Đề tài Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn lúa có khả năng chịu hạn của Việt Nam bằng chỉ thị SSR

ật di truyền, viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ tôi trong việc thu thập, tìm tài liệu, tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình nghiên cứu, và cho tôi những lời khuyên quý giá để luận văn có thể hoàn thiện hơn. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn cha mẹ, anh chị em trong gia đình, bạn bè đã luôn sát cánh hỗ trợ và động viên về cả vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể toàn tâm, toàn ý cho công việc. Xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, ngày 05 tháng 11 năm 2012 Học viên Nguyễn Thị Thảo DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABA: Axit abcisic ADN: Acid deoxyribonucleic AFLP: Amplified fragment length polymorphism ARN: Acid ribonucleic CTAB: Cetyl trimetyl amonium bromit dNTP: Dideoxyribo nucleozit triphosphat EtBr: Ethidium Bromide EDTA: Etylen diamine tetra acetic acid FAO: The World Food Organization HSPs: Heat shock protein IRRI: International Research Rice Institute LEA: Late embryogenesis abundant protein NTSYS: Numerial taxonomy system PCR: Polymerase chain reaction PIC: Polymorphic Information Content QTL: Quantitative trait loci RAPD: Random amplyfied polymorphic DNA RE: Restriction enzyme RFLP: Restriction fragment length polymorphism SDS: Sodium dodecyl sunphate SSR: Simple sequence repeats STS : Sequence Tagged Site TAE: Tris-acetat-acid EDTA TE: Tris EDTA WUE: Water use efficiency MỤC LỤC MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1 1. Lí do chọn đề tài ................................................................................................................ 1 2. Mục đích nghiên cứu ......................................................................................................... 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ........................................................................... 2 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ..................................................................................... 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 3 1.1. Vài nét sơ lƣợc về cây lúa ............................................................................................. 3 1.2. Khái niệm về hạn và phân loại hạn ............................................................................. 5 1.2.1. Khái niệm về hạn .................................................................................................... 5 1.2.2. Phân loại hạn ........................................................................................................... 6 1.3. Ảnh hƣởng của hạn hán đến sản xuất nông nghiệp ................................................... 7 1.3.1. Ảnh hưởng của hạn đến thực vật ............................................................................ 7 1.3.2. Tác động của hạn đến sản xuất nông nghiệp........................................................... 8 1.4. Đặc tính chịu hạn và nghiên cứu tính chịu hạn ở cây lúa ....................................... 10 1.4.1. Đặc điểm hình thái và sinh lí lúa chịu hạn ............................................................ 10 1.4.2. Cơ sở sinh lí, hóa sinh của tính chịu hạn .............................................................. 11 1.4.3. Cơ sở phân tử của tính chịu hạn ............................................................................ 12 1.4.4. Thể hiện của gen điều khiển tính chống chịu khô hạn .......................................... 14 1.5. Nghiên cứu đa dạng di truyền trên cây lúa .............................................................. 18 1.5.1. Vị trí và tầm quan trọng của đa dạng di truyền .................................................... 18 1.5.2. Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền ................................................. 19 1.5.3. Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây lúa .................................................. 21 1.6. Chọn tạo giống lúa chịu hạn ...................................................................................... 24 1.6.1. Chọn tạo lúa chịu hạn trên thế giới ....................................................................... 24 1.6.2. Chọn tạo giống lúa chống chịu hạn ở Việt Nam ................................................... 27 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 30 2.1. Vật liệu ......................................................................................................................... 30 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................... 30 2.1.2. Hóa chất ................................................................................................................ 31 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................... 35 2.2.1. Tách chiết ADN tổng số và đo độ tinh sạch ......................................................... 35 2.2.2. Nhân ADN bằng kỹ thuật SSR- PCR .................................................................... 36 2.2.3. Kiểm tra kết quả PCR trên gel Agarrose 3,0%. .................................................... 37 2.2.4. Phân tích và xử lí số liệu ....................................................................................... 38 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 39 3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số ................................................................................ 39 3.2. Kết quả phân tích đa hình tập đoàn lúa có khả năng chịu hạn bằng chỉ thị phân tử SSR ........................................................................................................................ 40 3.2.1. Kết quả phân tích với một số mồi điển hình ......................................................... 40 3.2.2. Hệ số PIC, số allele và tổng số băng ADN thể hiện trên từng cặp mồi ................ 43 3.2.3. Tỷ lệ dị hợp (H%) và tỷ lệ khuyết số liệu (M%) của 40 giống lúa nghiên cứu .............. 45 3.3. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của tập đoàn lúa chịu hạn nghiên cứu ........ 47 3.4. Kết quả xác định các allele hiếm, allele đặc trƣng nhận dạng các giống lúa trong tập đoàn nghiên cứu ................................................................................................ 52 3.4.1. Kết quả xác định các allele hiếm, nhận dạng các giống lúa trong tập đoàn nghiên cứu ....................................................................................................................... 52 3.4.2. Kết quả xác định các allele đặc trưng nhận dạng các giống lúa trong tập đoàn nghiên cứu ....................................................................................................................... 53 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................................ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 57 PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các loài Oryza theo Takeoka (1963) với số nhiễm sắc thể, kiểu gen và phân bố địa lý .............................................................................................. 4 Bảng 1.2. Đặc trưng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa ................. 5 Bảng 2.1. Danh sách, số đăng kí (SĐK) trong ngân hàng gen và kí hiệu các giống lúa nghiên cứu.................................................................................. 30 Bảng 2.2. Danh sách 50 mồi SSR ............................................................................ 33 Bảng 3.1. Số allele thể hiện và hệ số PIC của 23 cặp mồi SSR ................................ 44 Bảng 3.2. Một số kết quả phân tích đa dạng di truyền sử dụng ch thị SSR trên cây lúa đã được công bố ............................................................................ 45 Bảng 3.3. Tỷ lệ khuyết số liệu (M) và tỷ lệ dị hợp tử (H) của các giống lúa nghiên cứu .................................................................................................. 46 Bảng 3.4. Hệ số tương đồng di truyền giữa 40 giống lúa nghiên cứu ...................... 49 Bảng 3.5. Hệ số tương đồng di truyền giữa 40 giống lúa nghiên cứu (tiếp) ............. 50 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Sơ đồ minh hoạ cơ chế phân tử quá trình tham gia đáp ứng điều kiện hạn của các gen ở thực vật .............................................................. 13 Hình 1.2. Vị trí của protein hạn hán trên các nhiễm sắc thể ở cây lúa .................... 16 Hình 3.1. ADN tổng số của 40 giống lúa nghiên cứu ............................................... 39 Hình 3.2. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM566 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) ...................................... 40 Hình 3.3. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM3515 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) .................................... 40 Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM5599 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) .................................... 41 Hình 3.5. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM1364 (M: 100bp DNA Ladder) ............................................................ 41 Hình 3.6. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM3431 (M: 100bp DNA Ladder) ............................................................ 42 Hình 3.7. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM3534 (M: 100bp DNA Ladder) ............................................................ 42 Hình 3.8. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM7003 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) .................................... 42 Hình 3.9. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM25271 (M: 100bp DNA Ladder) .......................................................... 43 Hình 3.10. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM25319 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) .................................. 43 Hình 3.11. Sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền giữa 40 giống lúa địa phương chịu hạn ......................................................................................... 48 Hình 3.12. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM3467 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) .................................... 52 Hình 3.13. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM5811 (M: 100bp DNA Ladder) ............................................................ 53 Hình 3.14. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM1155 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) .................................... 54 Hình 3.15. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM3476 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) .................................... 54 Hình 3.16. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM3468 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) .................................... 55 Hình 3.17. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM6051 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) .................................... 55 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Cây lúa (Oryza sativa L.) là loại cây lương thực có từ rất lâu trên thế giới. Trải qua hàng ngàn năm, đến nay cây lúa đã trở thành nguồn lương thực chính của ½ dân số trên địa cầu. Nó cung cấp 20% tổng năng lượng hấp thụ hàng ngày của nhân loại. Ở hầu hết các nước nông nghiệp, ngành sản xuất lúa gạo đem lại giá trị kinh tế cao và cung cấp việc làm cho hàng triệu lao động. Việt Nam là một trong những trung tâm phát sinh cây lúa và có tài nguyên di truyền cây lúa vào loại phong phú nhất trên thế giới. Nghề trồng lúa trở thành nghề truyền thống, quan trọng hàng đầu trong nền nông nghiệp của nước ta. Trung bình hàng năm, lúa gạo chiếm trên 60% tổng sản lượng lương thực và được gieo trồng trên 3,96 triệu ha. Tuy nhiên, do điều kiện địa hình nhiều đồi núi, đồng bằng sát biển hoặc do hậu quả của biến đổi khí hậu, 50% diện tích lúa đang được canh tác trong điều kiện môi trường rất bấp bênh, dễ bị tác động bởi các yếu tố ngoại cảnh bất lợi như hạn, mặn, lạnh... Trong đó, khô hạn là một trong những vấn nạn làm cho năng suất bị giảm mạnh, sản phẩm nông nghiệp không ổn định. Hậu quả của biến đổi khí hậu toàn cầu làm cho hạn hán xảy ra thường xuyên trên diện rộng và đã vượt tầm kiểm soát của con người. Vấn đề hạn hán càng trở nên bức xúc khi hầu hết diện tích đất canh tác bị hạn nặng lại tập trung ở vùng sâu, vùng xa, vùng nông thôn nghèo, nơi mà cuộc sống người dân chủ yếu dựa vào sản phẩm nông nghiệp. Hiện nay, hạn hán là nguyên nhân cản trở rất lớn cho việc phát triển bền vững nền nông nghiệp của nước ta, vì vậy việc nghiên cứu, đánh giá các nguồn gen liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật nói chung và ở cây lúa nói riêng để nâng cao khả năng chịu hạn, ổn định năng suất ở cây trồng trở thành vấn đề thời sự mang tính cấp bách và cần thiết. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn lúa có khả năng chịu hạn của Việt Nam bằng chỉ thị SSR” nhằm tạo lập cơ sở dữ liệu cho nguồn gen lúa chịu hạn bản địa Việt Nam phục vụ công tác nghiên cứu, chọn tạo giống lúa chịu hạn. 1 2. Mục đích nghiên cứu Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của tập đoàn giống lúa chịu hạn bản địa của Việt Nam ở mức phân tử và xác định mối quan hệ di truyền giữa các nguồn gen ở các địa phương khác nhau phục vụ cho công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng có hiệu quả các nguồn gen lúa chịu hạn bản địa của Việt Nam. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Cung cấp thêm nhiều dữ liệu, thông tin khoa học hữu ích cho công tác nghiên cứu phân tích đa dạng di truyền của giống lúa chịu hạn. Hiểu biết về đa dạng di truyền của các nguồn gen lúa chịu hạn tạo cơ sở lý luận cho việc chọn lọc, phục tráng để nâng cao tiềm năng di truyền của các giống lúa chịu hạn trong sản xuất. Phát hiện sai khác di truyền của các giống lúa chịu hạn có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định các allele hiếm, allele đặc trưng để nhận dạng chính xác các nguồn gen ưu tú phục vụ nghiên cứu lai tạo giống và định hướng cho công tác thu thập bảo tồn đa dạng nguồn gen lúa chịu hạn ở mức phân tử. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu đa dạng di truyền thông qua các ch thị phân tử góp phần nâng cao hiệu quả công tác bảo tồn và chọn tạo giống lúa có phẩm chất gạo tốt, năng suất cao, có khả năng chịu hạn, phù hợp với điều kiện canh tác lúa vùng khô hạn và cơ cấu sản xuất lúa vùng khô hạn ở Việt Nam. 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 4.1. Đối tượng Đối tượng nghiên cứu là cứu là tập đoàn 39 giống lúa có đặc tính chịu hạn được thu thập ở nhiều địa phương khác nhau, các giống này đang được lưu giữ, bảo tồn tại ngân hàng gen Trung tâm Tài nguyên Thực vật, Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long và 01 giống lúa tham khảo (IR64) là giống mẫn cảm với khô hạn. 4.2. Phạm vi nghiên cứu Đề tài nghiên cứu, đánh giá nguồn gen lúa ở mức phân tử bằng ch thị SSR; Các thí nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Kĩ thuật Di truyền - Viện Di Truyền Nông nghiệp. 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vài nét sơ lƣợc về cây lúa Cây lúa thuộc họ hòa thảo (Graminae), tộc Oryzae, chi Oryza, có tổng số nhiễm sắc thể 2n = 24. Oryza có khoảng 20 loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới ẩm của Châu Phi, Nam và Đông Nam Châu Á, Nam Trung Quốc, Nam và Trung Mỹ và một phần ở Châu Úc. Trong đó, ch có 2 loài là lúa trồng, còn lại là lúa hoang hằng niên và đa niên. Loài lúa trồng quan trọng nhất, thích nghi rộng rãi và chiếm đại bộ phận diện tích lúa thế giới là Oryza sativa L. Loài này hầu như có mặt ở khắp nơi từ đầm lầy đến sườn núi, từ vùng xích đạo, nhiệt đới đến ôn đới, từ khắp vùng phù xa nước ngọt đến vùng đất cát sỏi ven biển nhiễm mặn, phèn Một loài lúa trồng khác là Oryza glaberrima Steud, ch được trồng giới hạn ở một số quốc gia Tây Châu Phi và hiện đang bị thay thế dần bởi Oryza sativa L. [13]. Tateoka (1963) (trong Oka, 1988) lại phân biệt 22 loài, trong đó, cũng thống nhất 2 loài lúa trồng O. sativa L. và O. glaberrima Steud. Tateoka xem dạng lúa Châu Phi (O. perennis Moench) như là một loài riêng O. barthii A. Chev., và dạng lúa Châu Á và Châu Mỹ thuộc về loài O. rufipogon Griff. Tateoka cũng bổ sung 2 loài mới: O. longiglumis Jansen và O. angustifolia Hubbard (Bảng 1.1) [47]. Năm 1928 - 1930, các nhà nghiên cứu Nhật Bản đã phân loại lúa trồng thành 2 nhóm “Indica” và “Japonica” dựa trên cơ sở phân bố địa lý, hình thái cây và hạt, độ bất dục khi lai tạo và phản ứng huyết thanh (Serological reaction). Các nhà nghiên cứu Nhật Bản sau đó đã thêm một nhóm thứ 3 “Javanica” để đặt tên cho giống lúa cổ truyền của Indonesia là “bulu” và “gundil”. Tên gọi của 3 nhóm thể hiện nguồn gốc xuất phát của các giống lúa từ 3 vùng địa lý khác nhau. Từ “Janvanica” có gốc từ chữ Java là tên của một đảo của Indonesia. Từ “Japonica” có lẽ xuất xứ từ chữ Japan là tên nước Nhật Bản. Còn “Indica” có lẽ có nguồn gốc từ India (Ấn Độ) (Bảng 1.2) [5]. 3 Bảng 1.1. Các loài Oryza theo Takeoka (1963) với số nhiễm sắc thể, kiểu gen và phân bố địa lý [47] Nhóm/loài 2n Kiểu gen Phân bố địa lý Nhóm Oryzae Sativa L. 24 AA Khắp thế giới, lúa trồng Rufipogon Griff. 24 AA Châu Á, Châu Mỹ Barthii A. Chev. 24 AA Châu Phi glaberrima Steud. 24 AA Châu Phi, lúa trồng breviligulata A. Chev. et Roehr. 24 AA Châu Phi australiensis Domin 24 EE Châu Úc eichingeri A. Peter 24 CC Châu Phi punctata Kotschy 24, 48 BB, BBCC Châu Phi officinalis Wall. 24 CC Châu Á minuta J.S. Presl 48 BBCC Châu Á latifolia Desv. 48 CCDD Châu Mỹ alta Swallen 48 CCDD Châu Mỹ grandiglumis Prod. 48 CCDD Châu Mỹ Nhóm Schlechterianae schlechteri Pilger New Guinea Nhóm Granulatae meyeriana Baill. 24 Châu Á Nhóm Ridleyanae ridleyi Hook. F. 48 Châu Á longiglumis Jansen 48 New Guinea Nhóm Angustifoliae brachyantha A. Chev. et Roehr. 24 FF Châu Phi angustifolia Hubbard 24 Châu Phi perrieri A. Camus 24 Malagasy Tisseranti A. Chev. 24 Châu Phi Nhóm Coarctatae Coarctata Roxb. 48 Châu Á Nguồn: Oka, 1988 [39] 4 Bảng 1.2. Đặc trưng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa Đặc tính INDICA JAVANICA JAPONICA Thân -Thân cao -Thân cao trung bình Thân thấp Chồi -Nở bụi mạnh -Nở bụi thấp Nở bụi trung bình Lá -Lá rộng, xanh nhạt -Lá rộng, cứng, xanh nhạt Lá hẹp, xanh đậm Hạt -Hạt thon dài, dẹp -Hạt to, dầy -Hạt tròn, ngắn -Hạt hầu như không -Hạt không có đuôi hoặc -Hạt không đuôi có đuôi có đuôi dài tới có đuôi dài -Trấu ít lông và lông -Trấu có lông dài -Trấu có lông dài ngắn -Ít rụng hạt và dầy -Hạt dễ rụng -Ít rụng hạt Sinh học -Tính quang cảm rất -Tính quang cảm rất yếu -Tính quang cảm thay đổi rất thay đổi Nguồn: Chang, 1985 [22]. Hiện nay, diện tích trồng lúa chiếm trên 1/10 diện tích đất trồng trên thế giới và có 15 nước trên thế giới trồng lúa với diện tích hơn 1 triệu ha, trong đó có tới 13 nước thuộc Châu Á. Riêng Trung Quốc và Ấn Độ chiếm khoảng 50% diện tích trồng lúa và 56% sản lượng lúa toàn cầu. Bangladesh, Indonexia, Thái Lan mỗi nước đều có diện tích trồng lúa lớn hơn tổng diện tích trồng lúa của tất cả các nước Mĩ La tinh. Châu Phi có diện tích trồng lúa gần bằng diện tích trồng lúa của Việt Nam, nhưng sản lượng lúa lại thấp hơn Việt Nam từ 2-3 lần. 1.2. Khái niệm về hạn và phân loại hạn 1.2.1. Khái niệm về hạn Bất cứ một cây trồng nào cũng cần có nước để duy trì sự sống. Mức độ cần nhiều hay ít phụ thuộc vào từng loại cây trồng và từng giai đoạn phát triển của chúng. Hạn đối với thực vật là khái niệm ch sự thiếu nước do môi trường gây nên trong suốt quá trình sống hay trong từng giai đoạn, làm ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển. Mức độ tổn thương của cây trồng do khô hạn gây ra có nhiều mức độ khác nhau: chết, chậm phát triển hay phát triển bình thường. Những cây trồng phát triển bình thường trong điều kiện khô hạn gọi là “cây chịu hạn” và 5 khả năng có thể giảm thiểu mức độ tổn thương do thiếu hụt nước gây ra gọi là “tính chịu hạn” [9]. Tuy nhiên, khó có thể xác định được thế nào là trạng thái hạn đặc trưng vì mức độ khô hạn do môi trường gây nên khác nhau theo từng mùa, từng năm, từng vùng địa lý và không thể dự đoán trước được. Mức độ khô hạn do môi trường gây nên ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của cây, nhẹ thì giảm năng suất, nặng thì có thể dẫn đến tình trạng hủy hoại cây, mùa màng [43] Dưới tác động các yếu tố gây hạn của môi trường như thành phần thổ nhưỡng, thời tiết, khí hậu, nhiệt độ cao, gió nóng đã gây nên hiện tượng thiếu nước của cây, mà nguyên nhân chính là do mất cân bằng áp suất thẩm thấu giữa cây và môi trường, dẫn đến sự thiếu hụt nước trong tế bào. Trong trường hợp này, tác động của môi trường bên ngoài rất lớn gây ảnh hưởng đáng kể lên sự phát triển của cây. Thông thường, hạn được phân biệt thành 3 loại là hạn không khí, hạn đất và hạn toàn diện [6]. 1.2.2. Phân loại hạn 1.2.2.1. Hạn không khí Hạn không khí thường có đặc trưng là nhiệt độ cao (39 - 420C) và độ ẩm thấp (< 65%). Hiện tượng này thường gặp ở những t nh miền Trung nước ta vào những đợt gió Lào và ở vùng Bắc bộ vào cuối thu, đầu đông. Hiện tượng này còn xuất hiện ở một số nước trên thế giới như gió Chamsin ở Israel; gió Mistral ở miền nam nước Pháp đã làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến một số loài cây trồng như phong lan, cam, chanh, đậu tương [42]... Hạn không ch ảnh hưởng trực tiếp lên các bộ phận của cây như hoa, lá, chồi non, mà còn ảnh hưởng đến quá trình tung phấn của cây. Đối với thực vật nói chung và cây lúa nói riêng thì hạn không khí thường gây ra hiện tượng héo tạm thời vì nhiệt độ cao, độ ẩm thấp, làm cho mức độ thoát hơi nước nhanh vượt qua mức độ bình thường, lúc đó rễ hút nước không đủ bù lại lượng nước mất, cây lâm vào tình trạng mất cân bằng về nước. Nước cũng là sản phẩm khởi đầu, trung gian và giai đoạn cuối cùng của quá trình chuyển hóa hóa sinh, là môi trường để các phản ứng trao đổi chất xảy ra [50]. Vì vây, việc cung cấp đủ nước cho cây chính là một biện 6 pháp canh tác quan trọng. Hướng nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn của cây trồng là một trong những mục tiêu của các nhà tạo chọn giống. Mức độ thiếu hụt nước càng lớn thì ảnh hưởng càng xấu đến quá trình sinh trưởng của cây. Thiếu nước nhẹ thì giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm trọng sẽ dẫn đến biến đổi hệ keo nguyên sinh chất, làm tăng quá trình già hóa tế bào. Khi bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào mô bị tổn thương và chết. 1.2.2.2. Hạn đất Mức độ khô hạn của đất tùy thuộc vào sự bốc hơi nước trên bề mặt và khả năng giữ nước của đất. Hạn đất sẽ làm cho áp suất thẩm thấu của đất tăng cao đến mức cây không thể lấy nước qua tế bào rễ, vì thế hạn đất có thể gây ra cho cây héo lâu dài. Hạn đất tác động trực tiếp đến bộ phận rễ làm ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây. Đối với cây trồng cạn, hạn đất cũng ảnh hưởng nghiêm trọng đến giai đoạn gieo hạt và nảy mầm. Lượng nước trong đất không đủ làm co mầm và héo; nếu thiếu nước nặng sẽ gây thui chột mầm và chết. 1.2.2.3. Hạn toàn diện Hạn toàn diện là hiện tượng khi có cả hạn đất và hạn không khí xảy ra cùng một lúc. Trong trường hợp này, cùng với sự mất nước do không khí làm cho hàm lượng nước trong lá giảm nhanh dẫn đến nồng độ dịch bào tăng lên, mặc dù sức hút nước từ rễ của cây cũng tăng nhưng lượng nước trong đất đã cạn kiệt không đủ cung cấp cho cây. Hạn toàn diện thường dẫn đến hiện tượng héo vĩnh viễn, cây không có khả năng phục hồi. Ở nước ta, hạn toàn diện thường xảy ra ở các t nh miền Trung (Nghệ An, Hà Tĩnh,) gây nên thiệt hại đáng kể cây trồng nói chung và cây lúa nói riêng. 1.3. Ảnh hƣởng của hạn hán đến sản xuất nông nghiệp 1.3.1. Ảnh hưởng của hạn đến thực vật Mỗi cây trồng có một giới hạn nhất định đối với các nhân tố sinh thái của môi trường như hạn, nóng, lạnh, mặn,... Nếu ở ngoài giới hạn đó có thể gây hại cho sự sinh trưởng và phát triển của cây, giảm năng suất sinh học [16]. Đối với thực vật, khái niệm “hạn” dùng để ch sự thiếu hụt nước do môi trường gây nên trong suốt cả 7 quá trình hay trong từng giai đoạn, làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây. Mức độ tổn thương của cây trồng do khô hạn gây ra có nhiều mức khác nhau như chết, chậm phát triển hay phát triển tương đối bình thường. Những cây trồng có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất tương đối ổn định trong điều kiện khô hạn được gọi là cây chịu hạn và khả năng của thực vật có thể giảm thiểu mức độ tổn thương do thiếu hụt nước gây nên gọi là tính chịu hạn [9]. Hạn dẫn đến một số biến đổi trong mô và tế bào như làm biến tính và kết tủa protein, làm tăng độ lỏng của lipit màng, mở xoắn các axit nucleic. Hạn cũng phá hoại hệ thống quang hóa II trên màng thylacoid. Ảnh hưởng của hạn trước hết là gây ra sự mất nước của tế bào và mô. Thiếu nước nhẹ làm ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng, thiếu nước nặng gây biến đổi hệ keo nguyên sinh chất, già hóa tế bào, làm cho cây bị héo. Cuối cùng hệ nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào và mô bị tổn thương và chết. Hạn là nguyên nhân chính của sự mất mùa và làm giảm năng suất gieo trồng [16]. Phản ứng của cây đối với hạn là sự đóng khí khổng, giảm tỷ lệ thoát hơi nước của mô, giảm quang hợp và làm tăng tích lũy axit abcisic (ABA), prolin, manitol, sorbitol, sự cấu thành nhóm ascobat, glutathione, α- tocopherol,... và sự tổng hợp protein mới [54]. 1.3.2. Tác động của hạn đến sản xuất nông nghiệp Hạn hán là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất cây trồng và làm cho sản lượng nông nghiệp toàn cầu không ổn định. Hàng năm, các điều kiện bất lợi của môi trường làm giảm 50% năng suất mùa màng, trong đó tính riêng hạn hán chiếm tới 15%. Thậm chí ở một số nơi có mực nước ngầm thấp, có năm hạn làm giảm 100% năng suất mùa màng [19]. Tại Trung Quốc, hạn hán nghiêm trọng thường xuyên xảy ra ở các t nh miền Bắc. Tình trạng hạn hán kéo dài từ cuối tháng 7/2009 đã ảnh hưởng nghiêm trọng vùng trồng ngô lớn nhất Trung Quốc và có nguy cơ thu hẹp 60% diện tích trồng trọt. Đây là trận hạn hán nghiêm trọng nhất quốc gia này trong vòng 60 năm qua và tác động lên hầu hết các vùng sản xuất lúa mì trong lãnh thổ Cộng hòa Nhân dân Trung Hoa. Ngoài việc phá hủy vụ mùa lúa mì, hạn hán còn gây ra tình trạng thiếu nước cho ước tính khoảng 2,31 triệu người và 2,57 triệu gia súc. Trong 8 8 t nh chịu tác động, 20% đất nông nghiệp và 35% tổng diện tích lúa mì đều bị ảnh hưởng. Đến tháng 2 năm 2011, trận hạn hán ảnh hưởng lên diện tích 7,73 triệu hécta lúa mì vụ đông sắp được thu hoạch. Theo FAO, thiệt hại vụ thu hoạch lúa mì của Trung Quốc có khả năng là một yếu tố đã làm tăng giá lúa mì trên toàn thế giới vào đầu năm 2011 [42]. Ấn Độ cũng đang phải đối mặt với đợt hạn hán nghiêm trọng nhất trong vòng 7 năm qua. Hiện nay đã có hơn 1/3 số quận của Ấn Độ rơi vào tình trạng hạn hán. Thiếu hụt lượng mưa cần thiết có thể khiến tăng trưởng kinh tế của quốc gia này giảm sút 1% trong năm 2006. Đợt hạn hán tồi tệ nhất trong lịch sử gần 20 năm qua tại Thái Lan vào năm 2002 đã đẩy quốc gia xuất khẩu gạo lớn nhất thế giới đối mặt với vụ mùa thất thu. Và theo thông báo mới nhất của cơ quan ngăn ngừa và giảm thiểu thảm họa Thái Lan, 354 huyện thuộc 47 trên tổng số 77 t nh, thành của nước này nằm trong khu vực thảm họa hạn hán [42]. Ở Việt Nam, hạn hán xảy ra ngày càng kéo dài hơn trước và ảnh hưởng ngày càng trầm trọng hơn đối với sản xuất nông nghiệp. Hạn hán năm 1962 ở Bắc bộ và Bắc Trung bộ đã phá huỷ 370.000ha hoa màu. Trận hạn hán 1982 đã tàn phá 180.000ha cây màu ở đồng bằng sông Cửu Long. Trong năm 1983, chúng ta đã mất 291.000ha trồng lúa do hạn hán. Vụ Đông Xuân năm 1992 - 1993, sản lượng lúa của đồng bằng sông Cửu Long giảm 559.000 tấn. Năm 1993 khoảng 175.000ha ở miền Trung bị hạn, trong đó 35.000ha bị chết hoàn toàn, mất khoảng 150.000 tấn lương thực. Vụ hạn 1994 - 1995 ở Đăk Lắk được xem là nặng nề nhất trong 50 năm gần đây, đã làm giảm doanh thu từ cây cà phê khoảng 600 t đồng. Trận hạn hán khác năm 1995 - 1996 ở Miền Bắc tàn phá hoa màu khoảng 13.380ha của vùng Trung Du và 100.000ha vùng đồng bằng sông Hồng. Đặc biệt, hạn hán năm 1998 xảy trên toàn lãnh thổ Việt Nam với tổng diện tích bị hạn hán là 734.284ha, trong đó 276.656ha ở đồng bằng sông Cửu Long. Trận hạn hán này đã ảnh hưởng tới 3,8 triệu dân, gây thiệt hại khoảng 5.000 t đồng. Các t nh từ Khánh Hoà đến Bình Thuận thường xuyên xảy ra hạn hán với tổng số diện tích hạn hán lên tới 300.000ha. Tại Bình Thuận, năm 2004, hạn hán xảy ra trầm trọng khiến diện tích trồng trọt giảm 30 - 50%. Đợt nắng nóng kéo dài cuối năm 2009 khiến ngành nông nghiệp các 9 t nh Đồng bằng sông Cửu Long bị thiệt hại hàng trăm t đồng. T nh Kiên Giang có khoảng 13.400ha lúa bị ảnh hưởng, trong đó hơn 3.000ha bị mất trắng hoàn toàn, thiệt hại gần 80 t đồng. Thiệt hại nặng nhất là huyện Gia Rai, ước tính ch riêng huyện này đã bị thiệt hại gần 50 t đồng [7]. Theo tính toán của Tổng cục Thủy lợi (CAO), thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (04/ 2010), nếu tình hình khô hạn, thiếu nước ngọt như hiện nay tiếp tục kéo dài sẽ ảnh hưởng tới năng suất của khoảng 26.000ha lúa đông ...ược phân thành 6 nhóm giống khác nhau [15]. 1.6. Chọn tạo giống lúa chịu hạn 1.6.1. Chọn tạo lúa chịu hạn trên thế giới Khô hạn là yếu tố chính làm giảm năng suất của lúa (Oryza sativa L.), dưới điều kiện canh tác nước trời (rainfed) và sự kiện thiếu nước tưới ngày càng nghiêm trọng hơn ở vùng có nước tưới cũng như vùng lúa rẫy. Người ta tập trung sự chú ý vào đối tượng khô hạn và mặn, hai dạng gây stress phi sinh học quan trọng đối với 24 sản xuất lúa, và đặt ra mục tiêu hướng tới để cải tiến giống lúa trên qui mô toàn cầu. Chọn giống truyền thống chống chịu khô hạn là cách tiếp cận rất cơ bản trong một thời gian dài, một vài thành công đã được ghi nhận trên cây ngô, cây lúa, cây lúa mì [60], [61]. Tuy nhiên, một lỗ hổng lớn giữa các mức độ chống chịu hạn vẫn chưa được xác định trong hầu hết các loài cây trồng. Đặc biệt là sự ổn định về năng suất vô cùng nhạy cảm với sự thiếu nước [56]. Đáp ứng lại hiện tượng stress do khô hạn, cây trồng có một cơ chế rất tiến bộ từ việc nhận tín hiệu đến truyền nó đi vào hệ thống tinh vi của tế bào, kích thích hoạt động của gen mục tiêu [54]. Chống chịu khô hạn là tính trạng cực kỳ phức tạp, bị ảnh hưởng bởi sự thể hiện đồng thời cả một hệ thống gen mục tiêu và bị ảnh hưởng bởi các yếu tố về môi trường, vật lý, hóa học [45], [48]. Điều này làm cho những tiến bộ nhất định về biến đổi di truyền tính chống chịu khô hạn xảy ra rất chậm chạp. Chiến lược có hiệu quả đã được ghi nhận là làm gia tăng lượng đường dễ hòa tan, các hợp chất cần thiết thông qua tiếp cận với kỹ thuật chuyển nạp gen. Những hợp chất đó là: proline, trehalose, betaine và mannitol, đóng vai trò như những thể bảo vệ thẩm thấu (osmoprotestants); trong vài trường hợp, chúng ổn định được các phân tử chức năng dưới điều kiện bị stress. Protein LEA (late embryogenesis abundant) cũng được chú ý trong điều kiện bị stress do thiếu nước [56]. Protein LEA được phân chia thành 5 nhóm chính trên cơ sở chuỗi trình tự amino acid của nó và chúng được xét nghiệm lại thông qua công cụ tin sinh học [19], [25]. Sự thể hiện của protein LEA và đặc điểm cấu trúc đại phân tử của nó cho thấy vai trò bảo vệ cây chống chịu sự kiện mất nước [29]. Mặc dù chúng ta có nhiều số liệu về cấu trúc và sự thể hiện của protein này, nhưng rất ít công trình đề cập đến thao tác của các gen LEA nhằm cải tiến tính chống chịu khô hạn trong điều kiện đồng ruộng [28]. Thí dụ, gen HVA1 mã hóa nhóm protein 3 LEA của cây lúa mạch (Hordeum vulgare L.). Người ta đã chuyển nạp gen này thành công vào cây lúa để tăng cường tính chống chịu khô hạn và chống chịu mặn, ch trong điều kiện ở nhà lưới [56]. Vào những năm gần đây, do sự phát triển không ngừng của công nghệ sinh học cùng với sự ra đời của các ch thị phân tử đặc biệt là ở lúa, các nhà khoa học đã 25 thiết lập được một số bản đồ phân tử cho các tính trạng số lượng như chịu hạn, chịu úng, chịu phèn. Đối với đặc tính chống chịu hạn bằng sử dụng ch thị phân tử như SSR, AFLP, RFLP, SNP,... các QTL kháng hạn đã được định vị ở nhiều loại cây trồng khác nhau cũng như cây lúa [53]. Phương pháp phân tích sự đóng góp của các tính trạng có liên quan, với mô hình QTL (quantitative trait loci). Phương pháp tiếp cận này phù hợp với hầu hết các loài cây trồng chủ yếu như cây lúa, nhờ bản đồ di truyền với nhiều marker phân tử ADN phủ kín trên nhiễm sắc thể. Tại Đại học Texas Tech, Zhang và cộng sự (1999) đã thực hiện bản đồ di truyền QTL đối với 2 tính trạng quan trọng liên quan đến sự kiện chống chịu khô hạn, đó là: khả năng điều tiết áp suất thẩm thấu (OA), và những tính trạng hình thái của rễ lúa. Quần thể lúa đã được sử dụng trước đây để lập bản đồ QTL tính trạng OA là: Quần thể cận giao tái tổ hợp (RIL) của tổ hợp lai CO39 / Moroberekan, với 1 QTL; Quẩn thể đơn bội kép (DH) của tổ hợp lai CT9993 / IR62266, với 4 QTL; Quần thể cận giao tái tổ hợp (RIL) của tổ hợp lai CO39 / Moroberekan, với 5 QTL; Quần thể lúa đã được sử dụng để lập bản đồ QTL tính trạng tích lũy ABA là quần thể F2 của tổ hợp lai IR20 / 63-83, với 10 QTL [32], [41], [59]. Việc ứng dụng của công nghệ tế bào thực vật trong đánh giá và chọn dòng chịu hạn với kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể được sử dụng để đánh giá khả năng chống chịu của cây trồng ở nhiều mức độ khác nhau như mức gen, mức tế bào riêng rẽ, các loại mô, cơ quan nuôi cấy, phân lập và cây hoàn ch nh. Cho đến nay kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được ứng dụng rộng rãi để đánh giá khả năng chống chịu và chọn dòng chống chịu như chịu hạn mang lại hiệu quả cao trong chọn lọc các giống cây trồng phù hợp với điều kiện sinh thái của từng vùng miền khác nhau. Mundy và Chua tiến hành gây mất nước mô sẹo lúa đã nhận thấy ABA là chất làm tăng khả năng giữ nước và chống chịu mất nước của mô sẹo ở lúa. Nồng độ ABA thích hợp cho xử lý tiền mô sẹo ở lúa là 10 - 5M và thời gian xử lý là 5 -7 ngày [24]. Nghiên cứu chuyển gen khô hạn ở lúa cũng đã thành công với các công trình nghiên cứu. Các kết quả nghiên cứu đều tập chung chuyển gen hrf1 làm tăng ABA là chất làm tăng khả năng giữ nước và chống chịu mất nước ở cây lúa. 26 1.6.2. Chọn tạo giống lúa chống chịu hạn ở Việt Nam Sự khan hiếm về nguồn nước tưới cho nông nghiệp hiện nay và trong tương lai là vấn đề ngày càng trở nên nghiêm trọng có tính chất toàn cầu. Do đó, các dự án nghiên cứu về cây trồng chống chịu khô hạn đang là hướng ưu tiêu đầu tư của các dự án quốc tế và quốc gia. Ở nước ta, việc nghiên cứu, đánh giá chọn tạo các giống lúa chịu hạn đã có từ những năm thập k 90. Cho đến nay, đã có rất nhiều các giống lúa chịu hạn được các nhà khoa học chọn tạo ra thông qua chọn tạo giống truyền thống cũng như ứng dụng công nghệ sinh học. Các kết quả nghiên cứu sơ bộ trên một số giống lúa cho thấy nước ta có nguồn gen chịu hạn phong phú từ các giống lúa địa phương, các giống lúa có tiềm năng chịu hạn vùng núi phía Bắc, Trung, Nam [2]. Vũ Tuyên Hoàng và cộng sự (1992) đã nghiên cứu đặc điểm sinh lý ‎ của các giống lúa chịu hạn ở Việt Nam và đã đưa ra được các ch tiêu như độ ẩm của cây héo, hàm lượng nước trong thân lá cũng như cường độ thoát hơi nước trong thân lá [6]. Nghiên cứu của Nguyễn Hữu Cường và cộng sự (2003) cho rằng, sự gia tăng hàm lượng proline của các giống lúa nghiên cứu có mối tương quan thuận với tính chống chịu lạnh, mặn và hạn. Chu Hoàng Mậu và cộng sự (2005) khi nghiên cứu về hàm lượng proline ở các giống lúa cạn đã nhận thấy khả năng chịu hạn của các giống lúa cạn có liên quan đến hàm lượng protein và hàm lượng proline [3], [10]. Đối với đặc tính chống chịu hạn bằng sử dụng ch thị phân tử như SSR, AFLP, RFLP, SNP, RAPD,... các QTL kháng hạn đã được định vị ở nhiều loại cây trồng khác nhau cũng như cây lúa. Tại Việt Nam, nghiên cứu lập bản đồ QTL kháng hạn ở giống lúa nương sử dụng ch thị phân tử do tổ chức Rockefeller tài trợ đã được tiến hành tại phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, viện Công nghệ Sinh học, viện lúa Đồng bằng Sông Cửu Long, viện Bảo vệ Thực vật, trường Đại học Nông nghiệp [2]. Nhiều giống lúa chịu hạn từ các t nh miền núi phía Bắc, miền Trung và miền Nam Việt Nam đã được thu thập, phân tích, đánh giá về mặt sinh lý cũng như đa dạng di truyền của chúng. Việc nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của các giống lúa cạn làm vật liệu khởi đầu cho công tác chọn tạo giống lúa chịu hạn là một bước quan trọng trong công tác chọn tạo giống. Các nghiên cứu của Chu Hoàng 27 Mậu và cộng sự (2007) đã nghiên cứu trên 12 giống lúa cạn ở 3 t nh Sơn La, Bắc Kạn, Cao Bằng và đã chia các giống lúa thành 4 nhóm với khoảng cách di truyền giữa các giống lúa cạn là 7,69% - 34% và hệ số đa dạng di truyền của hệ gen lúa cạn Hg = 52,37% [10]. Từ kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của một số giống lúa cạn, Lò Thị Mai Thu và cộng sự tiếp tục đánh giá mối quan hệ di truyền ở mức độ phân tử ADN bằng kỹ thuật RAPD đã nhân bản được 182 phân đoạn ADN từ hệ gen của 7 giống lúa cạn. Năm mồi sử dụng cho nghiên cứu đều thể hiện tính đa hình, tính đa hình cao được thể hiện ở các mồi M4, M7, M13 (trong đó mồi M13 có 100% phân đoạn đa hình). Trên cơ sở đó, các tác giả đã chia các giống lúa cạn nghiên cứu thành 2 nhóm chính: nhóm thứ nhất gồm 3 giống (LC, CB2, SL1) và nhóm thứ 2 gồm 4 giống (CB1, HG, SL2, LCh) với hệ số khác nhau là 26%. Hai giống HG và SL1 có khả năng chịu hạn tốt nhất, đồng thời cũng có hệ số tương đồng di truyền cao nhất (97%) được xếp vào cùng một nhóm (trích theo Phạm Thị Bé Tư và cộng sự, 2008) [15]. Nghiên cứu của nhóm tác giả Phạm Anh Tuấn và cộng sự (2008) đã nghiên cứu đánh giá khả năng chịu hạn của 50 giống lúa địa phương. Kết quả cho thấy, 12 trong số 50 giống lúa nghiên cứu đã thể hiện khả năng chịu hạn tốt và đều đạt các ch số độ cuốn lá, độ khô của lá và khả năng phục hồi trong khoảng điểm từ 0-3. Trong đó, có 5 giống là Blào đóng, Blào cô ném, Chạo lựu, Khẩu cụ và Bièo hồng súi chịu hạn cao với điểm của 3 ch tiêu đánh giá đều đạt trong khoảng 0-1. Các giống Q5, CR203 và Khang Dân mẫn cảm với điều kiện khô hạn với mức cấp phản ứng lần lượt là 9,0, 9,0 và 7,7 với cả 3 ch tiêu đánh giá. Kết quả phân tích đa hình di truyền đối với 15 giống lúa (gồm 12 giống có kiểu hình chịu hạn tốt và 3 giống mẫn cảm Khang Dân, Q5, CR203) với 10 cặp mồi SSR cho thấy 4 giống Blào đóng, Blào cô ném, Khẩu cụ và Bièo hồng súi chịu hạn cao tập trung thành một nhóm; các giống mẫn cảm liên kết thành một nhóm. Các giống lúa Blào đóng, Blào cô ném, Khẩu cụ và Bièo hồng súi có thể sử dụng làm nguồn gen chống chịu hạn trong chương trình chọn tạo giống lúa [15]. Việc lập bản đồ QTL các giống lúa chịu hạn, Nguyen Thi Lang và cộng sự đã lập được bản đồ QTL khô hạn với các marker liên kết tập trung quần thể với 232 28 markers chiều dài 2.553.70cM phủ trên 12 nhiễm sắc thể, trung bình là 10.97cM [37]. Chương trình tuyển chọn và phát triển giống lúa cạn cải tiến LC93-1 phục vụ sản xuất lượng thực ở vùng cao của Viện Bảo Vệ Thực Vật Từ Liêm, Hà Nội với phương pháp chọn lọc từ tập đoàn lúa cạn IRRI nhập nội, năm 1993 đã chọn được giống LC93-1 có thời gian sinh trưởng 115 - 125 ngày, năng suất 3 - 4 tấn/ha, chịu hạn khá, chất lượng gạo tốt, thích hợp cho vùng đồng bào dân tộc nghèo ở vùng cao. Nghiên cứu chọn giống lúa chống chịu khô hạn của Viện Cây lương thực thực phẩm với phương pháp thu thập nguồn vật liệu giống lúa cạn chịu hạn địa phương và các dòng lúa cải tiến nhập nội từ IRRI với phương pháp lai hữu tính kết hợp với gây đột biến để tạo ra các tổ hợp lai có khả năng chịu hạn khá và năng suất cao như CH2, CH3, CH133, CH5 trồng rộng rãi ở vùng Trung du miền núi phía Bắc, Trung bộ, Đông Nam bộ và Tây Nguyên. Ở Việt Nam, cho đến nay kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được ứng dụng rộng rãi để đánh giá khả năng chống chịu và chọn dòng chống chịu như chịu hạn mang lại hiệu quả cao. Tác giả Đinh Thị Phòng (2001) bằng các phương pháp thổi khô mô sẹo của các giống lúa CR203, CH133, Lốc, X11, C70 đã thu được 271 dòng mô và 900 dòng cây xanh có khả năng chịu hạn. Tác giả đã chọn tạo được giống DR1, DR2 cho năng suất cao, ổn định, có khả năng chịu hạn, chịu lạnh hơn hẳn giống gốc [12]. Nguyễn Thị Thu Hoài (2005) khi nghiên cứu về khả năng chịu hạn của các giống lúa cạn địa phương đã kết luận rằng khả năng chịu mất nước và tốc độ sinh trưởng của mô sẹo sau khi xử lý thổi khô của các giống nghiên cứu có sự sai khác rõ rệt, giống BC12 là giống chịu hạn tốt nhất so với các giống nghiên cứu [7]. 29 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu - Tổng số có 40 giống lúa (bảng 1), trong đó:  39 giống lúa địa phương Việt Nam có khả năng chịu hạn tốt được cung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên Thực vật và Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long.  01 giống lúa tham khảo (IR64) là giống mẫn cảm với khô hạn. Bảng 2.1. Danh sách, số đăng kí (SĐK) trong ngân hàng gen và kí hiệu các giống lúa nghiên cứu TT SĐK Tên giống Ký hiệu Nguồn gốc 1 412 Nếp bồ hóng Hải Dương H1 Hải Dương - 930 Lia tón H2 - 1832 Khẩu nuột cung H3 - 1837 Lúa mộ trắng H4 - 2021 Khẩu mèo H5 - 2125 B'le tolo H6 - 2127 Ble blu H7 - 2131 Ble la tong H8 - 2135 Ble lenh xi H9 - 2642 Ble’ la H10 11 3351 Lúa can đỏ H11 Qnam - ĐNẵng 12 3371 Nếp mậm H12 QNam - ĐNẵng 13 7099 Kháu căm pị H13 - 14 3429 Chiêm đỏ H14 Quảng Trị 15 3483 Lúa muối H15 Quảng Ngãi 16 3525 Ba chơ K'tê H16 Bình Định 17 6430 Khẩu kẻn H17 - 30 18 3588 Tan ngần H18 Yên Bái 19 4666 IR64 H19 IRRI 20 3895 Ble mạ mùa H20 Sơn La 21 3935 Mồng lu H21 - 22 3947 Khẩu bò khá H22 Lai Châu 23 3970 Blech cấu H23 - 24 4123 Khẩu lẩy khao H24 - 25 4723 Chăm soóng H25 - 26 4726 Nếp cái cạn H26 - 27 4748 Hang ngụa H27 - 28 4762 Lọ cang H28 - 29 4792 Khẩu mà giàng H29 - 30 4793 Khẩu nón H30 - 31 4794 Khẩu hin H31 - 32 4806 Blào sinh sái H32 - 33 4840 Blào đóng H33 - 34 4843 Blào cô ném H34 - 35 5057 Khẩu cụ H35 - 36 5015 Chạo lựu H36 - 37 5018 Khẩu sán H37 - 38 5020 Khẩu đó đón H38 - 39 # Nàng quớt biển H39 Bạc Liêu 40 # Nàng quớt vàng H40 Bạc Liêu Ghi chú: (-) chưa rõ nguồn gốc; (#): lúa địa phương miền Nam 2.1.2. Hóa chất * Hoá chất tách chiết ADN: Hoá chất tách chiết ADN bao gồm các loại như: Nito lỏng, Tris HCl, EDTA, SDS, NaCl, CTAB, Ete, Chloroform, isopropanol, isoamyl alcohol, Ethanol của các hãng Sigma, Merck, Prolabo, ICN, Labscan. 31 - Đệm tách chiết ADN của mẫu lá cây chuyển gen: - Đệm TE: 200 mM Tris-HCl pH8 10 mM Tris-HCl pH8 250 mM NaCl 1 mM EDTA 25 mM EDTA 0,5% SDS - Phenol: chloroform: isoamyl acohol 70% (25:24:1) - Ethanol 100% (hoặc Isopropanol) và Ethanol 70% * Hoá chất dùng cho phản ứng PCR: - Đệm PCR 1X (10 mM Tris-HCl pH8, 1,5 mM MgCl2, 5 mM KCl) hoặc đệm PCR 1X của Quiagen hoặc Invitrogen - MgCl2 của Fermentas, Invitrogen - dNTPs (dATP, dGTP, dCT, dTTP (hoặc dUTP)) của Fermentas, Invitrogen - Mồi, của hãng Fermentas, Invitrogen - Taq polymerase của Fermentas - Mẫu dò có huỳnh quang của IDT, USA - Nước cất hai lần khử ion * Hoá chất chạy dùng để điện di gel agarose: - Pha TAE 50X (1 lít): 242g Tris base; 57,1ml acetic acid; 100ml 0,5M EDTA PH=8; Chuẩn nước cất cho đến 1 lít - TAE 1X: 1 lít TAE 1X được pha 20ml TAE 50X + 980ml nước cất - Argarose: lấy tùy thể tích gel và nồng độ điện di - Chất nhuộm màu Ethidium Bromide - Marker øX17 - Hea III digest DNA, Marker 100bp, Marker λADN * Các mồi SSR: 50 cặp mồi SSR được được sử dụng để phân tích thuộc các locus RM được chọn lọc từ 2240 cặp mồi, do hãng Invitrogen cung cấp dựa vào các thông tin về trình tự, kích thước, số allele chuẩn trên mỗi locus, vị trí phân bố của các locus ở trên 12 nhiễm sắc thể khác nhau đã được McCouch và cộng sự công bố năm 2002 (bảng 2.2) [34]. 32 Bảng 2.2. Danh sách 50 mồi SSR Kích thƣớc TT Primer NST Trình tự lặp lại Các cặp mồi nghiên cứu (bp) 3’-TCCAACATGGCAAGAGAGAG -5’ 1 RM13 5 (GA)6(GA)16 141 5’- GGTGGCATTCGATTCCAG -3’ 3’- GGAAAGAATGATCTTTTCATGG -5’ 2 RM25 8 (GA)18 146 5’- CTACCATCAAAACCAATGTTC -3’ 3’- CCGGTAGGCGCCCTGCAGTTTC -5’ 3 RM145 2 (GA)31 179-222 5’- CAAGGACCCCATCCTCGGCGTC -3’ 3’- GAAACCACCACACCTCACCG -5’ 4 RM152 8 (GGC)10 151 5’- CCGTAGACCTTCTTGAAGTAG -3’ 3’- GCCAGCAAAACCAGGGATCCGG -5’ 5 RM162 6 (AC)20 229 5’- CAAGGTCTTGTGCGGCTTGCGG -3’ 3’- TCACATTCGGTGGCATTG -5’ 6 RM210 8 (CT)23 140 5’- CGAGGATGGTTGTTCACTTG -3’ 3’- CAAATCCCGACTGCTGTCC -5’ 7 RM237 1 (CT)18 130 5’- TGGGAAGAGAGCACTACAGC -3’ 3’- TGGAGTTTGAGAGGAGGG -5’ 8 RM259 1 (CT)17 162 5’- CTTGTTGCATGGTGCCATGT -3’ 3’- TGCAGACATAGAGAAGGAAGTG -5’ 9 RM267 5 (GA)21 156 5’- AGCAACAGCACAACTTGATG -3’ 3’- CTAGCAGGAACTCCTTTCAGG -5’ 10 RM314 6 (GT)3(CG)3(GT)5 118 5’- AACATTCCACACACACACGC -3’ 3’- CCATCCTCCTACTTCAATGAAG -5’ 11 RM342B 9 (CAT)12 141 5’- ACTA-TGCAGTGGTGTCACCC -3’ 3’- AATCCAAGGTGCAGAGATGG -5’ 12 RM495 1 (CTG)7 159 5’- CAACGATGACGAACACAACC -3’ 3’- ACCCAACTACGATCAGCTCG -5’ 13 RM566 9 (AG)15 239 5’- CTCCAGGAACACGCTCTTTC -3’ 3’- CAGCTGCTGCTACTACACCG -5’ 14 RM1103 12 (AG)12 216 5’- CTACTCCACGTCCATGCATG -3’ 3’- ACCAACGCCAAAAGCTACTG-5’ 15 RM1153 4 (AG)13 114 5’- TACTCGCCCTGCATGAGC -3’ 3’- AGGGAGTGTGGCAACTATGC-5’ 16 RM1155 4 (AG)13 148 5’- GGGAGGAGTGAGAAGGGATC -3’ 3’- TTCGTTTTCCTTGGTTAGTG -5’ 17 RM1233 11 (AG)15 175 5’- ATTGGCTCCTGAAGAAGG -3’ 3’- TGTGTCTGAAAACCAAGGGG -5’ 18 RM1313 2 (AG)19 94 5’- CGTCCAAGCTGTTCGTTCTC -3’ 3’- AAGAAATTCAAAACACATGA -5’ 19 RM1364 7 (AG)26 158 5’- AAACATCTACTTTGATCCA -3’ 3’- GTGTGTACGTAGGATCGGAG -5’ 20 RM1367 2 (AG)27 159 5’- TGCTACTCCTAGCTGCTACC -3’ 3’- ACGCTTAAAGAACATTTGAT -5’ 21 RM1761 11 (AT)16 143 5’- GCGATTAACTTTTAACCATT -3’ 3’- AATAAGGGAGAGCCAATCTG -5’ 22 RM2191 11 (AT)23 237 5’- TAGTAGATGGCCGTTCTCTC -3’ 3’- CTCGTACCGTCAAAAGACC -5’ 23 RM3288 4 (CT)14 209 5’- AATCTGGAGGCACTGTCAC -3’ 3’- AGAAGGTTGCTTTCTTGGCC -5’ 24 RM3248 2 (CT)13 197 5’- CTTGCAAGGTCTGTTGCATC -3’ 33 3’- ATCCAAATCCAATGGTGC -5’ 25 RM3431 6 (CT)18 161 5’- GCGAAAGGGAACATTCTG -3’ 3’- GCATCCCGGTGACTAGTACG -5’ 26 RM3436 3 (CT)18 184 5’- TGTGCATGTGGTAAGGAACC -3’ 3’- TGAATCCACACTCGCAGATC -5’ 27 RM3455 12 (CT)20 92 5’- GCCAGTCCACGATTGGTC -3’ 3’- ATAATGGCAGGGTTGTCTCG -5’ 28 RM3467 3 (CT)21 123 5’- CTCGGTGAGCCTCCTACAAC -3’ 3’- ACTAATTGCATGCAGTCTCC -5’ 29 RM3468 1 (CT)21 201 5’- GTTAACGGGATCTTGTTCG -3’ 3’- GATTCTCGTCGTAATCAAGA -5’ 30 RM3476 5 (CT)22 132 5’- ATCCACGGTTAAGATAAATG -3’ 3’- CCTAGCTTTCAGGAGCAAG -5’ 31 RM3483 12 (CT)22 174 5’- CCCACAATGAGAAACAGTTG -3’ 3’- GGAAAGAAGATATGCCATGC -5’ 32 RM3515 2 (CT)28 196 5’- AGAGAGAATCAGAAACACCAAC -3’ 3’- TTGAGCTTCGTCTACAAGCG -5’ 33 RM3534 4 (GA)12 129 5’- CAGCTCCCACCATCTCTCTC -3’ 3’- GCGCTTCTACTTCCACAAGG -5’ 34 RM5501 1 (TC)27 135 5’- GGTTGGCGTACGTAGAGAGG -3’ 3’- CTCCATAATCAAGGAAGCTA -5’ 35 RM5586 4 (TG)30 134 5’- ATGAGTTCTTTCGTCAGTGT -3’ 3’- CTCACAATATCACCATCCAC -5’ 36 RM5599 11 (AAC)11 141 5’- AATTTTGTGCTGTTGTTGAA -3’ 3’- GGAAGAACAGAGTTGCTCGG -5’ 37 RM5639 3 (AAG)13 123 5’- GTGCCATTTATTTCCGTCCC -3’ 3’- ATTGCTGCAAAGTGGGAGAC -5’ 38 RM5766 11 (AGA)9 104 5’- AAGTGGAGGCAGTTCACCAC -3’ 3’- GGATTTGGTCGAACAGGTTG -5’ 39 RM5811 1 (AGG)10 97 5’- TTCGCGCTCTCCAAGCTC -3’ 3’- AGGCTGATCCAAGATCCATG -5’ 40 RM6051 9 (CCG)10 136 5’- CCCGGAGGCTGATTCTTG -3’ 3’- GATTCGTGTCGGTTGTCAAG -5’ 41 RM6314 4 (CTT)11 169 5’- GGTTCAGGGACGAATTTCAG -3’ 3’- CGATCCGCATCTCGAATC -5’ 42 RM6570 9 (GGA)8 119 5’- CCTCCAAGGTCCTCATCCTC -3’ 3’- ACAGCAGGTTGATGAGGACC -5’ 43 RM6648 1 (GTC)8 207 5’- GATCGATCATGGCCAGAGAG -3’ 3’- GGCAGACATACAGCTTATAGGC -5’ 44 RM7003 12 (AAAC)6 101 5’- TGCAAATGAACCCCTCTAGC -3’ 3’- GCCCTTGTCTTCTTCACGTC -5’ 45 RM7372 9 (CTTC)6 148 5’- CAAAGTCGAGAGTCTGCGTG -3’ 3’- GAGGAGAAGAATGCTGGCTG -5’ 46 RM7419 1 (GGAA)6 146 5’- AGTGCTCACCGAGTCACTGG -3’ 3’- CAAAAGTCTGACCGTTTACC -5’ 47 RM7654 11 (TTTC)9 193 5’- TAAGAGACGGAAGAGTGAGC -3’ 3’- CCTAGCTTTCAGGAGCAAG -5’ 48 RM8214 12 (CT)22 174 5’- CCCACAATGAGAAACAGTTG -3’ 3’- AGACGCTACTCCCACCTGTAACC -5’ 49 RM25271 10 (TC)17 185 5’- ATATCATTGCCGCAACACAAGC -3’ 3’-AGGGTAGAGTATGTCGGTGTTTCC-5’ 50 RM25319 10 (CT)14 179 5’- CCGTGGCAGTAGCAGTAGGC -3’ 34 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Tách chiết ADN tổng số và đo độ tinh sạch 2.2.1.1. Tách chiết ADN tổng số Mẫu lá của từng giống được thu thập riêng rẽ và tách chiết ADN tổng số theo phương pháp của Obara và Kako (1998) [38]. Ưu điểm của phương pháp này là ADN tách chiết được khá nguyên vẹn do CTAB có khả năng tạo phức với ADN. Quy trình tách chiết như sau: 1. Nghiền 1,5 – 2 g lá tươi trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn bằng chày và cối sứ. 2. Chuyển bột này sang ống falcon 15ml, sau đó bổ sung 6 ml đệm chiết CTAB (đã được làm nóng đến 650C). 3. Đảo đều và ủ mẫu ở 650C trong thời gian 60 phút, 10 phút đảo đều một lần. 4. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Bổ sung 4 ml Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1), đảo đều trong 10 phút. 5. Ly tâm 13000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. 6. Sau đó chuyển dịch trong phía trên ống falcon sang một ống mới (4ml). Bổ sung một thể tích tương đương (4ml) Isopropanol, đảo đều, giữ ở nhiệt độ - 200C trong 30 phút. 7. Tủa ADN bởi máy ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 10 phút. Rửa tủa 2 - 3 lần (2 - 3h) mỗi lần với 1 ml Ethanol 70%. 8. Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng. Thêm 2 ml đệm TE và 15 µl RNase (10mg/ml). Ủ ở 37oC trong 3h. 9. Chuyển dung dịch ADN vào một ống mới. Thêm 2 ml phenol- chloroform- isoamyl alcohol (25:24:1), đảo đều trong 5 - 10 phút và ly tâm 10 phút ở 10000 vòng/phút. 10. Chuyển phần dịch phía trên vào ống mới. Thêm 750 µl NaCl 5M và 3ml Ete bão hòa hơi nước. Trộn đều và ly tâm 10 phút ở 10000 vòng/phút. 11. Loại bỏ lớp Ete bên trên. Cẩn thận chuyển phần bên dưới vào ống mới 12. Thêm 3ml isopropanol, trộn đều và làm lạnh ở -20°C trong 30 phút. Lấy ADN ra bằng đầu pipet hoặc đũa thủy tinh. 13. Rửa tủa 3 lần với 1,5 ml ethanol 70%. 35 14. Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng. Thêm 800 µl đệm TE để hòa tan tủa. 15. Giữ dung dịch ADN ở - 20°C. 2.2.1.2. Đo độ tinh sạch của ADN Độ tinh sạch và nồng độ ADN tổng số được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% trong môi trường đệm TAE 1X và dùng marker ADN  chuẩn có nồng độ (50ng/µl). * Chuẩn bị gel agarose 1% - Cân 0,4 gam agarose và đong 40 ml TAE 1X (Tris-acetat-acid EDTA) cho vào bình tam giác. - Đun agarose trong lò vi sóng (microwave) cho đến khi tạo thành một dung dịch đồng nhất (1 phút 15 giây). - Để nguội đến khoảng 50 - 600C, dùng pipet lấy 5µl Ethydium Bromide (0,5µg/ml) cho vào bình rồi lắc đều. - Chuẩn bị khay và lược. Đổ dung dịch agarose 1% vào khay sao cho không để lại bọt khí. Để gel đông lại trong khoảng 25-35 phút. * Điện di sản phẩm ADN được tách chiết - Rút lược ra khỏi gel, đặt gel vào bể điện di. Pha dung dịch TAE 1X và đổ TAE ngập mặt gel khoảng 2mm. - Nạp ADN và λADN vào các giếng trên gel - Chạy điện di với hiệu điện thế 130V trong khoảng 20-30 phút (thời gian chạy có thể thay đổi vào kích thước gel và yêu cầu khi nghiên cứu). Để kiểm tra và đánh giá nồng độ và chất lượng của ADN ta ch cần để cho mẫu chạy ra khỏi giếng 3-5cm là đủ. - Soi và chụp ảnh băng sản phẩm điện di trên máy soi UV của High performance UV Transilluminator (UVP). Nồng độ ADN được xác định đựa vào độ sáng của băng ADN so với độ sáng của băng λADN. Độ gọn của băng ADN sẽ cho biết độ nguyên vẹn của ADN đã tách chiết được. 2.2.2. Nhân ADN bằng kỹ thuật SSR- PCR Mỗi phản ứng PCR bao gồm các thành phần và hàm lượng cụ thể như sau: 36 STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước cất hai lần khử ion 3,2 2 Đệm PCR 10X + MgCl2 25mM 1 3 dNTPs 10mM 1,0 4 Taq ADN polymerase 1U/µl 0,8 5 Mồi xuôi 5µM 1,5 6 Mồi ngược 5µM 1,5 7 ADN 10g/µl 1 Tổng thể tích của một phản ứng 10,0 Phản ứng PCR được thực hiện trong ống eppendorf 0,2ml và thực hiện trên máy eppendorf. Quy trình phản ứng PCR: Các bƣớc Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ I 94 5 phút 1 II 94 40 giây 55-60 30 giây 35-37 72 1 phút III 72 5 phút 1 Giữ mẫu ở 40C 2.2.3. Kiểm tra kết quả PCR trên gel Agarrose 3,0%. Theo phương pháp của Khoa Genome thực vật, trường Đại học công nghệ Texas, Mỹ (2002) có cải tiến: Chuẩn bị gel agarose: - Agarose được hòa tan trong dung dịch đệm TAE 1X với nồng độ 3,0%. - Đun sôi dung dịch agarose bằng lò vi sóng (1 phút 30 giây). - Hạ nhiệt độ của gel agarose xuống khoảng 500C. - Bổ sung Ethidium Bromide (EtBr) với nồng độ 0,5µg/ml. 37 Các bước tiến hành: - Chuẩn bị khay gel và lược. - Rót hỗn hợp gel agarose và EtBr vào khay gel và cắm lược. Thời gian chờ gel đông là 7 - 10 phút. - Tra sản phẩm PCR. - Chuẩn bị dung dịch đệm TAE 1x cho vào bể chạy điện di. - Chạy điện di tại 100mA trong 4 giờ. - Rửa gel trong H2O, đặt gel vào máy soi UV và chụp ảnh. 2.2.4. Phân tích và xử lí số liệu Để xác định quan hệ di truyền giữa các dòng lúa, các kết quả thu được từ quá trình điện di sản phẩm PCR được thành lập dựa vào sự xuất hiện hay không xuất hiện của các băng ADN nhờ khuếch đại bằng PCR. - Số 1: các allele có xuất hiện băng ADN - Số 0: các allele không xuất hiện băng ADN - Số 9: các dòng không xuất hiện băng ADN ở tất cả các allele (mất số liệu) Các số liệu trên được nhập vào phần mềm Exel lần lượt theo từng mồi và được xử lý, phân tích bằng chương trình Exel version 5.0 và phần mềm NTSYSpc 2.1. Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được tính theo công thức sau: 2 PIC =1 - Pi (trong đó Pi là tần số xuất hiện của allele thứ i). Tỷ lệ dị hợp (H) của mỗi mẫu được tính theo công thức: X H%  M  Y Trong đó: X: là tổng số mồi có xuất hiện 2 allele/1 locus SSR. M: là tổng số mồi sử dụng trong nghiên cứu. Y: là tổng số mồi SSR không xuất hiện băng ADN. Tỷ lệ khuyết số liệu (M) được tính bằng công thức: Z M %  M Trong đó: Z là tổng số mồi không xuất hiện băng DNA. M là tổng số mồi sử dụng trong nghiên cứu. 38 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số Tách chiết axit nucleic là công việc đầu tiên đóng vai trò quan trọng trong công nghệ ADN. Nhờ tiến bộ và sự đổi mới công nghệ mà tách chiết axit nucleic ngày nay đã trở nên đơn giản. Hiện nay có rất nhiều phương pháp tách chiết ADN tổng số của mẫu thực vật. Tuy nhiên, đối với từng đối tượng mẫu thực vật nhất định cần có phương pháp riêng. Do vậy, việc lựa chọn và cải tiến phương pháp cho phù hợp với từng đối tượng là điều rất cần thiết và quan trọng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp CTAB của Obara và Kako (1998) (đã được cải tiến) để tách chiết ADN hệ gen từ lá của các giống lúa nghiên cứu [38]. Nguyên lý cơ bản của phương pháp này là sử dụng cetyl-trimethyl- amonium-bromid (CTAB), chất này có khả năng hòa tan các chất giải phóng ra từ màng tế bào sau khi màng của chúng bị phá vỡ, ADN dễ hòa tan hơn nhiều so với các chất khác. Vì vậy, CTAB đóng vai trò là chất chính trong tách chiết axit nucleic. Hình 3.1. ADN tổng số của 40 giống lúa nghiên cứu Sau khi thu được ADN, chúng tôi tiến hành kiểm tra chất lượng ADN bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%, (dùng 3µl và 5 µl marker ladder ADN có nồng độ 50ng/µl làm chuẩn để đo nồng độ ADN). Kết quả điện di (hình 3.1) cho thấy các băng gọn, sắc nét, ADN không bị đứt gẫy, có độ tinh sạch khá cao đảm bảo cho thực hiện các phản ứng PCR và các thí nghiệm tiếp theo. 39 3.2. Kết quả phân tích đa hình tập đoàn lúa có khả năng chịu hạn bằng chỉ thị phân tử SSR Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng tổng số 50 ch thị SSR để khảo sát với 5 mẫu giống lúa ngẫu nhiên, kết quả thu được 23 ch thị SSR cho kết quả tốt. 23 ch thị này tiếp tục được sử dụng để phân tích đa dạng di truyền của toàn bộ 40 giống lúa trong tập đoàn nghiên cứu. Sau đây là kết quả phân tích đa hình di truyền của 40 giống lúa với một số mồi SSR điển hình trên gel agarose 3,0%. 3.2.1. Kết quả phân tích với một số mồi điển hình * Kết quả phân tích với cặp mồi RM566 Hình 3.2. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM566 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) Kết quả điện di sản phẩm PCR của 40 mẫu lúa nghiên cứu với cặp mồi RM566 (hình 3.2) cho thấy: xuất hiện 4 loại allele khác nhau với kích thước trong khoảng 234bp - 290bp. Trong đó, duy nhất ở giống Khẩu lẩy khao (H24) không có sản phẩm PCR. 39 giống còn lại đều cho các băng ADN (allele) rất rõ nét và đều có kiểu gen đồng hợp tử ở locus RM566. * Kết quả phân tích với cặp mồi RM3515 Hình 3.3. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM3515 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) 40 Kết quả điện di sản phẩm PCR của 40 mẫu lúa chịu hạn với cặp mồi RM3515 (hình 3.3) cho thấy: xuất hiện 3 loại allele khác nhau có kích thước các allele trong khoảng 110bp – 156bp. Trong đó, 2 giống Blào sinh sái (H32) và Blào đóng (H33) xuất hiện 2 allele (thể hiện trạng thái dị hợp). Các giống còn lại ch xuất hiện 1 allele duy nhất (đều có kiểu gen đồng hợp tử ở locus RM3515). * Kết quả phân tích với cặp mồi RM5599 Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM5599 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) Kết quả điện di sản phẩm PCR của 40 mẫu lúa nghiên cứu với cặp mồi RM5599 (hình 3.4) cho thấy: xuất hiện 3 loại allele khác nhau với kích thước trong khoảng 120bp - 156bp. Trong đó, duy nhất ở giống Mồng lu (H21) không có sản phẩm PCR. 39 giống còn lại đều cho các băng ADN (allele) rất rõ nét và đều có kiểu gen đồng hợp tử ở locus RM5599. * Ảnh điện di kết quả phân tích với một số cặp mồi khác Hình 3.5. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM1364 (M: 100bp DNA Ladder) 41 Hình 3.6. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM3431 (M: 100bp DNA Ladder) Hình 3.7. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM3534 (M: 100bp DNA Ladder) Hình 3.8. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM7003 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) 42 Hình 3.9. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM25271 (M: 100bp DNA Ladder) Hình 3.10. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM25319 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) 3.2.2. Hệ số PIC, số allele và tổng số băng ADN thể hiện trên từng cặp mồi Phân tích 23 cặp mồi SSR với tập đoàn 40 giống lúa nghiên cứu thu được tổng số 82... the interspersion pattern of SINEs", Mol. Biol. Evol. 20, pp. 67-75. 24. Chen T. H., Muranta N. (2002), “Ehancement of tolerance of a family of plant dehydrin protein”, Physiol plant, pp. 795-803. 25. F.A.O., AGL (2000), Extent and causes of salt-affected soils in participating countries. Global network on intergrated soil management for sustainable use of salt-affected soils, Land and plant nutrition management service. 26. Giarrocco L.E., Marassi M. A. and Salerno G. L. (2007), Assessment of the genetic diversity in Argentine rice cultivars with SSR Markers, Crop Science, 47 (2), pp. 853-860. 27. Goyal K., Walton L. J., Tunnacliffe A. 9 (2005), LEA proteins prevent protein aggrevation due to water stress, Biochem J. 388, pp.151-157. 28. Hoisington D., Jiang C., Khairallah M., Ribault J. M., Bohn M., Melchinger A., Willcox M., Gonzalez-de-Leon D. (1996), QTL for insect resistance and drought tolerance in tropical maize: prospects for markerassisted selection, Sym Soc Exp Biol 50, pp. 39-44. 29. Ingram J., Bartels D. (1996), The molecular basis of dehydration tolerance in plants, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 47, pp. 377-403. 30. Jayamani P., Negraxo S., Martins M., Maçãs B. and Oliveira M. M. (2007), "Genetic Relatedness of Portuguese Rice Accessions from Diverse Origins as Assessed by Microsatellite Markers", Crop Sci 47, pp. 879-884 31. Kimura M. (1983), Rare variant alleles in the light of the neutral theory, Mol. Biol. Evol., 1, pp. 84-93. 32. Lilley J. M., Ludlow M. M., McCouch S. R., O’Toole J. C. (1996), Locating QTL for osmotic adjustment and dehydration tolerance in rice, J. Exp Bot 47, pp. 1427-1436. 33. Mahmoud M. S., Sawsan S. Y., Naglaa A. A., Hany S. A. and Ahmed M. E. S. (2005), "Genetic analysis of some Egyptian rice genotypes using RAPD, SSR and AFLP", African Journal of Biotechnology Vol. 4 (9), pp. 882-890. 59 34. McCouch S. R., Sunita J., Jain R. K (2005), "Genetic analysis of Indian aromatic and quality rice (Oryza sativa L.) germplasm using panels of fluorescently-labeled microsatellite markers", Theoretical and Applied Genetics, (Vol. 109) (No. 5), pp. 965-977. 35. McCouch S. R. et al. (2002), “Development and mapping of 2240 new SSR markers for rice (Oryza sativa L.)”, DNA Res. 9, pp. 199 - 207. 36. Nagaraju J., Kathirvel M., Ramesh Kumar R., Siddiq E. A., and Hasnain S. E., (2002), Genetic analysis of traditional and evolved Basmati and non-Basmati rice varieties by using fluorescence-based ISSR-PCR and SSR markers, PNAS, 99 (9), pp. 5836-5841. 37. Nguyen Thi Lang and Bui Chi Buu, (2008), Fine mapping for drought tolerance in Rice (Oryza sativa L.), Omonrice 16, pp. 9-15. 38. Obara-Okeyo P. and Kako S., (1998), Genetic diversity and identifi cation of Cymbidium cultivars as measured by random amplifi ed polymorphic DNA (RAPD) markers, Euphytica, 99, pp. 95-101. 39. Oka H. I. (1988), "Origin of cultivated rice", J. Sci. Societies press, Tokyo, pp. 129. 40. Olufowote J. O., Xu Y., Chen X., Park W. D., Beachell H. M., Dilday R. H., Goto M., and McCouch S. R. (1997), "Comparative evaluation of within- cultivar variation of rice (Oryza sativa L.) using microsatellite and RFLP markers", Genome 38, pp. 1170-1176. 41. Quarries S., V. Lazic -J., Ivanovic M., Pekic C., Heyl A., Landi P., Lebreton C., Steed A. (1997), “Molecular marker methods to dissect drought tolerance in maize”, In: Tsaftaris A, editor. Genetics, biotechnology and breeding of maize and sorghum, Cambridge (UK): The Royal Society of Chemistry, pp. 52-58. 42. Sakuma Y., Maruyama K., Qin F., Osakabe Y., Shinozaki K., and Yamaguchi S., K. (2006), “Dual function of an Arabidopsis transcription factor DREB2A in water-stress-responsive and heat-stress-responsive gene expression”, Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 103, pp. 18822-18827. 60 43. Shen L., Courtois B., McNally K., McCouch S. R., Li Z. (1999), “Developing nera-isogenic lines of IR64 introgressed with QTLs for deeper and thicker roots through marker-aided selection”, In: Genetic Improvement of Rice for Water- Limited Environments. (Eds.) O Ito, JC O’Toole, and B Hardy, IRRI, Philippines, pp. 275-289. 44. Smith J. S. C., Chin C. L., Shu H., Smith O. S., Wall S. J., Senior M. L., Michell S. C., Kresovick S., Ziegle J. (1997), "An evaluation of the utility of SSR loci as Molecular markers in maize (Zea Mays L.): Comparison with data from RFLP and pedigrees", Theor Appl Genet 100, pp. 697-712. 45. Soltis D. E., Soltis P. S. (2003), “The role of phylogenetics in comparative genomics”, Plant Physiol 132, pp. 1790-1800. 46. Sujatha K., Upadhyay R., Kaladhar K., Rani N. S. and Sarla N. (2004), "Genetic relationship among aromatic short grain and Basmati rice based on ISSR and SSR markers", Rice Genetic Newsletter, vol. 21. 47. Tateoka T. (1963), “Taxononic Studies of Oryza III. Key to the species and their enumeration”, Bot. Mag. Tokyo 76, pp. 165-173. 48. Thomashow M. F. (1999), “Plant Cold Acclimation: freezing tolerance genes and regulatory mechanisms”, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 50, pp. 571-599. 49. Victoria C. L., Darshan S. B., Toshinori A., Edilberto D. R. (2007), “Assessment of Genetic Diversity of Philippine Rice Cultivars Carring Good Quality trait using SSR marker”, Breeding Science (57), pp. 263-270. 50. Virk P. S., Fork B. V, Jakson M. T., New B. H. J. (1995), “Use of RADP for the study of diversity within plant Germplasm collection”, Heridity (74), pp. 170-179. 51. Wang H., Zhang H., Gao F., Li J., Li Z. (2007), “Comparision of gene expression between upland rice cultivars under water stress using cDNA microarray”, TAG 115, pp.1109-1126. 52. Wong S. C., Yiu P. H., Bong S. T. W., Lee H. H., Neoh P. N. P. and Rajan A., (2009), Analysis of Sarawak Bario Rice Diversity Using Microsatellite Markers, American Journal of Agricultural and Biological Sciences, 4 (4), pp. 298-304. 61 53. Xiao B., Huang Y., Tang N., Xiong L. (2007), Over-expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field conditions”, TAG 115, pp. 35-46. 54. Xiong L., Schumaker K. S., Zhu J. K. (2002), Cell signaling during cold, drought, and salt stress”, Plant Cell 14 (Suppl), pp. 165-183. 55. Xu Y., Henry B., Mc Couch S. R. (2004), “A marker approach to broading the genetic base of rice in the USA”, Crop Sci (44), pp. 1847-1959. 56. Xu D., Duan X., Wang B., Hong B., Ho T., Wu R. (1996), Expression of a late embyogenesis abundant protein gene, HVA1, from barley confers tolerance to water deficit and salt stress in transgenic rice”, Plant Physiol 110, pp. 249-257. 57. Yu S. B., Xu W. J., Vijayakumar C. H., Ali J., Fu B. Y., Xu J. L., Jiang Y. Z., Marghirang R., Domingo J., Aquino C., Virmani S.S., and Li Z. K., (2003), Molecular diversity and multilocus organization of the parental lines used in the International Rice Molecular Breeding Program, Theor. Appl. Genet, 108, pp. 131-140. 58. Zahida H. P., Malik A. R., Stephen R. P. and Salman A. M. (2009), “Determination of genetic variability of Asian rice (Oryza sativa L.) varieties using microsatellite markers”, African Journal of Biotechnology Vol. 8 (21), pp. 5641-5651. 59. Zhang J., Zheng H. G., Ali M. L., Triparthu J. N., Aarti A., Pathan M. S., Sarial A. K., Robin S., Thuy T. N., Babu R. C., Bay D. N., Sarkarung S., Blum A., Henry T. N. (1999), “Progress on the molecular mapping of osmotic adjustment and root traits in rice”, In: Genetic Improvement of Rice for Water- Limited Environments, (Eds.) O Ito, JC O’Toole, and B Hardy, IRRI, Philippines, pp. 307- 317. 60. Zhang X., Zhou S, Fu Y., Su Z., Wang X., Sun C. (2006), “Identification of a drought tolerant introgression line derived from Dongxiang common wild rice (O. rufipogon Griff.)”, Plant Mol Biol 62: pp. 247-259. 61. Zhao S. H., Wang F. Z., Lu L., Zhang H. Y., Zhang X.Y. (2000), “Breeding and selection of drought resistant and salt tolerant wheat variety Cang 6001”, Acta Agric Boreall Sin 15, pp. 113-117. 62 Tài liệu Internet 62. www.knowledgebank.irri.org 63. www.nea.gov.vn/html/DDSH/dulieu1/khainiem/ 63 PHỤ LỤC 1. Phụ lục 1. Danh sách giống lúa sử dụng để giải trình tự ADN Danh sách những giống lúa sử dụng để giải trình tự ADN Ký Nguồn Năng Ph m Kháng Bạc Đạo Chịu Chịu Chịu Chịu Đặc điểm TT SĐK Tên giống TGST hiệu gốc suất chất rầy lá ôn hạn mặn rét ngập chính Nếp bồ hóng Cứng cây yếu, 1 412 H1 Hải Dương 145 39,47 Kthơm NC Ktb K Tốt - Hải Dương đẻ nhánh mạnh Cây trung bình, 2 930 Lia tón H2 - 123 47,04 Kthơm NC N NC Tốt - đẻ nhánh mạnh 3 3429 Chiêm đỏ H14 Quảng Trị x x x 4 3525 Ba chơ K'tê H16 Bình Định x 5 3588 Tan ngần H18 Yên Bái ngon x 6 4806 Blào sinh sái H32 7 5018 Khẩu sán H37 8 Nàng quớt biển H39 64 2. Phụ lục 2: Bài báo: “Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn lúa chịu hạn của Việt Nam bằng chỉ thị SSR” đã đƣợc gửi đăng trên Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ĐÁNH GIÁ ĐA D NG DI TRU ỀN TẬP ĐOÀN L A CHỊU H N CỦA VIỆT NAM B NG CHỈ THỊ PH N T SSR Nguyễn Thị Minh Nguyệt1, Nguyễn Thị Nhài1, Nguyễn Thị Thanh Thủy2, Nguyễn Thúy Điệp1, Kiều Thị Dung1, Nguyễn Thị Thảo3, Khuất Hữu Trung1 TÓM TẮT Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn lúa chịu hạn của Việt Nam (bao gồm 39 giống lúa địa phương có khả năng chịu hạn tốt và giống lúa tham khảo - IR64 mẫn cảm với khô hạn) bằng ch thị SSR cho thấy: các giống lúa nghiên cứu rất đa dạng về các thành phần allele. Kết quả phân tích 23 locus SSR thu được tổng số 82 loại allele, trung bình 3,57 allele/locus. T lệ allele hiếm xuất hiện là 8,7% (2 allele hiếm xuất hiện ở các cặp mồi RM3467 và RM5811). Hệ số PIC dao động từ 0,22 - 0,77 (trung bình là 0,56). T lệ dị hợp ở các giống lúa nghiên cứu rất khác nhau dao động từ 0 đến 14,29% (trung bình là 3,45%). Tập đoàn giống lúa nghiên cứu có mức độ đa dạng di truyền rất cao, hệ số tương đồng di truyền giữa các giống lúa dao động từ 0,02 đến 0,91. Dựa vào khoảng cách di truyền, 40 giống lúa nghiên cứu được chia thành 4 nhóm lớn. Kết hợp kết quả phân nhóm cách biệt di truyền và những thông tin về kiểu hình chịu hạn, 8 giống lúa điển hình có nguồn gốc khác 1 Viện Di truyền Nông nghiệp Địa ch liên hệ: Tel: 84-4- 37540764; Fax: 84-4-37543196; Email: khuathuutrung@yahoo.com 2 Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn 3. Đại học Sư phạm Hà Nội 65 nhau đã được chọn để giải trình tự, tạo lập cơ sở dữ liệu nguồn gen phục vụ công tác chọn, tạo giống lúa chịu hạn của Việt Nam. Từ khóa: Chỉ thị SSR, chịu hạn, đa dạng di truyền, lúa địa phương. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực có khả năng chịu hạn kém và khá nhạy cảm với môi trường bên ngoài. Tính chịu hạn của lúa phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau: khả năng đâm xuyên của rễ, khả năng điều ch nh áp suất thẩm thấu của tế bào lá, cơ chế điều khiển thoát hơi nước ở khí khổng. Những nghiên cứu về sinh lý và di truyền học đã ch ra rằng: có khoảng 200 gen tham gia vào cơ chế kháng hạn ở cây trồng, nhưng các gen này không quy tụ vào một giống cố định. Vì vậy, khả năng và mức độ kháng hạn rất khác nhau phụ thuộc vào sự có mặt và biểu hiện của các gen khác nhau. Hiện nay, hạn hán là nguyên nhân cản trở rất lớn cho việc phát triển bền vững nền nông nghiệp của nước ta, vì vậy việc nghiên cứu, đánh giá các nguồn gen liên quan đến tính chịu hạn ở cây lúa để nâng cao khả năng chịu hạn, ổn định năng suất trở thành vấn đề thời sự mang tính cấp bách và cần thiết. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn lúa chịu hạn của Việt Nam bằng chỉ thị SSR” nhằm tạo lập cơ sở dữ liệu cho nguồn gen lúa chịu hạn bản địa của Việt Nam phục vụ công tác nghiên cứu, chọn tạo giống lúa chịu hạn. II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu là tập đoàn bao gồm 39 giống lúa có đặc tính chịu hạn được thu thập ở nhiều địa phương khác nhau, các giống này đang được lưu giữ và bảo tồn tại ngân hàng gen Cây trồng Quốc gia (Trung tâm Tài nguyên Thực vật) và ngân hàng gen của Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long và giống lúa tham khảo - IR64 mẫn cảm với khô hạn (bảng 1). 23 cặp mồi 66 SSR được sử dụng để phân tích thuộc các locus RM được chọn lọc từ 2240 cặp mồi, do hãng IDT (Mỹ) cung cấp dựa vào các thông tin về trình tự, kích thước, số allele chuẩn trên mỗi locus, vị trí phân bố của các locus ở trên 12 nhiễm sắc thể khác nhau đã được công bố (bảng 2) (McCouch et all., 2002). 2. Phƣơng pháp nghiên cứu Tách chiết ADN tổng số: mẫu lá của từng mẫu giống được thu thập riêng rẽ và tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB của Obara và Kako có cải tiến (Obara và Kako, 1998). Chạy PCR: các phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt: 940C (5 phút), 35-37 chu kỳ [940C (40s); 55-600C (30s), 720C (30s - 1 phút)] và kết thúc ở 720C (5 phút). Phân tích và xử lý số liệu: kết quả được thống kê dựa vào sự xuất hiện hay không xuất hiện của các băng ADN (các allele). Số liệu được xử lý, phân tích bằng chương trình Exel version 5.0 và phần mềm NTSYSpc 2.1 (Rohlf, 1997). Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được tính theo công thức sau: 2 PIC = 1 - Pi (trong đó Pi là tần số xuất hiện của allele thứ i). X Tỷ lệ dị hợp (H) của mỗi mẫu được tính theo công thức: H%  ; M  Y trong đó: X là tổng số mồi có xuất hiện 2 allele/1 locus SSR; M là tổng số mồi sử dụng trong nghiên cứu; Y là tổng số mồi SSR không xuất hiện băng ADN. Z Tỷ lệ khuyết số liệu (M) được tính bằng công thức: M %  ; trong đó: M Z là tổng số mồi không xuất hiện băng ADN; M là tổng số mồi sử dụng trong nghiên cứu. 67 Bảng 1. Danh sách, tên, kí hiệu và số đăng kí của các giống lúa nghiên cứu Ký Ký Nguồn TT SĐK Tên giống Nguồn gốc TT SĐK Tên giống hiệu hiệu gốc 1 412 Nếp bồ hóng H1 Hải Dương 21 3935 Mồng lu H21 - Hải Dương 2 930 Lia tón H2 - 22 3947 Khẩu bò khá H22 Lai Châu 3 1832 Khẩu nuột cung H3 - 23 3970 Blech cấu H23 - 4 1837 Lúa mộ trắng H4 - 24 4123 Khẩu lẩy H24 - khao 5 2021 Khẩu mèo H5 - 25 4723 Chăm soóng H25 - 6 2125 B'le tolo H6 - 26 4726 Nếp cái cạn H26 - 7 2127 Ble blu H7 - 27 4748 Hang ngụa H27 - 8 2131 Ble la tong H8 - 28 4762 Lọ cang H28 - 9 2135 Ble lenh xi H9 - 29 4792 Khẩu mà H29 - giàng 10 2642 Ble’ la H10 - 30 4793 Khẩu nón H30 - 11 3351 Lúa can đỏ H11 Quảng Nam 31 4794 Khẩu hin H31 - 12 3371 Nếp mậm H12 Quảng Nam 32 4806 Blào sinh sái H32 - 13 7099 Kháu căm pị H13 - 33 4840 Blào đóng H33 - 14 3429 Chiêm đỏ H14 Quảng Trị 34 4843 Blào cô ném H34 - 15 3483 Lúa muối H15 Quảng Ngãi 35 5057 Khẩu cụ H35 - 16 3525 Ba chơ K'tê H16 Bình Định 36 5015 Chạo lựu H36 - 17 6430 Khẩu kẻn H17 37 5018 Khẩu sán H37 - 18 3588 Tan ngần H18 Yên Bái 38 5020 Khẩu đó đón H38 - 19 4666 IR64 H19 IRRI 39 * Nàng quớt H39 - biển 20 3895 Ble mạ mùa H20 Sơn La 40 * Nàng quớt H40 - vàng Ghi chú: SĐK: số đăng kí ở ngân hàng gen;(-) chưa rõ nguồn gốc; (*): Giống lúa mùa địa phương miền Nam III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân tích đa hình ADN bằng các chỉ thị phân tử SSR Kết quả phân tích 23 cặp mồi SSR với tập đoàn 40 giống lúa nghiên 68 cứu thu được tổng số 82 loại allele khác nhau, số allele/locus dao động từ 2 - 5, trung bình 3,57 allele/locus. Cả 23 cặp mồi đều cho các locus đa hình, trong đó có 3 cặp mồi thu được 2 allele, 10 cặp mồi thu được 3 allele, 4 cặp mồi thu được 4 allele và 6 cặp mồi thu được 5 allele (bảng 2). 69 Bảng 2. Số allele thể hiện và hệ số PIC của 23 cặp mồi SSR Vị trí Kích thƣớc sản Số alen Số allele STT Tên mồi trên PIC ph m PCR (bp) thể hiện hiếm NST 1 RM145 2 194-281 5 0 0,61 2 RM152 8 151-175 3 0 0,51 3 RM267 5 150-180 3 0 0,59 4 RM566 9 234-290 4 0 0,72 5 RM1155 4 120-190 5 0 0,62 6 RM1364 7 120-194 4 0 0,63 7 RM1367 2 90-150 5 0 0,77 8 RM3288 4 130-190 3 0 0,50 9 RM3431 6 130-194 2 0 0,29 10 RM3467 3 95-180 5 1 0,70 11 RM3468 1 180-234 5 0 0,72 12 RM3476 5 118-190 4 0 0,70 13 RM3483 12 150-234 5 0 0,72 14 RM3515 2 110-156 3 0 0,66 15 RM3534 4 110-150 3 0 0,53 16 RM5599 11 120-156 3 0 0,53 17 RM5811 1 90-130 3 1 0,50 18 RM6051 9 118-156 3 0 0,46 19 RM7003 12 100-130 2 0 0,46 20 RM7372 9 100-140 3 0 0,46 21 RM7581 1 120-220 3 0 0,22 22 RM25271 10 156-210 2 0 0,38 23 RM25319 10 120-200 4 0 0,61 Tổng 82 2 12,89 Trung bình 3,57 0,087 0,56 Ghi chú: NST: nhiễm sắc thể; PIC: Polymorphic Information Content 70 Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được coi là thước đo tính đa hình của các allele ở từng locus SSR. Qua kết quả thu được ở bảng 2 cho thấy rằng, giá trị PIC của 23 marker thay đổi từ 0,22 (ở mồi xuất hiện 3 allen – RM7581) đến giá trị PIC cao nhất là 0,77 (ở mồi xuất hiện 5 allele- RM1367). Hệ số PIC trung bình của 23 cặp mồi nghiên cứu là 0,56. Có 2 allen hiếm xuất hiện (allele có tần số xuất hiện nhỏ hơn 5%) ở các cặp mồi RM145, RM3467 và RM5811 (chiếm t lệ 8,7%). Những kết quả thu được cũng tương đương với một số kết quả nghiên cứu trên thế giới (bảng 3). Bảng 3. Một số kết quả phân tích đa dạng di truyền sử d ng chỉ thị SSR trên cây lúa đ được công bố Trung bình Số Tổng Số Số allele TT Tác giả chỉ số PIC Số allele giống thể thị allele hiếm/locus hiện/locus 1 Nagaraju J., 2002 24 19 70 3,8 - - 2 Yu S. B., 2003 193 101 628 6,2 0,68 - 3 Chakravarthi B.K., 2006 15 30 462 - - - 4 Giarrocco L.E., 2007 69 26 219 8,4 0,69 1,7 5 Alvarez A., 2007 50 10 66 6,6 0,74 1,4 6 Herrera T.H., 2008 18 48 203 4,23 0,52 - 7 Wong S.C., 2009 8 12 31 2,6 0,52 - 8 Nghiên cứu này 40 23 82 3,57 0,56 0,087 Hình 1. Ảnh điện di sản phẩm PCR của 40 giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM3468 (M: øX17- Hea III digest DNA ladder) 71 3.2. Tỷ lệ dị hợp (H%) và tỷ lệ khuyết số liệu (M%) của 40 giống lúa nghiên cứu Bảng 4.Tỷ lệ dị hợp (H%) và tỷ lệ khuyết số liệu (M%) của 40 giống lúa nghiên cứu TT Tên giống M% H% TT Tên giống M% H% 1 Nếp bồ hóng Hải Dương 4,35 0,00 21 Mồng lu 4,35 4,55 2 Lia tón 0,00 0,00 22 Khẩu bò khá 0,00 0,00 3 Khẩu nuột cung 0,00 4,35 23 Blech cấu 4,35 9,09 4 Lúa mộ trắng 4,35 0,00 24 Khẩu lẩy khao 8,70 4,76 5 Khẩu mèo 4,35 0,00 25 Chăm soóng 0,00 4,35 6 B'le tolo 0,00 4,35 26 Nếp cái cạn 0,00 4,35 7 Ble blu 0,00 0,00 27 Hang ngụa 0,00 0,00 8 Ble la tong 0,00 0,00 28 Lọ cang 4,35 4,55 9 Ble lenh xi 0,00 0,00 29 Khẩu mà giàng 0,00 4,35 10 Ble’ la 4,35 0,00 30 Khẩu nón 0,00 4,35 11 Lúa can đỏ 0,00 4,35 31 Khẩu hin 0,00 0,00 12 Nếp mậm 0,00 0,00 32 Blào sinh sái 0,00 8,70 13 Kháu căm pị 0,00 0,00 33 Blào đóng 8,70 14,29 14 Chiêm đỏ 0,00 4,35 34 Blào cô ném 0,00 0,00 15 Lúa muối 0,00 8,70 35 Khẩu cụ 0,00 4,35 16 Ba chơ K'tê 0,00 8,70 36 Chạo lựu 0,00 8,70 17 Khẩu kẻn 0,00 8,70 37 Khẩu sán 4,35 4,55 18 Tan ngần 0,00 4,35 38 Khẩu đó đón 0,00 4,35 19 IR64 0,00 0,00 39 Nàng quớt biển 13,04 5,00 20 Ble mạ mùa 0,00 0,00 40 Nàng quớt vàng 8,70 0,00 Trung bình 1,85 3,45 Qua kết quả thu được ở bảng 4 cho thấy, tỷ lệ dị hợp ở các giống lúa nghiên cứu rất khác nhau. Tỷ lệ dị hợp (H%) cao nhất ở giống lúa Blào đóng với tỷ lệ 14,29%, tiếp theo là giống lúa Blech cấu có tỷ lệ dị hợp 9,09%. Các 72 giống lúa Ba chơ K'tê, Lúa muối, Khẩu kẻn, Blào sinh sái và Chạo lựu đều có tỷ lệ dị hợp 8,70%. Giống lúa Nàng quớt biển có tỷ lệ dị hợp 5,00%. Giống lúa Khẩu lẩy khao có tỷ lệ dị hợp 4,76%. Ba giống lúa Mồng lu, Lọ cang và Khẩu sán có tỷ lệ dị hợp 4,55%. Các giống lúa Khẩu nuột cung, B'le tolo, Lúa can đỏ, Chiêm đỏ, Tan ngần, Chăm soóng, Nếp cái cạn, Khẩu mà giàng, Khẩu nón, Khẩu cụ và Khẩu đó đón đều có tỷ lệ dị hợp 4,35%. 17 giống còn lại có tỷ lệ dị hợp 0% có nghĩa là các dòng này đều đồng hợp ở cả 23 mồi nghiên cứu (ch có 1 allele duy nhất/locus). T lệ dị hợp trung bình của cả tập đoàn là 3,45%. Tỷ lệ số liệu khuyết (M%) cao nhất ở giống lúa Nàng quớt biển với t lệ 14,29% (khuyết số liệu ở 3 mồi). Các giống Khẩu lẩy khao, Blào đóng và Nàng quớt vàng có t lệ khuyết số liệu là 8,7% (khuyết số liệu ở 2 mồi). Các giống Nếp bồ hóng Hải Dương, Lúa mộ trắng, Khẩu mèo, Ble’ la, Mồng lu, Blech cấu. Lọ cang, Khẩu sán có t lệ khuyết số liệu là 4,35% (khuyết số liệu ở 1 mồi). Còn lại 28 giống không bị khuyết số liệu ở tất cả các mồi. Tỷ lệ khuyết số liệu trung bình của cả tập đoàn là 1,85%, không có giống nào có t lệ khuyết số liệu lớn hơn 15%. Như vậy, cả 40 giống nghiên cứu đều có ý nghĩa thống kê trong phân tích đa dạng di truyền. 3.3. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của các giống lúa nghiên cứu Số liệu thu được từ kết quả điện di sản phẩm PCR của 23 cặp mồi SSR với tập đoàn 40 giống lúa chịu hạn nghiên cứu được thống kê và phân tích bằng phần mềm NTSYSpc 2.1, từ đó thiết lập được bảng hệ số tương đồng di truyền và sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa chịu hạn (hình 2). 73 H1 H39 H40 H4 H5 H9 H14 H15 H11 H12 H10 H19 H23 H24 H2 H3 H6 H7 H8 H13 H10MW H16 H17 H25 H28 H18 H20 H22 H21 H26 H27 H29 H30 H32 H33 H31 H34 H35 H36 H37 H38 0.19 0.26 0.33 0.40 0.48 0.55 0.62 0.69 0.76 0.84 0.91 Coefficient Hình 2. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền gi a các giống lúa chịu hạn nghiên cứu Qua bảng hệ số tương đồng và sơ đồ về mối quan hệ di truyền giữa các giống nghiên cứu (hình 2) cho thấy: hệ số tương đồng di truyền của 40 giống lúa chịu hạn nghiên cứu dao động trong khoảng từ 0,02 đến 0,91. Ở mức tương đồng di truyền 26%, 40 giống lúa chịu hạn nghiên cứu được chia thành 4 nhóm cách biệt di truyền. * Nhóm I gồm 3 giống lúa: Nếp bồ hóng Hải Dương, Nàng quớt biển và Nàng quớt vàng. Hệ số tương đồng di truyền giữa các giống trong nhóm dao động trong khoảng 0,26 (giống Nếp bồ hóng Hải Dương và Nàng quớt biển; giống Nếp bồ hóng Hải Dương và Nàng quớt vàng) đến 0,91 (giữa giống Nàng quớt biển và Nàng quớt vàng). * Nhóm II gồm 11 giống được chia thành 2 phân nhóm: - Phân nhóm 2.1 gồm 2 giống: Lúa mộ trắng và Khẩu mèo có hệ số tương đồng di truyền là 0,42. - Phân nhóm 2.2 gồm 9 giống được chia thành 2 phân nhóm phụ + Phân nhóm phụ 2.2.1 gồm 6 giống: Ble lenh xi, Chiêm đỏ, Lúa muối, 74 Lúa can đỏ, Nếp mậm và Ble’ la, có hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,42 (giữa giống Ble’ la và Lúa muối) đến 0,74 (giữa giống Ble lenh xi và Chiêm đỏ). + Phân nhóm phụ 2.2.1 gồm 3 giống: IR64, Blech cấu và Khẩu lẩy khao, có hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,53 (giữa giống Blech cấu và Khẩu lẩy khao) đến 0,62 (giữa giống IR64 và Blech cấu). * Nhóm III gồm 6 giống: Lia tón, Khẩu nuột cung, B'le tolo, Ble blu, Ble la tong và Kháu căm pị. Hệ số tương đồng di truyền giữa các giống trong nhóm dao động trong khoảng 0,28 (giữa giống Lia tón và Khẩu nuột cung) đến 0,64 (giữa giống Ble blu và Ble la tong). * Nhóm IV gồm 20 giống được chia thành 3 phân nhóm: + Phân nhóm 4.1 gồm 8 giống Ba chơ K'tê, Khẩu kẻn, Chăm soóng, Lọ cang, Tan ngần, Ble mạ mùa, Khẩu bò khá và Mồng lu có hệ số tương đồng dao động từ 0,37 (giữa giống Ba chơ K'tê và Mồng lu) đến 0,70 (giữa giống Ble mạ mùa và Khẩu bò khá). + Phân nhóm 4.2 gồm 7 giống: Nếp cái cạn, Hang ngụa, Khẩu mà giàng, Khẩu nón, Blào sinh sái, Blào đóng và Khẩu hin. Phân nhóm này có hệ số tương đồng dao động từ 0,38 (giữa giống Hang ngụa và Khẩu nón) đến 0,85 (giữa giống Khẩu mà giàng và Khẩu nón). + Phân nhóm 4.3 gồm 5 giống Blào cô ném, Khẩu cụ, Chạo lựu, Khẩu sán và Khẩu đó đón, Phân nhóm này có hệ số tương đồng dao động từ 0,47 (giữa giống Blào cô ném và Khẩu đó đón) đến 0,75 (giữa giống Khẩu cụ và Chạo lựu). IV. KẾT LUẬN Tập đoàn giống lúa chịu hạn bản địa của Việt Nam khá đa dạng về các thành phần allele. Kết quả phân tích 23 ch thị phân tử SSR với 39 giống lúa chịu hạn và giống IR64 thu được tổng số 82 loại allele, trung bình 3,57 allele/locus. Hệ số PIC dao động từ 0,22 đến 0,77 (trung bình 0,56). T lệ 75 allele hiếm xuất hiện là 8,7% (2 allele hiếm xuất hiện ở các cặp mồi RM3467 và RM5811). Các giống lúa chịu hạn có độ thuần di truyền khác nhau, tỷ lệ dị hợp của các giống lúa nghiên cứu dao động từ 0 đến 14,29% (trung bình là 3,45%). Mức độ đa dạng di truyền giữa các giống lúa chịu hạn rất cao. Hệ số tương đồng di truyền giữa các giống lúa dao động từ 0,02 đến 0,91. Dựa vào khoảng cách di truyền, 40 giống nghiên cứu được phân thành 4 nhóm cách biệt di truyền. Đã chọn được 8 giống lúa điển hình có độ đa dạng cao và có nguồn gốc khác nhau để giải trình tự, tạo lập cơ sở dữ liệu nguồn gen phục vụ công tác chọn, tạo giống lúa chịu hạn của Việt Nam. Lời cảm ơn: Nghiên cứu này được thực hiện trong khuôn khổ đề tài Nghị định thư hợp tác với Vương Quốc Anh:“Nghiên cứu giải mã genome một số giống lúa địa phương của Việt Nam”. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Alvarez A., Fuentes J. L., Puldón V., Gómez P. J., Mora L., Duque M. C., Gallego G. and Tohme J. M. (2007). Genetic diversity analysis of Cuban traditional rice (Oryza sativa L.) varieties based on microsatellite markers. Genetics and Molecular Biology, 30 (4): 1109-1117. 2. Chakravarthi B. K., and Naravaneni R. (2006). SSR marker based DNA fingerprinting and diversity study in rice (Oryza sativa. L). African Journal of Biotechnology, 5 (9): 684-688. 3. Giarrocco L.E., Marassi M. A. and Salerno G. L. (2007). Assessment of the genetic diversity in Argentine rice cultivars with SSR Markers. Crop Science, 47 (2): 853-860. 4. McCouch S. R., Leonid T.2, Y. Xu, K. B. Lobos, K. Clare, M. Walton, B. Fu, R. Maghirang, Z. Li, Y. Xing, Q. Zhang, I. Kono, M. Yano, R. Fjellstrom, G. DeClerck, D. Schneider, S. Cartinhour, D. Ware, L. Stein. (2002), "Development and Mapping of 2240 New SSR Markers for Rice (Oryza sativa L.)”, DNA Res. 9:199-207. 76 5. Nagaraju J., Kathirvel M., Ramesh Kumar R., Siddiq E. A., and Hasnain S. E., (2002). Genetic analysis of traditional and evolved Basmati and non-Basmati rice varieties by using fluorescence-based ISSR-PCR and SSR markers. PNAS, 99 (9): 5836-5841. 6. Nguyen Thi Thanh Thuy, Nguyen Duy Bay, Nguyen Quang Xu, Vu Duc Quang, Tran Duy Quy, Bui Chi Buu, Varapong Chamarerk, Surapong Sarkarung and Henry T. Nguyen, (2000). Genetic evaluation of several characteristics of drought resistance in selected rice line. Proceedings of 18th Conference of Asian Federation of engineering organizations. ASEAN Engineering Cooperation for the Development of the New Millennium: 458-462. 7. Obara O. P. and S. Kako (1998). Genetic diversity and identification of Cymbidium cultivars as measured by random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers. Euphytica, 99: 95-1001. 8. Rohlf F., (1997). NTSYS-pc: numerical taxonomy and multivariate analysis system, 2.1 edn. Department of Ecology and Evolution, State University of NY, Stony Brook. 9. Wong S. C., Yiu P. H., Bong S. T. W., Lee H. H., Neoh P. N. P. and Rajan A., (2009). Analysis of Sarawak Bario Rice Diversity Using Microsatellite Markers. American Journal of Agricultural and Biological Sciences, 4 (4): 298-304. 10. Yu S. B., Xu W. J., Vijayakumar C. H., Ali J., Fu B. Y., Xu J. L., Jiang Y. Z., Marghirang R., Domingo J., Aquino C., Virmani S.S., and Li Z. K., (2003). Molecular diversity and multilocus organization of the parental lines used in the International Rice Molecular Breeding Program. Theor. Appl. Genet, 108: 131-140. 77 ANALYZING GENETIC DIVERSITY OF NATIVE DROUGHT TOLERANT RICE VARIETIES IN VIETNAM BY MICROSATELLITE MARKERS Nguyen Thi Minh Nguyet1, Nguyen Thi Nhai1, Nguyen Thi Thanh Thuy2, Nguyen Thuy Diep1, Kieu Thi Dung1, Nguyen Thi Thao3, Khuat Huu Trung1 SUMMARY Analyzing genetic diversity of native drought tolerant rice varieties in Vietnam (including 39 local rice varieties tolerant to drought and IR64- reference variety which is sensitive to drought) by SSR markers showed that: These drought tolerant rice varieties have diversity about allele components. The results using 23 SSR markers for analyzing genetic diversity of 40 varieties have obtained 82 differences alleles, with an average of 3.57 alleles per SSR loci. The ratio of rare allele is 8.7% (2 rare alleles occur at RM3467 and RM5811). PIC value changed from 0.22 to 0.77 (with a mean of 0.56) which showed high diversity of the studied SSR loci. The ratio of homozygosity of native drought tolerant rice varieties are very different in 23 SSR loci. The heterozygosity changed from 0-14.29% (with an average of 3,45%). The genetic similarity coefficients of 40 varieties were ranging from 0.02 to 0.91. Genetic similarity was determined using Jaccard’s similarity coefficients and final dedrogram construction using a UPGMA clustering methods showed that 40 varieties were divided into four major groups, which shows great diversity among varieties. Based on genetic clustering result, 1 Agricultural Genetics Institute Author for correspondence: Tel: 84-4- 37540764; Fax: 84-4-37543196; Email: khuathuutrung@yahoo.com 2 Ministry of Agriculture and Rural Development 3 Hanoi National University of Education 78 drought tolerant phenotype and the origins of rice varieties, eight varieties have been selected as materials for further research on establishment of a database for local rice genetic resources in Vietnam. Keywords: Drought tolerance, genetic diversity, local rice varieties, SSR marker. 79