Đánh giá hiệu quả Vắc - Xin lở mồm long móng trong công tác phòng chống bệnh lở mồm long móng trên đàn lợn nái ông bà tại xí nghiệp giống gia súc Thuận Thành

thực và ch−a đ−ợc sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đ−ợc cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã đ−ợc chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Lê Thị Minh Thu 3 Lời cảm ơn Trong suốt 2 năm học tập và hoàn thành luận văn, với nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận đ−ợc sự giúp đỡ, h−ớng dẫn tận tình của nhiều cá nhân và tập thể, cho phép tôi đ−ợc tỏ lòng biết ơn và cảm ơn chân thành tới: Ban Giám hiệu Tr−ờng Đại học Nông nghiệp I, khoa Sau Đại học, khoa Chăn nuôi - Thú y, Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung −ơng, các thầy cô giáo đã giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi học tập, tiếp thu kiến thức của ch−ơng trình học. Các thầy cô giáo trong bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý khoa Chăn nuôi - Thú y Tr−ờng Đại học Nông nghiệp I; các cán bộ thuộc bộ môn Vi rút, Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung −ơng. Trực tiếp là thầy h−ớng dẫn TS. Tô Long Thành, Phó giám đốc Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung −ơng. Ban Lãnh đạo công ty, Ban lãnh đạo xí nghiệp và toàn thể cán bộ công nhân xí nghiệp lợn giống Thuận Thành. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi đ−ợc gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, ng−ời thân cùng bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi v−ợt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, thực hiện đề tài. Một lần nữa tôi xin đ−ợc bày tỏ lòng biết ơn, cảm ơn chân thành tới những tập thể, cá nhân đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành ch−ơng trình học tập. Tác giả luận văn Lê Thị Minh Thu 4 Mục lục Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt vi Danh mục các bảng vii Danh mục các biểu đồ viii 1. Mở đầu................................................................................................i 1.1. Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................... 10 1.2. ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................ 12 1.3. mục tiêu của đề tài .............................................................................. 12 2. Tổng quan tài liệu ................................................................... 13 2.1. Lịch sử bệnh Lở mồm Long móng...................................................... 13 2.1.1. Định nghĩa........................................................................................... 13 2.1.2. Lịch sử bệnh Lở mồm Long móng...................................................... 13 2.2. Tình hình dịch bệnh Lở mồm Long móng trên thế giới và Đông Nam á ....................................................................................... 14 2.2.1. Tình hình dịch bệnh Lở mồm Long móng trên thế giới...................... 14 2.2.2. Tình hình dịch LMLM ở Đông Nam á ............................................... 16 2.2.3. Tình hình dịch Lở mồm Long móng ở Việt Nam ............................... 18 2.3. Vi rút Lở mồm Long móng................................................................. 21 2.3.1. Hình thái, cấu trúc............................................................................... 21 2.3.2. Phân loại và biến chủng của vi rút ...................................................... 24 2.3.3. Đặc tính nuôi cấy ................................................................................ 26 2.3.4. Sức đề kháng ....................................................................................... 27 Trang 5 2.3.5. Độc lực, tính gây bệnh ........................................................................ 28 2.3.6. Nguồn dịch và cách lây lan ................................................................. 29 2.3.7. Triệu chứng ......................................................................................... 31 2.3.8. Bệnh tích.............................................................................................. 32 2.3.9. Chẩn đoán............................................................................................ 33 2.3.10. Đáp ứng miễn dịch ............................................................................. 41 2.4. Vắc xin ................................................................................................ 45 2.4.1. Vắc xin nh−ợc độc formol keo phèn ................................................... 46 2.4.2. Vắc xin vô hoạt nuôi cấy trên môi tr−ờng tế bào................................ 46 2.4.3. Vắc xin sản xuất theo công nghệ gen ................................................. 47 3. đối t−ợng, nội dung, nguyên liệu và ph−ơng pháp nghiên cứu................................................. 48 3.1. Đối t−ợng, thời gian, địa điểm nghiên cứu......................................... 48 3.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................... 48 3.2.1. Đánh giá tình hình dịch LMLM năm 2006......................................... 48 3.2.2. Tình hình dịch bệnh tại xí nghiệp. ...................................................... 48 3.2.3. Khảo sát diễn biến đáp ứng miễn dịch của đàn lợn sau khi tiêm vắc xin LMLM. (Ph−ơng pháp Elisa phát hiện kháng thể) .................... 48 3.2.4. Đánh giá hiệu quả của việc sử dụng vắc xin phòng bệnh LMLM, so sánh với biện pháp tổng thể................................................................. 48 3.3. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 49 3.4. Nguyên liệu ......................................................................................... 49 3.4.1. Dụng cụ ................................................................................................ 49 3.4.2. Máy móc thiết bị: ................................................................................ 49 3.4.3. Nguyên liệu làm thí nghiệm................................................................ 50 3.5. Ph−ơng pháp nghiên cứu ..................................................................... 50 3.5.1. Bố trí thí nghiêm ................................................................................. 50 3.5.2. Ph−ơng pháp thu thập, vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm............... 51 6 3.5.3. Ph−ơng pháp ELISA - 3ABC để phân biệt miễn dịch tự nhiên và miễn dịch bị động tự nhiên.................................................................. 52 3.5.4. Ph−ơng pháp ELISA để đánh giá đáp ứng miễn dịch (Phát hiện kháng thể) .......................................................................... 54 3.5.5. Ph−ơng pháp ELISA để phát hiện kháng nguyên .............................. 58 3.5.6. Ph−ơng pháp xử lý số liệu ................................................................... 59 4. kết quả và thảo luận............................................................. 60 4.1. Tình hình dịch bệnh LMLM trong năm 2006..................................... 60 4.2. Tình hình dịch bệnh tại xí nghiệp ....................................................... 62 4.3. Kết quả chẩn đoán phát hiện vi rút ..................................................... 66 4.4. Khảo sát đáp ứng miễn dịch của nái mẹ sau khi tiêm vắc xin .................... 69 4.5. Miễn dịch thụ động ở lợn con sinh ra từ đàn nái mẹ đã tiêm phòng... 72 4.6. Đáp ứng miễn dịch ở đàn lợn choai sau khi tiêm phòng 1 lần.......... 75 4.7. Đáp ứng miễn dịch ở đàn lợn choai sau khi tiêm liều tăng c−ờng.... 77 4.8. Đánh giá biện pháp phòng bệnh bằng vắc xin trong biện pháp tổng thể................................................................................................ 79 5. Kết luận và đề nghị ................................................................. 83 5.1. Kết luận ............................................................................................... 83 5.2. Đề nghị ................................................................................................ 83 tài liệu tham khảo .................................................................. 85 Phụ lục 7 Danh mục các chữ viết tắt ARN : Axít ribo nucleotit ELIZA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay EU : Liên hiệp châu Âu FAO : Food and Argricultural Organization FMD : Foot And Mouth disease LMLM : Lở mồm long móng NXB : Nhà xuất bản OIE : Office Internationale des Epizooties OD : Đậm độ quang học (Optical Density) PCR : Polyme Chain Reaction PI : Phần trăm ức chế mẫu (Percentage Inhibition) RT- PCR : Reverse Transcriptase Polyme Chain Reaction RCU : Tiểu ban phòng chống bệnh LMLM SEA : South East Asia. TCID : Tissue Culture Infectious Degree 8 Danh mục các bảng Bảng 4.1. Tình hình dịch bệnh LMLM tại Việt Nam trong năm 2006 61 Bảng 4.2. Một số chỉ tiêu kỹ thuật của xí nghiệp trong 4 năm qua 63 Bảng 4.3. Tỷ lệ chết và loại thải đàn nái của xí nghiệp 64 Bảng 4.4. Một số bệnh th−ờng gặp trên đàn nái tại xí nghiệp 65 Bảng 4.5. Kết quả chẩn đoán phát hiện kháng thể bằng ph−ơng pháp ELISA - 3ABC 69 Bảng 4.6. Kết quả xét nghiệm phát hiện kháng thể FMD ở đàn lợn nái tại xí nghiệp 70 Bảng 4.7. Kết quả theo dõi đáp ứng miễn dịch của đàn lợn nái tại xí nghiệp (có kháng thể tr−ớc khi tiêm) 70 Bảng 4.8. Kết quả xét nghiệm phát hiện kháng thể FMD ở đàn lợn con theo mẹ và cai sữa tại xí nghiệp 73 Bảng 4.9. Kết quả theo dõi đáp ứng miễn dịch của đàn lợn con theo mẹ và cai sữa 74 Bảng 4.10. Kết quả xét nghiệm phát hiện kháng thể FMD ở đàn lợn choai tại xí nghiệp 75 Bảng 4.11. Kết quả theo dõi đáp ứng miễn dịch của đàn lợn choai tại xí nghiệp 76 Bảng 4. 12. Kết quả xét nghiệm phát hiện kháng thể FMD ở đàn lợn choai tại xí nghiệp 77 Bảng 4.13. Kết quả theo dõi đáp ứng miễn dịch của đàn lợn choai sau khi tiêm phòng liều tăng c−ờng tại xí nghiệp. 78 9 Danh mục biểu đồ ảnh 1: Phân bố vùng dịch LMLM trên thế giới năm 2005. ....................... 15 ảnh 2: Bệnh tích do Vi rút LMLM gây ra ở môi và chân lợn. ................... 33 Hình 2.1: Biểu đồ biểu diễn số gia súc nhiễm bệnh LMLM qua các năm ở Việt Nam......................................................................................... 18 Hình 4.1. Biểu đồ biểu diễn tình hình dịch bệnh LMLM trong năm 2006..... 61 Hình 4.2. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ một số bệnh th−ờng gặp rên đàn lợn nái của xí nghiệp ................................................................................... 66 Hình 4.3: Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ bảo hộ của đàn lợn nái sau khi tiêm vắc xin LMLM ........................................................... 71 Hình 4.4: Biểu đồ biểu diễn diễn biến kháng thể thụ động của đàn lợn con sinh ra từ đàn nái đã tiêm phòng vắc xin..................... 74 Hình 4. 5: Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ bảo hộ của đàn lợn choai sau khi tiêm phòng vắc xin 1 lần ......................................................................... 76 Hình 4.6: Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ bảo hộ của đàn lợn choai sau khi tiêm phòng vắc xin liều tăng c−ờng ........................................................ 79 10 1. Mở đầu 1.1. Tính cấp thiết của đề tài Bệnh Lở mồm Long móng (LMLM) là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do vi rút gây ra cho ngành chăn nuôi trên thế giới. Bệnh lây lan nhanh, mạnh, gây thiệt hại nặng đối với động vật thuộc loài móng guốc chẵn: trâu, bò, dê, lợn, cừu, h−ơu, nai.... Bệnh th−ờng xảy ra ở thể cấp tính, có thể lây lan trong phạm vi một n−ớc hoặc nhiều n−ớc, sự lây lan không chỉ do tiếp xúc mà còn qua nhiều đ−ờng, kể cả qua không khí. Vì vậy, bệnh th−ờng phát thành đại dịch gây thiệt hại cho ngành chăn nuôi. Bệnh gây nên hậu quả nghiêm trọng về mặt kinh tế, xã hội và bảo vệ môi tr−ờng. Bệnh LMLM có tính chất bệnh dịch địa ph−ơng ở nhiều n−ớc, nh−ng vi rút có phân bố trên thế giới rất khác nhau. Bệnh LMLM đ−ợc Tổ chức Dịch tễ thế giới (OIE - Office Internationale des Epizooties) xếp đầu tiên trong danh mục bảng A gồm 15 bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của gia súc, gia cầm. Bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế và ảnh h−ởng đến th−ơng mại, đặc biệt là việc buôn bán động vật và sản phẩm có nguồn gốc động vật. Việc phòng chống bệnh LMLM ở nhiều n−ớc trở nên một chính sách rất quan trọng, nhất là trong nền kinh tế thị tr−ờng. Có hay không bệnh LMLM là một tiêu chí trong quan hệ buôn bán quốc tế và mọi quốc gia đều sử dụng nó nh− một vũ khí th−ơng mại [14]. Vi rút gây bệnh LMLM thuộc họ Picornaviridae đ−ợc chia thành 7 type huyết thanh là A, O, C, Asia-1, SAT-1, SAT-2 và SAT-3. Trong một type có các d−ới type (sub-type) và theo cách phân loại cũ có hơn 70 d−ới type [28]. Giữa 7 type nêu trên không có miễn dịch chéo, chúng gây bệnh với mức độ và diễn biến khác nhau nh−ng về triệu chứng lâm sàng lại hoàn toàn giống nhau. Chính vì vậy, ch−ơng trình phòng chống bệnh bằng vắc xin gặp nhiều khó khăn do có sự thay đổi cấu trúc kháng nguyên của vi rút, nhiều khi ổ dịch đã tiêm phòng vẫn mắc đi, mắc lại [29]. 11 ở Việt Nam, bệnh LMLM xuất hiện từ năm 1898 [22], từ đó đến nay bệnh liên tục xảy ra khi rải rác khi bùng phát dữ dội. Năm 1995 bệnh xảy ra liên tiếp trên địa bàn 107 huyện thuộc 26 tỉnh thành có 2.351 trâu bò, 11.000 lợn mắc bệnh. Đợt dịch lớn gần đây nhất là năm 1999-2000, 60 tỉnh. thành phố có gia súc mắc bệnh. Trong quý III năm 2006 cả n−ớc có 31 tỉnh, thành phố có dịch, tổng số gia súc mắc bệnh là 1.602 trâu, bò và 205 lợn. Tỉnh Bắc Ninh dịch xảy ra nhanh và mạnh nhất vào thời điểm tháng 6 đến tháng 10 năm 1999 trên 6 huyện với 1.416 trâu, bò; 556 lợn mắc bệnh. Sau đó bệnh vẫn xảy ra lẻ tẻ, trong 6 tháng đầu năm 2006 dịch xuất hiện tại 2 huyện Từ Sơn và Gia Bình. Phòng chống bệnh LMLM ở bất kỳ n−ớc nào cũng phải là chính sách quốc gia. Mỗi quốc gia đều phải đ−a ra chiến l−ợc phòng chống bệnh của riêng n−ớc mình. Chiến l−ợc phòng chống bệnh LMLM phụ thuộc vào các mục tiêu cần đạt đ−ợc, có 3 chiến l−ợc phòng chống bệnh đang đ−ợc áp dụng là: - Tiêu huỷ toàn bộ gia súc nhiễm bệnh (áp dụng ở các n−ớc phát triển). - Tiêm phòng vắc xin cho gia súc từ 5 đến 10 năm và không tiêu huỷ. - Vừa tiêm phòng vừa tiêu huỷ đàn gia súc mắc bệnh. Chủ tr−ơng áp dụng phòng chống dịch của n−ớc ta hiện nay là tiêu huỷ số l−ợng gia súc nhỏ nhiễm bệnh, đồng thời với việc tiêm phòng. Xí nghiệp giống gia súc Thuận Thành là cơ sở sản xuất lợn giống h−ớng nạc của tỉnh Bắc Ninh. Trong tình trạng bệnh LMLM đang bùng phát và là trở ngại hàng đầu cho ngành chăn nuôi thì công tác phòng chống bệnh càng trở nên đặc biệt quan trọng không chỉ đối với phạm vi cả n−ớc mà cả phạm vi tỉnh, thậm chí phạm vi một trại chăn nuôi. Xuất phát từ thực tế này, chúng tôi thực hiện đề tài “Đánh giá hiệu quả vắc xin Lở mồm Long móng trong công tác phòng chống bệnh Lở mồm Long móng trên đàn lợn nái ông bà tại xí nghiệp giống gia súc Thuận Thành” 12 1.2. ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Đánh giá đ−ợc hiệu quả của vắc xin phòng bệnh LMLM thông qua đáp ứng miễn dịch đặc hiệu, đáp ứng miễn dịch bảo hộ và độ dài miễn dịch. Những số liệu thu đ−ợc có thể làm tài liệu tham khảo cho công tác giảng dạy và hoạch định các chiến l−ợc thanh toán bệnh. Với kết quả nghiên cứu thu đ−ợc có thể kiểm chứng lại tính đúng đắn của qui trình sử dụng vắc xin đang đ−ợc áp dụng tại Việt Nam. 1.3. mục tiêu của đề tài - Xác định thời gian xuất hiện kháng thể và thời gian có bảo hộ sau khi tiêm phòng. - Xác định hàm l−ợng kháng thể và thời gian có bảo hộ của đàn con đ−ợc sinh ra từ đàn nái mẹ đã tiêm phòng. - Đánh giá hiệu quả sử dụng vắc xin trong công tác phòng chống bệnh LMLM. 13 2. Tổng quan tài liệu 2.1. Lịch sử bệnh lở mồm long móng 2.1.1. Định nghĩa Bệnh Lở mồm Long móng (LMLM) là bệnh truyền nhiễm cấp tính lây lan rất nhanh. Bệnh th−ờng xảy ra d−ới dạng dịch đại l−u hành đối với các loài móng guốc chẵn (trâu bò, lợn dê, cừu...). Bệnh do một loài vi rút h−ớng th−ợng bì gây ra. Gia súc mắc bệnh có đặc điểm sốt, có mụn n−ớc và vết loét ở niêm mạc miệng, kẽ móng, gờ móng, trên bầu vú, đầu vú. 2.1.2. Lịch sử bệnh lở mồm long móng Bệnh LMLM đ−ợc Frascastorius mô tả lần đầu tiên trên thế giới ở Italia vào năm 1514. Sau đó, năm 1897, Loeffler và Frosch đã xác định rằng bệnh là do vi rút gây ra. Tuy nhiên, phải đến những năm đầu thế kỷ 19 ng−ời ta mới công nhận tính truyền nhiễm mạnh mẽ của nó và mãi đến năm 1920 bệnh LMLM mới đ−ợc nghiên cứu một cách chi tiết (Andersen, 1980) [32]. Cuối thế kỷ 19, chỉ trong vòng vài tháng bệnh đã lây lan nhanh chóng khắp châu Âu từ Nga sang Đức, Hà Lan, Thuỵ Sỹ, Bỉ, Hungari, Đan Mạch, Pháp và Italia làm hàng chục triệu trâu bò mắc bệnh, kéo dài đến hàng chục năm không tắt (Nguyễn Vĩnh Ph−ớc, 1980) [16]. Trong những năm từ năm 1870 đến năm 1929, xuất hiện các ổ dịch LMLM ở Mỹ, do nhập khẩu trâu bò nhiễm bệnh từ các n−ớc khác. Bệnh xuất hiện ở nhiều bang nh− New England, Porland, Maine (1880), Boston, New England (1884)…Tại khu vực Bắc Mỹ, bệnh LMLM nổ ra ở Canada năm 1870, xuất hiện lần cuối vào năm 1952. Dịch phát ra tại Mexico năm 1946- 1954. Từ đầu thế kỷ 20 trở đi, dịch phát ra ở nhiều n−ớc trên thế giới: Năm 1902-1914: dịch nổ ra ở Mỹ. Năm 1929: dịch phát ở ấn Độ. 14 Năm 1946: dịch nổ ra ở Mehico. Năm 1948: dịch phát ra tại Myanma , Thái Lan, Indonesia. Năm 1951: ở châu á dịch phát ra ở Trung Quốc. ở châu Âu dịch phát ra từ Tây Đức, sau đó dịch lan sang Hà Lan, Bỉ, Luxemburg, Pháp, Anh, Italia, áo, Đan Mạch, Thuỵ Điển, Na Uy, Ba Lan và kéo dài đến năm 1953, 1954 [16]. Dịch cũng phát ra ở nhiều n−ớc Nam Mỹ nh− Argentina. Từ năm 1981 đến 1985: dịch LMLM đã xảy ra ở 80 n−ớc trên thế giới. Năm 1989: dịch đã xảy ra trên 50 n−ớc ở khắp các châu lục. Năm 1997: bùng nổ đại dịch huỷ diệt ngành chăn nuôi lợn của Đài Loan. Năm 2001: tình hình dịch LMLM trên thế giới lây lan rộng và gây thiệt hại lớn cho các n−ớc châu Âu và Nam Mỹ nh− Anh, Argentina và Braxin. Năm 2004, Liên Bang Nga và các n−ớc khác thuộc khu vực Đông Nam á là Mông Cổ và Trung Quốc báo cáo có dịch . Từ đầu năm 2005, đã xuất hiện type vi rút Asia-1 tại Trung Quốc, sau đó là Myanma. Trong năm 2005 và đầu năm 2006, các n−ớc tr−ớc đây có các vùng đ−ợc công bố là sạch bệnh nh− Brazil, Argentina và Bostwana thì nay lại báo cáo là có dịch xảy ra [30]. 2.2. Tình hình dịch bệnh lở mồm long móng trên thế giới và đông nam á 2.2.1. Tình hình dịch bệnh Lở mồm Long móng trên thế giới Bệnh LMLM đ−ợc ghi nhận đầu tiên ở châu Âu từ thế kỷ 17-18, sau đó bệnh phát hiện khắp toàn cầu. Theo thông báo của Tổ chức Dịch tễ Thế giới trong giai đoạn 1981 - 1985, bệnh LMLM xuất hiện ở 80 quốc gia trên toàn thế giới. Năm 1989, dịch LMLM xảy ra tại châu á, type O (ở 24 quốc gia, trong đó có Việt Nam), type A (ở 6 quốc gia), type Asia-1 (ở Thái Lan, Iran, Thổ Nhĩ Kỳ, Grudia), type SAT-2 (ở Arabsaudi, Kuwait), một số quốc gia khác ch−a định type 15 (Armenia, Azerbaijan, UAE, India) [43]. Những type khác nhau của LMLM phân bố khắp thế giới theo địa hình. ở Nam Mỹ chỉ có type O, A, C, trong đó type O và A phổ biến hơn. ở Bắc phi, những ổ dịch th−ờng do type O. ở Tây, Trung và Đông Phi tìm thấy có type SAT-1, SAT-2, O, A và C. Những vùng Nam Phi có type SAT-1, SAT-2 và SAT-3 nh−ng không có type O, A, C. ở châu á type O trội hơn mặc dù cũng có type Asia-1 và A, type C ít thấy [1]. Trong những năm gần đây tình hình bệnh LMLM trên thế giới nh− sau: Châu âu. Từ khi ngừng việc dùng vắc xin ở các n−ớc thuộc Liên hiệp châu Âu (EU) vào năm 1991, đã có những ổ dịch LMLM xảy ra ở Italia vào năm 1993, ở Hylạp vào năm 1994 và 1996. Các ổ bệnh xuất hiện ở Bungari vào năm 1991, 1993 và 1996, ở Nga năm 1995 và ở Anbani, Cộng hoà Macedonia, Kosovo vào năm 1996. Có thể nói rằng châu Âu ch−a bao giờ hoàn toàn không có bệnh LMLM. Các ổ dịch nổ ra lặp đi lặp lại. Phân tích chuỗi nucleotit cho thấy chủng vi rút LMLM thuộc type O. Cũng vào năm 1993, 57 ổ dịch đã nổ ra ở Italia. Tháng 5 năm 1996, ở Hylạp đ−ợc thông báo có 39 ổ dịch có cùng vi rút thuộc type O gây ra. Cũng vào năm 1996, vi rút LMLM type A đã xuất hiện ở phía đông nam Anbani (Kitching R.P., 1998) [47] . ảnh 1: Phân bố vùng dịch LMLM trên thế giới năm 2005. Phân bố vùng dịch LMLM trên thế giới 16 Nam Mỹ. Chilê, Guyana, Surinam không có bệnh LMLM trong thập kỷ này. Khoảng 8 năm trở lại đây đã có những tiến bộ đáng kể về hiệu quả của các ch−ơng trình khống chế bệnh LMLM ở Achentina, Paraguay, Uruguay và các bang phía nam của Braxin. Bolivia, Peru, Colombia, Equado và phần còn lại của Braxin mặc dù kém thành công hơn Achentina, Paraguay song cũng rất cố gắng khống chế bệnh LMLM nên kết quả đã giảm số l−ợng ổ dịch đ−ợc công bố (Kitching, 1998) [47]. Châu Phi. Năm 1989, vi rút LMLM type O đã thâm nhập vào Tuynidi (tr−ớc đây không có bệnh). Tr−ớc khi các biện pháp phòng chống đ−ợc triển khai, bệnh đã lan toả qua Angiêri và sau đó là Marốc. Vi rút LMLM type O cũng đang l−u hành ở Ai Cập và Libi (Kitching, 1998) [47]. 2.2.2. Tình hình dịch Lở mồm Long móng ở Đông Nam á Châu á là một lục địa có 22 quốc gia chính thức công bố có bệnh LMLM (Lombard và Schermbucker, 2000) [17]. Các ổ dịch lớn đã đ−ợc thông báo tại Đài Loan (1997) và Trung Quốc (1999). Năm 2000, dịch lây lan đến các n−ớc Đông Bắc á (Nhật Bản và Hàn Quốc). Năm 2004, Liên Bang Nga và các n−ớc khác thuộc khu vực Đông á là Mông Cổ và Trung Quốc báo cáo có dịch. Từ đầu năm 2005, đã xuất hiện type vi rút Asia-1 tại Trung Quốc, sau đó là Myanmar, đã làm cho diễn biến dịch LMLM trong khu vực đã phức tạp lại càng phức tạp hơn. Trong các năm 2005 và đầu năm 2006, các n−ớc tr−ớc đây có các vùng đ−ợc công nhận là sạch bệnh LMLM có hoặc không áp dụng biện pháp tiêm phòng nh− Brazil, Argentina và Bostwana thì nay lại báo cáo là có dịch xảy ra. Tình hình dịch LMLM tại khu vực Đông Nam á diễn ra theo chiều h−ớng gia tăng và phức tạp hơn. Các n−ớc có dịch là Thái Lan, Myanmar, Lào, Cămpuchia, Malaysia, Philippines và Việt Nam (Tô Long Thành và cs, 2006)[30]. 17 Nghiên cứu về dịch tễ học của bệnh LMLM cho thấy vi rút đã có nhiều thay đổi bằng cách sử dụng các kỹ thuật phân tử để xác định các chủng vi rút (Kitching, 1992). Vi rút LMLM type O ở các n−ớc trong khu vực: Những năm gần đây có một số subtype thuộc type O l−u hành trong khu vực Đông Nam châu á: chủng SEA (South East Asia) đ−ợc phát hiện ở Việt Nam năm 1997, Căm Pu Chia năm 1998 và Đài Loan năm 1999. Chủng ME-SA có mặt tại Irắc và Thổ Nhĩ Kỳ. Chủng vi rút Cathay phát hiện ở Hồng Kông 1982, ở Philippine năm 1996 và ở Đài Loan năm 1997. Năm 1997, chủng Cathay xuất hiện ở Việt Nam. Từ năm 1998, chủng Pan-Asia bắt đầu xuất hiện và lây lan trong vùng Đông Nam Châu á. Năm 1999, vi rút xuất ở Việt Nam do lây lan từ Trung Quốc qua buôn bán động vật qua biên giới Việt Trung. Vi rút cũng xuất hiện ở Thái Lan do trâu nhập từ Lào nh−ng về nguồn gốc lại nghi ngờ từ Vân Nam, Trung Quốc. Năm 2000, chủng vi rút này cũng xuất hiện tại Nhật và nguồn gốc ổ dịch bị nghi ngờ là do nhập khẩu từ Trung Quốc (Tô Long Thành và cs, 2006) [30]. Vi rút LMLM type A ở các n−ớc trong khu vực: Theo các tài liệu tham khảo, vi rút LMLM l−u hành tại ấn Độ và Trung Đông. Vi rút tạo thành dịch địa ph−ơng ở Thái Lan và đ−ợc lây từ Malaysia thông qua việc nhập khẩu trâu bò. Đặc điểm dịch tễ nổi bật là từ tháng 7/2003 đến nay, số ổ dịch do vi rút LMLM type A gây ra chiếm đa số; Lào cũng báo cáo phát hiện đ−ợc vi rút type A [30]. Vi rút LMLM type Asia-1 ở các n−ớc trong khu vực: Vi rút LMLM type Asia-1 đ−ợc thông báo ở châu á, Nam á, Đông á và Trung á. Ng−ời ta cho rằng vi rút Asia-1 l−u hành trên thế giới có nguồn gốc từ các n−ớc ASEAN. Vi rút Asia-1 gây nên dịch địa ph−ơng ở Thái Lan, Myanmar. Tuy nhiên, đặc điểm dịch tễ của các ổ dịch do vi rút Asia-1 ch−a đ−ợc nghiên cứu chi tiết. (Tô Long Thành và cs, 2006) [30]. 18 2.2.3. Tình hình dịch Lở mồm Long móng ở Việt Nam ở Việt Nam, dịch LMLM đã đ−ợc phát hiện từ năm 1898 tại Nha Trang. Từ đó đến nay, bệnh phát ra nhiều vùng trong cả n−ớc. Có thời kỳ bệnh phát ra lẻ tẻ nh−ng cũng có những năm bệnh lây rộng trong một tỉnh hoặc nhiều tỉnh gây thiệt hại đáng kể về kinh tế (Phan Đình Đỗ và Trịnh Văn Thịnh, 1958) [22]. Hình 2.1: Biểu đồ biểu diễn số gia súc nhiễm bệnh LMLM qua các năm ở Việt nam ở miền Bắc, trong 2 năm 1921 – 1922, đã xảy ra 690 ổ dịch làm 13.018 con trâu bò và lợn bị bệnh trong đó có 446 con chết. Năm 1937 – 1940, một ổ dịch lan tràn khắp tỉnh Quảng Ngãi, ở phía Bắc bệnh rải rác ở Sơn Tây và Thanh Hoá. Năm 1952 bệnh xuất hiện ở Thừa Thiên Huế, đến năm 1953 bệnh lan vào nam Trung Bộ và tiếp theo lan ra khu IV, khu Tả Ngạn, Việt Bắc, Tây Bắc và đến năm 1954, bệnh lây lan khắp miền Bắc với 179 ổ dịch. Tháng 4-1955, bệnh lại bùng phát trở lại ở liên khu III rồi lan sang khu Tả Ngạn, Việt Bắc, liên khu IV, Hà Nội, Nam Định, Hải Phòng cho đến cuối năm 1955 về căn bản dịch mới đ−ợc dập tắt (Phan Đình Đỗ, Trịnh Văn Thịnh, 1958) [22]. 19 Năm 1960, dịch phát ra 9 xã thuộc huyện Quỳnh L−u (Nghệ An). Nhờ các biện pháp phòng, chống dịch triệt để, bệnh hầu nh− đã bị tiêu diệt ở các tỉnh phía Bắc. Năm 1969 – 1970, ở miền Nam dịch bệnh lại xảy ra nghiêm trọng trên đàn trâu khu vực Sài Gòn – Chợ Lớn và từ đó lây lan ra các tỉnh lân cận và tấn công vào 5 trại lợn công nghiệp ở Nam Bộ (Hồ Đình Chúc và cs, 1978) [9]. Năm 1978, dịch xảy ra liên tiếp ở 17 tỉnh phía Nam từ Quảng Nam - Đà Nẵng trở vào tới các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. Từ năm 1976 đến năm 1983 theo các số liệu thống kê của Cục Thú y, đã có 98 ổ dịch xảy ra ở các tỉnh phía Nam làm 26.648 con trâu, bò; 2.919 con lợn mắc bệnh. Riêng năm 1983 các ổ dịch trâu, bò đã lan sang một số trại lợn thuộc huyện Thống Nhất tỉnh Đồng Nai làm 2.200 con lợn bị bệnh. Dịch LMLM th−ờng xuyên xảy ra rải rác ở một số tỉnh biên giới Tây Nam do lây từ Campuchia sang. Cuối những năm 1980, một số tỉnh nh− An Giang, Tây Ninh, Đồng Tháp th−ờng xuyên bị dịch LMLM. Năm 1989, ba huyện Long Đất, Long Thành, Xuyên Mộc của Đồng Nai bị dịch kéo dài từ tháng 5 đến giữa tháng 10 làm 3.514 con trâu, bò và lợn bị bệnh. Năm 1990, dịch cũng xuất hiện tại một số huyện thuộc tỉnh Thuận Hải (cũ) làm hơn 7.500 trâu bò bị mắc bệnh, đồng thời tại huyện Lộc Ninh tỉnh Sông Bé dịch cũng xảy ra làm 100 con trâu, bò ốm không cày kéo đ−ợc. Tháng 4 năm 1995, dịch LMLM đã xảy ra với tốc độ nhanh và lây ra hầu hết các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long, một số tỉnh Duyên Hải miền Trung. Năm 1996 – 1997, dịch xảy ra nặng ở một số tỉnh Duyên Hải miền Trung và Tây Nguyên; năm 1998 dịch xảy ra ở Bình Thuận. Đầu năm 1999, Tp. Hồ Chí Minh, Kiên Giang, Tiền Giang, Đồng Nai dịch LMLM cũng đã nổ ra. Tính từ 6 tháng cuối năm 1999 đến năm 2000 có 60 tỉnh, 439 huyện, 3.773 xã có gia súc mắc LMLM; 472.273 trâu, bò; 74.800 lợn mắc bệnh. 20 Năm 2001, nhờ Chính phủ chỉ đạo quyết liệt bằng các biện pháp hành chính và cấp 15 tỷ đồng cho các địa ph−ơng mua vắc xin tiêm phòng, trong năm 2001 dịch có phần đ−ợc khống chế: 11 tỉnh, 23 huyện, 35 xã có dịch LMLM, tập trung chủ yếu vào các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long làm 2.072 con trâu, bò và 3.311 lợn bị mắc bệnh. Năm 2002, dịch xảy ra trên 26 tỉnh thành làm 10.287 trâu, bò mắc bệnh. Năm 2003, dịch bùng nổ trên 38 tỉnh với 25.014 trâu, bò và lợn mắc bệnh. Năm 2004, số tỉnh có dịch LMLM là 24 tỉnh. Năm 2005: dịch LMLM có ở 37 tỉnh với 28.241 trâu, bò; 3.976 lợn; 81 dê mắc bệnh. Ngoài 2 type vi rút th−ờng thấy hàng năm còn xuất hiện vi rút LMLM type Asia-1 ở hai tỉnh Lao Cai và Khánh Hoà. Từ đầu năm 2006 đến nay, số tỉnh có dịch LMLM là 27 tỉnh với tổng số 9.271 trâu bò và 12.461 lợn bị bệnh (Tô Long Thành và cs, 2006) [30]. Về các type vi rút đ∙ đ−ợc phát hiện tại Việt Nam: Đặc điểm của các chủng vi rút gây bệnh LMLM thay đổi theo từng giai đoạn: giai đoạn từ năm 1985 trở về tr−ớc, Cục Thú y không có khả năng chẩn đoán xác định type vi rút gây bệnh LMLM nên không có số liệu l−u trữ, việc chẩn đoán trong thời kỳ này hoàn toàn dựa trên triệu chứng lâm sàng. Từ năm 1985, với sự trợ giúp của các tổ chức quốc tế, Cục Thú y bắt đầu xác định đ−ợc type vi rút gây bệnh LMLM. Năm 1992, sau 32 năm vắng mặt, bệnh LMLM đã tái xuất hiện ở miền Bắc và miền Trung n−ớc ta (ổ dịch LMLM cuối cùng là năm 1960). Nguyên nhân là do việc vận chuyển bất hợp pháp động vật, sản phẩm của động vật bị bệnh từ n−ớc ngoài vào sau khi mở cửa biên giới buôn bán với Trung Quốc và Lào. Các kết quả ghi nhận cho đến năm 1999 cho thấy có 3 type vi rút gây bệnh LMLM ở Việt Nam là type O, A và Asia-1. Trong đợt dịch lớn năm 1999-2000, kết quả chẩn đoán các ổ dịch đều là vi rút type O có quan hệ cấu trúc gen rất gần với vi rút type O gây bệnh ở Hồng Kông năm 21 1997. Việc biến mất type A và Asia-1 trong giai đoạn này ch−a đ−ợc khẳng định một cách đầy đủ để xác định rằng hai chủng này không tồn tại ở Việt Nam trong giai đoạn đó. Năm 2004: Trong số 24 tỉnh có dịch LMLM có 9 tỉnh do vi rút LMLM type A (phát hiện lần đầu tiên tại Ninh Thuận và Bình Định vào tháng 9/2004), 12 tỉnh do vi rút LMLM type O và 3 tỉnh do cả hai vi rút LMLM type O và A. Năm 2005, type A lại xuất hiện ở Ninh Thuận và sau đó phát hiện đ−ợc một số tỉnh khác ở phía Nam nh− Bình Định, Bình Thuận, Long An…. Cùng năm này, vi rút Asia-1 xuất hiện lần đầu tiên ở Khánh Hòa và sau đó là Lao Cai. Tháng 5 năm 2006, vi rút Asia-1 đ−ợc phát hiện ở Hà Giang, Lao Cai, Khánh Hoà. Từ đầu năm 2006 tới nay, trong số 27 tỉnh có dịch LMLM thì có 26 tỉnh là do vi rút type O và vi rút type A (Tô Long Thành và cs, 2006) [30]. Hiện tại, ch−a có chứng cứ khoa học xác định mối liên quan giữa các vi rút type Asia-1 l−u hành ở hai miền nh−ng có thể dự đoán nguồn gốc ổ dịch là do đ−a từ n−ớc ngoài vào theo gia súc mắc bệnh hoặc sản phẩm của gia súc mắc bệnh. 2.3. Vi rút lở mồm long móng 2.3.1. Hình thái, cấu trúc Vi rút LMLM thuộc họ Pico._.rnaviridae giống Apthovirus (Nguyễn Tiến Dũng, 2000), [14]. Theo nghĩa đen Pico: nhỏ, rna có nghĩa là axit ribonucleic, viridae là họ vi rút). Họ này bao gồm một vài loài vi rút rất quan trọng trong y học, đó là các loài gây bệnh bại liệt trẻ em (Poliomyelitis), bệnh viêm gan truyền nhiễm (Hepatitis A) [53]. Vi rút gồm có một nhân ARN chuỗi đơn nằm trong vỏ protein gồm 60 đơn vị gọi là capsome tạo nên một khối 30 mặt đối xứng với. Chúng có kích th−ớc rất nhỏ, đ−ờng kính vi rút khoảng 23nm (Bachrach, 1968) [33]. Vi rút qua đ−ợc các màng lọc Seitz, Chamberland và Berkefeld. Chuỗi protein tách ra làm 12 loại protein nhỏ chúng đ−ợc gọi tên là L, VP4, VP3, VP2, VP1, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C và 3D [53]. 22 Cấu trúc hệ gen của vi rút LMLM đ−ợc xác định bởi phòng thí nghiệm tham chiếu Pirbright nh− sau: 3 protein L pro, 2A, và 3C làm trung gian trong hầu hết các sự kiện phân giải protein tạo ra các sản phẩm thành thục. Vỏ capxit của vi rút có hơn 60 đơn vị (capxôme). Mỗi đơn vị này có chứa 4 loại protein là VP1, VP2, VP3 và VP4 có trọng l−ợng phân tử lần l−ợt là 34, 30, 26 và 8 x 103 Kdal. Các protein VP1, VP2 và VP3 tạo nên bề mặt của khối 20 mặt đối xứng, còn VP4 là protein ở bên trong capxit, kết dính ARN vi rút với mặt trong của capxít. VP1 ở ngoài cùng tham gia vào việc cố định vi rút trên những tế bào, đóng vai trò quan trọng nhất trong việc gây bệnh đồng thời nó là kháng nguyên chính tạo nên kháng thể chống lại bệnh LMLM. Một hạt vi rút cũng có thể chứa 1 tới 2 chuỗi 5-polypeptit (VP0), đây chính là tiền thân của VP1 và VP4. Tính gây miễn dịch thực sự của vi rút LMLM là do một polypeptit mẫn cảm với trypsin, chịu trách nhiệm đó chính là VP1 (Burroughs và cs, 1971) [35]. Vùng cấu trúc Vùng không cấu trúc 23 Hạt vi rút hoàn chỉnh (virion) có hằng số lắng 140S, phần vỏ capxít không có ARN có hằng số lắng 75S, mảnh protein của capxít là 12S và kháng nguyên VIA (Virus Infection Associated) là 5S (Bachrach, 1968) [33]. Cấu trúc kháng nguyên và sự liên kết với recepter: Vi rút LMLM có cấu trúc kháng nguyên không đồng nhất, có nhiều type và subtype mà mỗi type có thể có các biến chủng của nó. Sự khác nhau về hệ gen là nguyên nhân gây ra các biến chủng đặc biệt thông qua sự đa dạng của phân tử VP1. Những nghiên cứu ban đầu về cấu trúc kháng nguyên của vi rút LMLM chỉ với mục đích để tìm hiểu hiệu quả của vắc xin và phát triển vắc xin mới. Những nghiên cứu này chỉ ra rằng các kháng thể trung hoà kháng lại kháng nguyên VP1 tinh chế có thể để bảo vệ động vật tránh khỏi vi rút công c−ờng độc. Mảnh VP1 bao gồm 1 mạch dễ biến đổi giữa thành phần βG và βH của VP1 (mạch G-H), là phần lồi ra trên bề mặt vi rút. Điều đó cũng có nghĩa là mạch G-H VP1 bao hàm phần lớn vị trí kháng nguyên quan trọng. A B 8 D C D C D 3 B B A B A A 2 D 4 A A C C B B B 5 C 12 D 1 D C B c B 11 D B C D C 6 10 C B D C D A A 9 7 A A B A=VP1, B=VP3, C=VP2, D=VP4 24 Mạch tripeptide Arg - Gly - Asp trong mạch G-H của VP1 chịu trách nhiệm của fibronectin kết nối, nh− 1 tế bào tiếp nhận. Jackson (1996) phát hiện ra rằng glycosaminoglycan và heparan sulfate (HS) có thể đáp ứng nh− Corecepter cho subtype của vi rút LMLM týp O. Điều đáng quan tâm là vi rút týp O có thể sử dụng những recepter tăng thêm mà không chia sẻ điều đó với vi rút typ A [53]. 2.3.2. Phân loại và biến chủng của vi rút Vi rút LMLM biến dị rất mạnh, ở châu Âu, tại một số ổ dịch vào thời kỳ cuối ng−ời ta thấy xuất hiện các type vi rút mới hoặc các biến chủng mới và chúng có nguồn gốc ngay trong ổ dịch chứ không phải đ−a từ ổ dịch khác vào. Các biến chủng nh− vậy xuất hiện có lẽ là do kết quả của việc dùng vắc xin nh−ng không gây đ−ợc miễn dịch đầy đủ cho con vật đã thúc đẩy quá trình đột biến ở các chủng thực địa (Tô LongThành, 2000) [29]. Vi rút LMLM có 2 đặc tính đặc biệt liên quan đến dịch tễ học, đó là tính có đa type và tính dễ biến đổi kháng nguyên, các type tuy gây ra những triệu chứng bệnh tích giống nhau, nh−ng lại không gây miễn dịch chéo (Phan Đình Đỗ, Trịnh Văn Thịnh, 1958) [22]. Điều đầu tiên ng−ời ta nhận thấy là nhiều con bị bệnh đã lành vẫn có thể lại bị mắc bệnh nhiều lần. Lý do của hiện t−ợng này đ−ợc Vallée và Carre khám phá và nghiên cứu (1921, 1922, 1924) đó không phải khác nhau về độc lực mà do khác nhau về cấu trúc kháng nguyên. Đầu tiên hai tác giả trên đã gặp 2 chủng mà họ đặt tên là chủng A (Allemand là từ của Pháp có nghĩa là Đức) và chủng O (để chỉ Oise Valley, là nơi phân lập đ−ợc virút). Với sự phân lập của nhiều chủng khác Vallée và Carré chia thành 2 nhóm vi rút nhóm O và nhóm A. Đến năm 1926, hai nhà khoa học Đức là Waldman và Trautwein lại tìm thêm 1 nhóm nữa đặt tên là nhóm C. Từ năm 1952, các nhà khoa học trên thế giới đã thống nhất chấp nhận các nhóm O, A, C (thay cho 1 thời kỳ gọi là các nhóm A, B, C). Vi rút 25 LMLM đã đ−ợc xếp cùng nhóm với vi rút bệnh cúm, bệnh bại liệt, bệnh viêm não ngựa châu Mỹ và bệnh viêm miệng mụn n−ớc. Cho đến năm 1965, ngoài 3 type đó, còn phát hiện đ−ợc 3 type virút LMLM khác ở miền Nam châu Phi và đ−ợc đặt tên là SAT-1, SAT-2 và SAT-3 (SAT, South Africa Territory). Tiếp theo, các phòng thí nghiệm virút LMLM của Anh thông báo đã phân lập đ−ợc type vi rút thứ 7 ở tại nhiều n−ớc của châu á và đặt tên là type Asia-1. Cho đến nay ng−ời ta ch−a phát hiện thêm type nào khác, nh−ng các chủng vi rút LMLM do có cấu tạo ARN nên liên tục biến đổi tạo ra các subtype mới (Tô Long Thành, 2000) [28]. Các type chính nói trên phổ biến trong vùng nhất định, theo tài liệu định loại năm 1962 (FAO) ở châu Âu chỉ có các type O, A, C. Type C có nhiều ở lợn, type O có nhiều ở trâu bò, type A t−ơng đối phổ biến ở các loài, các type SAT chỉ có ở châu Phi (Nam, Trung, Đông Phi, Xu Đăng và Ai Cập). Phổ biến nhất là SAT-1 mới đây cũng thấy SAT-1 ở Trung Cận Đông (Irắc, Israel, Xy ri,…). Type Asia-1 gặp ở cận đông ấn Độ, Pakistan, Thái Lan, Trung Quốc, Lào, Hồng Kông. Type O thấy phổ biến ở Đông á và Nam á (OIE SEA FMD RCU, 2000) [55]. Ngoài 7 type cơ bản trên, ng−ời ta thừa nhận có hơn 70 subtype của vi rút LMLM. Các type và subtype của vi rút LMLM rất khác nhau về dịch tễ học và đáp ứng miễn dịch. Những ổ dịch âm ỉ vẫn tiếp tục xảy ra có thể là do tiêm phòng không đều đặn. Theo tài liệu của FAO vi rút mới đây đ−ợc khám phá ở Anh đ−ợc gọi là kiểu huyết thanh O của dòng Liên á. Nó đ−ợc xác định đầu tiên ở Bắc ấn độ vào năm 1990, lan truyền về h−ớng tây vào ả Rập năm 1994 và rồi lan khắp cận Đông, lan sang châu Âu. Năm 1993 nó xuất hiện ở Nepal và về sau ở Băngladesh và Bhutan. Cuối năm 1999 và 2000 nó đã ảnh h−ởng đến phần lớn Đông Nam á. Khả năng lan truyền bệnh dịch qua những khoảng cách lớn đã 26 đ−ợc minh chứng khi mà tháng 9 năm 2001 nhóm Liên á đã đến tận Nam phi. Đó là lần đầu dòng vi rút này đ−ợc phát hiện ra trên lục địa châu Phi. ở Việt Nam tr−ớc đây xảy ra dịch ở cả 2 miền Nam và Bắc, việc xác định type của vi rút không đ−ợc thực hiện nên không thể xác định đ−ợc sự biến đổi về type hay subtype trong các ổ dịch (Phạm Gia Ninh và cộng sự 1993) [23]. Hiện nay ở Việt Nam, Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung −ơng và Trung tâm Thú y Vùng Thành phố Hồ Chí Minh có thể xác định đ−ợc type vi rút bằng phản ứng ELISA. Các ổ dịch xảy ra trong những năm gần đây đ−ợc xác định là do type O, phòng thí nghiệm đã xác định đ−ợc subtype O Manisa, O Philipin và O 3039. Điều này đ−ợc xác nhận bởi phòng thí nghiệm tham chiếu ở Pirbright. 2.3.3. Đặc tính nuôi cấy Ngay sau khi phát hiện vi rút LMLM đầu tiên, Loeffer và Frosch, 1897 đã nghiên cứu nuôi cấy vi rút này tìm hiểu đặc tính của nó và tạo ra những chủng vi rút có tính kháng nguyên cao. Nhiều tác giả đã nuôi cấy vi rút LMLM trên da của thai lợn, thai bò còn sống (giữ thai sống bằng ph−ơng pháp nhân tạo) hoặc tiêm vi rút LMLM vào xoang phúc mạc chuột nhắt con thì thấy kháng nguyên của vi rút không thay đổi, khả năng gây bệnh và cho miễn dịch đối với bò khi đã tiếp đời qua chuột nhắt con th−ờng dùng để chế vắc xin nh−ợc độc. Tổ chức thích hợp nhất với vi rút LMLM là th−ợng bì l−ỡi bò tr−ởng thành, l−ỡi phải lấy ngay sau khi mổ bò và giữ ngay trong lạnh 2 – 3oC và chỉ dùng trong phạm vi 8 ngày. Sau đó lột mảnh th−ợng bì l−ỡi có mụn n−ớc đem pha chế. Ph−ơng pháp này cho kết quả tốt là độc lực vi rút sau mấy chục lần tiếp đời vẫn cao đối với bò, chuột lang. Môi tr−ờng tế bào tốt nhất là lấy từ tuyến yên của bò, tuyến yên của lợn, thận bê, thận cừu non hoặc các dòng tế bào có độ mẫn cảm. 27 Theo Geoffrey. W. (1989) [43], phòng thí nghiệm Pirbright trong năm 1973 đã nuôi cấy 140 vi rút LMLM, gần 120 chủng này đã sinh tr−ởng phù hợp trong môi tr−ờng BHK-21 (Baby Hamster Kidney-21) hiện nay môi tr−ờng BHK - 21 đ−ợc áp dụng th−ờng xuyên nhất trong việc nuôi cấy phân lập vi rút LMLM. 2.3.4. Sức đề kháng Theo nhiều tác giả, sức đề kháng của vi rút đối với ngoại cảnh t−ơng đối mạnh (Phan Đình Đỗ và Trịnh Văn Thịnh, 1958) [22]; (Nguyễn Vĩnh Ph−ớc, 1980) [16]; (Merchant và Barner, 1981) [52]; (Swan, 1994) [60]. Dựa trên cấu trúc của virion LMLM (kích th−ớc nhỏ, không có vỏ bọc) sức đề kháng của vi rút rất cao, tạo điều kiện cho sự lan truyền âm ỉ, xa và gián tiếp, cần đòi hỏi việc tiêu độc nghiêm khắc. Các yếu tố vật lý tự nhiên th−ờng tỏ ra không có khả năng tiêu diệt đ−ợc vi rút LMLM (lạnh, làm khô, nhiệt, cách ly). Các yếu tố hoá học làm vô hoạt vi rút đ−ợc chọn là NaOH (80%, pH = 12) đ−ợc sử dụng ở các cơ sở công nghiệp, viện nghiên cứu, lò mổ. Các đồ dùng dễ vỡ đ−ợc khử độc bằng vôi và axít lactic 10%. Các yếu tố sinh học phá huỷ tự nhiên hoặc dùng vô hoạt bằng nhiệt (ph−ơng pháp nhiệt sinh học ở giữa đống phân ủ) hoặc dùng ph−ơng pháp axít hoá (làm chín thịt bằng axít lactic). Độ tin cậy vào các ph−ơng pháp trên cũng có mức hạn chế. Sự sống sót của vi rút LMLM trong điều kiện tự nhiên phụ thuộc vào các tia tử ngoại và độ ẩm. Nh− vậy khí t−ợng tạo điều kiện tồn tại của vi rút LMLM trong môi tr−ờng bên ngoài. ánh sáng tác động yếu: trên bề mặt đồng cỏ vi rút sống ít nhất 2 tháng về mùa đông hoặc 3 ngày về mùa hè, trên lông bò vi rút có hoạt lực sau 4 tuần lễ. Trong đất ẩm, vi rút có thể duy trì độc lực tới 42 ngày về mùa hè hoặc tới 146 – 163 ngày về mùa đông, và 39 – 75 ngày về mùa xuân. 28 Sức đề kháng của vi rút phụ thuộc rất lớn vào chất chứa, vi rút có sức đề kháng t−ơng đối mạnh khi nó dính vào những chất khô hay protein [23]. Các chất kiềm tiêu diệt vi rút nhanh chóng: NaOH 0,5 – 1%; NH4OH trong n−ớc tiểu có tác dụng tiêu độc trong vài giờ. Chất toan cũng có tác dụng song không đều. Sự toan hoá tự nhiên xảy ra trong thịt, sữa có thể tiêu diệt đ−ợc mầm bệnh nhanh chóng. Thịt để 48 giờ ở nhiệt độ th−ờng sẽ không còn mầm bệnh nữa. Vôi, n−ớc vôi 5%, formol 1%, axít phênic 3% phải sau 6 giờ mới tiêu diệt đ−ợc vi rút. Các chất anitol, quinosol, chloroform có tác dụng mạnh. Vi rút đề kháng với các chất tẩy trắng. Nếu vi rút lẫn với các chất hữu cơ khác thì tác dụng của thuốc sát trùng kém đi. Trong thực tế ng−ời ta th−ờng dùng NaOH 0,5% để sát trùng cho cơ thể gia súc và cho ng−ời, còn dung dịch 1% dùng để sát trùng dụng cụ, khi dùng nên cho thêm n−ớc vôi 5%. Vi rút có thể tồn tại đ−ợc trong vòng 5 – 10 tuần ở những nơi thời tiết mát, đặc biệt là ở những mô bào hoặc ở tổ chức ngoài cơ thể với điều kiện độ pH không thấp hơn 6,5. Những nơi khô ráo, lạnh và tập trung ở nồng độ muối cao không gây ảnh h−ởng cho vi rút và nó có thể sống lâu hơn ở những nơi đóng băng. Tại chuồng trâu bò vi rút có thể duy trì khoảng 14 ngày, ở trong phế thải của động vật đ−ợc 39 ngày, ở trên bề mặt của phân ở mùa hè đ−ợc 28 ngày và ở mùa đông đ−ợc 67 ngày, vi rút có thể sống lâu hơn trong thức ăn đ−ợc 15 tuần, ở lông trâu bò đ−ợc 4 tuần, ở trong n−ớc thải đ−ợc trên 130 ngày, vi rút nhạy cảm có thể bị tiêu diệt bởi axit xitric và axit axêtic. Do sự tồn tại dai dẳng của vi rút, các chất tẩy uế thông th−ờng không có hiệu quả. 2.3.5. Độc lực, tính gây bệnh Độc lực của vi rút có thể định nghĩa là khả năng gây bệnh lâm sàng của vi rút. Nói cách khác độc lực là mức độ gây bệnh của vi rút. Mọi chủng vi rút LMLM đều đ−ợc coi là c−ờng độc (Nguyễn Tiến Dũng, 2000) [14], vật chủ 29 nhiễm vi rút có thể biểu hiện d−ới nhiều mức độ khác nhau từ dạng rất nghiêm trọng đến dạng lâm sàng thể ẩn. Ngay trong một ổ dịch ta cũng có thể thấy nhiều dạng bệnh khác nhau. Tính kháng nguyên và độc lực của vi rút LMLM là hai phạm trù hoàn toàn độc lập nhau. Đối với một vi rút khác khi bị nh−ợc độc thì tính kháng nguyên có khả năng giảm đi, hoặc khả năng gây bệnh cho một loài độngvật này có thể gắn liền với một tính kháng nguyên riêng biệt. Vi rút LMLM không có các đặc điểm trên. Trong tự nhiên, vi rút LMLM gây bệnh chủ yếu trên trâu, bò, dê, cừu, lợn và các động vật hoang dã nh− bò rừng, trâu rừng, lợn rừng, lạc đà,... ở loài ăn thịt ít mắc hơn và th−ờng mắc ở thể nhẹ. Loài động vật một móng nh− ngựa, lừa, gia cầm, chim.... không mắc bệnh nh−ng cũng có thể gây bệnh thí nghiệm cho vịt. Trong phòng thí nghiệm chuột lang, chuột nhắt trắng dễ cảm nhiễm bệnh. Khía da bàn chân chuột rồi xát bệnh phẩm có chứa vi rút lên sau 12 – 24 giờ chỗ chà xát có nổi mụn nhỏ màu đỏ, thuỷ thũng, đau, sau 2 – 3 ngày có thể nhiễm trùng toàn thân và có nhiều mụn ở niêm mạc mồm, l−ỡi, lợi. Bê sơ sinh ch−a bú sữa mẹ có thể chết sau 36 – 48 giờ nếu tiêm vi rút LMLM. 2.3.6. Nguồn dịch và cách lây lan ở động vật mắc bệnh, dịch và vẩy mụn n−ớc chứa rất nhiều vi rút. Vi rút có nhiều nhất trong dịch mụn tiên phát, mụn mới mọc (khoảng 2 ngày) và có độc lực rất mạnh. Tr−ớc khi có triệu chứng, các chất bài tiết đã truyền đ−ợc bệnh nhất là khi cơn sốt cao nhất với vai trò chính là n−ớc bọt. Tr−ớc khi có triệu chứng, trong n−ớc bọt của bò có tới 102 – 103 ID50/ml cho chuột nhắt con còn khi triệu chứng xuất hiện thì tăng lên tới 104,5 – 106ID50/ml. Khả năng nhiễm và tồn tại trong n−ớc bọt lên tới 11 ngày. Hàm l−ợng vi rút cao nhất là 30 trong n−ớc mụn và thành mụn. ở lợn, vi rút khu trú rất nhiều ở vùng hầu họng chính vì vậy mà khả năng thải vi rút qua đ−ờng hô hấp ở lợn là rất lớn (lớn hơn từ 1000 đến 3000 lần so với bò). Từ những chất chứa trên mà vi rút có thể truyền trực tiếp từ con vật bị bệnh sang con khoẻ khi nhốt chung hoặc chăn thả chung trên đồng cỏ hay ở các nơi tập trung gia súc nh− chợ, triển lãm... Vi rút LMLM đ−ợc thải ra ngoài qua n−ớc bọt lẫn n−ớc mụn và các mảnh th−ợng bì của mụn bị vỡ ra trên niêm mạc l−ỡi và miệng. Các mụn khác ở chân, vú cũng nh− trong sữa, phân, n−ớc tiểu chứa ít vi rút hơn. Vi rút có thể tồn tại trong một thời gian dài đáng kể và bệnh có thể lây lan sang các vật môi giới trung gian truyền bệnh là các sản phẩm động vật nh− da, lông, sừng, móng, sữa và từ các sản phẩm này mà nguồn bệnh bị phát tán đi xa. T−ờng, máng ăn, chất độn chuồng, các dụng cụ chăn nuôi đều có thể là nguồn vi rút. Do vậy, một nguyên nhân chính dẫn tới tái phát dịch là do tiêu độc không kỹ các ổ dịch cũ nên vi rút tồn tại trong chuồng và gây bệnh cho gia súc mới nhập. Một yếu tố tự nhiên cũng có thể làm lây lan dịch bệnh đó là gió. Gió có thể mang mầm bệnh đi xa hàng trăm cây số. Tại Việt Nam, nguồn dịch đ−ợc xác định từ một số nguồn chủ yếu sau: - Nguồn dịch từ n−ớc ngoài xâm nhập (3,6%): do n−ớc ta có đ−ờng biên giới chung với Trung Quốc, Lào, Campuchia mà các n−ớc này th−ờng xuyên có dịch LMLM. Việc buôn bán, trao đổi động vật, sản phẩm động vật của nhân dân vùng biên theo con đ−ờng tiểu ngạch rất khó kiểm soát dẫn đến làm lây lan dịch bệnh. - Nguồn dịch do vận chuyển trái phép động vật và sản phẩm động vật từ vùng có dịch đến các vùng khác (75,7%). - Nguồn dịch thiên nhiên: trong những năm gần đây, những ổ dịch LMLM vẫn còn l−u cữu ở tỉnh Quảng Ninh, một số tỉnh Duyên Hải miền 31 Trung, Tây Nguyên và Nam Bộ, những ổ dịch này vẫn ch−a đ−ợc tiêu diệt hoàn toàn nên bệnh LMLM vẫn có thể xảy ra bất cứ lúc nào. Theo số liệu của Cục Thú y, nguồn dịch này chiếm 19,9%. 2.3.7. Triệu chứng 2.3.7.1. Dạng điển hình * Loài nhai lại: - Sốt cao 40 – 41oC trong thời gian ngắn ở thời kỳ ủ bệnh (3 – 6 ngày). - Miệng: Mụn n−ớc và các vết trợt có thể mọc ở môi, vòm khẩu cái, lợi, l−ỡi, hầu, họng trâu, bò chảy nhiều n−ớc rãi dính quánh. Con vật đau, nhai chóp chép và không ăn đ−ợc. - Chân: mụn n−ớc ở chân xuất hiện đặc biệt là ở vùng viền móng, kẽ móng. Khi mụn n−ớc vỡ con vật đi lại khập khiễng, hay nằm và th−ờng không muốn đặt chân xuống đất. Vết loét do mụn n−ớc vỡ ra có thể bị nhiễm trùng kế phát và dẫn đến loãng móng. - Mụn có thể xuất hiện ở vú con cái, các vùng da không có lông nh− âm hộ, bìu,... * Lợn: Thời gian nung bệnh 2 – 12 ngày. Triệu chứng lâm sàng gần giống nh− loài nhai lại. Con vật sốt cao, bỏ ăn, các mụn n−ớc th−ờng xuất hiện trên mõm, tổn th−ơng ở miệng ít hơn, không chảy n−ớc rãi, xuất hiện mụn ở viền móng, kẽ móng. Mụn n−ớc phát triển ở vành móng làm lợn loãng móng, có thể loãng một hoặc hai móng, con vật đi khập khiễng. Lợn nái nuôi con cũng có mụn n−ớc (Baillrrèe Tindal, 1985) [34]. Trên lợn, các triệu chứng lâm sàng của LMLM không thể phân biệt đ−ợc với các bệnh có mụn n−ớc khác nh− bệnh viêm miệng mụn n−ớc; bệnh ngoại ban có mụn n−ớc và bệnh mụn n−ớc ở lợn (Callis, Kercher, 1986) [47]. 2.3.7.2. Dạng không điển hình - Thể hiện ở đ−ờng tiêu hoá: chủ yếu xảy ra ở gia súc non, con vật bị tiêu chảy và chết. 32 - Thể hiện ở đ−ờng hô hấp: th−ờng xảy ra ở cừu nhất là cừu non Bắc Âu, Trung Cận Đông. Con vật sốt cao 41,5 – 42oC da đen sạm, miệng chẩy n−ớc rãi chết trong vòng 3 – 5 ngày. - Nhiễm trùng huyết: xảy ra ở gia súc non, vi rút có độc lực cao. - Xẩy thai (cần phân biệt với các bệnh khác cũng gây xẩy thai). 2.3.7.3. Dạng tiềm ẩn Không biểu hiện triệu chứng lâm sàng, phải lấy niêm mạc hầu để tìm vi rút, tr−ờng hợp thấy có kháng thể cao và giữ lâu không giảm thì khẳng định là vi rút tồn tại và phải xem là con vật mang trùng. Lợn ít mang trùng, ng−ợc lại dê, cừu là loài mang trùng và là nguồn làm lây lan bệnh cao. 2.3.8. Bệnh tích Bò niêm mạc môi, mặt trên của l−ỡi vòm khẩu cái ban đầu xuất hiện các mụn n−ớc do vi rút gây ra, sau đó mụn n−ớc vỡ để lại các vết loét. Tiếp đó là bò tiết nhiều các n−ớc bọt dính quánh, các mụn n−ớc cũng có dính ở bờ móng, kẽ móng, sau đó loét có kết hợp nhiễm trùng kế phát gây hoại tử móng, ở lợn các vị trí tổn th−ơng th−ờng xảy ra ở chân nhiều hơn là ở mồm. Các bệnh tích đặc tr−ng ở giai đoạn đầu th−ờng là vi thể và giới hạn ở các vùng biểu mô, ban đầu là thoái hoá các tế bào ở vùng giữa lớp gai có biểu mô. Tế bào biểu mô co tròn và bong tách. T−ơng bào trở lên ái toan, nhân của chúng phình to. dịch phù chứa những mảnh fibrin tích tụ ở gian bào và tách ra. Bạch cầu trung tính thâm nhiễm các biểu mô. Hoại tử −ớt và tích tụ huyết thanh, bạch cầu tạo nên các mụn n−ớc, lớp hạ bì bị xung huyết nặng các mụn n−ớc nhỏ hợp lại thành các lớp mỏng làm cho cả một vùng biểu mô lớn bị tách ra và vỡ, các bệnh tích ở vùng da và kẽ móng cũng t−ơng tự. Biểu mô th−ờng bong tróc trên bề mặt của hai phần ba phía tr−ớc l−ỡi bò để lại bề mặt l−ỡi đỏ rỉ máu. Hiện t−ợng này giải thích cho triệu chứng chán ăn. Các th−ơng tổn ở miệng và l−ỡi đ−ợc hàn gắn nhanh chóng và 33 th−ờng liền sẹo trong vòng một tuần. Bệnh tích của vùng móng th−ờng bị nhiễm trùng kế phát gây nên hoại tử và chảy mủ. Móng bong ra tạo nên sự dị hình ở móng và què. ảnh 2: Bệnh tích do Vi rút LMLM gây ra ở môi và chân lợn. Bệnh tích ở tim th−ờng thấy ở gia súc non bị chết. Bệnh tích th−ờng là những điểm màu ghi nhỏ hoặc kích th−ớc đa dạng, làm cho cơ tim có các vết sọc (tim vằn hổ). Về vi thể, sự thoái hoá kính và hoại tử của sợi cơ tim kết hợp thâm nhiễm lympho và bạch cầu trung tính. Bệnh tích cơ tim không phải thực sự là điển hình của bệnh LMLM nh−ng nó đ−ợc tin là một nguyên nhân gây chết gia súc mới sinh. Các bệnh tích cơ tim t−ơng tự nh−ng trầm trọng hơn th−ờng sẩy ra ở chuột con đang bú đ−ợc gây nhiễm thực nghiệm với vi rút LMLM (Andersen, 1980 ) [32]. 2.3.9. Chẩn đoán Việc xác định chính xác bệnh LMLM là quan trọng bậc nhất ở tất cả các n−ớc, ngay cả những n−ớc có dịch địa ph−ơng hoặc những n−ớc, những vùng thực tế không có bệnh. Phát hiện sớm bệnh LMLM có tầm quan trọng trong việc đ−a ra các biện pháp khống chế và tiêu diệt bệnh, giảm các thiệt hại do bệnh gây nên. Việc xác định type, subtype vi rút LMLM gây bệnh ở các vùng, địa ph−ơng có ý nghĩa quyết định trong ch−ơng trình phòng chống bệnh bằng vắc xin. 34 Theo các tác giả Callis và Mc Kercher,1986 [47]; Kitching, 1989 [49]; Brooksby, 1982 [46]; Dimitradis. I,1991 [37]; Have và Jensen 1983 [44]; và nhiều tác giả khác thì chẩn đoán xác định bệnh LMLM bằng các ph−ơng pháp sau: 2.3.9.1. Chẩn đoán dựa trên triệu chứng lâm sàng và bệnh tích Việc chẩn đoán lâm sàng bệnh LMLM có thể thực hiện trong tr−ờng hợp bệnh xẩy ra tại khu vực đã đ−ợc xác định là có dịch LMLM (Nguyễn Tiến Dũng, 2000) [14]. Căn cứ các đặc điểm dịch tễ: Bệnh đại l−u hành, tốc độ lây lan nhanh, tỷ lệ mắc cao, tỷ lệ chết thấp, động vật guốc chẵn đều mắc bệnh. Các triệu chứng: Sốt cao, chảy n−ớc bọt nhiều, con vật có biểu hiện què, có các mụn n−ớc ở niêm mạc miệng, lợi, chân răng, l−ỡi, kẽ móng, gờ móng, ở vú. Những con mới khỏi bệnh thì trên niêm mạc miệng, lợi, chân răng, l−ỡi, kẽ móng... có các vết sẹo. Đối với lợn da trắng, có thể xuất hiện các vệt đen trên móng chân màu trắng, lợn con theo mẹ bị chết nhiều. Thông th−ờng lợn mắc bệnh dễ bị tụt móng chân hơn bò. Tuy nhiên việc chẩn đoán lâm sàng cần phải chẩn đoán phân biệt với các bệnh khác nh−: viêm miệng mụn n−ớc (VS), bệnh mụn n−ớc lợn (SVD), bệnh ngoại ban có mụn n−ớc (VES), bệnh do vi rút s− tử biển san Migual gây lên (SMSV) (Kitching và Donalson, 1987) [48]. Chẩn đoán phân biệt chính xác phải dựa trên chẩn đoán phòng thí nghiệm. 2.3.9.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm + Lấy mẫu bệnh phẩm: Bệnh phẩm thích hợp nhất để phân lập vi rút LMLM là biểu mô và dịch tiết ở các mụn n−ớc ch−a hoặc mới vỡ. L−ợng mẫu tối thiểu phải từ 3 đến 5 g tổ chức t−ơi. Để phát hiện kháng thể, th−ờng dùng bệnh phẩm là máu của những con nghi mắc bệnh. 35 Bệnh phẩm đ−ợc lấy sạch, ch−a bị hoại tử, đ−ợc bảo quản trong dung dịch PBS 0,04M với một l−ợng t−ơng đ−ơng glycerin (pH: 7,2 – 7,6), bảo quản và vận chuyển trong điều kiện nhiệt độ lạnh. Bệnh phẩm là máu phải đ−ợc lấy vô trùng với một l−ợng tối thiểu 3 – 5 ml. Để máu đông, ly tâm chắt lấy huyết thanh và bảo quản ở nhiệt độ mát (4oC) và đ−a đến phòng thí nghiệm. a. Tiêm truyền vi rút Huyễn dịch bệnh phẩm nghi có chứa vi rút LMLM cần phải li tâm tr−ớc khi cấy vào môi tr−ờng tế bào nuôi hoặc tiêm cho động vật thí nghiệm. Các tế bào nhạy cảm với vi rút LMLM bao gồm: Tế bào tuyến giáp trạng bò sơ cấp, tế bào thận cừu, thận lợn sơ cấp; các tế bào dòng nh− tế bào thận chuột Hamster non (BHK-21). Dùng bệnh phẩm trên tiêm vào nội bì l−ỡi bò, bò không nằm trong phạm vi ổ dịch ch−a đ−ợc tiêm phòng vắc xin LMLM, sau khi tiêm 24-48 giờ, xuất hiện các mụn n−ớc ở các chỗ tiêm, dần dần mụn vỡ thành vết loét. Có thể dùng chuột lang để tiêm truyền gây bệnh bằng cách khía da bàn chân rồi xát bệnh phẩm lên, sau 12-24 giờ các chỗ khía da nổi mụn nhỏ, màu đỏ, có thuỷ thũng, sau đó có thể nhiễm trùng toàn thân và chết (Nguyễn Nh− Thanh, 1997) [12]. b. Phát hiện kháng nguyên * Phản ứng kết hợp bổ thể (CFT- Complement Fixation Test) Phản ứng kết hợp bổ thể là phản ứng th−ờng đ−ợc dùng để phát hiện bệnh LMLM, vì đơn giản, cho kết quả nhanh, chính xác và ít tốn kém. Trong ph−ơng pháp này ng−ời ta sử dụng kháng huyết thanh chuẩn đã biết để phát hiện type vi rút. Nguyên lý: dùng các type huyết thanh đã biết để phát hiện type vi rút gây bệnh (Nguyễn Nh− Thanh, 2001) [13]. Phản ứng kết hợp bổ thể đ−ợc thực hiện nhờ hai hệ thống: hệ thống dung huyết và hệ thống dung trùng với sự tham gia của bổ thể. 36 - Huyết thanh miễn dịch của từng type vi rút đ−ợc chế trên chuột lang bằng ph−ơng pháp gây tối miễn dịch: tiêm vắc xin LMLM của các type khác nhau vào trong da d−ới gan bàn chân từng nhóm chuột lang hai lần, mỗi lần cách nhau một tháng, sau đó lấy máu chắt huyết thanh có chứa kháng thể. - Kháng nguyên là máu gia súc nghi mắc bệnh LMLM hoặc dùng bệnh phẩm cấy vào môi tr−ờng tế bào tổ chức lấy từ tuyến yên của bò hoặc của lợn, tế bào thận bê non hoặc dòng tế bào có độ nhạy t−ơng đ−ơng, khi tế bào nuôi xuất hiện các biến đổi tế bào thì lấy dịch làm phản ứng kết hợp bổ thể. Theo Tô Long Thành [28] tóm tắt nguyên lý phản ứng: kháng huyết thanh của một trong 7 type vi rút LMLM đ−ợc pha loãng trong dung dịch đệm veronal theo bậc 1,5; bắt đầu từ độ pha loãng 1/16, thể tích dùng trong phản ứng là 25 àl. Thêm vào 50 àl có chứa 3 đơn vị bổ thể, sau đó thêm 25 àl huyễn dịch bệnh phẩm cần chẩn đoán. Cuối cùng thêm 25 àl dung dịch hồng cầu đã pha loãng. Hiệu giá của phản ứng kết hợp bổ thể là nghịch đảo độ pha loãng của huyết thanh tạo nên dung huyết 50%. Hiệu giá của phản ứng kết hợp bổ thể >36 đ−ợc coi là phản ứng d−ơng tính. Phản ứng kết hợp bổ thể cũng đã đ−ợc hoàn thiện rất kỹ, khi sử dụng thành thục nó sẽ là một ph−ơng tiện hữu hiệu để chẩn đoán phân biệt giữa vi rút LMLM và các vi rút gây viêm miệng mụn n−ớc khác. Tuy vậy một số tác giả cho rằng, dùng phản ứng kết hợp bổ thể để phân biệt các type với nhau kém hiệu quả. *Phản ứng ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) - Phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên: trong chẩn đoán bệnh LMLM hiện nay, ph−ơng pháp ELISA là một ph−ơng pháp có độ chính xác cao và rất nhạy (Crowther, Abu Elzein, 1979 [36]; Have và cs, 1983 [44]; Hamblin và cs, 1987 [45]. Phản ứng ELISA th−ờng đ−ợc dùng hơn so với phản ứng KHBT vì nó đặc hiệu và nhạy hơn, cũng nh− nó không bị ảnh h−ởng 37 của các yếu tố tăng c−ờng hoặc ức chế bộ thể (Tô Long Thành, 2000) [28]. So với ph−ơng pháp kết hợp bổ thể, ELISA có −u điểm rõ rệt về mặt thời gian. Nguyên lý: dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzym, rồi cho kết hợp trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng nguyên, sau đó cho cơ chất vào, cơ chất bị enzym phân huỷ tạo màu. Và khi so màu trong quang phổ kế sẽ định l−ợng đ−ợc mức độ phản ứng. B−ớc 1: cố định kháng thể đặc hiệu lên phiến chất dẻo, rửa n−ớc để loại bỏ kháng thể không gắn. B−ớc 2: cho huyễn dịch bệnh phẩm đã chiết xuất hoà tan (kháng nguyên) lên. Nếu có kháng nguyên t−ơng ứng, chúng sẽ gắn với kháng thể đặc hiệu. Rửa n−ớc để loại bỏ kháng thể thừa. B−ớc 3: cho kháng thể đã gắn enzym vào. Nếu trong b−ớc 2 đã có kết hợp giữa kháng nguyên với kháng thể đặc hiệu, thì trong b−ớc 3 sẽ xẩy ra kết hợp lần thứ hai của kháng nguyên với kháng thể đánh dấu enzym. Rửa n−ớc loại bỏ kháng thể đánh dấu thừa. B−ớc 4: tiếp tục cho cơ chất t−ơng ứng với enzym vào. Đánh giá kết quả: - Nếu có màu tức là có kháng nguyên t−ơng ứng, kết luận phản ứng d−ơng tính. - Nếu không có màu tức là kháng nguyên không t−ơng ứng, cho nên kháng nguyên bị rửa trôi từ b−ớc 2, do đó không có kết hợp kháng thể - kháng nguyên - kháng kháng thể, kết luận âm tính. Trong tr−ờng hợp giám định type vi rút: phản ứng sử dụng kháng thể thỏ kháng vi rút LMLM hấp phụ lên đĩa nhựa 96 lỗ để bẫy kháng nguyên vi rút trong mẫu bệnh phẩm. Sau đó 1 kháng thể thứ hai (kháng thể chuột lang kháng vi rút LMLM) đ−ợc dùng để định type kháng nguyên vi rút đã bẫy đ−ợc. Ph−ơng pháp này đang đ−ợc áp dụng th−ờng quy tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới. 38 Hiện nay phản ứng ELISA là một phản ứng chẩn đoán nhanh dùng cho bệnh LMLM cũng nh− trong giám định type của vi rút. Phản ứng này có những thuận lợi hơn hẳn các phản ứng thông th−ờng khác. Đây là một phản ứng có tính đặc hiệu cao và khi dùng với một kháng thể đơn dòng, có thể đây là một kỹ thuật nhạy nhất với mục đích chẩn đoán và định type (Tô Long Thành, 2000) [28]. Theo quy định của phòng thí nghiệm chuẩn về LMLM của OIE, ph−ơng pháp thích hợp nhất để phát hiện kháng nguyên của vi rút LMLM và định type vi rút LMLM là phản ứng ELISA. *Chẩn đoán bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Để chẩn đoán khẳng định bệnh LMLM trong phòng thí nghiệm, ngoài các ph−ơng pháp kinh điển nh− phản ứng kết hợp bộ thể, phản ứng ELISA ng−ời ta còn sử dụng ph−ơng pháp PCR (Reid và cs,1999 [60]; Oleksiewicz và cs, 2001 [57]; đây là ph−ơng pháp mới đang đ−ợc nghiên cứu ứng dụng trong chẩn đoán LMLM. Kỹ thuật PCR đ−ợc sử dụng khi sử dụng ph−ơng pháp ELISA và phân lập vi rút trên môi tr−ờng tế bào không thể phát hiện đ−ợc vi rút. Kỹ thuật PCR đ−ợc Kary Mullis và cộng sự phát minh ra vào năm 1985 (Reid và cs, 1999) [60]. Kỹ thuật PCR là một ph−ơng pháp tạo dòng Invitro cho phép khuếch đại một vùng AND (deoxyribonucleic) đặc hiệu từ một hệ gen phức tạp và khổng lồ mà không cần đến việc tách và nhân dòng (cloning). Với những vi rút thuộc loại ARN vi rút thì phải tiến hành thêm phản ứng sao chép ng−ợc nhờ men sao chép ng−ợc RT (Reverse Transcriptase) để chuyển ARN thành AND. Sau đó tiến hành ph−ơng pháp PCR nh− các quy trình thông th−ờng (Kitching, 1989) [50]. Do tính chất đa dạng của vi rút LMLM, những ph−ơng pháp chẩn đoán nh−: Ph−ơng pháp cố định bổ thể, ph−ơng pháp trung hoà vi rút và ph−ơng pháp ELISA chỉ có ý nghĩa xác định type huyết thanh của vi rút chứ không phân biệt đ−ợc các subtype với nhau, cũng nh− phát hiện kháng thể kháng các protein cấu trúc của vi rút chứ không phân biệt đ−ợc kháng thể đó là do con 39 vật tiêm phòng hay do bị nhiễm bệnh tự nhiên mà có. Chính vì vậy, ng−ời ta sử dụng ph−ơng pháp chẩn đoán RT- PCR để tách dòng và giải trình trình tự Nucleotid để chẩn đoán, phân lập, định ty._. biệt quan tâm. Do có tính kháng nguyên rất cao nên kháng nguyên 3-ABC sẽ kích thích gia súc tạo ra kháng thể với số l−ợng lớn và tồn tại nhiều tháng trong huyết thanh trâu bò đã bị nhiễm bệnh. Vì vậy việc phát hiện kháng thể đặc hiệu 3- ABC cho phép kết luận gia súc đang bị nhiễm vi rút LMLM. Hiện nay, n−ớc ta nhập vắc xin LMLM từ hãng Pfizer, Merial và Intervet. Đây là những vắc xin vô hoạt và đã đ−ợc loại bỏ những kháng nguyên không cấu trúc, do đó sau khi tiêm gia súc chỉ sản sinh kháng thể không đặc hiệu chống vi rút LMLM chứ không có kháng thể kháng lại kháng nguyên không cấu trúc 3-ABC. Bởi vậy, ph−ơng pháp này sẽ phát hiện đ−ợc lợn bị nhiễm vi rút LMLM, kể cả những con đã đ−ợc tiêm phòng. Bộ kit này chỉ cho phép chúng ta phát hiện đ−ợc những lợn mắc bệnh LMLM do nhiễm tự nhiên trong một thời gian ngắn nh−ng không xác định đ−ợc đó là type nào. Ngoài ra bộ kit này có khả năng phát hiện kháng thể 3- ABC ở lợn bị nhiễm vi rút LMLM sau 10 - 16 ngày và kéo dài 6 - 8 tháng. Vì vậy, khi kết quả (+) tính (OD ≥ 30%), có thể kết luận lợn bị nhiễm vi rút LMLM. Lấy ngẫu nhiên 20 mẫu huyết thanh lợn nái, 20 mẫu huyết thanh lợn con và 30 mẫu huyết thanh lợn choai. Chúng tôi thực hiện phản ứng ELISA với bộ kít 3- ABC. 69 Kết quả đ−ợc thể hiện ở bảng 4.5. Bảng 4.5 Kết quả chẩn đoán phát hiện kháng thể bằng ph−ơng pháp ELISA – 3ABC Kết quả kiểm tra bằng ELISA – 3ABC Số l−ợng D−ơng tính Âm tính Lợn nái 20 0 20 Lợn con 20 0 20 Lợn choai 30 0 30 Kết quả cho thấy toàn bộ số mẫu đem thử đều âm tính. Điều này chỉ ra rằng đàn lợn tr−ớc đó không bị nhiễm vi rút LMLM, kháng thể đàn lợn có là do tiêm phòng vắc xin hoặc là do mẹ truyền cho con qua sữa đầu. Sau đó chúng tôi tiến hành các phản ứng ELISA khảo sát hiệu giá kháng thể của đàn lợn đ−ợc tiêm phòng. 4.4. Khảo sát đáp ứng miễn dịch của nái mẹ sau khi tiêm vắc xin Đàn nái đ−ợc tiêm vắc xin toàn bộ đàn hàng năm vào các tháng 2 và tháng 8. Để khảo sát diễn biến kháng thể của đàn lợn giống chúng tôi lấy mẫu ở thời điểm tr−ớc khi tiêm đợt tháng 2 năm 2006, sau khi tiêm 21 ngày, 60 ngày, 90 ngày và 120 ngày và chắt huyết thanh để kiểm tra kháng thể. Việc làm này một mặt kiểm tra hiệu quả của vắc xin, mặt khác để theo dõi xem với lịch vắc xin đang áp dụng, đàn lợn có đ−ợc đảm bảo an toàn về khả năng phòng hộ bệnh LMLM hay không. Kết quả xét nghiệm thể hiện ở bảng 4.6. Kết quả cho thấy ở thời điểm tr−ớc khi tiêm chỉ có 13/15 mẫu phát hiện có kháng thể. Sau khi tiêm 60 ngày toàn bộ số mẫu phát hiện có kháng thể, nh−ng chỉ sau 90 ngày số mẫu phát hiện thấy kháng thể đã giảm chỉ còn 15/21 mẫu và sau 120 ngày chỉ còn 14/21 mẫu phát hiện thấy kháng thể. 70 Bảng 4.6. Kết quả xét nghiệm phát hiện kháng thể FMD ở đàn lợn nái tại xí nghiệp Kết quả Thời điểm lấy mẫu Số l−ợng D−ơng tính Âm tính Truớc khi tiêm 15 13 2 Sau khi tiêm 21 ngày 21 21 0 Sau khi tiêm 60 ngày 21 21 0 Sau khi tiêm 90 ngày 21 15 6 Sau khi tiêm 120 ngày 21 14 7 Tổng cộng 97 82 15 Chúng tôi tiến hành kiểm tra hàm l−ợng kháng thể ở các mẫu d−ong tính để kiểm tra mức độ bảo hộ của vắc xin. Hiệu giá kháng thể ở mức 1/128 đ−ợc coi là bảo hộ. Kết quả đ−ợc thể hiện ở bảng 4.7. Bảng 4.7. Kết quả theo dõi đáp ứng miễn dịch của đàn lợn nái tại xí nghiệp (có kháng thể tr−ớc khi tiêm) Tr−ớc khi tiêm Sau tiêm 21 ngày Sau tiêm 60 ngày Sau tiêm 90 ngày Sau tiêm 120 ngày Số mẫu kiểm tra (mẫu) 15 21 21 21 21 Số mẫu 13 21 21 18 17 Có kháng thể Tỷ lệ % 86,7 100 100 85,7 81 Số mẫu 11 2 4 Hiệu giá 1/64 Tỷ lệ % 73,3 9,5 19 Số mẫu 2 7 12 11 Hiệu giá 1/128 Tỷ lệ % 13,3 33,3 57,2 52,4 Số mẫu 21 14 4 2 Hiệu giá 1/256 Tỷ lệ % 100 66,7 19 9,5 Tỷ lệ bảo hộ (%) 13,3 100 100 76,2 61,9 71 Qua kết quả ở bảng 4.7, chúng tôi nhận thấy: tr−ớc khi tiêm vắc xin; 160 ngày sau đợt tiêm tr−ớc, tỷ lệ số mẫu phát hiện thấy kháng thể là 86,7% nh−ng chỉ có 13,3% số mẫu có kháng thể đạt mức bảo hộ. Tại thời điểm 21 ngày sau khi tiêm tỷ lệ bảo hộ đạt 100%, trong đó có 100% số mẫu đạt trên ng−ỡng bảo hộ (từ 1/128 trở lên). Sau khi tiêm 60 ngày chúng tôi tiến hành lấy mẫu lần 2, kết quả kiểm tra cho thấy: tỷ lệ bảo hộ vẫn đạt 100%, nh−ng hiệu giá kháng thể ở các mức khác nhau, trong đó có 33,3% số mẫu ở mức bảo hộ và 66,7% số mẫu đạt trên ng−ỡng bảo hộ. Tới ngày thứ 90 sau khi tiêm tỷ lệ bảo hộ đã giảm t−ơng đối nhanh, 85,7 % số mẫu phát hiện thấy kháng thể nh−ng chỉ có 76,2% số mẫu đạt ng−ỡng bảo hộ và số mẫu trên ng−ỡng bảo hộ là 19%. Tại thời điểm kiểm tra lần cuối cùng, 120 ngày sau khi tiêm, tỷ lệ mẫu có kháng thể còn 81%, tỷ lệ bảo hộ giảm xuống còn 61,9%, trong đó số mẫu đạt trên mức bảo hộ là 9,52%. Kết quả bảng 4.7 đ−ợc biểu diễn ở hình 4.3 0 20 40 60 80 100 120 Tr−ớc khi tiêm Sau tiêm 21 ngày Sau tiêm 60 ngày Sau tiêm 90 ngày Sau tiêm 120 ngày Thời gian % bảo hộ Hình 4.3: Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ bảo hộ của đàn lợn nái sau khi tiêm vắc xin LMLM 72 Từ kết quả ở bảng 4.6 và 4.7, chúng tôi có thể rút ra các nhận xét: Tr−ớc khi tiêm phòng khả năng bảo hộ của đàn lợn nái đã giảm xuống rất thấp chỉ còn 13,3%. Sau khi tiêm 60 ngày, hàm l−ợng kháng thể kháng vi rút LMLM type O tồn tại trên mức bảo hộ ở 100% số mẫu. Sau 90 ngày còn 85,7% số mẫu đ−ợc tiêm phòng phát hiện có kháng thể và khả năng bảo hộ là 76,2%. Khả năng bảo hộ đ−ợc duy trì tới 120 ngày sau khi tiêm ở 61,9% số mẫu. Những kết quả nghiên cứu này chứng tỏ khả năng phòng bệnh của bản thân vắc xin ch−a thật đáng tin cậy, ở thời điểm 120 ngày sau tiêm phòng khả năng bảo hộ đã giảm thấp. Tất cả các nghiên cứu và kinh nghiệm thu đ−ợc trong thực tế đã chứng minh rằng thử hiệu lực với khả năng bảo hộ do tiêm phòng trong thực tiễn là ít hiệu quả. Ngay cả với gia súc đ−ợc tiêm nhiều lần thì phần lớn khoảng thời gian giữa các lần tiêm, gia súc không đ−ợc miễn dịch; thêm vào đó, vắc xin cho lợn có hiệu lực rất thấp nếu đánh giá qua hiệu giá kháng thể bằng ph−ơng pháp ELISA [10]. 4.5. miễn dịch thụ động ở lợn con sinh ra từ đàn nái mẹ đ∙ tiêm phòng Có một số tác giả cho rằng kháng thể của lợn con có thể nhận đ−ợc từ mẹ qua sữa đầu và sự bảo hộ này có thể kéo dài tới lần tiêm vắc xin LMLM đầu tiên hay không, do vậy chúng tôi tiến hành kiểm tra hàm l−ợng kháng thể trên đàn lợn con theo mẹ bằng ph−ơng pháp ELIZA phát hiện kháng thể (ph−ơng pháp định tính). 73 Bảng 4.8: Kết quả xét nghiệm phát hiện kháng thể FMD ở đàn lợn con theo mẹ và cai sữa tại xí nghiệp Kết quả Thời điểm lấy mẫu Số l−ợng D−ơng tính Âm tính Lợn con 1 ngày tuổi 20 17 3 Lợn con 14 ngày tuổi 20 15 5 Lợn con 21 ngày tuổi 20 11 9 Lợn con 60 ngày tuổi 20 0 20 Tổng cộng 80 43 37 Nếu đàn nái mẹ đ−ợc tiêm phòng đều đặn, mức độ bảo hộ ở đàn lợn con là t−ơng đối tốt, 17/20 mẫu phát hiện kháng thể. Nh−ng l−ợng kháng thể này giảm nhanh, khi lợn con 21 ngày tuổi chỉ còn 11/20 mẫu d−ơng tính và tới 60 ngày tuổi hàm l−ợng kháng thể giảm hết hẳn. Để kiểm tra độ bảo hộ của những lợn con có kháng thể này chúng tôi thực hiện phản ứng ELISA định l−ợng kháng thể. Kết quả đ−ợc thể hiện ở bảng 4.9. Kết quả ở bảng 4.9 cho thấy, tại thời điểm 1 ngày tuổi 85% số mẫu có kháng thể và tỷ lệ bảo hộ t−ơng đối đồng đều, toàn bộ 85% số mẫu bảo hộ đều đạt trên ng−ỡng bảo hộ, hiệu giá kháng thể 1/256. Điều này cũng chỉ ra rằng việc tiêm phòng ở đàn nái là tốt và đáp ứng miễn dịch ở đàn nái mẹ đồng đều nhau. Tại thời điểm 14 ngày tuổi tỷ lệ bảo hộ đã giảm chỉ còn 75% số mẫu đạt bảo hộ, trong đó 50% số mẫu còn hiệu giá kháng thể đạt trên mức bảo hộ. ở 21 ngày tuổi chỉ còn 50% số mẫu có khả năng bảo hộ và tới 60 ngày tuổi thì không còn mẫu nào phát hiện đ−ợc kháng thể nữa. 74 Bảng 4.9 : Kết quả theo dõi diễn biến kháng thể thụ động của đàn lợn con theo mẹ và cai sữa 1 ngày tuổi 14 ngày tuổi 21 ngày tuổi Số mẫu kiểm tra (mẫu) 20 20 20 Số mẫu 17 15 11 Có kháng thể Tỷ lệ % 85 75 55 Số mẫu 1 Hiệu giá 1/64 Tỷ lệ % 5 Số mẫu 5 8 Hiệu giá 1/128 Tỷ lệ % 25 40 Số mẫu 17 10 2 Hiệu giá 1/256 Tỷ lệ % 85 50 10 Tỷ lệ bảo hộ (%) 85 75 50 Kết quả ở bảng 4.9 đ−ợc biểu diễn trên hình 4.4. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1 ngày tuổi 21 ngày tuổi 60 ngày tuổi Ngày tuổi % b ảo h ộ % bảo hộ Hình 4.4: Biểu đồ biểu diễn diễn biến kháng thể thụ động của đàn lợn con sinh ra từ đàn nái đã tiêm phòng vắc xin 75 4.6. Đáp ứng miễn dịch ở đàn lợn choai sau khi tiêm phòng 1 lần Chúng tôi tiến hành tiêm phòng lần 1 cho đàn lợn choai ở 60 ngày tuổi. Sau khi tiêm 21 ngày, 60 ngày và 120 ngày chúng tôi lấy máu kiểm tra hiệu giá kháng thể. Kết quả thể hiện ở bảng 4.10. Bảng 4.10: Kết quả xét nghiệm phát hiện kháng thể FMD ở đàn lợn choai tại xí nghiệp Kết quả Thời điểm lấy mẫu Số l−ợng D−ơng tính Âm tính Truớc khi tiêm 20 0 20 Sau khi tiêm 21 ngày 30 30 0 Sau khi tiêm 60 ngày 30 28 2 Sau khi tiêm 120 ngày 30 25 5 Tổng cộng 110 83 27 Sau khi tiêm 21 ngày toàn bộ số mẫu đều phát hiện thấy kháng thể nh−ng ở các hiệu giá khác nhau. Số mẫu đủ khả năng bảo hộ là 73,3%, và 26,7 % số mẫu tuy phát hiện thấy kháng thể nh−ng hàm l−ợng rất thấp. Tới ngày thứ 60 còn 66,7% số mẫu đủ khả năng bảo hộ, số mẫu có phát hiện kháng thể nh−ng không đủ khả năng bảo hộ là 26,6%. Tại thời điểm lấy mẫu cuối cùng vào ngày thứ 120 có 83,3% số mẫu phát hiện thấy kháng thể, trong số đó 60% số mẫu đủ khả năng bảo hộ. Theo kết quả theo dõi ở 2 bảng 4.10 và 4.11 ta thấy đáp ứng miễn dịch của đàn lợn choai không đ−ợc cao và giảm nhanh, chúng tôi cho rằng hàm l−ợng kháng thể thấp có thể do vắc xin chỉ đ−ợc tiêm một lần. Để xác định giả thuyết này chúng tôi tiến hành tiêm nhắc lại ở đàn lợn choai sau một tháng và 76 tiến hành lấy máu kiểm tra. Bảng 4.11: Kết quả theo dõi đáp ứng miễn dịch của đàn lợn choai tại xí nghiệp Sau tiêm 21 ngày Sau tiêm 60 ngày Sau tiêm 120 ngày Số mẫu kiểm tra (mẫu) 30 30 30 Số mẫu 30 28 25 Có kháng thể Tỷ lệ % 100 93,3 83,3 Số mẫu 8 8 7 Hiệu giá 1/64 Tỷ lệ % 26,7 26,6 23,3 Số mẫu 19 20 18 Hiệu giá 1/128 Tỷ lệ % 63,3 66,7 60 Số mẫu 3 Hiệu giá 1/256 Tỷ lệ % 10 Tỷ lệ bảo hộ (%) 73,3 66,7 60 Kết quả của các bảng đ−ợc biểu diễn trên hình 4.5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Tr−ớc khi tiêm Sau tiêm 21 ngày Sau tiêm 60 ngày Sau tiêm 120 ngày Thời gian % b ảo h ộ Hình 4. 5: Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ bảo hộ của đàn lợn choai sau khi tiêm phòng vắc xin 1 lần 77 4.7. Đáp ứng miễn dịch ở đàn lợn choai sau khi tiêm liều tăng c−ờng Sau khi tiêm phòng lần đầu cho đàn lợn choai ở 60 ngày tuổi, chúng tôi tiến hành tiêm phòng liều tăng c−ờng sau mũi đầu tiên 1 tháng. Sau đó 21 ngày, 60 ngày và 120 ngày chúng tôi lấy máu kiểm tra hiệu giá kháng thể. Kết quả thể hiện ở bảng 4.12. Bảng 4. 12: Kết quả xét nghiệm phát hiện kháng thể FMD ở đàn lợn choai tại xí nghiệp Kết quả Thời điểm lấy mẫu Số l−ợng D−ơng tính Âm tính Truớc khi tiêm 20 0 20 Sau khi tiêm 21 ngày 30 30 0 Sau khi tiêm 60 ngày 30 29 1 Sau khi tiêm 120 ngày 30 29 1 Tổng cộng 110 88 22 Sau khi tiêm 21 ngày, phát hiện thấy kháng thể ở toàn bộ số mẫu kiểm tra. ở các lần kiểm tra sau, số mẫu phát hiện thấy kháng thể không giảm nhiều (29/30 mẫu). Chúng tôi cũng tiến hành phản ứng ELISA để xác định hàm l−ợng kháng thể ở các mẫu d−ơng tính. Kết quả đ−ợc thể hiện ở bảng 4.13. Hiệu giá kháng thể ở các lần kiểm tra đều cao: sau 21 ngày, 100% số mẫu đạt mức bảo hộ và trên mức bảo hộ. Sau khi tiêm 60 ngày, số mẫu đạt bảo hộ và trên mức bảo hộ là 96,7%; sau 120 ngày 96,7% số mẫu phát hiện thấy kháng thể và số mẫu đạt bảo hộ là 86,7%. 78 Bảng 4.13: Kết quả theo dõi đáp ứng miễn dịch của đàn lợn choai sau khi tiêm phòng liều tăng c−ờng. Sau tiêm 21 ngày Sau tiêm 60 ngày Sau tiêm 120 ngày Số mẫu kiểm tra (mẫu) 30 30 30 Số mẫu 30 29 29 Có kháng thể Tỷ lệ % 100 96,7 96,7 Số mẫu 3 Hiệu giá 1/64 Tỷ lệ % 10 Số mẫu 7 11 20 Hiệu giá 1/128 Tỷ lệ % 23,3 36,7 66,7 Số mẫu 23 18 6 Hiệu giá 1/256 Tỷ lệ % 76,7 60 20 Tỷ lệ bảo hộ (%) 100 96,7 86,7 Kết quả theo dõi đuợc thể hiện trên hình 4.6. So với tiêm 1 lần, có thể nhận thấy sau khi tiêm liều tăng c−ờng mức độ bảo hộ đã tăng lên rõ rệt. Số mẫu có hàm l−ợng kháng thể kháng vi rút LMLM type O tồn tại trên mức bảo hộ đến 120 ngày sau tiêm phòng là 86,7 %, hàm l−ợng kháng thể cao kéo dài hơn và giảm xuống chậm hơn so với khi tiêm một lần. So với tài liệu của nhà sản xuất, kiểm tra hiệu giá kháng thể sau khi tiêm phòng vắc xin Posi – FMD bằng phản ứng trung hoà huyết thanh [16] cho thấy kết quả nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn. Điều này có thể lý giải là do quá trình vận chuyển vắc xin kéo dài, điều kiện bảo quản không đảm bảo đ−ợc nh− trong phòng thí nghiệm, ảnh h−ởng kỹ thuật tiêm và do sức khoẻ đàn lợn không thực sự đồng đều. 79 0 20 40 60 80 100 120 Tr−ớc khi tiêm Sau tiêm 21 ngày Sau tiêm 60 ngày Sau tiêm 120 ngày Thời gian % b ảo h ộ Hình 4.6: Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ bảo hộ của đàn lợn choai sau khi tiêm phòng vắc xin liều tăng c−ờng Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể sau khi tiêm 1 lần và sau khi tiêm nhắc lại đ−ợc biểu diễn trên hình 4.7. Biểu đồ này biểu diễn hiệu quả của việc tiêm phòng nhắc lại rất rõ rệt. Hình 4.7: Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ bảo hộ của đàn lợn choai sau khi tiêm phòng vắc xin 1 lần và tiêm nhắc lại 0 20 40 60 80 100 120 Tr−ớc khi tiêm 21 ngày 60 ngày 120 ngày Thời gian T ỷ lẹ b ảo h ộ (% ) Tiêm 1 lần Tiêm nhắc lại 80 4.8. Đánh giá biện pháp phòng bệnh bằng vắc xin trong biện pháp tổng thể Chiến l−ợc dùng vắc xin tiêm phòng đã đ−ợc áp dụng thành công và kết hợp với các biện pháp khác nhằm khống chế và thanh toán bệnh LMLM ở một số n−ớc trong những năm gần đây. Nhiều n−ớc không có bệnh này coi việc dùng vắc xin là giải pháp cuối cùng và họ có nguồn dự trữ chiến l−ợc các sản phẩm vắc xin vô hoạt [2]. Để khống chế bệnh LMLM, việc dùng vắc xin và khả năng phòng hộ là hai vấn đề hoàn toàn khác nhau. Bản chất của bệnh LMLM và đáp ứng miễn dịch của nó dẫn đến việc khống chế bệnh phụ thuộc một cách đặc biệt vào chất l−ợng của vắc xin. Một vắc xin lý t−ởng sẽ kích thích hệ thống miễn dịch tạo ra một trạng thái miễn dịch mà không có các tác dụng phụ. Hiệu quả của một vắc xin ngoài thực địa phụ thuộc vào một số yếu tố bao gồm: sự lựa chọn một chủng vi rút vắc xin thích hợp, chiến l−ợc của ch−ơng trình tiêm phòng và các yếu tố ảnh h−ởng tới việc tiêm phòng và tỷ lệ tiêm phòng ngoài thực địa. Tuy nhiên, ng−ời ta chấp nhận rằng vắc xin LMLM không đạt hiệu quả 100% và do sự đe dọa th−ờng xuyên có các chủng vi rút mới, nên chính sách hiện nay là ngăn ngừa sự xâm nhập của vi rút vào trại chăn nuôi bằng các biện pháp kiểm tra nghiêm ngặt, với việc coi vắc xin chỉ đứng vị trí thứ 2 trong quá trình phòng chống bệnh. Việc ngăn ngừa sự xâm nhập của vi rút hữu hiệu bằng các biện pháp khử trùng tiêu độc và hạn chế di chuyển gia súc. Theo Strohmainer và Straub (1995) [10], vì lý do kinh tế mà việc tạo miễn dịch bền vững và hiệu quả cho lợn là không thể thực hiện đ−ợc, ngoài ra vắc xin cho lợn còn có hiệu lực rất thấp. Mục đích tiêm phòng là tránh những tổn thất trong sản xuất do LMLM gây ra. Để có hiệu quả, vắc xin phải có hiệu lực, an toàn, t−ơng đồng về tính kháng nguyên, chống các chủng vi rút đang gây bệnh hoặc có thể sẽ đe dọa 81 gây bệnh và cách sử dụng đúng để cho đáp ứng miễn dịch tối −u. Một tỷ lệ tiêm phòng thích đáng và tiêm phòng nhắc lại tốt sẽ bảo vệ đ−ợc cả gia súc lớn và gia súc con. Lần tiêm phòng tr−ớc là chủ động phòng bệnh, lần sau là tạo thêm kháng thể miễn dịch thụ động cho con non. Mối nguy hiểm đặc biệt là những con vật có miễn dịch một phần nh− đàn gia súc non thể hiện bệnh trong thời gian miễn dịch qua con mẹ giảm, Những con vật tiêm vắc xin lần đầu tiếp xúc với với bệnh tr−ớc khi có miễn dịch hoàn toàn, những con vật không tiêm vắc xin đều đặn những con đã tiêm vắc xin này nh−ng lại nhiễm biến chủng vi rút gây bệnh trong thực tế. Rõ ràng rằng những vấn đề này sẽ đ−ợc giảm tối thiểu nếu chất l−ợng vắc xin tốt, tính kháng nguyên phù hợp, sử dụng theo sự chỉ dẫn của nơi sản xuất. Bên cạnh việc tiêm phòng vắc xin, những biện pháp bổ sung khác nói chung cũng cần thiết cho việc thanh toán dịch bao gồm khống chế nhập, khống chế thức ăn, những tr−ờng hợp nghi ngờ cần báo cáo nhanh chóng, chẩn đoán phòng thí nghiệm nhanh chóng, thi hành có hiệu quả và nhanh chóng các biện pháp vệ sinh tiêu độc khi ổ dịch xảy ra. Một ph−ơng pháp loại trừ đã đ−ợc xác nhận là cần thiết là giết mổ và huỷ tất cả những con mắc bệnh lâm sàng và các loài cảm nhiễm ở vùng bị nhiễm kèm theo các biện pháp vệ sinh tiêu độc. Giết huỷ từng phần là chỉ giết những con mắc bệnh lâm sàng và tiêm vắc xin phần còn lại, khả năng mắc bệnh tăng lên do con mang trùng vẫn còn. Các biện pháp phòng chống chủ yếu bao gồm: kiểm dịch vận chuyển động vật, tiêu huỷ (chôn hoặc đốt) vật bệnh và vật cảm nhiễm trong khu vực có bệnh, tiêm chủng (hoặc không tiêm chủng) vắc xin, vệ sinh tiêu độc sát trùng, kiểm tra huyết thanh học, giám sát dịch tễ...đ−ợc thực hiện xen kẽ, tổng hợp hoặc phân cái chính cái phụ, tất cả phụ thuộc vào khả năng kỹ thuật, vốn đầu t−, tình hình dịch tễ cụ thể, thực trạng chăn nuôi của mỗi n−ớc mà quyết định. Việc đấu tranh để kiểm soát, khống chế tiến tới loại trừ đ−ợc bệnh 82 LMLM là một quá trình kiên trì, đòi hỏi nhiều thời gian (có thể 5 - 10 năm hoặc dài hơn), phức tạp và tốn kém. Năm 1991, Pháp viết lại toàn bộ toàn bộ các luật lệ thú y để chuyển từ bắt buộc tiêm phòng LMLM hàng năm sang cấm tiêm chủng và bố trí lại lực l−ợng quản lý để chiến l−ợc phòng chống bệnh LMLM trở thành chỉ có vệ sinh phòng bệnh (Barbara, 2000) [2]. Và kể từ đó quan điểm về xây dựng một ngân hàng vắc xin LMLM để điều chế khẩn cấp các lô vắc xin đem dùng ở vùng có tỷ lệ cao gia súc mẫn cảm trong tr−ờng hợp có bệnh xảy ra đ−ợc sử dụng nh− một ph−ơng tiện mới để chống bệnh (Lombard, 2000) [19]. Bệnh LMLM đã đ−ợc thanh toán trên đất Pháp 25 năm nay. 83 5. Kết luận và đề nghị 5.1. kết luận Từ những kết quả nghiên cứu đã trình bày trên đây chúng tôi có một số kết luận sau: + Mặc dù dịch LMLM xảy ra mạnh ở các tỉnh, kể cả tỉnh Bắc Ninh nh−ng xí nghiệp giống gia súc Thuận Thành vẫn bảo đảm an toàn dịch. + Tỷ lệ bảo hộ của đàn lợn nái khi tiêm phòng vắc xin Posi - FMD sau 21 ngày đạt 100%, sau 60 ngày đạt 100%, sau 90 ngày đạt 71,2%, sau 120 là 61,9% và tại thời điểm tr−ớc khi tiêm lại là 13,3%. + Tỷ lệ bảo hộ của đàn lợn con đ−ợc sinh ra từ đàn nái đã tiêm phòng vắc xin FMD cao, t−ơng đối đồng đều nh−ng giảm nhanh. Lúc 1 ngày tuổi 85% số mẫu đạt trên mức bảo hộ, lúc 14 ngày tuổi 75% số mẫu có hiệu giá kháng thể ở mức bảo hộ và trên mức bảo hộ, 50% số mẫu hiệu giá kháng thể trên mức bảo hộ đến 21 ngày tuổi. + Tỷ lệ bảo hộ của đàn lợn choai tại thời điểm 60 ngày tuổi tr−ớc khi tiêm phòng là 0%. Sau khi tiêm phòng vắc xin Posi – FMD 1 lần hàm l−ợng kháng thể chống lại vi rút LMLM chủng O tồn tại trên mức bảo hộ đến 21 ngày sau tiêm phòng là 73,3%, đến 60 ngày sau khi tiêm phòng là 66,7% số mẫu, đến 120 ngày sau tiêm phòng là 60% số mẫu. + Sau khi tiêm phòng vắc xin Posi – FMD liều tăng c−ờng sau liều thứ nhất 1 tháng, 100% số lợn đ−ợc tiêm có hàm l−ợng kháng thể kháng vi rút LMLM type O đạt trên mức bảo hộ có thể tồn tại đến 21 ngày sau khi tiêm, 96,7% tồn tại đến 60 và 86,7% tồn tại đến 120 ngày sau khi tiêm. 5.2. đề nghị + Xí nghiệp giống gia súc gia cầm Thuận Thành là một xí nghiệp chăn nuôi lợn công nghiệp với mật độ cao, công tác phòng bệnh LMLM thực sự rất 84 quan trọng. Để phòng bệnh bằng vắc xin đạt hiệu quả, xí nghiệp nên có ch−ơng trình kiểm tra hiệu giá kháng thể ở các thời điểm sau khi tiêm để giảm bớt khoảng trống giữa các đợt tiêm phòng vắc xin LMLM. + Do hạn chế về thời gian, chúng tôi ch−a khảo sát đ−ợc hàm l−ợng kháng thể ở lợn nái vào các thời điểm tiêm khác nhau khi mang thai, khi nuôi con và xác định đ−ợc t−ơng quan giữa hàm l−ợng kháng thể mẹ và hàm l−ợng kháng thể con tại các thời điểm đó. Đề nghị tiếp tục đánh giá các chỉ tiêu này và thực hiện các khảo sát t−ơng tự đối với các vắc xin khác đ−ợc sử dụng tại xí nghiệp. 85 tài liệu tham khảo tiếng việt 1. A.I Donaldson, Trung tâm chẩn đoán Pirbright, “Dịch tễ học bệnh Lở mồm Long móng, tình hình hiện nay và triển vọng”, Tạp Chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, tập VII, số3 năm 2000, tr.28 -35. 2. Barbara Dufour và Francois Moutou, “Cuộc đấu tranh chống bệnh LMLM tại Pháp”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, Số 3 năm 2000, tr.80-87 3. Bùi Quang Anh, Trần Hữu Cổn, Hoàng Văn Năm, Nguyễn Nh− Thanh (2001), Tài liệu t ập huấn dịch tễ học Thú y, Cục Thú y, 256 trang. 4. Chi cục thú y (2006), Báo cáo sơ kết 6 tháng đầu năm 2006, Bắc Ninh. 5. Cục Thú y (2004), “ Nghiên cứu giải pháp dịch tễ học phát hiện và khống chế bệnh LMLM”, Báo cáo tổng kết đề tài độc lập cấp nhà n−ớc, Hà Nội. 6. Cục Thú y (2006), Báo cáo công tác quý III và kế hoạch quý IV năm 2006, Hà Nội. 7. DAH (2005), Thông báo tình hình dịch cúm gia cầm và LMLM ngày..tháng...năm2006, 8. Đào Trọng Đạt (2000), “Để góp phần vào việc đấu tranh phòng chống bệnh LMLM”, Tạp Chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, tập VII, số 3 năm 2000, tr.6 - 7. 9. Hồ Đình Chúc, Nguyễn Văn Hanh, Đặng Thế Huynh (1978), Giáo trình Bệnh truyền nhiễm gia súc, NXB Nông nghiệp, tr 94-108. 10. K. Strohmainer và O.C.Straub, “Điều mong đợi sau khi ngừng tiêm phòng lở mồm long móng tại các n−ớc thành viên E.U”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, Số 3 năm 2000, tr.74-79. 86 11. Nguyễn Đăng Khải, Nguyễn Thị Thu Hà, Phạm Thành Long, Trung tâm chẩn đoán Thú y T.W, “Sử dụng kỹ thuật ELISA chẩn đoán bệnh LMLM”, Tạp Chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, tập VII, số 3 năm 2000, tr.100 -104. 12. Nguyễn Nh− Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan H−ơng (1997), Giáo trình vi sinh vật Thú y, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 13. Nguyễn Nh− Thanh , Tr−ơng Quang (2001), Cơ sở của ph−ơng pháp nghiên cứu dịch tễ học Thú y, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 14. Nguyễn Tiến Dũng (2000), “Bệnh Lở mồm Long móng”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, Số 3.2000, tr. 22-23. 15. Nguyễn Văn Nam, “Ph−ơng pháp kiểm soát bệnh lở mồm long móng bằng vắc xin Posi - FMD”, Hội thảo chuyên đề Kiểm soát bệnh lở mồm long móng bằng vắc xin Posi – FMD, Pfizer, Tp. Hồ Chí Minh. 16. Nguyễn Vĩnh Ph−ớc (1980), Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 17. M.F.Lombard và C.G. Schermbrucker, “Vacxin chống bệnh LMLM trên phạm vi toàn cầu: sản xuất, chọn chủng và hiệu suất ngoài thực địa”, Tạp Chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, tập VII, số 3 năm 2000, tr.36 -42. 18. Lê minh Chí (2000), Bệnh Lở mồm Long móng, Cục Thú y. 19. Lombard, “Xây dựng ngân hàng kháng nguyên đông lạnh và sản xuất khẩn cấp vắc xin chống bệnh lở mồm long móng”, tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, Số 3 năm 2000, tr.88-89. 20. OIE, Tiểu ban phòng chống LMLM ở Đông Nam á, ”Kế hoạch khống chế thanh toán bệnh LMLM trong khu vực Đông Nam á”, Tạp Chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, tập VII, số 3 năm 2000, tr.67 -73. 21. Pháp lệnh Thú y (2004), NXB Nông nghiệp. 87 22. Phan Đình Đỗ, Trịnh Văn Thịnh (1958), Bệnh truyền nhiễm gia súc (những bệnh th−ờng có ở Việt nam), Quyển 2, NXB Nông thôn 1958, tr.117-170. 23. Phạm Gia Ninh, Lê Minh Chí, Bùi Quý Huy, Trần Hữu Cổn (1993), Bệnh Lở mồm Long móng, Cục Thú y xuất bản, tr.1-58. 24. Sổ tay phòng chống bệnh Lở mồm Long móng (2003), NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 25. Thái Thị Thuỷ Ph−ợng (2002), “Đề xuất một số biện pháp góp phần thực hiện ch−ơng trình khống chế bệnh LMLM ở Việt Nam”, Tạp Chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, tập IV, số 2 năm 2002, tr. 89 -92. 26. Tr. Doel (2003), “ Miễn dịch LMLM tự nhiên và do tiêm phòng, những triển vọng cải tiến vacxin”, Tạp Chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, tập V, số 2 năm 2003, tr. 75 -85. 27. Trần Đình Từ (2000), “Ph−ơng pháp bảo quản và sử dụng vacxin LMLM”, Tạp Chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, tập VII, số 3 năm 2000, tr.103 -104. 28. Tô Long Thành (2000), “Cơ sở để phân loại vi rút LMLM”, Tạp Chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, tập VII số 3 năm 2000, tr.17 -21. 29. Tô Long Thành (2000), “Những tiến bộ trong sản xuất vacxin chống bệnh LMLM”, Tạp Chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, tập VII, số 3 năm 2000, tr.22- 27. 30. Tô Long Thành, Bùi Quang Anh, Hoàng Văn Năm, Đổng Mạnh Hoà, Ngô Thanh Long, Nguyễn Thu Hà (2006), “Kết quả chẩn đoán bệnh, giám sát sự l−u hành của vi rút và lựa chọn vắc xin phòng chống bệnh LMLM của Cục thú y (1985-2006)”, Tạp Chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, tập XIII, số 3 năm 2006, tr.70-75. 31. Văn Đăng Kỳ, Nguyễn Văn Thông (2001), “Một số kết quả phòng chống bệnh LMLM tại các khu vực trên thế giới”, Tạp Chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, tập VIII, số 3 năm 2001, tr.83 -88. 88 tiếng ANH 32. Andersen (1980), “Picornaviruses of animal Clinical observations and diagnosis”, In Comparative Diagnosis of Viral Diseases, vol 3. In press. 33. Bachrach, H.L (1968), “Food and mouth disease”, Annu. Rev. Microbiol, 22, pp.201-244. 34. Baillre Tindall (1985), Medicine Veterinary, pp 733-740. 35. Burrough J.N., Rowland D.J., Sangar D.V., Talbot P., and Brown F. (1971), “ Further evidence for multiple protein in the foot and mouth disease virus particle”, Journal of General Virology, 13, pp 73-84. 36. Crowther J.R and Abu Elzein E.M.E. (1979), “Application the enzyme linked immunosorbent assay to the detection of foot and mouth disease viruses”, J.Hvq. Camb., 83, 513-519. 37. Dimitriadis J.(1991), Laboratory diagnosis of Foot and Mouth Disease and swine vesicular in 1962-1988 in Greece, Berlene and Munchener Tierazliche Wochenschrift, pp.194-199. 38. Donalson A.I.(1987), “Foot and Mouth Disease, the principal features”, Irish veterinary Journal, 41(9), pp.325-327. 39. Donalson A.I.(1988), Development and use of model for forescasting the airborne spread of Foot and Mouth Disease, R.I.P. 39. Donalson A.I. (1988), “Foot and Mouth Disease in swine”, Selezione Veterinarian, 29-1, pp. 189-195. 40. Donalson A.I., Lee M, Shimhshony A (1988), “ Apossible airbonrne of foot and mouth disease viuts from jordan to Israel. A simula test computer”, Journal of Veterinary Medicine, 44(2), pp.92-96. 41. Donalson A.I. (1988), The Global status of foot and mouth disease and ist relevant to conttrol and eracdication efforts in South East Asia, R.I.P. 89 42. Geoffrey.W (1989), “Anote on some epizootlogical observation on FMD outbreak in an organised herd”, Indian veterinary medical journal, 113(2), pp.127-129. 43. Have. P. and Jensen M.H.(1983), Report of the Session of the Research Group of the Stading Technical Committee of the Eropean Commision for the Contron of foot and mouth disease, Netherlands, FAO of the United Nations, Rom 1983-1984. 44. Hamblin C., Kitching R.P., Donalson A.E., Crowther J.R., Barnett I.T.R. (1987), “ELISA for the detection of antibodises against foot and mouth disease Viruts. Evaluation of antibodies after infection and vaccination”, Epidemiology and Infection, 99(3), pp 733-744. 45. J.B.Brooksby (1982), Portraits of Foot and Mouth Disease Virus, Research Institute Pirbright, Surrey. 46. J.J Callis, P.D Kercher (1986), Foot and mouth disease, Disease of swine, Sixth Edition IOWA State University press Ames Iowa, USA, pp. 337-347. 47. Kitching R.P. (2000), “A recent history of FMD”, Veterinary sceinses and techniques, Vol. VII, No 1-2000. 48. Kitching R.P. & Donalson A.I. (1987), “Collection and transportation of specimen for vesicular víu investigation”, Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz, 6(1), pp.263-272. 49. Kitching R.P. (1989), Development of FMD virus strain characterisation a review, Tropical animal health and production, pp.153 – 166. 50. Kim U. (1992), “FMD control strategies”, Report of the meeting of the coordinating group for FMD control in South East Asia, NAHPI- Bangkok. 90 51. Namdy S. (1996), “Foot and mouth disease in wild animals”, Asian livestock 1/1996, FAO, Thailan, pp. 2-5. 52. Merchant I.A, Barner R.D. (1981), Infectious disease of domestical animal, Iowa Stae university Press, USA, pp.199-210. 53. Lanzhou Veterinary Research Institute (2004), International training workshop on standard Diagnosis Techniques of Livestock Health Diseases in Developing Country, the People’s Republic of China. 54. Lubroth J.et al. (1990), “Foot and mouth disease viruts in the diagnosis, transmission and suscepbility”, Journal of veterinary diagnosis, 2(3), pp.197-203. 55. OIE SEA FMD RCU (2000), “Report to the FMD commission”, The sixth Meeting of the Sub-commission for FMD control in Hanoi, 21-25th Feb, 2000. 56. Olesiewicz M.B., Donalson A.L., Alexandersen S. (2001), “Developmen of a novel real-time RT-PCA assay for quantitation of foot and mouth disease viruts in diverse porcine tissues”, Journal Virology Methods, 92(1), pp.23-55. 57. Pearson, W.R & Lipman, D.J. (1988), PNAS, 85, pp. 2444- 2448. 58. Remond M, Kaiser C, Lebreton F (2002), Diagnosis and screening of foot and mouth disease, Comp Imunol Microbiol Infect Dis, pp.309-20. 59. Reid SM, Hutchings GH, Ferris NP, De Clercq K. (1999), “Diagnosis of foot and mouth disease by RT-PCR: evaluation of primers for serotypic characterisation viral RNA in clinical Samples”, Virology Methods, 1999 Dec, 83(1-2), pp.113-123. 60. Swam H. (1994), What is Foot and mouth disease, FMD just a third world problem?, Intervet, pp. 7-8. 61. Thomson G.R.(2000), Foot and mouth disease, Facing the new dilemmas, Rev sci. tech. Off. in. Epiz, OIE, Rom, Italia. i ảnh 1: Khu lợn nái chửa ảnh 2: Chuồng lợn nái đẻ ảnh 3: Lấy mẫu máu ảnh 4: Lấy mẫu máu ii Phụ lục Một số hình ảnh minh hoạ ._.