Đề tài Đánh giá chất lượng giống của một số chủng vi khuẩn Lactobacillus trong điều kiện bảo quản

ị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Vi Thị Thu Hòa i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Thị Tuyết Lê đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Dinh dưỡng - Thức ăn, Khoa Chăn nuôi - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./. Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Vi Thị Thu Hòa ii MỤC LỤC Lời cam đoan ..................................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii Mục lục ........................................................................................................................... iii Danh mục các chữ viết tắt ................................................................................................. v Danh mục bảng ................................................................................................................ vi Danh mục biểu đồ ........................................................................................................... vii Danh mục hình ................................................................................................................ vii Trích yếu luận văn ......................................................................................................... viii Thesis abstract ................................................................................................................... x Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1 1.2. Mục đích – yêu cầu ............................................................................................. 2 1.2.1. Mục đích ............................................................................................................. 2 1.2.2. Yêu cầu ............................................................................................................... 2 Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 3 2.1. Tổng quan về Lactobacillus ............................................................................... 3 2.1.1. Đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus ................................................................. 3 2.1.2. Lên men lactic ở Lactobacillus ........................................................................... 4 2.1.3. Một số đặc tính probiotic của Lactobacillus ...................................................... 5 2.1.4. Vai trò của vi khuẩn Lactobacillus trong chăn nuôi ........................................... 6 2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của vi sinh vật ....................... 9 2.2.1. Yếu tố dinh dưỡng .............................................................................................. 9 2.2.2. Yếu tố vật lý ..................................................................................................... 11 2.2.3. Yếu tố hóa học .................................................................................................. 14 2.3. Biến dị ở vi sinh vật .......................................................................................... 15 2.3.1. Khái niệm ......................................................................................................... 15 2.3.2. Các dạng biến dị ............................................................................................... 16 2.4. Các phương pháp bảo quản vi sinh vật ............................................................. 17 2.4.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật.................................................................. 17 2.4.2. Giữ giống vi sinh vật trong môi trường đất, cát, hạt ........................................ 19 2.4.3. Phương pháp đông khô và đông khô dịch thể trực tiếp .................................... 20 2.4.4. Bảo quản lạnh ................................................................................................... 21 2.4.5. Phương pháp bảo quản lạnh sâu ....................................................................... 21 2.5. Vai trò của sinh khối vi khuẩn lactic trong chăn nuôi ...................................... 22 Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................................ 23 iii 3.1. Đối tượng – địa điểm – thời gian nghiên cứu ................................................... 23 3.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 23 3.2.1. Đánh giá sự biến đổi về mặt hình thái của vi khuẩn Lactobacillus trong thời gian giữ giống:........................................................................................... 23 3.2.2. Đánh giá sự biến đổi về đặc tính sinh học của các chủng Lactobacillus .......... 23 3.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 23 3.3.1. Nguyên vật liệu ................................................................................................. 23 3.3.2. Phương pháp bảo quản, giữ giống .................................................................... 24 3.3.3. Phương pháp xác định hình thái ....................................................................... 24 3.3.4. Các phản ứng sinh hóa – Catalase Test ............................................................ 24 3.3.5. Phương pháp đánh giá khả năng phân giải protein ........................................... 25 3.3.6. Phương pháp xác định khả năng sinh axit lactic và đông vón sữa ................... 25 3.3.7. Phương pháp đánh giá sức sống của giống ....................................................... 26 3.3.8. Phương pháp đánh giá khả năng sinh trưởng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau .......................................................................................................... 26 3.3.9. Phương pháp xác định số lượng tế bào ............................................................. 26 3.4. Xử lý số liệu...................................................................................................... 27 Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................... 28 4.1. Đánh giá sự biến đổi hình thái của vi khuẩn Lactobacillus trong quá trình giữ giống .................................................................................................. 28 4.1.1. Sự biến đổi hình thái khuẩn lạc ........................................................................ 28 4.1.2. Sự biến đổi hình thái vi khuẩn .......................................................................... 30 4.2. Đánh giá sự biến đổi các đặc tính sinh học của các chủng Lactobacillus trong thời gian bảo quản giữ giống ................................................................... 32 4.2.1. Khả năng phân giải protein ............................................................................... 32 4.2.2. Khả năng đông vón sữa và sinh axit lactic của các chủng Lactobacillus ......... 35 4.2.3. Đánh giá sức sống của các chủng giống Lactobacillus trong thời gian bảo quản ............................................................................................................ 38 4.2.4. Khả năng sinh trưởng ở các mức nhiệt độ khác nhau ....................................... 39 Phần 5. Kết luận và kiến nghị ...................................................................................... 50 5.1. Kết luận ............................................................................................................. 50 5.1.1. Về sự biến đổi hình thái của Lactobacillus trong thời gian bảo quản .............. 50 5.1.2. Về sự biến đổi đặc tính sinh học của Lactobacillus trong thời gian bảo quản ............................................................................................................ 50 5.2. Kiến nghị .......................................................................................................... 51 5.2.1 Tồn tại ............................................................................................................... 51 5.2.2. Kiến nghị .......................................................................................................... 51 Tài liệu tham khảo ........................................................................................................ 52 iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt cs. : Cộng sự oC : Độ C h : Giờ NXB : Nhà xuất bản ST : Sinh trưởng TB : Tế bào VK : Vi khuẩn VSV : Vi sinh vật v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Hoạt độ của nước đối với một số giống vi sinh vật ..................................... 12 Bảng 4.1. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Lactobacillus trong thời gian bảo quản giữ giống ............................................................................................. 29 Bảng 4.2. Hình thái vi khuẩn Lactobacillus trong thời gian bảo quản ......................... 31 Bảng 4.3. Khả năng phân giải protein của các chủng vi khuẩn Lactobacillus trong thời gian bảo quản .............................................................................. 32 Bảng 4.4. Khả năng sinh axit lactic của các chủng vi khuẩn Lactobacillus trong thời gian bảo quản ........................................................................................ 35 Bảng 4.5. Khả năng đông vón sữa ở thời điểm 24h của các chủng Lactobacillus trong thời gian bảo quản giữ giống .............................................................. 37 Bảng 4.6. Số lượng tế bào sống (TB/ml) của các chủng Lactobacillus trong thời gian bảo quản giữ giống ............................................................................... 38 Bảng 4.7. Khả năng sinh trưởng của các chủng Lactobacillus ở 30oC ........................ 41 Bảng 4.8. Khả năng sinh trưởng của các chủng Lactobacillus ở 35oC ........................ 43 Bảng 4.9. Khả năng sinh trưởng của các chủng Lactobacillus ở 40oC ........................ 45 Bảng 4.10. Khả năng sinh trưởng của các chủng Lactobacillus ở 45oC ......................... 47 vi DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 2.1. Giới hạn nhiệt độ của các nhóm vi sinh vật ............................................... 13 Biểu đồ 4.1. Khả năng phân giải protein của các chủng Lactobacillus trong thời gian bảo quản ...................................................................................................... 34 Biểu đồ 4.2. Khả năng sinh axit lactic của các chủng Lactobacillus trong thời gian bảo quản giữ giống ............................................................................................ 36 Biểu đồ 4.3. Khả năng sinh trưởng của Lactobacillus ở nhiệt độ 30oC .......................... 42 Biểu đồ 4.4. Khả năng sinh trưởng của Lactobacillus ở nhiệt độ 35oC .......................... 44 Biểu đồ 4.5. Khả năng sinh trưởng của Lactobacillus ở nhiệt độ 40oC .......................... 46 Biểu đồ 4.6. Khả năng sinh trưởng của Lactobacillus ở nhiệt độ 45oC .......................... 48 DANH MỤC HÌNH Hình 4.1. Đĩa petri nuôi cấy NCb ................................................................................... 31 Hình 4.2. Khuẩn lạc NCb ................................................................................................ 31 Hình 4.3. NCb qua ba lần cấy chuyển ............................................................................ 31 Hình 4.4. Hình thái một số chủng giống Lactobacillus .................................................. 32 Hình 4.5. Khả năng phân giải protein của các chủng Lactobacillus .............................. 34 Hình 4.6. Khả năng đông vón sữa của vi khuẩn Lactobacillus ...................................... 38 Hình 4.7. Đánh giá sinh trưởng trên môi trường MRS dịch thể ..................................... 40 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Vi Thị Thu Hòa Tên Luận văn: Đánh giá chất lượng giống của một số chủng vi khuẩn Lactobacillus trong điều kiện bảo quản Ngành: Chăn Nuôi Mã số: 60.62.01.05 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Đánh giá sự biến đổi về hình thái, đặc điểm sinh trưởng và một số đặc tính sinh học của 6 chủng vi khuẩn Lactobacillus được bảo quản, giữ giống trên môi trường thạch nghiêng trong tủ lạnh (4oC) trong 90 ngày để từ đó đánh giá phẩm chất giống và đưa ra quy trình bảo quản giống phù hợp trong điều kiện phòng thí nghiệm. Phương pháp nghiên cứu Đề tài có 4 nội dung chính - Đánh giá sự biến đổi về mặt hình thái của vi khuẩn Lactobacillus trong thời gian giữ giống. - Đánh giá khả năng sống sót của các chủng Lactobacillus trong thời gian bảo quản. - Đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng Lactobacillus ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau trong thời gian bảo quản. - Đánh giá một số đặc tính sinh học của giống: + Đánh giá khả năng phân giải protein + Đánh giá khả năng sinh axit lactic và đông vón sữa Nguyên vật liệu Các chủng Lactobacillus sử dụng trong nghiên cứu: + 01 chủng Lactobacillus bulgaricus: Proc + 02 Lactobacillus acidophilus: LA, NCb + 03 Lactobacillus plantarum: LP, ND1, ND2 Tất cả các chủng giống đều được phân lập và chọn lọc mới từ các mẫu là các sản phẩm lên men. Sử dụng môi trường MRS để giữ giống. Phương pháp nghiên cứu. - Phương pháp bảo quản, giữ giống: Giống Lactobacillus được nuôi cấy trên môi trường thạch nghiêng MRS ở 37oC/48h sau đó giữ giống trong tủ lạnh (4oC). viii - Phương pháp xác định hình thái: Vi khuẩn nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi quang học. - Các phản ứng sinh hóa: gồm phản ứng lên men đường, Catalase Test. - Phương pháp đánh giá khả năng phân giải protein: sử dụng phương pháp khuếch tán trên thạch, đo đường kính vòng phân giải. - Xác định khả năng sinh axit lactic bằng phương pháp chuẩn độ và đông vón sữa. - Phương pháp đánh giá sức sống của giống: Đếm số lượng tế bào sống bằng phương pháp pha loãng nồng độ. - Phương pháp đánh giá khả năng sinh trưởng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau: xác định số lượng tế bào nuôi cấy ở các mức nhiệt độ 30, 35, 40 và 45oC ở 24-48h. Kết quả chính và kết luận - Với phương pháp bảo quản giữ giống trên môi trường thạch nghiêng ở 4oC trong 90 ngày với thời gian cấy truyền 1 tháng/lần thì khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng giống nghiên cứu không có sự biến đổi so với ban đầu. - Trong số 6 chủng giống kiểm tra chỉ có 3 chủng LA, LP và Proc vẫn duy trì chất lượng giống ổn định trong suốt 90 ngày bảo quản. - Ở mức nhiệt độ thường (30-35oC): Các chủng giống có tốc độ sinh trưởng lớn nhất gồm LA, LP, NCb, Proc. Ở nhiệt độ cao (40-45oC): Các chủng giống có tốc độ sinh trưởng lớn nhất gồm LA và LP. - Chủng Lactobacillus LA là chủng giống có sức sống và đặc tính sinh học ổn định nhất trong suốt quá trình bảo quản. ix THESIS ABSTRACT Master candidate: Vi Thi Thu Hoa Thesis title: Evaluation of viability and stability of some Lactobacillus strains under storage condition Major: Animal Science Code: 60.62.01.05 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives Six Lactobacillus strains were preservated by On Agar Slopes Method at refrigeration temperature 4o C. Their morphology, viability, growth ability and some functional properties relevant to their use as probiotics were evaluated during 90 days of preservation. The aim of this study was to evaluate of quality of six Lactobacillus strains and establish a suitable preservation method for stater culture at laboratory scale. Materials and Methods Four main subjects: - Evaluation of mophology characteristics of six Lactobacillus strains during 90 days of preservation. - Evaluation of viability of six Lactobacillus strains during 90 days of preservation. - Evaluation of growth ability of six Lactobacillus strains at different temperatures during 90 days of preservation. - Evaluation of some functional properties of six Lactobacillus strains during 90 days of preservation such as protease activity, lactic acid production and milk coagulation ability. Materials Lactobacillus strains were used in this study: + 01 Lactobacillus bulgaricus strain: Proc + 02 Lactobacillus acidophilus strains: LA, NCb + 03 Lactobacillus plantarum strains: LP, ND1, ND2 All strains were isolated from fermented products and preserved on MRS agar Slopes Method. x Study methods - Preservation of pure culture: Pure culture of six Lactobacillus strains were preserved on MRS agar slopes after taking a growth of 48 h at 37o C at ordinary refrigeration temperature (4oC). - Morphological examination of culture: Morphological and cultural examination was carried out by using Gram’s staining method. - Biochemical tests: sugar fermentation and catalase test. - Protein hydrolysis test by determining of clearing zone around the bacterial growth. - Evaluation of lactic acid production by titratable acidity method and milk coagulation ability. - Viability of culture: Viability was estimated as described by Awan and Rahman (2002) at 0, 30, 60 and 90 days of storage. Bacterial count based on serial dilution and plate count method. - Methods of assessment of growth in the various temperature conditions 30, 35, 40 and 45oC: Bacterial count method according to Vinogradxki – Sulghina – Brid (Nguyễn Lân Dũng, 1978). Main results and conclusions - The morphology of six Lactobacillus strains preservated on MRS agar slope at refrigeration temperature 4o C have showed no changes in cell morphology as well as colony morphology during the 90 days of preservation. - 3/6 Lactobacillus strains including LA, LP and Proc almost remained stability, vitality and growth ability during storage of 90 days. - Growth ability at temperature 30 and 35oC: The best growth rate was detected 4 in Lactobacillus strains including LA, LP, NCb, Proc. - Growth ability at hight temperature 40 and 45oC: The best growth rate was detected 4 in Lactobacillus strains including LA and LP. It is concluded that only Lactobacillus strain LA showed the stability during storage of 90 days. xi PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Probiotic là chế phẩm sinh học chứa các vi khuẩn sống, có tác động làm cân bằng hệ vi sinh vật trong đường ruột, từ đó ảnh hưởng tốt cho động vật. Cách thức hoạt động của probiotic là cạnh tranh, qua đó tạo nên hàng rào vật lý bảo vệ sự tấn công của các vi sinh vật gây bệnh. Ngoài ra, chúng cũng sinh ra các hoạt chất kháng khuẩn và men kích thích hệ thống miễn dịch của vật nuôi. Lactobacillus là nhóm vi khuẩn lactic được sử dụng rộng rãi nhất trong chế tạo probiotics. Hoạt động của Lactobacillus rất hiệu quả trong việc tạo khả năng bám dính vào tế bào, loại trừ hoặc làm giảm khả năng lan truyền bệnh, tính bền vững và khả năng nhân lên (Rolfe, 2000). Các chủng Lactobacillus được tìm thấy và phân lập nhiều ở trong đường tiêu hóa của động vật, trong các phế phụ công nghiệp sản xuất bia, rượu, đường và sản phẩm lên men.... Các sản phẩm này có chứa hàm lượng axit lactic rất cao là tiềm năng để sản xuất probiotics. Để thu được những chủng giống vi khuẩn lactic có phẩm chất sinh học tốt, đáp ứng yêu cầu trong việc sản xuất các chế phẩm sinh học hay tạo ra các giống khởi động có chất lượng cao thì khâu phân lập, chọn lọc đóng vai trò then chốt. Tuy nhiên, công việc chọn lọc này cũng rất tốn kém, đòi hỏi công sức và phụ thuộc rất nhiều vào công tác bảo quản giống sau phân lập. Các chủng giống được chọn lọc tự nhiên thường có sức sống tốt và có các đặc tính sinh học cao, nhưng chúng dễ bị biến đổi hoặc xuất hiện những biến dị không mong muốn nếu khâu bảo quản và giữ giống không tốt. Hiện nay có rất nhiều các phương pháp bảo quản, giữ giống vi sinh vật hiệu quả như đông lạnh, đông khô. Tuy nhiên, các phương pháp này đòi hỏi phải có thiết bị, máy móc hiện đại mà nhiều phòng thí nghiệm trong nước chưa đáp ứng được. Vì vậy, các chủng giống sau phân lập chọn lọc vẫn được giữ giống với phương pháp truyền thống là nuôi cấy trên thạch nghiêng và bảo quản trong tủ lạnh. Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện, không tốn kém nhưng lại có một số nhược điểm như thời gian bảo quản ngắn, dễ bị biến đổi đặc tính sinh học của giống, thoái hóa giống Xuất phát từ thực tế trên, để đánh giá sự biến đổi các đặc điểm về hình thái cũng như đặc tính sinh học của một số chủng Lactobacillus 1 sử dụng làm chế phẩm sinh học trong chăn nuôi trong quá trình giữ giống, chúng tôi tiến hành đề tài: “Đánh giá chất lượng giống của một số chủng vi khuẩn Lactobacillus trong điều kiện bảo quản”. 1.2. MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU 1.2.1. Mục đích Theo dõi các chủng vi khuẩn Lactobacillus trong quá trình bảo quản, giữ giống ở nhiệt độ bảo quản tủ lạnh (4oC) để đánh giá sự biến đổi đặc tính sinh học của chúng trong các điều kiện và thời gian khác nhau, từ đó đánh giá phẩm chất giống và đưa ra quy trình bảo quản giống phù hợp. 1.2.2. Yêu cầu Đánh giá phẩm chất giống vi khuẩn Lactobacillus trong thời gian giữ giống trên các tiêu chí sau: - Đánh giá về hình thái. - Đánh giá về đặc tính sinh học như: sức sống, khả năng phân giải protein, khả năng sinh axit lactic và đông vón sữa; khả năng sinh trưởng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TỔNG QUAN VỀ LACTOBACILLUS 2.1.1. Đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus Theo khóa phân loại vi khuẩn của Bergey’s (2005) Lactobacillus được phân loại như sau: Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Eubacteriales Họ: Lactobacillaceae Giống: Lactobacillus Lactobacillus thuộc nhóm các vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic gồm một số giống trong ngành Firmicutes, chúng có chung đặc tính là các vi khuẩn Gram dương và lên men carbohydrate thành năng lượng và axit lactic. Giống Lactobacillus rất đa dạng. Sự đa dạng của chúng có thể được đánh giá bằng hàm lượng G+C trong ADN của các loài, thường chiếm 32-53 mol%. Điểm đặc trưng phổ biến nhằm phân biệt chúng với phần lớn các giống khác là dạng hình que và khả năng tạo ra axit lactic như một sản phẩm cuối cùng chủ yếu. Bên cạnh đó, Lactobacillus còn là vi khuẩn Gram dương, không hình thành bào tử và hiếm khi di động. Người ta thấy rằng tế bào Lactobacillus điển hình có dạng hình que, với kích thước biến đổi trong khoảng (0,5-1,2)×(1-10) µm, đôi khi trông chúng có thể gần giống như hình cầu (coccoid) trong điều kiện nào đó và thường hình thành dạng chuỗi hoặc tồn tại đơn (Abee et al., 1999). Khuẩn lạc của vi khuẩn Lactobacillus trên môi trường agar có kích thước 2- 5mm, dạng lồi, mờ đục và không nhuộm màu. Những tế bào này đòi hỏi môi trường nuôi cấy phức tạp, có khả năng lên men và phân hủy saccharose. Ít nhất một nửa sản phẩm lên men từ nguồn cacbon là lactose. Về nhu cầu oxy, Lactobacillus là vi khuẩn kỵ khí tùy ý, thường sinh trưởng chậm trong không khí. Đôi khi, sự sinh trưởng của chúng có thể được kích thích bằng cách thêm 5% CO2 vào môi trường nuôi cấy. Về nhu cầu dinh dưỡng, vi khuẩn Lactobacillus cần chế độ dinh dưỡng đặc biệt, chúng phát triển rất tốt trên môi trường có chứa nhiều phức chất. 3 Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn Lactobacillus là 30 – 400C. Nhưng chúng có thể sinh trưởng trong phạm vi nhiệt độ là 5 – 530C. Vi khuẩn Lactobacillus có khả năng chịu đựng được môi trường có tính axit. pH tối ưu cho sự phát triển của chúng là pH 5,5 – 5,8. Lactobacillus có một số đặc tính sinh hóa đặc trưng như: catalase âm tính, khử nitrate âm tính (đôi khi dương tính với pH > 6), có khả năng lên men glucose (Axelsson and Lars, 2004). Lactobacillus phân bố tương đối rộng rãi trong tự nhiên đặc biệt là trong các sản phẩm lên men, chúng giữ vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm: các sản phẩm chế biến từ sữa và rượu bia. Người ta có thể tìm thấy Lactobacillus ở cả động vật và thực vật. Ở người, Lactobacillus thường tìm thấy ở ruột và âm đạo (Fuller, 1989). 2.1.2. Lên men lactic ở Lactobacillus Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường thành axit lactic nhờ vi sinh vật, điển hình là vi khuẩn lactic. Lactobacillus có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưng không có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột. Sự phát triển của chúng cần sự có mặt của peptone, axit amin hay muối amoni. Vi khuẩn Lactobacillus có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, axit amin và khoáng chất. Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trường axit pH từ 5,5÷6, khi pH < 5,5 quá trình lên men bị dừng lại. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men từ 15÷500C. Tuy nhiên, mỗi loài có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 800C vi khuẩn lactic bị tiêu diệt hoàn toàn. Quá trình lên men lactic diễn ra trong tế bào vi khuẩn. Đầu tiên, đường sẽ được vi khuẩn lactic đưa vào bên trong tế bào nhờ cơ chế vận chuyển đặc trưng của màng tế bào. Nếu phân tử đường là đường đơn như glucose thì sẽ vào thẳng chu trình chuyển hóa, còn nếu phân tử đường là đường đôi hay các dạng đường khác thì sẽ bị thủy phân thành các monosaccharide rồi mới vào chu trình chuyển hóa. Sau đó phân tử đường này sẽ đi vào các chu trình chuyển hóa khác nhau và cuối cùng cho sản phẩm là axit lactic, axit axetic, CO2 Dựa vào sản phẩm tạo thành của quá trình lên men mà người ta chia chúng ra làm hai nhóm là vi khuẩn lactic lên men đồng hình hay vi khuẩn lactic lên men dị hình (Nguyễn Lân Dũng và cs., 2002) 4 Các loài thuộc nhóm lên men đồng hình tạo ra 85% axit lactic từ glucose, trong khi các loài lên men dị hình chỉ tạo ra 50% axit lactic và một lượng đáng kể carbone dioxide, acetate và ethanol. Các loài Lactobacillus lên men đồng hình gồm: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus leichmannii và các loài lên men dị hình gồm: Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum (Axelsson and Lars, 2004). Mặc dù tất cả các loài Lactobacillus đều tạo ra axit lactic, nhưng các loài khác nhau có thể tạo ra các axit lactic khác nhau về đồng phân hóa học. 2.1.3. Một số đặc tính probiotic của Lactobacillus 2.1.3.1. Khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh Lactobacillus có khả năng sinh ra các chất ức chế với cả vi khuẩn Gram dương, Gram âm, kể cả nấm và có khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn bao gồm các axit hữu cơ, hydrogen peroxit, cacbondioxit, và diaxetyl cũng như bacteriocin và các hợp chất giống bacteriocin (Hollang et al., 1987; Mishra and Lambert, 1996). Axit hữu cơ có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, được sản sinh bởi vi khuẩn lactic như acetic, lactic, axit probionic. Một vài vi khuẩn chi Lactobacillus có khả năng ngăn chặn sự phát triển của E. coli, M. luteus, Salmonella typhi và Shigella flexneri bằng cách sinh ra ra axit lactic (Mai Thị Đàm Linh và cs., 2008). Cả axit lactic và axit axetic đều có khả năng hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật khác bởi chúng làm giảm pH bên trong đường ruột và chính điều này đã ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của các vi sinh vật khác. Ngoài ra, Lactobacillus còn có khả năng sinh ra bacteriocin, một loại protein có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải ADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào. Bacteriocin sẽ tấn công các vi khuẩn gây bệnh và ức chế sự phát triển của chúng, trong đó có các vi khuẩn gây bệnh như: E.coli, Samonella, Vibrio, Campylobacter, Shigella, Clostridium, Candida albicans, và một số virus khác (Mishra and Lambert, 1996). 5 2.1.3.2. Khả năng chịu mặn Khả năng chịu mặn của Lactobacillus có vai trò quan trọng vì đây là yếu tố đầu tiên quyết định sự tồn tại của probiotic trong môi trường nước biển. Khả năng chịu mặn là đặc tính quý khi sử dụng các chủng này chế tạo chế phẩm sử dụng cho nuôi trồng thủy sản ở các vùng khác nhau. Một số chủng Lactobacillus đã được biết với khả năng chịu độ mặn cao, cao hơn rất nhiều so với độ mặn trung bình từ 3,1% tới 3,8% của nước biển như L. amylovorus DCE 471 có thể tồn tại và sinh ra bacteriocin trong môi trường 3 % (w/v) NaCl (Patricia et al., 2003). 2.1.3.3. Khả năng tồn tại trong đường tiêu hóa và ức chế vi khuẩn gây bệnh Trong các điều kiện in vitro, nhiều chủng Lactobacillus đã được tuyển chọn với khả năng tồn tại ở trong điều kiện bất lợi của đường ruột động vật thủy sản ...ừ -15oC đến -20oC: 6 tháng cấy chuyển một lần. Giữ giống ở nhiệt độ -30oC : 9 tháng cấy chuyển một lần. Giữ giống ở nhiệt độ -40oC : 1 năm cấy chuyển một lần. Giữ giống ở nhiệt độ từ -50oC đến -60oC : 3 năm cấy chuyển một lần. Giữ giống ở nhiệt độ -70oC : 10 năm cấy chuyển một lần. 20 2.4.3.2. Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp (L-drying) Khác với phương pháp đông khô ở chỗ dịch huyền phù vi sinh vật được làm khô nhanh ở chế độ chân không thích hợp mà mẫu không cần làm lạnh từ trước. Phương pháp này thường sử dụng cho nhóm vi khuẩn không có khả năng sống trong điều kiện nhiệt độ thấp của giai đoạn tiền đông. Các thông số quan trọng cần chú ý: - Tuổi của vi sinh vật bảo quản. - Thành phần dịch huyền phù tế bào vi sinh vật. - Tốc độ đông khô. - Nhiệt độ đông khô thấp nhất. - Khoảng thời gian làm khô mẫu và độ ẩm cuối cùng của mẫu. Đây là phương pháp nhanh và thuận lợi khi phải bảo quản số lượng mẫu lớn. Thông thường theo phương pháp này vi sinh vật được bảo quản từ 10 – 20 năm. 2.4.4. Bảo quản lạnh Kỹ thuật bảo quản lạnh là chế độ bảo quản ở dải nhiệt độ thấp 0 – 120C (phổ biến ở 0 – 20C, trong các tủ lạnh dân dụng). Ưu điểm lớn nhất của kỹ thuật này là điều kiện bảo quản ôn hòa, dễ xác lập và chi phí thấp. Tuy nhiên, trong điều kiện bảo quản này, vi sinh vật vẫn có thể sinh trưởng và phát triển chậm. Nghĩa là chúng vẫn sử dụng thức ăn, tích tụ sản phẩm trao đổi chất và nếu thời gian bảo quản dài, vi sinh vật có thể thích nghi dần... Vì vậy, kỹ thuật bảo quản này thường được áp dụng để bảo quản ngắn ngày các sản phẩm, thực phẩm tươi sống hoặc thức ăn dư, bảo quản mẫu phẩm trước phân tích và bảo quản canh trường giống vi sinh vật (Để bảo đảm chất lượng bảo quản canh trường giống cần phải cấy truyền 1- 2 tháng/lần và định kì kiểm tra hoạt lực) (Trần Liên Hà, 2007). 2.4.5. Phương pháp bảo quản lạnh sâu Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu (-196oC đến -80oC). Khi bảo quản vi sinh vật theo phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một trong những nguyên nhân dẫn đến vỡ tế bào là do tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh 21 thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này, người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu như Glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide). Bảo quản ở mức nhiệt độ cao hơn -30oC thì hiệu quả thấp hơn do tế bào chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải. Phương pháp này mặc dù có nhiều ưu điểm nhưng cũng bộc lộ một số nhược điểm như: kinh phí đầu tư cho thiết bị cao, rủi ro cháy nổ Đặc biệt, phương pháp này không thích hợp với những chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến. Nói chung, phương pháp này được áp dụng cho những chủng vi sinh vật có những đặc tính quý mà không thích hợp với phương pháp đông khô. 2.5. VAI TRÒ CỦA SINH KHỐI VI KHUẨN LACTIC TRONG CHĂN NUÔI Các chủng Lactobacillus sử dụng trong nghiên cứu này được chọn lọc, giữ giống và có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh đời sống và chăn nuôi như: - Sử dụng để sản xuất giống khởi động ứng dụng để ủ chua thức ăn xanh hoặc sản xuất axit lactic ở quy mô công nghiệp. - Sử dụng để sản xuất các chế phẩm probiotic sử dụng trong chăn nuôi như men tiêu hóa. - Sử dụng trong bảo quản thực phẩm: do các chủng này có sinh hoạt chất kháng khuẩn bacteriocin có thể ức chế vi khuẩn có hại và vi khuẩn gây thối hỏng. Khi sử dụng các chủng này với các mục đích sản xuất chế phẩm như trên cần phải kiểm tra sự tạp nhiễm, tính ổn định của giống thông qua các chỉ tiêu về hình thái, các phản ứng sinh hóa Catalase Test, sức sống của giống, khả năng phân giải protein, khả năng sinh axit lactic và đông vón sữa, khả năng sinh trưởng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau trước khi sử dụng để đảm bảo chất lượng giống cũng như chất lượng của chế phẩm khi sản xuất. 22 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỐI TƯỢNG – ĐỊA ĐIỂM – THỜI GIAN NGHIÊN CỨU - Đối tượng: Một số giống vi khuẩn Lactobacillus đang được bảo quản tại phòng thí nghiệm bộ môn Dinh dưỡng – Thức ăn, khoa Chăn nuôi. - Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh, bộ môn Dinh dưỡng – Thức ăn, khoa Chăn nuôi, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. - Thời gian: Từ tháng 10/2015 đến tháng 6/2016. 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.2.1. Đánh giá sự biến đổi về mặt hình thái của vi khuẩn Lactobacillus trong thời gian giữ giống: - Đặc điểm hình thái khuẩn lạc - Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn 3.2.2. Đánh giá sự biến đổi về đặc tính sinh học của các chủng Lactobacillus - Đánh giá khả năng phân giải protein - Đánh giá khả năng sinh axit lactic và đông vón sữa - Đánh giá sức sống của các chủng giống - Đánh giá khả năng sinh trưởng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Nguyên vật liệu 3.3.1.1. Các chủng Lactobacillus sử dụng trong nghiên cứu + 01 chủng Lactobacillus bulgaricus : Proc + 02 Lactobacillus acidophilus: LA, NCb + 03 Lactobacillus plantarum: LP, ND1, ND2 Tất cả các chủng giống đều được phân lập và chọn lọc mới. 3.3.1.2. Môi trường MRS Pepton 10g Cao thịt 10g Cao nấm men 5g Glucose 20g Tween 80 0,1g K2HPO4 2g Sodium acetate 5g Triammonium citrate 0,2g MgSO4.7H2O 0,2g MnSO4.4H2O 0,05g Thạch 15 – 18g Nước cất 1000ml Hấp tiệt trùng hơi nước cao áp ở 121oC trong 15 – 20 phút. 23 3.3.2. Phương pháp bảo quản, giữ giống Sử dụng phương pháp cấy truyền trên môi trường thạch nghiêng (Agar slope method) và bảo quản ở nhiệt độ 4oC. Các chủng Lactobacillus sau khi phân lập và chọn lọc với mục đích sử dụng làm giống khởi động sẽ được nuôi cấy trên môi trường thạch MRS ở 37oC/24 – 48h để giữ giống. Kiểm tra tạp nhiễm giống trước khi bảo quản giống trong tủ lạnh ở điều kiện nhiệt độ 4oC. Giống được cấy truyền 1 tháng một lần sang môi trường MRS mới. Trong quá trình bảo quản, tiến hành đánh giá các chỉ tiêu về hình thái, đặc tính sinh học của giống tại các thời điểm 0, 30, 60, 90 ngày. 3.3.3. Phương pháp xác định hình thái - Hình thái tế bào được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram và quan sát tiêu bản nhuộm dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần. - Quan sát hình thái, tính chất khuẩn lạc nuôi cấy trên môi trường thạch bằng kính lúp có độ phóng đại 20 lần. - Đặc điểm hình thái vi khuẩn cũng như hình thái khuẩn lạc trong quá trình giữ giống sẽ được so sánh đánh giá với đặc điểm hình thái của giống được ghi chép tại thời điểm phân lập và chọn lọc. 3.3.4. Các phản ứng sinh hóa – Catalase Test Mục đích: Để phân biệt các loài Lactobacillus spp. với các loài Corynebacterium spp. Do đặc điểm hình thái của hai loài này giống nhau đều không sinh bào tử. Tất cả những chủng có phản ứng catalase dương tính thì loại bỏ. Lactobacillus spp. là những loài âm tính với phản ứng catalase (theo khóa phân loại Bergey, 2005). - Lấy một ít khuẩn lạc của các mẫu cần kiểm tra đặt lên phiến kính, nhỏ lên đó một vài giọt oxy già (H2O2 3%). - Kết quả: Dương tính: Có bọt khí sủi lên. Âm tính: Không có bọt khí. 24 3.3.5. Phương pháp đánh giá khả năng phân giải protein - Chuẩn bị môi trường thạch đĩa: Cao nấm men 5g NaCl 10g Sữa tách bơ 300ml Nước cất 700ml Agar 16 – 20g Điều chỉnh pH = 6,1 – 6,5. - Cấy các chủng cần kiểm ra vào các đĩa thạch trên, cấy dạng điểm, nuôi cấy ở 37oC/24 – 48 giờ. Kết quả: + Dương tính: Có vòng phân giải protein xung quanh khuẩn lạc. Dùng thước để đo đường kính của vòng phân giải. - Âm tính: Không có vòng phân giải 3.3.6. Phương pháp xác định khả năng sinh axit lactic và đông vón sữa 3.3.6.1. Khả năng sinh axit lactic Dùng phương pháp chuẩn độ Therner (Độ T) để xác định khả năng sinh axit lactic của các chủng vi khuẩn lactic. - Lấy 10ml dịch lên men, bổ sung 20ml nước cất và thêm 1 – 2 giọt Phenolphtalein 1%. - Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây thì ngừng lại. - Theo tiêu chuẩn A.O.A.C (1990): 1ml NaOH 0,1N chuẩn độ được tương đương với 9,008mg axit lactic. 25 3.3.6.2. Khả năng đông vón sữa - Sử dụng sữa tươi tiệt trùng đã tách bơ, cho vào ống nghiệm, mỗi ống 7 – 8ml. Cấy vi khuẩn lactic vào. Theo dõi ở 30 – 35oC/24 giờ. - Đánh giá kết quả: + Đông vón ở mức +++: Casein bị đông vón nhanh sau 6 giờ nuôi cấy. Sữa đông đặc thành khối đồng nhất. + Đông vón ở mức ++: Casein bị đông vón từ 12 – 24 giờ nuôi cấy. Sữa đông đặc thành khối đồng nhất hoặc đông thành khối phía trên có dung dịch trong. + Đông vón ở mức +: Casein bị đông vón chậm sau 20 – 24 giờ nuôi cấy, sữa có dạng bã đậu, có nhiều dung dịch trong. + Âm tính: Sữa ở dạng dung dịch đồng nhất như trước khi nuôi cấy. 3.3.7. Phương pháp đánh giá sức sống của giống Nuôi cấy các chủng Lactobacillus trên môi trường MRS dịch thể ở 37oC/48h sau đó bảo quản trong tủ lạnh. Đếm số lượng tế bào vi khuẩn bằng phương pháp pha loãng nồng độ ở các thời điểm 0, 30, 60 và 90 ngày bảo quản. 3.3.8. Phương pháp đánh giá khả năng sinh trưởng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau - Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch MRS dịch thể. - Đưa vi khuẩn đã cấy vào tủ ấm. Điều chỉnh nhiệt độ của tủ ấm ở các nhiệt độ 30oC, 35oC, 40oC, 45oC. Đếm số lượng tế bào ở các thời điểm 0 giờ, 24 giờ, 48 giờ. Thí nghiệm lặp lại 3 lần (n=3). 3.3.9. Phương pháp xác định số lượng tế bào - Dùng phương pháp đếm tế bào trên các vết bôi đã được cố định và nhuộm màu theo Vinogradxki – Sulghina – Brid (Nguyễn Lân Dũng, 1978). Phương pháp dùng để đếm trực tiếp dưới kính hiển vi số lượng tế bào vi khuẩn có trong 1 thể tích xác định của dịch huyền nghiên cứu. - Chuẩn bị tiêu bản: Chuẩn bị phiến kính sạch, hơ qua ngọn lửa đèn cồn. Sử dụng bút viết kính, kẻ một ô vuông có diện tích là 1cm2. Dùng pipet vô trùng, hút chính xác 0,05ml dịch nuôi cấy, trải đều trên phiến kính đã rửa sạch mỡ, làm khô tự nhiên sau đó cố định bằng cồn 96oC hoặc hơ qua lại trên ngọn lửa đèn cồn. 26 Nhuộm màu với thuốc nhuộm đơn, quan sát dưới kính hiển vi quang học với thị kính có độ phóng đại 10x, vật kính có độ phóng đại 100x. - Tính toán số lượng: Đếm số lượng tế bào có trong 5 – 10 thị trường với vật kính dầu. Tính số lượng tế bào trung bình. - Xác định đường kính của thị trường kính bằng thước đo vật kính, tính diện tích của vi trường. X.100.K Số lượng tế bào trong 1ml dịch môi trường = S.0,05 X : Số lượng tế bào trung bình trong một thị trường 100 : Diện tích vết bôi tính bằng mm2 S : Diện tích thị trường tính bằng mm2 (R2 x 3,14) K : Độ pha loãng dịch mẫu 0,05 : Lượng dịch mẫu làm tiêu bản là 0,05ml 3.4. XỬ LÝ SỐ LIỆU Số liệu được phân tích phương sai, sử dụng bảng tính Excel (Microsof® Excel, 2010). 27 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. ĐÁNH GIÁ SỰ BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI CỦA VI KHUẨN LACTOBACILLUS TRONG QUÁ TRÌNH GIỮ GIỐNG Tất cả các chủng Lactobacillus giữ giống đều được nhuộm Gram để kiểm tra độ tạp nhiễm và kiểm tra đặc điểm hình thái tế bào. Khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn kiểm tra được lấy để tiến hành phản ứng catalase. Theo khóa phân loại Bergey (2005), Lactobacillus là loài có phản ứng catalase âm tính. Đánh giá sự biến đổi về mặt hình thái tế bào cũng như hình thái khuẩn lạc được tiến hành tại các thời điểm 0, 30, 60 và 90 ngày bảo quản. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.1 và bảng 4.2. 4.1.1. Sự biến đổi hình thái khuẩn lạc Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Lactobacillus được đánh giá dựa trên các tiêu chí: màu sắc, trạng thái, rìa, bề mặt khuẩn lạc. Kết quả được trình bày ở bảng 4.1. Kết quả cho thấy, hình thái khuẩn lạc của tất cả các chủng Lactobacillus đều không có sự biến đổi so với ban đầu trước khi bảo quản ở tất cả các thời điểm đánh giá. Phần lớn khuẩn lạc của vi khuẩn lactic đều là khuẩn lạc dạng S (tròn, trơn nhẵn bóng, rìa gọn, bề mặt vồng), chỉ có chủng NCb dạng R (rìa răng cưa). Tương tự, kích thước khuẩn lạc của các chủng cũng không có sai khác so với thời điểm ban đầu trước khi bảo quản giữ giống. Trong đó, chủng LA có đường kính khuẩn lạc lớn nhất sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC ở thời điểm 60 và 90 ngày là 1,5mm. Chủng Proc có đường kính khuẩn lạc nhỏ nhất là 0,3 – 0,5 mm. Có thể thấy rằng, không xuất hiện sự biến đổi về mặt hình thái khuẩn lạc của tất cả các chủng Lactobacillus kiểm tra trong thời gian bảo quản 90 ngày với 3 lần cấy truyền giống. Biến dị về khuẩn lạc của vi khuẩn được coi là biến dị gây ra bởi điều kiện ngoại cảnh như điều kiện nuôi cấy, thành phần dinh dưỡng của môi trường hoặc do tác nhân hóa học như thuốc sát trùng, kháng sinh. Những yếu tố này gây tổn thương trong cấu trúc tế bào vi khuẩn dẫn đến làm thay đổi hình dạng của khuẩn lạc. Những biến đổi về hình thái khuẩn lạc dễ quan sát thấy nhất như biến đổi về màu sắc của khuẩn lạc, biến đổi từ dạng S sang dạng R hoặc dạng nhầy. 28 Bảng 4.1. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Lactobacillus trong thời gian bảo quản giữ giống Chủng vi Thời gian bảo quản giữ giống (ngày) khuẩn 0 30 60 90 Khuẩn lạc tròn, nhỏ, đường kính Khuẩn lạc tròn, nhỏ, đường kính Màu trắng đục, nhỏ, rìa gọn, bề Màu trắng đục, tròn, nhỏ, rìa ND1 0,8 - 1,0 mm, rìa gọn, bề mặt 0,8 - 1,0mm, rìa gọn, bề mặt ướt. mặt vồng, ướt, đường kính 1,0 gọn, bề mặt vồng, đường kính ướt. Màu trắng đục Màu trắng đục mm 1mm Khuẩn lạc tròn, nhỏ, đường kính Khuẩn lạc tròn, nhỏ, đường kính Màu trắng đục, tròn, rìa gọn, Màu trắng đục, tròn, nhỏ, rìa ND2 1mm, rìa gọn 1mm, rìa gọn đường kính 1mm gọn, đường kính 1mm Tròn, nhẵn bóng, rìa gọn hoặc Khuẩn lạc tròn, nhỏ, đường kính Màu trắng đục, nhỏ, rìa răng Màu trắng đục, tròn, nhỏ, rìa NCb răng cưa,bề mặt vồng lên hoặc 0,5mm, bề mặt ướt, rìa răng cưa cưa, đường kính 0,5mm, bề răng, bề mặt vồng, đường dẹt,màu trắng sữa hoặc trắng đục mặt vồng lên kính 0,5mm 28 Màu trắng trong, rìa gọn, bề mặt Màu trắng trong, rìa gọn, bề mặt Màu trắng trong, rìa gọn, bề Màu trắng trong, rìa gọn, Proc vồng, đường kính 0,3 - 0,5mm vồng, đường kính 0,3 - 0,5mm mặt vồng, đường kính 0,5mm đường kính 0,5mm Màu trắng sữa, bề mặt vồng lên, Màu trắng sữa, bề mặt vồng lên, Màu trắng sữa, tròn, rìa gọn, bề Màu trắng sữa, rìa gọn, bề LA khuẩn lạc ướt, rìa gọn, đường khuẩn lạc ướt, rìa gọn, đường mặt vồng, đường kính 1,0 - mặt ướt, vồng lên, đường kính 1 - 1,5mm kính 1,0 - 1,5mm 1,5mm kính 1,5mm Khuẩn lạc tròn, trắng sữa, bề mặt Khuẩn lạc tròn, trắng sữa, bề mặt Màu trắng sữa, tròn, rìa gọn, bề Màu trắng sữa, rìa gọn, bề LP vồng, ướt, rìa gọn, đường kính vồng lên, rìa gọn, đường kính mặt vồng, đường kính 1mm mặt vồng, đường kính 1 - 1mm 1mm 1,2mm 29 Trong nghiên cứu này, các chủng giống Lactobacillus được nuôi cấy giữ giống trên môi trường và các điều kiện thích hợp nhất để giống có thể sinh trưởng tốt. Bên cạnh đó, thời gian lưu giữ giống không quá dài để có thể gây nên hiện tượng biến dị do môi trường cạn kiện chất dinh dưỡng. Chính vì vậy, khuẩn lạc của tất cả các chủng kiểm tra đều không có sự biến đổi về mặt hình thái so với ban đầu. 4.1.2. Sự biến đổi hình thái vi khuẩn Kết quả đánh giá về hình thái tế bào của các chủng Lactobacillus kiểm tra được trình bày ở bảng 4.2. Kết quả cho thấy, hình thái tế bào của tất cả các chủng kiểm tra vẫn giữ được những đặc điểm đặc trưng của vi khuẩn lactic sau 90 ngày bảo quản. Các chủng Lactobacillus đều có hình thái chung là trực khuẩn, bắt màu Gram dương, đứng riêng lẻ hoặc nối chuỗi. Chủng Proc có kích thước nhỏ và mảnh nhất trong tất cả các chủng. Những đặc tính mô tả đều phù hợp với các đặc điểm mô tả của các vi khuẩn lactic của các tác giả khác như Ahmed and Kanwal (2004); Nair and Surendran (2005); Bayane et al. (2006), Olaoye and Onilude (2009). Hình thái của vi khuẩn có thể bị biến đổi do tác động của các yếu tố khác nhau như thành phần dinh dưỡng của môi trường, điều kiện nuôi cấy và những chất độc hại đối với tế bào như kháng sinh, thuốc sát trùngNhững yếu tố này tác động vào màng tế bào, vào nguyên sinh chất, gây biến tính protein của nhân Từ đó có thể gây nên những biến đổi hình thái tế bào như làm cho tế bào không có màng, co tròn, hoặc có hình thái khác so với thông thường. Những biến dị này thường xuất hiện chậm và không ổn định. Với phương pháp bảo quản giữ giống trên môi trường thạch nghiêng ở 4oC và thời gian cấy truyền trong nghiên cứu này là 1 tháng/lần thì hình thái tế bào của tất cả các chủng giống nghiên cứu đã không quan sát thấy có sự biến đổi so với sau khi phân lập, chọn lọc. 30 Bảng 4.2. Hình thái vi khuẩn Lactobacillus trong thời gian bảo quản Thời gian bảo quản giữ giống (ngày) Chủng 0 30 60 90 Trực khuẩn dài, hai đầu tròn, Trực khuẩn dài, đứng riêng lẻ Trực khuẩn dài, nối chuỗi Trực khuẩn dài, hai đầu tròn, ND1 gram dương, đứng riêng lẻ / hoặc nối chuỗi ngắn ngắn, đứng riêng lẻ nối chuỗi ngắn, đứng riêng lẻ nối chuỗi ngắn Trực khuẩn ngắn, nối chuỗi Trực khuẩn ngắn, mập, hai đầu Trực khuẩn ngắn, nhỏ, hai đầu Trực khuẩn ngắn, nhỏ, hai đầu ND2 dài tròn, nối chuỗi dài tròn, nối chuỗi dài tròn, nối chuỗi dài Trực khuẩn dài, mảnh, nhỏ, Trực khuẩn dài, mảnh, nhỏ, Trực khuẩn dài, mảnh, nối Trực khuẩn nhỏ, dài, nối chuỗi NCb đứng riêng lẻ hoặc nối chuỗi đứng riêng lẻ hoặc nối chuỗi chuỗi ngắn, đứng riêng lẻ hoặc ngắn. Đứng riêng lẻ hoặc tụ ngắn ngắn tụ đám đám Trực khuẩn kích thước nhỏ, Trực khuẩn kích thước nhỏ, Trực khuẩn mảnh, nhỏ, ngắn, Trực khuẩn mảnh, nhỏ, mập, 30 Proc mảnh, ngắn, nằm riêng lẻ hoặc mảnh, ngắn, nằm riêng lẻ hoặc nối chuỗi dài, ngắn, nối chuỗi dài nối chuỗi dài nối chuỗi dài Trực khuẩn nhỏ, hơi mảnh, Trực khuẩn nhỏ, hơi mảnh, Trực khuẩn nhỏ, hơi mảnh, Trực khuẩn nhỏ, hơi mảnh, LA ngắn, đứng riêng lẻ hoặc nối ngắn, nối chuỗi dài, đứng riêng ngắn, đứng riêng lẻ hoặc tụ ngắn, nối chuỗi dài, đứng riêng chuỗi dài, lẻ hoặc tụ đám đám, nối chuỗi dài lẻ hoặc tụ đám Trực khuẩn nhỏ, ngắn, nối Trực khuẩn nhỏ, ngắn, nối Trực khuẩn nhỏ, ngắn, nối Trực khuẩn nhỏ, ngắn, nối LP chuỗi dài, đứng riêng lẻ hoặc chuỗi dài, đứng riêng lẻ hoặc tụ chuỗi dài, đứng riêng lẻ hoặc tụ chuỗi dài, đứng riêng lẻ hoặc tụ tụ đám đám đám đám 31 Hình 4.1. Đĩa petri nuôi cấy NCb Hình 4.2. Khuẩn lạc NCb Hình 4.3. NCb qua ba lần cấy chuyển NCb Proc 31 LA LP Hình 4.4. Hình thái một số chủng giống Lactobacillus Một số tác giả Silva et al. (1983); Standbury and Whitaker (1990); Zahoor et al. (2003) cho biết, các chủng vi khuẩn lactic không có sự thay đổi về hình thái khi được bảo quản giữ giống với các phương pháp khác nhau như đông sâu, bảo quản bằng dầu khoáng và nuôi cấy trên thạch nghiêng trong 60 ngày - 1 năm. Tuy nhiên, nếu không tuân thủ đầy đủ quy trình bảo quản giữ giống hoặc do các yếu tố khách quan như mất điện thời gian dài, quên không cấy truyền giống đúng kỳ hạn . có thể dẫn đến tình trạng thoái hóa giống hoặc phát sinh những biến dị không mong muốn về hình thái của vi khuẩn. 4.2. ĐÁNH GIÁ SỰ BIẾN ĐỔI CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG LACTOBACILLUS TRONG THỜI GIAN BẢO QUẢN GIỮ GIỐNG 4.2.1. Khả năng phân giải protein Các vi khuẩn lactic có khả năng phân giải protein do chúng có thể sản sinh enzyme protease. Mỗi chủng lactic khác nhau có khả năng phân giải protein khác nhau. Kết quả đánh giá sự thay đổi khả năng phân giải protein của các chủng Lactobacillus trong thời gian bảo quản được trình bày ở bảng 4.3. Qua kết quả ở bảng 4.3 chúng tôi có nhận xét: - Tất cả các chủng Lactobacillus được phân lập và chọn lọc đều có khả năng phân giải protein. Trong đó, khả năng phân giải mạnh nhất ở chủng Proc với đường kính vòng phân giải là 7,5mm; thấp nhất ở chủng LP với đường kính vòng phân giải chỉ đạt 1,5mm. 32 Bảng 4.3. Khả năng phân giải protein của các chủng vi khuẩn Lactobacillus trong thời gian bảo quản Chủng Đường kính vòng phân giải protein (mm) vi khuẩn 0 ngày 30 ngày 60 ngày 90 ngày ND1 4,5 ±0,5 4,0±0,2 4,2±0,4 3,9 ±0,2 ND2 4,0 ± 0,6 3,0 ±0,2 3,5±0,6 3,4±0,4 NCb 7,0 ±0,7 6,0±0,2 5,6±0,3 6,5±0,5 Proc 7,5±0,8 7,5±0,3 7,0±0,5 7,2±0,4 LA 3,5±0,3 3,0±0,2 2,8±0,3 2,8±0,6 LP 1,5±0,3 0 0 0 - Trong quá trình bảo quản giữ giống hầu hết các chủng đều giữ đặc tính phân giải protein ngoại trừ chủng LP. Trước khi tiến hành bảo quản, chủng LP có khả năng phân giải protein kém. Sau thời gian bảo quản 30 ngày, không phát hiện thấy có hiện tượng phân giải protein ở đĩa nuôi cấy chủng LP. Kết quả tương tự đối với thời điểm kiểm tra 60 và 90 ngày. Kết quả này chứng tỏ, đặc tính phân giải protein của chủng LP đã mất đi trong quá trình bảo quản giống. - Hầu hết các chủng Lactobacillus còn lại mặc dù vẫn giữ được đặc tính phân giải protein nhưng mức độ hoạt động của enzyme protease đã suy giảm so với ban đầu. - Ở chủng Proc đặc tính phân giả protein tương đối ổn định. Sau 90 ngày bảo quản đường kính vòng phân giải đạt được 7,2mm, giảm không đáng kể so với thời điểm trước khi bảo quản. Có thể kết luận đây là một chủng giống ổn định. Tuy nhiên, nếu tiếp tục bảo quản thời gian dài hơn, cấy truyền qua nhiều đời hơn thì đặc tính này có thể sẽ suy giảm hoặc mất đi. Sự biến đổi về đặc tính phân giải protein của các chủng Lactobacillus trong thời gian bảo quản có thể thấy rõ qua biểu đồ 4.1. 33 Biểu đồ 4.1. Khả năng phân giải protein của các chủng Lactobacillus trong thời gian bảo quản Như vậy, có thể thấy rằng phương pháp bảo quản trên môi trường thạch nghiêng ở 4oC và định kỳ cấy truyền có ảnh hưởng tới đặc tính phân giải protein của các chủng Lactobacillus kiểm tra. Đặc tính phân giải protein của các chủng này suy giảm hoặc mất di theo thời gian bảo quản kéo dài và qua nhiều đời cấy truyền. Vì vậy, để đảm bảo hoạt tính của chủng cần phải nhân giống qua môi trường tự nhiên và phân lập lại để tăng sức khỏe của giống. Chủng Proc Chủng LA Hình 4.5. Khả năng phân giải protein của các chủng Lactobacillus 34 4.2.2. Khả năng đông vón sữa và sinh axit lactic của các chủng Lactobacillus 4.2.2.1. Khả năng sinh axit lactic Khả năng sinh axit lactic là đặc điểm đặc trưng của vi khuẩn lactic. Mặt khác, axit lactic có khả năng kích thích sự phát triển lông nhung ở niêm mạc ruột, tạo môi trường pH thấp để ức chế các vi khuẩn có hại trong đường ruột. Các chất kháng khuẩn Bacteriocin do các vi khuẩn lactic sản sinh ra cũng có khả năng ức chế nhiều vi khuẩn gây bệnh. Vì vậy đặc tính sản sinh axit lactic là một trong những đặc tính quan trọng của các vi khuẩn Lactobacillus. Dựa vào cơ sở đó, chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng sinh axit lactic của các chủng vi khuẩn lactic và đánh giá sự thay đổi trong thời gian bảo quản. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.4 và biểu đồ 4.2. Bảng 4.4. Khả năng sinh axit lactic của các chủng vi khuẩn Lactobacillus trong thời gian bảo quản Hàm lượng axit lactic (mg/ml) Thời gian bảo quản ND1 ND2 NCb Proc LA LP 0 ngày 22,0 12,1 14,3 19,8 24,3 18,4 30 ngày 22,0 11,1 13,5 19,8 24,2 18,1 60 ngày 19,0 10,1 13,8 19,6 22,5 17,2 90 ngày 18,7 9,8 14,1 19 22,3 16,8 Kết quả ở bảng 4.4 cho thấy: - Tất cả các chủng Lactobacillus được chọn lọc đều có khả năng sinh axit lactic tốt. Hàm lượng axit lactic dao động từ 14,3 – 24,3mg/ml, cao nhất ở chủng LA và ND1. - Trong thời gian bảo quản giữ giống, tất cả các chủng Lactobacillus kiểm tra đều giữ được hoạt tính sinh axit lactic. Tuy nhiên, khả năng sinh axit lactic đã cho thấy sự suy giảm so với ban đầu. Trong số này, chỉ có chủng NCb có đặc 35 tính sinh axit lactic tương đối ổn định, hàm lượng axit lactic dao động trong khoảng 13,5 – 14,1mg/ml trong suốt quá trình bảo quản. - Các chủng còn lại khả năng sinh axit lactic mặc dù đã giảm so với ban đầu nhưng hàm lượng axit lactic sản sinh vẫn ở mức cao và đạt tiêu chuẩn của giống. So sánh khả năng sinh axit lactic của các chủng Lactobacillus trong thời gian bảo quản qua biểu đồ 4.2. Biểu đồ 4.2. Khả năng sinh axit lactic của các chủng Lactobacillus trong thời gian bảo quản giữ giống Để có thể đánh giá chính xác hơn đặc tính sinh axit lactic của các chủng Lactobacillus kiểm tra, chúng tôi tiến hành phản ứng đông vón sữa. Kết hợp với tốc độ đông vón sữa có thể lựa chọn được các chủng có đặc tính sinh axit lactic cao nhất và nhanh nhất. 4.2.2.2. Khả năng đông vón sữa Vi khuẩn lactic có khả năng làm đông vón casein nhờ khả năng sinh axit lactic. Axit lactic sinh ra sẽ làm các protein trong sữa bị biến tính, duỗi thẳng ra để lộ đầu ưa nước và đuôi kị nước. Sau đó, các đuôi kị nước sẽ lập tức quay vào nhau, đầu ưa nước quay ra ngoài, khiến protein đông tụ lại, gây ra hiện tượng đông vón sữa. Lượng axit sinh ra càng nhiều thì thời gian đông vón càng nhanh. 36 Kết quả đánh giá khả năng đông vón sữa của các chủng Lactobacillus kiểm tra được trình bày ở bảng 4.5. Bảng 4.5 cho thấy, tốc độ đông vón sữa kém nhất ở chủng ND2, kết quả này phù hợp với kết quả ở bảng 4.4. Trong quá trình bảo quản, tốc độ đông vón sữa cũng giảm ở một số chủng NCb và ND2. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả xác định hàm lượng axit lactic của các chủng này. Cả hai chủng này đều có hàm lượng axit lactic sinh ra sau 24h nuôi cấy là thấp nhất. Bảng 4.5. Khả năng đông vón sữa ở thời điểm 24h của các chủng Lactobacillus trong thời gian bảo quản giữ giống Tốc độ đông vón sữa Ký hiệu chủng 0 ngày 30 ngày 60 ngày 90 ngày ND1 +++ +++ ++ ++ ND2 ++ + ++ + NCb +++ ++ ++ ++ Proc +++ +++ +++ ++ LA +++ +++ ++ +++ LP +++ ++ +++ +++ Chú thích: +++: Sữa bị đông đặc thành khối đồng nhất sau 6h nuôi cấy ++: Sữa đông đặc thành khối đồng nhất từ 12-24 giờ nuôi cấy. +: Sữa đông đặc từ 20-24h nuôi cấy. Hoặc sữa có dạng bã đậu, có dung dịch trong trên bề mặt Như vậy, từ các kết quả trên chúng tôi có nhận xét: Thời gian bảo quản kéo dài cũng đã ảnh hưởng đến đặc tính sinh axit lactic của các chủng Lactobacillus kiểm tra. Các chủng có hoạt tính ổn định có thể được lựa chọn là ND1, Proc, LA và LP. Tuy nhiên, để đặc tính sinh học này không tiếp tục bị suy giảm hoặc mất đi, các chủng này đều cần phải nhân giống lại trên môi trường tự nhiên để phân lập lại. 37 Hình 4.6. Khả năng đông vón sữa của vi khuẩn Lactobacillus 4.2.3. Đánh giá sức sống của các chủng giống Lactobacillus trong thời gian bảo quản Các chủng giống Lactobacillus được nuôi cấy trên môi trường thạch nghiêng MRS ở 37oC/48h sau đó được bảo quản ở trong tủ lạnh. Số lượng tế bào vi khuẩn được đếm ở các thời điểm 0, 30, 60 và 90 ngày bảo quản để đánh giá sức sống của giống. Kết quả được trình bày ở bảng 4.6. Bảng 4.6. Số lượng tế bào sống (TB/ml) của các chủng Lactobacillus trong thời gian bảo quản giữ giống Chủng Thời gian bảo quản Trung bình VK 0 ngày 30 ngày 60 ngày 90 ngày 6 6 5 5 6 ND1 4,7 x10 3,8 x10 9,5 x10 4,8 x10 2,48 x10 6 6 6 5 6 ND2 4,4 x10 3,6 x10 2,1 x10 6,4 x10 2,69 x10 6 6 6 5 6 NCb 4,9 x10 4,1 x10 1,6 x10 5,5 x10 2,79 x10 6 6 6 6 6 Proc 7,4 x10 6,2 x10 2,8 x10 1,2 x10 4,4 x10 6 6 6 6 6 LA 11,8 x10 9,5 x10 5,6 x10 2,4 x10 7,33 x10 6 6 6 6 6 LP 9,5 x10 8,4 x10 4,7 x10 2,2 x10 6,2 x10 38 Kết quả ở bảng 4.6 cho thấy, sức sống của tế bào vi khuẩn Lactobacillus đều giảm dần trong thời gian bảo quản, được thể hiện qua số lượng tế bào đếm được giảm dần so với trước khi bảo quản. Trong số 6 chủng giống kiểm tra, chỉ có 3 chủng LA, LP và Proc, số lượng tế bào đếm được sau 90 ngày bảo quản vẫn duy trì ở mức >1,2-2,4x106 TB/ml. Các chủng còn lại số lượng tế bào đã giảm xuống dưới mức <1 triệu tế bào/ml. Kết quả này phù hợp với báo cáo của Zahoor et al. (2003). Các tác giả cho biết số lượng tế bào Lactobacillus phân lập từ sữa chua đã giảm từ 9,9 x106 xuống còn 3,5 x105TB/ml sau 60 ngày bảo quản trên thạch nghiêng MRS ở trong tủ lạnh. Các tác giả khuyến cáo nên bảo quản các chủng giống Lactobacillus dưới lớp dầu khoáng để duy trì sức sống và sự ổn định của giống. Như vậy, thời gian và phương pháp bảo quản có ảnh hưởng tới sức sống của giống. Trong số 6 chủng giống kiểm tra chỉ có chủng LA, Lp và Proc là vẫn duy trì được sự ổn định của giống trong 90 ngày bảo quản. Tuy nhiên, với thời gian bảo quản kéo dài hơn thì chắc chắn số lượng tế bào còn sống sẽ giảm đi. 4.2.4. Khả năng sinh trưởng ở các mức nhiệt độ khác nhau Các chủng giống sau khi được đánh giá sức sống thì cần phải tiếp tục đánh giá khả năng sinh trưởng ở các mức nhiệt độ khác nhau. Mục đích của việc đánh giá sinh trưởng này nhằm xác định xem khi giống bảo quản bằng phương pháp truyền thống có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của giống khi nuôi cấy ở các mức nhiệt độ khác nhau hay không. Đặc biệt, là để đánh giá khả năng chịu nhiệt độ của các chủng giống đã được chọn lọc có bị ảnh hưởng trong quá trình giữ giống hay không. Chúng tôi tiến hành khảo sát sự sinh trưởng của chủng giống Lactobacillus được bảo quản trên thạch nghiêng ở điều kiện 4oC qua 4 mức nhiệt độ: 30, 35, 40 và 45oC. Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường MRS dịch thể, sau khi quan sát tính chất mọc sẽ đếm số lượng tế bào trên kính hiển vi. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để theo dõi sự thay đổi của các chủng giống trong thời gian bảo quản. 39 Hình 4.7. Đánh giá sinh trưởng trên môi trường MRS dịch thể 4.2.4.1. Khả năng sinh trưởng ở 30oC Ở 30oC, vi khuẩn lactic sinh trưởng tương đối tốt. Kết quả theo dõi sinh trưởng của các giống Lactobacillus phân lập được thể hiện ở bảng 4.7 và biểu đồ 4.3. Kết quả cho thấy: - Chủng LP có khả năng sinh trưởng tốt nhất ở điều kiện 30oC/24h–48h nuôi cấy với số lượng tế bào dao động trong khoảng 28,9 – 81,1 triệu/ml. So với thời điểm 0h khi bắt đầu nuôi cấy, số lượng tế bào đã tăng từ 1,8 – 5,4 lần sau 90 ngày bảo q