi Tác động giống nhƣ kanamycetius khuẩn Gram âm và streptomycin và neomycin Gram dƣơng Streptomyces Cycloserine Điều trị bệnh lao Cản trở tổng hợp vách lavendulae tế bào 1.2 Tổng quan prodigiosin 1.2.1. Khái niệm về prodigiosin Prodigiosin là một tripyrrole đƣợc phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc trƣng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” cĩ nguồn gốc từ “prodigious” cĩ nghĩa là một điều gì đĩ kỳ diệu. Prodigiosin đƣợc tìm thấy ở dạng túi bên ngồi tế bào cũng nhƣ các tế bào liên kết, và dạng hạt ở bên trong tế bào (Kobayashi và Ichikawa, 1991). Prodigiosin là một chất chuyển hĩa thứ cấp, đƣợc sản xuất bởi các vi khuẩn nhƣ Serratia marcescens, Pseudomonas magneslorubra, Vibrio psychroerythrous, Serratia rubidaea, Vibrio gazogenes, Alteromonas rubra, Rugamonas rubra và các xạ khuẩn Gram dƣơng, chẳng hạn Streptoverticillium rubrireticuli và Streptomyces longisporus (Khanafari và cộng sự, 2006). Hình 1.1 trình bày cấu trúc hĩa học của các hợp chất đại diện của prodigiosin. 15 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) 1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin Mãi đến năm 1960, cơng thức hĩa học chính xác của prodigiosin đƣợc tổng hợp bởi Serrattia marcescens mới đƣợc biết đến (Rapoport và Holden, 1962). Do sự tiến bộ nhanh chĩng trong khoa học phân tích và quang phổ ở những năm tiếp theo, mà cấu trúc của prodigiosin dần đƣợc nghiên cứu rõ ràng hơn (Hesse, 2000). Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2- ylidene)methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) cĩ cơng thức phân tử C20H25N30 và trọng lƣợng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự, 2006; Williamson và cộng sự, 2006). Prodigiosin là một alkaloid cĩ cấu trúc hĩa học đặc biệt, với ba vịng pyrrole tạo thành bộ khung pyrrolylpyrromethane, trong đĩ hai vịng đầu liên kết trực tiếp với nhau, cịn vịng thứ ba đƣợc gắn vào thơng qua cầu nối methene (Qadri và Williams, 1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin cĩ bảy liên kết đơi và đƣợc miêu tả là tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008). 16 Đồ án tốt nghiệp Hình 1 .2. Cấ u trúc hĩa học prodigiosin (Krishna , 2008). (Krishna Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và khơng tan đƣợc trong nƣớc. Prodigiosin cĩ thể tan tƣơng đối trong alcohol và ether; bên cạnh đĩ, nĩ dễ tan trong chloroform, methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977; Khanafari và cộng sự, 2006). Bảng 1.2. Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) Lồi Tên sắc tố Danh pháp prodigiosin Trọng lƣợng phân tử và cơng thức Serratia marcescens Prodigiosin 2-Methyl-3-amyl-6- 323,4 Da methoxy prodigiosene C20H25N30 Serratia marcescens Norprodigiosin 2-Methyl-3-amyl-6- 309,4 Da hydroxy-prodigiosene C10H23N30 Nocardia Nonylprodigiosin 2-Nonly-6- 363,5 Da (Actinomadura) methoxyprodigiosene C23H31N30 madurae 17 Đồ án tốt nghiệp Nocardia Cyclononylprodig 2,10-Nonano-6- 265,5 Da (Actinomadura) iosin melhoxy-prodigiosene C23H33N30 madurae Nocardia(Actinomadura) Methylcyclodc 2,10-Nonano-6- 391,5 Da cyl-prodigiosin pellctieri Methoxy-prodigiosene C25H33N30 Streptomyces Undccylprodigios 2-Undecyl-6- 393,6 Da longisporusruber và in Rnethoxyprodigiosene C25H35N30 Nocardia(Actinomadura) pelletieri Streplonlyces Metacycloprodig 2,4-(9-Ethylnonano)-6- 391,6 Da longisporusruber iosin methoxyprodigiosene C25H33N30 1.2.3. Hoạt tính sinh học của prodigiosin 1.2.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn Prodigiosin cĩ khả năng ức chế sự tăng trƣởng của một số lồi vi khuẩn (Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là do khả năng thấm qua màng tế bào và khả năng ức chế các enzyme nhƣ DNA gyrase, topoisomerase IV, dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trƣởng của tế bào vi khuẩn (Ramina và Samira, 2009). Nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin cĩ thể kháng một số vi khuẩn nhƣ: Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, Bacillus subtilis, Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes, Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus 18 Đồ án tốt nghiệp mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Bacillus cereus,... Tuy nhiên, hoạt động kháng khuẩn của prodigiosin đối với các vi khuẩn Gram dƣơng lại cao hơn so với các vi khuẩn Gram âm (Ramina và Samira, 2009; Chandni và cộng sự, 2012). 1.2.3.2. Hoạt tính chống tế bào ung thư Prodigiosin cĩ khả năng gây độc tế bào và cĩ thể chống lại một loạt các dịng tế bào ung thƣ ở ngƣời, nhƣng vẫn duy trì cá... của các prodigiosin đỏ sản xuất ra đƣợc ƣớc tính bằng cách đo độ hấp thụ ở 535 nm sử dụng chùm quang phổ tia UV khả kiến trong methanol đã đƣợc acid hĩa (0,01N HCI 4ml + 96ml methanol) (Goldschmidt và Williams, 1968). Khối lƣợng phân tử của chất màu tinh khiết đƣợc xác định bằng việc sử dụng quang phổ khối. Các 1 13 H- và C-NMR của các mẫu màu đƣợc ghi nhận sau khi hịa tan trong CDCl3. Các dịch chuyển hĩa đã đƣợc đối chiếu trong một TMS (trimetylsilyl) tín hiệu. Phổ FT-IR của các sắc tố đƣợc ghi nhận (Song và cộng sự, 2006). 41 Đồ án tốt nghiệp 1.4.4.2. Định lượng Mẫu tinh khiết của prodigiosin cho thấy nĩ cĩ độ hấp thụ cao và duy nhất tại bƣớc sĩng 535nm trong quang phổ UV (Giri và cộng sự, 2004). Chính vì vậy, nồng độ của các prodigiosin đỏ sản xuất ra đƣợc thu nhận trong methanol đã acid hĩa (với 0,01N HCI 4ml và 96ml methanol) sẽ đƣợc ƣớc tính bằng cách đo độ hấp thụ ở bƣớc sĩng 535 nm và sử dụng quang phổ UV khả kiến (Goldschmidt và Williams, 1968). Tổng số các sắc tố đƣợc ƣớc tính theo cơng thức sau (Chen và cộng sự, 2006; Williams và cộng sự, 1960): TP(µg/L)= Trong đĩ: TP: Biểu thị tổng số sắc tố thu đƣợc (μg/L). A: Độ hấp thụ của sắc tố đƣợc chiết xuất trong methanol ở 535 nm. D: Hệ số pha lỗng. V1: Thể tích methanol bổ sung vào. V2: Thể tích canh trƣờng ban đầu. 7.07×104 : Hệ số hấp thụ của prodigiosin. 1.5 Tiềm năng sản xuất prodigiosin của Serratia marcescens Trong nhiều thập kỷ qua, prodigiosin đƣợc biết đến là một hợp chất tự nhiên cĩ thể gây độc tế bào (Furstner, 2003) và đƣợc sản xuất bởi các vi sinh vật nhƣ Vibrio psychroerythrus (D’Aoust và Gerber,1974), Serratia marcescens, Pseudomonas magnesiorubra và một số vi khuẩn khác (Lewis và Corpe, 1964). Đặc trƣng của Serratia marcescens là sản xuất sắc tố đỏ khơng cĩ khả năng khuếch tán prodigiosin nên cĩ khuẩn lạc với màu đỏ rất đẹp (Kalesperis và cộng sự, 42 Đồ án tốt nghiệp 1975; Gargallo và cộng sự, 1987; Gargallo-Viola, 1989). S. marcescens cũng là một tác nhân gây bệnh cơ hội ở ngƣời với những chủng khơng sản xuất sắc tố gây đe dọa sức khỏe cộng đồng (Gargallo-Viola, 1989). Những chủng sản xuất sắc tố phân lập từ tự nhiên ít liên quan đến nhiễm trùng và thật thú vị là những sắc tố đỏ khơng tan trong nƣớc này lại đƣợc báo cáo là cĩ hoạt tính kháng sinh (Tsuji và cộng sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji và cộng sự, 1992; Songia và cộng sự, 1997). Các prodigiosin tốt nhất đƣợc biết đến là một chất màu đỏ nondiffusible gắn với lớp màng bên trong tế bào (Iranshahi và cộng sự, 2004). S. marcescens cũng sản xuất một chất hịa tan trong nƣớc, cĩ màu đỏ hồng-tím superoxidase dismutase (Hardjito và cộng sự, 2002). Ở S. marcescens khuẩn lạc rất nhỏ và ban đầu khơng cĩ màu, màu đầu tiên xuất hiện gần đƣờng kính khuẩn lạc khoảng 1mm (Haddix và Werner, 2000). S. marcescens chỉ tổng hợp sắc tố trong một điều kiện nhất định. Bizio và Sette đã phân lập đƣợc sắc tố đỏ sản xuất bởi các chủng Serratia và cố gắng sử dụng nĩ nhƣ là một loại thuốc nhuộm cho mục đích thƣơng mại. Tuy nhiên, ở dạng tinh khiết nĩ quá nhạy cảm với ánh sáng khi đƣợc sử dụng thực tế (Furstner, 2003). Serratia, giống các vi sinh vật họ Enterobacteriaceae khác, cĩ thể phát triển tốt trong điều kiện mơi trƣờng kỵ khí và hiếu khí. Nĩ phát triển tốt trên các mơi trƣờng tổng hợp, sử dụng các hợp chất khác nhau nhƣ một nguồn carbon duy nhất. Giri và cộng sự (2004) đã thực hiện thử nghiệm trên một loạt các mơi trƣờng và phát hiện ra trên mơi trƣờng từ hạt đậu phộng làm tăng một lƣợng đáng kể prodigiosin. Hơn nữa, một báo cáo chứng minh việc bổ sung silica gel vào mơi trƣờng lỏng của S. marcescens cũng dẫn đến sự tăng trƣởng tế bào, sản xuất prodigiosin và serrawettin (Yamashita và cộng sự,2001). Ngồi ra, prodigiosin thƣờng nằm trên màng tế bào, việc bổ sung các chất hoạt động bề mặt chẳng hạn nhƣ sodium dodecyl sulface (SDS) cũng cĩ thể nâng cao hiệu quả sản xuất prodigiosin (Wei và Chen, 43 Đồ án tốt nghiệp 2005). Hardjito và cộng sự (2002) báo cáo rằng việc sản xuất sắc tố bởi chủng phi lâm sàng (non-clinical) cĩ ý nghĩa khoa học và quan trọng, cĩ một mối quan hệ giữa quá trình sản xuất sắc tố với sự vắng mặt của plasmid. Do đĩ, sản xuất sắc tố do chủng phi lâm sàng của S. marcescens đã đƣợc quan tâm nghiên cứu sâu hơn để xác định mối quan hệ của quá trình sản xuất sắc tố và khả năng gây bệnh. Đặc điểm sắc tố của S. marcescens cũng khác nhau (Hardjito và cộng sự, 2002), chịu ảnh hƣởng của cả hai yếu tố di truyền và mơi trƣờng. Sản xuất các sắc tố tan trong nƣớc đƣợc tăng cƣờng bằng cách bổ sung polymyxin B (Suzuki và cộng sự, 2001), gramicidin và valinomycin vào mơi trƣờng tăng trƣởng (Hardjito và cộng sự, 2002). Khơng nghi ngờ gì nữa, sản xuất sắc tố bởi S. marcescens sẽ tiếp tục hấp dẫn các nhà vi sinh vật học, bác sĩ và kỹ sƣ cơng nghệ sinh học. Gần đây, prodigiosin đã đƣợc xem là hiệu quả nhƣ một tác nhân kiểm sốt sinh học với tảo cĩ hại trong mơi trƣờng biển tự nhiên, do đĩ, prodigiosin phải sản xuất với số lƣợng lớn để cĩ thể đáp ứng nhu cầu trong tƣơng lai (Someya và cộng sự, 2001). 44 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm 2.1.1. Thời gian Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 25/05/2015 đến ngày 15/08/2015. 2.1.2. Địa điểm Phịng Thí Nghiệm Cơng Nghệ Sinh Học, Khoa Cơng Nghệ Sinh Học – Thực phẩm - Mơi trƣờng, Trƣờng Đại Học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Nguồn vi sinh vật Nguồn vi khuẩn thử nghiệm là chủng Serratia marcescens_SH1 do Nguyễn Hồng Anh Kha phân lập từ tuyến trùng diệt sâu (EPN) Heterorhabditis indica CP 16 (H.CP 16) tại phịng Thí Nghiệm Cơng Nghệ Sinh Học, khoa Cơng nghệ Sinh học-Thực phẩm-Mơi trƣờng, Đại học Cơng nghệ TP. HCM, đƣợc định danh bằng phƣơng pháp sinh học phân tử cĩ số đăng kí trên genbank là KF534508.1. Vi khuẩn sử dụng đồng nuơi cấy gồm Bacillus sb, E. coli do phịng thí nghiệm khoa Cơng nghệ Sinh học - Thực phẩm - Mơi trƣờng cung cấp. 2.2.2. Mơi trường nuơi cấy và hĩa chất sử dụng 2.2.2.1. Mơi trường nuơi cấy ( thành phần mơi trƣờng xem phụ lục) - Mơi trƣờng Nutrient agar (NA); 45 Đồ án tốt nghiệp - Mơi trƣờng Nutrient broth (NB); - Mơi trƣờng Peptone glycerol broth (PG); - Mơi trƣờng huyền phù đậu phộng, pepton, dầu hƣớng dƣơng (MT3); - Mơi trƣờng huyền phù đậu phộng, pepton, dầu hƣớng dƣơng, muối NaCl (MT4). 2.2.2.2. Hĩa chất sử dụng - NaCl; HCl; NaOH; H2SO4 - Pepton, meat extract, agar - Nƣớc muối sinh lý 0,85%; nƣớc muối bão hịa - Ethanol 96%; Petrolium ether; Bismuth nitrate; KI; Ether; Acetic acid; Aceton; - Coomassie brilliant blue; Methanol; N-hexan; Etyl Acetate 2.2.2.3. Thiết bị và dụng cụ Thiết bị Nồi tiệt trùng Autoclave, cân kỹ thuật, cân phân tích, máy lắc, máy ly tâm, máy đo độ hấp thụ quang học, tủ lạnh thƣờng, tủ cấy vơ trùng, tủ ấm, kính hiển vi Dụng cụ Cốc thủy tinh, bình tam giác, bình định mức, pipet, micropipet, ống nghiệm, đĩa petri, Eppendorf, vi quản, bản mỏng TLC, đũa thủy tinh, que cấy,cuvet thủy tinh, đèn cồn 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phƣơng pháp luận 46 Đồ án tốt nghiệp Dựa trên mục tiêu đề tài “Cải tiến điều kiện lên men Serratia marcescens tổng hợp prodigiosin, cũng nhƣ phƣơng pháp thu hồi sắc tố thơ”, các nội dung nghiên cứu đã đƣợc đề ra với các phƣơng pháp luận nhƣ sau: Khảo sát chủng Serratia marcescens SH1 xem xét độ thuần khiết, khảo sát kháng sinh đồ so sánh chủng sử dụng với cơng bố về các chủng cĩ khả năng gây bệnh. Cải tiến điều kiện nuơi cấy Serratia marcescens SH1 tổng hợp prodigiosin: tăng thể tích lên men, ảnh hƣởng của vận tốc lắc, pH nuơi cấy, nồng độ muối NaCl, thử áp dụng phƣơng pháp đồng nuơi cấy tăng hợp chất thứ cấp, thử áp dụng bổ sung dịch nuơi cấy vi khuẩn Gram âm chứa phân tử tín hiệu Quorum sensing. Prodigiosin là hợp chất thứ cấp, quá trình tổng hợp thƣờng trễ hơn pha tăng trƣởng tế bào. Điều kiện nuơi cấy quyết định nồng độ prodigiosin tổng hợp. Nghiên cứu này dựa trên các báo cáo trƣớc đĩ của các tác giả cùng nhĩm (sinh viên năm trƣớc) và ngồi nƣớc để cải thiện điều kiện nuơi cấy cho chủng phân lập của phịng thí nghiệm. Thiết lập quy trình trích ly sắc tố thơ từ canh trƣờng nuơi cấy đáp ứng yêu cầu tăng hiệu suất trích ly, tiết kiệm dung mơi và an tồn sinh học. 2.4 Bố trí thí nghiệm Bố trí thí nghiệm theo sơ đồ trên hình 2.1 47 Đồ án tốt nghiệp Chủng VK SH1 Khảo sát thể tích lên men và vận tốc lắc trong nuơi cấy. Kiểm tra độ thuần khiết và khuẩn Xác định pH nuơi 1. Khảo sát chủng nuơi định S. marcescens cấy. cấy. Kháng sinh đồ Ảnh hƣờ ng của nồng độ muối 2. Cải tiến điều kiện lên NaCl men thu prodigiosin Xác định tỷ lệ dung Kh ảo sát sự ảnh 3. Thu hồi prodigiosin từ mơi trích ly hƣở ng của phƣơng pháp canh trƣờng đồng nuơi cấy. Cải thiện quá trình trích ly nhờ Kh ảo sát sự ảnh tiền xử lý gia hƣởng của sản nhiệt. phẩm Quorum Prodigiosin thơ (sắc tố sensing. thơ – STT) Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 48 Đồ án tốt nghiệp 2.5.1 Khảo sát chủng nuơi cấy 2.5.1 Kiểm tra độ thuần khiết Khảo sát hình thái khuẩn lạc Cấy ria chủng vi khuẩn SH1 đã đƣợc phân lập trên mơi trƣờng NA. Dùng dao sắc, nhỏ, cắt một miếng thạch mỏng, mép cắt sát với mép khuẩn lạc. Quan sát dƣới kính hiển vi ở hai gĩc độ là từ trên xuống và soi nghiêng ở vật kính 4X và 10X. 2.5.2 Kháng sinh đồ Sau khi kiểm tra độ thuần khiết, ngƣời thực hiện đề tài gửi chủng vi khuẩn đến cơng ty Nam Khoa, 793/58 Trần Xuân Soạn - Phƣờng Tân Hƣng Quận 7 - Thành phố HCM - Việt Nam để khảo sát kháng sinh đồ. Sử dụng các kháng sinh amoxicillin- clavulanic acid, ampicillin, tetracycline, cefuroxime và cefotaxime,ciprofloxacin, amikacin, ertapenem, ceftazidime, chloramphenicol, imipenem, trimethoprim/sulfamethoxazole, cefepime, piperacillin/tazobactam, gentamicin khuếch tán vào thạch Mueler-hinton. Tiêu chuẩn biện luận kháng sinh đồ theo Enterobacteriaceae đƣợc trình bày ở bảng 1 phần phụ lục. 2.6 Xác định điều kiện lên men 2.6.1 Ảnh hƣởng của thể tích lên men lên nồng độ prodigiosin tổng hợp Lên men đƣợc thực hiện trong bình tam giác với các nghiệm thức: đối chứng: 20 ml/bình, thí nghiệm 200 ml/bình và 400 ml/bình. Thí nghiệm lặp lại ba lần. Cách tiến hành Bƣớc 1 (nhân giống): từ ống thạch nghiêng đã kiểm tra đổ tinh khiết cũng nhƣ khẳng định là S. marcescens SH1, tiến hành nhân giống trong mơi trƣờng Nutrient broth trong 24, lắc 150 vịng/phút, ủ tối, nhiệt độ phịng. 49 Đồ án tốt nghiệp Bƣớc 2. Chuẩn bị mơi trƣờng lên men MT3 thành phần trong phụ lục 1 với thể tích nhƣ nêu trên. Đem hấp khử trùng trong 15’ ở áp suất 1 atm, nhiệt độ 1210C. Bƣớc 3: Cấy giống vi khuẩn thu từ canh trƣờng ở bƣớc 1, pha lỗng sao cho OD 600 nm ≈ 0,7 vào mơi trƣờng MT3 với tỷ lệ giống 3%. Lắc 200 vịng/phút ở 24h đầu, 150 vịng/phút ở 24h sau với nghiệm thức 20 ml/bình và lắc thêm 150 vịng/ phút với nghiệm thức 200 ml/bình và 400 ml/bình. Bƣớc 4: thu canh trƣờng, tiến hành trích ly theo sơ đồ trích ly hình 2.2 với tỷ lệ canh trƣờng : dung mơi (Ethanol : HCl 1N (95:5; v:v)) 1:2 (A:B 1:2). 50 Đồ án tốt nghiệp Hình 2.2 Sơ đồ trích ly 51 Đồ án tốt nghiệp Sau khi trích ly, loại bỏ dịch trong, gom dịch 1, dịch 2 và dịch 3 vừa trích ly, tiến hành đo OD ở bƣớc sĩng λ=535 nm hợp chất thu đƣợc và dựa vào đƣờng chuẩn sắc tố xác định hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu. 2.7.1 Khảo sát vận tốc lắc trong nuơi cấy Ngƣời thực hiện đề tài khảo sát vận tốc lắc cho bình lên men với thể tích 400 ml/bình ở các chế độ lắc đƣợc trình bày trên bảng 2.1 Bảng 2.1 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của máy lắc và chế độ lắc. Thí nghiệm Ngày Loại máy lắc Tốc độ (vịng/phút) 1 Máy lắc ngang 180 Nghiệm thức 1 2 Máy lắc ngang 150 3 Máy lắc vịng 150 1 Máy lắc ngang 180 2 Máy lắc ngang 150 Nghiệm thức 2 3 Máy lắc ngang 150 4 Máy lắc vịng 150 1 Máy lắc ngang 180 Nghiệm thức 3 2 Máy lắc ngang 150 52 Đồ án tốt nghiệp 3 Máy lắc ngang 150 4 Khơng sử dụng 0 1 Máy lắc vịng 200 Nghiệm thức 4 2 Máy lắc vịng 150 3 Máy lắc vịng 150 1 Máy lắc vịng 200 Nghiệm thức 5 2 Máy lắc vịng 200 3 Máy lắc vịng 200 Cách tiến hành, trích ly sắc tố và xác định hàm lƣợng prodigiosin nhƣ trong thí nghiệm 2.6.1. 2.7.2 Xác định pH tối ưu cho mơi trường lên men Chuẩn bị mơi trƣờng lên men MT3 với thể tích 20 ml/bình, điều chỉnh pH ≈ 7.2 lặp lại cho 3 bình thí nghiệm và 3 bình khơng điều chỉnh pH làm đối chứng. Đem hấp khử trùng trong 15’ ở áp suất 1 atm, 1210C. Các bƣớc nhân giống, lên men và xác định hàm lƣợng prodigiosin tiến hành giống thí nghiệm 2.6.1 lắc 200 vịng/phút ở 24h đầu và 150 vịng/phút ở 24h sau. 2.7.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl Các bƣớc nhân giống và lên men tiến hành giống thí nghiệm 2.6.1 lắc 200 vịng/phút ở 24h đầu và 150 vịng/phút ở 24h sau, điều chỉnh pH phù hợp với kết quả 53 Đồ án tốt nghiệp của thí nghiệm 2.7.2. Bổ sung nồng độ muối NaCl tỷ lệ với thể tích canh trƣờng lên men lần lƣợt là 0% (đối chứng), 1%, 2%, 3%, lặp lại 3 lần với mỗi nghiệm thức. Sau khi trích ly, tiến hành đo OD ở bƣớc sĩng 535 nm hợp chất thu đƣợc và dựa vào đƣờng chuẩn sắc tố xác định hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu. Đo pH canh trƣờng sau nuơi cấy, xác định nồng độ NaCl cho nồng độ prodigiosin tổng hợp cao nhất trong tƣơng quan với pH sau nuơi cấy. 2.7.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của phương pháp đồng nuơi cấy 2.7.4.1 Thí nghiệm đồng nuơi cấy với vi khuẩn Bacillus subtilis Cách tiến hành Bƣớc 1 ( nhân giống Serratia marcescens SH1) từ ống thạch nghiêng đã kiểm tra độ tinh khiết cũng nhƣ khẳng định là S. marcescens SH1, tiến hành nhân giống trong mơi trƣờng NB trong 24h, lắc 150 vịng/phút, ủ tối, nhiệt độ phịng. Nhân giống cho vi khuẩn Bacillus subtilis: từ ống thạch nghiêng đã đƣợc cấy thuần, tiến hành nhân giống trong mơi trƣờng NB trong 24h, lắc 150 vịng/phút, nhiệt độ phịng. Bƣớc 2: Thu canh trƣờng, pha lỗng sao cho OD 600 nm ≈ 0,7. Cấy giống vào MT4 (MT3 + %NaCl ở thí nghiệm 2.6.3 đƣợc điều chỉnh pH tối ƣu khảo sát ở thí nghiệm 2.6.2) với các nghiệm thức nhƣ sau: Đối chứng: Cấy giống vi khuẩn S. marcescens vào mơi trƣờng MT4, tỷ lệ giống 3% . Nghiệm thức S/B = 2/1: Cấy giống đồng thời hai giống vi khuẩn S. marcescens tỷ lệ 3 % và vi khuẩn Bacillus subtilis tỷ lệ 1,5%. 54 Đồ án tốt nghiệp Nghiệm thức S/B = 1/1: Cấy giống đồng thời hai giống vi khuẩn S. marcescens tỷ lệ 3 % và vi khuẩn Bacillus subtilis tỷ lệ 3%. Nghiệm thức S/B = 1/2: Cấy giống đồng thời hai giống vi khuẩn S. marcescens tỷ lệ 3 % và vi khuẩn Bacillus subtilis tỷ lệ 6%. Bƣớc 3: lắc 200 vịng/phút ở 24h đầu và 150 vịng/phút ở 24h sau, ủ tối, nhiệt độ phịng. Sau 48h thu canh trƣờng, tiến hành trích ly theo sơ đồ hình 2.2 nhƣ trong thí nghiệm 2.6.1. Sau khi trích ly, tiến hành đo OD ở bƣớc sĩng 535 nm hợp chất thu đƣợc và dựa vào đƣờng chuẩn sắc tố xác định hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu. 2.7.4.2 Thí nghiệm đồng nuơi cấy với vi khuẩn Echerichia coli Các bƣớc tiến hành thực hiện giống thí nghiệm 2.7.4.1 và thay chủng vi khuẩn Bacillus subtilis là vi khuẩn gram + bằng vi khuẩn gram – E. coli. 2.7.5 Khảo sát sự ảnh hưởng của sản phẩm Quorum sensing. Bƣớc 1 ( nhân giống cấp 2): từ ống thạch nghiêng đã kiểm tra độ tinh khiết cũng nhƣ khẳng định là S. marcescens SH1, tiến hành nhân giống cấp 2 trong mơi trƣờng NB trong 24h, lắc 150 vịng/phút, ủ tối, nhiệt độ phịng. Bƣớc 2: lên men S. marcescens mơi trƣờng MT5 (đậu phộng 10%+ peptone 5% + dầu hƣớng dƣơng 1% + 10ml H2O cất + % NaCl tối ƣu khảo sát ở thí nghiệm 2.7.3 và điều chỉnh pH thích hợp theo thí nghiệm 2.7.2), tỷ lệ cấy giống 3%. Đối chứng: MT5 + 10ml nƣớc cất. Nghiệm thức 1: MT5 + 10ml dịch nuơi cấy S. marcescens đã loại bỏ tế bào. Nghiệm Thức 2: MT5 + 10 ml dịch nuơi cấy E. coli đã loại bỏ tế bào. 55 Đồ án tốt nghiệp Bƣớc 3: lắc 200 vịng/phút ở 24h đầu và 150 vịng/phút ở 24h sau, ủ tối, nhiệt độ phịng. Sau 48h thu canh trƣờng, tiến hành trích ly theo sơ đồ hình 2.2. Sau khi trích ly, tiến hành đo OD ở bƣớc sĩng 535 nm hợp chất thu đƣợc và dựa vào đƣờng chuẩn sắc tố xác định hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu. 2.8 Thu hồi sản phẩm thơ 2.8.1 Xác định tỷ lệ trích ly dung mơi đồng thời khảo sát thể tích lên men Trích ly sắc tố bằng dung mơi Ethanol : HCl (95:5) với tỷ lệ canh trƣờng : dung mơi (A:B) nhƣ các nghiệm thức sau 2:3, 1:2, 2:5. Trích ly theo sơ đồ hình 2.1 ở thí nghiệm 2.6.1. Sau khi trích ly, tiến hành đo OD ở bƣớc sĩng 535 nm hợp chất thu đƣợc và dựa vào đƣờng chuẩn sắc tố xác định hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu. 2.8.2 Cải thiện quá trình trích ly nhờ gia tăng nhiệt độ Các bƣớc tiến hành lên men thực hiện tƣơng tự thí nghiệm 2.6.1 Sau đĩ gia nhiệt canh trƣờng ở 1000C, 15 phút. Tiến hành trích ly theo sơ đồ hình 2.2. Sau khi trích ly, tiến hành đo OD ở bƣớc sĩng 535 nm hợp chất thu đƣợc và dựa vào đƣờng chuẩn sắc tố xác định hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu. 2.9 Các phƣơng pháp phân tích Phân tích prodigiosin Quang phổ hấp thụ UV/VIS, thiết bị đo mật độ quang. Nồng độ hợp chất prodigiosin đƣợc xác định dựa vào đƣờng chuẩn hợp chất và giá trị đo OD tại bƣớc sĩng λ =535 nm. 56 Đồ án tốt nghiệp 2.9.1 Xác định protein cĩ trong mẫu 2.9.1.1 Phản ứng Biuret’s test Hút 1 ml mẫu thêm 5-8 giọt NaOH 10% sau đĩ thêm 1-2 giọt CuSO4 3%. Đem đun cách thủy từ 1-2 phút. Nếu dƣơng tính (+) sẽ tạo phức màu tím và ngƣợc lại. 2.9.1.2 Phản ứng Nynhydrin Hút 1ml mẫu vào ống nghiệm sau đĩ thêm 1ml nynhydrin 1%, đun nĩng 1-2 phút. Mẫu sau khi đun nĩng cĩ màu tím thì đƣợc xem là dƣơng tính (+). 2.9.2 Xác định lipid cĩ trong mẫu Chấm mẫu trên bản mỏng sắc ký. Dùng CBB (Coomassie brilliant blue) 0.03% trong methanol 20% xịt và sấy 100oC. Mẫu cĩ màu xanh trên nền sáng đƣợc coi là cĩ lipid trong mẫu. 2.10 Sắc ký bản mỏng TLC Sử dụng dung mơi Petrolium ether: Ether : Acetic acid (70:40:2, v:v:v) và bản mỏng silica gel. Chuẩn bị bản sắc ký Dùng bút chì và thƣớc kẻ vạch đƣờng xuất phát để chấm mẫu cách mép dƣới 2cm và vạch kết thúc cách mép trên bản sắc ký 0,5 cm (Hình ...). Lƣu ý: khơng chạm tay lên bản silicagel. Dùng bút chì vạch và chấm nhẹ lên bản silicagel tránh trầy xƣớc lớp silicagel. 57 Đồ án tốt nghiệp Vạch kết 0,5 cm thúc Vạch xuất phát 2 cm Hình 2.3 Cách chuẩn bị giấy chạy sắc ký Mẫu sắc tố đƣợc chấm lên bản sắc ký theo vị trí đã đƣợc xác định trên vạch xuất phát. Dùng vi quản để chấm mẫu. Mẫu chấm phải gọn, khơng lan rộng, cĩ thể dùng máy sấy để làm khơ ngay. Chấm lặp lại nhiều lần để số lƣợng mẫu nạp đủ mức cần thiết. Tiến hành chạy sắc ký Tiến hành cho mẫu chạy sắc ký với hệ dung mơi trên. Cho bản sắc ký vào buồng sắc ký chứa sẵn dung mơi. Đảm bảo dung mơi tiếp xúc gần sát vạch xuất phát. Đậy nắp bình để tránh thất thốt dung mơi và tránh ảnh hƣởng đến sức khỏe. Dung mơi sẽ thấy lên bản sắc ký theo lực mao dẫn và phân tách các thành phần của mẫu. Chấm dứt chạy sắc ký khi dung mơi thấm đến vạch kết thúc. 58 Đồ án tốt nghiệp 2.11 Phƣơng pháp phân tích 2.11.1. Phương pháp định lượng hợp chất prodigiosin Mục đích Xác định đƣợc lƣợng hợp chất prodigiosin cĩ trong mẫu từ đĩ đƣa ra kết luận cho thí nghiệm. Nội dung Nồng độ hợp chất prodigiosin đƣợc xác định dựa vào đƣờng chuẩn hợp chất và giá trị đo OD tại bƣớc sĩng λ =535 nm. 2.11.2. Phương pháp xử lý số liệu thống kê Các số liệu thơ đƣợc xử lý outlier trên phần mềm Statgraphics Centurion XV. Các số liệu sau đĩ đƣợc phân tích ANOVA và đƣợc trắc nghiệm phân hạng LSD với mức ý nghĩa 0,05. Các số liệu đƣợc tính tốn và xử lý trên phần mềm Microsoft Office Excel 2010. Các biểu đồ cũng đƣợc thể hiện bằng phần mềm này. 59 Đồ án tốt nghiệp Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả kiểm tra độ thuần khiết Hình thái khuẩn lạc Chủng S. marcescens SH1 sau khi nuơi cấy trên mơi trƣờng NA (hình 3.1) tạo khuẩn lạc đặc trƣng trịn, lồi, màu đỏ, cĩ quầng sáng bao quanh. Đây cũng chính là đặc điểm hình thái S. marcescens theo mơ tả của David (2002). Hình 3.1 Khuẩn lạc chủng SH1 nuơi cấy trên mơi trƣờng NA Chủng SH1 tổng hợp sắc tố đỏ trên mơi trƣờng NA làm cho khuẩn lạc cĩ màu đỏ (Hình 3.1) nhƣ theo mơ tả của các tài liệu về khả năng tổng hợp sắc tố của Serratia marcescens (Grimont và Grimont, 2006; Anita và cộng sự, 2006; Chidambaram và cộng sự, 2009; Antony và cộng sự, 2011). 60 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc soi thằng và soi nghiêng dƣới kính hiển vi vật kính 10X. Kết quả nhuộm gram Nhuộm Gram là hình thức quan sát vi thể hình thái tế bào vi sinh vật và là cách đơn giản nhất, nhanh nhất để phân biệt vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dƣơng. Kết quả hình 3.3 cho thấy chủng phân lập cĩ lớp peptidoglycan mỏng nên khơng giữ đƣợc phức hợp crystal violet – iodine sau khi tẩy cồn và tiếp tục bắt màu hồng với thuốc nhuộm fuchsin. Điều này cho thấy hai chủng phân lập đƣợc là Gram âm, phù hợp với những mơ tả về Serratia marcescens (Williams và Qadri, 1980; Grimont và Grimont, 2006; David R.C.,2012). 61 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.3 Kết quả nhuộm Gram chủng SH1 Sau khi khẳng định là S. marcescens SH1, gửi mẫu cho cơng ty Nam Khoa thực hiện kháng sinh đồ đƣợc kết quả nhƣ hình 3.4. Hình 3.4 Kết quả kháng kháng sinh của chủng SH1 62 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1 Kết quả kháng kháng sinh S(Sensitivity) - Nhạy cảm: nghĩa là vi khuẩn gây nhiễm khuẩn cĩ thể điều trị đƣợc với liều thơng thƣờng đã đƣợc khuyến cáo. I(Intermediate) - Trung gian: là kiểu kháng trong đĩ với những nồng độ ức chế tối thiểu của một kháng sinh thƣờng đạt đƣợc trong máu và tổ chức cho đáp ứng thấp hơn so với kiểu nhậy cảm (S). Kháng trung gian phản ánh hiệu quả lâm sàng tại các cơ quan, bộ phận mà thuốc phân bố. R(Resistan) - Đề kháng: chủng vi khuẩn khơng bị ức chế bởi bất cứ nồng độ nào của thuốc mà cơ thể cĩ thể chấp nhận đƣợc. Kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch Mueler-hinton cĩ chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh đƣợc biểu hiện bằng đƣờng kính các vịng vơ khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh. Cũng giống nhƣ các chủng khác của Enterobacteriaceae, S. marcescens và các lồi Serratia khác đều kháng penicillin G, các macrolides, clindamycin, linezolid, các glycopeptide, quinupristin-dalfopristin và rifampin (Department of Pathology and Area Laboratory Services, Madigan Healthcare System, Tacoma, Washington, 2011). Hầu hết các chủng vi khuẩn thuộc chi Serratia, trong đĩ cĩ S. marcescens thƣờng kháng ampicillin, amoxicillin, amoxicillin-clavulanate, ampicillin-sulbactam, 63 Đồ án tốt nghiệp cephalosporin phổ hẹp, cephamycins, cefuroxime, nitrofurantoin và colistin (CLSI, 2011; Stock và cộng sự, 2003). Cũng theo nghiên cứu của Stock và cộng sự thì một số chủng Serratia nhƣ S. marcescens, S.odorifera, và S. rubidaea kháng nội với tetracycline. Thực tế là S. marcescens là một loại vi sinh vật đề kháng với rất nhiều loại kháng sinh đã đƣợc cơng nhận ở nhiều trƣờng hợp. Ví dụ Wheat và cộng sự, trong báo cáo chuyên đề của họ về 11 trƣờng hợp nhiễm trùng tiểu từ San Francisco vào năm 1951, sau này xác định là S. marcescens, làm viêm màng trong tim gây tử vong do kháng polymyxin B, Terramycin (oxytetracycline), chloramphenicol, streptomycin và penicillin, nhạy cảm trung bình với sulfonamid. Kết quả kháng sinh đồ ở bảng 3.1 và hình 3.4 cho thấy chủng S. marcescens SH1 kháng 3 loại kháng sinh thơng dụng là amoxicillin-clavulanic acid, ampicillin, tetracycline, đúng nhƣ mơ tả ở các báo cáo trên. Sở dĩ S. marcescens SH1 kháng kháng sinh amoxicillin-clavulanic acid bởi vì amoxicilin rất dễ bị phá hủy bởi beta - lactamase, do đĩ khơng cĩ tác dụng đối với những chủng vi khuẩn sản sinh ra các enzyme này (S. marcescens SH1 thuộc chủng Enterobacteriaceae cĩ khả năng sản sinh ra enzyme này). Đối với 2 kháng sinh cịn lại là ampicillin, tetracycline là 2 kháng sinh phổ rộng thế hệ cũ chủng S. marcescens SH1 cũng gây ra tính kháng. Ngồi ra theo bảng 3.1 thì chủng S. marcescens SH1 cũng kháng yếu với kháng sinh cefuroxime và cefotaxime. Một số loại kháng sinh nhạy cảm với Serratia rất phổ biến nhƣ quinolone và trimethoprim-sulfamethoxazole. Qua khảo sát tất cả 110 chủng S. marcescens thu hồi từ các mẫu bệnh 2008-2010 đều nhạy cảm với trimethoprim-sulfamethoxazole. Nĩi chung, hầu hết các lồi Serratia rất nhạy cảm với các kháng sinh nhĩm aminoglycosides. (Stock và cộng sự, 2003). 64 Đồ án tốt nghiệp Qua bảng 3.1 và hình 3.4 thì chủng S. marcescens SH1 cĩ tính nhạy cảm với các kháng sinh ciprofloxacin, amikacin, ertapenem, ceftazidime, chloramphenicol, imipenem, trimethoprim/sulfamethoxazole, cefepime, piperacillin/tazobactam, gentamicin. Serratia marcescens SH1 là chủng đƣợc phân lập từ tuyến trùng gây bệnh cơn trùng. Việc ứng dụng chủng phân lập từ mơi trƣờng tự nhiên ứng dụng trong cơng nghệ sinh học sản xuất các sản phẩm thuốc đã đƣợc nghiên cứu và thực hành trong nhiều năm qua. Do Serratia marcescens là chủng tự thân kháng nhiều kháng sinh và nằm trong danh sách đối tƣợng vi sinh vật gây bệnh cơ hội nên các biện pháp an tồn sinh học cần đƣợc áp dụng khi nghiên cứu và sản xuất. 3.2 Xác định điều kiện lên men thu prodigiosin Quá trình này đƣợc thực hiện vì các nghiên cứu trƣớc đĩ của các bài báo nƣớc ngồi cho nhiều kết quả khác nhau vì nhiều lý do, mà chủ yếu là các điều kiện mơi trƣờng. Vì vậy ngƣời thực hiện đề tài tiến hành thí nghiệm này với mục đích tìm ra đƣợc điều kiện nuơi cấy phù hợp với mơi trƣờng phịng thí nghiệm tại Việt Nam. 3.2.1 Ảnh hưởng của thể tích lên men lên hàm lượng prodigiosin tổng hợp Các thí nghiệm lên men tổng hợp prodigiosin từ S. marcescens SH1 trƣớc kia đƣợc tiến hành với quy mơ nhỏ phịng thí nghiệm, thể tích lên men là 20 ml/bình. Để cĩ thể cung cấp thơng số kỹ thuật cho quá trình lên men việc tăng thể tích thí nghiệm là tất yếu. Vì vậy ngƣời thực hiện đề tài thử thực hiện lên men với cùng thơng số cung cấp từ DATN Trần Lâm Tú Quyên 10DSH với quy mơ 200 ml/bình và 400 ml/bình. 65 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2 % Hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp so với đối chứng (thí nghiệm A) Tỉ lệ Thí nghiệm A Thí nghiệm B Thí nghiệm C (20 ml/bình) (%) (200 ml/bình) (%) (400 ml/bình) (%) Trung bình 100 ± 0 82,9 ± 3,2 47,8 ± 3,8 Kết quả cho thấy (hình 3.5) quy mơ lên men tăng làm giảm hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp. Khi thể tích tăng từ 20 ml lên 200 ml thì hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp chỉ bằng (82,9 ± 3,2) % so với đối chứng, khi thể tích là 400 ml thì tỷ lệ này chỉ cịn (47,8 ± 3,8) % so với đối chứng. Một điểm nữa cần nhận xét là màu hồng xuất từ 24-48 giờ khi lên men 20 ml thì chỉ xuất hiện sau 48 giờ ở quy mơ lên men lớn hơn. Vì vậy thời gian lên men ở mẫu thí nghiệm là 72 giờ, tăng thêm 24 giờ so với đối chứng. Hình 3.5. Ảnh hƣởng của thể tích lên men lên hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp 66 Đồ án tốt nghiệp Phân tích nguyên nhân gây giảm hàm lƣợng prodigiosin khi tăng thể tích lên men cĩ thể dễ dàng nhận thấy yếu tố ảnh hƣởng mạnh nhất là oxy. Do mơi trƣờng đậu phộng cĩ độ nhớt cao nên nhu cầu khuấy đảo (hoặc lắc) mạnh hơn để đạt đến cùng một nhu cầu oxy cho vi sinh vật. Vì vậy ngƣời thực hiện đề tài khảo sát ảnh hƣởng của chế độ lắc lên khả năng tổng hợp prodigiosin trong thí nghiệm tiếp theo. 3.2.2 Xác định vận tốc lắc Quá trình lên men tạo sinh khối tế bào đề thu hợp chất thứ cấp rất cần oxi để cung cấp cho vi khuẩn S. marcescens sinh tổng hợp. Khi chọn đƣợc số vịng lắc thích hợp sẽ kích thích quá trình tăng trƣởng tế bào và đồng thời sinh tổng hợp prodigiosin. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Hàm lƣợng prodigiosin khi thay đổi vận tốc lắc. Thí nghiệm Prodigiosin trung bình trích ly đƣợc từ 1ml canh trƣờng lên men mg/ml 1(180N/150N/150V) 8,9 2(180N/150N/150N/150V) 1,7 3(180N/150N/150N/0) 0,0 4(200V/150V/150V) 9,1 5(200V/200V/200V) 10,6 67 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.6 Hàm lƣợng prodigiosin khi thay đổi vận tốc lắc Từ kết quả ở hình 3.6 và bảng 3.3 nhận thấy việc sử dụng máy lắc ngang và máy lắc vịng cũng nhƣ thay đổi vịng lắc cĩ ảnh hƣởng đến hàm lƣợng prodigiosin. Trong 5 nghiệm thức ta thấy sử dụng máy lắc vịng ở chế độ lắc 200/200/200 vịng/phút thu đƣợc kết quả tốt nhất. Do điều kiện cơ sở vật chất khơng cho phép nên việc lặp thí nghiệm chƣa tốt, nhƣng qua thí nghiệm kết luận đƣợc rằng việc sử dụng máy lắc vịng tốt hơn máy lắc ngang và tốt nhất ở chế độ lắc 200/200/200 vịng/phút. Mơi trƣờng đậu phộng cĩ độ nhớt cao làm tăng nhu cầu oxy cung cấp. Quy mơ lên men càng lớn thì địi hỏi lực khuấy đảo càng cao. Cũng do mơi trƣờng nhƣ vậy và màu hồng canh trƣờng xác định oxy hịa tan khơng thực hiện đƣợc bằng phƣơng pháp hĩa học nhƣ phƣơng pháp chuẩn độ iot – thiosunfat do L.W.Winkler đề xuất từ năm 1914, đã cĩ nhiều cải 68 Đồ án tốt nghiệp tiến để phù hợp với mẫu. Do đĩ nhu cầu oxy thực sự khơng xác định đƣợc, mà chỉ xác định đƣợc số vịng lắc thích hợp trong điều kiện thí nghiệm. 3.2.3 Kết quả xác định pH tối ưu cho mơi trường MT3 Quá trình tăng trƣởng của vi sinh vật rất nhạy cảm với pH, mỗi vi sinh vật thích ứng với khoảng pH khác nhau. Vì vậy, tìm ra đƣợc pH phù hợp sẽ giúp cho quá trình tăng trƣởng tế bào của vi sinh vật phát triển tốt hơn và tổng hợp hợp chất mong muốn. S. marcescens cĩ thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012). Samrot và cộng sự (2011), đã thực hiện quá trình tối ƣu hĩa sản xuất prodigiosin bởi Serratia marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của prodigiosin. Kết quả cho thấy điều ki...un canh trƣờng ở 100oC trong 15 phút trƣớc khi trích ly Ethanol :HCl cho hàm lƣợng prodigiosin cao hơn mẫu đối chứng là 157,12%. Đồng thời tiêu diệt vi sinh vật và tối ƣu hĩa quá trình trích ly mà khơng làm thay đổi bản chất hợp chất thứ cấp trích ly là prodigiosin. Trong tất cả các mẫu trích ly prodigiosin bằng Ethanol : HCl, khơng bổ sung hay bổ sung muối NaCl, đun hay khơng đun đều cho kết quả chứa lipid và protein. 91 Đồ án tốt nghiệp 4.2 Kiến nghị Phƣơng pháp đồng nuơi cấy hoặc bổ sung dịch trong canh trƣờng vi khuẩn Gram âm đều khơng đạt kết quả mong đợi, cần đƣợc nghiên cứu thêm. Nghiên cứu lên men quy mơ fermenter. Khảo sát thêm việc bổ sung enzyme protease vào mơi trƣờng đậu phộng để giảm hàm lƣợng peptone trong mơi trƣờng. 92 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Nguyễn Hồng Anh Kha, 2013. Thu nhận sắc tố màu đỏ dạng prodigiosin tổng hợp bởi vi khuẩn phân lập từ tuyến trùng EPN. Đồ án tốt nghiệp. Nguyễn Hiếu Dân, 2013. Khảo sát hoạt tính sinh học của vi khuẩn Serratia marcescens phân lập từ tuyến trùng EPN và hợp chất màu dạng prodigiosin tổng hợp bởi vi khuẩn này. Đồ án tốt nghiệp. Trần Lâm Tú Quyên, 2014. Thiết lập mơi trường dinh dưỡng và điều kiện nuơi cấy để sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn S. marcescens SH1. Đồ án tốt nghiệp. Võ Hồng Thi, 2012. Bài giảng thực hành hĩa kỹ thuật mơi trường. Trƣờng ĐH Cơng nghệ Tp.HCM Tài liệu tiếng anh Aguilera M.M. and Smart J.R.(1993). Development, reproduction, and pathogenicity of Steinernema scapterisci in monoxenic culture with different species of bacteria, J. Invertebr, Pathol, 62: 289-294. Amaya D.B.R. (2001). A Guide to Carotenoid Analysis in Foods, OMNI Research, ILSI Press, United States of America, pp. 1 -71. Anita Khanafari, Mahnaz Mazaheri Assadi and Fatemeh Ahmadi Fakhr (2006). Review of Prodigiosin, Pigmentation in Serratia marcescens, Online Journal of Biological Sciences, 6 (1): 1-13. Antony V. S., Chandana K., Senthilkumar P., Narendra K. G. (2011). Optimization of prodigiosin production by Serratia marcescens SU-10 and evaluation of its 93 Đồ án tốt nghiệp bioactivity. International Research Journal of Biotechnology, Vol.2(5), 128- 133. Bauernfeind J.C. (1981) Natural food colors. Carotenoids as Colorants and Vitamin A Precursors, Bauernfeind J.C., Academic Press, New York, 1-45. Bizio B. (1823). Lettera di Bartolomeo Bizio al chiarissimo canonico Angelo Bellani sopra il fenomeno della polenta porporina Biblioteca Italiana o sia Giornale di Letteratura, Scienze e Arti, 30: 275-295. Brigida P.V. de Q. and Itamar S. de M. (2006). Antagonism of Serratia marcescens towards Phytophithora parasitica and its effects in promoting the growth of Citrus, Brazilian Journal of Microbiology, 37: 448-450. Casullo de Arẳjo, Helvia W., K. Fukushima, and Galba M. Campos Takaki. "Prodigiosin production by Serratia marcescens UCP 1549 using renewable- resources as a low cost substrate." Molecules 15.10 (2010): 6931-6940. Cerdeno A. M., Bibb M. J., Challis G. L. (2001). Analysis of the prodiginine biosynthesis gene cluster of Streptomyces coelicolor A3 (2): new mechanisms for chain initiation and termination in modular multienzymes. Chem. Biol, 8, 817-829. Chang, Chia-Che, et al. "Development of natural anti-tumor drugs by microorganisms." Journal of bioscience and bioengineering 111.5 (2011): 01-511. Chandni Gulani, Sourav Bhattacharya and Arijit Das (2012). Assessment of process parameters influencing the enhanced production of prodigiosin from Serratia marcescens and evaluation of its antimicrobial, antioxidant and dyeing potentials. 94 Đồ án tốt nghiệp Chen D., Han Y., Gu Z. (2006). Application of statistical methodology to the optimization of fermentative medium for carotenoids production by Rhodobacter sphaeroides. Process Biochem, 41, 1773-1778. Chidambaram K.V., Perumalsamy L. (2009). An Insightful Overview on Microbial Pigment, Prodigiosin, Electronic Journal of Biology, Vol. 5(3): 49-61. CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA), (2011). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 21st informational supplement. CLSI document M100–S21. Counsell J.N., Jeffries G.S. and Knewstubb C.J. (1979). Some other natural colors and their applications, Natural Colors for Foods and Other Uses, Counsell J.N. and Dunastable J.A., Eds Applied Science, London, 122-151. D'Alessio R., Bargiotti A., Carlini O., Colotta F., Ferrari M., Gnocchi P., Isetta A., Mongelli N., Motta P., Rossi A., Rossi M., Tibolla M., Vanotti E. (2000). Synthesis and immunosuppressive activity of novel prodigiosin derivatives. J. Med. Chem, 43, 2557-2565. Dauenhauer S.A., Hull R.A. and Williams R.P. (1984). Cloning and expression in Escherichia coli of Serratia marcescens genes encoding prodigiosin biosynthesis, Journal of Bacteriology, 158: 1128-1132. David R. Caprette (2012). Enterobacteriaceae: Serratia marcescens. Rice University. Houston, Texas, US. Department of Pathology and Area Laboratory Services, Madigan Healthcare System, Tacoma, Washington (2011). Serratia Infections: from Military Experiments to Current Practice, p. 755–791 Vol. 24, No. 4 95 Đồ án tốt nghiệp Doi, Y., et al. (2004). Plasmid-mediated 16S rRNA methylase in Serratia marcescens conferring high-level resistance to aminoglycosides. Antimicrob. Agents Chemother. 48:491–496. Estrada, Castro, Regina Basurto-Ríos, Jorge Toledo, Jorge E. Ibarra (2012). Phoresis between Serratia marcescens and Steinernema carpocapsae (Rhabditida: Steinernematidae) during Infection of Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) Larvae, Florida Entomologist, 95(1):120-127. Feng J.S., Webb J.W. and Tsang J.C. (1982). Enhancement by sodium dodecyl sulfate of pigment fonnation in Serratia marcescens O8, Appl, Environ, Microbiol, 43: 850-853. Florencio J.A., Soccol C.R., Furianetto L.F., Bonfim T.M.B., Krieger N., Baron M. and Fontana J.D. (1998). A factorial approach for a sugarcane juice- based low cost culture medium: increasing the astaxanthin production by the red yeast Phaffia rhodozyma, Bioprocess Eng, 19,161-164. Fodor A., Fodor A.M., Forst S., Hogan J.S., Klein M.G., Lengyel K., Saringer G., Stackebrandt E., Taylor R.A.J. and Lehoczky E. (2010). Comparative analysis of antibacterial activities of Xenorhabdus species on related and non-related bacteria in vivo, J. Microbiol, Antimicrob, 2: 36-46. Furstner A. (2003). Chemistry and biology of roseophilin and the prodigiosin alkaloids: A survey of the last 2500 years, Chem Int Ed Engl, 42: 3582-3603 Khanafari, Anita, Mahnaz M. Assadi, and Fatemeh A. Fakhr. "Review of prodigiosin, pigmentation in Serratia marcescens." Online Journal of Biological Sciences 6.1 (2006): 1. 96 Đồ án tốt nghiệp Gaughran, E. R. L. (1969). From superstition to science: the history of a bacterium. Trans. N. Y. Acad. Sci. 31:3–24. Gargallo D., Loren J.G., Guinea J., Vinas M. (1987). Glucose-6-phosphate dehydrogenase alloenzymes and their relationship to pigmentation in Serratia marcescens, Appl Environ Microbiol, 53: 1983-1986. Gaughran E.R.L. (1969). From superstition to science the history of a bacterium,Transactions of the New York Academy of Sciences, 31:3-24. Gauthier, M. J. "Alteromonas rubra sp. nov., a new marine antibiotic-producing bacterium." International Journal of Systematic Bacteriology 26.4 (1976): 459-466. Gillen A.L. and Gibbs R. (2011). Serratia marcescens: The Miracle Bacillus, Department of Biology and Chemistry, Liberty University. Giri, Anuradha V., et al. “ A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil”, BMC microbiology 4.1 (2004): 11. Goldschmidt M.C. and WiIliams R.P. (1968). Thiamine-induced Formation of the Monopyrrole Moiety of Prodigiosin, J. Bacteriol, 96: 609-616. Grimont, Patrick AD, and Francine Grimont. "The genus Serratia." Annual Reviews in Microbiology 32.1 (1978): 221-248. Gulani, Chandni, Sourav Bhattacharya, and Arijit Das. Assessment of process parameters influencing the enhanced production of prodigiosin from Serratia marcescens and evaluation of its antimicrobial, antioxidant and dyeing potentials. Malaysian Journal of Microbiology 8.2 (2012): 116-122. 97 Đồ án tốt nghiệp Han S.B., Park S.H., Jeon Y.J., Kim Y.K., Kim H.M., Yang K.H. (2001). Prodigiosin blocks T cell activation by inhibiting interleukin - 2Rα expression and delays progression of autoimmune diabetes and collagen induced arthritis, J Pharm Exp Ther, 299: 415-425. Hardjito L., Huq A., Colwell R.R. (2002). The influence of environmental conditions on the production of pigment by Serratia marcescens, Biotechnol Bioprocess Eng, 7: 100-104. Harris K.P., Williamson R., Slater H., Cox A., Abbasi S., Foulds I., Simonsen T., Leeper J. and Salmond P.C. (2004). The Serratia gene cluster encoding biosynthesis of the red antibiotic, prodigiosin, shows species and strain dependent genome context variation, Microbiol, 150: 3547-3560. Heinemann B., Howard A. J., Pa1ocz. H. J. (1970). Influence of Dissolved Oxygen Levels on Production of L-Asparaginase and Prodigiosin by Serratia marcescens. Appl. Microbiol, 19, 800-804. Helvia W.C. de A., Fukushima K. and Gallba M.C.T. (2010). Prodigiosin Production by Serratia marcescens UCP 1549 Using Renewable-Resources as a Low Cost Substrate, Molecules, 15: 6931-6940. Hidalgo-Romano B., Benjamin. Microbiology (2014). Indole inhibition of N-acylated homoserine lactone-mediated quorum signalling is widespread in Gram-negative bacteria, 160,2464–2473. Hiroaki M., Hiroyuki A., Masakatsu F., Takeji S., Teisuya T. (1996). Industrial production of optically active intermediate in the synthesis of dialtizem with lipase, Seibutsu kogaku, 74: 273-288. 98 Đồ án tốt nghiệp Kataoka T., Magae J., Kasamo K., Yamanishi H., Endo A., Yamasaki M., Nagai K. (1992). Effects of prodigiosin 25-c on cultured cell lines: Its similarity to monovalent polyether ionophores and vacuolar type H+-ATP ase inhibitor, J Antibiot, 45: 1618-1625. Khanafari A., Assadi M.M. and Fakhr F.A. (2006). Review of prodigiosin, pigmentation in Serratia marcescens, Online J Biol Sci, 6: 1-13. Krishna J.G. (2008) Pigment production by marine Serratia sp. BTWJ8, PhD dissertation, Microbial Technology Laboratory, Department of Biotechnology Cochin University of Science and Technology, Kerala, India. Labbate, M., Queck, S. Y., Koh, K. S., Rice, S. A., Givskov, M. & Kjelleberg, S.(2004). rum sensing-controlled biofilm development in Serratia liquefaciens MG1. J Bacteriol 186, 692–698. Lawanson A.O. and Sholeye F.O. (1975). Inhibition of prodigiosin formation in Serratia marcescens by adenosine triphosphate, Experientia, 32: 439-440. Lewis S.M., Corpe W.A. (1964). Prodigiosin producing bacteria from marine sources, Appl Microbiol, 12: 13-17. Liaaen-Jensen S. (1971). Isolation, reactions. In: Isler O. (ed). Carotenoids. Birkhauser Verlag, Basel, 61-188. Llagostera E., Soto-Cerrato V., Joshi R., Montaner B., Gimenez-Bonafe P., Perez Tomas R. (2005). High cytotoxic sensitivity of the human small cell lung doxorubicin resistant carcinoma (GLC4/ADR) cell line to prodigiosin through apoptosis activation. Anticancer Drugs, 16, 393-399. Iranshahi M., Shahverdi A.R., Mirjani R., Amin G., Shafiee A. (2004). 99 Đồ án tốt nghiệp Umbelliprenin from Ferula persica roots inhibits the red pigment production in Serratia marcescens, Z Naturforsch, 59: 506-508. Johnson E.A., Lewis M.J. and Grau C.R. (1980). Pigmentation of Egg Yolks with Astaxanthin from the Yeast Phaffia rhodozyma. Poultry Science, 59,1777-1782. Malpartida F., Niemi J., Navarrete R. and Hopwood D.A. (1990). Cloning and expression in a heterologous host of the complete set of genes for the biosynthesis of the Streptomyces coelicolor antibiotic undecylprodigiosin, Gene, 93: 91-99. Mandarville R.A. (2001). Synthesis, Proton affinity and Anticancer properties of the prodigiosin group of natural product, Curr Med Chem, 1: 195-218. Montaner B., Perez-Tomas R. (2001). Prodigiosin-induced apoptosis in human colon cancer cells. Life Sci, 68, 2025-2036. Ortega-Estrada, María De Jesús, et al. "Phoresis between Serratia marcescens and Steinernema carpocapsae (Rhabditida: Steinernematidae) during Infection of Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) Larvae." Florida Entomologist95.1 (2012): 120-127. Pérez-Tomás R., Montaner B. (2003). Effects of the proapoptotic drug prodigiosin on cell cycle-related proteins in Jurkat T cells. Histol, Histopathol, 18,379- 385. Pérez-Tomás R. and Viđas M. (2010) New insights on the antitumoral properties of prodiginines, Curr. Med. Chem., 17: 2222-2231. Pfander H., Riesenz R. and Nigglil U. (1994). HPLC and SFC of carotenoids 100 Đồ án tốt nghiệp - scope and limitations, Pure Appl, Chem. 66: 947-954. Phonnok, Sirinet, Wanlaya Uthaisang-Tanechpongtamb, and Benjamas Thanomsub Wongsatayanon. "Anticancer and apoptosis-inducing activities of microbial metabolites." Electronic Journal of Biotechnology 13.5 (2010): 1-2. Qadri S.M.H. and Williams R.P. (1972). Induction of Prodigiosin Biosynthesis after Shift-Down in Temperature of Nonproliferating Cells of Serratia marcescens, Appl. Microbiol, 23: 704-709. Ramina M. và Samira Y.Y. (2009). The role of red pigment produced by Serratia marcescens as antibacterial and plasmid curing agent, University of Duhok, vol 12: 268-274. Rjazantseva IN1, Andreeva IN, Ogorodnikova TI, (1994). Effect of various growth conditions on pigmentation of Serratia marcescens. Riedel, K., Ohnesorg, T., Krogfelt, K. A., Hansen, T. S., Omori, K., Givskov, M. & Eberl, L. (2001). N-acyl-L-homoserine lactonemediated regulation of the lip secretion system in Serratia liquefaciens MG1. J Bacteriol 183, 1805–1809. Rosenzwcig W.D. and Stotzky G. (1980). Prodigiosin and the inhibition of Aspergillus niger by Serratia marcescens in soil, Soil Bioi. Biochent, 12: 295- 296. Shahitha S. and Poornima K. (2012). Enhanced Production of Prodigiosin Production in Serratia Marcescens, Journal of Applied Pharmaceutical Science, 02 (08): 138-140. Slater H., Crow M., Everson L. and Salmond G.P.C. (2003). Phosphate availability regulates biosynthesis of two antibiotics, prodigiosin and carbapenem, in 101 Đồ án tốt nghiệp Serratia via both quorum sensing-dependent andindependent pathways, Mol. Microbiol, 47: 303-320. Song M. J., Bae J., Lee D. S., Kim C. H., Kim J. S., Kim S. W., Hong S. I. (2006). Purification and Characterization of Prodigiosin Produced by Integrated Bioreactor from Serratia sp. KH-95. J. Biosci. Bioeng, 101, 157-161. Soto-Cerrato V., Llagostera E., Montaner B., Scheffer G. L., Pérez-Tomás R. (2004). Mitochondria-mediated apoptosis operating irrespective of multidrug resistance in breast cancer cells by the anticancer agent prodigiosin. Biochem. Pharmacol., 68, 1345-1352. Stock, I., S. Burak, K. J. Sherwood, T. Gru¨ger, and B. Wiedemann (2003). Natural antimicrobial susceptibilities of ‘unusual’ Serratia species: S. ficaria, S. fonticola, S. odorifera, S. plymuthica, and S. rubidaea. J. Antimicrob. Chemother. 51:865–885. Stock, I., T. Grueger, and B. Wiedemann (2003). Natural antibiotic susceptibility of strains of Serratia marcescens and the S. liquefaciens complex: S. liquefaciens sensu stricto, S. proteamaculans, and S. grimesii. Int. J. Antimicrob. Agents 22:35–47. Tariq A.L. and John J.P. (2010). Molecular Characterization of Psychrotrophic Serratia marcescens TS1 Isolate form Apple Garden at Badran Kashmir, Journal of Agriculture and Biological Sciences, 6(3): 364-369. Thomson R.H. (1962a). Melanins, Comparative Biochemist'y, Florkin M. and Mason H.S., Vol. III: Constituents of Life. Part A, Academic Press, New York, 727-753. 102 Đồ án tốt nghiệp Thomson N.R., Crow M.A., McGowan S.I., Cox A. and Salmond G.P.C. (2000). Biosynthesis of carbapenem antibiotic and prodigiosin pigment in Serratia is under quorum sensing control, Mol. Microbial, 36: 539-556. Tomas R. P., Montaner B. (2003). Effects of the proapoptotic drug prodigiosin on cell cycle-related proteins in lurkat T cells. Histol, Histopathol, 18, 379-385. Tomas R. P., Montaner B., LIagostera E., Soto-Cerrato V. (2003). The prodigiosins, proapoptotic drugs with anticancer properties. Biochem, Pharmacal,66, 1447- 1452. Turner J.M. and Messenger A.J. (1986) Occurrence, biochemistry, and physiology of phenazinc pigment production, Adv. Microbial Physiol, 27, 211-275. Venil, Chidambaram Kulandaisamy, and Perumalsamy Lakshmanaperumalsamy. "An insightful overview on microbial pigment, prodigiosin." Electronic Journal of Biology 5.3 (2009): 49-61. Wei Y.H., Chen W.C. (2005). Enhanced production of prodigiosin-like pigment from Serratia marcescens SMΔR by medium improvement and oil supplementation strategies, J Biosci Bioeng, 99: 616-622. Whitehead, N. A., Barnard, A. M., Slater, H., Simpson, N. J. & Salmond, G. P. (2001). Quorum-sensing in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiol Rev 25, 365–404. Williams R.P., Gott C.L. and Qadri S.M.H. (1971). Induction of pigmentation in non proliferating cells of Serratia marcescens by addition of single amino acids, J. Bacteriol, 106,444-448. Williams R.P. (1973). Biosynthesis of prodigiosin, a secondary metabolite of Serratia marcescens, Appl. Microbiol, 25: 396-402. 103 Đồ án tốt nghiệp Williamson N.R., Simonsen H.T., Ahmed R.A., Goldet G., Slater H., Woodley L., Leeper F.J., Salmond P.C. (2005). Biosynthesis of the red antibiotic, prodigiosin, in Serratia: identification of a novel 2-methyl-3-n-amyl- pyrrole (MAP) assembly pathway, definition of the terminal condensing enzyme, and implications for undecylprodigiosin biosynthesis in Streptomyces, Mol Microbiol, 56: 971-989. Williamson N.R., Fineram P.C., Leeper F.J., Salmond G.P.C. (2006). The biosynthesis and regulation of bacterial prodiginines. Nat. Rev. Microbiol, 4: 887-899. Witney F.R., Failia M.L., Weinberg E.D. (1977). Phosphate inhibition of secondary metabolism in Serratia marcescens. Appl Environ Microbiol, 33, 1042-1046. Zhang J., Shen Y., Liu J. and Wei D. (2005). Antimetastatic effect of prodigiosin through inhibition of tumor invasion, Biochem. Pharmacol., 69: 407-414. 104 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1 THÀNH PHẦN MƠI TRƢỜNG VÀ CÁC THUỐC THỬ Thành phần mơi trƣờng Nutrient agar (Gram/Lít) Meat extract 3,00 Peptone 5,00 Agar 20,00 Thành phần mơi trƣờng Nutrient broth (Gram/Lít) Meat extract 3,00 Peptone 5,00 Mơi trƣờng huyền phù đậu phộng Hạt đậu phộng khơ luộc khoảng 10 phút, bĩc vỏ và xay nhuyễn. Mơi trƣờng MT3 Huyền phù đậu phộng 10% Peptone 5% Dầu hƣớng dƣơng 1% Mơi trƣờng MT4 Huyền phù đậu phộng 10% Peptone 5% Dầu hƣớng dƣơng 1% Muối NaCl 1% 1 Đồ án tốt nghiệp ách pha thuốc thử : Dragendorff Dung dịch A: cân 0,8 g bismuth nitrate hịa tan trong 10 ml acid acetic đậm đặc định mức lên 50 ml bằng nƣớc cất. Bảo quản chai màu trong tủ lạnh. o Dung dịch B: Cân 20 g KI và hịa tan trong 50 ml H2O, Bảo quản 4 C. Hút 5 ml dd A và 5 ml dd B vào bình định mức 50 ml. Định mức bằng acid sulfuric 10% đã pha sẵn. Khoanh giấy kháng sinh - Sử dụng khoanh giấy kháng sinh của các hãng sản xuất cĩ bán trên thị trƣờng cho kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch. - Các khoanh giấy kháng sinh phải đƣợc bảo quản trong hộp riêng trong điều kiện khơ ráo, ở trong tủ lạnh nhiệt độ 80C hoặc -200C. - Khi sử dụng xong khoanh giấy cịn thừa phải đƣợc đĩng kín và cất giữ trở lại tủ lạnh. PHỤ LỤC 2 MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP Phƣơng pháp khảo sát tính kháng của Serratia marcescens SH1 bằng cách sử dụng đĩa kháng: Chủng nấm đƣợc nuơi cấy trên mơi trƣờng NA trong đĩa petri sau 2 ngày. Sau đĩ quan sát hình dạng khuẩn lạc, chọn khuẩn lạc đặc trƣng. Tăng sinh trên mơi trƣờng NB Tiến hành pha lỗng bằng nƣớc muối sinh lý tới nồng độ 10-6 Cấy trãi chủng vi khuẩn trên đĩa petri bằng tăm bơng vơ trùng. Đặt đĩa kháng sinh lên mặt mơi trƣờng đã đƣợc cấy trãi . 2 Đồ án tốt nghiệp Ủ trong điều kiện phịng thí nghiệm. Quan sát và đọc kết quả sau 2 ngày. Phƣơng đo oxy hịa tan DO Lấy mẫu vào đầy chai DO. Thêm vào chai 1mL dung dịch MnSO4 và 1mL dung dịch Iodide-Azide kiềm. Đậy nút chai, đảo chai vài lần. Khi kết tủa đã lắng xuống cịn khoảng 1/2 chai, thêm vào chai 1mL H2SO4 đậm đặc. Đậy nút và đảo chai vài lần đến khi kết tủa tan hồn tồn. Đổ bớt 99mL dung dịch từ chai sang ống đong. Tiến hành chuẩn độ phần dung dịch mẫu cịn lại trong chai (201mL) bằng dung dịch Na2S2O3 0,025M với chỉ thị hồ tinh bột và kết thúc chuẩn độ khi dung dịch vừa mất màu xanh. Lƣu ý chỉ thêm hồ tinh bột vào giai đoạn cuối, khi dung dịch trong chai đã chuyển từ màu vàng đậm sang vàng nhạt. Ghi nhận thể tích dung dịch chất chuẩn (V mL) đã sử dụng. (ThS. Võ Hồng Thi, 2012) 3 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 3 ĐƢỜNG CHUẨN SẮC TỐ Đƣờng chuẩn Sắc tố 0.4 y = 1.100x + 0.004 0.35 R² = 0.999 0.3 O 0.25 D 0.2 53 5 0.15 0.1 0.05 0 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 Nồng độ sắc tố (mg/ml) PHỤ LỤC 4 SỐ LIỆU THỐNG KÊ. Ảnh hƣởng của pH đến hàm lƣợng sắc tố ANOVA Table for Prodigiosin by pH Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2.4576 1 2.4576 50.68 0.0021 Within groups 0.193979 4 0.0484949 4 Đồ án tốt nghiệp Total (Corr.) 2.65158 5 Summary Statistics for Prodigiosin pH Count Average Standard Coeff. of Minimum Maximum Range deviation variation 7.2 3 3.3012 0.19277 5.83939% 3.1055 3.4909 0.3854 khơng 3 2.0212 0.244601 12.1017% 1.7763 2.2655 0.4892 chỉnh Total 6 2.6612 0.728228 27.3646% 1.7763 3.4909 1.7146 Multiple Range Tests for Prodigiosin by pH Method: 95.0 percent LSD pH Count Mean Homogeneous Groups khơng chỉnh 3 2.0212 X 7.2 3 3.3012 X Khảo sát ảnh hƣờng của nồng độ muối NaCl Summary Statistics for Prodigiosin % Count Averag Standard Coeff. of Minimum Maximum Range Stnd. NaCl e deviation variation skewness 5 Đồ án tốt nghiệp 0% 3 12.103 0.750165 6.19816% 11.3091 12.8 1.4909 -0.4044 1% 3 18.460 2.53651 13.7402% 15.5454 20.1636 4.6182 -1.1733 2% 3 12.987 4.71475 36.3012% 8.0727 17.4727 9.4 -0.2880 3% 3 7.7454 3.82559 49.3915% 4.6909 12.0363 7.3454 0.9209 Total 12 12.824 4.88085 38.0596% 4.6909 20.1636 15.472 -0.0849 ANOVA Table for Prodigiosin by % NaCl Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 174.328 3 58.1094 5.30 0.0264 Within groups 87.7213 8 10.9652 Total (Corr.) 262.049 11 Multiple Range Tests for Prodigiosin by % NaCl Method: 95.0 percent LSD % NaCl Count Mean Homogeneous Groups 3 3 7.74543 X 0 3 12.103 X 6 Đồ án tốt nghiệp 2 3 12.9879 XX 1 3 18.4606 X Đồng nuơi cấy S. marcescens và Bacillus subtilis tỷ lệ S/B 2:1 ANOVA Table for Prodigiosin by đồng nuơi cấy Source Sum of Df Mean Square F-Ratio P-Value Squares Between groups 0.101873 1 0.101873 0.02 0.8848 Within groups 17.096 4 4.27399 Total (Corr.) 17.1979 5 Summary Statistics for Prodigiosin dong nuoi Count Average Standard Coeff. of Minimu Maxim Range Stnd. cay deviation variation m um skewness S/B 2:1 3 7.53333 1.71541 22.7709% 5.9091 9.3273 3.4182 0.31176 Đối chứng 3 7.79403 2.36773 30.3787% 5.9818 10.473 4.4912 1.00872 Total 6 7.66368 1.8547 24.2011% 5.9091 10.473 4.5639 0.76131 Đồng nuơi cấy S. marcescens và Bacillus subtilis tỷ lệ S/B 1:1, S/B 1:2 Summary Statistics for Prodigiosin 7 Đồ án tốt nghiệp NT Count Average Standard Coeff. of Minimum Maximum Rang Stnd. deviation variation e skewness 1:1 3 16.8545 7.40232 43.9189% 9.05455 23.7818 14.72 -0.36993 1:2 3 17.4273 9.00178 51.6534% 7.03636 22.8545 15.81 -1.22109 ĐC 3 26.0818 13.2061 50.6335% 11.6727 37.6091 25.93 -0.6613 Total 9 20.1212 9.87946 49.0997% 7.03636 37.6091 30.57 0.38955 ANOVA Table for prodigiosin by nghiệm thức Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 160.372 2 80.1859 0.78 0.5017 Within groups 620.458 6 103.41 Total (Corr.) 780.829 8 Multiple Range Tests for prodigiosin by nghiệm thức Method: 95.0 percent LSD NT Count Mean Homogeneous Groups 1:1 3 16.8545 X 8 Đồ án tốt nghiệp 1:2 3 17.4273 X DC 3 26.0818 X Sử dụng dịch trong trong nuơi cấy ANOVA Table for prodigiosin by nghiệm thức Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2.49983 2 1.24992 0.01 0.9872 Within groups 579.421 6 96.5702 Total (Corr.) 581.921 8 Table of Means for PRO by NT with 95.0 percent LSD intervals NT Count Mean Stnd. error (pooled s) Lower limit Upper limit DC 3 26.0818 5.67363 16.2651 35.8985 E. coli 3 26.7182 5.67363 16.9015 36.5349 S. 3 27.3727 5.67363 17.556 37.1894 marcescens Total 9 26.7242 Multiple Range Tests for Prodigiosin by nghiệm thức 9 Đồ án tốt nghiệp NT Count Mean Homogeneous Groups DC 3 26.0818 X Dịch 3 26.7182 X nuơi cấy E. coli Dịch 3 27.3727 X trong S. marces cens Xác định vận tốc lắc So sánh kết quả giữa các thí nghiệm với nhau ANOVA Table for Prodigiosin by TN Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between groups 48.365 2 24.1825 8.89 0.0161 Within groups 16.3287 6 2.72145 10 Đồ án tốt nghiệp Total (Corr.) 64.6937 8 Multiple Range Tests for Prodigiosin by TN Method: 95.0 percent LSD TN Count Mean Homogeneous Groups TNC 3 5.185 X TNB 3 8.8848 X TNA 3 10.7653 X Summary Statistics for Prodigiosin TN Count Average Standard Coeff. of Minimum Maximum Range deviation variation TNA 3 10.7653 2.08945 19.409% 8.376 12.25 3.874 TNB 3 8.8848 1.42031 15.9859% 7.2545 9.8545 2.6 TNC 3 5.185 1.33464 25.7405% 3.736 6.364 2.628 Total 9 8.27838 2.84372 34.3511% 3.736 12.25 8.514 Thí nghiệm xử lý nhiệt canh trƣờng Summary Statistics for Prodigiosin 11 Đồ án tốt nghiệp NT Count Average Standard Coeff. of Minimum Maximum Range deviation variation DC 4 10.168 4.34639 42.7458% 6.291 14.8 8.509 DUN 4 26.15 5.89949 22.5602% 18.655 33.054 14.399 Total 8 18.159 9.79748 53.9538% 6.291 33.054 26.763 ANOVA Table for Prodigiosin by NT Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between groups 510.849 1 510.849 19.03 0.0048 Within groups 161.085 6 26.8475 Total (Corr.) 671.934 7 Multiple Range Tests for Prodigiosin by NT Method: 95.0 percent LSD NT Count Mean Homogeneous Groups DC 4 10.16 X 8 12 Đồ án tốt nghiệp DUN 4 26.15 X PHỤ LỤC 4 BẢNG Bảng 1 Tiêu chuẩn biện luận kháng sinh đồ theo Enterobacteriaceae Tiêu chuẩn biện luận kháng sinh đồ theo Enterobacteriaceae Kháng sinh Ký S I R Hàm lƣợng hiệu Đĩa Ampicillin Am ≥ 17 14 – 16 ≤ 13 10μg Gentamicin Ge ≥ 15 13 – 14 ≤ 12 10 μg Cefuroxime Cu ≥ 18 15 – 17 ≤ 14 30 μg Cefoxitin Cn ≥ 18 15 – 17 ≤ 14 30 μg Cefotaxime Ct ≥ 26 23 – 25 ≤ 22 30 μg Amoxicillin-clavulanic Ac ≥ 18 14 – 17 ≤ 13 20 μg /10 μg acid Amikacin Ak ≥ 17 15 – 16 ≤ 14 30 μg Piperacillin/tazobactam Pt ≥ 21 18 – 20 ≤ 17 100 μg /10 μg Ciprofloxacin Ci ≥ 21 16 – 20 ≤ 15 5 μg Ertapenem En ≥ 22 19 – 21 ≤ 18 10 μg Ceftazidime Cz ≥ 21 18 – 20 ≤ 17 30 μg Chloramphenicol Cl ≥ 18 13 – 17 ≤ 12 30 μg Imipenem Im ≥ 23 20 – 22 ≤ 19 10 μg Trimethoprim / Bt ≥ 16 11 – 15 ≤ 10 1.25 μg sulfamethoxazole /23.75 μg Cefepime Cm ≥ 18 15 – 17 ≤ 14 30 μg Tetracycline Te ≥ 15 12 – 14 ≤ 11 30 μg 13 Đồ án tốt nghiệp Bảng 2 Đánh giá nồng độ oxy hịa tan. Nồng độ O2 Đánh giá 2 mg/l Nguy hiểm, oxy trong nƣớc khơng đủ cho cá, tơm 4 mg/l Nƣớc đủ oxy cung cấp ch0 cá, tơm 6 -8 mg/l Tốt, nƣớc cĩ nhiều oxy Bảng 3 Hàm lƣợng prodigiosin thu hồi bằng trích ly ở các tỷ lệ canh trƣờng:dung mơi (mg/ ml canh trƣờng) và quy mơ lên men khác nhau. A (thể tích lên B (thể tích lên C (thể tích Tỷ lệ canh trƣờng: men 20 ml/ men 200 ml/ lên men 400 dung mơi bình) bình) ml/ bình) Tỷ lệ 2:3 8,4 7,3 3,7 Tỷ lệ 1:2 12,3 9,9 6,4 Tỷ lệ 2:5 11,7 9,5 5,5 14 Đồ án tốt nghiệp Bảng 4 Kết quả hàm lƣợng prodigiosin khi đồng nuơi cấy S. marcescens SH1 với Bacillus sp. Nghiệm thức Đối chứng S/B = 2:1 Đối chứng 2 S/B = 1:1 S/B = 1:2 1 Hàm lƣợng 7,8 ± 2,4(a) 7,5 ± 1,7 (a) 26,1 ± 13,2 (a) 16,9 ± 7,4 17,4 ± 9,0 prodigiosin tổng (a) (a) hợp (mg/ml canh trƣờng) % prodigiosin 100 ± 96,7 ± 22 % 100 ± 50,6 % 64,6 ± 66,8 ± tổng hợp so với 30,4% 28,4 % 34,5% đối chứng (%) PHỤ LỤC 6 HÌNH ẢNH Thí nghiệm đo oxy hịa tan DO 15 Đồ án tốt nghiệp Hình 1. Chai DO chứa canh trƣờng MT3 trong thí nghiệm đo oxy hịa tan. Hình 2. Mẫu đo oxy hịa tan lên men 24h lắc 200 vịng/phút. 1. Mơi trƣờng PG; 2.Mơi trƣờng MT3 Canh trƣờng MT3 (6 mg/l) Mơi trƣờng PG (4 mg/l) Hình 3. Đo oxy hịa tan sử dụng kit đo oxy hịa tan bán sẵn trên thị trƣờng Thí nghiệm đồng nuơi cấy S. marcescens và Bacillus subtilis 16 Đồ án tốt nghiệp A. Đối chứng; B. Nghiệm thức S/B = 2:1 A.Đối chứng; B. S/B = 1:1; C. S/B = 1:2. Hình 4. Thí nghiệm lên men đồng nuơi cấy S. marcescens SH1 với Bacillus sp Thí nghiệm nuơi cấy cĩ bổ sung dịch trong S. marcescens SH1 và E. coli Hình 5. Sử dụng dịch trong trong nuơi cấy 17 Đồ án tốt nghiệp A. Đối chứng; B. Dịch trong S. marcescens; C. Dịch loại bỏ tế bào E. coli Hình 6. Canh trƣờng đun ở 1000C. 18