Đánh giá khả năng tái sinh Invitro và biến nạp gen GFP vào lúa Japonica thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Tài liệu Đánh giá khả năng tái sinh Invitro và biến nạp gen GFP vào lúa Japonica thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens: ... Ebook Đánh giá khả năng tái sinh Invitro và biến nạp gen GFP vào lúa Japonica thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Tóm tắt tài liệu Đánh giá khả năng tái sinh Invitro và biến nạp gen GFP vào lúa Japonica thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Bé GI¸O DôC Vµ §µO T¹O
TR¦êNG §¹I HäC N¤NG NGHIÖP Hµ NéI
------------ ----------
PHïNG THÞ PH¦¥NG NHUNG
§¸NH GI¸ KH¶ N¡NG T¸I SINH IN VITRO Vµ BIÕN N¹P
GEN GFP VµO LóA JAPONICA TH¤NG QUA VI KHUÈN
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
LUËN V¡N TH¹C SÜ N¤NG NGHIÖP
Chuyªn ngµnh: Trång trät
M· sè : 60.62.01
Ng−êi h−íng dÉn khoa häc: GS.TS. §ç N¡NG VÞNH
Hµ Néi - 2010
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ i
LêI CAM §OAN
T«i xin cam ®oan sè liÖu vµ kÕt qu¶ nghiªn cøu trong luËn v¨n nµy lµ
trung thùc vµ ch−a hÒ ®−îc sö dông ®Ó b¶o vÖ mét häc vÞ nµo.
T«i xin cam ®oan mäi sù gióp ®ì cho viÖc thùc hiÖn luËn v¨n nµy ®0
®−îc c¶m ¬n vµ c¸c th«ng tin trÝch dÉn ®0 ®−îc chØ râ nguån gèc
T¸c gi¶
Phïng ThÞ Ph−¬ng Nhung
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ ii
LêI C¶M ¥N
T«i xin göi lêi c¶m ¬n ch©n thµnh vµ s©u s¾c tíi GS. TS. §ç N¨ng VÞnh,
Phã ViÖn tr−ëng, Gi¸m ®èc Phßng ThÝ nghiÖm träng ®iÓm C«ng nghÖ tÕ bµo
thùc vËt - ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp, TS. NguyÔn V¨n Khiªm, Nghiªn cøu
viªn chÝnh Phßng ThÝ nghiÖm träng ®iÓm C«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt - ViÖn Di
truyÒn N«ng nghiÖp ®0 tËn t×nh chØ dÉn vµ trùc tiÕp h−íng dÉn t«i trong qu¸
tr×nh thùc hiÖn luËn v¨n nµy, ®ång thêi còng lµ ng−êi nhiÖt t×nh cæ vò, gióp ®ì
t«i trong qu¸ tr×nh häc tËp vµ c«ng t¸c t¹i ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp.
T«i xin bµy tá lßng biÕt ¬n tíi c¸c thÇy c« trong Bé m«n Di truyÒn
gièng ®0 tËn t×nh d¹y dç vµ gióp ®ì t«i trong suèt qu¸ tr×nh häc tËp t¹i bé
m«n. T«i còng xin ch©n thµnh c¶m ¬n Ban L%nh ®¹o ViÖn §µo t¹o sau ®¹i
häc, Tr−êng §¹i häc N«ng nghiÖp Hµ Néi ®0 t¹o ®iÒu kiÖn thuËn lîi cho t«i
trong suèt qu¸ tr×nh häc tËp t¹i tr−êng.
T«i xin ch©n thµnh c¶m ¬n c¸c c¸n bé, ®ång nghiÖp trong Phßng ThÝ
nghiÖm träng ®iÓm C«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt, ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp ®0
gióp ®ì, ®éng viªn t«i trong qu¸ tr×nh c«ng t¸c vµ nghiªn cøu khoa häc t¹i
Phßng ThÝ nghiÖm trong thêi gian thùc hiÖn ®Ò tµi..
Cuèi cïng, t«i xin ch©n thµnh c¶m ¬n gia ®×nh, b¹n bÌ ®0 nhiÖt t×nh ®éng
viªn, gióp ®ì t«i trong qu¸ tr×nh häc tËp, nghiªn cøu khoa häc vµ trong cuéc
sèng. Sù tin t−ëng vµ khÝch lÖ tõ gia ®×nh ®0 gióp t«i v÷ng vµng, toµn t©m,
toµn ý cho c«ng viÖc.
T«i ch©n thµnh göi lêi c¶m ¬n ®Õn tÊt c¶ mäi ng−êi !
Hµ Néi, ngµy th¸ng 12 n¨m 2010
T¸c gi¶
Phïng ThÞ Ph−¬ng Nhung
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ iii
MôC LôC
LêI CAM §OAN i
LêI C¶M ¥N ii
MôC LôC iii
DANH MôC C¸C CH÷ VIÕT T¾T Vµ THUËT NG÷ vi
PHÇN 1 Më §ÇU 1
1.1. §Æt vÊn ®Ò 1
1.2. Môc tiªu, ý nghÜa nghiªn cøu 2
1.2.1. Môc tiªu 2
1.2.2 ý nghÜa khoa häc vµ ý nghÜa thùc tiÔn cña ®Ò tµi 2
PHÇN 2 TæNG QUAN TµI LIÖU 4
2.1 BiÕn ®æi khÝ hËu - th¸ch thøc lín ®èi víi nÒn s¶n xuÊt n«ng nghiÖp 4
2.1.1 ¶nh h−ëng cña biÕn ®æi khÝ hËu ®Õn s¶n xuÊt n«ng nghiÖp toµn cÇu 4
2..1.2. BiÕn ®æi khÝ hËu víi s¶n xuÊt n«ng nghiÖp t¹i ViÖt Nam 5
2.2. Thùc tr¹ng vÒ c©y trång biÕn ®æi gen vµ c¸c h−íng chuyÓn gen chÝnh 6
2.2.1 Thùc tr¹ng vÒ c©y trång biÕn ®æi gen vµ c¸c h−íng chuyÓn gen chÝnh thÕ
giíi 7
2.2.2. Thùc tr¹ng vÒ c©y trång biÕn ®æi gen vµ c¸c h−íng chuyÓn gen chÝnh ë
ViÖt Nam 8
2.3. C¬ së khoa häc cña x©y dùng, ®¸nh gi¸ kh¶ n¨ng t¸i sinh 10
2.4.1. §Æc ®iÓm chung cña vi khuÈn Agrobacterim tumefaciens 14
2.5 Kh¸i qu¸t vÒ c©y lóa 22
2.5.1 Nguån gèc, vÞ trÝ vµ ph©n lo¹i 22
2.5.2 T×nh h×nh nghiªn cøu t¸i sinh vµ chuyÓn gen vµo lóa 23
2.5.2 T×nh h×nh nghiªn cøu t¸i sinh vµ chuyÓn gen vµo lóa ë ViÖt Nam 26
2.6 Gen gfp vµ c¸c nghiªn cøu chuyÓn gen gfp vµo thùc vËt 29
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ iv
PHÇN 3 VËT LIÖU, NéI DUNG Vµ PH¦¥NG PH¸P NGHI£N CøU
Error! Bookmark not defined.
3.1 §Þa ®iÓm, vËt liÖu vµ ph¹m vi nghiªn cøu 31
3.1.1 §Þa ®iÓm nghiªn cøu 31
3.1.2 VËt liÖu nghiªn cøu 31
3.1.5 Ph¹m vi nghiªn cøu 36
3.2 Néi dung nghiªn cøu 37
3.2.1 Nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña c¸c c¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr−ëng ®Õn kh¶ n¨ng t¹o
m« sÑo vµ t¸i sinh c©y ë mét sè gièng lóa thuéc loµi phô Japonica. 37
3.2.2. Nghiªn cøu t¹o c©y lóa chuyÓn gen th«ng qua Agrobacterium 37
3.3 Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 39
3.3.1.Bè trÝ thÝ nghiÖm 39
3.3.2 C¸c chØ tiªu theo dâi, ph−¬ng ph¸p thu thËp vµ xö lý sè liÖu 39
3.3.3 Ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy m« vµ chuyÓn gen 40
3.3.4. Ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh biÓu hiÖn cña gen chuyÓn b»ng kÝnh hiÓn vi huúnh
quang 42
PHÇN 4 KÕT QU¶ Vµ TH¶O LUËN 47
4.1 Nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña chÊt ®iÒu hoµ sinh tr−ëng ®Õn kh¶ n¨ng t¹o m«
sÑo vµ t¸i sinh c©y 47
4.1.1 §¸nh gi¸ kh¶ n¨ng t¹o m« sÑo cña c¸c gièng lóa 47
4.1.1.1 ¶nh h−ëng cña t−¬ng t¸c Gièng x MTCL tíi tû lÖ ph¸t sinh m« sÑo 48
4.1.1.2 ¶nh h−ëng cña t−¬ng t¸c Gièng x MTCL ®Õn tû lÖ m« sÑo ph«i hãa 50
4.1.1.3 ¶nh h−ëng cña Gièng tíi thêi gian xuÊt hiÖn vµ ®Æc ®iÓm h×nh th i¸ m« sÑo 53
4.1.1.4 ¶nh h−ëng cña t−¬ng t¸c Gièng x MTCL tíi kÝch th−íc m« sÑo ph«i hãa 55
4.1.1.5 ¶nh h−ëng cña t−¬ng t¸c Gièng x MTCL tíi kh¶ n¨ng t¸i sinh m« sÑo 58
4.1.2 §¸nh gi¸ kh¶ n¨ng t¸i sinh cña c¸c gièng lóa 60
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ v
4.1.2.1 ¶nh h−ëng cña t−¬ng t¸c MTCL x MTTS ®Õn kh¶ n¨ng t¸i sinh cña
c¸c gièng nghiªn cøu 60
4.1.2.3 ¶nh h−ëng cña t−¬ng t¸c Gièng x MTTS ®Õn thêi gian xuÊt hiÖn mµu xanh 64
4.1.2.4 ¶nh h−ëng cña t−¬ng t¸c Gièng x MTTS ®Õn sè chåi trung b×nh/côm
m« sÑo t¸i sinh vµ tû lÖ c©y b¹ch t¹ng 66
4.2 Nghiªn cøu t¹o c©y lóa chuyÓn gen gfp vµ x¸c ®Þnh sù hîp nhÊt cña gen
chuyÓn vµo hÖ gen lóa 69
4.2.1 Nghiªn cøu t¹o c©y lóa chuyÓn gen gfp 69
4.2.2 X¸c ®Þnh sù tån t¹i cña gen chuyÓn 75
4.2.2.1 X¸c ®Þnh sù tån t¹i cña gen chuyÓn b»ng kÝnh hiÓn vi huúnh quang 75
4.2.2.2 X¸c ®Þnh sù tån t¹i cña gen chuyÓn b»ng PCR 77
PHÇN 5 KÕT LUËN Vµ §Ò NGHÞ 79
5.1 KÕt luËn 79
5.2 §Ò nghÞ 80
TÀI LIÖU THAM KH¶O 81
PHô LôC 89
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ vi
DANH MôC C¸C CH÷ VIÕT T¾T Vµ THUËT NG÷
B5 M«i tr−êng Gamborg (1963)
BA 6-Benzyl Amino Purine
Bp (base pair) CÆp baz¬ nit¬
Cs Céng sù
Kb Kilo base
LB- Left Border Biªn bªn tr¸i
RB- Right Border Biªn bªn ph¶i
MS M«i tr−êng Murashige - Skoog (1962)
N6 M«i tr−êng Chu et al (1975)
α-NAA α- Napthalene axetic axit
IAA 3- indole acetic acid
NST NhiÔm S¾c ThÓ
PCR (Polymerase Chain Reaction) Ph¶n øng chuçi trïng hîp
T-DNA (Transfer DNA) §o¹n DNA chuyÓn
Ti-plasmid (Tumor inducing
plasmid)
Plasmid g©y khèi u
Vir (Virulence Region) Vïng g©y ®éc
2,4 D 2,4-D-Dichlorophenoxi axetic axit
MTCL M«i tr−êng t¹o m« sÑo
MTTS M«i tr−êng t¸i sinh
PRM (Pre-regeneration medium) M«i tr−êng tiÒn t¸i sinh
RM (Regeneration medium) M«i tr−êng t¸i sinh
MS-R (MS- Regenration) M«i tr−êng t¹o c©y hoµn chØnh
CCM (Co-culture medium) M«i tr−êng ®ång nu«i cÊy
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 1
PHÇN 1: Më §ÇU
1.1 §Æt vÊn ®Ò
C©y lóa (Oryza sativa L.) lµ mét trong sè c©y l−¬ng thùc quan träng nhÊt
nu«i sèng h¬n 2 tû ng−êi trªn thÕ giíi (Datta, 2004). Do ®ã, c©y lóa ®0 vµ ®ang lµ
®èi t−îng quan t©m cña nhiÒu nhµ nghiªn cøu. C©y lóa ®−îc trång chñ yÕu ë
vïng nhiÖt ®íi vµ cËn nhiÖt ®íi cña c¸c ch©u lôc. Trong ®ã, kho¶ng 90% diÖn
tÝch lóa trång trªn thÕ giíi thuéc vÒ ch©u ¸. C¸c gièng japonica chiÕm kho¶ng
11% s¶n l−îng lóa thÕ giíi (Nathan W. Childs and Linwood Hoffman1,1999).
HiÖn nay, do yªu cÇu cña thùc tiÔn, vÊn ®Ò chuyÓn gen vµo c©y lóa ®0 vµ
®ang ®−îc c¸c nhµ khoa häc trªn kh¾p thÕ giíi ®Æc biÖt quan t©m. ChuyÓn gen
lµ mét trong c¸c chiÕn l−îc quan träng ®−îc sö dông ®Ó ®−a gen ph©n lËp tõ
c¬ thÓ nµo ®ã vµo c©y trång trong cïng hoÆc kh¸c loµi, t¹o ra nh÷ng c©y biÕn
®æi gen cã tÝnh tr¹ng mong muèn. ChuyÓn gen vµo lóa kÕt hîp víi c¸c ph−¬ng
ph¸p chän gièng truyÒn thèng cã thÓ coi lµ mét biÖn ph¸p tèi −u ®Ó t¹o ra c¸c
gièng lóa n¨ng suÊt cao, chÊt l−îng tèt, cã kh¶ n¨ng kh¸ng víi s©u, bÖnh, c¸c
t¸c nh©n v« sinh trong thêi gian ng¾n, vµ cã tÝnh bÒn v÷ng cao.
Cã 2 ph−¬ng ph¸p chuyÓn gen ®ang ®−îc ¸p dông phæ biÕn hiÖn nay lµ
dïng sóng b¾n gen vµ sö dông vi khuÈn Agrobacterium. Tuy nhiªn, chuyÓn
gen th«ng qua vi khuÈn Agrobacterium ngµy cµng ®−îc sö dông nhiÒu h¬n v×
gi¸ thµnh rÎ, thao t¸c ®¬n gi¶n, gen chuyÓn Ýt bÞ bÊt ho¹t do sè b¶n gen chuyÓn
hîp nhÊt vµo hÖ gen thÊp.
HiÖu qu¶ biÕn n¹p gen lóa phô thuéc vµo nhiÒu yÕu tè: ph−¬ng ph¸p biÕn
n¹p, gièng lóa, m« sö dông ®Ó biÕn n¹p, thµnh phÇn m«i tr−êng nu«i cÊy, chÊt
®iÒu hßa sinh tr−ëng vµ ®iÒu kiÖn t¸i sinh c©y [30]. NhiÒu nghiªn cøu ®0 chØ
ra ë c¸c gièng lóa japonica hiÖu qu¶ t¹o m« sÑo vµ t¸i sinh c©y in vitro cao
h¬n ë c¸c gièng indica, do ®ã hiÖu qu¶ biÕn n¹p còng cao h¬n ë c¸c gièng
indica [19][39]. Cho ®Õn nay, hÇu hÕt c¸c quy tr×nh ®−îc c«ng bè ®Òu cho
thÊy ®Ó thu ®−îc c©y lóa biÕn n¹p th«ng th−êng mÊt 3- 4 th¸ng tõ nu«i cÊy
®Çu tiªn. ChØ cã nghiªn cøu cña Toki (1997) biÕn n¹p thµnh c«ng vµo lóa
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 2
japonica trong thêi gian 2 th¸ng vµ Toki et al. (2006) thu ®−îc c©y biÕn n¹p
sau mét th¸ng [63]. Nh− vËy, thêi gian biÕn n¹p vµo c¸c gièng japonica cã thÓ
®−îc rót ng¾n h¬n nhiÒu so víi c¸c gièng indica.
Theo t¸c gi¶ NguyÔn §×nh Giao, NguyÔn ThiÖn Huyªn vµ céng sù (2001)
th× ®iÒu kiÖn vÞ trÝ ®Þa lý cña n−íc ta chñ yÕu thÝch hîp cho sù ph¸t triÓn cña
c¸c gièng lóa thuéc loµi phô indica [7]. Tuy nhiªn, trªn thùc tÕ cã nhiÒu gièng
lóa japonica ®0 ®−îc trång phæ biÕn ë c¸c tØnh miÒn nói phÝa B¾c tõ l©u ®êi vµ
®−îc coi nh− c¸c gièng lóa ®Æc s¶n ®Þa ph−¬ng nh− lóa TÎ Méc Ch©u, TÎ Yªn
B¸i, TÎ n−¬ng Lµo Cai... MÆt kh¸c, trong 10 n¨m trë l¹i ®©y, nhiÒu gièng lóa
japonica ®0 ®−îc ®−a vµo trång t¹i ViÖt Nam, g¹o cña c¸c gièng lóa nµy ®−îc
coi nh− mét lo¹i g¹o ®Æc s¶n, chÊt l−îng cao, ®−îc bao tiªu xuÊt khÈu ®Õn c¸c
thÞ tr−êng khã tÝnh víi gi¸ cao lµm t¨ng hiÖu qu¶ kinh tÕ cho ng−êi n«ng d©n
trång lóa [75].
Nh− vËy, bªn c¹nh viÖc tiÕn hµnh nghiªn cøu chuyÓn gen vµo lóa indica
th× ë n−íc ta viÖc nghiªn cøu chuyÓn gen vµo lóa japonica còng lµ mét h−íng
®i cÇn ®−îc quan t©m ®óng møc.
XuÊt ph¸t tõ nh÷ng lÝ do trªn, chóng t«i tiÕn hµnh nghiªn cøu ®Ò tµi:
“§¸nh gi¸ kh¶ n¨ng t¸i sinh in vitro vµ biÕn n¹p gen GFP vµo lóa Japonica
th«ng qua vi khuÈn Agrobacterium.
1.2 Môc tiªu, ý nghÜa nghiªn cøu
1.2.1 Môc tiªu
- Chän ®−îc m«i tr−êng thÝch hîp ®Ó tû lÖ t¹o m« sÑo, vµ t¸i sinh c©y cao
cho 1 sè gièng lóa japonica.
- Chän ®−îc gièng lóa japonica cã hiÖu qu¶ t¸i sinh cao
- T¹o ®−îc c©y lóa japonica biÕn n¹p mang gen gfp víi hiÖu qu¶ cao,
trong thêi gian ng¾n, lµm cë së ®Ó biÕn n¹p nh÷ng gen cã ý nghÜa kinh tÕ kh¸c
vµo lóa b»ng vi khuÈn Agrobacterium.
1.2.2 ý nghÜa khoa häc vµ ý nghÜa thùc tiÔn cña ®Ò tµi
1.2.2.1 ý nghÜa khoa häc
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 3
- Nghiªn cøu rót ng¾n thêi gian biÕn n¹p gen vµo lóa, n©ng cao hiÖu qu¶
chuyÓn gen.
- B−íc ®Çu x©y dùng quy tr×nh chuyÓn gen vµo lóa japonica
1.2.2.2 ý nghÜa thùc tiÔn
- §¸nh gi¸ ®−îc kh¶ n¨ng t¸i sinh c©y tõ m« sÑo cña mét sè gièng lóa
japonica, lùa chän gièng thÝch hîp cho chuyÓn gen.
- Phôc vô cho chiÕn l−îc chuyÓn gen vµo lóa, t¹o gièng lóa japonica
kh¸ng s©u, kh¸ng h¹n, chÞu rÐt, chÞu nãng, chÞu mÆn...
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 4
PHÇN 2: TæNG QUAN TµI LIÖU
2.1 BiÕn ®æi khÝ hËu - th¸ch thøc lín ®èi víi nÒn s¶n xuÊt n«ng nghiÖp
2.1.1 ¶nh h−ëng cña biÕn ®æi khÝ hËu ®Õn s¶n xuÊt n«ng nghiÖp toµn cÇu
Mét nghiªn cøu ®−îc c«ng bè trªn t¹p chÝ Science [73] chØ ra r»ng, do
biÕn ®æi khÝ hËu (B§KH), Nam Phi cã thÓ mÊt 30% s¶n l−îng ng« vµ c¸c c©y
l−¬ng thùc kh¸c vµo n¨m 2030; khu vùc B¾c ¸ s¶n l−îng g¹o, ng« vµ kª cã thÓ
gi¶m ®Õn 10%. Liªn HiÖp Quèc kªu gäi cÇn ph¶i cã hµnh ®éng khÈn cÊp ngay
tõ th¸ng 3 n¨m 2007 khi gi¸ lóa m×, ®Ëu t−¬ng ®0 t¨ng 87% vµ tiÕp ngay sau ®ã
lµ 130%. Gi¸ c¸c lo¹i l−¬ng thùc chñ lùc nh− g¹o, ng« vµ lóa m× sÏ tiÕp tôc t¨ng
do nhu cÇu, ®Æc biÖt lµ ë Trung Quèc vµ Ên §é, vµ do viÖc sö dông ng«, ®Ëu
t−¬ng cho c¸c nguyªn liÖu thay thÕ ®Ó s¶n xuÊt nhiªn liÖu sinh häc.
Theo b¸o c¸o cña ñy ban liªn chÝnh phñ vÒ B§KH (IPCC), trong 100
n¨m qua nhiÖt ®é toµn cÇu ®0 t¨ng 20C vµ sÏ cßn tiÕp tôc t¨ng vµo thÕ kû tíi.
Tr¸i ®Êt nãng lªn ®ång nghÜa víi viÖc më réng c¸c sa m¹c trªn diÖn réng,
®ång thêi mùc n−íc biÓn d©ng do sù tan ch¶y cña b¨ng hµ sÏ nhÊn ch×m
nh÷ng vïng ®Êt duyªn h¶i, khiÕn mét diÖn tÝch lín ®Êt n«ng nghiÖp biÕn mÊt.
Ch−¬ng tr×nh ph¸t triÓn liªn hîp quèc (UNDP) [74] dù b¸o, cuéc x©m l¨ng
hµnh tinh xanh cña sa m¹c sÏ khiÕn vïng cËn Sahara cã thÓ më réng thªm 60 -
90 triÖu hecta vµo n¨m 2060, g©y thiÖt h¹i kho¶ng 26 tû USD. Mét nghiªn cøu
kh¸c còng chØ ra r»ng, ®Õn n¨m 2100, Mü sÏ mÊt kho¶ng 5000 dÆm mÐt vu«ng
®Êt kh« r¸o vµ 4000 dÆm mÐt vu«ng ®Êt −ít do n−íc biÓn d©ng. Còng theo tæ
chøc FAO (FAO report, 2007) th«ng b¸o r»ng, c¸c n−íc ®ang ph¸t triÓn sÏ
mÊt ®i 11% diÖn tÝch ®Êt canh t¸c sö dông n−íc m−a vµo n¨m 2080 so víi n¨m
1995 vµ 65 n−íc ®ang ph¸t triÓn cã thÓ mÊt tíi 280 triÖu tÊn ngò cèc, −íc tÝnh trÞ
gi¸ kho¶ng 56 tû USD do B§KH [72].
LÜnh vùc s¶n xuÊt n«ng nghiÖp chiÕm 1/3 doanh thu xuÊt khÈu cña h¬n
50 quèc gia vµ cung cÊp kho¶ng mét nöa viÖc lµm ë c¸c n−íc ph¸t triÓn. §èi
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 5
víi nh÷ng n«ng d©n ë c¸c n−íc nghÌo th× sù sinh tån phô thuéc hoµn toµn vµo
gieo trång. Nh÷ng quan s¸t vµ tiªn ®o¸n cña c¸c m« h×nh thêi tiÕt chØ ra r»ng,
khi Tr¸i ®Êt nãng lªn khiÕn thêi tiÕt ë Ch©u Phi ngµy cµng bÊt æn, l−îng m−a
gi¶m nh−ng ®ång thêi tÇn suÊt xuÊt hiÖn nh÷ng c¬n b0o cã chiÒu h−íng t¨ng
nhanh tõ vµi thËp niªn trë l¹i ®©y. Theo mét ®iÒu tra cho thÊy, nh÷ng vïng cËn
Sahara, tû lÖ t¨ng tr−ëng kinh tÕ ®i ®«i víi l−îng m−a. Bªn c¹nh ®ã, tèc ®é hãa
sa m¹c diÖn réng ®ang trë thµnh nh÷ng trë lùc ®èi víi qu¸ tr×nh xãa ®ãi ë
Ch©u Phi, Trung Quèc vµ Nam ¸. Theo b¸o c¸o cña Uû ban liªn chÝnh phñ vÒ
thay ®æi khÝ hËu (IPCC) [70], sè ng−êi ®ãi ë Ch©u Phi vïng cËn Sahara hiÖn
nay ®0 v−ît qua con sè 300 triÖu ng−êi. Dù b¸o, do t¸c ®éng cña h¹n h¸n, ®Õn
n¨m 2020, n¨ng suÊt c©y trång ë c¸c vïng ®Êt n«ng nghiÖp ë ch©u lôc nµy sÏ
gi¶m 10 - 20%. Cßn ®èi víi Trung Quèc, trong vßng 20 - 80 n¨m n÷a, s¶n
l−îng lóa, ng« cã thÓ gi¶m 37% [71].
2..1.2. BiÕn ®æi khÝ hËu víi s¶n xuÊt n«ng nghiÖp t¹i ViÖt Nam
B§KH ®ang lµ mèi quan t©m chung cña céng ®ång. §Æc biÖt, víi mét
n−íc cã nÒn kinh tÕ n«ng nghiÖp nh− ViÖt Nam th× ¶nh h−ëng cña B§KH ®èi
víi n«ng nghiÖp nãi riªng vµ n«ng th«n nãi chung cµng ®−îc quan t©m h¬n
lóc nµo hÕt. Theo c¸c nhµ khoa häc th× ViÖt Nam lµ mét trong hai n−íc ®ang
ph¸t triÓn bÞ t¸c ®éng bëi B§KH tåi tÖ nhÊt trªn thÕ giíi. Th¸ng 2 n¨m 2007
Ng©n hµng ThÕ giíi ®−a ra dù b¸o: “NÕu hiÖn t−îng nãng lªn toµn cÇu lµm
cho mùc n−íc biÓn d©ng lªn th× −íc tÝnh sÏ cã kho¶ng 17 - 19 triÖu ng−êi ViÖt
Nam mÊt ®Êt ë, mét phÇn rÊt lín ®Êt trång trät còng sÏ bÞ ngËp d−íi mùc n−íc
biÓn”. Mùc n−íc biÓn d©ng lªn 1m cã thÓ lµm mÊt 12,2% diÖn tÝch ®Êt, lµ n¬i
c− tró cña 23% d©n sè, lµ mét n−íc n«ng nghiÖp, song n«ng d©n ViÖt Nam,
®Æc biÖt lµ n«ng d©n vïng ven biÓn cã rÊt Ýt ®Êt ®Ó canh t¸c. V× vËy, viÖc mÊt
®i mét phÇn rÊt lín quü ®Êt trång do B§KH cïng víi viÖc ®« thÞ hãa vµ c«ng
nghiÖp hãa sÏ ®Æt ViÖt Nam tr−íc mét th¸ch thøc rÊt nghiªm träng.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 6
B§KH g©y rèi lo¹n chÕ ®é m−a n¾ng, nguy c¬ nãng nhiÒu h¬n, l−îng
m−a thay ®æi sÏ dÉn ®Õn hiÖn t−îng xãi mßn vµ röa tr«i ®Êt, t¸c ®éng m¹nh
mÏ ®Õn vÊn ®Ò n−íc s¹ch vµ vÖ sinh m«i tr−êng n«ng th«n. ViÖt Nam cã
kho¶ng 25 triÖu hecta ®Êt dèc, chiÕm hÇu hÕt diÖn tÝch ®Êt miÒn nói vµ trung
du, ®Æc ®iÖt lµ vïng T©y B¾c ®Êt dèc chiÕm 98% nªn nguy c¬ tho¸i hãa vµ xãi
mßn lµ rÊt lín. Sù tho¸i hãa ®Êt t¹i nhiÒu vïng, sù tho¸i hãa ®Êt cßn kÐo theo
c¶ sù suy tho¸i vÒ hÖ thùc vËt, ®éng vËt vµ m«i tr−êng ®Þa ph−¬ng lµm cho
diÖn tÝch ®Êt n«ng nghiÖp gi¶m xuèng ®Õn møc b¸o ®éng.
Ban chØ ®¹o vÒ B§KH cña Bé N«ng nghiÖp vµ Ph¸t triÓn N«ng Th«n cho
r»ng, n¨ng suÊt c©y trång còng sôt gi¶m râ rÖt. VÝ nh−, n¨ng suÊt ng« sÏ gi¶m
tõ 5 - 20% nÕu nhiÖt ®é tr¸i ®Êt t¨ng thªm 1oC vµ gi¶m tíi 60% nÕu nhiÖt ®é
t¨ng thªm 4oC. KÕt qu¶ cña ViÖn Nghiªn cøu Lóa quèc tÕ (IRRI) cho thÊy,
n¨ng suÊt lóa còng gi¶m 10% ®èi víi mçi 1oC t¨ng lªn. Theo −íc tÝnh cña
IPCC, nÕu mùc n−íc biÓn d©ng cao 1m th× lµm cho 22 triÖu ng−êi ViÖt Nam
mÊt nhµ cöa, ®ång b»ng S«ng Hång sÏ bÞ ngËp 5.000 km2 vµ ®ång b»ng S«ng
Cöu Long bÞ ngËp 15.000 - 20.000 km2; mµ ®©y lµ hai vùa lóa lín nhÊt, tËp
trung ®«ng d©n c− nhÊt c¶ n−íc. MÊt ®Êt, s¶n l−îng l−¬ng thùc cña ViÖt Nam
sÏ gi¶m 12% (xÊp xØ 5 triÖu tÊn).
Qua c¸c th«ng tin trªn cã thÓ thÊy r»ng, biÕn ®æi khÝ hËu ®ang g©y ra
nhiÒu x¸o ®éng vµ th¸ch thøc ®èi víi nÒn n«ng nghiÖp toµn cÇu nãi chung vµ
n«ng nghiÖp n−íc ta nãi riªng. H¹n h¸n, lò lôt, nhiÒu vïng ®Êt ®ang s¶n xuÊt
hiÖn nay cã thÓ sÏ trë thµnh sa m¹c, hoÆc bÞ ngËp ch×m trong n−íc mÆn, thùc
tiÔn ®ã ®Æt ra nhu cÇu lín vÒ c¸c gièng c©y trång míi cã kh¶ n¨ng chÞu h¹n,
chÞu mÆn, chÞu rÐt, chÞu nãng trong t−¬ng lai. Nghiªn cøu t¹o c©y chuyÓn gen
chÝnh lµ mét b−íc ®ét ph¸ ®Ó mau chãng cã ®−îc gièng c©y trång míi ®¸p
øng ®−îc nh÷ng ®ßi hái cña nÒn s¶n xuÊt n«ng nghiÖp tr−íc nh÷ng biÕn ®æi
kh¾c nghiÖt cña khÝ hËu toµn cÇu.
2.2 Thùc tr¹ng vÒ c©y trång biÕn ®æi gen vµ c¸c h−íng chuyÓn gen chÝnh
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 7
2.2.1 Thùc tr¹ng vÒ c©y trång biÕn ®æi gen vµ c¸c h−íng chuyÓn gen
chÝnh trªn thÕ giíi
Nh÷ng gièng c©y trång míi ®−îc t¹o ra b»ng c«ng nghÖ gen th−êng ®−îc
gäi t¾t lµ GMO víi nghÜa lµ c¬ thÓ sèng biÕn ®æi di truyÒn (Genetically
Modified Organism) [18].
N¨m 1996 ®−îc coi lµ n¨m khëi ®Çu cña kû nguyªn ph¸t triÓn s¶n xuÊt
c¸c c©y trång biÕn ®æi gen, khi gièng c©y trång biÕn ®æi gen ®Çu tiªn ®−îc
th−¬ng m¹i hãa ë Mü. Trong 10 n¨m qua, diÖn tÝch canh t¸c c©y trång biÕn
®æi gen liªn tôc t¨ng lªn. §Õn n¨m 2006, c©y trång chuyÓn gen ®0 ®−îc s¶n
xuÊt th−¬ng m¹i ë 22 quèc gia, ®¹t diÖn tÝch toµn cÇu 102 triÖu hecta, t¨ng 12
triÖu hecta so víi n¨m 2005. N−íc cã diÖn tÝch trång c©y chuyÓn gen lín nhÊt
lµ Mü, tiÕp ®Õn lµ Argentina, Brasil vµ Canada. DiÖn tÝch c©y chuyÓn gen ë
Trung Quèc vµ Ên ®é còng t¨ng m¹nh víi c©y trång chñ lùc lµ b«ng kh¸ng
s©u. Ng−îc l¹i víi xu thÕ ®ãn nhËn c©y chuyÓn gen m¹nh mÏ ë c¸c n−íc ch©u
Mü, c¸c n−íc Ch©u ¢u rÊt thËn träng víi c©y trång chuyÓn gen, gi÷ lËp tr−êng
ph¶n ®èi th−¬ng m¹i ho¸ c©y trång chuyÓn gen. Do vËy, ng−êi ta míi chØ thÊy
mét sè ®iÓm trång thö nghiÖm c©y trång biÕn ®æi gen ë Ch©u ¢u. Ngo¹i lÖ,
T©y Ban Nha lµ n−íc Ch©u ¢u duy nhÊt cã diÖn tÝch c©y biÕn ®æi gen th−¬ng
m¹i trªn 66.000 ha vµo n¨m 2006 [18].
§Ëu t−¬ng, ng«, b«ng vµ c¶i dÇu lµ 4 c©y trång chuyÓn gen chñ lùc,
chiÕm hÇu hÕt diÖn tÝch c©y trång chuyÓn gen toµn cÇu. C¸c c©y trång biÕn ®æi
gen kh¸c nh− ®u ®ñ, cµ chua, khoai t©y, cñ c¶i ®−êng mang c¸c gen kh¸ng
virus míi chØ ®−îc trång trªn diÖn hÑp do ng−êi tiªu dïng ch−a chÊp nhËn.
VÒ ®Æc tÝnh sinh häc, c¸c gièng c©y trång GMO s¶n xuÊt trªn thÕ giíi
®−îc chia thµnh c¸c nhãm sau:
- Gièng GMO kh¸ng thuèc diÖt cá
- Gièng GMO kh¸ng s©u
- Gièng GMO kh¸ng virus
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 8
- Gièng GMO kh¸ng bªnh nÊm
- Gièng GMO c¶i thiÖn chÊt l−îng s¶n phÈm
- Gièng GMO c¶i thiÖn tÝnh tr¹ng n«ng nghiÖp vµ tÝnh tr¹ng kh¸c
§©y còng chÝnh lµ c¸c h−íng chuyÓn gen chÝnh cña c¸c nhµ khoa häc
vµo c©y trång.
C¸c tÝnh tr¹ng quan träng nhÊt ë c©y trång biÕn ®æi gen hiÖn nay ®øng ®Çu
lµ gen kh¸ng chÊt diÖt cá. N¨m 1996, gièng kh¸ng chÊt diÖt cá míi ®−îc trång
trªn diÖn tÝch 0,6 triÖu hecta, ®Õn n¨m 2006 lªn ®Õn 69,9 triÖu hecta. TÝnh tr¹ng
kh¸ng s©u chiÕm vÞ trÝ thø 2, chñ yÕu lµ gen Bt (Bt toxin gen), n¨m 1996 gièng
kh¸ng s©u ®−îc trång trªn diÖn tÝch 1,1 triÖu hecta, ®Õn n¨m 2006 diÖn tÝch nµy
t¨ng lªn 19,0 triÖu hecta. C¸c gièng c©y trång mang ®ång thêi hai gen kh¸ng
s©u vµ gen kh¸ng thuèc diÖt cá n¨m 1997 míi ®−îc trång trªn diÖn tÝch nhá h¬n
0,1 triÖu hecta, ®Õn n¨m 2006 t¨ng lªn 13,1 triÖu hecta. C¸c gièng mang gen
kh¸ng virus mÆc dï ®0 ®−îc th−¬ng m¹i ho¸ tõ n¨m 1996 nh−ng cho tíi n¨m
2006 diÖn tÝch nµy vÉn chØ dõng ë møc d−íi 0,1 triÖu hecta trong tæng sè 102,0
triÖu hecta c©y trång biÕn ®æi gen toµn cÇu (ISAAA, 2007) [18].
C¸c gièng c©y trång biÕn ®æi gen ®i vµo s¶n xuÊt nhanh nh− vËy lµ nhê
t¨ng n¨ng suÊt, ®ång thêi gi¶m chi phÝ s¶n xuÊt trªn mét ®¬n vÞ diÖn tÝch, vÝ dô:
- Gi¶m chi do trång c¸c gièng ®Ëu t−¬ng kh¸ng thuèc diÖt cá (Roundup
ready soya) n¨m 1998: 30 USD/ha ( gi¶m 40% chÊt diÖt cá).
- Gi¶m chi phÝ do trång c¸c gièng b«ng Bt cña Novartis n¨m 1997: 42 USD/ha.
- Gi¶m chi phÝ do sö dông c¸c gièng b«ng chuyÓn gen n¨m 1998: 133
USD/ha/n¨m.
Trong khu vùc Asean, mét sè n−íc nh− Th¸i Lan, Philippin, Malaysia
còng ®0 tham gia vµo lÜnh vùc nghiªn cøu vµ th−¬ng m¹i ho¸ mét sè gièng c©y
trång biÕn ®æi gen (ISAAA, 2007)[18].
2.2.2. Thùc tr¹ng vÒ c©y trång biÕn ®æi gen vµ c¸c h−íng chuyÓn gen
chÝnh ë ViÖt Nam
ë ViÖt Nam, nghiªn cøu t¹o gièng c©y trång biÕn ®æi gen cßn ë møc
kh¸ s¬ khai do mét sè yÕu tè h¹n chÕ sau:
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 9
- C¬ së sinh häc cña t¹o gièng c©y trång biÕn ®æi gen cßn yÕu: Ch−a ph©n
lËp, c¶i biÕn vµ thiÕt kÕ ®−îc c¸c gen cã gi¸ trÞ. C¸c vector mang gen tuy ®−îc
thiÕt kÕ nh−ng ch−a ®−îc ®¸nh gi¸ biÓu hiÖn ë c¸c c©y chuyÓn gen. Do vËy, cã
thÓ nãi r»ng chóng ta hÇu nh− ch−a cã ®−îc c¸c gen ®−îc thiÕt kÕ hîp lý.
- Quy tr×nh t¸i sinh c©y tõ tÕ bµo nu«i cÊy in vitro ë c¸c ®èi t−îng c©y
chuyÓn gen cßn ch−a tèt, hiÖu qu¶ t¸i sinh ch−a cao, trong khi ®ã c¸c nhµ
khoa häc quèc tÕ ®0 kh¼ng ®Þnh vai trß quyÕt ®Þnh ®èi víi thµnh c«ng trong
chuyÓn gen phô thuéc vµo hÖ thèng t¸i sinh cña tÕ bµo, m« vµ kiÓu gen cña
c©y trång trong ®iÒu kiÖn nu«i cÊy in vitro.
§Ó t¹o ra thµnh c«ng trong øng dông kü thuËt chuyÓn gen ë c©y trång,
vÊn ®Ò sè mét ®Æt ra lµ ph¶i:
- X©y dùng ®−îc c¬ së sinh häc ph©n tö vµ c«ng nghÖ tÕ bµo cña c«ng
nghÖ gen. Chóng ta ph¶i cã trong tay mét tµi nguyªn di truyÒn phong phó gåm
nhiÒu gen cã gi¸ trÞ, ph©n lËp vµ thiÕt kÕ ®−îc nhiÒu gen, nhiÒu vector chuyÓn
gen trªn c¬ së hiÓu biÕt s©u s¾c vÒ hÖ ®iÒu hµnh ho¹t ho¸ cña tõng gen hoÆc
nhãm gen. §ång thêi chóng ta ph¶i cã trong tay hÖ thèng nu«i cÊy tÕ bµo cã
kh¶ n¨ng t¸i sinh c©y cao ®Ó n©ng cao hiÖu qu¶ cña thao t¸c chuyÓn gen.
- X©y dùng ®−îc ph−¬ng ph¸p chuyÓn gen hiÖu qu¶ cao, t¹o ®−îc nhiÒu
c©y chuyÓn gen víi c¸c vÞ trÝ cµi gen kh¸c nhau trªn nhiÔm s¾c thÓ cña c©y
chñ. Tõ ®ã chän ®−îc c©y chuyÓn gen cã ho¹t ho¸ tèi −u cña gen chuyÓn.
- Phèi hîp tèt gi÷a c«ng nghÖ gen víi c«ng nghÖ chän gièng truyÒn thèng.
Kinh nghiÖm trªn thÕ giíi cho thÊy c¸c gen kinh tÕ quan träng nh−
kh¸ng s©u, kh¸ng chÊt diÖt cá chØ cã gi¸ trÞ khi nã ®−îc chuyÓn vµo c¸c gièng
c©y trång tèt nhÊt. Ng−êi ta cho r»ng Mosanto ®0 ph¶i bá ra kho¶ng 5,5 tû
USD ®Ó mua b¶n quyÒn sö dông c¸c gièng c©y trång tèt nhÊt (ng«, ®Ëu t−¬ng,
b«ng, c¶i dÇu...) cña c¸c c«ng ty gièng kh¸c nhau.Trong khi ®ã chØ tèn kho¶ng
450,0 triÖu USD trong 15 n¨m ®Ó tiÕn hµnh chuyÓn gen thµnh c«ng vµo c¸c
gièng c©y ®ã. Qua ®ã ta thÊy, thµnh c«ng cña c«ng nghÖ chän gièng truyÒn
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 10
thèng lµ rÊt lín, nÕu vÝ c¸c thµnh tùu cña khoa häc chän t¹o gièng truyÒn
thèng lµ c¸c kim tù th¸p cao ngÊt th× c¸c gen ®−îc c«ng nghÖ sinh häc hiÖn
®¹i t¹o ra chÝnh lµ nh÷ng ng«i sao s¸ng, ng«i sao chØ lÊp l¸nh nhÊt, ®Ñp nhÊt
khi ®−îc ®Æt trªn ®Ønh cña c¸c kim tù th¸p cao ngÊt kia. Do vËy, c¸c nhµ ho¹ch
®Þnh chÝnh s¸ch vµ c¸c nhµ khoa häc cÇn cã t− duy lÞch sö vµ hÖ thèng ®èi víi
thµnh tùu cña di truyÒn t¹o gièng truyÒn thèng vµ kü thuËt gen ®Ó x¸c ®Þnh
b−íc ®i vµ tæ chøc hÖ thèng tèt nhÊt cho sù ph¸t triÓn bÒn v÷ng kü thuËt nµy ë
n−íc ta, trong ®ã sù kÕt hîp nhuÇn nhuyÔn gi÷a kü thuËt gen vµ di truyÒn chän
gièng truyÒn thèng lµ rÊt cÇn thiÕt [18].
Cïng víi xu thÕ chung cña chuyÓn gen thÕ giíi, chuyÓn gen ë ViÖt Nam
hiÖn nay cã môc ®Ých t¹o ra c¸c gièng c©y trång cã n¨ng suÊt cao, æn ®Þnh, cã
kh¶ n¨ng chèng chÞu tèt víi s©u bÖnh vµ c¸c ®iÒu kiÖn ngo¹i c¶nh bÊt lîi.
2.3 C¬ së khoa häc cña x©y dùng, ®¸nh gi¸ kh¶ n¨ng t¸i sinh
2.3.1 C¬ së khoa häc cña x©y dùng vµ ®¸nh gi¸ kh¶ n¨ng t¸i sinh
ViÖc x©y dùng vµ ®¸nh gi¸ kh¶ n¨ng t¸i sinh cña c©y trång cã thÓ thùc
hiÖn ®−îc nhê vµo tÝnh toµn n¨ng cña tÕ bµo thùc vËt.
TÝnh toµn n¨ng cña tÕ bµo thùc vËt lµ kh¶ n¨ng cña c¸c tÕ bµo ®0 ®−îc
biÖt hãa (trõ mét sè lo¹i tÕ bµo ®0 biÖt hãa s©u nh− èng m¹ch, mao dÉn…) cã
kh¶ n¨ng thÓ hiÖn toµn bé hÖ thèng di truyÒn vµ trong ®iÒu kiÖn phï hîp cã
thÓ ph¸t triÓn ph«i dÉn ®Õn viÖc h×nh thµnh c©y hoµn chØnh míi.
Trong mét c¬ thÓ thùc vËt bao gåm nhiÒu c¬ quan chøc n¨ng kh¸c
nhau, trong ®ã cã nhiÒu lo¹i tÕ bµo kh¸c nhau thùc hiÖn c¸c chøc n¨ng kh¸c
nhau. C¸c m« cã cÊu tróc chuyªn m«n nhÊt ®Þnh lµ nhê sù ph©n hãa. Ph©n hãa
tÕ bµo lµ sù chuyÓn hãa c¸c tÕ bµo ph«i sinh thµnh c¸c tÕ bµo cña m« chuyªn
hãa, ®¶m nhËn c¸c chøc n¨ng kh¸c nhau trong c¬ thÓ. Trong ®iÒu kiÖn thÝch
hîp, c¸c tÕ bµo ph©n hãa cã thÓ trë vÒ d¹ng tÕ bµo ph«i sinh vµ l¹i ph©n chia
m¹nh mÏ. Qu¸ tr×nh nµy gäi lµ qu¸ tr×nh ph¶n ph©n hãa.
§¸nh gi¸ kh¶ n¨ng t¸i sinh cña c¸c gièng c©y trång cã thÓ ®−îc tiÕn
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 11
hµnh dùa trªn viÖc x©y dùng mét hÖ thèng t¸i sinh in vitro cã hiÖu qu¶ t¸i sinh
cao tõ mét gièng ®iÓn h×nh.
2.3.2 Mét sè hÖ thèng t¸i sinh sö dông cho biÕn n¹p gen
C¸c ph−¬ng ph¸p chuyÓn gen vµo c¸c tÕ bµo hay m«, yªu cÇu m« vµ tÕ
bµo ®ã ph¶i cã kh¶ n¨ng t¸i sinh thµnh c©y th× biÕn n¹p gen ®−îc thùc hiÖn
míi cã ý nghÜa. V× vËy, kh¶ n¨ng t¸i sinh cao lµ ®iÒu kiÖn quan träng ®Ó thùc
hiÖn thµnh c«ng biÕn n¹p gen víi hiÖu qu¶ cao.
Mét sè hÖ thèng nu«i cÊy th−êng ®−îc sö dông:
- Nu«i cÊy ph©n hãa gåm: Nu«i cÊy ®Ønh sinh tr−ëng vµ chåi bªn; nu«i
cÊy t¹o chåi bÊt ®Þnh vµ nu«i cÊy t¹o ph«i v« tÝnh. §©y lµ nh÷ng ph−¬ng ph¸p
dùa trªn c¬ së nu«i cÊy m«, tõ c¸c c¬ quan x¸c ®Þnh cã sù ph©n hãa h×nh
thµnh nªn c¸c c¬ quan míi.
- Nu«i cÊy kh«ng ph©n hãa: tõ c¸c m«, c¬ quan nu«i cÊy sÏ t¹o nªn c¸c
khèi tÕ bµo v« tæ chøc, kh«ng cã h×nh d¹ng nhÊt ®Þnh, gäi lµ m« sÑo (hay
callus). ë m«i tr−êng thÝch hîp, m« sÑo ®−îc nu«i cÊy ®Ó t¨ng sinh khèi.
- Nu«i cÊy m« sÑo: M« sÑo lµ khèi c¸c tÕ bµo m« mÒm cã møc ®é cÊu
tróc di truyÒn thÊp, ch−a ph©n hãa, ph©n chia mét c¸ch hçn lo¹n vµ cã tÝnh
biÕn ®éng di truyÒn cao. M« sÑo thu ®−îc b»ng nu«i cÊy in vitro c¸c c¬ quan
cña thùc vËt nh− th©n, l¸, h¹t, ph«i non trong m«i tr−êng nu«i cÊy thÝch hîp.
M« sÑo cã thÓ ®−îc duy tr× liªn tôc trªn m«i tr−êng nu«i cÊy b»ng c¸ch cÊy
chuyÓn ®Þnh k×.
- Nu«i cÊy tÕ bµo huyÒn phï: §©y lµ kü thuËt nu«i cÊy tÕ bµo ®¬n hoÆc
côm nhá tÕ bµo trong m«i tr−êng láng. Tuy nhiªn, nh−îc ®iÓm cña ph−¬ng
ph¸p nµy lµ thêi gian nu«i cÊy dµi, lµm gi¶m kh¶ n¨ng t¸i sinh c©y do tÕ bµo dÔ
bÞ mäng n−íc.
- Nu«i cÊy tÕ bµo trÇn: TÕ bµo thùc vËt bÞ ph¸ bá hoµn toµn líp vá bao
bäc chØ cßn l¹i khèi nguyªn sinh chÊt ®−îc bao bäc bëi mµng nguyªn sinh
®−îc nu«i cÊy trªn m«i tr−êng thÝch hîp th× t¸i t¹o thµnh tÕ bµo, ph¸t triÓn
thµnh khèi m« sÑo vµ t¸i sinh c©y hoµn chØnh. øng dông cã ý nghÜa nhÊt cña
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 12
ph−¬ng ph¸p nµy lµ t¹o c©y soma, t¹o c©y lai tÕ bµo chÊt th«ng qua dung hîp
tÕ bµo trÇn vµ biÕn n¹p gen.
Tuy nhiªn, nh»m môc ®Ých x©y dùng hÖ thèng t¸i sinh vµ ®¸nh gi¸ kh¶
n¨ng t¸i sinh c©y phôc vô chuyÓn gen, chóng ta cÇn nghiªn cøu ®Õn kh¶ n¨ng
sèng sãt cña tÕ bµo sau khi chuyÓn gen trªn m«i tr−êng chän läc. Do vËy, hÖ
thèng nu«i cÊy m« sÑo thÝch hîp h¬n c¶ v× hÖ thèng cho tû lÖ t¸i sinh c©y cao;
thêi gian nu«i cÊy kh«ng qu¸ dµi; thao t¸c nu«i cÊy ®¬n gi¶n. T¸i sinh c©y qua
con ®−êng m« sÑo cã thÓ h×nh thµnh ph«i hay t¸i sinh t¹o chåi trùc tiÕp. C©y t¸i
sinh tõ ph«i soma xuÊt ph¸t tõ mét tÕ bµo ®¬n, riªng lÎ vµ ph¸t triÓn thµnh mét
c©y hoµn chØnh nªn duy tr× ®−îc tÝnh ®ång nhÊt cña hÖ gen, do vËy h¹n chÕ hiÖn
t−îng kh¶m ë c©y chuyÓn gen [1].
2.3.3 Nh÷ng thay ®æi di truyÒn x¶y ra trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy in vitro
HiÖn t−îng phæ biÕn x¶y ra trong nu«i cÊy m« in vitro lµ biÕn dÞ tÕ bµo
soma. C¨n cø vµo quy luËt cña Vavilop, trong nh÷ng ®iÒu kiÖn m«i tr−êng
gièng nhau cã thÓ quan s¸t thÊy c¸c biÕn dÞ di truyÒn gièng nhau ë c¸c loµi
gÇn nhau vÒ ph©n lo¹i. Nguyªn nh©n c¬ b¶n dÉn ®Õn c¸c biÕn dÞ (®ét biÕn) x¶y
ra trong tÕ bµo nu«i cÊy in vitro:
- TÕ bµo chÞu t¸c ®éng trùc tiÕp cña c¸c chÊt hãa häc trong m«i tr−êng
nu«i cÊy.
- Trong ®iÒu kiÖn in vitro, c¸c gen di ®éng (tranposon) hay cßn gäi lµ c¸c
“gen nh¶y” ho¹t ®éng rÊt m¹nh. Ho¹t ®éng cña c¸c gen nh¶y phô thuéc vµo
kiÓu gen vµ ®iÒu kiÖn m«i tr−êng. Trong nu«i cÊy m«, c¸c gen nµy di chuyÓn
tÝch cùc, nã cã thÓ cµi vµo bÊt k× gen nµo trªn nhiÔm s¾c thÓ (NST) vµ g©y ra
tÇn sè ®ét biÕn rÊt cao.
Orton (1984) cho biÕt trong thêi gian nu«i cÊy trªn m«i tr−êng dinh
d−ìng, hÖ gen cña c¸c tÕ bµo thùc vËt ®0 tr¶i qua qu¸ tr×nh c¶i tæ nhanh chãng
vµ ®0 ph¸t hiÖn nh÷ng thay ®æi sè l−îng, cÊu tróc NST, ®ét biÕn gen. TÇn sè
®ét biÕn gen nhiÒu khi rÊt cao (10-2 - 10-1) tÝnh theo locus trªn c©y. Thay ®æi di
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 13
truyÒn phæ biÕn x¶y ra trong tÕ bµo nu«i cÊy lµ ®a béi thÓ. Sau khi m« ®−îc
nu«i cÊy, nh©n tÕ bµo cã thÓ x¶y ra qu¸ tr×nh néi ph©n lµm sè l−îng NST t¨ng
lªn gÊp ®«i hoÆc h¬n n÷a nh−ng kh«ng x¶y ra ph©n chia tÕ bµo. KÕt qu¶ sè
l−îng NST cña tÕ bµo t¨ng lªn [16].
* §ét biÕn di truyÒn trong nu«i cÊy m« lóa:
§ét biÕn tÕ bµo soma ®0 ®−îc ph¸t hiÖn bëi nhiÒu c«ng tr×nh nu«i cÊy tÕ
bµo lóa. Nhµ khoa häc NhËt B¶n Oono (1978) ®0 t¸i sinh c©y qua m« sÑo cã
nguån gèc tõ h¹t cña c©y nhÞ béi ®ång hîp gåm 75 h¹t vµ ®0 chøng minh ®Çy
søc thuyÕt phôc vÒ sù tån t¹i cña ®ét biÕn tÕ bµo soma vµ di truyÒn ®ét b._.iÕn
cña nã. Phæ biÕn dÞ di truyÒn réng ®0 quan s¸t thÊy ë c¸c ®Æc ®iÓm nh− ®é h÷u
thô cña h¹t, chiÒu cao c©y, thêi gian trç. §ét biÕn s¾c tè thÊy ë 8,4 % sè dßng.
Ph©n tÝch c©y t¸i sinh tõ m« sÑo cho biÕt ®a sè c¸c biÕn ®æi di truyÒn x¶y ra
trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy. Ph©n tÝch di truyÒn cho thÊy ®ét biÕn x¶y ra ë n¨m
tÝnh tr¹ng vµ biÓu hiÖn víi tÇn sè 0,03 - 0,7% trªn mét lÇn ph©n bµo (Oono,
1978). Fukui (1983) ®0 nhËn ®−îc 12 c©y t¸i sinh qua m« sÑo cã nguån gèc tõ
1 h¹t lóa, trong ®ã ®0 t¸ch ®−îc c¸c ®ét biÕn kh¸c nhau nh− ®ét biÕn chÝn
sím, b¹ch t¹ng, ®ét biÕn thÊp c©y vµ bÊt dôc (Fukui, 1983). Dabarth (1983)
còng nhËn ®−îc c¸c d¹ng ®ét biÕn lóa cã ý nghÜa thùc tiÔn tõ mét m« sÑo ban
®Çu. TÇn sè ®ét biÕn tû lÖ thuËn víi tuæi m« sÑo [16].
C¸c c«ng tr×nh nghiªn cøu ë trªn chøng tá tÇn sè ®ét biÕn cao vµ phæ
biÕn dÞ réng trong nu«i cÊy m« lóa cã ý nghÜa quan träng ®èi víi chän gièng.
Ph©n tÝch ®a h×nh ®é dµi ®o¹n ph©n c¾t DNA ë c¸c c©y lóa t¸i sinh tõ nu«i cÊy
m« cho thÊy 23 % sè c©y t¹o ®−îc tõ nu«i cÊy in vitro dµi h¹n ®0 thÓ hiÖn c¸c
biÕn ®æi trong cÊu tróc DNA, so víi 6,3 % c©y t¸i sinh tõ nu«i cÊy ng¾n h¹n.
Nh− vËy, thêi gian nu«i cÊy tÕ bµo kÐo dµi ë tr¹ng th¸i ch−a ph©n hãa lµ mét
yÕu tè quan träng lµm ph¸t sinh c¸c ®ét biÕn gen vµ sau ®ã thÓ hiÖn ®ét biÕn ë
kiÓu h×nh c©y t¸i sinh [17].
2.4 Agrobacterium tumefaciens vµ c¬ chÕ chuyÓn gen vµo thùc vËt
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 14
2.4.1 §Æc ®iÓm chung cña vi khuÈn Agrobacterim tumefaciens
Agrobacterium lµ c¸c vi khuÈn ®Êt nhuém gram (-) g©y ra c¸c triÖu
chøng bÖnh ë c©y khi x©m nhiÔm qua vÕt th−¬ng, t¹o ra c¸c u sÇn ¶nh h−ëng
®Õn sù sinh tr−ëng b×nh th−êng cña c©y bÞ x©m nhiÔm [2], [4].
Trong tù nhiªn, A. tumefaciens chñ yÕu tÊn c«ng c©y hai l¸ mÇm, ®Æc biÖt
lµ nhãm thùc vËt cã hoa. Hoµn toµn kh¸c víi m« vµ tÕ bµo thùc vËt b×nh
th−êng, khèi u do A. tumefaciens sinh ra ph¸t triÓn rÊt m¹nh ngay trong ®iÒu
kiÖn thiÕu hoocmon sinh tr−ëng (auxin vµ cytokinin). §ã lµ do A. tumefaciens
®0 chuyÓn mét ®o¹n T-DNA (Transfer DNA) sang tÕ bµo thùc vËt vµ T-DNA
®iÒu khiÓn qu¸ tr×nh sinh tæng hîp c¸c c¸c chÊt ®ã. Ngoµi ra, c¸c khèi u còng
sinh tæng hîp c¸c opin lµ c¸c axit amin, ®Æc biÖt lµ c¸c dÉn xuÊt cña ®−êng.
D¹ng opin ®−îc tæng hîp cã thÓ lµ nopalin, octopin, agrocinopin, mannozapin
vµ agropin phô thuéc vµo tõng chñng A. tumefaciens. Trong ®ã, octapin vµ
nopalin lµ hai d¹ng opin phæ biÕn. Opin ®−îc vi khuÈn sö dông thay cho nguån
cacbon vµ nit¬ nhê ho¹t ®éng cña gen chuyÓn hãa opin trªn plasmid g©y khèi u
thùc vËt (Tumor inducing plasmid - Ti-plasmid) [36][37]. C¬ chÕ ph©n tö cña sù
h×nh thµnh khèi u ®0 ®−îc quan t©m nghiªn cøu nh»m t×m ra mét ph−¬ng thøc
phßng bÖnh cho c©y. Khi ph¸t hiÖn ra Ti-plasmid vµ kh¶ n¨ng tù chuyÓn T-
DNA vµo genom thùc vËt, ng−êi ta ®0 ®Æc biÖt chó ý vµ khai th¸c kh¶ n¨ng sö
dông chóng nh− mét vect¬ tù nhiªn ®Ó chuyÓn c¸c gen quan t©m vµo thùc vËt
nh»m t¹o c©y trång mang nh÷ng tÝnh tr¹ng mong muèn [11].
Trong chi Agrobacterium th× A.tumefaciens ®−îc sö dông nhiÒu nhÊt cho
viÖc chuyÓn gen.
Ph©n lo¹i khoa häc:
Giíi: Bacteria
Ngµnh: Proteobacteria
Líp: Alpha Proteobacteria
Bé: Rhizobiales
Hä: Rhizobiaceae
Chi: Agrobacterium
Loµi: A. Tumefaciens
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 15
Danh ph¸p khoa häc: Agrobacterium tumefaciens.
Hình 2.1. Một số khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra
trên thân cây hoa hồng (A) và trên thân cây nho (B).
2.4.2 CÊu tróc vµ chøc n¨ng cña Ti-plasmid
Ti-plasmid ®−îc ph¸t hiÖn ë tÊt c¶ c¸c chñng A.tumefaciens g©y nhiÔm
vµ tån t¹i bÒn v÷ng ë nhiÖt ®é d−íi 300C. §©y lµ mét ph©n tö DNA d¹ng m¹ch
vßng, sîi kÐp vµ tån t¹i trong tÕ bµo nh− mét ®¬n vÞ sao chÐp ®éc lËp, cã kÝch
th−íc kho¶ng 200 kilo base (kb). Ph©n tÝch di truyÒn cho thÊy, Ti-plasmid
d¹ng octopin vµ d¹ng nopalin lµ hai d¹ng phæ biÕn nhÊt, cã 4 vïng t−¬ng
®ång, trong ®ã vïng T-DNA vµ vïng g©y ®éc (Virulence Region-vïng Vir),
liªn quan trùc tiÕp tíi sù h×nh thµnh khèi u ë thùc vËt. Vïng g©y ®éc cã chøa
c¸c gen m0 hãa c¸c protein/enzyme Vir. Cã 9 lo¹i protein Vir lµ A, B, C, G,
B1-11, D1-2, E1-2, F, H, J/AcvB. C¸c protein Vir nµy cã vai trß quan träng
trong viÖc chuyÓn T-DNA sang tÕ bµo thùc vËt. Hai vïng cßn l¹i chøa gen m0
hãa cho viÖc sao chÐp plasmid vµ chuyÓn n¹p.
Trªn Ti-plasmid, chØ cã vïng T-DNA ®−îc chuyÓn tõ vi khuÈn sang hÖ
gen cña c¸c c©y bÞ bÖnh vµ tån t¹i bÒn v÷ng ë trong ®ã. Tuy nhiªn, vïng nµy
l¹i kh«ng m0 hãa nh÷ng s¶n phÈm trung gian cho qu¸ tr×nh chuyÓn T-DNA
mµ cÇn cã sù trî gióp ®Æc biÖt cña c¸c gen g©y khèi u n»m trªn vïng VIR vµ
trªn nhiÔm s¾c thÓ vi khuÈn. Vïng VIR dµi kho¶ng 40 kb ®¶m nhiÖm chøc
n¨ng g©y nhiÔm. ë Ti-plasmid d¹ng octopin, vïng VIR chøa tíi 24 gen g©y
®éc. S¶n phÈm protein do c¸c gen nµy m0 hãa ®0 kÝch thÝch sù t¸ch biÖt T-
DNA, bao bäc, che chë vµ gióp chóng tiÕp cËn víi hÖ gen c©y chñ [36][37].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 16
B¶n ®å Ti- plasmid d¹ng octopin ®−îc thÓ hiÖn trong H×nh 2.2.
H×nh 2.2. B¶n ®å Ti- plasmid d¹ng octopin
2.4.3 CÊu tróc vµ chøc n¨ng cña c¸c ®o¹n T-DNA
KÕt qu¶ ph©n tÝch tr×nh tù gen trªn T-DNA ë c¸c Ti-plasmid kh¸c nhau
cho thÊy, T-DNA ®−îc giíi h¹n bëi mét ®o¹n tr×nh tù lÆp l¹i gÇn nh− hoµn
toµn tõ kho¶ng 25 base pair (bp) vµ gäi lµ ®o¹n biªn. Chóng lµ dÊu hiÖu nhËn
biÕt cho qu¸ tr×nh chuyÓn T-DNA vµ x©m nhËp cña T-DNA vµo tÕ bµo thùc
vËt. ë ®o¹n biªn bªn ph¶i (Right border- RB) cã yÕu tè ®iÒu khiÓn cis cÇn cho
qu¸ tr×nh chuyÓn T-DNA. §o¹n bªn tr¸i (Left border- LB) gi¸n tiÕp tham gia
vµo qu¸ tr×nh chuyÓn T-DNA vµ lµ dÊu hiÖu ®Ó qu¸ tr×nh nµy kÕt thóc b×nh
th−êng [46].
ë Ti-plasmid d¹ng nopalin, T-DNA x©m nhËp vµo genom thùc vËt ë
d¹ng mét ®o¹n liªn tôc dµi 22 kb. Trong khi ë Ti-plasmid d¹ng octopin, T-
DNA lµ mét ®o¹n gen liªn tôc dµi 13 kb. T-DNA mang rÊt nhiÒu gen nh−: (1)
c¸c gen m0 hãa nh÷ng enzyme cÇn thiÕt cho qu¸ tr×nh sinh tæng hîp opin; (2)
c¸c gen g©y khèi u nh− tms1, tsm2, tmr m0 hãa cho c¸c enzyme liªn quan ®Õn
qu¸ tr×nh sinh tæng hîp auxin vµ cytokinin [36][37].
2.4.4 C¬ chÕ ph©n tö cña viÖc chuyÓn gen th«ng qua Agrobacterium
tumefaciens
C¸c tÕ bµo c©y bÞ tæn th−¬ng sÏ tiÕt ra c¸c hîp chÊt hãa häc dÉn dô vi
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 17
khuÈn nh−: Acetosyringon, Hydroxy-acetosyringon... D−íi t¸c dông cña c¸c
hîp chÊt nµy, A. tumefaciens nhËn biÕt råi b¸m vµo thµnh tÕ bµo chñ vµ
chuyÓn T-DNA vµo tÕ bµo thùc vËt. Qu¸ tr×nh nµy ®−îc sù trî gióp ®Æc biÖt
cña c¸c gen Vir vµ RB, LB [11]. Còng chÝnh c¸c hîp chÊt nµy, víi vai trß c¶m
øng, gióp cho c¸c gen vïng Vir ho¹t ®éng vµ t¨ng c−êng biÓu hiÖn.
Ho¹t ®éng cña c¸c gen Vir sinh ra sîi ®¬n T-DNA lµm xuÊt hiÖn b¶n sao
sîi bªn d−íi cña T-DNA. ChØ ®o¹n sîi ®¬n DNA gi÷a hai tr×nh tù biªn (LB vµ
RB) cña T-DNA míi ®−îc chuyÓn vµo tÕ bµo thùc vËt, vµ ®−îc g¾n vµo hÖ gen
cña tÕ bµo. §ã lµ yÕu tè ho¹t ®éng cis cña hÖ thèng vËn chuyÓn T-DNA.
Protein Vir D1, D2 ®ãng vai trß lµ ch×a khãa trong b−íc nµy, chóng nhËn ra
tr×nh tù biªn T-DNA vµ c¾t sîi bªn d−íi t¹i mçi bªn. §iÓm c¾t lµ ®iÓm ®Çu vµ
kÕt thóc cña sîi t¸i sinh. Sau ®ã, protein Vir D2 vÉn cßn g¾n kÕt víi ®Çu cuèi
5’ cña sîi T-DNA vµ tÕ bµo thùc vËt. NÕu g©y ®ét biÕn hay lo¹i bá ®o¹n RB
th× hÇu nh− mÊt hoµn toµn kh¶ n¨ng chuyÓn T-DNA, cßn nÕu ®ét biÕn LB sÏ
lµm gi¶m hiÖu qu¶ chuyÓn T-DNA [35]. §iÒu ®ã chøng tá tæng hîp sîi T-
DNA lµ tõ ®Çu 5’®Õn 3’, ®−îc b¾t ®Çu tõ ®o¹n RB vµ kÕt thóc ë LB.
Ph−¬ng tiÖn ®Ó chuyÓn ®o¹n T-DNA vµo nh©n tÕ bµo thùc vËt lµ phøc
protein vµ sîi T-DNA. Theo ®a sè c¸c nhµ khoa häc cho r»ng phøc hîp sîi
®¬n T-DNA–Vir D2 ®−îc bao bäc bëi protein Vir E2 cã träng l−îng 96 kDa.
Sù phèi hîp nµy gióp ng¨n c¶n sù tÊn c«ng cña nuclease, h¬n n÷a sîi ®¬n T-
DNA duçi th¼ng lµm gi¶m kÝch th−íc cña phøc xuèng xÊp xØ 2 nm, t¹o ®iÒu
kiÖn thuËn lîi cho qu¸ tr×nh di chuyÓn qua c¸c kªnh dÉn truyÒn trªn mµng tÕ
bµo [31]. Protein Vir E2 chøa ®ùng hai tÝn hiÖu ®Þnh vÞ trong nh©n tÕ bµo thùc
vËt vµ mét protein Vir D2 [23]. Thùc tÕ cho thÊy hai protein nµy cã vai trß
quan träng trong viÖc dµn xÕp sù hÊp thô phøc vµo trong nh©n tÕ bµo thùc vËt
[69]. NÕu lo¹i bá tÝn hiÖu ®Þnh vÞ trong nh©n th× mét trong c¸c protein nµy bÞ
gi¶m, nh−ng kh«ng øc chÕ hoµn toµn qu¸ tr×nh chuyÓn T-DNA vµ t−¬ng t¸c
gi÷a T-DNA víi hÖ gen tÕ bµo thùc vËt, chøng tá cã mét thµnh viªn kh¸c cã
thÓ ®¶m nhËn mét phÇn tèi thiÓu vai trß cña protein bÞ thiÕu [31].
Protein Vir D4 còng lµ b¾t buéc ®èi víi sù vËn chuyÓn phøc ss-T- DNA.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 18
Chøc n¨ng cña protein Vir D4 lµ liªn kÕt víi ATP ®éc lËp víi phøc protein cÇn
thiÕt víi qu¸ tr×nh di truyÒn T-DNA [28].
C¸c nghiªn cøu c«ng bè ®0 miªu t¶ vai trß cña operon Vir B cã kÝch
th−íc 9,5 kb trong qu¸ tr×nh s¶n sinh cÊu tróc bÒ mÆt cña tÕ bµo ®èi víi sù vËn
chuyÓn phøc tõ vi khuÈn sang tÕ bµo thùc vËt [27].
Protein Vir B lµ protein cã tÝnh kÞ n−íc t−¬ng tù protein kÕt hîp trªn
mµng kh¸c [55]. PhÇn lín protein Vir B ®0 ®−îc ph¸t hiÖn gièng nh− kªnh
protein xuyªn mµng [58][60]. Tuy nhiªn, còng cã thÓ vµi protein Vir B kh¸c
®−îc ph©n phèi l¹i trong qu¸ tr×nh ph¸t sinh sinh vËt vµ thùc hiÖn chøc n¨ng
cña kªnh kÕt hîp qua tÕ bµo vËn chuyÓn. §¸ng chó ý lµ trong ®ã protein Vir
B2, Vir B11 lµ thµnh phÇn c¬ b¶n cña bé m¸y vËn chuyÓn T-DNA tõ tÕ bµo vi
khuÈn sang tÕ bµo thùc vËt [21]. Sau khi T-DNA qua mµng tÕ bµo chóng ®i
th¼ng vµo nh©n vµ kÕt hîp víi hÖ gen thùc vËt, b¾t ®Çu ho¹t ®éng vµ s¶n sinh
ra auxin, cytokinin vµ opin g©y nªn sù ph¸t triÓn th¸i qu¸ cña hµng lo¹t tÕ bµo
l©n cËn dÉn ®Õn sù h×nh thµnh khèi u. Qu¸ tr×nh chuyÓn T- DNA vµo tÕ bµo
thùc vËt ®−îc thÓ hiÖn trong H×nh 2.3.
H×nh 2.3. Qu¸ tr×nh chuyÓn T-ADN vµo tÕ bµo thùc vËt
2.4.5 T−¬ng t¸c gi÷a T-DNA vµ genome tÕ bµo thùc vËt
Trong tÕ bµo thùc vËt, phøc ss-T-DNA ®−îc ®−a qua mµng nh©n vµo nh©n.
Hai protein ®ãng vai trß quan träng trong b−íc nµy lµ Vir D2 vµ Vir E2. TÝn
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 19
hiÖu ®Þnh vÞ trong nh©n cña Vir D2 vµ Vir E2 ®ãng vai trß chñ yÕu. Protein Vir
D2 cã chøc n¨ng x¸c ®Þnh vÞ trÝ cho T-DNA trong nh©n. Phøc ss-T-DNA lµ
phøc nucleoprotein lªn ®Õn 20 Kb chøa mét ®Çu 5’ g¾n víi protein Vir D2.
Nh−ng phøc ®−îc bao bäc bëi sè l−îng lín ph©n tö Vir E2 (xÊp xØ 600/ 20 kb
T-DNA) vµ mçi phøc nµy cã hai tÝn hiÖu ®Þnh vÞ trong nh©n. Hai tÝn hiÖu nµy
cña Vir E2 ®ãng vai trß quan träng ®èi víi viÖc nhËn liªn tôc phøc T-DNA cña
nh©n, cã kh¶ n¨ng kÝch thÝch më lç mµng nh©n. Kh¶ n¨ng nhËn phøc cña nh©n
®−îc ®iÒu khiÓn bëi protein kÕt hîp tÝn hiÖu ®Þnh vÞ ®Æc tr−ng trong nh©n,
protein ®−îc t×m thÊy trong tÕ bµo chÊt cña tÕ bµo thùc vËt [31].
B−íc cuèi cïng trong qu¸ tr×nh vËn chuyÓn T-DNA lµ sù t−¬ng t¸c trong
genom tÕ bµo thùc vËt. C¸c ph¶n øng trong sù t−¬ng t¸c T-DNA kh«ng cã tÝnh
®iÓn h×nh. Sù t−¬ng t¸c nµy t×m thÊy bëi sù t¸i tæ hîp kh«ng theo quy luËt.
Theo c¸ch nh×n nhËn viÖc c¾t bá bít base, nh− microhomologies, ®−îc cÇn
®Õn ®èi víi b−íc lÆp l¹i gi÷a cÆp vËn chuyÓn T-DNA víi Vir D2 vµ DNA thùc
vËt. Sù t−¬ng ®ång nµy rÊt thÊp vµ cung cÊp ®Æc tr−ng nhá nhÊt ®èi víi qu¸
tr×nh t¸i tæ hîp bëi sù x¸c ®Þnh vÞ trÝ cña Vir D2 ®Ó g¾n kÕt. ë tr×nh tù gÇn kÒ
hay ®Çu 3’ cña T-DNA t×m thÊy mét vµi sù t−¬ng ®ång nhá víi DNA thùc vËt,
kÕt qu¶ ë sù t−¬ng t¸c ®Çu tiªn gi÷a sîi T-DNA vµ DNA thùc vËt lµ t¹o lç
hæng ë sîi 3’-5’ cña DNA thùc vËt. Sau ®ã DNA thùc vËt ®−îc c¾t ë vÞ trÝ ®Çu
3’ cña lç hæng bëi endonuclease vµ nucleotit cña ®Çu 5’ b¾t cÆp víi Vir D2 bëi
mét nucleotit cña ®Çu 5’ b¾t cÆp víi Vir D2 bëi mét nucleotit trong ®Çu sîi
(5’-3’) DNA thùc vËt. PhÇn 3’ nh« ra cña T-DNA còng nh− DNA thùc vËt
thay thÕ bÞ ph©n hñy bëi endonuclease hay 3’-5’ enxonuclease. §Çu 5’ cña T-
DNA g¾n víi Vir D2 cßn ®Çu 3’ kia cÆp ®«i víi DNA thùc vËt kÐo dµi tõ b−íc
®Çu cña qu¸ tr×nh t−¬ng t¸c, nèi liÒn víi vÕt c¾t trong sîi DNA d−íi cña thùc
vËt. Sù ®−a vµo cña sîi T-DNA trong sîi 3’-5’ cña DNA thùc vËt ®−îc bæ
sung, t×nh tr¹ng xo¾n sinh ra bëi vÕt c¾t trong sîi ®èi ng−îc ®−îc s¶n sinh.
T×nh tr¹ng nµy ho¹t hãa ph¶n øng söa ch÷a cña tÕ bµo thùc vËt vµ sîi bæ
sung ®−îc tæng hîp sö dông ®Ó chÌn dÔ dµng sîi T-DNA nh− lµ sîi khu«n.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 20
Vir D2 cã vai trß ho¹t hãa trong sù hßa hîp chÝnh x¸c sîi T-DNA vµo nhiÔm
s¾c thÓ thùc vËt. Phãng thÝch protein Vir D2 cã thÓ cung cÊp n¨ng l−îng chøa
®ùng trong c¸c liªn kÕt phosphodieste, nh− Tyr 29 víi nucleotit ®Çu tiªn cña
sîi T-DNA, qui ®Þnh ®Çu 5’ cña sîi T-DNA kh«ng cßn [61]. Ngoµi ra, qu¸
tr×nh chuyÓn T-DNA cßn cã sù t−¬ng t¸c víi c¸c protein do gen trªn nhiÔm
s¾c thÓ cña A. tumefaciens quy ®Þnh vµ protein trong tÕ bµo thùc vËt.
2.4.6 Mét sè ph−¬ng ph¸p biÕn n¹p gen th«ng qua vi khuÈn
Agrobacterium tumefaciens
KÓ tõ khi vai trß cña A. tumefaciens ®−îc ph¸t hiÖn vµ nghiªn cøu th× chóng
®0 trë thµnh c«ng cô chuyÓn gen h÷u hiÖu vµo thùc vËt. Ph−¬ng ph¸p biÕn n¹p
gen th«ng qua vi khuÈn A. tumefaciens gåm cã 2 hÖ thèng chÝnh.
2.4.6.1 HÖ thèng chuyÓn gen in vitro
Khã kh¨n chÝnh trong viÖc x©y dùng hÖ thèng chuyÓn gen in vitro lµ ph¶i
cã ®−îc sù kÕt hîp gi÷a sù x©m nhiÔm cña A. tumefaciens vµ kh¶ n¨ng t¸i sinh
cña c¸c tÕ bµo sau khi l©y nhiÔm víi vi khuÈn [22].
Mét sè trî gióp kü thuËt trong qu¸ tr×nh biÕn n¹p ®0 c¶i thiÖn hiÖu qu¶
cña hÖ thèng chuyÓn gen in vitro nhê A. tumefaciens bao gåm:
Xö lý sãng siªu ©m
Xö lý mét thùc vËt víi A. tumefaciens trong ®iÒu kiÖn sãng siªu ©m t¹o ra
c¸c tæn th−¬ng nhá, ®ång nhÊt ë m« thùc vËt, cho phÐp A. tumefaciens dÔ
dµng x©m nhËp vµo tÕ bµo thùc vËt. B»ng ph−¬ng ph¸p nµy ®0 c¶i thiÖn râ rÖt
hiÖu qu¶ chuyÓn gen, biÓu hiÖn gus t¹m thêi ®0 t¨ng tõ 100 lªn 1400 lÇn ë c¸c
tÕ bµo ®Ëu t−¬ng, ®Ëu ®òa, lóa mú vµ ng« [64].
Ly t©m tÕ bµo
Ph−¬ng ph¸p chuyÓn gen th«ng qua A. tumefaciens kÕt hîp víi ly t©m ®0
®−îc ¸p dông thµnh c«ng khi biÕn n¹p vµo huyÒn phï tÕ bµo ph«i hãa nhËn
®−îc tõ hoa chuèi ®ùc nu«i cÊy in vitro cña hai gièng chuèi th−¬ng m¹i
Cavendish vµ Lady Finger. TÇn sè chuyÓn gen ®0 ®−îc c¶i thiÖn ®¸ng kÓ b»ng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 21
c¸ch ¸p dông chÕ ®é ly t©m tÕ bµo thùc vËt trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy céng sinh
víi vi khuÈn [40].
2.4.6.2 HÖ thèng chuyÓn gen in vivo
Ph−¬ng ph¸p nµy dùa trªn c¬ së cña viÖc chuyÓn gen vµo nguyªn c©y (in
planta) vµ rÊt phæ biÕn ®èi víi loµi A. thaliana, mét trong nh÷ng loµi c©y m«
h×nh ®èi víi c¸c nghiªn cøu vÒ di truyÒn häc. Ph−¬ng ph¸p chuyÓn gen nµy
tèn Ýt thêi gian, bá qua c«ng ®o¹n nu«i cÊy m« vµ t¸i sinh sau biÕn n¹p, v× thÕ
lo¹i bá ®−îc c¸c biÕn dÞ soma vµ sè l−îng c©y chuyÓn gen thu ®−îc lín h¬n.
Kü thuËt nµy ®0 ®−îc m« t¶ ë c¸c c©y trång kh¸c nhau nh− ®Ëu t−¬ng,
Arabidopsis, hoa h−íng d−¬ng vµ c©y l¹c [53].
Ph−¬ng ph¸p chuyÓn gen vµo h¹t
H¹t cña c©y Arabidopsis ®−îc l©y nhiÔm víi A. tumefaciens sau ®ã ®em
trång vµ thu ®−îc c©y tr−ëng thµnh víi tÇn sè biÕn n¹p 1%. H¹t Arabidopsis
chuyÓn gen ®0 ®−îc t¹o thµnh tõ c¸c côm hoa míi xuÊt hiÖn sau khi l©y nhiÔm
A. tumefaciens t¹i nh÷ng vïng bÞ tæn th−¬ng khi c¾t bá côm hoa [38].
Ph−¬ng ph¸p ng©m côm hoa
Mét sè nghiªn cøu chuyÓn gen ®0 ®−îc tiÕn hµnh ë c©y Arabidopsis b»ng
c¸ch ng©m c¸c thÓ giao tö c¸i cña hoa non, côm hoa trong dÞch vi khuÈn A.
tumefaciens. Ph−¬ng ph¸p nµy còng ®0 ®−îc ¸p dông víi c¸c c©y mét l¸ mÇm
®0 chuyÓn ®−îc gen nptII vµo dßng ng« AT-3 b»ng c¸ch xö lý r©u ng« cña c¸c
c©y ng« ®ang sinh tr−ëng trªn ®ång ruéng víi dÞch vi khuÈn A. tumefaciens
chñng GV3101 (pTd33). Ph©n tÝch PCR cho thÊy kho¶ng 6,8 % c¸c c©y con
n¶y mÇm tõ h¹t nhËn ®−îc tõ c¸c c©y ng« sau khi l©u nhiÔm b»ng c¸ch nµy
mang gen nptII.
Ph−¬ng ph¸p thÊm läc ch©n kh«ng
Ph−¬ng ph¸p chuyÓn gen thÊm läc ch©n kh«ng còng t−¬ng tù nh−
ph−¬ng ph¸p ng©m côm hoa. Ph−¬ng ph¸p nµy ®0 ®−îc ¸p dông ë mét sè c©y
trång, ®Æc biÖt lµ c©y mét l¸ mÇm. Trong m«i tr−êng ch©n kh«ng, tÕ bµo thùc
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 22
vËt tiÕp xóc víi A. tumefaciens tèt h¬n. Ng−êi ta nhËn ®−îc c¸c c©y Medicago
truncatula (c©y m« h×nh thuéc hä ®Ëu) chuyÓn gen bÒn võng b»ng ph−¬ng
ph¸p chuyÓn gen nµy [65].
2.5 Kh¸i qu¸t vÒ c©y lóa
2.5.1 Nguån gèc, vÞ trÝ vµ ph©n lo¹i
C©y lóa lµ mét trong nh÷ng c©y l−¬ng thùc cã lÞch sö trång trät l©u ®êi
nhÊt ë n−íc ta. VÒ nguån gèc thùc vËt häc, c©y lóa thuéc hä hßa th¶o
(Gramineae), chi Oryza. Lóa trång hiÖn nay lµ do lóa d¹i Oryza fatua h×nh
thµnh th«ng qua mét qu¸ tr×nh chän läc nh©n t¹o l©u dµi. Loµi lóa d¹i nµy
th−êng gÆp ë Ên §é, ViÖt Nam, Th¸i Lan, Trung Quèc...Hä hµng víi c©y lóa
trång lµ c¸c loµi trong chi Oryza. C¸c c«ng tr×nh nghiªn cøu cho thÊy cã 22
loµi trong chi Oryza víi 24 hoÆc 48 nhiÔm s¾c thÓ. Trong sè 22 loµi cña chi
Oryza chØ cã 2 loµi lµ Oryza sativa vµ Oryza glaberrima lµ lóa trång [9].
Tr¶i qua hµng ngµn n¨m tiÕn hãa vµ ¶nh h−ëng l©u dµi cña hÖ thèng
chän läc gièng, ®Õn nay ë c©y lóa ®0 h×nh thµnh mét tËp ®oµn c¸c gièng lóa
víi c¸c lo¹i h×nh th¸i rÊt ®a d¹ng phong phó. §Ó sö dông cã hiÖu qu¶ nguån
gen quý gi¸ nµy rÊt cÇn thiÕt ph¶i ph©n lo¹i gièng lóa. Tuy nhiªn, cã nhiÒu
c¸ch ph©n lo¹i kh¸c nhau theo c¸c tiªu chÝ kh¸c nhau (theo ®iÒu kiÖn sinh th¸i,
theo thêi gian sinh tr−ëng, theo nguån gèc h×nh thµnh, theo tÝnh tr¹ng ®Æc
tr−ng...). Cho ®Õn nay, ph©n lo¹i c©y lóa theo hÖ thèng ph©n lo¹i thùc vËt häc
cña loµi lóa trång Oryza sativa L. ®0 ®¹t ®−îc sù thèng nhÊt. Theo c¸c tµi liÖu
chÝnh thøc th× loµi Oryza sativa L. gåm 3 loµi phô (indica, japonica vµ
javanica), 8 nhãm biÕn chñng vµ 284 biÕn chñng. Theo cÊu t¹o cña tinh bét
cßn ph©n biÖt lóa nÕp (glutinosa) vµ lóa tÎ (utilissima). MÆc dï vËy, theo ®Þnh
luËt vÒ d0y biÕn dÞ t−¬ng ®ång cña Vavilov th× c©y lóa vÉn tiÕp tôc tiÕn hãa vµ
nhiÒu biÕn chñng míi vÉn tiÕp tôc xuÊt hiÖn, c¸c nhµ khoa häc vÉn ®ang tiÕp
tôc nghiªn cøu, t©p hîp vµ bæ sung thªm cho hÖ thèng ph©n lo¹i nµy [9].
Theo t¸c gi¶ NguyÔn §×nh Giao, NguyÔn ThiÖn Huyªn vµ céng sù
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 23
(2001) th× loµi phô indica (lóa tiªn) vµ japonica (lóa c¸nh) ®−îc ph©n lo¹i theo
®iÒu kiÖn sinh th¸i vµ vÜ ®é ®Þa lý. VÒ mÆt ph©n bè: lóa indica ë vïng vÜ ®é
thÊp nh−: Ên §é, Nam Trung Quèc, ViÖt Nam, Indonexia. Lóa japonica ph©n
bè ë vïng vÜ ®é cao nh− NhËt B¶n, TriÒu Tiªn, B¾c Trung Quèc, Ch©u ©u, v.v.
[7]. Mét sè h×nh th¸i lóa loµi phô indica vµ loµi phô japonica ®−îc thÓ hiÖn
trong B¶ng 2.1.
B¶ng 2.1 Ph©n biÖt h×nh th¸i lóa loµi phô indica vµ loµi phô japonica
§Æc ®iÓm Loµi phô Indica Loµi phô Japonica
ChiÒu cao c©y Cao c©y ThÊp c©y
L¸
L¸ nhá, mµu xanh nh¹t,
xÕp ®øng
L¸ to, mµu xanh ®Ëm,
xÕp xße
H¹t H¹t dµi, vá trÊu máng H¹t ng¾n, bÇu, vá trÊu dµy
ChÊt l−îng c¬m Th−êng lµ kh«, cøng Th−êng lµ dÎo, mÒm
Ngµy nay, do sù giao l−u, hîp t¸c ph¸t triÓn gi÷a c¸c n−íc trªn thÕ giíi,
viÖc ph©n bè cña lóa indica vµ japonica kh«ng cßn nguyªn d¹ng ban ®Çu.
Trong 10 n¨m trë l¹i ®©y, lóa japonica ®0 ®−îc ®−a vµo s¶n xuÊt t¹i ViÖt Nam
vµ phÇn lín s¶n l−îng thu ®−îc ®ang ®−îc xuÊt khÈu ra c¸c thÞ tr−êng khã
tÝnh, ng−êi d©n vÉn quen gäi ®ã lµ c©y “lóa NhËt” hay “g¹o NhËt” [75].
2.5.2 T×nh h×nh nghiªn cøu t¸i sinh vµ chuyÓn gen vµo lóa
2.5.2.1 T×nh h×nh nghiªn cøu t¸i sinh vµ chuyÓn gen vµo lóa trªn thÕ giíi
T¸i sinh c©y tõ m« sÑo ®−îc th«ng b¸o lÇn ®Çu tiªn ë loµi c©y ngò cèc
bëi Tamaoki vµ Ullstrup n¨m 1958. Cho ®Õn nay m« sÑo ®0 ®−îc t¹o ra tõ c¸c
m« lóa kh¸c nhau nh− n¸t c¾t th©n [29], hoa non, bao phÊn, tiÓu bµo tö, ®Ønh
rÔ [25][41][52][68], bao l¸ mÇm [48][24], trô d−íi l¸ mÇm [34], h¹t tr−ëng
thµnh [44][51]. HiÖn nay, h¹t tr−ëng thµnh vµ h¹t non (ph«i non) ®−îc sö dông
lµm vËt liÖu nghiªn cøu nhiÒu nhÊt v× c¸c vËt liÖu nµy cho m« sÑo cã tû lÖ t¸i
sinh c©y cao h¬n.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 24
N¨m 1985, t¸i sinh c©y tõ ph«i tr−ëng thµnh ë c¸c gièng lóa japonica
®−îc th«ng b¸o bëi Fujimura vµ céng sù. T¹o m« sÑo vµ t¸i sinh c©y ë c¸c
gièng lóa indica tõ ph«i non ®−îc th«ng b¸o bëi Koetije et al. n¨m 1989. So
víi gièng lóa indica c¸c gièng lóa japonica cã ph¶n øng t¹o m« sÑo vµ hiÖu
qu¶ t¸i sinh c©y cao h¬n [52]. §a phÇn c¸c gièng lóa japonica dÔ cã ph¶n øng
t¹o m« sÑo vµ tû lÖ t¸i sinh kh¸ cao. Tuy nhiªn còng cã gièng t¹o m« sÑo Ýt vµ
khã t¸i sinh. NhiÒu nghiªn cøu còng chØ ra r»ng c¸c gièng lóa indica cã sù
kh¸c nhau ®¸ng kÓ vÒ ph¶n øng t¹o m« sÑo vµ t¸i sinh c©y [19][39]. Do ®ã, ®Ó
c¶i thiÖn hiÖu qu¶ t¹o m« sÑo vµ t¸i sinh c©y, cÇn thiÕt tèi −u hãa m«i tr−êng
cho mçi gièng japonica vµ ®Ó t¨ng hiÖu qu¶ chuyÓn gen cÇn chän ®−îc gièng
cã ph¶n øng t¹o m« sÑo m¹nh vµ cã tû lÖ t¸i sinh c©y cao.
BiÕn n¹p vµo lóa japonica thµnh c«ng b»ng Agrobacterium ®−îc c«ng bè
lÇn ®Çu tiªn bëi Raineri et al. 1990. Hä sö dông Agrobacterium d¹ng d¹i vµ ®0
thu ®−îc m« sÑo kh¸ng kanamycin. Mét sè yÕu tè ¶nh h−ëng ®Õn hiÖu qu¶
biÕn n¹p b»ng Agrobacterium còng ®0 ®−îc nghiªn cøu [43].
Hiei et al. (1994) th«ng b¸o thu ®−îc tÇn sè biÕn n¹p cao (10- 30%) vµo
lóa japonica b»ng Agrobacterium tumefaciens chñng LBA4404, vµ EHA101,
qu¸ tr×nh chuyÓn gen diÔn ra theo 7 b−íc vµ thu ®−îc c©y chuyÓn gen sau 4
th¸ng kÓ tõ nu«i cÊy ®Çu tiªn [33]. Hai ®iÓm míi cña nghiªn cøu nµy lµ t¹o t¸c
gi¶ sö dông m« sÑo ph«i hãa ®−îc t¹o tõ h¹t lóa chÝn vµ bæ xung
acetosyringone vµo m«i tr−êng ®ång nu«i cÊy[20].
Rachmawati vµ Anzai (2006) ®0 nghiªn cøu tèi −u hãa m«i tr−êng t¹o
m« sÑo vµ t¸i sinh c©y lóa vµ sö dông hÖ thèng t¸i sinh ®0 ®−îc tèi −u hãa nµy
®Ó biÕn n¹p gen vµo c¸c gièng lóa javanica. Hä còng nhËn thÊy hiÖu qu¶ biÕn
n¹p gen phô thuéc nhiÒu vµo gièng [51].
Chu et al. (1975) ®0 x©y dùng hÖ thèng t¸i sinh c©y víi hiÖu qu¶ cao cho
c¸c gièng lóa japonica. NhiÒu nhµ nghiªn cøu kh¼ng ®Þnh cã thÓ biÕn n¹p vµo
c¸c gièng lóa japonica víi hiÖu qu¶ biÕn n¹p tõ 10% ®Õn 50%. Sallaud et
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 25
all.(2003) kh¼ng ®Þnh hiÖu qu¶ chuyÓn gen vµo lóa japonica cã thÓ ®¹t ®−îc
75-95% [55]. Lin vµ Zhang (2005) ®0 chØ ra r»ng nguyªn nh©n chÝnh thu ®−îc
tû lÖ biÕn n¹p thµnh c«ng thÊp ë c¸c gièng lóa indica (so víi c¸c gièng lóa
japonica) cã thÓ do hiÖu qu¶ t¸i sinh cña c¸c gièng lóa indica thÊp h¬n. Hä ®0
t×m ra ®−îc 2 m«i tr−êng míi ®Ó cÊy chuyÓn, ph©n hãa m« sÑo vµ sö dông quy
tr×nh t¸i sinh c©y ®Ó biÕn n¹p cho c¸c gièng lóa indica [44]. N¨m 2006, Philippe
HervÐ vµ Toshiaki Kayano c«ng bè ®0 biÕn n¹p thµnh c«ng gen nptII vµo lóa
Nipponbare vµ mét sè gièng kh¸c thuéc loµi phô japonica [49].
TrÇn ThÞ Cóc Hßa et all. (1999) ®0 tiÕn hµnh chuyÓn gen vµo m« sÑo
®−îc t¹o tõ h¹t giµ cña 5 gièng lóa trång ë ViÖt Nam (DDS20, OMCS96,
MOCS97, IR64 vµ IR72), hiÖu qu¶ chuyÓn gen thu ®−îc tõ 1,78-13,3%, t¸c
gi¶ cho biÕt hiÖu qu¶ chuyÓn gen nµy cßn thÊp h¬n so víi hiÖu qu¶ chuyÓn gen
vµo gièng lóa japonica Taipei 309 do t¸c gi¶ tiÕn hµnh tr−íc ®ã. HiÖu qu¶
chuyÓn gen vµo Taipei 309 ®¹t ®−îc tõ 14,28%- 32,43% [66].
Hiei et al. (2006) ®0 tèi −u hãa quy tr×nh biÕn n¹p cho c¸c gièng lóa
indica b»ng Agrobacterium tumefaciens sö dông ph«i non cña h¹t non sau thô
phÊn 8-12 ngµy. Quy tr×nh ®0 ®−îc ¸p dông ®Ó biÕn n¹p thµnh c«ng víi hiÖu
qu¶ cao (trªn 7 dßng/ph«i) cho c¸c gièng lóa indica IR8, IR24, IR26, IR36,
IR54, IR64, IR72, Xin Qing Ai 1, Nan Jin 11 and Suewon 258 [32].
Còng trong n¨m 2006, Asuka Nishimura vµ Cs ®0 c«ng bè mét quy tr×nh
chuyÓn gen, theo t¸c gi¶ nÕu tiÕn hµnh chuyÓn gen theo quy tr×nh nµy th× sÏ
thu ®−îc c©y chuyÓn gen ë c¸c gièng japonica sau 2-3 th¸ng, hiÖu qu¶ biÕn
®æi gen thu ®−îc tõ 30- 50% [20].
Mét sè t¸c gi¶ ®0 th«ng b¸o biÕn n¹p thµnh c«ng vµo lóa th«ng qua
Agrobacterium b»ng sö dông m¶nh nu«i cÊy lµ ®Ønh chåi [39]. Mét sè quy
tr×nh biÕn n¹p thµnh c«ng vµo lóa japonica trong 2 th¸ng ®0 ®−îc th«ng b¸o
bëi Toki (1997) vµ gÇn ®©y bëi Toki et al. (2006) thu ®−îc trong thêi gian 1
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 26
th¸ng [63]. Tuy vËy, hÇu hÕt c¸c quy tr×nh ®−îc c«ng bè ®Òu cho thÊy ®Ó thu
®−îc c©y lóa biÕn n¹p th«ng th−êng mÊt 3-4 th¸ng tõ nu«i cÊy ®Çu tiªn.
2.5.2 2 T×nh h×nh nghiªn cøu t¸i sinh vµ chuyÓn gen vµo lóa ë ViÖt Nam
KÕ thõa tiÕn bé khoa häc trªn thÕ giíi, nhiÒu nhµ khoa häc t©m huyÕt vµ
nhiÒu trung t©m, viÖn nghiªn cøu ë ViÖt Nam ®0 nghiªn cøu vµ ¸p dông nu«i
cÊy m« trong chän t¹o gièng lóa. Trong ®iÒu kiÖn cßn nhiÒu h¹n chÕ vÒ kinh
phÝ, c¬ së vËt chÊt vµ thiÕt bÞ nªn c¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu ch−a lµm tháa m0n
c¸c nhµ khoa häc, còng nh− ch−a thÓ ®−a ra gièng lóa míi ®¸p øng nhu cÇu
thùc tiÔn s¶n xuÊt nh− ®0 k× väng.
Nghiªm ThÞ Nh− V©n (1989) ®0 nghiªn cøu sù h×nh thµnh m« sÑo tõ h¹t
phÊn lóa trong ®iÒu kiÖn in vitro. Trªn m«i tr−êng dinh d−ìng cã bæ sung 2mg/l
2,4D, nu«i cÊy trong tèi, c¸c kÕt qu¶ t¸c gi¶ cho thÊy qu¸ tr×nh h×nh thµnh m«
sÑo, h×nh th¸i m« sÑo vµ møc ®é ®a béi x¶y ra trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy [15].
Hå H÷u NhÞ, Hoµng ThÞ Yªn (1996) nghiªn cøu kh¶ n¨ng t¸i sinh in
vitro cña c¸c dßng lóa bÊt dôc phôc vô cho c«ng nghÖ s¶n xuÊt lóa lai. T¸c gi¶
sö dông m«i tr−êng nÒn Murashige- Skoog (MS, 1962) cã bæ sung acid amin
(arginin, casein hydrolysate) vµ c¸c phytohocmon (BAP, NAA) cho nu«i cÊy
t¸i sinh m« ph©n sinh vµ hoa non. KÕt qu¶ nghiªn cøu nµy kh¼ng ®Þnh vai trß
cô thÓ cña tõng yÕu tè ¶nh h−ëng ®Õn kh¶ n¨ng t¸i sinh in vitro cña m« ph©n
sinh vµ hoa non lóa [12].
N¨m 1997, c¸c nhµ khoa häc ë ViÖn Di truyÒn n«ng nghiÖp vµ ViÖn
C«ng nghÖ sinh häc ®0 phèi hîp víi n−íc ngoµi thùc hiÖn thµnh c«ng viÖc
chuyÓn gen Xa 21 kh¸ng bÖnh b¹c l¸ vµo gièng lóa indica VL 901. N¨m
1999, t¹i Héi nghÞ c«ng nghÖ sinh häc toµn quèc ë Hµ Néi, c¸c nhµ khoa häc
ë ViÖn Di truyÒn n«ng nghiÖp tiÕp tôc c«ng bè kÕt qu¶ cña viÖc chuyÓn gen
kh¸ng thuèc trõ cá vµo c¸c gièng lóa ViÖt Nam.
C¸c nhµ khoa häc ViÖn Di truyÒn n«ng nghiÖp còng ®0 nghiªn cøu
chuyÓn gen chÞu thuèc trõ cá vµ kh¸ng bÖnh kh« v»n vµo gièng lóa DT10,
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 27
DT13; gen kh¸ng bÖnh b¹c l¸ vµo gièng lóa VL902; gen Bt, GNA, Xa-21
(chuyÓn n¹p 2 gen cïng lóc) b»ng sóng b¾n gen vµ Agrobacterium vµo lóa
indica, gen B-caroten vµo lóa indica (MTL250, IR64, KDML) ®Ó cã gièng lóa
giµu vitamin A. T¹i ViÖn Lóa ®ång b»ng s«ng Cöu Long, c¸c nhµ khoa häc
còng ®ang nghiªn cøu nh»m t¹o ra c¸c dßng lóa kh¸ng rÇy n©u, s©u ®ôc th©n
vµ kh¸ng c¸c bÖnh nh− ®¹o «n, b¹c l¸ b»ng ph−¬ng ph¸p chuyÓn gen.
Bïi B¸ Bæng (1997) ®0 sö dông m«i tr−êng cã bæ sung thªm kinetine
(1mg/l) trong nu«i cÊy tói phÊn lóa lai thuéc tæ hîp japonica x indica. T¸c gi¶
®0 cho thÊy m«i tr−êng nÒn N6 cã hiÖu qu¶ trong t¹o m« sÑo, t¸i sinh trªn m«i
tr−êng nÒn MS. T¸c gi¶ ®ång thêi kh¼ng ®Þnh: “callus kh«ng thµnh lËp nÕu chØ
bæ sung 2,4D (2mg/l)” [3].
NguyÔn M¹nh §«n (2001) nu«i cÊy bao phÊn lóa indica trªn m«i tr−êng
t¹o m« sÑo (G1, Fj vµ L8) trong tèi ë nhiÖt ®é 25 ± 10C. T¸i sinh c©y trªn m«i
tr−êng MS trong ®iÒu kiÖn chiÕu s¸ng cã bæ sung chÊt ®iÒu hßa sinh tr−ëng.
T¸c gi¶ bè trÝ thÝ nghiÖm theo ph−¬ng ph¸p hoµn toµn ngÉu nhiªn, sè liÖu ®−îc
thu thËp vµ xö lý thèng kª theo ch−¬ng tr×nh SAS. Tû lÖ t¹o m« sÑo dao ®éng tõ
1,2% (gièng VN23) ®Õn 28,4% (gièng VN15) [6].
NguyÔn H÷u Hæ (2001) ®0 c«ng bè c«ng tr×nh “T¹o c©y lóa chuyÓn gen
kh¸ng s©u ®ôc th©n vµ kh¸ng thuèc trõ cá ë 2 gièng lóa ViÖt Nam nhê vi
khuÈn Agrobacterium”. T¸c gi¶ ®0 sö dông m«i tr−êng MS ®Ó t¹o m« sÑo, sö
dông vi khuÈn Agro chñng LBA4404 mang gen kh¸ng s©u Bt phèi hîp
cry1A(b)- cry1b vµ gen kh¸ng thuèc trõ cá bar. (Trung t©m häc liÖu, ngµy
7/5/2009, tõ khãa: nghiªn cøu lóa).
NguyÔn ThÞ Hång Ch©u vµ Cs. (2003) ®0 thùc hiÖn chuyÓn gen vµo gièng
lóa C71 th«ng qua A. tumefaciens. M« sÑo ®−îc t¹o tõ h¹t chÝn, trªn m«i tr−êng
MS cã bæ sung 2mg/l 2,4D, trong ®iÒu kiÖn tèi, nhiÖt ®é 250C ± 2, kÕt qu¶ cho
tû lÖ t¹o m« sÑo cña gièng lóa C71 kho¶ng 92%. Nhãm t¸c gi¶ ®0 sö dông m«i
tr−êng MS lµm nÒn cho tÊt c¶ c¸c giai ®o¹n nu«i cÊy, chuyÓn gen vµ t¸i sinh. Gen
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 28
®−îc chuyÓn gåm 3 gen lµ cryIA(b), cryIA(c) (gen m0 hãa cho protein ®éc tè trõ
s©u cña vi khuÈn Bt) vµ gen Xa21 (gen kh¸ng bÖnh b¹c l¸). VËt liÖu lµ m« sÑo 15-
20 ngµy tuæi cña gièng lóa C71. Tû lÖ biÕn n¹p gen cryIA(c) ®¹t 6,6%. T¸c gi¶
còng cho r»ng kh¶ n¨ng t¸i sinh cña lóa indica lµ thÊp h¬n so víi lóa japonica.
Thêi gian cho c©y chuyÓn gen mÊt tõ 4,5 ®Õn 5 th¸ng [5].
N¨m 2004, t¸c gi¶ TrÇn ThÞ Cóc Hßa vµ Cs còng c«ng bè kÕt qu¶ nghiªn
cøu “ChuyÓn n¹p gen kh¸ng s©u cry1Ab vµ cry1Ac vµo c¸c gièng lóa b»ng
ph−¬ng ph¸p Agrobacterium vµ chän läc mannose”. T¸c gi¶ ®0 chuyÓn gen vµo
ph«i non cña gièng IR64, ph«i giµ cña gièng Mét Bôi vµ K105, kÕt qu¶ thu
®−îc hiÖu qu¶ biÕn ®æi gen cña c¸c gièng tõ 0,79- 5,83% [8].
NguyÔn ThÞ Thanh HuyÒn vµ Cs. (2003) ®0 nghiªn cøu vµ ®¸nh gi¸ ¶nh
h−ëng cña mèi t−¬ng t¸c gi÷a nguån gen lóa vµ m«i tr−êng nu«i cÊy. T¸c gi¶
sö dông gièng lóa C70 lµm ®èi chøng ®Ó ®¸nh gi¸ cho tËp ®oµn c¸c gièng lóa
®Þa ph−¬ng; Nghiªn cøu nµy cho r»ng ®èi víi c¸c nguån gen trong thÝ nghiÖm,
m«i tr−êng N6 tá ra thÝch hîp cho t¹o m« sÑo h¬n so víi L8 vµ MS. (NguyÔn
ThÞ Thanh HuyÒn vµ Cs., 2003
Tõ kÕt qu¶ tæng hîp trªn, chóng t«i rót ra mét sè nhËn ®Þnh sau:
- VÒ vËt liÖu nu«i cÊy: Cã thÓ sö dông nhiÒu lo¹i vËt liÖu cho nghiªn cøu
t¹o m« sÑo vµ t¸i sinh c©y lóa (h¹t giµ, h¹t non, ph«i non, ®Ønh chåi, bao
phÊn). Trong ®ã vËt l._.----------------------------------------
MEANS FOR EFFECT MT$
-------------------------------------------------------------------------------
MT$ NOS CR
N1 15 0.327333
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 97
N2 15 0.476667
N3 15 0.534667
N4 15 0.537333
N5 15 0.488000
SE(N= 15) 0.301846E-02
5%LSD 8DF 0.984290E-02
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT Error(a)
-------------------------------------------------------------------------------
NLAI MT$ NOS CR
1 N1 5 0.334000
1 N2 5 0.478000
1 N3 5 0.526000
1 N4 5 0.540000
1 N5 5 0.486000
2 N1 5 0.318000
2 N2 5 0.474000
2 N3 5 0.536000
2 N4 5 0.532000
2 N5 5 0.484000
3 N1 5 0.330000
3 N2 5 0.478000
3 N3 5 0.542000
3 N4 5 0.540000
3 N5 5 0.494000
SE(N= 5) 0.567458E-02
5%LSD 40DF 0.162182E-01
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT GIONG$
-------------------------------------------------------------------------------
GIONG$ NOS CR
G1 15 0.489333
G2 15 0.473333
G3 15 0.476000
G4 15 0.606667
G5 15 0.318667
SE(N= 15) 0.327622E-02
5%LSD 40DF 0.936360E-02
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT MT$*GIONG$
-------------------------------------------------------------------------------
MT$ GIONG$ NOS CR
N1 G1 3 0.423333
N1 G2 3 0.400000
N1 G3 3 0.410000
N1 G4 3 0.243333
N1 G5 3 0.160000
N2 G1 3 0.590000
N2 G2 3 0.510000
N2 G3 3 0.516667
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 98
N2 G4 3 0.556667
N2 G5 3 0.210000
N3 G1 3 0.520000
N3 G2 3 0.573333
N3 G3 3 0.570000
N3 G4 3 0.696667
N3 G5 3 0.313333
N4 G1 3 0.503333
N4 G2 3 0.486667
N4 G3 3 0.490000
N4 G4 3 0.760000
N4 G5 3 0.446667
N5 G1 3 0.410000
N5 G2 3 0.396667
N5 G3 3 0.393333
N5 G4 3 0.776667
N5 G5 3 0.463333
SE(N= 3) 0.732585E-02
5%LSD 40DF 0.209376E-01
-------------------------------------------------------------------------------
ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE VIDU21 7/11/** 21:59
---------------------------------------------------------------- PAGE 3
Thiet ke kieu Split-plot
F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1
VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI |MT$
|Error(a)|GIONG$ |MT$*GIO|
(N= 75) -------------------- SD/MEAN | | |
| |NG$ |
NO. BASED ON BASED ON % | | |
| | |
OBS. TOTAL SS RESID SS | | |
| | |
CR 75 0.47280 0.14912 0.12689E-01 2.7 0.0943 0.0000 0.5672
0.0000 0.0000
4.2 Ảnh hưởng của tương tác Giống x MTCL tới chiều dài mô sẹo
BALANCED ANOVA FOR VARIATE CD FILE VIDU20 7/11/** 21:49
---------------------------------------------------------------- PAGE 1
Thie ke kieu Split-plot
VARIATE V004 CD
LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER
SQUARES SQUARES LN
=============================================================================
1 NLAI 2 .416000E-03 .208000E-03 1.37 0.266 6
2 MT$ 4 .740912 .185228 869.62 0.000 3
3 Error(a) 8 .170400E-02 .213000E-03 1.40 0.225 6
4 GIONG$ 4 .341912 .854780E-01 562.36 0.000 6
5 MT$*GIONG$ 16 .733768 .458605E-01 301.71 0.000 6
* RESIDUAL 40 .607999E-02 .152000E-03
-----------------------------------------------------------------------------
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 99
* TOTAL (CORRECTED) 74 1.82479 .246594E-01
-----------------------------------------------------------------------------
TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE VIDU20 7/11/** 21:49
---------------------------------------------------------------- PAGE 2
Thie ke kieu Split-plot
MEANS FOR EFFECT NLAI
-------------------------------------------------------------------------------
NLAI NOS CD
1 25 0.598000
2 25 0.596400
3 25 0.602000
SE(N= 25) 0.246576E-02
5%LSD 40DF 0.704728E-02
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT MT$
-------------------------------------------------------------------------------
MT$ NOS CD
N1 15 0.412000
N2 15 0.648000
N3 15 0.692667
N4 15 0.654667
N5 15 0.586667
SE(N= 15) 0.376829E-02
5%LSD 8DF 0.122880E-01
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT Error(a)
-------------------------------------------------------------------------------
NLAI MT$ NOS CD
1 N1 5 0.420000
1 N2 5 0.642000
1 N3 5 0.686000
1 N4 5 0.660000
1 N5 5 0.582000
2 N1 5 0.402000
2 N2 5 0.648000
2 N3 5 0.692000
2 N4 5 0.650000
2 N5 5 0.590000
3 N1 5 0.414000
3 N2 5 0.654000
3 N3 5 0.700000
3 N4 5 0.654000
3 N5 5 0.588000
SE(N= 5) 0.551362E-02
5%LSD 40DF 0.157582E-01
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT GIONG$
-------------------------------------------------------------------------------
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 100
GIONG$ NOS CD
G1 15 0.632667
G2 15 0.590000
G3 15 0.588667
G4 15 0.694667
G5 15 0.488000
SE(N= 15) 0.318329E-02
5%LSD 40DF 0.909800E-02
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT MT$*GIONG$
-------------------------------------------------------------------------------
MT$ GIONG$ NOS CD
N1 G1 3 0.533333
N1 G2 3 0.486667
N1 G3 3 0.490000
N1 G4 3 0.323333
N1 G5 3 0.226667
N2 G1 3 0.783333
N2 G2 3 0.686667
N2 G3 3 0.683333
N2 G4 3 0.663333
N2 G5 3 0.423333
N3 G1 3 0.700000
N3 G2 3 0.740000
N3 G3 3 0.736667
N3 G4 3 0.746667
N3 G5 3 0.540000
N4 G1 3 0.623333
N4 G2 3 0.593333
N4 G3 3 0.590000
N4 G4 3 0.860000
N4 G5 3 0.606667
N5 G1 3 0.523333
N5 G2 3 0.443333
N5 G3 3 0.443333
N5 G4 3 0.880000
N5 G5 3 0.643333
SE(N= 3) 0.711805E-02
5%LSD 40DF 0.203437E-01
-------------------------------------------------------------------------------
ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE VIDU20 7/11/** 21:49
---------------------------------------------------------------- PAGE 3
Thie ke kieu Split-plot
F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1
VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI |MT$
|Error(a)|GIONG$ |MT$*GIO|
(N= 75) -------------------- SD/MEAN | | |
| |NG$ |
NO. BASED ON BASED ON % | | |
| | |
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 101
OBS. TOTAL SS RESID SS | | |
| | |
CD 75 0.59880 0.15703 0.12329E-01 2.1 0.2655 0.0000 0.2253
0.0000 0.0000
5. Ảnh hưởng của tương tác Giống x MTCL tới khả năng tái sinh cây
BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLTS FILE VIDU17 6/11/** 10:29
---------------------------------------------------------------- PAGE 1
Thiet ke kieu Split-plot
VARIATE V004 TLTS
LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER
SQUARES SQUARES LN
=============================================================================
1 NLAI 2 15.7067 7.85333 0.75 0.481 6
2 MT$ 4 13509.5 3377.37 313.59 0.000 3
3 Error(a) 8 86.1601 10.7700 1.03 0.428 6
4 GIONG$ 4 48151.3 12037.8 ****** 0.000 6
5 MT$*GIONG$ 16 5725.19 357.824 34.35 0.000 6
* RESIDUAL 40 416.643 10.4161
-----------------------------------------------------------------------------
* TOTAL (CORRECTED) 74 67904.4 917.628
-----------------------------------------------------------------------------
TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE VIDU17 6/11/** 10:29
---------------------------------------------------------------- PAGE 2
Thiet ke kieu Split-plot
MEANS FOR EFFECT NLAI
-------------------------------------------------------------------------------
NLAI NOS TLTS
1 25 49.4800
2 25 49.7600
3 25 48.6800
SE(N= 25) 0.645479
5%LSD 40DF 1.84481
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT MT$
-------------------------------------------------------------------------------
MT$ NOS TLTS
N1 15 25.5667
N2 15 57.3667
N3 15 60.8000
N4 15 59.5000
N5 15 43.3000
SE(N= 15) 0.847349
5%LSD 8DF 2.76312
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT Error(a)
-------------------------------------------------------------------------------
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 102
NLAI MT$ NOS TLTS
1 N1 5 25.2000
1 N2 5 57.2000
1 N3 5 62.6000
1 N4 5 59.1000
1 N5 5 43.3000
2 N1 5 25.4000
2 N2 5 57.4000
2 N3 5 62.6000
2 N4 5 60.0000
2 N5 5 43.4000
3 N1 5 26.1000
3 N2 5 57.5000
3 N3 5 57.2000
3 N4 5 59.4000
3 N5 5 43.2000
SE(N= 5) 1.44333
5%LSD 40DF 4.12512
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT GIONG$
-------------------------------------------------------------------------------
GIONG$ NOS TLTS
G1 15 76.0000
G2 15 69.2667
G3 15 63.8000
G4 15 21.8667
G5 15 15.6000
SE(N= 15) 0.833309
5%LSD 40DF 2.38164
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT MT$*GIONG$
-------------------------------------------------------------------------------
MT$ GIONG$ NOS TLTS
N1 G1 3 40.0000
N1 G2 3 36.8333
N1 G3 3 34.8333
N1 G4 3 10.3333
N1 G5 3 5.83333
N2 G1 3 97.8333
N2 G2 3 82.5000
N2 G3 3 78.6667
N2 G4 3 15.6667
N2 G5 3 12.1667
N3 G1 3 95.0000
N3 G2 3 90.3333
N3 G3 3 76.8333
N3 G4 3 22.1667
N3 G5 3 19.6667
N4 G1 3 90.0000
N4 G2 3 77.3333
N4 G3 3 72.0000
N4 G4 3 34.6667
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 103
N4 G5 3 23.5000
N5 G1 3 57.1667
N5 G2 3 59.3333
N5 G3 3 56.6667
N5 G4 3 26.5000
N5 G5 3 16.8333
SE(N= 3) 1.86334
5%LSD 40DF 5.32551
-------------------------------------------------------------------------------
ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE VIDU17 6/11/** 10:29
---------------------------------------------------------------- PAGE 3
Thiet ke kieu Split-plot
F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1
VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI |MT$
|Error(a)|GIONG$ |MT$*GIO|
(N= 75) -------------------- SD/MEAN | | |
| |NG$ |
NO. BASED ON BASED ON % | | |
| | |
OBS. TOTAL SS RESID SS | | |
| | |
TLTS 75 49.307 30.292 3.2274 6.5 0.4810 0.0000 0.4276
0.0000 0.0000
6. Ảnh hưởng của tương tác Giống x MTTS ñến khả năng tái sinh
BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLTS FILE VIDU14 6/11/** 8:39
---------------------------------------------------------------- PAGE 1
Thiet ke kieu Split-plot
VARIATE V004 TLTS
LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER
SQUARES SQUARES LN
=============================================================================
1 NLAI 2 .775995 .387998 4.63 0.026 6
2 MT$ 1 156.865 156.865 ****** 0.000 3
3 Error(a) 2 .986641E-01 .493321E-01 0.59 0.571 6
4 GIONG$ 4 19521.1 4880.28 ****** 0.000 6
5 MT$*GIONG$ 4 3.38134 .845334 10.09 0.000 6
* RESIDUAL 16 1.34007 .837543E-01
-----------------------------------------------------------------------------
* TOTAL (CORRECTED) 29 19683.6 678.744
-----------------------------------------------------------------------------
TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE VIDU14 6/11/** 8:39
---------------------------------------------------------------- PAGE 2
Thiet ke kieu Split-plot
MEANS FOR EFFECT NLAI
-------------------------------------------------------------------------------
NLAI NOS TLTS
1 10 49.4800
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 104
2 10 49.7600
3 10 49.8600
SE(N= 10) 0.915174E-01
5%LSD 16DF 0.274371
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT MT$
-------------------------------------------------------------------------------
MT$ NOS TLTS
RN1 15 51.9867
RN2 15 47.4133
SE(N= 15) 0.573481E-01
5%LSD 2DF 0.344130
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT Error(a)
-------------------------------------------------------------------------------
NLAI MT$ NOS TLTS
1 RN1 5 51.8400
1 RN2 5 47.1200
2 RN1 5 52.0400
2 RN2 5 47.4800
3 RN1 5 52.0800
3 RN2 5 47.6400
SE(N= 5) 0.129425
5%LSD 16DF 0.388019
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT GIONG$
-------------------------------------------------------------------------------
GIONG$ NOS TLTS
G1 6 76.0000
G2 6 69.2667
G3 6 65.6000
G4 6 21.8667
G5 6 15.7667
SE(N= 6) 0.118148
5%LSD 16DF 0.354211
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT MT$*GIONG$
-------------------------------------------------------------------------------
MT$ GIONG$ NOS TLTS
RN1 G1 3 78.6667
RN1 G2 3 71.8667
RN1 G3 3 67.3333
RN1 G4 3 24.1333
RN1 G5 3 17.9333
RN2 G1 3 73.3333
RN2 G2 3 66.6667
RN2 G3 3 63.8667
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 105
RN2 G4 3 19.6000
RN2 G5 3 13.6000
SE(N= 3) 0.167087
5%LSD 16DF 0.500930
-------------------------------------------------------------------------------
ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE VIDU14 6/11/** 8:39
---------------------------------------------------------------- PAGE 3
Thiet ke kieu Split-plot
F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1
VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI |MT$
|Error(a)|GIONG$ |MT$*GIO|
(N= 30) -------------------- SD/MEAN | | |
| |NG$ |
NO. BASED ON BASED ON % | | |
| | |
OBS. TOTAL SS RESID SS | | |
| | |
TLTS 30 49.700 26.053 0.28940 0.6 0.0255 0.0003 0.5711
0.0000 0.0003
7. Ảnh hưởng của tương tác MTCL x MTTS ñến khả năng tái sinh
BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLTS FILE VI DU9 6/11/** 8:27
---------------------------------------------------------------- PAGE 1
Thiet ke kieu Split-plot
VARIATE V004 TLTS
LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER
SQUARES SQUARES LN
=============================================================================
1 NLAI 2 .776002 .388001 3.09 0.072 6
2 MTTS$ 1 156.865 156.865 ****** 0.000 3
3 Error(a) 2 .986667E-01 .493333E-01 0.39 0.686 6
4 MTCL$ 4 5687.40 1421.85 ****** 0.000 6
5 MTTS$*MTCL$ 4 24.7547 6.18866 49.36 0.000 6
* RESIDUAL 16 2.00605 .125378
-----------------------------------------------------------------------------
* TOTAL (CORRECTED) 29 5871.90 202.479
-----------------------------------------------------------------------------
TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE VI DU9 6/11/** 8:27
---------------------------------------------------------------- PAGE 2
Thiet ke kieu Split-plot
MEANS FOR EFFECT NLAI
-------------------------------------------------------------------------------
NLAI NOS TLTS
1 10 49.4800
2 10 49.7600
3 10 49.8600
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 106
SE(N= 10) 0.111972
5%LSD 16DF 0.335695
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT MTTS$
-------------------------------------------------------------------------------
MTTS$ NOS TLTS
RN1 15 51.9867
RN2 15 47.4133
SE(N= 15) 0.573488E-01
5%LSD 2DF 0.344135
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT Error(a)
-------------------------------------------------------------------------------
NLAI MTTS$ NOS TLTS
1 RN1 5 51.8400
1 RN2 5 47.1200
2 RN1 5 52.0400
2 RN2 5 47.4800
3 RN1 5 52.0800
3 RN2 5 47.6400
SE(N= 5) 0.158353
5%LSD 16DF 0.474745
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT MTCL$
-------------------------------------------------------------------------------
MTCL$ NOS TLTS
G1 6 25.5667
G2 6 57.3667
G3 6 62.6000
G4 6 59.6667
G5 6 43.3000
SE(N= 6) 0.144556
5%LSD 16DF 0.433381
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT DAM$*GIONG$
-------------------------------------------------------------------------------
MTTS$ MTCL$ NOS TLTS
RN1 G1 3 27.5333
RN1 G2 3 58.8000
RN1 G3 3 64.4000
RN1 G4 3 61.8667
RN1 G5 3 47.3333
RN2 G1 3 23.6000
RN2 G2 3 55.9333
RN2 G3 3 60.8000
RN2 G4 3 57.4667
RN2 G5 3 39.2667
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 107
SE(N= 3) 0.204433
5%LSD 16DF 0.612893
-------------------------------------------------------------------------------
ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE VI DU9 6/11/** 8:27
---------------------------------------------------------------- PAGE 3
Thiet ke kieu Split-plot
F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1
VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI |MTTS$
|Error(a)|MTCL$ |MTTS$*MTCL|
(N= 30) -------------------- SD/MEAN | | |
| |NG$ |
NO. BASED ON BASED ON % | | |
| | |
OBS. TOTAL SS RESID SS | | |
| | |
TLTS 30 49.700 14.230 0.35409 0.7 0.0719 0.0003 0.6855
0.0000 0.0000
8. Ảnh hưởng của tương tác Giống x MTTS tới thời gian tái sinh
BALANCED ANOVA FOR VARIATE NG FILE VIDU6 3/11/** 9:37
---------------------------------------------------------------- PAGE 1
Thiet ke kieu Split-plot
VARIATE V004 NG
LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER
SQUARES SQUARES LN
=============================================================================
1 NLAI 2 .466667 .233333 0.54 0.599 6
2 MT$ 1 6.53333 6.53333 4.00 0.184 3
3 Error(a) 2 3.26667 1.63333 3.77 0.045 6
4 GIONG$ 4 345.467 86.3667 199.31 0.000 6
5 MT$*GIONG$ 4 4.80000 1.20000 2.77 0.063 6
* RESIDUAL 16 6.93338 .433336
-----------------------------------------------------------------------------
* TOTAL (CORRECTED) 29 367.467 12.6713
-----------------------------------------------------------------------------
TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE VIDU6 3/11/** 9:37
---------------------------------------------------------------- PAGE 2
Thiet ke kieu Split-plot
MEANS FOR EFFECT NLAI
-------------------------------------------------------------------------------
NLAI NOS NG
1 10 9.10000
2 10 9.00000
3 10 9.30000
SE(N= 10) 0.208167
5%LSD 16DF 0.624089
-------------------------------------------------------------------------------
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 108
MEANS FOR EFFECT MT$
-------------------------------------------------------------------------------
MT$ NOS NG
RN1 15 9.60000
RN2 15 8.66667
SE(N= 15) 0.329983
5%LSD 2DF 1.98014
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT Error(a)
-------------------------------------------------------------------------------
NLAI MT$ NOS NG
1 RN1 5 10.0000
1 RN2 5 8.20000
2 RN1 5 9.40000
2 RN2 5 8.60000
3 RN1 5 9.40000
3 RN2 5 9.20000
SE(N= 5) 0.294393
5%LSD 16DF 0.882595
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT GIONG$
-------------------------------------------------------------------------------
GIONG$ NOS NG
G1 6 5.00000
G2 6 6.50000
G3 6 8.16667
G4 6 11.8333
G5 6 14.1667
SE(N= 6) 0.268743
5%LSD 16DF 0.805695
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT MT$*GIONG$
-------------------------------------------------------------------------------
MT$ GIONG$ NOS NG
RN1 G1 3 5.66667
RN1 G2 3 6.66667
RN1 G3 3 8.00000
RN1 G4 3 12.6667
RN1 G5 3 15.0000
RN2 G1 3 4.33333
RN2 G2 3 6.33333
RN2 G3 3 8.33333
RN2 G4 3 11.0000
RN2 G5 3 13.3333
SE(N= 3) 0.380060
5%LSD 16DF 1.13943
-------------------------------------------------------------------------------
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 109
ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE VIDU6 3/11/** 9:37
---------------------------------------------------------------- PAGE 3
Thiet ke kieu Split-plot
F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1
VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI |MT$
|Error(a)|GIONG$ |MT$*GIO|
(N= 30) -------------------- SD/MEAN | | |
| |NG$ |
NO. BASED ON BASED ON % | | |
| | |
OBS. TOTAL SS RESID SS | | |
| | |
NG 30 9.1333 3.5597 0.65828 7.2 0.5986 0.1843 0.0448
0.0000 0.0631
9. Ảnh hưởng của tương tác Giống x MTTS ñến số chồi tái sinh từ 1 cụm mô sẹo
BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOI FILE VIDU5 3/11/** 4:36
---------------------------------------------------------------- PAGE 1
Thiet ke kieu Split-plot
VARIATE V004 CHOI
LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER
SQUARES SQUARES LN
=============================================================================
1 NLAI 2 3.26666 1.63333 3.16 0.069 6
2 MT$ 1 56.0333 56.0333 240.14 0.003 3
3 Error(a) 2 .466667 .233333 0.45 0.649 6
4 GIONG$ 4 324.333 81.0833 156.93 0.000 6
5 MT$*GIONG$ 4 15.8000 3.95000 7.65 0.001 6
* RESIDUAL 16 8.26672 .516670
-----------------------------------------------------------------------------
* TOTAL (CORRECTED) 29 408.167 14.0747
-----------------------------------------------------------------------------
TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE VIDU5 3/11/** 4:36
---------------------------------------------------------------- PAGE 2
Thiet ke kieu Split-plot
MEANS FOR EFFECT NLAI
-------------------------------------------------------------------------------
NLAI NOS CHOI
1 10 7.60000
2 10 7.60000
3 10 8.30000
SE(N= 10) 0.227304
5%LSD 16DF 0.681460
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT DAM$
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 110
-------------------------------------------------------------------------------
MT$ NOS CHOI
RN1 15 9.20000
RN2 15 6.46667
SE(N= 15) 0.124722
5%LSD 2DF 0.748422
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT Error(a)
-------------------------------------------------------------------------------
NLAI MT$ NOS CHOI
1 RN1 5 8.80000
1 RN2 5 6.40000
2 RN1 5 9.00000
2 RN2 5 6.20000
3 RN1 5 9.80000
3 RN2 5 6.80000
SE(N= 5) 0.321456
5%LSD 16DF 0.963731
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT GIONG$
-------------------------------------------------------------------------------
GIONG$ NOS CHOI
G1 6 12.8333
G2 6 9.66667
G3 6 7.83333
G4 6 3.33333
G5 6 5.50000
SE(N= 6) 0.293448
5%LSD 16DF 0.879762
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT MT$*GIONG$
-------------------------------------------------------------------------------
MT$ GIONG$ NOS CHOI
RN1 G1 3 15.3333
RN1 G2 3 11.3333
RN1 G3 3 9.33333
RN1 G4 3 4.00000
RN1 G5 3 6.00000
RN2 G1 3 10.3333
RN2 G2 3 8.00000
RN2 G3 3 6.33333
RN2 G4 3 2.66667
RN2 G5 3 5.00000
SE(N= 3) 0.414998
5%LSD 16DF 1.24417
-------------------------------------------------------------------------------
ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE VIDU5 3/11/** 4:36
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 111
---------------------------------------------------------------- PAGE 3
Thiet ke kieu Split-plot
F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1
VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI |MT$
|Error(a)|GIONG$ |MT$*GIO|
(N= 30) -------------------- SD/MEAN | | |
| |NG$ |
NO. BASED ON BASED ON % | | |
| | |
OBS. TOTAL SS RESID SS | | |
| | |
CHOI 30 7.8333 3.7516 0.71880 9.2 0.0685 0.0026 0.6492
0.0000 0.0013
10. Ảnh hưởng của tương tác Giống x MTTS ñến tỷ lệ cây bạch tạng
BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLBT FILE VIDU15 6/11/** 9:50
---------------------------------------------------------------- PAGE 1
Thiet ke kieu Split-plot
VARIATE V004 TLBT
LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER
SQUARES SQUARES LN
=============================================================================
1 NLAI 2 .585867E-01 .292934E-01 0.92 0.422 6
2 MT$ 1 23.1617 23.1617 282.97 0.002 3
3 Error(a) 2 .163707 .818533E-01 2.57 0.106 6
4 GIONG$ 4 48.7290 12.1822 382.05 0.000 6
5 MT$*GIONG$ 4 .131447 .328617E-01 1.03 0.423 6
* RESIDUAL 16 .510180 .318862E-01
-----------------------------------------------------------------------------
* TOTAL (CORRECTED) 29 72.7545 2.50878
-----------------------------------------------------------------------------
TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE VIDU15 6/11/** 9:50
---------------------------------------------------------------- PAGE 2
Thiet ke kieu Split-plot
MEANS FOR EFFECT NLAI
-------------------------------------------------------------------------------
NLAI NOS TLBT
1 10 4.79600
2 10 4.86800
3 10 4.90200
SE(N= 10) 0.564679E-01
5%LSD 16DF 0.169292
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT MT$
-------------------------------------------------------------------------------
MT$ NOS TLBT
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 112
RN1 15 5.73400
RN2 15 3.97667
SE(N= 15) 0.738707E-01
5%LSD 2DF 0.443278
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT Error(a)
-------------------------------------------------------------------------------
NLAI MT$ NOS TLBT
1 RN1 5 5.77000
1 RN2 5 3.82200
2 RN1 5 5.73600
2 RN2 5 4.00000
3 RN1 5 5.69600
3 RN2 5 4.10800
SE(N= 5) 0.798577E-01
5%LSD 16DF 0.239415
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT GIONG$
-------------------------------------------------------------------------------
GIONG$ NOS TLBT
G1 6 2.57500
G2 6 4.51000
G3 6 5.32833
G4 6 5.57000
G5 6 6.29333
SE(N= 6) 0.728998E-01
5%LSD 16DF 0.218555
-------------------------------------------------------------------------------
MEANS FOR EFFECT MT$*GIONG$
-------------------------------------------------------------------------------
MT$ GIONG$ NOS TLBT
RN1 G1 3 3.35000
RN1 G2 3 5.45000
RN1 G3 3 6.28667
RN1 G4 3 6.41667
RN1 G5 3 7.16667
RN2 G1 3 1.80000
RN2 G2 3 3.57000
RN2 G3 3 4.37000
RN2 G4 3 4.72333
RN2 G5 3 5.42000
SE(N= 3) 0.103096
5%LSD 16DF 0.309083
-------------------------------------------------------------------------------
ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE VIDU15 6/11/** 9:50
---------------------------------------------------------------- PAGE 3
Thiet ke kieu Split-plot
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............ 113
F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1
VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI |MT$
|Error(a)|GIONG$ |MT$*GIO|
(N= 30) -------------------- SD/MEAN | | |
| |NG$ |
NO. BASED ON BASED ON % | | |
| | |
OBS. TOTAL SS RESID SS | | |
| | |
TLBT 30 4.8553 1.5839 0.17857 3.7 0.4216 0.0022 0.1064
0.0000 0.4225
11. Ảnh hưởng của quy trình chuyển gen tới hiệu quả chuyển gen
BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSUAT FILE VIDU26 19/11/** 21:30
---------------------------------------------------------------- PAGE 1
VARIATE V003 HSUAT
LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER
SQUARES SQUARES LN
=============================================================================
1 QTRI$ 1 168.100 168.100 25.47 0.001 2
* RESIDUAL 8 52.8000 6.60000
-----------------------------------------------------------------------------
* TOTAL (CORRECTED) 9 220.900 24.5444
-----------------------------------------------------------------------------
TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE VIDU26 19/11/** 21:30
---------------------------------------------------------------- PAGE 2
MEANS FOR EFFECT QTRI$
-------------------------------------------------------------------------------
QTRI$ NOS HSUAT
G1 5 23.0000
G2 5 14.8000
SE(N= 5) 1.14891
5%LSD 8DF 3.74649
-------------------------------------------------------------------------------
ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE VIDU26 19/11/** 21:30
---------------------------------------------------------------- PAGE 3
F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1
VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |QTRI$ |
(N= 10) -------------------- SD/MEAN | |
NO. BASED ON BASED ON % | |
OBS. TOTAL SS RESID SS | |
HSUAT 10 18.900 4.9542 2.5690 13.6 0.0011
._.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
CH2679.pdf
