Đánh giá sự biến đổi hoạt độ enzym của hỗn hợp Papain và Amylase dạng bột và dạng dung dịch trong điều kiện lão hoá cấp tốc

em xuống còn một nửa, nhưng giá trị dinh dưỡng không hề thay đổi và hiệu quả hấp thu tăng lên [14]. Trong thời gian qua nhờ thành tựu phát triển của khoa học đặc biệt là dược học, các nghiên cứu sâu về ứng dụng của các enzym cũng được phát triển. Ngoài tác dụng thuỷ phân tinh bột và protein, hai enzym này còn có tác dụng chống viêm, làm sạch da rất hiệu quả. Ngày nay, bên cạnh việc chiết tách, tinh chế, người ta đang phải đưa các chế phẩm enzym này vào những dạng bào chế thích hợp nhằm phân liều chính xác, ổn định hoạt chất và hiện đại hoá sản phẩm. Papain và amylase đã được phối hợp thích hợp nhằm bổ trợ tiêu hoá các thành phần hoá học trong thức ăn ở mức tối ưu theo nhu cầu dinh dưỡng của một số đối tượng bị rối loạn tiêu hoá, trẻ em suy dinh dưỡng và những người lớn có bệnh đường tiêu hoá. Hỗn hợp này đã trở thành những sản phẩm thuốc được sử dụng ở nhiều nước trên thế giới, chiếm tỷ trọng lớn ở các nước đang phát triển do có tỷ lệ trẻ em suy dinh dưỡng cao. Việt Nam cũng là một nước đang phát triển có tỷ lệ trẻ em SDD dưới 5 tuổi cao, đến năm 2004 là 26,4% và số người có bệnh đường tiêu hoá cũng cao, chủ yếu do viêm dạ dày, ruột. Mặt khác nước ta có khí hậu nhiệt đới, cây cối quanh năm xanh tốt, nguồn nguyên liệu để thu papain và amylase rất dồi dào. Nhưng hàng năm chúng ta đang phải nhập hàng triệu sản phẩm thuốc là hỗn hợp papain và amylase từ các nước Mỹ, Pháp, Hàn Quốc, Nhật Bản và ấn Độ. Đó là một thực tế, nhưng điều đó là không thể chấp nhận được đối với người dược sĩ trong điều kiện nguồn nguyên liệu để thu các sản phẩm này ở nước ta thuộc loại dồi dào, sẵn có. Để góp phần nghiên cứu triển khai và biến các chế phẩm enzym papain và amylase thành những sản phẩm thuốc có giá trị, ổn định và hiện đại, sản xuất được ở Việt Nam, phục vụ số khá đông những người bệnh đang có nhu cầu, chúng tôi tiến hành đề tài: “ Đánh giá sự biến đổi hoạt độ enzym của hỗn hợp Papain và Amylase dạng bột và dạng dung dịch trong điều kiện lão hoá cấp tốc” với mục tiêu: đánh giá được sự biến đổi hoạt tính của các enzym trong hỗn hợp ở điều kiện nhiệt độ cao, đồng thời tìm ra những quy luật thay đổi hoạt độ enzym. Từ đó có những biện pháp cụ thể ổn định hoạt chất và nâng cao độ ổn định của thuốc, sớm triển khai sản xuất thuốc này thành hiện thực. Phần I Tổng quan 1.1. Đại cương về amylase và papain 1.1.1. Amylase Amylase [EC.3.2.1] thuộc nhóm enzym hydrolase có vai trò quan trọng trong việc thuỷ phân tinh bột trong thức ăn thành các thành phần đơn giản hơn. Amylase xúc tác sự phân giải liên kết nội phân tử trong các polysaccarid với sự tham gia của nước có trong dịch tiêu hoá như nước bọt, dịch dạ dày..., được mô phỏng theo phương trình sau: R-R' + H-OH g RH + R'OH Amylase có nguồn gốc ở cả động vật và thực vật. ở người amylase được sinh ra chủ yếu ở hai tuyến: tuỵ và nước bọt. Hiện nay, người ta đã biết có 6 loại amylase, trong đó 3 loại: a-amylase, b-amylase, g-amylase (glucoamylase) thuỷ phân các liên kết a-1,4-glucosid của tinh bột, glycogen và các polysaccharid. Các amylase còn lại: dextrin-6-glucanhydrolase, amylopectin-6-glucanhydrolase và olygodextrin-6-glucanhydrolase (hay dextrinase) thuỷ phân liên kết a-1,6-glucosid trong phân tử polysaccharid. Sáu enzym amylase này cũng có thể được chia thành hai nhóm: endoamylase và exoamylase [4]: - Endoamylase: gồm có a-amylase và các enzym khử nhánh. Nhóm enzym khử nhánh được chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase (hay a-dextrin 6-glucanohydrolase); khử gián tiếp là transglucosylase (hay oligo-1,6-glucosidase) và amylo-1,6-glucosidase. Các endoamylase thuỷ phân các liên kết glucosid bên trong của chuỗi polysaccharid. - Exoamylase:gồm b-amylase và g-amylase, là những enzym thuỷ phân tinh bột từ các đầu cuối không khử của chuỗi polysaccharid. v Đặc điểm của một số amylase: c a-amylase (a-1,4-glucan-4-glucanohydrolase, EC.3.2.1.1) a-amylase là enzym có khả năng thuỷ phân tinh bột, amylose amylopectin, glycogen, dextrin, là một endoenzym, có ở nước bọt và dịch tuỵ và cả ở máu, tham gia thuỷ phân tiêu hoá tinh bột một phần ở miệng, phần lớn là tiêu hoá tinh bột ở ruột non. a-amylase cũng được phân lập từ hầu hết các động vật, các hạt nảy mầm và một số loài nấm như Aspergillus oryzae, hoặc từ một số loại vi khuẩn không gây bệnh như Bacillus subtilis. * Cơ chế tác dụng: a-amylase có khả năng phân cắt các liên kết a-1,4-glucosid của cơ chất một cách ngẫu nhiên, tạo nên hỗn hợp gồm 70 - 90% maltose, một lượng nhỏ D-glucose và các a-dextrin giới hạn phân tử lượng thấp (gồm 4 - 8 phân tử glucose và chứa một hoặc hơn một liên kết a-1,6- glucosid). Các liên kết a-1,6-glucosid trong chuỗi polysaccharid không bị phá vỡ bởi enzym này. Các giai đoạn của quá trình thuỷ phân tinh bột của a-amylase: - Giai đoạn dextrin hoá: a-amylase Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp (4-8 liên kết glucosid) - Giai đoạn đường hoá: a-amylase Dextrin tetra- và trimaltose di- và monosaccharid a-amylase † Tổng quát : Amylose oligosaccharid polyglucose (di và monosaccharid) Maltose maltotriose maltotetrose Khả năng dextrin hoá của a-amylase rất cao, do đó người ta còn gọi a-amylase là amylase dextrin hoá hay amylase dịch hoá. * Tính chất: a-amylase là một protein phức tạp có chứa Ca2+. a-amylase có nguồn gốc khác nhau, thường có thành phần acid amin không hoàn toàn giống nhau và mỗi loại a-amylase từ một nguồn gốc cũng thường có một tổ hợp các acid amin đặc hiệu riêng. Thành phần chung của các a-amylase có chứa nhiều tyrosin, trytophan, acid glutamic và acid aspartic. Các acid amin có tính acid là glutamic và aspartic chiếm khoảng 1/4 lượng acid amin của phân tử enzym, nhưng ngược lại, a-amylase có rất ít methionin và chỉ có 7 – 10 gốc cystein. Các a-amylase có nguồn gốc khác nhau cũng có KLPT rất khác nhau: a-amylase từ tuỵ động vật có KLPT là 4500 Da, trong khi đó a-amylase từ Bacillus subtilis có tác dụng giống a-amylase từ tuỵ động vật mà KLPT lại gấp đến 2 lần là 9900 Da [4], [6]. Nhìn chung, a-amylase có một số đặc tính như: + Protein của a-amylase có tính acid yếu; dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và cồn thấp độ. + Điểm đẳng điện của a-amylase nằm trong vùng pH 4,2 - 5,7 [3]. + a-amylase là một metaloenzym, mỗi phân tử a-amylase đều có chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam Ca/mol. Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc ba của enzym, duy trì hoạt động của enzym [4]. + Hoạt động của a-amylase được hoạt hoá bởi ion Cl-, bị kìm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+... pH tối thích là 6,9 (a-amylase động vật); 4,7 - 5,4 (a-amylase thực vật – mầm lúa); 5,0 - 6,0 (a-amylase vi khuẩn Bacillus subtilis) [3]. + Độ bền nhiệt của các a-amylase nguồn gốc khác nhau cũng không giống nhau, các a-amylase nấm men và vi khuẩn bền với nhiệt hơn các a-amylase động vật và thực vật [4]. c b-amylase (a-1,4-glucan–maltohydrolase, EC.3.2.1.2) b-amylase là enzym thuỷ phân tinh bột, hiện diện phổ biến ở thực vật, đặc biệt là ở hạt nảy mầm. b-amylase xúc tác sự thuỷ phân cắt từng phân tử maltose khỏi đầu không khử của chuỗi polysaccarid bằng cách phân cắt liên kết a-1,4-glucosid. KLPT của b-amylase là 152.000 Da và 215.000 Da, bị ức chế bởi iodoazobenzoat, iodoacetamid, ascorbat, các kim loại nặng như Ag+, Hg2+, Cu2+, các thuốc thử có chứa nhóm –SH. pH tối thích 4,0 – 5,0 [4]. b-amylase chịu nhiệt kém hơn a-amylase nhưng bền với acid hơn, bị bất hoạt ở nhiệt độ 70oC [4]. c g-amylase (glucoamylase, a-1,4-glucan-4-glucanohydrolase, EC.3.2.1.3) g-amylase là enzym này có khả năng thuỷ phân liên kết a-1,4 lẫn a-1,6 glucosid. Khi thuỷ phân liên kết a-1,4-glucosid trong chuỗi polysaccharid, glucoamylase tách lần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch polysaccharid. Ngoài các liên kết a-1,4 và a-1,6 glucosid, glucoamylase còn có khả năng thuỷ phân các liên kết a-1,2 và a-1,3 glucosid. Do đó, glucoamylase có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột, glycogen, amylopectin, dextrin, maltose... thành glucose mà không cần có sự tham gia của các loại amylase khác [4]. pH tối thích của glucoamylase nằm trong vùng acid nhẹ là 4,0-5,0 và cũng có loại glucoamylase có pH tối thích nằm trong vùng trung tính khoảng 6,0-7,5 [4]. v ứng dụng: Với vai trò là enzym có tác dụng thuỷ phân polysaccharid, amylase đã được ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt may, y tế và nhiều lĩnh vực kinh tế khác. Trong công nghiệp thực phẩm để làm lỏng tinh bột, nấu rượu bia, chế tạo bánh kẹo. Trong Y Dược, dùng để chế tạo glucose, dextrin uống và tiêm truyền, dùng làm thuốc chữa rối loạn tiêu hoá, bổ trợ tiêu hoá cho nhiều đối tượng khác nhau. Đặc biệt, gần đây người ta dùng amylase để hoá lỏng thức ăn nhằm tăng đậm độ dinh dưỡng trên một thể tích thức ăn cho trẻ em SDD. Ngoài ra, cũng đã có những ý tưởng sử dụng amylase nhằm mục đích chống viêm và phù nề mặc dù những ý tưởng đó vẫn còn phải được chứng minh trong thực tế. 1.1.2. Papain Papain [EC.3.4.1.21] là một trong các enzym thuỷ phân protein có nguồn gốc thực vật được nghiên cứu nhiều về tính chất và cơ chế hoạt động. Papain chủ yếu được tách chiết từ nhựa quả đu đủ xanh của cây đu đủ Carica papaya L. (Caricaceae). a- Cấu tạo hoá học: Papain là một endoprotease có chứa 16,1%N và 1,2%S [4]. Phân tử enzym có 212 acid amin trong đó không chứa methionin, khối lượng phân tử 23400 Da. Mạch polypeptid của Papain có đầu tận amin là isoleucin, đầu tận carboxyl là asparagin, phân tử có 3 liên kết disulfua (S-S) được tạo bởi 6 gốc cystein và một nhóm –SH (sulfhydryl) tự do ở vị trí 25, các liên kết này không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính bền vững của cấu trúc [4]. Thành phần chính của papain chưa hoạt hoá là hỗn hợp protein cystein disulfid. Khi hoạt hoá papain bằng KCN sẽ giải phóng ra nhóm thiol của phân tử enzym và b-thiocyanatalanin do sự tương tác giữa cyanid và cystein. Sau đó, b-thiocyanatalanin khép vòng tạo thành a-iminothiazolidin. Khi có không khí, cơ chế trên xảy ra theo chiều ngược lại tạo thành sản phẩm không hoạt hoá. Quá trình hoạt hoá papain không làm thay đổi cấu trúc không gian của nó [4]. N+H3 CºN papa in papa in N+H3 COO- ắSắSắCH2ắCH ắSH + S CH2-CH COO- Papain hoạt động CN- hoạt hoá b-thiocyanatalanin O2 HC-NH2 S NH COO- H2C CH a-iminothiazolidin Hình1: Sơ đồ cơ chế hoạt hoá papain bằng cyanid b- Cấu trúc không gian của papain: Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thước của các trục chính trong cấu trúc không gian 3 chiều là: 36´48´36, mạch polypeptid chính bị gấp khúc thành hai phần riêng biệt tạo nên một “hốc đặc biệt”. Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt của “khe” này, nhóm sulfhydryl hoạt động của cystein 25 nằm bên trái “khe” và nhóm histidin 159 nằm bên phải “khe”. Phần có cấu trúc xoắn a chiếm khoảng 20% toàn bộ acid amin có trong phân tử [4]. c- Hoạt tính enzym và cơ chế tác dụng: Đặc điểm quan trọng nhất của papain là khả năng thuỷ phân protein đến tận acid amin. Papain thuỷ phân protein thành các polypeptid và các acid amin, đóng vai trò vừa như một endopetidase vừa như một exopeptidase [4]. R R R R Các endopeptidase thuỷ phân proein chủ yếu thành peptid: (-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)n + (HOH) (-NH-CH-COOH)i + (H2N-CH-CO-)k i + k = n R R R R Các exopeptidase thuỷ phân các peptid thành amino acid: (-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)n + (HOH) (NH2-CH-COOH)n' + (H2N-CH-CO-)k' n' + k' = n So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác, papain có khả năng thuỷ phân sâu hơn, vì vậy nó được dùng để thuỷ phân tiếp các liên kết peptid còn lại sau khi đã thuỷ phân bằng pepsin, trypsin hay chymotrysin. Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng, papain có khả năng phân huỷ hầu hết các liên kết peptid trừ các liên kết với prolin và với các acid glutamic có nhóm carboxyl tự do. d- Sự hoạt hoá papain: Papain cần có nhóm sulfhydryl tự do để thể hiện hoạt tính xúc tác. Do trung tâm hoạt động của papain có nhóm cystein 25 và nitrogen bậc 3 của histidin 159 có tính khử nên các chất đóng vai trò hoạt hoá papain là các chất có tính khử yếu như: cystein, glutathion acid, hydrocyanid, hydrosulfid, natrithiosulfat... trong đó cystein thường được dùng nhiều nhất. Khi có mặt của một trong các chất hoạt hoá này thì nhóm -SH ở trung tâm hoạt động của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính của papain. Sự hoạt hoá càng được tăng cường khi có sự hiện diện của các chất có khả năng liên kết với kim loại nặng như EDTA. Vì vậy, để thu được hoạt tính enzym tối ưu nhất người ta thường dùng hỗn hợp cystein và EDTA, trong đó cystein đóng vai trò chất hoạt hoá papain, còn EDTA đóng vai trò liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong dung dịch enzym. Cơ chế của sự hoạt hoá papain: HCN, H2S,... I2, O2,... Pa-S-S-Pa 2 Pa-SH (bất hoạt) (hoạt động) 2+ 2+ Pa-S- + -S-Pa {2 Pa-S-}Me2+ (hoạt động) (bất hoạt) e- Sự ức chế papain: Papain bị kìm hãm (ức chế) bất thuận nghịch bởi các chất oxy hoá như: O2, ozon, H2O2, Iodid acetat, iodid acetamid, thuỷ ngân chlobenzoat, cystin và một số dẫn chất disulfid khác. Các chất này ức chế hoạt tính của papain bằng phản ứng với nhóm –SH ở trung tâm hoạt động của papain và do vậy mà làm thay đổi cấu trúc tâm hoạt động của nó [4]. Papain bị ức chế thuận nghịch bởi không khí, cystein ở nồng độ thấp, các ion kim loại nặng như Cd2+, Zn2+, Fe2+, Cu2+, Hg2+, Pb2+ [4],[3]. f- Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym: w Nhiệt độ: Papain là enzym chịu được nhiệt độ tương đối cao và độ bền chịu nhiệt của nó phụ thuộc vào dạng chế phẩm. ở dạng nhựa khô papain không bị biến tính trong 3 giờ ở 100oC. Còn ở dạng dung dịch papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,5oC và nếu tăng nhiệt độ cao hơn (> 100oC) thì nó sẽ bị mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm một lượng lớn chất hoạt hoá vào dung dịch do cấu trúc trung tâm hoạt động của enzym đã bị phá huỷ hoàn toàn. Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 4oC bền trong nhiều tháng. Trong dung dịch dẫn xuất thuỷ ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng. Papain dạng ổn định ở trạng thái khô có thể chịu nhiệt độ sấy ở 115oC trong thời gian 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì được 90% [4]. Papain ở dạng tinh sạch và ở dạng tinh thể có độ bền nhiệt thấp hơn papain ở trong nhựa mủ, do trong nhựa mủ còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ nó [4]. Khi thuỷ phân các protein khác nhau, tuỳ thuộc vào cơ chất mà nhiệt độ phản ứng thích hợp (nhiệt độ tối ưu) cho papain cũng khác nhau. Đối với cơ chất casein, nhiệt độ phản ứng tối ưu là 37oC [4]. w pH: Papain hoạt động ở khoảng pH tương đối rộng từ 4,5 - 8,5 và hầu như bền ở khoảng pH này, nhưng lại dễ biến tính trong môi trường acid có pH 12. Đặc biệt papain dạng ổn định có thể chịu được ở pH = 1,5 và pH = 8,5 trong 90 phút. Tuỳ thuộc vào bản chất của cơ chất mà pH tối ưu của papain sẽ khác nhau, chẳng hạn papain phản ứng với casein ở pH tối ưu là 7 - 7,5; với albumin ở pH tối ưu là 4,5 - 7,1 và với gelatin ở pH tối ưu là 5,2 - 6,0 và 6,4. Điểm đẳng điện của papain là pI = 9 [4]. g- Công dụng: Papain có tác dụng làm mềm thịt, thuỷ phân protein làm trong đồ uống, làm mềm và sạch da. Trong Y Dược, papain là enzym được dùng để phòng chống dính, làm tróc vẩy và xử lý làm sạch vết thương [9]; chế phẩm uống papain có tác dụng tiêu hoá protein có trong thức ăn và có tác dụng chống viêm phi steroid (theo cơ chế enzym). 1.2. Một số sản phẩm thuốc có chứa papain và amylase Hiện nay các chế phẩm enzym đang được sử dụng ở Việt Nam vẫn chủ yếu là nhập của nước ngoài. Một số chế phẩm chứa Papain và Amylase sử dụng với mục đích điều trị rối loạn tiêu hoá thông dụng như [8]: - Pantyrase, Panthicone, Panticone F, Dailase, Gastal, Korzym, Pandual, Panwoodi, Sancase, Stilase, Topase F, Hanolase...(Dạng viên nén hoặc viên nang) (Hàn Quốc). - Gaszym (Viên nén, viên nang) (Thái Lan). - Panzytrat, Pancurmen, Pangrol, Nezym forte (Đức). - Viên nén sủi bọt Pepfiz, Papaynol (siro, viên nén, viên nhện), Neopetine (dạng thuốc giọt và dạng viên nang) (ấn Độ). - Viên bọc đường Pancrelase (Pháp - Đức). - Creon, Pancreflash (viên nén bọc) (Pháp). - Festale N (Roussel VN). - Neo-Panpur (Hungari). - AlPAMylase (viên nang) và alpamylase trẻ em (dạng dung dịch): lần đầu tiên được sản xuất tại Việt Nam, tại công ty Dược khoa - Trường Đại học Dược Hà Nội. Các sản phẩm này đã được sản xuất và được phép lưu hành cho mục đích phòng và chữa bệnh, nhưng những công trình nghiên cứu hỗ trợ thêm nhằm đảm bảo chất lượng thuốc tốt trong các quá trình sản xuất và phân phối lưu thông vẫn cần được tiếp tục. Đánh giá sự biến đổi hoạt tính của hỗn hợp papain và alpha amylase trong các dạng thuốc ở những điều kiện nhất định vẫn là cần thiết để có cơ sở đảm bảo và nâng cao độ ổn định của thuốc, phục vụ tốt cho công tác phòng và chữa bệnh. Phần II Thực nghiệm và kết quả 2.1. Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm 2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu 2.1.1.1. Chế phẩm enzym - Chế phẩm papain đạt tiêu chuẩn IP 96. - Chế phẩm alpha amylase đạt tiêu chuẩn IP 96. 2.1.1.2. Hỗn hợp các chế phẩm a) Hỗn hợp bột papain và alpha amylase (PA B): PA B1 PA B2 Alpha amylase IP 96 Papain IP 96 Dimethicone IP 96 Lactose 100 mg 100 mg 30 mg vđ 500 mg Alpha amylase (fungal) IP 96 100 mg Papain IP 96 100 mg Simethicon DĐVN III 30 mg Calci tribasic phosphat vđ 500 mg b) Hỗn hợp dung dịch papain và alpha amylase (PA D): PA D1 PA D2 Alpha amylase IP 96 200 mg Papain IP 96 100 mg Tinh dầu Dill IP 96 20 mg Tinh dầu Anise IP 96 20 mg Tinh dầu Caraway IP 96 20 mg Nước cất vđ 10 ml Alpha amylase (fungal) IP 96 200 mg Papain IP 96 100 mg Tinh dầu hồi DĐVN III 30 mg Tinh dầu cam DĐVN III 30 mg Saccarose DĐVN III 200 mg Hỗn hợp Nipazin/Nipazon (tỷ lệ 9/2) 0,2 mg Nước cất vđ 10 ml * Trong đó: - Hỗn hợp PA B1 và PA D1 được nghiên cứu và sản xuất bởi hãng Raptakos – ấn Độ, đã được phép nhập khẩu và lưu hành ở Việt Nam. - Hỗn hợp PA B2 và PA D2 được nghiên cứu chế tạo tại bộ môn Hoá sinh – Trường Đại học Dược Hà Nội. 2.1.2. Hoá chất và thuốc thử * Cơ chất: - Dung dịch casein 4%: Hoà tan 4,0g casein tinh khiết với 90ml nước (60oC, 30phút), chỉnh đến pH 7,0 bằng dung dịch NaOH 1N, thêm nước vừa đủ 100ml (pha trước khi dùng). - Dung dịch casein 0,6%: Cân chính xác khoảng 0,6g casein tinh khiết cho vào cốc có mỏ. Thêm dung dịch đệm phosphat pH 7,2 vừa đủ 100ml. Đun cách thuỷ trong 60 phút, vừa đun vừa khuấy. Sau đó lọc qua gạc. - Dung dịch tinh bột 1‰: Cân chính xác khoảng 1,0g tinh bột khô (sấy chân không ở 60oC, 5 mmHg trong 4 giờ) vào cốc có mỏ dung tích 100ml. Thêm khoảng 5ml nước, khuấy đều, sau đó thêm 50ml nước sôi để hồ hoá. Đun nóng trong 5 phút, làm lạnh đến khoảng 20oC, thêm 5g NaCl. Chuyển toàn lượng dung dịch vào bình định mức, thêm nước vừa đủ 100ml. Pha loãng 10ml dung dịch này với dung dịch đệm acetat pH 5,0 thành 100ml dung dịch cơ chất tinh bột. * Hoá chất và thuốc thử: - Dung dịch cystein hydroclorid 5%: Hoà tan 5,0g cystein hydroclorid trong 90ml nước cất, chỉnh pH đến 7,0 bằng dung dịch NaOH 1N, thêm nước vừa đủ 100ml (pha trước khi dùng). - Dung dịch cystein 0,04M: Hoà tan 0,49g cystein vào 90ml dung dịch đệm pH 7,2, sau đó thêm dung dịch đệm pH 7,2 vừa đủ 100ml (pha trước khi dùng). - Dung dịch đệm phosphat pH 7,2: Na2HPO4.12H2O 55,132g. Acid citric 4,853g. Nước cất vừa đủ 1000ml. - Dung dịch đệm acetat pH 5,0: Hoà tan 6,8g natri acetat và 2,5ml acid acetic băng vào khoảng 400ml nước cất, sau đó thêm nước vừa đủ 500ml. Điều chỉnh đến pH 5,0 nếu cần. - Dung dịch Iod 0,1N: Hoà tan 7g Iod và 18g Kali Iodid vào 50ml nước cất. Thêm 3 giọt acid hydroclorid và pha loãng với nước thành 500ml. - Dung dịch Iod 0,02N: Pha loãng 10ml dung dịch Iod 0,1N bằng nước cất thành 50ml. - Dung dịch acid trichloroacetic 10% Acid trichloroacetic 10g. Nước cất vừa đủ 100ml. - Thuốc thử Gornall: Hoà tan 1,5g CuSO4.5H2O và 6,0g Natri Kali Tartrat trong 500ml nước cất. Thêm 300ml dung dịch NaOH 10% (30g Natri hydroxyd trong 300ml nước cất). Vừa thêm vừa lắc đều. Thêm 1g KI rồi hoàn thành 1000ml bằng nước cất. Lắc kỹ, bảo quản trong lọ nút kín. - Dung dịch NaOH 1N và 0,1N. - Dung dịch phenolphtalein 0.1% trong cồn. - Dung dịch formaldehyd (TT). 2.1.3. Dụng cụ máy móc - Tủ ấm. - Máy điều nhiệt Cliffton Peu - 2. - Máy li tâm Hettich 13 - 12. - Máy đo quang (UV - VIS) Helios. 2.1.4. Phương pháp nghiên cứu 2.1.4.1. Điều kiện lão hoá cấp tốc cho các chế phẩm enzym - Buồng thí nghiệm LHCT chứa mẫu nghiên cứu là một tủ ấm riêng biệt, đóng kín, đặt cố định và để liên tục ở nhiệt độ 50oC trong suốt thời gian thí nghiệm: 10 tuần (70 ngày). - Các mẫu nghiên cứu PA B1, PA B2, PA D1, PA D2 đựng trong chai thuỷ tinh màu nâu, nắp kín, được đặt trong buồng thí nghiệm LHCT trong suốt thời gian nghiên cứu. Định kỳ 7 ngày (1 tuần) 1 lần lấy mẫu xác định hoạt độ enzym theo các phương pháp xác định hoạt độ enzym và đánh giá sự biến đổi hoạt độ các enzym trên các biểu đồ riêng biệt thông qua theo dõi phần trăm (%) hoạt độ enzym (HđE) còn lại và tốc độ (v) giảm HđE theo tuần (HđE/t) cho mỗi hỗn hợp enzym. 2.1.4.2. Kỹ thuật định lượng protein bằng phản ứng Biuret [10] ã Nguyên tắc: Protein có liên kết peptid cho tác dụng với CuSO4 và NaOH tạo thành phức màu tím hồng. Đo quang phổ hấp thụ so với biểu đồ mẫu để định lượng protein. ã Xây dựng biểu đồ mẫu để định lượng protein bằng phản ứng Biuret: Cân 1,00g Albumin bò tinh khiết, hoà tan với dung dịch NaCl 0,9% vừa đủ để có dung dịch 1%. Từ dung dịch này ta thực hiện phản ứng theo bảng sau: Thuốc thử ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Dd albumin 1% (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 Dd NaCl 0,9% (ml) 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Thuốc thử Gornall (ml) 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 Lắc đều, để 30 phút ở nhiệt độ phòng, đo quang ở bước sóng l = 530nm. Từ kết quả đo quang phổ hấp thụ thu được của các dung dịch dựng biểu đồ nồng độ protein (mg/ml) – mật độ quang (D). 2.1.4.3. Phương pháp xác định hoạt độ Papain a) Phương pháp 1 (PP1): Xác định hoạt độ papain dựa theo nguyên tắc của phản ứng Biuret. ã Nguyên tắc: Cơ chất protein được ủ với enzym ở điều kiện thích hợp trong thời gian nhất định. Lượng protein còn lại được xác định bằng cách cho tủa với acid trichloroacetic, tủa này phản ứng với thuốc thử Gornall tạo phức màu tím hồng. Đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng l = 530nm, cuvet 1cm. ã Tiến hành: - Pha chế phẩm enzym đến nồng độ thích hợp bằng dung dịch đệm phosphat pH = 7,2. - Xác định khả năng thuỷ phân protein của papain: Tiến hành phản ứng theo bảng sau: Thuốc thử (ml) ống cơ chất ống thử ống chứng Dd casein 0,6% 2,0 2,0 0 Acid trichloroacetic 10% 2,5 0 2,5 Dd đệm pH 7,2 1,5 1,5 1,5 Cystein 0,04M 0,5 0,5 0,5 Dd enzym 1% 0 0,5 0,5 Lắc đều, ủ ấm 37oC trong 60 phút. Sau thời gian ủ ấm, cho vào ống thử 2,5 ml acid trichloroacetic 10%. Lắc kỹ, để ở nhiệt độ phòng 10 phút, đem ly tâm lấy tủa. Hoà tan tủa với 4,0 ml thuốc thử Gornall, lắc kỹ, để ổn định ở nhiệt độ phòng 30 phút. Đo mật độ quang ở bước sóng l = 530nm, cuvet 1cm. ã Cách tính kết quả: Đơn vị hoạt độ papain (HđP): Katal (K) và nanoKatal (nK), 1nK=10-9K. Katal là số mol cơ chất bị thuỷ phân bởi 1 mg enzym trong 1 giây. ỉ Hoạt độ papain được tính theo công thức: HđP = (nanoKatal) Trong đó: A : Lượng protein (mg) bị thuỷ phân (xác định theo biểu đồ). B : Độ pha loãng của dung dịch chế phẩm enzym. 23600 : Trọng lượng phân tử gam của casein (g). 209 : Số liên kết peptid của một phân tử casein. T : Thời gian thuỷ phân (giây). m : Lượng chế phẩm enzym đem thử (mg). ỉ Hoạt độ papain theo % (hoạt độ protease tương đối) được tính theo công thức: Dcơ chất - Dthử – Dchứng Dcơ chất HđP (%) = ´ 100% Trong đó: Dcơ chất : Mật độ quang của ống cơ chất. Dthử : Mật độ quang của ống thử. Dchứng : Mật độ quang của ống chứng. b)Phương pháp 2 (PP2): Xác định hoạt độ papain theo IP 96 [11] ã Nguyên tắc: Dưới tác dụng của Papain ở 60oC trong thời gian thích hợp, cơ chất casein bị thuỷ phân hoàn toàn giải phóng các acid amin. Định lượng các acid amin sinh ra sau phản ứng, từ đó suy ra hoạt độ papain. ã Tiến hành: - Pha dung dịch thử: + Từ hỗn hợp PA dạng bột: Cân chính xác lượng bột chế phẩm chứa khoảng 0,5g bột Papain cho vào cốc có mỏ, thêm 10ml dung dịch cystein hydroclorid, trộn đều. Chuyển hỗn hợp này vào bình định mức 100ml, tráng cốc bằng nước cất, thêm nước vừa đủ. Lắc đều. Lọc lấy dịch lọc. + Từ hỗn hợp PA dạng dung dịch: Lấy chính xác 10ml chế phẩm cho vào bình định mức 50ml, thêm 10ml dung dịch cystein hydroclorid, lắc đều, thêm nước vừa đủ. - Lấy chính xác 15ml dung dịch casein và 30ml nước vào một bình nón dung tích 100ml. Để ổn định ở nhiệt độ 60oC ± 0,1 trong bình cách thuỷ. - Thêm 5,0ml dung dịch thử, duy trì hỗn hợp ở 60oC trong 30 phút. - Làm lạnh nhanh đến nhiệt độ phòng. Song song làm một mẫu trắng với 5,0ml dung dịch thử đã đun sôi 5 phút và để nguội tới nhiệt độ phòng (huỷ enzym). - Thêm vào mỗi bình 2 – 3 giọt dung dịch phenolphtalein 0,1% và 10ml dung dịch formaldehyd (TT) đã được trung hoà bằng NaOH 0,1N với chỉ thị là dung dịch phenolphtalein 0,1%. - Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi có màu hồng nhạt xuất hiện. ã Cách tính kết quả: Sự chênh lệch thể tích dung dịch NaOH 0,1N dùng cho mẫu thử và mẫu trắng là hoạt độ thuỷ phân protein (hoạt độ papain) có trong 5,0ml dung dịch thử. † Hoạt độ papain có trong mỗi ml dung dịch chế phẩm được tính theo công thức: HđP / ml = † Hoạt độ papain của mỗi gam bột chế phẩm được tính theo công thức: HđP / g = Trong đó: a : Số ml dung dịch NaOH 0,1N dùng cho mẫu thử. b : Số ml dung dịch NaOH 0,1N dùng cho mẫu trắng. F : Hệ số hiệu chỉnh của NaOH. Mt : Khối lượng bột thuốc đem thử (g). 2.1.4.4. Xác định hoạt độ Amlylase theo IP 96 [11] ã Nguyên tắc: Cơ chất tinh bột được ủ với dịch amylase ở các nồng độ khác nhau ở 40oC trong một thời gian nhất định. Bằng cách lên màu với thuốc thử Iod của tinh bột dư sau phản ứng xác định được lượng enzym đã thuỷ phân hết cơ chất tinh bột. Từ đó suy ra hoạt độ amylase. ã Tiến hành: - Pha dung dịch thử: + Từ hỗn hợp PA dạng bột: Cân chính xác một lượng bột hỗn hợp PA chứa khoảng 0,025g bột alpha amylase vào bình định mức 100ml, thêm dung dịch đệm acetat pH 5,0 vừa đủ, trộn đều. Lọc lấy dịch lọc. Lấy chính xác 2ml dung dịch này vào bình định mức 50ml, thêm dung dịch đệm acetat pH 5,0 vừa đủ, lắc đều. + Từ hỗn hợp PA dạng dung dịch: Lấy chính xác 1ml chế phẩm cho vào bình định mức 100ml, thêm dung dịch đệm acetat pH 5,0 vừa đủ, lắc đều. Lấy chính xác 2ml dung dịch này pha loãng bằng dung dịch đệm acetat pH 5,0 thành 50ml dung dịch thử. - Cho vào 6 ống nghiệm có nắp mỗi ống chính xác 5ml dung dịch cơ chất tinh bột. Đặt các ống nghiệm vào bình cách thuỷ duy trì ở nhiệt độ 40oC ± 0,1. - Khi nhiệt độ của dung dịch trong các ống nghiệm đạt tới 40oC, thêm chính xác 0,55; 0,60; 0,65; 0,70; 0,75; 0,80 ml dung dịch thử vào từng ống nghiệm riêng biệt. Tính thời gian từ lúc cho dung dịch thử vào cơ chất. Trộn đều, đặt các ống nghiệm vào bình cách thuỷ. - Sau đúng 60 phút, lấy các ống nghiệm ra và làm nguội nhanh đến nhiệt độ phòng. - Thêm vào mỗi ống nghiệm 0,05ml dung dịch Iod 0,02N, trộn đều để lên màu. - Xác định ống có chứa lượng dung dịch thử nhỏ nhất không có màu xanh hay tím nhạt, tính hoạt độ enzym theo ống này. (Trong trường hợp tất cả các ống đều không lên màu hoặc đều lên màu thì cần phải điều chỉnh lại độ pha loãng của dung dịch thử cho phù hợp). ã Cách tính kết quả: Hoạt độ alpha amylase trong 1ml chế phẩm dạng dung dịch hoặc trong 1g chế phẩm dạng bột là lượng tinh bột tính bằng gam bị thuỷ phân bởi 1ml chế phẩm dạng dung dịch hoặc 1g chế phẩm dạng bột trong 1 giờ ở 40oC, được tính theo công thức sau: ỉ Hoạt độ alpha amylase trong 1ml chế phẩm dạng dung dịch: HđA / ml = ỉ Hoạt độ alpha amylase trong 1g chế phẩm dạng bột: HđA / g = Trong đó: Mtinh bột : Khối lượng tinh bột khô đã cân để pha dung dịch cơ chất tinh bột (g). Vmin : Thể tích dung dịch thử nhỏ nhất trong ống nghiệm không có màu xanh hay tím nhạt (ml). Mt : Khối lượng bột đem thử (g). 2.1.4.5. Phương pháp xử lý thống kê y học các mẫu nghiên cứu [10] a) Tính độ lệch tiêu chuẩn d Độ lệch tiêu chuẩn là sự biến đổi của những kết quả riêng biệt xung quanh trị số trung bình M. Công thức tính độ lệch tiêu chuẩn d: d = Trong đó: Xi : kết quả đo lần thứ i (i = 1,2,3,…,n). M : giá trị trung bình của các kết quả giữa các lần đo. n : số lần đo. Như vậy ta có kết quả của mẫu nghiên cứu là: M ± d. b) Tính độ tin cậy t, ngẫu xuất thống kê p Cách tính trị số t so sánh sự chênh lệch của hai số trung bình: - Tính khoảng lệch tiêu chuẩn chung cho hai số trung bình theo công thức: d 1,2 = - Tính sai số tiêu chuẩn chênh lệch giữa hai số trung bình: - Tính trị số t: Trong đó: X1, X2 : Kết quả của mẫu 1 và mẫu 2. M1, M2 : Trị số trung bình của kết quả mẫu 1 và mẫu 2. n1, n2 : Số lần đo của mẫu 1 và mẫu 2. ị Sau đó xem ngẫu xuất p (tra bảng t [10], với độ tự do n1 + n2 - 2). 2.1.4.6. Phương pháp tính tuổi thọ thuốc theo nguyên tắc Vanhoff [1] Tth = K ´ Tct Trong đó: Tth: Tuổi thọ thuốc ở điều kiện thường. Tct: Tuổi thọ thuốc ở điều kiện LHCT. A là hệ số nhiệt độ của tốc độ phản ứng (thường là 2). DTo = To lão hoá - To bảo quản bình thường. 2.2. Kết quả Thực nghiệm và nhận xét 2.2.1. Xây dựng biểu đồ mẫu định lượng protein bằng phản ứng Biuret Đo mật độ quang (D) theo nồng độ protein thu được kết quả như sau: Nồng độ protein (mg/ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Mật độ quang D 0,053 0,115 0,157 0,203 0,273 0,313 0,386 0,419 0,468 0,535 † Tính các hệ số protein Ki là tỷ lệ giữa nồng độ protein (mg/ml) và độ hấp thụ quang (D): Nồng độ protein (mg/ml) D K = Tính hệ số K trung bình (KTB): [ Công thức tính nồng độ protein (Cprotein)theo mật độ quang (D): Cprotein = KTB ´ D (*) Từ các kết quả trên, thiết lập và vẽ biểu đồ mẫu biểu diễn độ hấp thụ quang (D) theo nồng độ protein (mg/ml): Hình2: Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang D theo nồng độ protein (mg/ml). ĩ Kết quả trên biểu đồ (hình 1) cho thấy sự biến thiên của mật độ quang D biến đổi ._.