Đánh giá tính kháng, nhiễm bệnh bạc lá (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) trên một số dòng lúa triển vọng

cứu của riêng tơi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được cơng bố trong bất kì cơng trình nào khác. Tơi xin cam đoan rằng các thơng tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, tháng 11 năm 2010 Xác nhận của giáo viên hướng dẫn Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hồng Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ ii LỜI CÁM ƠN Trong thời gian học tập và thực hiện Luận văn tốt nghiệp tơi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các thầy cơ, anh chị, bạn bè và người thân. Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Vũ Đức Quang, KS. Nguyễn Trịnh Tồn đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo điều kiện để tơi hồn thành Luận văn. Tơi xin cám ơn các cơ chú, các anh chị em cùng bạn bè đồng nghiệp đang cơng tác tại phịng Sinh học phân tử - Viện Di truyền Nơng nghiệp đã quan tâm và tận tình giúp đỡ tơi. Tơi xin cám ơn các thầy cơ trong Bộ mơn Bệnh cây & Nơng dược - Khoa Nơng học - Trường Đại học Nơng nghiệp I, các anh chị, bạn bè lớp Cao học Bảo vệ thực vật Khĩa 17 và người thân trong gia đình đã gĩp ý, động viên, giúp đỡ tơi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Tơi xin chân thành cám ơn. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hồng Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cám ơn ii Mục lục iii Danh mục bảng v Danh mục hình vi PHẦN 1. MỞ ðẦU 1 1.1. ðặt vấn đề 1 1.2. Mục đích, yêu cầu của đề tài 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 4 2.1. Bệnh bạc lá lúa 4 2.2. Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa 6 2.3. Tính kháng bệnh bạc lá của cây trồng 12 2.4. Các loại chỉ thị di truyền 17 2.5. Phương pháp MAS 24 PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.1. ðịa điểm và thời gian nghiên cứu 29 3.2. ðối tượng và vật liệu nghiên cứu 29 3.3. Nội dung nghiên cứu 33 3.4. Phương pháp nghiên cứu 35 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 4.1. ðánh giá phổ kháng nhiễm bạc lá của các dịng NILs mang các đơn gen kháng khác nhau và phân nhĩm 20 isolate vi khuẩn bạc lá 39 4.2. Khảo sát giá trị kháng của các gen kháng và phối hợp các gen kháng bạc lá 43 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ iv 4.2.2. Khảo sát giá trị kháng của IRBB54 (xa5+Xa21) 46 4.2.3. Khảo sát giá trị kháng của IRBB55 (xa13+Xa21) 47 4.2.4. Khảo sát giá trị kháng của IRBB59 (xa5+xa13+Xa21) 49 4.2.5. Khảo sát giá trị kháng của IRBB60 (Xa4+xa5+xa13+Xa21) 51 4.2.6. Khảo sát giá trị kháng của IRBB61 (Xa4+xa5+Xa7) 53 4.2.7. Khảo sát giá trị kháng của IRBB62 (Xa4+Xa7+Xa21) 55 4.2.8. Khảo sát giá trị kháng của IRBB63 (xa5+Xa7+xa13) 56 4.2.9. Khảo sát giá trị kháng của IRBB65 (Xa4+Xa7+xa13+Xa21) 58 4.3. Chọn lọc các dịng lúa bằng một số chỉ thị phân tử liên kết gen kháng bạc lá 60 4.3.1. Kết quả chọn lọc các dịng thuộc tổ hợp HC x IRBB62 60 4.3.2. Kết quả chọn lọc các dịng thuộc tổ hợp HC x IRBB62 62 4.3.3. Kết quả chọn lọc các dịng thuộc tổ hợp HC x IRBB63 64 4.4. ðánh giá tính kháng nhiễm bệnh bạc lá của các dịng triển vọng 66 4.4.1. Kết quả lây nhiễm 10 isolate vi khuẩn đại diện trên các dịng thuộc tổ hợp lai HC x IRBB62 66 4.4.2. Kết quả lây nhiễm 10 isolate vi khuẩn đại diện trên các dịng thuộc tổ hợp lai HC x IRBB63 68 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70 5.1. Kết luận 70 5.2. Kiến nghị 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 PHỤ LỤC 75 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ v DANH MỤC BẢNG STT TÊN BẢNG TRANG 3.1. Danh sách nguồn gốc các dịng NILs mang đơn gen kháng bạc lá 30 3.2. Danh sách hai cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 31 3.3. Danh sách các isolate vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu 32 4.1a. Phản ứng kháng nhiễm của các dịng NILs mang đơn gen kháng với 20 isolate vi khuẩn 40 4.1b. Phản ứng kháng nhiễm của các dịng NILs mang đơn gen kháng với 20 isolate vi khuẩn 41 4.2. Kết quả đánh giá hiệu lực kháng của IRBB52 44 4.3. Kết quả đánh giá hiệu lực kháng của IRBB54 46 4.4. Kết quả đánh giá hiệu lực kháng của IRBB55 47 4.5. Kết quả đánh giá hiệu lực kháng của IRBB59 49 4.6. Kết quả đánh giá hiệu lực kháng của IRBB60 51 4.7. Kết quả đánh giá hiệu lực kháng của IRBB61 53 4.8. Kết quả đánh giá hiệu lực kháng của IRBB62 55 4.9. Kết quả đánh giá hiệu lực kháng của IRBB63 57 4.10. Kết quả đánh giá hiệu lực kháng của IRBB65 58 4.11. Kết quả chọn lọc các dịng mang gen Xa4 trong tổ hợp HC x IRBB62 61 4.12. Kết quả chọn lọc các dịng mang gen Xa7 trong tổ hợp HC x IRBB62 63 4.13. Kết quả chọn lọc các dịng mang gen Xa7 trong tổ hợp HC x IRBB63 64 4.14. Kết quả đánh giá kiểu hình kháng, nhiễm của các dịng triển vọng thuộc tổ hợp lai HC x IRBB62 với 10 isolate vi khuẩn đại diện 67 4.15. Kết quả đánh giá kiểu hình kháng nhiễm của các dịng triển vọng thuộc tổ hợp lai HC x IRBB63 với 10 isolate vi khuẩn đại diện 68 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ vi DANH MỤC HÌNH STT TÊN HÌNH TRANG 4.1. Sơ đồ hình cây thể hiện sự phân nhĩm 20 isolate vi khuẩn dựa trên phản ứng kháng nhiễm với các dịng NILs mang đơn gen kháng 42 4.2. Biểu đồ thể hiện hiệu lực kháng của IRBB52 45 4.3. Biểu đồ thể hiện hiệu lực kháng của IRBB54 46 4.4. Biểu đồ thể hiện hiệu lực kháng của IRBB55 48 4.5. Biểu đồ thể hiện hiệu lực kháng của IRBB59 50 4.6. Biểu đồ thể hiện hiệu lực kháng của IRBB60 52 4.7. Biểu đồ thể hiện hiệu lực kháng của IRBB61 54 4.8. Biểu đồ thể hiện hiệu lực kháng của IRBB62 56 4.9. Biểu đồ thể hiện hiệu lực kháng của IRBB63 58 4.10. Biểu đồ thể hiện hiệu lực kháng của IRBB65 59 4.11. Ảnh gel kiểm tra sự cĩ mặt gen Xa4 trong kiểu gen của các dịng con lai thuộc tổ hợp HC x IRBB62 61 4.12. Ảnh gel kiểm tra sự cĩ mặt gen Xa7 trong kiểu gen của các dịng con lai thuộc tổ hợp HC x IRBB62 63 4.13. Ảnh gel kiểm tra sự cĩ mặt gen Xa7 trong kiểu gen của các dịng con lai thuộc tổ hợp HC x IRBB63 64 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 1 PHẦN 1. MỞ ðẦU 1.1. ðặt vấn đề Bệnh bạc lá ở lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây ra là một trong những bệnh gây thất thốt nghiêm trọng về năng suất và sản lượng của ngành trồng lúa. Bệnh bạc lá cĩ diện phân bố rộng và tác hại nghiêm trọng đối với cây lúa. Bệnh được phát hiện đầu tiên ở Nhật Bản vào năm 1884, sau đĩ bệnh này được ghi nhận và thơng báo lần lượt từ các vùng trồng lúa khác nhau của Châu Á, Bắc Úc, Châu Phi và Mỹ. Các nghiên cứu về mức độ thiệt hại chỉ ra rằng, thiệt hại về năng suất biến động rất rộng tùy thuộc vào giai đoạn bị nhiễm bệnh, mức độ nhiễm của giống, điều kiện thời tiết và mơi trường khi bệnh diễn ra và cĩ thể dao động từ 20 đến 30% thậm chí mất trắng. ðể giảm thiểu thiệt hại do bệnh gây ra, người ta đã phải sử dụng phương pháp hĩa học. Một lượng lớn thuốc hĩa học đã được sử dụng gây ra những tác hại khơng nhỏ tới mơi trường và sức khỏe con người. Ngày nay con người đang hướng tới một nền sản xuất thân thiện với mơi trường. ðối phĩ với tình trạng biến đổi khí hậu tồn cầu chỉ cĩ thể bằng cách hạn chế sử dụng hố chất bảo vệ thực vật và tìm phương thức khác để giải quyết vấn đề sâu bệnh. Bên cạnh những phương pháp phịng trừ mang tính thân thiện với mơi trường thì phương pháp sử dụng các dịng/giống lúa kháng bệnh được đánh giá là quan trọng nhất và cĩ tiềm năng nhất. Và cũng nhờ sự phát triển mạnh mẽ của khoa học cơng nghệ cuối thế kỷ 20 - đầu thế kỷ 21, đặc biệt là lĩnh vực cơng nghệ sinh học thực vật như: nuơi cấy mơ tế bào, sinh học phân tử, chuyển gen…. mà nhân loại đã đạt được rất nhiều thành tựu to lớn trong chọn tạo giống cây trồng kháng sâu bệnh, chống chịu với stress mơi trường hay những cây trồng và sản phẩm cây trồng phục vụ những mục đích riêng của con người. Một trong những phương pháp được coi là cĩ hiệu quả và đang được ứng dụng rộng rãi tại các phịng nghiên cứu, các Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 2 trung tâm chọn tạo giống cây trồng nĩi chung và chọn tạo giống lúa nĩi riêng là phương pháp chọn tạo giống nhờ sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử (Marker- Assisted Selection – MAS). ðề tài: “Chọn tạo giống lúa thuần kháng bệnh bạc lá bằng cơng nghệ chỉ thị phân tử” thuộc chương trình Cơng nghệ Sinh học Nơng nghiệp giai đoạn 2006 – 2010 đặt mục tiêu, thơng qua phương pháp MAS, chọn tạo các dịng lúa thuần triển vọng cĩ đặc tính nơng sinh học tốt và mang gen kháng bạc lá. ðể đảm bảo thành cơng cho mục tiêu cuối cùng là chọn tạo được giống lúa thuần kháng bạc lá, các cơng việc cần thiết như lây nhiễm nhân tạo, đánh giá tính kháng/ nhiễm bạc lá... cần được tiến hành như một phần quan trọng của đề tài. Vì mục đích đĩ, chúng tơi tiến hành đề tài: “ðánh giá tính kháng, nhiễm bệnh bạc lá (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) trên một số dịng lúa triển vọng”. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 3 1.2. Mục đích, yêu cầu của đề tài 1.2.1. Mục đích Trên cơ sở đánh giá tính kháng nhiễm bệnh bạc lá của một số dịng NILs mang đơn hay đa gen kháng, đưa ra định hướng cho việc quy tụ các gen kháng hữu hiệu cho cơng tác chọn tạo giống lúa kháng bạc lá. Trên cơ sở đánh giá tính kháng nhiễm bệnh bạc lá của một số dịng lúa thu được qua phép lai chuyển gen kháng, tuyển chọn ra các dịng cĩ tính kháng cao để tiếp tục chọn lọc thành các dịng triển vọng và giống lúa thuần kháng bạc lá cho vùng đồng bằng Bắc Bộ. 1.2.2. Yêu cầu ðánh giá hiệu lực kháng và phổ kháng của một số dịng NILs mang đơn gen kháng với các nịi vi khuẩn thu thập được. ðánh giá hiệu lực kháng của một số dịng NILs mang hai hay nhiều hơn các gen kháng bạc lá hữu hiệu. ðánh giá tính kháng của các dịng chọn lọc được bằng MAS. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 4 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 2.1. Bệnh bạc lá lúa 2.1.1. Triệu chứng Bệnh bạc lá lúa phát sinh phá hoại suốt thời kỳ mạ đến khi lúa chín, nhưng cĩ triệu chứng điển hình là thời kỳ lúa cấy trên ruộng từ sau khi đẻ nhánh - trỗ - chín sữa. Triệu chứng trên mạ khơng đặc trưng nên dễ nhầm lẫn với các hiện tượng khơ đầu lá do sinh lý. Vi khuẩn hại mạ gây ra triệu chứng ở mép lá, đầu lá với những vệt cĩ độ dài ngắn khác nhau, ban đầu cĩ màu xanh vàng sau đĩ chuyển nâu bạc rồi khơ xác. Trên lúa cấy, triệu chứng bệnh thể hiện rõ rệt hơn, tuy nhiên cĩ thể biến đổi ít nhiều tuỳ theo giống và điều kiện ngoại cảnh. Vết bệnh từ mép lá, đầu lá lan dần vào trong phiến lá hoặc kéo dài theo gân chính; nhưng cũng cĩ vết bệnh từ ngay giữa phiến lá lan rộng ra. Vết bệnh lan rộng theo đường gợn sĩng màu vàng; mơ bệnh ban đầu xanh tái, vàng lục, nâu bạc rồi khơ xác. Theo kết quả nghiên cứu của Bộ mơn Bệnh cây, Trường ðại học Nơng nghiệp I, cĩ hai loại hình triệu chứng của bệnh bạc lá lúa là: bạc lá gợn vàng và bạc lá tái xanh [11]. Loại hình bạc lá gợn vàng phổ biến trên hầu hết các giống và các mùa vụ; cịn loại hình bạc lá tái xanh thường chỉ thấy xuất hiện trên một số giống lúa, đặc biệt đối với các giống lúa ngắn ngày, chịu phân, phiến lá to, thế lá đứng, ví dụ như giống T1, X1, NN27….. Ngồi ra, theo kết quả nghiên cứu của Viện Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam, khi vi khuẩn xâm nhập vào cây lúa qua rễ và gốc, cây cĩ thể biểu hiện ngay triệu trứng Kresek: lá và tồn bộ cây lúa bị héo. ðơi khi lá bệnh của giống lúa dễ nhiễm bệnh cĩ màu nhạt. Lá già cĩ vẻ bình thường và cĩ màu xanh, lá non cĩ màu vàng trắng đồng đều hoặc vàng hoặc sọc vàng pha xanh [10]. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 5 Thơng thường, ranh giới giữa mơ bệnh và mơ khoẻ được phân biệt rõ ràng, cĩ giới hạn theo đường gợn sĩng màu vàng hoặc khơng vàng, cĩ khi chỉ là một đường viền màu nâu đứt quãng hay khơng đứt quãng. Trong điều kiện nhiệt độ, ẩm độ cao, trên bề mặt vết bệnh dễ xuất hiện những giọt dịch vi khuẩn hình trịn nhỏ, cĩ màu vàng, khi keo đặc cĩ màu nâu hổ phách. 2.1.2. Quy luật phát sinh, phát triển của bệnh Ở miền Bắc nước ta, bệnh cĩ thể phát sinh, phát triển trên tất cả các vụ trồng lúa. Vụ chiêm xuân, bệnh thường phát sinh vào tháng 3 - 4. phát triển mạnh hơn vào tháng 5 - 6 khi mà lúa chiêm xuân trỗ chín, song ở vụ chiêm xuân mức độ bị bệnh thường nhẹ hơn, tác hại ít nghiêm trọng hơn so với vụ mùa, trừ một số giống lúa cấy muộn, nhiễm bệnh ngay từ khi lúa làm địng. Bệnh bạc lá lúa thường phát sinh và gây tác hại lớn trong vụ mùa. Bệnh cĩ thể phát sinh sớm vào tháng 8, khi lúa làm địng, trỗ, chín sữa với các trà lúa sớm. ðối với các giống lúa mẫn cảm, bệnh thường bị rất sớm và khá nặng, giảm năng suất nhiều. Các trà lúa cấy muộn trỗ vào tháng 10 thường bị bệnh nhẹ hơn, tác hại của bệnh cũng ít hơn. Nhìn chung, bệnh phát triển mạnh vào giai đoạn cây lúa dễ nhiễm bệnh nhất là lúc lúa làm địng và chín sữa. Bệnh phát sinh, phát triển mạnh và truyền lan nhanh trong điều kiện nhiệt độ từ 26- 30oC, ẩm độ cao từ 90% trở lên. Nhiệt độ đảm bảo cho bệnh phát triển, cịn ẩm độ cĩ ý nghĩa quyết định đến đến mức độ bệnh, mưa giĩ lại tạo điều kiện cho bệnh truyền lan. Vì thế mà bệnh thường phát sinh, phát triển mạnh vào khoảng tháng 7- 8, do trong thời gian này, những cơn mưa khơng những tạo vết thương trên lá mà cịn làm cho vi khuẩn sinh sản nhanh, số lượng keo vi khuẩn hình thành nhiều, tạo điều kiện cho sự xâm nhiễm và truyền lan nhanh chĩng. Chân đất cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát sinh, phát triển của bệnh. Những vùng đất màu mỡ, nhiều chất hữu cơ bệnh thường phát sinh, phát triển mạnh hơn những vùng đất xấu, cằn cỗi. Nơi đất chua, Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 6 úng ngập hoặc mực nước sâu, đặc biệt là những vùng đất hẩu, nhiều mùn, ruộng lúa bị che bởi bĩng cây sẽ bị bệnh nặng hơn. Về yếu tố dinh dưỡng, các dạng đạm vơ cơ dễ làm cây lúa nhiễm bệnh mạnh hơn đạm hữu cơ; phân xanh bĩn vùi cũng làm cho lúa dễ nhiễm bệnh hơn bĩn phân chuồng ủ hoai mục. Ở vụ xuân, cĩ thể bĩn đạm với số lượng cao hơn vụ mùa. Bĩn phân sâu, bĩn tập trung, bĩn nặng đầu nhẹ cuối, bĩn thúc sớm làm cho cây lúa đẻ nhánh tập trung, đẻ nhanh thì bệnh bạc lá sẽ nhẹ hơn so với bĩn phân rải rác và bĩn muộn. Nếu bĩn đạm cân đối với lân và kali thì bệnh nhẹ hơn nhiều so với việc bĩn phân riêng rẽ và mất cân đối. Tuy nhiên, với lượng đạm bĩn 120-150 kg N/ha thì dù cĩ bĩn thêm lân và kali cũng khơng cịn tác dụng. Yếu tố giống: nhìn chung các giống lúa đang trồng trong sản xuất hiện nay đều cĩ thể nhiễm bệnh bạc lá nhưng ở các mức độ khác nhau. Bệnh này cũng rất dễ phát sinh thành dịch, nhất là ở những nơi gieo cấy giống nhiễm bệnh [9]. Các giống lúa địa phương cũ như Di Hương, Tám Thơm... bị bệnh rất nhẹ, cịn các giống lúa mới nhập nội cĩ năng suất cao, thấp cây, phàm ăn, phiến lá to thì hầu như nhiễm bệnh tương đối nặng như CR203, DT10..., hay một số giống nhập nội từ Trung Quốc. 2.2. Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa 2.2.1. Vị trí phân loại Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa trước đây cĩ tên là Pseudomonas oryzae, về sau Downson đổi tên lại là Xanthomonas oryzae pv. oryzae Downson. Dựa theo hệ thống phân loại của Bergey (1939) và Gorlenco (1966) thì lồi Xanthomonas oryzae thuộc chi Xanthomonas, họ Pseusomonadaceae, bộ Eubacteriales, lớp Schizomycetes (Eubacteria). Tuy nhiên hệ thống phân loại này cịn cĩ nhiều tiêu chí chưa được nghiên cứu đầy đủ nên hệ thống chưa cĩ được sự thống nhất tồn diện. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 7 Trong những năm gần đây, phân loại vi khuẩn hiện đại dựa trên các nghiên cứu và phân tích trực tiếp cấu trúc ADN. Các cá thể, các isolate khác nhau nhưng cùng một lồi sẽ cĩ cấu trúc di truyền tương tự nhau. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, hàm lượng các nucleotit (nu) G+C đặc trưng cho mỗi lồi và được sử dụng làm 1 trong những chỉ tiêu phân loại. Theo đĩ, các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy hàm lượng G+C của những lồi trong chi Erwinia là 50-54%; Corynebacterium: 54-55%; Pseudomonas: 58-63%; cịn ở Xanthomonas là 63-69% [12]. 2.2.2. ðặc điểm hình thái, đặc điểm hố sinh Vi khuẩn Xanthomonas orryzae pv. oryzae cĩ dạng hình gậy, hai đầu hơi trịn, cĩ một lơng roi ở một đầu, kích thước 1- 2 x 0.5- 0.9 µm. Trên mơi trường nhân tạo, khuẩn lạc của vi khuẩn cĩ dạng hình trịn, màu vàng sáp, rìa nhẵn, bề mặt khuẩn lạc ướt, háo khí, nhuộm gram âm. Vi khuẩn khơng cĩ khả năng phân giải nitrat, khơng dịch hố gelatin, khơng tạo NH3, indol, nhưng tạo H2S, tạo khí nhưng khơng tạo axit trong mơi trường cĩ đường. Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn sinh trưởng là từ 26-30oC, nhiệt độ tối thiểu 0-5 oC, nhiệt độ làm vi khuẩn chết là 53 oC. Vi khuẩn cĩ thể sống trong phạm vi pH khá rộng từ 5.7-8.5, thích hợp nhất là pH 6.8-7.2. 2.2.3. ðặc điểm truyền lan và bảo tồn Vi khuẩn xâm nhập cĩ tính chất thụ động, cĩ thể xâm nhập qua thuỷ khổng, khí khổng ở trên chĩp lá, mép lá, đặc biệt qua vết thương cơ giới. Khi tiếp xúc với bề mặt cĩ màng nước, vi khuẩn dễ dàng di động, xâm nhập vào bên trong và theo các bĩ mạch lan rộng đi. Trong điều kiện mưa ẩm, thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn, trên bề mặt vết bệnh tiết ra những giọt dịch vi khuẩn. Thơng qua sự va chạm giữa các lá lúa, bệnh cĩ thể truyền lan. Tuy bệnh bạc lá cĩ cự ly truyền lan hẹp song cịn tuỳ thuộc vào điều kiện mưa bão xảy ra vào cuối vụ chiêm và trong vụ mùa mà bệnh cĩ thể truyền lan tới phạm vi khơng gian tương đối rộng. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 8 Về nguồn bảo tồn của bệnh, cĩ nhiều ý kiến khác nhau được đưa ra. Các tác giả Nhật Bản cho rằng, nguồn bệnh tồn tại chủ yếu trên một số cỏ dại họ hồ thảo. Một số tác giả Trung Quốc lại cho rằng nguồn bệnh chủ yếu của bệnh là trên hạt giống. Cịn ở Việt Nam, theo nghiên cứu của bộ mơn Bệnh cây, trường ðại học Nơng nghiệp I đã kết luận: nguồn bệnh bạc lá tồn tại ở hạt giống và tàn dư cây bệnh là chủ yếu. Ngồi ra nĩ cũng bảo tồn ở dạng viên keo trên các cây cỏ dại như: cỏ lồng vực, cỏ mơi, cỏ lá tre, cỏ tranh, cỏ gừng bị, cỏ gà nước... [11]. 2.2.4. ðặc điểm di truyền liên quan đến tính gây bệnh Trong hệ thống phân loại, Xanthomonas bao gồm 3 lồi là Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xanthomonas axonopodis pv. citri, Xanthomonas campestis pv. campestris. Bộ genom của Xanthomonas oryzae pv. oryzae cĩ chiều dài xấp xỉ 5 triệu bp (4.940.217 bp), trong đĩ thành phần G+C chiếm 63.72% và vùng mã hố protein chiếm tới 84.12% [22]. Về đặc tính gây bệnh của vi khuẩn, các nghiên cứu chỉ ra rằng cĩ liên quan đến 3 nhĩm gen là: nhĩm hrp, avr và hrpX . - Nhĩm gen hrp mã hố cho hệ thống các enzyme tiết, cĩ chức năng chuyển các protein thụ thể vào tế bào cây chủ. Ở Xanthomonas oryzae pv. oryzae, nhĩm này bao gồm 27 gen khác nhau. - Nhĩm gen avr đĩng vai trị quyết định sự đặc hiệu ký sinh - ký chủ. Chúng mã hố ra các yếu tố tạo nên độc lực của vi khuẩn, giúp vi khuẩn ký sinh, gây bệnh. Xanthomonas oryzae pv. oryzae bao gồm 17 bản copy các thành viên của họ gen avrBs3/pth, một kiểu avr gene chính, được định vị trên 7 vùng khác nhau của bộ genom. - Nhĩm gen HrpX: Ở cả 3 lồi thì sự biểu hiện của nhĩm gen hrp và avr đều phụ thuộc vào sản phẩm của gen hrpG và hrpX. Một vài gen HrpX cĩ sự đồng nhất về trình tự (TTCGC…N15…TTCGC), người ta đặt tên cho nĩ là đoạn Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 9 PIP box. Vì vậy PIP box là đặc điểm để phân loại các gen HrpX. Ở lồi Xoo, các nghiên cứu đã tìm thấy cĩ 37 bản copy hồn chỉnh hoặc gần hồn chỉnh của đoạn PIP box trong vùng khởi đầu phiên mã của các gen, 5 trong số các gen đĩ nằm trong vùng của nhĩm gen hrp, cịn lại thì nằm rải rác khắp bộ genom của vi khuẩn. Họ gen avrBs2 cĩ ở cả 3 lồi, họ gen avrBs1 chỉ tìm thấy ở Xanthomonas campestis pv. campestris, cịn họ gen avrBs3/pth xuất hiện phổ biến ở lồi Xanthomonas oryzae pv. oryzae [21]. Ở lồi Xanthomonas axonopodis pv. citri thì những gen avr đều nằm trên plasmid. Cịn ở lồi Xanthomonas oryzae pv. oryzae cĩ 1 gen là thuộc họ gen avrBs2 cịn lại đa số thuộc họ gen avrBs3 và nằm trong cấu trúc genom của vi khuẩn. Ví dụ như Avrxa5 thuộc nhĩm AvrBs3, AvrXa7 cũng là một thành viên của họ gen avrBs3. AvrXa7 cĩ đặc trưng là chứa trình tự lặp ở vùng trung tâm. ðoạn sợi kép của AvrXa7 rất giàu trình tự T. Nếu xảy ra đột biến ở vùng kết thúc cĩ chứa trình tự CCC thì AvrXa7 sẽ trở thành avrXa7 (tức là gen gây độc). AvrXa21 muốn hoạt động được địi hỏi sự cĩ mặt của các gen raxA, raxB, raxC, những gen mã hố cho các thành phần của hệ thống bài tiết. Trong khi đĩ với lồi Xanthomonas campestris pv.campestris thì AvrXa21 chỉ hoạt động khi cĩ gen raxA và raxST, mã hố ra enzym sulfotransferase. Sự biểu hiện của các gen rax lại phụ thuộc vào mật độ chủng quần cũng như các gen rax chức năng khác. 2.2.5. Các chủng sinh lý Vi khuẩn bạc lá rất phong phú và đa dạng về thành phần nịi. Các nghiên cứu để phân chia các nịi thành các chủng sinh lý đều dựa trên độc tính gây bệnh của chúng trên các giống lúa khác nhau. Tuy nhiên, mỗi quốc gia lại gieo trồng các giống khác nhau vì thế để phân nhĩm và so sánh các chủng sinh lý giữa các quốc gia, các nhà khoa học của Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) và Nhật Bản xây dựng nên hệ thống các dịng lúa phục vụ cho mục Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 10 đích này. Hệ thống này bao gồm các dịng NILs được tạo ra dựa vào việc lai chuyển các gen kháng vào nền gen của 3 giống IR24, Toyonishiki và Milyang 23 [23]. Bảng 2.1. Danh sách các dịng NILs sử dụng cho nghiên cứu bệnh bạc lá Tên dịng Gen kháng Giống cho gen Giống nhận gen IR-BB1 Xa1 Kogyoku IR24 IR-BB2 Xa1,Xa2 Te-tep IR24 IR-BB3 Xa3 Chugoku 45 IR24 IR-BB4 Xa4 IR20 IR24 IR-BB5 xa5 IR1545 IR24 IR-BB7 Xa7 DV85 IR24 IR-BB8 xa8 PI231129 IR24 IR-BB10 Xa10 Cas209 IR24 IR-BB11 xa11 IR8 IR24 IR-BB12 Xa12 Kogyoku IR24 IR-BB13 xa13 BJ1 IR24 IR-BB14 Xa14 TN1 IR24 IR-BB15 xa15 M41 IR24 IR-BB16 Xa16 Te-tep IR24 IR-BB17 Xa17 Asomonori IR24 IR-BB18 Xa18 IR24 IR24 IR-BB19 xa19 XM5 IR24 IR-BB20 xa20 XM6 IR24 IR-BB21 Xa21 O. longistaminata IR24 IR-BB22 Xa22 O. minuta IR24 IR-BB23 Xa23 O. rufipogon IR24 IR-BB24 xa24 Aus295 IR24 IR-BB101 Xa1 Kogyoku Toyonishiki Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 11 IR-BB102 Xa1, Xa2 Te-tep Toyonishiki IR-BB103 Xa3 Chugoku 45 Toyonishiki IR-BB104 Xa4 IR20 Toyonishiki IR-BB105 xa5 IR1545 Toyonishiki IR-BB107 Xa7 DV85 Toyonishiki IR-BB108 xa8 PI231129 Toyonishiki IR-BB110 Xa10 Cas209 Toyonishiki IR-BB111 xa11 IR8 Toyonishiki IR-BB201 Xa1 Kogyoku Miliang 23 IR-BB202 Xa1,Xa2 Te-tep Miliang 23 IR-BB203 Xa3 Chugoku 45 Miliang 23 IR-BB204 Xa4 IR20 Miliang 23 IR-BB205 xa5 IR1545 Miliang 23 IR-BB207 Xa7 DV85 Miliang 23 IR-BB208 xa8 PI231129 Miliang 23 IR-BB210 Xa10 Cas209 Miliang 23 IR-BB211 xa11 IR8 Miliang 23 (nguồn: Ở Nhật, cĩ rất nhiều hệ thống phân loại nhĩm nịi, nhưng theo hệ thống của Noda and Ohuchi năm 1989 thì các chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae phân thành 7 nhĩm dựa vào khả năng gây bệnh trên các giống lúa khác nhau, Philippin cĩ sáu nhĩm (nhĩm I – nhĩm VI)…. Cịn ở Việt Nam, nghiên cứu thành phần nịi vi khuẩn cũng đã được tác giả Lê Lương Tề và Tạ Minh Sơn thực hiện năm 1987, dựa trên 8 dịng chỉ thị mang các gen kháng Xa2; Xa3; Xa4; xa5; Xa7; Xa10; Xa11; Xa14. Các tác giả phân các nịi thành 10 nhĩm (nhĩm I - nhĩm X). Theo những nghiên cứu gần đây của Bùi Trọng Thuỷ dựa trên 11 dịng chỉ thị mang các gen kháng Xa1, Xa2; Xa3; Xa4; xa5; Xa7; Xa10; Xa11; Xa12, Xa14, Xa21 thì thành phần nịi đã lên đến con số 13 [2]. Theo kết quả nghiên cứu của Cục Bảo vệ Thực vật về sự đa dạng di truyền một số chủng vi khuẩn gây bệnh ở miền Bắc Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 12 bằng cặp mồi XOR đặc hiệu cho thấy 47 chủng phân lập được phân chia thành 13 nhĩm nịi [3]. ðiều đĩ chứng tỏ thành phần các chủng nịi sinh thái ở miền Bắc Việt Nam rất đa dạng và phong phú. 2.3. Tính kháng bệnh bạc lá của cây trồng 2.3.1. Thuyết gen đối gen Vào khoảng những năm 1940, Harold H. Flor đã tiến hành một thí nghiệm nhằm tìm hiểu cách thức kháng bệnh ở cây trồng. Ơng cho lây nhiễm nhân tạo rất nhiều các chủng nấm gây bệnh gỉ sắt trên số lượng lớn các giống lanh khác nhau rồi đánh giá phản ứng của cây trồng với bệnh theo các mức: miễn dịch, kháng, kháng trung bình và nhiễm. Tiếp theo ơng cịn cho lai các giống lanh với nhau và lai các chủng nấm với nhau, rồi tiếp tục lây nhiễm để tìm hiểu sự tương tác giữa ký sinh và ký chủ. Qua thu thập, xử lý kết quả Flor đã kết luận rằng cả tính kháng ở cây trồng cũng như tính gây bệnh ở ký sinh đều cĩ tính di truyền. Ơng cũng phát biểu rằng, cho dù cây trồng cĩ chứa tác nhân kháng thì nĩ cũng chỉ kháng được nếu tác nhân gây bệnh tấn cơng vào chúng cĩ tác nhân đặc biệt (nay gọi là gen khơng độc). Flor cũng nhận định rằng, trong hầu hết trường hợp ơng quan sát, gen kháng ở trạng thái trội sẽ khơng bị nhiễm bệnh và gen độc ở trạng thái trội sẽ khơng độc (Flor sử dụng thuật ngữ “factor” thay vì “gene”) [26]. Dựa trên các kết quả của Flor, các nhà khoa học sau này đã đưa ra thuyết “gen đối gen” được phát biểu như sau: cứ mỗi một gen R quy định tính kháng ở giống cây ký chủ thì cĩ một gen a quy định tính độc ở nịi ký sinh, khơng trước thì sau gen độc a tương ứng này sẽ vượt qua được gen kháng R dẫn đến tình trạng nhiễm bệnh. ðồng thời, cứ mỗi một gen kháng R ở giống cây ký chủ cũng sẽ cĩ một gen A tương ứng ở ký sinh để kích hoạt cây ký chủ hình thành các phản ứng tự vệ chống lại gen A đĩ dẫn đến tình trạng khơng nhiễm bệnh. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 13 Từ kiểu gen của cây ký chủ và kiểu gen của ký sinh ta cĩ thể dự đốn được tính kháng nhiễm như sau: Kiểu gen cây ký chủ Kiểu gen ký sinh RR hoặc Rr rr AA hoặc Aa Kháng Nhiễm Aa Nhiễm Nhiễm Theo nghiên cứu của Flor, hầu hết các gen kháng đều cĩ tính trội. Một giống cây trồng mà trong hệ gen của chúng chứa những gen cĩ chức năng mã hĩa tạo ra những phân tử tiếp nhận giúp cho ký chủ nhận biết được ký sinh tấn cơng vào, từ đĩ phát động các phản ứng tự vệ khác nhau để chống lại ký sinh thì giống đĩ được gọi là cĩ gen kháng (R). Người ta phân chia gen kháng theo chức năng của chúng: gen kháng tạo ra các phân tử tiếp nhận chất cảm ứng của ký sinh; gen kháng trực tiếp tổng hợp ra các enzym để khử hoặc oxi hĩa độc tố của ký sinh; gen kháng tạo ra các chất ức chế sự phát triển của ký sinh (mã hĩa tạo ra protein cĩ trình tự các axit amin tương đồng với protein vỏ của virut…) ðối với ký sinh, chủng ký sinh nào cĩ thể gây hại được trên một giống cây ký chủ cĩ gen kháng R thì trong hệ genom của chủng đĩ phải cĩ ít nhất một gen độc a cĩ thể vượt qua được gen R, khi đĩ gen độc a được coi là gen độc tương ứng với gen kháng R. Cơ chế hoạt động của gen độc: gen độc tổng hợp ra các enzym phân giải vách tế bào của ký chủ, enzym thủy phân các hợp chất dinh dưỡng, tổng hợp ra các độc tố, tổng hợp ra các hoocmon sinh trưởng…. Ngồi ra, gen độc khơng tạo ra các chất cảm ứng mà cây trồng cĩ thể tiếp nhận được, vì thế khơng cĩ cơ chế kháng nào được phát động, kết quả cây trồng bị nhiễm bệnh. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 14 Cịn đối với những chủng ký sinh khơng gây bệnh được trên một giống cây ký chủ nào đĩ thì cĩ thể nĩi chúng chứa gen khơng độc (A) đối với giống đĩ. Cơ chế cĩ thể xảy ra như sau:  Gen quy đinh tính gây bệnh tổng hợp ra những chất khơng độc đối với giống cây ký chủ đĩ, hoặc là chất độc nhưng bị cây ký chủ ức chế nên tổng hợp khơng đủ liều lượng.  Gen quy định tính gây bệnh tổng hợp ra các chất bị giống cây ký chủ phát hiện được (gọi là chất cảm ứng) nên cây trồng sẽ phát động cơ chế kháng, kết quả ký sinh khơng thể tiếp tục phát triển và gây bệnh. Sau Flor, một số nhà khoa học cũng đã nghiên cứu về vấn đề này trên một số đối tượng khác thì thấy rằng thuyết “gen đối gen” này vẫn đúng, và từ đĩ giúp ta đưa ra một số nhận định sau về mối quan hệ ký sinh – ký chủ:  Cứ mỗi một gen kháng dọc ở cây ký chủ (cĩ 1 gen kháng) thì cĩ một gen độc tương ứng ở ký sinh cĩ khả năng vượt qua gen kháng đĩ để lây nhiễm.  Chủng ký sinh nào chỉ cĩ thể nhiễm trên cây ký chủ khơng cĩ gen kháng là chủng ký sinh khơng cĩ gen độc; ngược lại, giống nào mà bị nhiễm bởi bất kỳ chủng nào trong quần thể ký sinh đĩ là giống khơng cĩ gen kháng hay cịn gọi là giống nhiễm chuẩn.  Chủng ký sinh nào cĩ thể nhiễm trên tất cả các lồi ký chủ thì nĩ là chủng cĩ tất cả các gen độc của lồi ký sinh đĩ và là chủng độc nhất tại thời điểm đĩ; giống ký chủ nào chỉ bị nhiễm bởi một chủng ký sinh duy nhất trong quần thể ký sinh ấy sẽ là giống cĩ đầy đủ các gen kháng hiện cĩ mặt cũng tại thời điểm đĩ. Trong cuộc đấu tranh đồng tiến hĩa này, cây trồng luơn tìm cách chống lại sự xâm nhiễm của ký sinh, cịn ký sinh thì luơn biến đổi để vượt qua hàng rào bảo vệ đĩ để cĩ thể gây bệnh. Quá trình biến đổi, thích ứng trong mối Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 15 quan hệ giữa ký sinh – ký chủ luơn luơn diễn ra trong tự nhiên và khơng bao giờ ngừng nghỉ [4]. 2.3.2. Một số gen kháng ở cây trồng Việc nghiên cứu và đề xuất các biện pháp phịng trừ đối với bệnh bạc lá được triển khai rất sớm, đã cĩ nhiều biện pháp phịng trừ được đề xuất và đưa vào áp dụng, song cho tới nay bệnh này vẫn là một trong những bệnh nguy hại của ngành trồng lúa. Cho tới nay, biện pháp phịng trừ chính được dùng rộng rãi ở tất cả các vùn._.g trồng lúa là biện pháp sử dụng thuốc hĩa học. Tuy nhiên biện pháp này cũng cĩ nhiều hạn chế, hơn nữa việc lạm dụng thuốc hĩa học trong phịng trừ dịch hại đã gây ra những nguy hại mới đối với mơi trường sống, phá vỡ sự cân bằng sinh thái, gây ơ nhiễm mơi trường và tác động tới sức khỏe cộng đồng. Ngày nay, với những thành tựu đạt được trong việc phát hiện và xác định các gen kháng định tính (major genes) và các gen kháng định lượng (quantitative genes) đã đặt nền tảng cho những thành cơng trong cơng tác chọn tạo giống kháng bệnh. Khai thác và ứng dụng các giống lúa kháng bệnh trở thành một phương pháp khả thi và hữu hiệu trong cơng tác phịng trừ bệnh nĩi chung và bệnh bạc lá nĩi riêng. Cho tới nay đã cĩ rất nhiều gen kháng chính kiểm sốt bệnh bạc lá đã được xác định, định vị trên nhiễm sắc thể và lập bản đồ phân tử. Sakaguchi (1967) là người đầu tiên phát hiện ra 2 gen kháng bạc lá Xa1 và Xa2 [24]. Gen Xa4 là gen cĩ phổ kháng khá rộng ở các nước Châu Á nhiệt đới như Ấn độ, Trung quốc, Philippin và đã được Yoshimura và cs. (1992) định vị trên NST 11 nhờ vào chỉ thị RFLP G181, sau này được Li và cs. (1999) lập bản đồ nằm giữa 2 chỉ thị RZ536 và G2132b [27]. Nhưng hiện nay với sự hình thành nịi mới, gen này đã khơng cịn tác dụng như trước nữa (Mew.T.W 1992) [18]. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 16 Theo Chen và cs. (2002) đã cĩ 25 gen kháng chính kiểm sốt tính kháng bạc lá, 30 gen kháng đạo ơn và 12 gen kháng rầy nâu [13]. Theo nghiên cứu của Jicar (2003) đã cơng bố thì các gen kháng bạc lá được phát hiện nằm trên các nhiễm sắc thể (NST) khác nhau: trên NST11 cĩ gen Xa21, Xa4, Xa3, Xa10; trên NST5 cĩ gen xa5; Xa8, xa13 nằm trên NST8; Xa7 nằm trên NST6. Theo Babu và cs. (2004) đã cĩ 27 gen kháng bạc lá đã được xác định và một số gen trong số đĩ đã được chuyển vào các giống lúa đang gieo trồng bằng phương pháp chọn giống truyền thống. Chu và cs. (2005) đã lập được bản đồ gen xa13 với chiều dài là 14.8 kb và cĩ 4 chỉ thị liên kết chặt với gen này đã được thiết kế là: E6a, SR6, ST9, SR11 [14]. Cũng theo Chu và cs. (2005) đã cĩ 30 gen kháng chính kiểm sốt tính kháng của cây chủ đối với các nịi vi khuẩn bạc lá khác nhau đã được phát hiện và xác định, trong đĩ cĩ 21 gen trội và 9 gen lặn được ký hiệu từ Xa1 đến Xa29, trong đĩ cĩ 5 gen kháng bạc lá (Xa1, xa5, Xa21, Xa26 và Xa27) đã được phân lập, đánh giá và bắt đầu được sử dụng trong nghiên cứu chuyển gen. Theo Khush và cs. (2007), cho đến nay các nhà khoa học đã phát hiện được hơn 30 gen kháng trên các giống lúa trồng và lúa hoang. Mười một trong số đĩ là gen lặn bao gồm: xa5, xa5(t), xa8, xa13, xa15, xa19, xa20, xa24, xa28, xa31 và xa32. Cĩ 6 gen đã được tách dịng là: Xa1, xa5, xa13, Xa21 Xa26 và Xa27. Trong tất cả các gen kháng bạc lá thì cĩ 3 gen kháng đã được cơng bố và lập bản đồ định vị trên NST6. Gen đầu tiên là Xa7, là gen trội được xác định trên giống lúa DV85 và DV87. Gen thứ hai là Xa27, được phát hiện trên giống lúa hoang O. minuta và đã được tách dịng sau đĩ khơng lâu. Gen cuối cùng là gen lặn xa32, phát hiện trên giống lúa hoang O. barthii, được định vị trên vai ngắn của NST6 [18]. Các gen kháng nĩi trên đã được nghiên cứu và định vị trên nhiễm sắc Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 17 thể khác nhau, nhiều gen cũng đã được lập bản đồ ở mức độ phân tử. Những kết quả nghiên cứu này là các cơng cụ hữu hiệu cho chương trình chọn giống nhờ chỉ thị phân tử, tạo điều kiện đáng kể cho việc khai thác và sử dụng gen kháng một cách cĩ hiệu quả. 2.4. Các loại chỉ thị di truyền 2.4.1. Chỉ thị hình thái Chỉ thị hình thái là các chỉ thị chọn lọc dựa trên các tính trạng hình thái biểu hiện ra bên ngồi. Về nguyên tắc, một tính trạng hình thái nào đĩ do 1 gen kiểm sốt mà sự biểu hiện của nĩ khơng bị ảnh hưởng nhiều do tác động của mơi trường thì cĩ thể được dùng làm chỉ thị chọn lọc [5]. Ví dụ, ở lúa, gen quy định tính kháng rầy nâu liên kết chặt với gen quy định màu tím của bao lá mầm. Vì vậy, tính trạng bao lá mầm màu tím là chỉ thị hình thái để chọn lọc tính kháng rầy nâu [17]. Tuy nhiên, chỉ thị hình thái khơng được áp dụng nhiều do chúng cĩ các mặt hạn chế sau: - Số lượng các loại chỉ thị hình thái được tìm thấy khơng nhiều. - Sự biểu hiện của chúng ít nhiều vẫn phụ thuộc vào điều kiện mơi trường, gây khĩ khăn cho việc đánh giá. - Một số chỉ thị là đột biến cĩ hại hoặc liên kết với các gen quy định các tính trạng khơng tốt. - Chỉ xuất hiện ở một số giai đoạn nhất định trong quá trình phát triển của cơ thể. 2.4.2. Chỉ thị hố sinh (chỉ thị protein) Chỉ thị protein là các chỉ thị chọn lọc dựa vào các phân tử protein. Như ta đã biết, protein là sản phẩm của gen. Các alen khác nhau của gen sẽ tạo ra các pr cĩ thành phần axit amin khác nhau. Thơng thường, chỉ thị protein là các chỉ thị izozym. Các izozym cĩ thể được phân biệt bằng phương pháp diện di Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 18 trên gel tinh bột. Do các enzym xúc tác cho những phản ứng đặc hiệu vì vậy khi đưa cơ chất của enzym, cofactor (nhân tố tác động) và chất tạo phản ứng màu với sản phẩm mới tạo thành của phản ứng enzym thì ta cĩ thể định vị enzym trên gel. Các băng thấy được từ các enzym đặc hiệu đặc trưng cho các sản phẩm protein và nĩ cĩ thể cung cấp thơng tin di truyền như các chỉ thị đồng trội. Trước khi các chỉ thị ADN được phát minh, các izozym được sử dụng phổ biến cho cả động vật và thực vật, cho đến nay chỉ thị này vẫn được sử dụng kết hợp với các chỉ thị ADN. Tuy nhiên, hạn chế của loại chỉ thị này là các izozym phụ thuộc vào sự biểu hiện của gen và chỉ cĩ thể phát hiện được ở từng giai đoạn phát triển riêng biệt 2.4.3. Chỉ thị phân tử (chỉ thị ADN) Chỉ thị phân tử (CTPT) là các chỉ thị chọn lọc trực tiếp dựa trên cấu trúc phân tử ADN. Số lượng các chỉ thị ADN là rất lớn. Cây trồng cĩ khoảng 108 – 1010 nu trong ADN tổng số và vì thế, nếu giữa 2 cá thể chỉ cần cĩ sự sai khác nhỏ thì giữa chúng sẽ cĩ một số lượng khổng lồ các chỉ thị ADN để phân biệt sự sai khác đĩ. Theo lý thuyết, một chỉ thị ADN lý tưởng phải đáp ứng đầy đủ các yêu cầu sau: - Cho đa hình cao - Di truyền đồng trội - Xuất hiện nhiều trong genom - Tập tính chọn lọc trung tính - Dễ tiếp cận - Phân tích nhanh, dễ dàng - Tuy nhiên, gần như khơng thể tìm được 1 CTPT nào cĩ thể thoả mãn được tất cả các yêu cầu trên. Tuỳ thuộc vào từng nghiên cứu mà người ta sử dụng hệ thống các chỉ thị phù hợp cho mục đích của mình [6]. Các CTPT được phân loại dựa trên phương pháp thực hiện với chúng bao gồm: chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN và chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 19 2.4.3.1. Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN (chỉ thị RFLP) RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism – ða hình chiều dài đoạn phân cắt giới hạn). Khi ADN nhân được cắt bởi 1 enzym giới hạn đặc hiệu nào đĩ, nĩ sẽ sản sinh ra hàng triệu đoạn cắt xếp liên tục cạnh nhau theo kích thước khi điện di. Nếu như đưa các đoạn cắt trên gel đã điện di này nhuộm mầu và soi dưới tia UV, mắt người sẽ chỉ nhìn thấy điện di đồ như một dải mây. Vì vậy, cho dù sự sai khác của các đoạn cắt này là cĩ thật thì mắt người cũng khĩ cĩ thể nhận ra sự sai khác rất nhỏ đĩ. ðể khắc phục nhược điểm này, trong kỹ thuật RFLP, người ta lấy một đoạn ADN nào đĩ từ thư viện mẫu đã nhân dịng sử dụng làm mẫu dị nhằm phát hiện ra trình tự nu tương ứng cĩ mặt trên băng điện di. Tiến hành phản ứng lai Southern Blot, so sánh sự hiện diện của các vị trí lai ta sẽ nhận biết được tính đa hình của các đoạn cắt [7]. Kỹ thuật RFLP cho phép: - Phát hiện được sự cĩ mặt của các gen cần tìm trong hệ gen của sinh vật nghiên cứu - Phát hiện sự đa dạng ADN của các cá thể khác nhau - Phát hiện các đột biến - Phát hiện các thể lai soma qua dung hợp tế bào trần - Lập bản đồ giới hạn của một gen Các chỉ thị RFLP được sử dụng đầu tiên trong việc lập bản đồ di truyền và là các chỉ thị đồng trội. Tuy nhiên, ngày nay phương pháp RFLP khơng cịn được sử dụng nhiều trong những nghiên cứu thơng thường do chúng cĩ nhược điểm: địi hỏi khối lượng lớn ADN của mỗi cá thể; số lượng băng cho đa hình ít; tốn nhiều thời gian và cơng sức [8]. 2.4.3.2. Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN (chỉ thị PCR) Chỉ thị PCR là các chỉ thị giúp phát hiện sự đa hình ADN dựa trên cơ sở nhân bản các đoạn ADN với số lượng lớn nhờ PCR (Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp polymerase). Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 20 Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNAs – ða hình các đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên). Phương pháp RAPD được William, Welsh, Mc Clelland đề xuất vào năm 1990. Phương pháp này thực chất là quá trình nhân bản các đoạn ADN bằng kỹ thuật PCR cĩ sử dụng các mồi được thiết kế ngẫu nhiên (thơng thường cĩ chiều dài từ 6 – 10 nu). Các mồi này sẽ bắt cặp một cách ngẫu nhiên vào ADN khuơn ở vị trí bất kỳ nào mà tại đĩ cĩ trình tự bổ sung với nĩ. Sự đa hình phát hiện được cĩ thể là do sự thay đổi nu ở vị trí gắn mồi hoặc sự thêm hay mất nu nằm trong vùng khuyếch đại (William và cs., 1990; Parks và cs., 1991). Do đĩ, đa hình RAPD thường là trội, biểu hiện sự cĩ mặt hay vắng mặt của 1 sản phẩm khuyếch đại từ 1 locut đơn. Ưu điểm chính của chỉ thị này là khơng địi hỏi thơng tin về trình tự ADN; kỹ thuật đơn giản, rẻ tiền và nhiều chỉ thị cĩ thể được phát hiện trong thời gian ngắn. Do vậy, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong việc lập bản đồ di truyền, phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các thứ cây trồng hay giữa các giống, các cá thể để phục cho cơng tác lai tạo hoặc phân loại. Chúng cũng được sử dụng như những CTPT để xác định những kiểu gen kiểm sốt hoặc cĩ liên quan đến một tính trạng nào đĩ ở cây trồng, ví dụ như tính trạng chất lượng sợi ở cây bơng; tính kháng bệnh virut ở bơng, cà chua. Ngồi các ưu điểm, các chỉ thị RAPD cũng tồn tại một số nhược điểm nhất định [15]. Ưu điểm Nhược điểm - Cho kết quả nhanh - Nhạy cảm cao với những thay đổi nhỏ - Khơng cần thơng tin về trình tự đoạn yêu cầu - Khĩ cĩ thể cho ra một kết quả giống nhau trong những lần tiến hành khác nhau Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 21 - Chỉ cần một lượng nhỏ ADN tổng số - Là chỉ thị trội nên khơng thể phân biệt được kiểu gen dị hợp tử - Cĩ thể được tìm thấy vơ số trong hệ gen - Khơng sử dụng được cho các lồi gần giống nhau. - ða hình cao - Giá rẻ - Thường xuất hiện trên nhiều locut - Cĩ thể tiến hành tự động hố Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - ða hình chiều dài các đoạn ADN được khuyếch đại) Phương pháp AFLP được Zabeau và Vos cùng cộng sự đề xuất vào những năm 1993, 1995. Bản chất của phương pháp này là sử dụng kỹ thuật PCR để nhân bản các đoạn ADN đã được cắt bởi enzym giới hạn. Khâu then chốt của kỹ thuật này là việc thiết kế các mồi đặc trưng. ðể thiết kế được các mồi đặc trưng, trước hết ADN của mẫu nghiên cứu được cắt bởi các enzym giới hạn, thường dùng đồng thời 2 enzym giới hạn (ví dụ EcoRI và MseI). Kết quả sau khi xử lý enzym, ADN sẽ bị cắt thành nhiều đoạn với kích thước khác nhau nhưng trình tự nu ở 2 đầu là giống nhau và đã xác định. Dựa vào trình tự đã biết ở hai đầu cắt, người ta cĩ thể thiết kế các đoạn gắn (adaptor) và gắn chúng vào các đầu cắt. Tiếp đĩ, dựa vào trình tự adaptor ta cĩ thể thiết kế các mồi gồm 2 phần: phần trình tự bổ sung với adaptor và phần bổ sung với các nu tuỳ ý (thường từ 1- 3 nu). Với mồi thiết kế như trên, chỉ cĩ các đoạn ADN cĩ trình tự 2 đầu bắt cặp với trình tự mồi mới được nhân bản. Kỹ thuật này được đánh giá là nhanh chĩng và cĩ hiệu quả trong việc xác định tính đa dạng ở cây trồng, tách dịng và lập bản đồ phân tử. Ưu, nhược điểm: Ưu điểm Nhược điểm - Chỉ cần một lượng nhỏ ADN tổng số - Yêu cầu kỹ thuật cao Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 22 - Khơng cần thơng tin về trình tự đoạn yêu cầu - Là chỉ thị trội - Cĩ thể tiến hành tự động hố - Cĩ thể phù hợp với nhiều mục đích khác nhau: nghiên cứu đa dạng, lập bản đồ, nhân dịng gen… Chỉ thị Microsatellite (Chỉ thị vi vệ tinh) ðây là nhĩm các chỉ thị được thiết kế dựa trên những trình tự lặp lại, cĩ kích thước khác nhau, đặc trưng cho lồi thuộc hệ sinh vật Eukaryote, chúng bao gồm các loại sau: - SSR: Simple Sequence Repeats - STR: Short Tandom Repeats - SSLP: Single Sequence Length Polymorphisms Trình tự lặp lại thường gồm từ 2 – 5 nu, ví dụ như (TG)n, (AAT)n…. Ở thực vật, trình tự AT/TA được lặp lại nhiều nhất sau đĩ đến GA/CT (Mohan và cs., 1997). Trên lúa người ta đã phát hiện các nhĩm GA, GT, AT, GGT được lặp lại rất nhiều, trong khi ở động vật thì lại phổ biến là trình tự CA/GT (Zhao và Ganal, 1996). Các đoạn ADN nhắc lại này cĩ trình tự hai đầu rất đặc trưng nên được sử dụng để thiết kế mồi cho PCR. Do cĩ sự sai khác về kích thước giữa các đoạn lặp lại nên kỹ thuật này rất thích hợp cho nghiên cứu đa hình, lập bản đồ và phân lập gen. Trong các nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng sâu bệnh gần đây (bạc lá, rầy nâu, đạo ơn…) người ta sử dụng rất nhiều nhĩm mồi này và được gọi là các mồi RM (Rice Microsatellite), hiện nay cĩ hàng nghìn các mồi RM đã được thiết kế dựa trên các thơng tin về trình tự hệ gen của cây lúa phục vụ cho cơng tác nghiên cứu. Ưu, nhược điểm: Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 23 Ưu điểm Nhược điểm - Nhanh chĩng - ðặc trưng lồi - ða hình cao - Chỉ cần một lượng nhỏ ADN tổng số - ðịi hỏi phịng TN cĩ trình độ cao để thiết kế mồi - Tính nghiêm ngặt - Chỉ thị đồng trội - Cĩ thể tiến hành tự động hố Chỉ thị STS (Sequence Tagged Site - ðiểm mục tiêu đã biết trình tự) STS là một đoạn ADN ngắn gồm khoảng 60 – 1000 bp. Kỹ thuật này do M. Olson và cộng sự đề xuất năm 1989 và được ứng dụng trong nghiên cứu lập bản đồ gen người. Hai đoạn mồi được thiết kế dựa trên các trình tự nu đã biết giúp ta xác định được vùng ADN cần tìm kiếm. Các đoạn mồi STS thường chứa khoảng 20 nu nên cĩ tính đặc hiệu cao. Mỗi một STS được xác định tại một điểm trên bản đồ như là một mốc trong genom. Ở cây lúa, các STS được coi như là mốc chuẩn và người ta đã xác lập được các STS liên kết với một số gen kháng sâu bệnh. Kỹ thuật này cũng rất thuận lợi cho việc nghiên cứu mối quan hệ họ hàng giữa các lồi. STS cịn là tiền đề cho phép chúng ta chuyển đổi bản đồ di truyền thành bản đồ vật lý [1]. Ngồi ưu điểm là cĩ tính chính xác cao thì nhược điểm lớn nhất của loại chỉ thị này là cần phải cĩ được thơng tin về trình tự của đoạn nghiên cứu. Với tính kháng bạc lá ở cây lúa, một số marker STS liên kết với gen kháng bạc lá đã được tìm thấy, phục vụ rất hữu ích cho cơng tác chọn tạo giống kháng. Yoshimura và cs. (1992) đã tìm được marker Npb235 liên kết với gen Xa1 với khoảng cách 3.3cM; liên kết với gen Xa2 với khoảng cách 3.4cM; Npb181 liên kết với gen Xa3 với khoảng cách 2.3cM; Npb78 và Npb181 liên kết với gen Xa4 với cùng khoảng cách 1.7cM. McCouch và cs. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 24 (1991) cũng đã phát hiện ra marker RG556 liên kết với gen kháng xa5 với khoảng cách rất gần (0-1cM). Marker RZ28 và RG136 liên kết với gen lặn xa13 ở khoảng cách lần lượt 5.1cM và 3.8cM (Zhang và cs., 1994). Gen kháng Xa21 liên kết rất chặt (khoảng cách từ 0-1cM) với các marker pTA248, pTA818 và RG103 (Ronald và cs., 1992) [16]. Chỉ thị RGA (Resistance Gene Analog - Vùng tương đồng gen kháng) Khi so sánh trình tự ADN của những gen kháng đã phân lập từ nhiều lồi thực vật khác nhau, các nhà khoa học đã phát hiện ra rằng những gen này cĩ chung những vùng nhắc lại giàu leucine (LRR - Leucine Rich Repeat), vùng vị trí liên kết nu (NBS – Nucleotide Binding Site) và vùng protein kinaza (PK) [14]. Những vùng này đã được sử dụng trong việc xây dựng một kỹ thuật dựa trên PCR, đĩ là kỹ thuật RGA. Bản chất của kỹ thuật RGA là những cặp mồi được xây dựng dựa vào những vùng bảo tồn nằm trong gen kháng. Bởi vậy mà sản phẩm nhận dạng ADN cĩ thể là một vùng hoặc tồn bộ gen kháng. Kỹ thuật này đã được dùng để tách gen kháng, lập bản đồ gen kháng, mơ tả đa dạng di truyền. 2.5. Phương pháp MAS Việc sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu di truyền và phục vụ cho cơng tác chọn giống cây trồng đang được nhiều phịng thí nghiệm trên thế giới triển khai rộng rãi. Nhiều bản đồ phân tử cùng vị trí các gen kiểm sốt các tính trạng khác nhau đã được định vị thay thế cho những phương pháp đánh giá theo hình thái cổ điển thơng thường. Các nhà khoa học ở Trường ðHTH Cornel (Mỹ) là những người đầu tiên định vị hàng loạt các chỉ thị phân tử RFLP trên bản đồ di truyền ở lúa. Trong chương trình genom lúa do Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 25 Nhật chủ trì, các nhà khoa học đã phát hiện và tách dịng hơn 3000 đoạn ADN bổ trợ. ðến nay đã cĩ khoảng vài chục nghìn chỉ thị vi vệ tinh ở lúa đã được phát hiện và thiết kế, trong đĩ cĩ nhiều chỉ thị liên kết với gen cĩ ý nghĩa kinh tế quan trọng. Hiện nay cĩ khoảng trên 30 gen chính kháng bệnh bạc lá, 30 gen kháng đạo ơn, 12 gen kháng rầy nâu và một số QTL kháng đạo ơn và rầy nâu đã được phát hiện. Ngồi ra gen thơm của giống Jasmin, gen điều khiển tính trạng hạt dài, gen điều khiển thời gian sinh trưởng và nhiều gen và QTL cĩ liên quan đến các tính trạng khác của cây lúa như chịu hạn, chịu mặn, chịu độc nhơm, chịu thiếu phốt-pho, bất dục đực nhân nhậy cảm quang chu kỳ, bất dục đực nhân nhậy cảm nhiệt độ, gen tương hợp rộng... cũng được phát hiện hay được lập bản đồ phân tử để đưa vào sử dụng trong chọn giống. Ngồi ra, thơng qua việc đánh giá đa dạng di truyền và khoảng cách di truyền, CTPT cịn giúp các nhà chọn giống xác định gián tiếp các cặp lai cĩ khả năng cho ưu thế lai. Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của chỉ thị phân tử, một quy trình cơng nghệ chọn giống mới được ra đời, đĩ là quy trình chọn giống nhờ chỉ thị phân tử. Thơng thường, trong quy trình chọn tạo giống truyền thống, người ta đưa nguồn gen mới cĩ tính trạng mong muốn vào 1 giống khác bằng phương pháp hồi giao liên tục qua 5-6 thế hệ, hoặc chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly từ thế hệ F2 đến các thế hệ tiếp theo. Mỗi gen chính thường chỉ kháng được với một chủng gây bệnh hoặc nịi gây hại nào đĩ, do vậy nếu quy tụ được vài gen kháng vào một dịng hoặc giống lúa thì sẽ tạo ra được một dịng lúa kháng được với nhiều chủng hoặc nịi gây hại. Như vậy muốn tạo ra giống lúa kháng bền vững với dịch hại, người ta phải đưa được vài gen kháng hiệu quả cao vào "genom đích". Bằng phương pháp chọn giống truyền thống, việc đưa gen lặn vào tổ hợp lai, hoặc du nhập cùng một lúc vài gen mong muốn vào "genom đích" (quy tụ nhiều gen vào một dịng ưu việt) thường gặp rất nhiều khĩ khăn hoặc đơi khi khơng thể thực hiện được (Mohan và cs., 1997) [21]. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 26 Cịn đối với quy trình MAS, nguồn gen mới nhập được phát hiện gián tiếp thơng qua các chỉ thị phân tử liên kết chặt với những gen đĩ. Như vậy chọn giống nhờ chỉ thị phân tử, khi phối hợp với chọn giống truyền thống, tỏ ra rất hiệu quả, tiết kiệm cơng sức và rút ngắn đáng kể thời gian tạo giống. Những nước cĩ nền khoa học phát triển như Mỹ, Nhật, Úc... và Viện Lúa Quốc tế đặc biệt quan tâm đến cơng nghệ MAS. Cơng nghệ MAS đã được ứng dụng thành cơng trong việc chọn tạo cây cho gỗ chất lượng cao làm nguyên liệu giấy. Ở lúa, MAS đã được ứng dụng với các gen kháng bệnh bạc lá, đạo ơn và 1 số gen quy định tính trạng khác. Bằng phương pháp chọn tạo giống truyền thống đã cĩ nhiều dịng/giống lúa mang gen kháng đơn được tạo ra và đưa và sản xuất. Song những dịng/giống này nhanh chĩng bị nhiễm trở lại do: (1) Mỗi một gen kháng chính thường chỉ kháng được một hoặc một vài nịi hoặc nhĩm nịi gây bệnh, trong khi đĩ thành phần của quần thể gây hại lại rất đa dạng và phong phú và luơn biến động theo điều kiện của mơi trường và theo các vùng sinh thái; (2) Bản thân nịi gây hại dưới áp lực của chọn lọc (sử dụng giống lúa kháng) cũng phát sinh đột biến để thích ứng sản sinh ra các chủng nịi mới. Như vậy một yêu cầu đặt ra là phải tạo được giống cĩ tính kháng bền vững, cĩ nghĩa là “tính kháng của giống được duy trì cĩ hiệu quả khi giống được gieo trồng trên diện rộng và lâu dài”, hay nĩi một cách khác giống phải cĩ phổ kháng rộng. Muốn vậy một trong những hướng tạo giống kháng bền vững là đưa được vài gen kháng chính vào genom đích, hay cịn gọi là phương pháp quy tụ gen (pyramiding genes). ðể tạo được một giống được qui tụ hai và nhiều hơn số gen kháng trong kiểu bằng phương pháp chọn lọc truyền thống thơng qua chọn lọc kiểu hình là rất khĩ khăn vì sự biểu hiện tương tác giữa các gen. Sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết gần với các gen kháng cĩ thể nhận biết và xác định được cá thể mang nhiều hơn một gen kháng trong một quần thể phân ly. Việc sử dụng CTPT trong nghiên cứu di Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 27 truyền và phục vụ cho cơng tác chọn giống cây trồng đang được nhiều phịng thí nghiệm trên thế giới triển khai. Nhiều bản đồ và CTPT liên kết với các gen kiểm sốt cho tất cả các tính trạng như: chống chịu sâu bệnh, gen chống chịu bất dục đực, gen tương hợp rộng....đã và đang được xác định và sử dụng ngày càng nhiều và cĩ hiệu quả trong chọn tạo giống. Việc lập bản đồ chi tiết các chỉ thị liên kết chặt với các gen kháng tạo điều kiện vơ cùng thuận lợi cho cơng tác chọn giống. MAS là một phương pháp chọn giống rất hiệu quả, bởi chúng chọn lọc trực tiếp những chỉ thị liên kết với tính trạng mục tiêu hoặc những tính trạng số lượng. Một số gen kháng bệnh bạc lá đã được tìm ra nhờ chỉ thị phân tử. Yoshimura và cộng sự (1995) đã chọn được các dịng lúa mang gen Xa4 + xa5 và Xa4 + Xa10 bằng cách sử dụng chỉ thị RFLP và RAPD liên kết với các gen kháng bạc lá. Các dịng mang gen Xa4 + xa5 kháng với những nịi thuộc nhĩm 4 tốt hơn bố mẹ chúng. Huang và cs. (1997) đã sử dụng MAS để quy tụ 4 gen kháng bạc lá là Xa4, xa5, xa13, và Xa21 vào IR24. Sanchez và cs. (1997) sử dụng chỉ thị STS để quy tụ 3 gen kháng vào dịng lúa ưu tú [25]. Những dịng quy tụ 3 đến 4 gen kháng khác nhau sẽ cĩ phổ kháng rộng hơn những dịng mang đơn gen kháng và thời gian tồn tại tính kháng sẽ lâu hơn. Singh và cs. (2001) cũng sử dụng MAS để quy tụ các gen kháng bạc lá vào giống lúa Indica nhiễm bạc lá nhưng cĩ năng suất cao là PR106 tạo nên giống mới vừa cĩ năng suất cao vừa cĩ khả năng kháng bền và kháng rộng với bệnh bạc lá [26]. Gen Xa7 và Xa21 cũng đã được Zhang và cs. (2006) quy tụ vào các giống lúa lai nhằm tăng cường tính kháng cho chúng [30]. ðể tạo thêm điều kiện cho cơng tác nghiên cứu và chọn tạo giống lúa kháng bạc lá, tại IRRI một hệ thống các dịng mang đơn gen kháng bạc lá được tạo ra. Ngồi ra bằng phương pháp qui tụ gen tại IRRI, các dịng mang 2, 3 gen kháng cũng đã được tạo ra – đây là nguồn cây cho gen (donor) rất thiết thực trong cơng tác qui tụ và tạo giống kháng bền vững. Cũng bằng Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 28 phương pháp MAS đã cĩ rất nhiều giống và dịng mang gen kháng được tạo ra tại nhiều nước gieo trồng lúa, trong số đĩ đã cĩ những thành tựu chuyển gen kháng bạc lá vào các dịng bố mẹ để tạo giống lúa lai cao sản. Tại Trung Quốc, một số nghiên cứu đã sử dụng phương pháp MAS để chuyển thành cơng hai gen Xa21 và Xa4 vào dịng phục hồi Minghui 725 cho tổ hợp lúa lai Shuhui 207. Chen và cs. (2000) sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết với gen Xa21 là pTA21 và AB9 để chuyển thành cơng gen Xa21 vào dịng phục hồi Minghui63 (tổ hợp lúa lai Shanyou 63) [13]. Cũng tương tự, các tác giả cũng đã thu được dịng phục hồi Minghui 63 mang tổ hợp gen kháng bạc lá (Xa21) và gen Bt kháng sâu, dịng Minghui 63 mang hai gen kháng đạo ơn Pi-1(t) và Pi-2(t), dịng Minghui 63 mang hai gen kháng rầy nâu. Loida và cs. của Viện nghiên cứu lúa Philippin đã chuyển thành cơng các gen Xa21, Xa4, Xa7 vào lúa lai hai dịng TGMS1. Với sự phát triển của lúa lai hai dịng trong những năm gần đây, các nhà chọn tạo giống cũng đã quan tâm tới việc cải tiến và nâng cao tính kháng bệnh bạc lá cho lúa lai hệ hai dịng này bằng phương pháp MAS. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 29 PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ðịa điểm và thời gian nghiên cứu Các thí nghiệm phục vụ cho luận văn này được thực hiện tại các địa điểm sau: - Phịng thí nghiệm Bộ mơn Sinh học phân tử, Viện Di truyền Nơng nghiệp. - Khu nhà lưới thí nghiệm Trung tâm chuyển giao cơng nghệ và khuyến nơng, Viện Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam. Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 01/2010 đến tháng 6/2010. 3.2. ðối tượng và vật liệu nghiên cứu 3.2.1. ðối tượng nghiên cứu Một số dịng NILs mang đơn gen kháng và đa gen kháng (nguồn từ IRRI và đang được lưu giữ tại Bộ mơn Sinh học phân tử). Các dịng lúa triển vọng mang gen kháng bạc lá (thuộc đề tài: “Chọn tạo giống lúa thuần kháng bệnh bạc lá bằng cơng nghệ chỉ thị phân tử”) đã được các cán bộ thuộc Bộ mơn Sinh học phân tử chọn lọc được bằng phương pháp MAS. 3.2.2. Vật liệu nghiên cứu a/ Một số dịng/giống lúa Một số dịng NILs mang đơn gen kháng bạc lá: IRBB1, IRBB2, IRBB3, IRBB4, IRBB5, IRBB7, IRBB10, IRBB11, IRBB13, IRBB14, IRBB21. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 30 Bảng 3.1. Danh sách nguồn gốc các dịng NILs mang đơn gen kháng bạc lá Tên dịng Gen kháng NST Giống cho gen Giống nhận gen Tác giả IRBB1 Xa1 4 Kogyoku IR24 Sakaguchi, 1967 IRBB2 Xa2 4 Te-tep IR24 Sakaguchi, 1967 IRBB3 Xa3 11 Chugoku 45 IR24 Ezuka et al. 1975 IRBB4 Xa4 11 IR20 IR24 Petpisit et al. 1977 IRBB5 xa5 5 DZ192 IR24 Sidhu et al. 1978 IRBB7 Xa7 6 DV85 IR24 Sidhu et al. 1978 IRBB10 Xa10 11 Cas 209 IR24 Yoshimura et al. 1983 IRBB11 Xa11 11 IR8 IR24 Ogawa et al. 1991 IRBB13 xa13 8 BJ1 IR24 Ogawa et al. 1987 IRBB14 Xa14 8 TN1 IR24 Taura et al. 1987 IRBB21 Xa21 11 O.longistaminata IR24 Khush et al. 1990 Một số dịng NILs mang nhiều gen kháng (đặc biệt là các tổ hợp chứa các gen kháng quan trọng Xa4, xa5, Xa7, xa13, Xa21): IRBB52, IRBB54, IRBB55, IRBB59, IRBB60, IRBB61, IRBB62, IRBB63, IRBB65. Giống lúa Hương cốm cho năng suất cao, chất lượng gạo ngon nhưng lại nhiễm nặng bệnh bạc lá, được sử dụng làm giống nhận gen trong lai quy tụ tạo các dịng/giống kháng. 10 dịng chọn lọc từ tổ hợp lai giữa Hương Cốm với IRBB62: 2.18.1, 2.18.2, 2.18.3, 2.18.4, 2.18.5, 2.19.1, 2.19.2, 2.19.3, 2.19.4, 2.19.5. 26 dịng chọn lọc từ tổ hợp lai giữa Hương Cốm với IRBB63: 2.7.1 (TT), 2.7.2 (TT), 2.7.3 (TT), 2.7.2, 2.7.3, 2.7.4, 2.7.5, 2.7.6, 2.7.7, 2.7.8, Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 31 2.7.4.1, 2.7.4.2, 2.7.4.3, 2.7.4.4, 2.7.6.1, 2.7.6.2, 2.7.6.3, 2.7.6.4, 2.8.2, 2.8.3, 2.8.4, 2.8.5, 2.8.6, 2.8.7, 2.8.8, 2.8.9. b/ Cặp mồi nhận biết chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng Xa4 và Xa7: Cặp mồi MP được thiết kế đặc hiệu để nhận biết chỉ thị liên kết với gen Xa4 và P3 được thiết kế đặc hiệu để nhận biết chỉ thị liên kết với gen Xa7. Dưới đây là một số thơng tin chi tiết về hai cặp mồi này. Bảng 3.2. Danh sách hai cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu Cặp mồi Tác giả Gen liên kết Trình tự Kt. đoạn khuyếch đại MP Mabo Jun (1999) Xa4 5’-ATC GAT CGA TCT TCA CGA GG -3’ 5’-TG CTA TAA AAG GCA TTC GGG -3’ 150/120 bp P3 Poter and white KSU Xa7 5’-CAG GAA TTG ACT GGA GTA GTG GTT-3’ 5’-CAT CAC GGT CAC CGC CAT ATC GGA-3’ 300/250 bp (Chú thích: K.t - Kích thước) c/ Vi khuẩn: Các isolate vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu được phân lập tại phịng thí nghiệm của Bộ mơn Sinh học phân tử, Viện Di truyền Nơng nghiệp, thời điểm phân lập năm 2009. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 32 Bảng 3.3. Danh sách các isolate vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu STT Ký hiệu isolate Phân lập trên giống ðịa điểm thu thập mẫu bệnh 1 Is1 Nếp DT22 Hải Dương 2 Is2 Nếp Sơn La 3 Is3 Khang dân Bắc Ninh 4 Is4 Tạp giao 1 Hà Nam 5 Is5 C70 Lào Cai 6 Is6 Xi6 Bắc Ninh 7 Is7 Bắc thơm Thái Bình 8 Is8 Nếp cái Hưng Yên 9 Is9 Nếp cái Hưng Yên 10 Is10 Nếp ngố Hưng Yên 11 Is11 Tám thơm Hà Nội 12 Is12 TH33 Hà Nội 13 Is13 Q5 Vĩnh Phúc 14 Is14 Nếp cái Hưng Yên 15 Is15 Khang dân Hà Nội 16 Is16 VL50 Hà Nội 17 Is17 N46 Bắc Ninh 18 Is18 N46 Bắc Ninh 19 Is19 Tẻ đỏ Hà Nội 20 Is20 Nếp tẻ Hưng Yên Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ............ 33 3.3. Nội dung nghiên cứu 3.3.1. ðánh giá phổ kháng nhiễm bạc lá của các dịng NILs mang các đơn gen kháng khác nhau và phân nhĩm 20 isolate vi khuẩn bạc lá Chúng tơi sử dụng 20 isolate vi khuẩn phân lập được để lây nhiễm các dịng lúa chỉ thị với mục đích: đánh giá vai trị của các gen kháng, phân nhĩm các isolate vi khuẩn và dựa vào độ độc tính để lựa chọn các isolate đại diện lây nhiễm trên các dịng triển vọng. Các cơng việc cần làm: - Gieo trồng các dịng NILs mang đơn gen kháng bạc lá. - ðánh giá phổ kháng nhiễm bạc lá của các dịng NIL. - Phân nhĩm 20 isolate vi khuẩn bạc lá, lựa chọn các isolate đại diện. 3.3.2. Khảo sát giá trị kháng của các gen kháng và phối hợp các gen kháng bạc lá Các dịng NILs sử dụng trong nội dung nghiên cứu: - Dịng IRBB4 mang gen Xa4; - Dịng IRBB5 mang gen xa5; - Dị._.