Đánh giá hiệu quả sử dụng Vắc Xin (Vaccine) phòng bệnh cúm gia cầm trên địa bàn thành phố Hải Dương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP – HÀ NỘI NGUYỄN MẠNH HÙNG ðÁNH GIÁ HIỆU QUẢ SỬ DỤNG VẮC XIN PHÒNG BỆNH CÚM GIA CẦM TRÊN ðỊA BÀN THÀNH PHỐ HẢI PHÒNG LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : THÚ Y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN VĂN CẢM HÀ NỘI - 2008 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng: - Các kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. - Mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, tháng 09 năm 2008 Tác giả luận văn Nguyễn Mạnh Hùng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành ñược ñề tài nghiên cứu, tôi ñã nhận ñược sự chỉ bảo giúp ñỡ, hướng dẫn tận tình của nhiều cá nhân và tập thể, nhân dịp này cho phép tôi ñược tỏ lòng biết ơn và cảm ơn chân thành tới: Ban Giám hiệu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, khoa Sau ðại học, khoa Thú y, Cơ quan Thú y vùng II, các thầy cô giáo ñã giúp ñỡ, tạo ñiều kiện ñể tôi học tập, tiếp thu kiến thức của chương trình học. Các thầy cô giáo bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý khoa Thú y Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội; các cán bộ Trạm chẩn ñoán, Cơ quan Thú y vùng II. Trực tiếp là thầy hướng dẫn TS. Nguyễn Văn Cảm – Giám ñốc Trung tâm Chẩn ñoán Thú y Trung ương ñã hướng dẫn nhiệt tình và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi ñể tôi thực hiện ñược ñề tài nghiên cứu. Ban Lãnh ñạo và toàn thể cán bộ Chi cục Thú y, ñồng nghiệp ñang làm việc trong lĩnh vực Chăn nuôi - Thú y của thành phố Hải Phòng. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi ñược gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia ñình, người thân cùng bạn bè ñã ñộng viên giúp ñỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, thực hiện ñề tài. Một lần nữa tôi xin ñược bày tỏ lòng biết ơn, cảm ơn chân thành tới những tập thể, cá nhân ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ tôi hoàn thành chương trình học tập. Hà Nội tháng 9 năm 2008 Tác giả Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………iii Nguyễn Mạnh Hùng MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt v Danh mục các bảng vi Danh mục các biểu ñồ vii Danh mục các ñồ thị viii Danh mục các hình ix 1. Mở ñầu 1 1.1. ðặt vấn ñề 1 1.2. Mục tiêu của ñề tài 4 1.3. ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4 1.4. ðối tượng, thời gian, ñịa ñiểm nghiên cứu 4 2. Tổng quan tài liệu 5 2.1. Giới thiệu chung về bệnh cúm gia cầm 5 2.2. Lịch sử bệnh cúm gia cầm 6 2.3. Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới và trong nước 7 2.4. Lưu hành bệnh 12 2.5. ðặc ñiểm sinh học của vi rút cúm typ A 16 2.6. Triệu chứng, bệnh tích của bệnh cúm gia cầm 30 2.7. Chẩn ñoán bệnh cúm gia cầm 33 2.8. Kiểm soát bệnh cúm gia cầm 35 2.9. Phòng chống bệnh cúm gia cầm 36 2.10. ðiều trị 40 3. Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 41 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………iv 3.1. Nội dung nghiên cứu 41 3.2. Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu 41 3.3. Phương pháp nghiên cứu 42 4. Kết quả và thảo luận 43 4.1. Diễn biến dịch cúm gia cầm tại Hải Phòng 43 4.2. Kết quả phòng chống dịch cúm gia cầm của thành phố Hải Phòng. 47 4.3. Kết quả ñánh giá ảnh hưởng của vắc xin H5N1. 51 4.4. ðáp ứng miễn dịch và ñộ dài miễn dịch của gia cầm tiêm vắc xin cúm H5N1 Trung Quốc. 59 4.5. Kết quả giám sát vi rút 81 5. Kết luận và ñề nghị 83 5.1. Kết luận 83 5.2. ðề nghị 84 tài liệu tham khảo 85 phụ lục 90 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TN. Thí nghiệm ðC. ðối chứng PƯ. Phản ứng GC. Gia cầm ARN. Acid ribonucleic cADN. Complementary ADN GMT. Geographic Mean Titre HA. Hemagglutination test HI. Hemagglutination inhibitory test HPAI. High Pathogenic Avian Influenza KN. Antigene KT. Antibody LPAI. Low Pathogenic Avian Influenza OIE. Office Internationale des Epizooties PBS. Phosphate- Buffered- Saline RT - PCR. Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………vi DANH MỤC CÁC BẢNG Số bảng Tên bảng Trang 4.1 Biến ñộng số lượng gia cầm từ năm 2001- 2008 43 4.2 Tình hình dịch cúm gia cầm từ năm 2004 ñến năm 2008 46 4.3 Kết quả tiêm vắc xin cúm gia cầm 48 4.4 Kết quả tiêm vắc xin cúm gia cầm ñợt I năm 2008 50 4.5 Kết quả giám sát ñàn gia cầm trước khi tiêm vắc xin 52 4.6 Kết quả theo dõi ñộ an toàn của vắc xin trên ñàn gia cầm sau khi tiêm vắc xin ñợt I năm 2008 tại Hải Phòng 55 4.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng vắc xin H5N1 ñến tỷ lệ ñẻ trứng của ñàn gà trong 5 tuần 56 4.8 Kết quả khảo sát ảnh hưởng vắc xin H5N1 ñến tỷ lệ ñẻ trứng của ñàn vịt trong 5 tuần 58 4.9 Hiệu giá kháng thể và ñộ dài miễn dịch của gà thí nghiệm 60 4.10 Hiệu giá kháng thể, ñộ dài miễn dịch của gà thực ñịa tiêm vắc xin H5N1 tại thành phố Hải Phòng ñợt I năm 2008 62 4.11 Hiệu giá kháng thể trung bình, tỷ lệ bảo hộ của ñàn gà TN và các ñàn gà thực ñịa ñược tiêm vắc xin trong thành phố 64 4.12 Tần số phân bố các mức KT của gà TN và gà thực ñịa tiêm vắc 66 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………vii xin H5N1 ñợt I năm 2008 4.13 Hiệu giá kháng thể và ñộ dài miễn dịch của vịt thí nghiệm 70 4.14 Hiệu giá kháng thể và ñộ dài miễn dịch của vịt thực ñịa tiêm vắc xin H5N1 tại thành phố Hải Phòng ñợt I năm 2008 72 4.15 Hiệu giá kháng thể trung bình, tỷ lệ bảo hộ của ñàn vịt TN và các ñàn vịt trong thành phố ñược tiêm vắc xin 75 4.16 Tần số phân bố các mức KT của vịt TN và vịt thực ñịa tiêm vắc xin H5N1 ñợt I năm 2008 77 4.17 Giám sát sự lưu hành của vi rút cúm trên ñàn gia cầm ñược tiêm phòng vắc xin 81 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………viii DANH MỤC CÁC BIỀU ðỒ Số biểu ñồ Tên biều ñồ Trang 4.1 Biến ñộng số lượng gia cầm từ năm 2001 - 2008 44 4.2 Tần số phân bố các mức kháng thể của gà thí nghiệm và gà thực ñịa tại thời ñiểm 30 ngày sau tiêm vắc xin H5N1 67 4.3 Tần số phân bố các mức kháng thể của gà thí nghiệm và gà thực ñịa tại thời ñiểm 60 ngày sau tiêm vắc xin H5N1 68 4.4 Tần số phân bố các mức kháng thể của gà thí nghiệm và gà thực ñịa tại thời ñiểm 90 ngày sau tiêm vắc xin H5N1 68 4.5 Tần số phân bố các mức kháng thể của gà thí nghiệm và gà thực ñịa tại thời ñiểm 120 ngày sau tiêm vắc xin H5N1 69 4.6 Tần số phân bố các mức kháng thể của gà thí nghiệm và gà thực ñịa tại thời ñiểm 150 ngày sau tiêm vắc xin H5N1 69 4.7 Tần số phân bố các mức kháng thể của vịt thí nghiệm và vịt thực ñịa tại thời ñiểm 30 ngày sau tiêm vắc xin H5N1 mũi 1 78 4.8 Tần số phân bố các mức kháng thể của vịt thí nghiệm và vịt thực ñịa tại thời ñiểm 60 ngày sau tiêm vắc xin H5N1 mũi 1 79 4.9 Tần số phân bố các mức kháng thể của vịt thí nghiệm và vịt thực ñịa tại thời ñiểm 90 ngày sau tiêm vắc xin H5N1 mũi 1 79 4.10 Tần số phân bố các mức kháng thể của vịt thí nghiệm và vịt thực ñịa tại thời ñiểm 120 ngày sau tiêm vắc xin H5N1 mũi 1 80 4.11 Tần số phân bố các mức kháng thể của vịt thí nghiệm và vịt thực ñịa tại thời ñiểm 150 ngày sau tiêm vắc xin H5N1 mũi 1 80 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………ix DANH MỤC CÁC ðỒ THỊ Số ñồ thị Tên ñồ thị Trang 4.1 Các mẫu dich swab âm tính với vi rút cúm H5 trước khi tiêm phòng 53 4.2 ðối chứng dương tính với vi rút cúm H5 trong dich swab 53 4.3 ảnh hưởng vắc xin H5N1 ñến tỷ lệ ñẻ của gà trong 5 tuần 57 4.4 ảnh hưởng vắc xin H5N1 ñến tỷ lệ ñẻ của vịt trong 5 tuần 59 4.5 Biến ñộng hiệu giá kháng thể trung bình của gà thí nghiệm tiêm vắc xin H5N1 61 4.6 Biến ñộng hiệu giá kháng thể trung bình của gà thực ñịa tiêm vắc xin H5N1 63 4.7 So sánh biến ñộng hiệu giá kháng thể trung bình của gà TN với các ñàn gà thực ñịa ñược tiêm vắc xin trong thành phố 65 4.8 Biến ñộng hiệu giá kháng thể trung bình của vịt thí nghiệm tiêm vắc xin H5N1 71 4.9 Biến ñộng hiệu giá kháng thể trung bình của vịt thực ñịa tiêm vắc xin H5N1 74 4.10 So sánh biến ñộng hiệu giá kháng thể trung bình của vịt TN với các ñàn vịt thực ñịa ñược tiêm vắc xin trong thành phố 76 4.11 Các mẫu dịch swab âm tính với vi rút cúm H5 sau khi tiêm phòng 82 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………x DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Bảo quản vắc xin 2 - 80C 91 Tiêm phòng vắc xin cúm gia cầm 91 Dụng cụ và nguyên liệu làm phản ứng HA, HI 92 ðọc kết quả phản ứng HI 92 Tiêu bản chuẩn ñộ 4HA 93 Tiêu bản phản ứng HI gia cầm tiêm phòng vắc xin 93 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………1 1. MỞ ðẦU 1.1. ðẶT VẤN ðỀ Chăn nuôi gia cầm từ lâu ñã chiếm một vị trí quan trọng trong kinh tế gia ñình của người dân nước ta. Trong những năm gần ñây, ngoài những giống gia cầm nội, các gia ñình nông dân ñã và ñang tiếp nhận, chăn nuôi những giống gia cầm nhập ngoại với phương thức chăn nuôi công nghiệp cho năng suất thịt, trứng và hiệu quả kinh tế cao. Bên cạnh ñó có những trở ngại trong việc phát triển ñàn gia cầm tại các cơ sở chăn nuôi gia cầm tập trung cũng như trong gia ñình là dịch bệnh xảy ra phổ biến, nhiều dịch bệnh gây thiệt hại lớn cho ñàn gia cầm. Một trong những dịch bệnh gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm và ñe doạ ñến tính mạng con người, ñó là dịch cúm gia cầm. Bệnh cúm gia cầm chủng ñộc lực cao (High Pathogenicity Avian Influenza - HPAI) là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, có tốc ñộ lây lan rất nhanh với tỷ lệ gây chết cao trong ñàn gia cầm nhiễm bệnh (Cục Thú y, 2004) [4] gây thiệt hại nghiêm trọng ñến nền kinh tế và sức khoẻ của con người. Vi rút ñược chia thành các type A, B, C dựa trên các kháng nguyên nucleocapsit hoặc matrix protein. Vi rút cúm type A lại ñược chia thành các subtype tuỳ theo các loại kháng nguyên bề mặt của chúng là Haemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA). Cho ñến nay người ta ñã xác ñịnh ñược 16 kháng nguyên HA (ký hiệu từ H1 ñến H16) và 9 kháng nguyên NA (ký hiệu từ N1 ñến N9). Các vi rút cúm type A có thể gây bệnh cho các loài ñộng vật như gà, vịt, ngan, ngỗng, ñà ñiểu, các loài chim, lợn, ngựa, chồn, hải cẩu, cá voi và có thể gây bệnh cho cả con người. Tuỳ theo ñộc lực của chủng vi rút gây bệnh và ñiều kiện ngoại cảnh mà biểu hiện bệnh lý ở gia cầm mắc bệnh có sự thay ñổi khác nhau. Các chủng vi rút có ñộc lực cao thường gây bệnh trầm trọng với tỷ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………2 lệ chết cao, có thể lên tới 100% số gia cầm nhiễm bệnh chỉ trong vài giờ ñến vài ngày lây nhiễm. Do tính chất nguy hiểm của bệnh, Tổ chức Thú y Thế giới (OIE) xếp bệnh vào Bảng A - Bảng danh mục các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất (Cục Thú y, 2004) [4]. Vi rút cúm gia cầm phân bố rộng rãi khắp toàn cầu, vì vậy dịch bệnh ñã xảy ra tại nhiều nước trên thế giới. Bệnh có từ lâu trong lịch sử, ngày nay bệnh vẫn hoành hành. Mỗi khi xuất hiện bệnh thường gây ra những vụ ñại dịch gây chết rất nhiều gia cầm và người. Ví dụ như năm 1918-1919 vi rút cúm A (H1N1) hay còn gọi là cúm Tây Ban Nha ñã làm 500.000 nghìn người chết ở Hoa Kì và khoảng từ 20 ñến 50 triệu người thiệt mạng trên thế giới, nhiều người chỉ chết trong vòng vài ngày sau khi nhiễm. Từ ñó tới nay còn nổ ra nhiều vụ ñại dịch gây thiệt hại rất lớn cho loài người cả về người và của. Ở Châu Á, cuối năm 2003, dịch cúm gia cầm xảy ra trên diện rộng ở một số nước. Dịch xuất hiện ñầu tiên ở Hàn Quốc từ ñầu tháng 12/2003, sau ñó dịch xảy ra ở nhiều nước với diễn biến rất phức tạp. Tại Việt Nam, theo báo cáo của Cục Thú y, dịch cúm gia cầm nổ ra vào cuối tháng 12/2003 và ñầu năm 2004 ñã gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi. Bệnh bùng phát rất nhanh, xảy ra trên quy mô lớn 57/64 tỉnh, thành và diễn biến rất phức tạp. Theo thông báo của Bộ Y tế, từ khi xuất hiện dịch cúm gia cầm ñến nay ñã có 105 trường hợp người bị nhiễm vi rút Cúm A (H5N1), trong ñó có 51 trường hợp bị tử vong. (Số liệu tính ñến ngày 5-3-2008). Tại Hải Phòng dịch cúm gia cầm xảy ra từ ngày 21/1/2004 ñến ngày 9/2/2004 dịch ñã ñược dập tắt, dịch lây lan ra 39/223 xã, phường, thuộc 10/14 huyện, quận. Tổng số gia cầm ốm, chết và tiêu hủy: 236.977 con. Năm 2005 Hải Phòng ñã xảy ra 2 ñợt dịch: ðợt 1: Dịch xảy ra từ ngày 17/01/2005 ñến 10/3/2005. Toàn thành phố có 12 xã, phường thuộc 6 quận, huyện có dịch. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………3 ðợt 2: Dịch nổ ra từ ngày 10/11/2005 ñến ngày 19/02/2006 dịch ñã xảy ra tại 11 xã thuộc 7 quận, huyện trên ñịa bàn thành phố. Tổng số gia cầm ốm chết và tiêu hủy do dịch cúm A (H5N1) năm 2005 là: 358.641 con. Ngày 19/12/2005 dịch ñã ñược khống chế trên ñịa bàn thành phố. Ngày 13/01/2006 công bố hết dịch trên ñịa bàn thành phố. Sau 18 tháng (từ ngày 19/12/2005 ñến 23/5/2007) tình hình ñàn gia cầm của thành phố vẫn an toàn và ổn ñịnh, không có gia cầm ốm, chết do bệnh cúm và không có trường hợp người nhiễm cúm A (H5N1). Ngày 24/5/2007 ñến ngày 21/6/2007 dịch cúm gia cầm tái bùng phát tại 08 xã, thị trấn thuộc 03 huyện, tổng số gia cầm ốm, chết và tiêu hủy trên ñịa bàn toàn thành phố là: 13.187 con gia cầm. Theo thông báo của Sở Y tế Hải Phòng từ khi xuất hiện dịch cúm gia cầm ñến nay thành phố ñã có 8 trường hợp nhiễm vi rút cúm A (H5N1) ñều chữa trị kịp thời không có ca tử vong. Qua những thông tin trên cho thấy: Cúm gia cầm thực sự là một bệnh nguy hiểm, không những làm chết nhiều gia cầm mà còn làm chết nhiều người gây thiệt hại về kinh tế, xã hội rất nghiêm trọng. ðể dập dịch cũng như khống chế, tiến tới thanh toán bệnh Cúm gia cầm, Chính phủ và các ñịa phương ñã áp dụng hàng loạt các biện pháp như: ban hành các văn bản pháp quy; giám sát phát hiện bệnh; tiêu huỷ triệt ñể ñàn gia cầm nhiễm bệnh; vệ sinh tiêu ñộc; kiểm dịch, kiểm soát giết mổ.... Tuy nhiên, do tập quán chăn nuôi nhỏ lẻ và ý thức chấp hành pháp lệnh thú y của người dân còn thấp nên dịch vẫn liên tục xảy ra. Việc áp dụng biện pháp tiêu hủy ñàn gia cầm bệnh và nghi bị bệnh là không chủ ñộng khống chế ñược bệnh Cúm gia cầm ở các nước ðông Nam Châu Á, ñó là nhận ñịnh ñược nêu trong Hội Nghị Cúm gia cầm khu vực Châu Á họp tại Thành phố Hồ Chí Minh tháng 5 năm 2005. ðồng thời Hội nghị cũng khuyến cáo nên dùng vắc xin Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………4 phòng bệnh như là một biện pháp tích cực ñể bảo vệ ñàn gia cầm. Từ tháng 8 năm 2005 Việt Nam ñã nhập và dùng thí ñiểm vắc xin cúm gia cầm tại 2 tỉnh là Nam ðịnh và Tiền Giang sau ñó dùng rộng rãi trong cả nước, trong ñó có thành phố Hải Phòng. ðể góp phần xem xét việc dùng vắc xin trong thực tế ra sao bằng các cơ sở khoa học, chúng tôi tiến hành ñề tài: “ðánh giá hiệu quả sử dụng vắc xin phòng bệnh Cúm gia cầm trên ñịa bàn thành phố Hải Phòng” 1.2. MỤC TIÊU CỦA ðỀ TÀI - ðánh giá ñộ an toàn, hiệu lực vắc xin H5N1 của Trung Quốc ñối với gà và vịt trong ñiều kiện tiêm phòng ñại trà. - ðánh giá hiệu quả của việc tiêm vắc xin H5N1 trong giải pháp tổng thể phòng chống bệnh cúm gia cầm tại thành phố Hải Phòng. 1.3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN - Các kết quả ñiều tra, nghiên cứu tại Hải Phòng nhằm cung cấp, bổ xung, hoàn thiện thêm các thông tin về bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam. - Các biện pháp tổ chức thực hiện và kết quả tiêm vắc xin cúm gia cầm ñại trà của Hải Phòng nói riêng và cả nước nói chung. 1.4. ðỐI TƯỢNG, THỜI GIAN, ðỊA ðIỂM NGHIÊN CỨU - ðối tượng nghiên cứu: gà, vịt. - Thời gian nghiên cứu: tháng 11/2007 ñến tháng 8/2008. - ðịa ñiểm nghiên cứu trên ñịa bàn thành phố Hải Phòng. - ðịa ñiểm xét nghiệm và thực tập: Trạm chẩn ñoán – Cơ quan Thú y vùng II (Hải Phòng). Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………5 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BỆNH CÚM GIA CẦM Bệnh cúm gia cầm (avian influenza), là một bệnh truyền nhiễm gây ra bởi vi rút cúm type A thuộc họ Orthomyxoviridae với nhiều subtype khác nhau (Ito, T and Y. Kawaoka, 1998) [32]. Trước ñây bệnh còn ñược gọi là bệnh dịch tả gia cầm (Fowl plague), nhưng từ Hội nghị Quốc tế lần thứ nhất về bệnh cúm gia cầm tại Beltsville, Mỹ, năm 1981 ñã thay thế tên này bằng tên bệnh cúm truyền nhiễm cao ở gia cầm (Highly pathogenic avian influenza viết tắt là HPAI) ñể chỉ vi rút cúm type A có ñộc lực mạnh (Cục Thú y, 2004) [4]. Bệnh cúm gia cầm HPAI là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, có tốc ñộ lây lan rất nhanh với tỷ lệ chết cao trong ñàn gia cầm nhiễm bệnh. Vi rút gây bệnh cúm gia cầm chủ yếu là loại H5, H7 và H9, gây bệnh cho gà, vịt, ngan, ngỗng, ñà ñiểu, các loại chim. Vi rút còn gây bệnh cho cả con người và có thể thành ñại dịch, vì thế bệnh cúm gia cầm ñang ngày càng trở nên nguy hiểm hơn bao giờ hết (Cục thú y, 2005; Lê Văn Năm, 2004) [5], [16]. Bệnh Cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, theo hiểu biết trước ñây bệnh chỉ xuất hiện ở gà và gà tây, do chủng vi rút có ñộc lực cao (HPAI) gây ra và ñang lưu hành nhanh chóng qua một loạt các nước Châu Á. Gần ñây, theo thông báo của Tổ chức Thú y thế giới (OIE) bệnh ñã lan sang cả Châu Âu, Châu Mỹ và Châu Phi. Bệnh Cúm gia cầm thể ñộc lực cao hiện nay không chỉ xuất hiện ở loài gà (với tỷ lệ ốm và tỷ lệ chết 100%) mà còn xuất hiện ở cả vịt, ngỗng, ngan, chim cút. Không những thế, bệnh còn tạo nên một mối quan tâm quốc tế ñặc biệt do số lượng người bị nhiễm bệnh và tử vong do vi rút H5N1 ngày càng tăng lên. ðể tránh thiệt hại cho ngành chăn nuôi, ñảm bảo nhu cầu thực phẩm của người dân và tránh thảm họa ñại dịch Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………6 cúm ở người, cần phải có biện pháp khống chế thật tốt và tiến tới thanh toán cúm gia cầm. 2.2. LỊCH SỬ BỆNH CÚM GIA CẦM Năm 412 trước công nguyên, Hippocrate ñã mô tả về bệnh cúm. Năm 1680 một vụ ñại dịch cúm ñã ñược mô tả kỹ và từ ñó ñến nay ñã xảy ra 31 vụ ñại dịch. Trong hơn 100 năm qua ñã xảy ra 4 vụ ñại dịch cúm vào các năm 1889, 1918, 1957, 1968 (Cục Thú y, 2004) [4]. Bệnh cúm gia cầm (Avian Influenza - AI) ñược Porroncito mô tả lần ñầu tiên ở Italy vào năm 1878 với tên gọi là bệnh “Dịch tả gia cầm” (Fowl plague). ñến năm 1901 Centanni và Savunozzi mới xác ñịnh ñược yếu tố gây bệnh là căn nguyên siêu nhỏ có khả năng qua lọc. Tuy nhiên, phải ñến năm 1955 Schafer mới xác ñịnh ñược chính xác nguyên nhân gây bệnh cúm gia cầm là vi rút cúm type A thông qua kháng nguyên bề mặt H7N1 và H7N7 gây chết nhiều gà, gà tây và các loài khác (Schafer, W.1955) [45]. Năm 1933, Smith ñã phát hiện vi rút cúm người bằng cách dùng nước rửa mũi - họng của người bị cúm gây lây qua ñường mũi cho chồn. Năm 1940, Fransis và Magill ñã xác ñịnh một vi rút mới có những ñặc tính sinh học và kháng nguyên khác. Vi rút ñầu tiên trong số vi rút ñã tìm ra ñược gọi là type A, vi rút thứ 2 là type B, vi rút thứ 3 là type C. Năm 1963, vi rút cúm type A ñược phân lập từ gà tây ở Bắc Mỹ do loài thuỷ cầm di trú dẫn nhập vi rút vào ñàn gà. Cuối thập kỷ 60, phân type H1N1 thấy ở lợn và có liên quan ñến những ổ dịch ở gà tây. Mối liên hệ giữa lợn và gà tây là những dấu hiệu ñầu tiên về vi rút cúm ở ñộng vật có vú có thể lây nhiễm và gây bệnh cho gia cầm. Những nghiên cứu ñều cho rằng vi rút cúm type A phân type H1N1 ñã ở lợn và truyền cho gà tây, ngoài ra phân type H1N1 ở vịt còn truyền cho lợn (Cục Thú y, 2004) [4]. Bệnh cũng ñược Beard C.W mô tả khá kỹ qua ñợt dịch cúm khá lớn trên Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………7 gà tây ở Mỹ vào năm 1971. Các năm tiếp theo, bệnh ñược phát hiện ở Nam Mỹ, Bắc Mỹ rồi Nam Phi, Trung Cận ðông, Châu Âu, liên hiệp Anh và Liên Xô cũ (Beard C.W., Schnitziein W.M ) [23]. Sự lây nhiễm từ chim hoang dã sang gia cầm ñã có bằng chứng từ trước năm 1970 nhưng chỉ ñược công nhận khi xác ñịnh ñược tỷ lệ nhiễm vi rút cúm cao ở một số loài thuỷ cầm di trú (Cục Thú y, 2004) [4]. Dịch cúm gia cầm liên tục bùng nổ khắp các Châu lục trên thế giới, ñã thúc ñẩy các nhà khoa học tổ chức hội thảo chuyên ñề về bệnh cúm gia cầm (Hội thảo lần ñầu tiên vào năm 1981 tại Beltsville MD, lần thứ 2 tại Athen năm 1986, lần 3 tại Madison WI vào 1992, lần thứ 4 tại Athen năm 1997 và lần thứ 5 cũng tại Athen năm 2003). Từ ñó ñến nay trong các hội thảo về dịch tễ bệnh cúm gia cầm luôn là một trong những nội dung ñược coi trọng và ñược liên tục tổ chức ở nhiều nơi trên thế giới. Qua ñó có thể thấy, bệnh cúm gia cầm ngày càng trở nên nguy hiểm, gây nhiều thiệt hại về mặt kinh tế cho ngành chăn nuôi gia cầm trên phạm vi toàn cầu. 2.3. TÌNH HÌNH DỊCH CÚM GIA CẦM TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC 2.3.1. Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới Vi rút cúm gia cầm phân bố khắp toàn cầu, vì vậy dịch bệnh ñã xảy ra ở nhiều nước trên thế giới. Năm 1983 - 1984 ở Mỹ, dịch cúm gà xảy ra do chủng vi rút H5N2 ở 3 bang Pensylvania, Virginia, Newtersey làm chết và tiêu huỷ hơn 19 triệu gà (Phạm Sĩ Lăng, 2004) [13], cũng trong thời gian này tại Ireland người ta ñã phải tiêu huỷ 270 nghìn con vịt tuy không có triệu chứng lâm sàng nhưng ñã phân lập ñược vi rút cúm chủng ñộc lực cao (HPAI) ñể loại trừ bệnh một cách hiệu quả, nhanh chóng. Năm 1977 ở Minesota ñã phát hiện dịch trên gà tây do chủng H7N7. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………8 Năm 1986 ở Australia dịch cúm gà xảy ra tại bang Victoria do chủng H5N2. Năm 1997 ở Hồng Kông dịch cúm gà xảy ra do vi rút cúm type A subtype H5N1. Toàn bộ ñàn gia cầm của lãnh thổ này ñã bị tiêu diệt vì ñã gây tử vong cho con người (Cục Thú y, 2004) [4]. Như vậy ñây là lần ñầu tiên vi rút cúm gia cầm ñã vượt “rào cản về loài” ñể lây cho người ở Hồng Kông làm cho 18 người nhiễm bệnh, trong ñó có 6 người chết (Nguyễn Hoài Tao, Nguyễn Tuấn Anh, 2004) [17]. Năm 1999, Guet on, Hoffman et on và Xuet on ñã chứng minh sự xuất hiện của vi rút H5N1 tại Hồng Kông SAR vào năm 1997 là do sự tổ hợp của vi rút cúm từ ngỗng, vịt, mòng và chim cút. Vào các năm 2000, 2001, Guet on ñã phát hiện và thấy 8 chủng vi rút khác nhau lưu hành tại Hồng Kông SAR , trong ñó có 5 chủng lưu hành do sự tổ hợp. Mặt khác sự tổ hợp gen giữa các chủng vi rút ñã tạo ra loại vi rút H5N1 có ñộc lực cao ñối với vịt mà thông thường vi rút cúm không gây bệnh cho thuỷ cầm. Từ giữa tháng 12 năm 2003, ñã có 11 quốc gia ở Châu Á là Nhật Bản, Hàn Quốc, Thái Lan, Lào, Campuchia, Inñônêxia, Trung Quốc, Hồng Công, ðài loan, Việt Nam và Pakistan ñã thông báo bùng phát dịch cúm gia cầm ñộc lực cao ở gà và vịt. Sự lây lan nhanh chóng dịch cúm gia cầm xảy ra ñồng thời ở một số nước ñã trở thành mối quan tâm lớn trên toàn cầu. (Bùi Quang Anh, 2005; Cục Thú y, 2004; Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004; Phạm Sỹ Lăng, 2004; Tô Long Thành, 2004) [3], [4], [8], [14], [19]. Ngoài các ổ dịch do vi rút cúm H5N1 nêu trên, còn có 7 nước và vùng lãnh thổ khác có các ổ dịch cúm gia cầm do các chủng khác là Pakistan (H7N3 và H9N2), Canada (H7N3), Mỹ (H7N2), Nam Phi (H6 và H5N2), Ai Cập (H10N7) và Triều Tiên (H7) (Tô Long Thành, 2006) [20]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………9 Giữa năm 2005 dịch cúm gia cầm do H5N1 bắt ñầu xuất hiện tại Kazakhstan, Nga rồi nhanh chóng lan rộng sang các nước khác ở khu vực Châu Âu như Rumani, Hy Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ, Azerbaijan, rồi tràn sang Châu Phi, các nước khác thuộc Châu Á như ở vùng Vịnh, Trung Quốc và Iraq. Tính ñến ngày 02 tháng 08 năm 2006 chủng vi rút ñộc lực cao H5N1 ñã có mặt tại 51 quốc gia và vùng lãnh thổ trên hầu khắp các châu lục, tập trung chủ yếu ở Châu Á và Châu Âu. Ngoài thiệt hại về kinh tế do bệnh gây ra, theo thống kê số người bị nhiễm cúm gia cầm H5N1 của các nước báo cáo với Tổ chức Y tế thế giới (WHO) từ tháng 12/2003 ñến tháng 6/2008, ñã có tới 385 trường hợp mắc cúm A/H5N1, trong ñó có 243 trường hợp ñã tử vong chiếm 63,11%. Trong ñó, Việt Nam và Indonesia là 2 nước có số người tử vong và nhiễm cao nhất do vi rút cúm A/H5N1 trên thế giới (Indonesia có số người tử vong do nhiễm cúm gia cầm 110/135 người; Việt Nam 52/106 người). 2.3.2. Tình hình dịch cúm gia cầm ở Việt Nam Cuối năm 2003, dịch cúm gia cầm phát ra tại trại gà giống của Công ty C.P (Thái Lan) ở xã Thuỷ Xuân Tiên, huyện Chương Mỹ, tỉnh Hà Tây gây ốm, chết 8.000 gà trong 4 ngày. Ngày 02/01/2004, Công ty ñã tiến hành tiêu huỷ 107.000 gà (Trần Hữu Cổn, Bùi Quang Anh, 2004) [7]. Dịch ñã nhanh chóng lây lan ra hầu hết các tỉnh trong cả nước. ðể thuận lợi cho việc ñánh giá về dịch tễ học có thể chia quá trình dịch từ khi xuất hiện vào cuối năm 2003 ñến nay thành 5 ñợt dịch như sau: * ðợt dịch thứ nhất: Từ tháng 12/2003 ñến 30/3/2004: Cuối tháng 12 năm 2003, dịch cúm gia cầm thể ñộc lực cao với tác nhân gây bệnh là vi rút cúm gia cầm H5N1 xảy ra ở Việt Nam. ðây là lần ñầu tiên bệnh xuất hiện tại Việt Nam và vì thế nó có thể ñược coi là một bệnh mới ở gia cầm. ðặc ñiểm của ñợt dịch thứ nhất này là dịch lây lan một cách nhanh chóng với nhiều ổ bệnh xuất hiện cùng một lúc ở nhiều ñịa phương khác nhau ñã gây thiệt hại Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………10 lớn cho người chăn nuôi gia cầm. Ngay cả các trại gia cầm nằm ở những vùng không có dịch cũng gặp phải những khó khăn trong việc duy trì ñàn gia cầm dẫn ñến việc phải tiêu hủy. Chỉ trong vòng 2 tháng, ñến ngày 27/02/2004 dịch ñã xuất hiện ở 2.574 xã, phường (chiếm 24,6%) thuộc 381 huyện, quận, thị xã (chiếm 60%) của 57 tỉnh, thành phố trong cả nước. Tổng số gia cầm bị mắc bệnh, chết và tiêu hủy hơn 43,9 triệu con chiếm 16,8% tổng ñàn, trong ñó gà 30,4 triệu con; thủy cầm 13,5 triệu con. Ngoài ra còn có 14,76 triệu con chim cút và các loại chim khác bị chết và bị tiêu huỷ. Theo thống kê cho ñến cuối ñợt dịch, ñồng bằng sông Hồng và ñồng bằng sông Cửu Long là những khu vực có tỷ lệ số xã có gia cầm bị mắc bệnh cao nhất (Cục Thú y, 2004) [4]. * ðợt dịch thứ hai từ tháng 4 ñến tháng 11 năm 2004: Dịch cúm gia cầm thể ñộc lực cao ñã tái xuất hiện vào giữa tháng 4 năm 2004 ở một số tỉnh thuộc ðồng bằng sông Cửu Long. Bệnh chủ yếu xuất hiện ở các hộ chăn nuôi nhỏ lẻ và hầu như không có trại chăn nuôi qui mô lớn nào bị nhiễm bệnh. Dịch có khuynh hướng xuất hiện ở những vùng có chăn nuôi nhiều thủy cầm. Dịch ñã xảy ra ở 46 xã phường của 32 quận, huyện, thị xã thuộc 17 tỉnh. Thời gian cao ñiểm nhất là tháng 7 sau ñó giảm dần, ñến tháng 11 cả nước chỉ có 1 ñiểm phát dịch. Tổng số gia cầm bị tiêu huỷ trong thời gian này là 84.078 con, trong ñó có 55.999 gà, 8.132 vịt và 19.947 chim cút. (Bùi Quang Anh, 2005) [3] * ðợt dịch thứ 3 từ tháng 12/2004 ñến tháng 5/2005: Trong thời gian này dịch ñã xuất hiện ở 670 xã của 182 huyện thuộc 36 tỉnh, thành phố (15 tỉnh phía Bắc, 21 tỉnh phía Nam). Dịch xuất hiện nhiều nhất vào tháng 1/2005 với 143 ổ dịch xảy ra trên 31 tỉnh thành phố, số gia cầm tiêu hủy là 470.495 gà, 825.689 vịt, ngan và 551.029 chim cút. Bệnh xuất hiện ở tất cả các tỉnh, thành phố thuộc vùng ðồng bằng sông Cửu Long (Hội nghị Tổng kết 2 năm phòng chống dịch cúm gà, 2005) [1]. * ðợt dịch thứ 4 từ 01/10/2005 ñến 15/12/2005: Dịch tái phát ở 285 xã, phường, thị trấn thuộc 100 quận, huyện của 24 tỉnh, thành phố. Số gia cầm Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………11 ốm, chết và tiêu hủy là 3.735.620 con, trong ñó có 1.245.282 gà; 2.005.557 vịt; 484.781 chim cút, bồ câu, chim cảnh. Diễn biến của ñợt dịch thứ 4 khá phức tạp ñã khiến nhiều ñịa phương phải áp dụng các biện pháp quyết liệt như ñề nghị phải tiêu diệt toàn bộ thuỷ cầm thả rông , ñóng cửa rừng, ñóng cửa các vườn chim, không nuôi gia cầm, chim cảnh trong nội thành. Trong nỗ lực phấn ñấu ñến năm 2006 không còn dịch cúm gia cầm Bộ NN&PTNT ñã ban hành lệnh cấm ấp mới thuỷ cầm ñến hết tháng 2 năm 2007. * ðợt dịch thứ 5: Sau hơn một năm tạm lắng, cúm gia cầm lại xuất hiện trở lại Việt Nam vào cuối tháng 12 năm 2006. Dịch bắt ñầu nổ ra tại hai tỉnh Cà Mau và Bạc Liêu rồi nhanh chóng lan sang các tỉnh khác trong cả nước. Theo Cục Thú y (Bộ NN và PTNT) tính ñến ngày 6/2/2007 dịch cúm gia cầm ñang xảy ra ở 41 xã, phường, 18 huyện, thị thuộc 8 tỉnh chưa qua 21 ngày là Cà Mau, Bạc Liêu, Hậu Giang, Vĩnh Long, Kiên Giang, Trà Vinh, Sóc Trăng và Cần Thơ. Tổng số gia cầm mắc bệnh và chết là gần 19.000 con . Tại Hội nghị sơ kết “Công tác phòng chống dịch bệnh gia súc, gia cầm và thuỷ sản” Hà Nội, ngày 26/8/2008 cho biết: Từ ñầu năm 2008, cả nước xuất hiện dịch cúm gia cầm tại 96 hộ gia ñình của 74 xã, thuộc 51 huyện, quận, thị xã của 27 tỉnh, thành phố gồm: Tổng số gia cầm chết và buộc phải tiêu huỷ là 75.170 con (gồm 29.048 gà, 43.157 vịt và 2.965 ngan). Như vậy, ở nước ta dịch cúm gia cầm xảy ra vào cuối năm 2003 ñầu năm 2004 là dịch cúm ñầu tiên xuất hiện tại Việt Nam nên sự nghiên cứu về bệnh còn chưa sâu. ðể xác ñịnh chủng vi rút gây bệnh, chính phủ ñã gửi mẫu bệnh phẩm sang Trung tâm kiểm soát dịch bệnh (CDC) của Hoa Kỳ ñể xác ñịnh loại protein N và ñã xác ñịnh ñược vi rút gây bệnh trên ñàn gia cầm là H5N1. Trong tiếng chuông cảnh báo của dịch cúm gia cầm ở Hồng Kông ý thức ñược khả năng lây lan của vi rút cúm trong cơ chế kinh tế mở, Viện Thú y quốc gia ñã chủ ñộng quan hệ với Trung tâm kiểm soát dịch bệnh Hoa Kỳ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………12 (CDC) nhằm tạo cơ sở cho sự hỗ trợ kỹ thuật phát hiện vi rút H5N1, phân lập và tập huấn kỹ thuật ñể Viện Thú y có thể chủ ñộng thực hiện những phương pháp kỹ thuật vi rút học này tại Việt Nam. Nhờ ñó ñến cuối tháng 8/2003, Viện ñã có ñủ khả năng về con người và vật liệu ñể xác ñịnh chủng H5 vi rút cúm gia cầm ñồng thời ñịnh ñược type A KN N1 của chủng cúm gia cầm gây bệnh Việt Nam, nhưng tí._.nh biến chủng của vi rút H5N1 và ñưa ra giải pháp công nghệ phòng chống bệnh cúm gia cầm trong thời gian tới. Khi phân tích trình tự nucleotide 8 ñoạn RNA của 9 chủng vi rút cúm H5N1 ñược phân lập từ người, chim cút, gà và vịt trong ñợt dịch cuối năm 2003 ñầu 2004 và lập cây phả hệ của chúng (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004) [8] ñã kết luận rằng: - Các chủng vi rút cúm H5N1 lưu hành ở Việt Nam ñều giống nhau và có cùng nguồn gốc. - Mặc dù chưa biết nguồn gốc của 2 ñoạn M và NP, các ñoạn gen của vi rút ñều ñã ñược phát hiện và công bố ở Trung Quốc trước khi xảy ra dịch ở nước ta. Như vậy, có thể kết luận rằng vi rút cúm H5N1 ở Việt Nam có nguồn gốc từ Trung Quốc và vi rút lưu hành ở nước ta chỉ có một loại xuất phát từ một ổ dịch ban ñầu (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004) [8]. Việc vi rút này ñược ñưa vào Việt Nam theo con ñường nào chưa ñược xác ñịnh chính xác nhưng có giả thuyết cho rằng việc vận chuyển lậu gà bị nhiễm từ nước ngoài vào nước ta là một trong các nguyên nhân gây ra dịch. Ngoài ra, với ñặc ñiểm khí hậu ấm áp và có nhiều sông ngòi, các loài chim và thủy cầm di cư thường xuyên ra vào Việt Nam và chúng cũng có thể là tác nhân truyền bệnh cơ giới. 2.4. LƯU HÀNH BỆNH 2.4.1. Danh pháp Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) qui ñịnh thống nhất lưu trữ hệ gene của các chủng vi rút cúm A theo danh pháp dựa trên cơ sở khác nhau của hai Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………13 protein HA và NA bề mặt của vi rút, ñó là những protein chính ñặc trưng của vỏ vi rút (MPC- Major Protein Capsid) thể hiện bản chất của mỗi chủng vi rút cúm A. Với 16 phân nhóm HA và 9 phân nhóm NA có thể sẽ tạo nên ñược 144 tổ hợp các chủng vi rút cúm A khác nhau, theo thứ tự kí hiệu: Tên Serotype/Loài ñộng vật bị nhiễm/Vùng ñịa lí phân lập/Số hiệu ñăng kí của chủng vi rút/Thời gian phân lập/Loại hình phân type[HA(H) và NA(N)]. Ví dụ: Vi rút cúm có kí hiệu: A/Chicken/Vietnam/TY31/05/H5N1, có nghĩa là: Vi rút cúm nhóm A, ñối tượng bị nhiễm là gà, nơi phân lập Việt Nam, số hiệu ñăng kí TY31, năm phân lập 2005, phân type H5N1 (Lê Thanh Hoà, 2004) [12]. Với các vi rút cúm phân lập ñược ở người bị nhiễm người ta bỏ ñi phần loài ñộng vật bị nhiễm trong danh pháp (Hình1). Hình 1: Sơ ñồ danh pháp quốc tế các chủng vi rút cúm A (Vi rút type: Chủng vi rút; Geographic origin: Vùng ñịa lí phân lập; Strain number: số hiệu chủng vi rút; Year of isolation: Năm phân lập; Vi rút suptype: phân type kháng nguyên HA và NA của vi rút) 2.4.2. Phân bố dịch bệnh Vi rút cúm gia cầm phân bố khắp trên thế giới trong các loài gia cầm, dã cầm và ñộng vật có vú. Sự phân bố và lưu hành của vi rút cúm gia cầm rất khó xác ñịnh chính xác. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………14 Sự phân bố bị ảnh hưởng của cả loài vật nuôi và hoang dã, tập quán chăn nuôi gia cầm, ñường di trú của dã cầm, mùa vụ và hệ thống báo cáo dịch bệnh. Sự lưu hành cũng bị ảnh hưởng của những nguyên nhân tương tự và sự khác nhau của các quốc gia về hệ thống, phương pháp nghiên cứu. Ví dụ: Ở gà tây tại Minnesota, Mỹ thì sự lưu hành bệnh rất cao trong vài năm nhưng sau ñó bệnh gần như không tồn tại, nguyên nhân không phải do miễn dịch ñàn ñược kéo dài, hoặc không có vi rút mà thực tế không giải thích ñược. Sự phân bố và lưu hành vi rút cúm gia cầm ñã xảy ra trong phạm vi toàn cầu do sự di trú của các dã cầm, do ñó rất khó dự ñoán khi nào vi rút xuất hiện, gây thành dịch cho ñàn gia cầm nuôi và việc ngăn chặn sự tiếp xúc giữa các loài gia cầm nuôi có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển chăn nuôi gia cầm (Phạm Sỹ Lăng, 2004) [14]. 2.4.3. ðộng vật cảm nhiễm Tất cả các loài chim thuần dưỡng (gia cầm) hoặc hoang dã (ñặc biệt các loài thuỷ cầm di cư) ñều mẫn cảm vi rút. Bệnh thường phát hiện khi lây nhiễm cho gia cầm (gà, vịt, gà tây, chim cút). Phần lớn các loài gia cầm non ñều mẫn cảm với vi rút cúm type A. Vi rút cúm của loài chim có thể gây bệnh cho các loài ñộng vật có vú (lợn, ngựa...) và cả con người. Vi rút cúm type A phân bố trong hầu như tất cả các loài chim và ñộng vật có vú từ loài sống trên cạn ñến loài sống dưới nước (cá voi, hải cẩu...). Lợn mắc bệnh cúm thường do subtype H1N1, H3N3. Vịt nuôi cũng bị nhiễm vi rút cúm nhưng ít phát hiện do vịt có sức ñề kháng với vi rút gây bệnh kể cả chủng có ñộc cao gây bệnh nặng cho gà, gà tây. 2.4.4. ðộng vật mang vi rút Vi rút cúm ñã phân lập ñược ở hầu hết các loài chim hoang dã như vịt trời, thiên nga, hải âu, mòng biển, vẹt, vẹt ñuôi dài, vẹt mào, chim thuộc họ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………15 sẻ, diều hâu. Tần suất và số lượng vi rút phân lập ñược ở thủy cầm (ñặc biệt vịt trời) ñều cao hơn các loài khác (Bùi Quang Anh, Văn ðăng Kỳ, 2004) [2]. Kết quả ñiều tra thuỷ cầm di trú ở Bắc Mỹ cho thấy trên 60% chim non mang vi rút do tập hợp ñàn trước khi di trú. Trong các loài thuỷ cầm di trú thì vịt trời có tỷ lệ bị nhiễm vi rút cao hơn các nhóm khác. Khi nghiên cứu sự lưu hành của vi rút cúm gia cầm ở khu vực ñồng bằng sông Hồng và sông Cửu Long (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2005; Nguyễn Tiến Dũng, ðào Thanh Vân và cs, 2005) [10], [11] phát hiện thấy vịt nuôi là con vật mang trùng và gây bệnh trong khu vực châu thổ ñồng bằng sông Hồng và sông Cửu Long; chính ñàn vịt thuần hoá là nơi lưu giữ vi rút cúm gia cầm và gây ra dịch ñịa phương sau khi ñợt dịch lần thứ nhất kết thúc. 2.4.5. Sự truyền lây Khi gia cầm bị nhiễm vi rút cúm, vi rút ñược nhân lên trong ñường hô hấp và ñường tiêu hoá. Sự truyền lây bệnh ñược thực hiện theo hai phương thức là trực tiếp và gián tiếp. Lây trực tiếp do con vật mẫn cảm tiếp xúc với con vật mắc bệnh thông qua các hạt khí dung ñược bài tiết từ ñường hô hấp hoặc qua phân, thức ăn và nước uống bị nhiễm. Theo các tổ chức WHO và FAO thì con người có nguy cơ lây nhiễm vi rút cúm gia cầm cao nhất là do tiếp xúc trực tiếp với gia cầm bị bệnh trong quá trình bắt và giết mổ. Lây gián tiếp qua các hạt khí dung trong không khí với khoảng cách gần hoặc những dụng cụ chứa vi rút do gia cầm mắc bệnh bài thải qua phân hoặc lây qua chim, thú, thức ăn, nước uống, lồng nhốt, quần áo, xe vận chuyển... ðây là phương thức lây truyền chủ yếu. Như vậy vi rút cúm dễ dàng lây truyền tới những vùng khác do con người, phương tiện vận chuyển, dụng cụ chăn nuôi...ðối với các vi rút gây bệnh cúm truyền nhiễm cao ở gia cầm thì sự truyền lây chủ yếu qua phân, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………16 ñường miệng. Chu kỳ bệnh cúm gia cầm trong loài chim và từ loài chim sang người ðối với gia cầm nuôi, nguồn dịch bùng phát thường thấy là: + Từ các loài gia cầm nuôi khác nhau ở trong cùng một trang trại hoặc trang trại khác liền kề như vịt lây sang gà hoặc từ gà tây lây sang gà, gà nhật lây sang gà lôi. + Từ gia cầm nhập khẩu. + Từ chim di trú: ñặc biệt là thuỷ cầm, vai trò của thuỷ cầm trong ổ dịch là: tỷ lệ lưu hành bệnh cao hơn ñối với các ñàn gia cầm nuôi nhốt trong các ñiều kiện phơi nhiễm như: gà tây ñược nuôi trong các trang trại, vịt ñược nuôi vỗ béo tại các cánh ñồng gần trại. Các ổ dịch cúm ở các khu vực có nguy cơ cao thường xuất hiện theo mùa cùng lúc với các hoạt ñộng di trú của thuỷ cầm. Phần lớn các ổ dịch ñều ghi nhận có sự tiếp xúc với thuỷ cầm tại ñiểm phát dịch ñầu tiên. + Từ người và các ñộng vật có vú khác. Phần lớn các ổ dịch cúm gia cầm gần ñây ñã có sự lây lan thứ cấp thông qua con người. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………17 2.5. ðẶC ðIỂM SINH HỌC CỦA VI RÚT CÚM TYPE A 2.5.1. ðặc ñiểm cấu trúc chung của vi rút thuộc họ Orthomyxoviridae Họ Orthomyxoviridae gồm có 4 nhóm vi rút là: + Nhóm vi rút cúm A: Gây bệnh cho mọi loài chim, một số ñộng vật có vú và cả con người. + Nhóm vi rút cúm B: Chỉ gây bệnh cho người. + Nhóm vi rút cúm C: Gây bệnh cho người, lợn. + Nhóm Thogotovi rút. Vi rút thuộc họ Orthomyxoviridae có ñặc tính cấu trúc chung là hệ gen chứa axit Ribonucleic (ARN) một sợi, có cấu trúc là sợi âm ñược ký hiệu là ss(-) ARN (Negative Single Stranded RNA). Sợi âm ARN của hệ gen có ñộ dài từ 10.000 - 15.000 nucleotit (tùy loại vi rút), mặc dù nối với nhau thành 1 sợi ARN liên tục, nhưng hệ gen lại chia thành 6 - 8 phân ñoạn (segment), mỗi phân ñoạn là một gen chịu trách nhiệm mã hóa cho mỗi loại protein của vi rút (Lê Thanh Hoà, 2004; Muphy. B. R and R. G Webter, 1996) [12], [42]. Hạt vi rút (virion) có cấu trúc hình khối, ñôi khi có dạng hình khối kéo dài, ñường kính khoảng 80 - 120 nm. Vỏ vi rút có bản chất protein có nguồn gốc từ nguồn tế bào mà vi rút ñã gây nhiễm, bao gồm một số protein ñược glycosyl hóa (glycoprotein) và một số protein dạng trần không ñược glycosyl hóa (non glycosylated protein). Protein bề mặt có cấu trúc từ các loại glycoprotein, ñó là những gai, mấu có ñộ dài 10 - 14 nm, ñường kính 4 - 6 nm. Nucleocapsid bao bọc lấy nhân vi rút là tập hợp của nhiều protein phân ñoạn, cấu trúc ñối xứng xoắn, kích thước 130 - 150 nm, tạo vòm (loop) ở giới hạn cuối của mỗi phân ñoạn và liên kết với nhau qua cầu nối các peptit. Phân tử lượng của hạt vi rút vào khoảng 250 triệu dalton (Lê Thanh Hoà, 2004; Muphy. B. R and R. G Webter, 1996) [12], [42]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………18 2.5.2. ðặc ñiểm hình thái, cấu trúc của vi rút cúm type A Vi rút cúm gà có tên khoa học là influenza vi rút, thuộc họ Orthomyxovi rút, là họ vi rút ña hình thái, có vỏ ngoài, genom là ARN ñơn, (-), phân ñoạn. Trước ñây, các vi rút Orthomyxo và Paramyxo ñều ñược xếp chung vào một họ là Myxoviridae do chúng có cấu trúc và khả năng lây bệnh giống nhau, nhưng về sau ñược tách thành 2 họ riêng là Orthomyxoviridae và Paramyxoviridae do phát hiện thấy chúng có nhiều ñặc ñiểm cơ bản không giống nhau. Chữ myxo có nghĩa là chất nhầy, nguồn gốc của từ này là do phần ngoài cùng của protein của vi rút có mang các loại ñường và phần ngọn của các mạch nối ñường chính là một loại acid: acid sialic hay còn gọi là acid neuraminidic. Ortho có nghĩa là chính thống, nói lên loại myxo vi rút ñược phát hiện và ñặt tên trước. Vi rút cúm gia cầm có kích thước trung bình, ñường kính 80 – 120 nm, trọng lượng phân tử 4,6 – 6,4 daltong, trên kính hiển vi ñiện tử tương phản âm có dạng gần như hình cầu hoặc các hạt mỏng, một số ít vi rút có dạng hình sợi có thể dài một vài nm, có vỏ bọc là lớp lipid có gắn các glycoprotein gây ngưng kết hồng cầu (kháng nguyên bề mặt) – Haemagglutinin (viết tắt là H) và protein enzim có thụ thể – Neuraminidae (viết tắt N) ñây là những kháng nguyên có vai trò quan trọng trong miễn dịch bảo hộ và có tính ña dạng cao (Alexander D.J, 1996; Capua I. &. Marrangon S, 2000) [22], [25]. Hình thái vi cấu trúc của căn nguyên bệnh ñược Kawaoka 1988, và Muphy mô tả chi tiết và nhấn mạnh rằng ARN của vi rút là một sợi ñơn, âm chia 8 ñoạn kế tiếp nhau mang 10 ORF (open reading frames) cho 10 loại virion protein khác nhau: HA, NA, NP, M1, M2, PB1, PB2 ,PA, NS1 và NS2 tất cả 8 ñoạn của sợi ARN có thể tách và phân biệt rõ ràng thông qua phương pháp ñiện di, các protein có vỏ bọc nhân nối 8 ñoạn này với nhau, ñược bọc bên ngoài bằng các protein và có màng lipip ở ngoài cùng (Alexander D.J, 1993; WHO Expert committee, 1980) [21], [47]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………19 Protein hemagglutinine hay HA là một glycoprotein dưới dạng trimer. Mỗi monomer gồm có 2 phần HA1 và HA2. Hai phần của protein này ñược nối với nhau bằng một chuỗi các acid amin trong ñó có arginin. Tại vị trí này các men cắt protein có sẵn trong cơ thể (trên các màng niêm mạc) của ký chủ sẽ cắt HA ra làm ñôi, tạo ñiều kiện cho vi rút bám vào thụ thể của tế bào ký chủ. Do vậy ñoạn này ñược gọi là cleavage site của HA. Do các enzym protease chỉ cắt protein tại các acid amin basic nên nếu vị trí này càng nhiều acid amin basic thì khả năng bị cắt ñôi của HA lại càng cao dẫn ñến khả năng ñể vi rút bám vào thụ thể tế bào và bắt ñầu quá trình xâm nhập vào tế bào càng lớn. Dựa trên cơ sở này người ta ñã phân loại vi rút có ñộc lực cao là loại vi rút cúm có nhiều acid amin basic tại vị trí cleavage site và ngược lại. Protein NA chính là một loại enzym có tên là neuraminidase. Khi vi rút xâm nhập vào cơ thể, các mạch ñường của protein HA và thụ thể của tế bào sẽ liên kết với nhau, gắn vi rút vào bề mặt tế bào. Sau ñó nhờ neuraminidase cắt mối liên kết này ñi làm cho vi rút có thể vào bên trong, sau khi HA ñược cắt ñôi, hoặc nếu không như vậy, vi rút sẽ bị rời ra khỏi tế bào. (A) (B) Hình 2: Cấu tạo vi rút cúm gia cầm Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………20 (A: Mô hình cấu tạo vi rút cúm A. Hemagglutinine: phân tử kháng nguyên HA, Neuraminidase: phân tử kháng nguyên NA, Capsid: vỏ vi rút, Lipid enverlope: lớp màng bao lipid, RNA: Hệ gene vi rút. B: Ảnh chụp các tiểu phần vi rút cúm A dưới kính hiển vi ñiện tử truyền quang Thành phần hoá học của vi rút ARN của vi rút chiếm 0.8 - 1.1%; protein chiếm 70 - 75%; lipit chiếm 20 - 24%; hydratcacbon chiếm 5 - 8% khối lượng hạt vi rút. Lipit tập trung ở màng vi rút và chủ yếu là lipit có gốc phospho, số còn lại là cholesterol, glucolipit và một ít hydrocacbon gồm các loại men galactose, ribose, fructose, glucosamin. Thành phần chính protein của vi rút chủ yếu là glycoprotein (Lê Văn Năm, 2004) [16]. 2.5.3. Cấu tạo acid nhân RNA của vi rút là một sợi âm ở dạng ñơn bao gồm 8 ñoạn khác nhau (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS) mã hoá cho 10 loại protein khác nhau: PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M1, M2, NS1 và NS2 (B. C. Easterday, 1997) [24]. ðoạn ARN có trọng lượng nhỏ nhất mã hoá cho 2 loại không có cấu trúc protein là NS1 và NS2, chúng dễ dàng tách ñược ở các tế bào bị nhiễm. Các ñầu 5’ và 3’ của hệ gen chứa những chuỗi nucleotit bảo tồn về thành phần có chức năng là promotor khởi ñộng sao chép của hệ gen vi rút. Tất cả 8 ñoạn của sợi ARN có thể tách và phân biệt dễ dàng qua phương pháp ñiện di. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………21 (hemagglutinin)(neuraminidase) RNA polymerase Hình 3: Mô hình cấu trúc của vi rút cúm A H5N1 (A) (B) HA1 HA2 Hình 4: Mô hình cấu trúc kháng nguyên HA của vi rút cúm A (A: Cấu trúc không gian một ñơn phân của phân tử HA, hai dưới ñơn vị HA1 và HA2. B: Cấu trúc phân tử kháng nguyên HA gắn trên bề mặt vỏ vi rút. Lipid bilayer of envelope: lớp lipid kép của vỏ vi rút, Receptor site: Vị trí gắn kháng nguyên HA với thụ thể bề mặt tế bào nhiễm, 4 major antigenic variable regions: 4 vùng biến ñổi kháng nguyên chính của một ñơn phân HA). 2.5.4. Quá trình nhân lên Kingsbury [37], Fener và cộng sự [28] mô tả quá trình sinh sản của vi Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………22 rút ñược tóm tắt như sau: Vi rút ñược hấp thụ vào bề mặt tế bào nhờ có receptor mà bản chất là glycoprotein chứa axit sialic, sau ñó vi rút chui qua màng tế bào nhờ một loại men ñặc biệt ñể vào trong nguyên sinh chất và nhân tế bào. Tại ñây vi rút sinh trưởng nhanh chóng và thực hiện quá trình sao chép. Hình 4 : Sơ ñồ mô tả sự nhân lên của vi rút cúm Sự xâm nhập của vi rút vào tế bào nhờ protein HA thông qua hiện tượng ẩm bào với cơ chế tiếp hợp thụ thể có sự tham gia của men peptidase. Sau khi xâm nhập vào tế bào, nucleocapsit của vi rút ñược chuyển vận vào nhân của tế bào chuẩn bị quá trình tổng hợp RNA của vi rút. Hệ thống gen của vi rút sao chép các mRNA. ðể tổng hợp mRNA các phân ñoạn RNA của vi rút phải ñược “mũ hóa” (capping) ở vị trí 10 – 13 ñầu 5’, nguyên liệu ñể mũ hóa ñược lấy từ RNA của tế bào nhờ hoạt tính enzym PB2 của vi rút. Sự tổng hợp của mRNA ñặc hiệu của vi rút có thể bị kìm hãm bằng actinomycin D hoặc các hợp chất amanitin (Các hợp chất này phong tỏa sự tạo thành RNA phụ thuộc DNA của tế bào, ngăn cản enzym PB2 của vi rút không thực hiện ñược sự mũ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………23 hóa tạo nên các primer tổng hợp mRNA của vi rút). Các mRNA của vi rút ñược Adenyl hóa ở ñầu 3’. Hầu hết các loại protein của vi rút (H, N, M2) sau khi ñược tổng hợp ở nguyên sinh chất thì ở luôn tại ñó, còn NS1, NP, M1 ñược chuyển vào nhân ñể bao bọc các RNA của hệ gen mới ñược tổng hợp rồi chuyển chúng ra ngoài nguyên sinh chất ñể lắp ráp tạo thành virion vi rút mới. Từ một sợi âm ñơn ban ñầu, một sợi dương hoàn chỉnh ñược tạo ra theo nguyên tắc bổ sung. Sợi dương mới này chính là khuôn ñể tổng hợp sợi âm (vi rút cúm A mới). Thực sự chúng ta vẫn chưa hiểu biết rõ ràng vi rút cúm giết chết tế bào vật chủ như thế nào. Theo Hinshaw [31] thì các tế bào trong môi trường nuôi cấy bị phá huỷ theo phương thức apoptosis. 2.5.5. ðặc tính kháng nguyên của vi rút cúm type A Các loại kháng nguyên ñược nghiên cứu nhiều nhất là protein nhân (Nucleoprotein, NP), protein ñệm (matrix protein, M1), protein gây ngưng kết hồng cầu (Hemagglutinin, HA) và protein enzim cắt thụ thể (Neuraminidase, NA). NP và M1 là protein thuộc loại hình kháng nguyên ñặc hiệu nhóm (genus - specific antigen), ký hiệu là gs kháng nguyên; HA và NA là protein thuộc loại hình kháng nguyên ñặc hiệu type và dưới type (type - specific antigen), ký hiệu là ts kháng nguyên. Vi rút cúm type A có ñặc ñiểm ñặc trưng là chúng thường có ñột biến gen dẫn ñến sự biến ñổi liên tục về tính kháng nguyên. Vậy chúng thay ñổi như thế nào? Theo Ito và Kawaoka (1998), Horimoto T and Kawaoka Y (2001) [29], [32], sự phức tạp trong diễn biến kháng nguyên của vi rút cúm là sự biến ñổi và trao ñổi trong nội bộ gen dẫn ñến sự biến ñổi liên tục về tính kháng nguyên. Có 2 cách biến ñổi kháng nguyên của vi rút cúm: + ðột biến ñiểm (ñột biến ngẫu nhiên hay hiện tượng trôi trượt, lệch lạc về kháng nguyên - Antigenic drift): Trong nhiều trường hợp, các phân tử kháng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………24 nguyên này vẫn có chức năng của kháng nguyên, nhưng chúng có thể thay ñổi ñến mức hệ thống miễn dịch của cơ thể không nhận ra chúng trong một thời gian nhất ñịnh. Vi rút lợi dụng thời gian này ñể lây nhiễm (Kida, H., Y. Kawaoka, 1987) [38]. ðây là kiểu ñột biến xảy ra liên tục thường xuyên trong quá trình tồn tại của vi rút mà bản chất là do có sự thay ñổi nhỏ về trình tự nucleotit của gen mã hóa, ñặc biệt ñối với kháng nguyên H và kháng nguyên N. Kết quả là tạo ra các phân type cúm hoàn toàn mới có tính thích ứng loài vật chủ khác nhau và mức ñộ ñộc lực gây bệnh khác nhau. Chính nhờ sự biến ñổi này mà vi rút cúm A tạo nên 16 biến thể gen HA (H1- H16) và 9 kháng nguyên N (N1 - N9) (Cục thú y, 2005) [5]. Chu kỳ của bệnh cúm hàng năm phụ thuộc sự kết hợp của tốc ñộ biến ñổi, thời gian ủ bệnh và sự biến ñổi theo mùa của khí hậu. + ðột biến tái tổ hợp di truyền (hiện tượng thay ca - antigenic Shift): Hiện tượng tái tổ hợp gen ít xảy ra hơn so với hiện tượng ñột biến ñiểm. Một số chủng vi rút chỉ gây bệnh cho gia cầm mà không gây bệnh cho người (Franklin, R. M. and E. Wecker, 1950; Hinshaw, V.S, 1981; Kawaoka.Y, 1991; Katz JM, Lu X, 2000) [27], [30], [34], [35]. Một số chủng khác lại chỉ gây bệnh cho người mà không gây bệnh cho gia cầm. Trong một số trường hợp, cả vi rút cúm người và vi rút cúm gia cầm có thể cùng nhiễm vào ñộng vật thứ 3, như lợn chẳng hạn. Hiện tượng tượng tái tổ hợp gen chỉ xảy ra khi 2 hoặc nhiều loại vi rút cúm khác nhau cùng nhiễm vào một tế bào chủ do sự trộn lẫn 2 bộ gen của vi rút. ðột biến này là sự tổ hợp di truyền xảy ra ñịnh kỳ trong ñó có sự sắp xếp lại các nucleotit do sự trộn lẫn 2 bộ gen của vi rút cúm khác nhau. ðiều ñó ñã tạo nên những sai khác cơ bản về bộ gen của vi rút ñời con so với vi rút bố mẹ. Khi nhiều vi rút khác nhau cùng xâm nhiễm vào một tế bào chủ, các thế hệ vi rút ñược sinh ra sau ñó có thể ñược sinh ra từ sự tái tổ hợp của các gen bố mẹ xuất phát từ nhiều vi rút khác nhau. Do hạt vi rút cúm A có cấu trúc là 8 ñoạn gen nên về lý thuyết từ 2 vi rút có thể xuất hiện Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………25 256 kiểu tổ hợp của vi rút thế hệ sau (Cục Thú y, 2004) [4]. Khi hiện tượng tái tổ hợp gen xuất hiện có thể sẽ gây ra các vụ dịch lớn cho người và ñộng vật với mức ñộ nguy hiểm không thể lường trước ñược. Vụ dịch năm 1918 - 1819 làm chết 40 - 50 triệu người mà tác nhân gây bệnh là vi rút H1N1 từ lợn lây sang người kết hợp với vi rút cúm người tạo ra chủng vi rút mới có ñộc lực rất mạnh (Phạm Sĩ Lăng, 2004) [13]. Khi nghiên cứu về ñặc tính kháng nguyên của vi rút cúm thấy giữa các biến thể tái tổ hợp và biến chủng subtype về huyết thanh học không hoặc rất ít có phản ứng chéo. ðây là ñiểm trở ngại lớn cho việc nghiên cứu nhằm tạo ra vắc xin cúm ñể phòng bệnh cho người và ñộng vật (Ito. T, J. N. Couceiro, 1998; Kawaoka. Y, 1991) [33], [ 42]. Trên thực tế, các nhà khoa học ñã phát hiện vi rút cúm có thể nhanh chóng trao ñổi nhiều gen cùng một lúc ñể tạo ra các chủng mới, kháng thuốc chứ không phải trao ñổi dần dần từ mùa cúm này sang mùa cúm khác. Khi phân tích 156 chủng vi rút cúm A lưu hành trong thời kỳ 1999 - 2004 tại New York, các nhà khoa học ñã phát hiện một số chủng thay ñổi ít nhất 4 lần trong một thời gian ngắn. ðiều ñó cho thấy các chủng vi rút cúm có thể biến ñổi lớn trong mỗi mùa, gây khó khăn lớn cho công tác phòng trị. Khi nghiên cứu di truyền học của vi rút H5N1 các nhà khoa học của Việt Nam cũng nhận thấy chúng có nhiều thay ñổi. Trong các ñàn vịt nuôi của Việt Nam không chỉ có H5N1 mà còn có nhiều loại vi rút cúm gia cầm khác như H3, H4, H7, H8, H9 và H11 (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2005; Nguyễn Tiến Dũng, ðào Thanh Vân và cs, 2005) [10], [11]. Khi xâm nhập nhiễm vào cơ thể ñộng vật, vi rút cúm A kích thích cơ thể sản sinh ra kháng thể ñặc hiệu, trong ñó quan trọng hơn cả là kháng thể kháng HA, chỉ có kháng thể này mới có vai trò trung hòa vi rút cho bảo hộ miễn dịch. Một số kháng thể khác có tác dụng kìm hãm sự nhân lên của vi rút, kháng thể kháng M2 ngăn cản chức năng M2 không cho quá trình bao gói vi rút xảy ra Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………26 (Lu. X, T. M. Tumpey, 1999; Seo. S and R. G Webter, 2001) [40], [44]. Kết quả trên cho thấy chúng ta cần giám sát các chủng vi rút cúm ñang lưu hành một cách hệ thống và thường xuyên bởi những ñột biến quan trọng có thể xảy ra ñột ngột, bất kỳ thời ñiểm nào. Việc lưu hành nhiều loại vi rút cùng lúc sẽ tạo ñiều kiện cho sự trao ñổi gen của các loại vi rút tạo ra vi rút mới. Gia cầm và các ñộng vật khác (kể cả người) có thể mắc các vi rút cúm biến dị này với hậu quả khó lường. Một ñặc tính quan trọng là vi rút cúm có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của nhiều loài ñộng vật. ðó là sự kết hợp giữa mấu lồi kháng nguyên HA trên bề mặt của vi rút cúm với thụ thể có trên bề mặt hồng cầu, làm cho hồng cầu ngưng kết với nhau tạo thành mạng ngưng kết thông qua cầu nối vi rút, gọi là phản ứng ngưng kết hồng cầu HA (Hemagglutination test) . Kháng thể ñặc hiệu của kháng nguyên HA có khả năng trung hòa các loại vi rút tương ứng, chúng là kháng thể trung hòa có khả năng triệt tiêu vi rút gây bệnh. Nó có thể phong tỏa sự ngưng kết bằng cách kết hợp với kháng nguyên HA. Do vậy thụ thể của hồng cầu không bám vào ñược ñể liên kết tạo thành mạng ngưng kết. Người ta gọi phản ứng ñặc hiệu KN - KT có hồng cầu tham gia là phản ứng ngăn cản ngưng kết hồng cầu HI (Hemagglutination inhibition test). Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) và phản ứng ngăn cản ngưng kết hồng cầu (HI) ñược sử dụng trong chẩn ñoán cúm gia cầm. 2.5.6. ðộc lực của vi rút ðộc lực của vi rút cúm gia cầm có sự dao ñộng lớn, phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trước hết là protein HA. Các nghiên cứu ở mức ñộ phân tử cho thấy khả năng lây nhiễm của vi rút phụ thuộc vào tác ñộng của men proteaza vật chủ ñến sự phá vỡ của liên kết hóa học sau khi dịch mã của phân tử ngưng kết, thực chất là sự cắt rời protein HA thành 2 tiểu phần HA1 và HA2. Tính thụ cảm của Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………27 ngưng kết tố và sự phá vỡ liên kết của men protease lại phụ thuộc vào số lượng các amino axit cơ bản tại ñiểm bắt ñầu phá vỡ các liên kết. Các enzim giống trypsin có khả năng phá vỡ liên kết khi chỉ có một phân tử Arginin, trong khi ñó các enzim protease khác lại cần nhiều amino axit cơ bản. Tại Hội thảo thế giới lần ñầu tiên về bệnh cúm gà 1981, Bankowski và cộng sự thông báo vi rút cúm gà có kháng nguyên bề mặt H7 thuộc loại có ñộc lực cao. Nhưng Pensyvania (Mỹ) ñã chứng kiến trận dịch cúm gà gây chết 75% số gà, khi phân lập vi rút có kháng nguyên bề mặt H5 mà không phải là H7. ðể ñánh giá ñộc lực của vi rút cúm một cách khoa học, các nhà khoa học sử dụng phương pháp gây bệnh cho gà 3 - 6 tuần tuổi bằng cách tiêm tĩnh mạch 0,2 ml nước trứng ñã ñược gây nhiễm vi rút với tỷ lệ pha loãng 1/10, sau ñó ñánh giá mức ñộ nhiễm bệnh của gà ñể cho ñiểm (chỉ số IVPI). ðiểm tối ña là 3 ñiểm và ñó là vi rút có ñộc lực cao nhất. Theo quy ñịnh của Tổ chức Thú y Thế giới (OIE), vi rút nào có chỉ số IVPI từ 1,2 trở lên thuộc loại có ñộc lực cao (Nguyễn Tiến Dũng, 2004; OIE, 1992) [9], [43]. - Vi rút có ñộc lực cao: Nếu sau khi tiêm tĩnh mạch 10 ngày phải làm chết 75 - 100% số gà thực nghiệm. Vi rút gây bệnh cúm gà (có thể là type phụ) phải làm chết 20% số gà mẫn cảm thực nghiệm và phát triển tốt trên tế bào xơ phôi trong môi trường nuôi cấy không có Trypsin. - Vi rút có ñộc lực trung bình: là những chủng vi rút gây dịch cúm gà với triệu chứng lâm sàng rõ rệt nhưng gây chết gà không quá 15% số gà bị nhiễm bệnh tự nhiên hoặc không gây quá 20% số gà mẫn cảm thực nghiệm. - Vi rút có ñộc lực thấp (nhược ñộc): là những vi rút phát triển tốt trong cơ thể gà, có thể gây ra dịch nhưng không có triệu chứng lâm sàng rõ rệt, không tạo ra bệnh tích ñại thể và không làm chết gà. Trong thực tế người ta chia vi rút cúm gà ra làm 2 loại: loại vi rút có ñộc lực thấp - LPAI (Light Pathogenic Avian Influenza) và loại vi rút có ñộc Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………28 lực cao - HPAI (Highly Pathgennic Avian Influenza). Các vụ dịch lớn ñều do vi rút HPAI gây ra thường là vi rút có kháng nguyên H5, H7 và H9. Riêng H5 và H7 thông thường bắt nguồn từ vi rút ñộc lực thấp, sau quá trình lây truyền trên gà và chim cút ñộc lực tăng lên rất nhanh và gây ra các vụ dịch lớn. 2.5.7. Sức ñề kháng của vi rút cúm Vi rút không bền vững với nhiệt ñộ, ở 56 – 600C chỉ vài phút vi rút mất ñộc lực. Tuy nhiên vi rút tồn tại khá lâu trong các vật chất hữu cơ như phân gà ít nhất 3 tháng, 30 - 35 ngày ở nhiệt ñộ 40C, 7 ngày ở nhiệt ñộ 200C. Trong thức ăn, nước uống bị ô nhiễm vi rút có khả năng tồn tại hàng tuần. ðây chính là nguồn bệnh nguy hiểm và tiềm tàng ñể làm lây lan dịch bệnh (Lê Văn Năm, 2004) [16]. Trong nước ao hồ vi rút vẫn có thể duy trì ñặc tính gây bệnh tới 4 ngày ở nhiệt ñộ 220C và trên 30 ngày ở nhiệt ñộ 00C (Webster. R. G, W. J. Bean, 1992) [46]. Do cấu trúc vỏ ngoài của vi rút là lipit nên chúng mẫn cảm với các chất dung môi và chất tẩy rửa như formalin, axit, ete, β - propiolacton, sau khi tẩy vỏ, các hóa chất như phenolic, NH4+, axit loãng, natrihypochlorit và hydroxylanine có thể phá hủy vi rút cúm gia cầm. Người ta thường dùng các hóa chất này như các chất sát trùng hữu hiệu ñể tẩy uế chuồng trại, dụng cụ và các thiết bị chăn nuôi (Ilaria Capua, Stefano Marangon, 2004) [6]. 2.5.8. Nuôi cấy và lưu giữ vi rút cúm gà Vi rút cúm gia cầm phát triển tốt trong phôi gà 9 -11 ngày tuổi. Chúng tồn tại ñược trong dịch niệu vài tuần ở ñiều kiện 40C. Khả năng tồn tại của vi rút rất cao nếu chúng ta bảo quản dịch niệu ñó ở -700C hoặc cho ñông khô. Vi rút cúm gia cầm cũng phát triển tốt trong môi trường tế bào xơ phôi gà (CEF), tế bào dòng có nguồn gốc thận chó (Madin-Darby-Canine-Kidney Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………29 cells-MDCK) hoặc thận khỉ với ñiều kiện môi trường nuôi cấy tế bào không chứa trypsin (Lê Văn Năm, 2004) [16]. 2.5.9. Miễn dịch chống bệnh của gia cầm Miễn dịch là trạng thái ñặc biệt của cơ thể không mắc phải tác ñộng có hại của yếu tố gây bệnh, trong khi ñó các cơ thể cùng loài hoặc khác loài lại bị tác ñộng trong ñiều kiện sống như nhau. Cũng như các ñộng vật khác, miễn dịch chống vi rút cúm của gia cầm có 2 loại là miễn dịch ñặc hiệu và không ñặc hiệu. 2.5.9.1. Miễn dịch không ñặc hiệu Khi mầm bệnh xâm nhập vào cơ thể, gia cầm bảo vệ trước hết bằng miễn dịch không ñặc hiệu nhằm ngăn cản hoặc giảm số lượng và khả năng gây bệnh của chúng. Miễn dịch không ñặc hiệu có vai trò quan trọng khi miễn dịch ñặc hiệu chưa phát huy tác dụng. Hệ thống miễn dịch không ñặc hiệu của gia cầm rất phát triển bao gồm: - Hàng rào vật lý như da, niêm mạc và các dịch tiết có tác dụng bảo vệ cơ thể ngăn cản tác nhân gây bệnh xâm nhập vào cơ thể. - Khi mầm bệnh qua hàng rào da và niêm mạc nó gặp phải hàng rào hóa học là kháng thể dịch thể tự nhiên không ñặc hiệu. + Bổ thể: Bổ thể có tác dụng làm tan màng vi khuẩn, làm tăng khả năng thực bào của ñại thực bào (opsonin hóa), ngoài ra bổ thể cũng có vai trò nhất ñịnh trong cơ chế ñáp ứng miễn dịch ñặc hiệu (nhiều trường hợp sự tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể cần sự có mặt của bổ thể) (Nguyễn Như Thanh, 1997) [18]. + Interferol (IFN): Do nhiều loại tế bào tiết ra nhưng nhiều nhất là tế bào diệt tự nhiên (._.5 20 25 30 0 1 2 3 4 5 6 7 8 GMT (log2) T û lÖ ( % ) VÞt TN VÞt thùc ®Þa Biểu ñồ 4.10. Tần số phân bố các mức kháng thể của vịt thí nghiệm và vịt thực ñịa tại thời ñiểm 120 ngày sau tiêm vắc xin H5N1 mũi 1 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………86 BiÓu ®å TÇn sè ph©n bè c¸c møc KT cña vÞt t¹i thêi ®iÓm 150 ngµy sau tiªm v¾c xin mòi 1 7 7 7 20 20 20 20 0 0 9 2 13 19 32 18 7 0 0 0 5 10 15 20 25 30 35 0 1 2 3 4 5 6 7 8 GMT (log2) T û lÖ ( % ) VÞt TN VÞt thùc ®Þa Biểu ñồ 4.11. Tần số phân bố các mức kháng thể của vịt thí nghiệm và vịt thực ñịa tại thời ñiểm 150 ngày sau tiêm vắc xin H5N1 mũi 1 4.5. KẾT QUẢ GIÁM SÁT VI RÚT Song song với việc lấy mẫu huyết thanh trên gà, vịt ñược tiêm vắc xin ñể ñánh giá khả năng ñáp ứng miễn dịch và ñộ dài miễn dịch, chúng tôi ñồng thời lấy mẫu dịch ổ nhớp (swab) giám sát sự lưu hành của vi rút cúm H5N1. Mẫu ñược chuyển về Trạm Chẩn ñoán – Cơ quan Thú y vùng II ñể giám ñịnh vi rút bằng kỹ thuật Real – time RT – PCR. Kết quả ñược trình bày qua bảng 4.17. Bảng 4.17. Giám sát sự lưu hành của vi rút cúm trên ñàn gia cầm ñược tiêm phòng vắc xin Gà Vịt Thời ñiểm lấy mẫu Phươn g pháp giám ñịnh Tiêm vắc xin Không tiêm vắc xin Tiêm vắc xin Không tiêm vắc xin Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………87 sau tiêm vắc xin (tháng) Số mẫu kiểm tra (mẫu) Kết quả Số mẫu kiểm tra (mẫu) Kết quả Số mẫu kiểm tra (mẫu) Kết quả Số mẫu kiểm tra (mẫu) Kết quả 1 60 (-) 30 (-) 60 (-) 30 (-) 2 60 (-) 30 (-) 60 (-) 30 (-) 3 60 (-) 30 (-) 60 (-) 30 (-) 4 Real - time RT - PCR 60 (-) 30 (-) 60 (-) 30 (-) Sè liÖu trong b¶ng 4.17 vµ ®å thÞ 4.11 cho thÊy: T¹i c¸c thêi ®iÓm 30 ngµy, 60 ngµy, 90 ngµy, 120 ngµy, 150 ngµy sau tiªm v¾c xin 100% sè mÉu dÞch æ nhíp (swab) cña gµ, vÞt lµm ph¶n øng Real – time RT - PCR cho kÕt qu¶ ©m tÝnh. Nh− vËy kh«ng cã sù l−u hµnh vi rót cóm gia cÇm H5N1 trªn ®µn gµ, vÞt ®O ®−îc tiªm v¾c xin t¹i thµnh phè H¶i Phßng. Từ những kết quả nghiên cứu trên cho thấy chủ trương tiêm vắc xin ñã tạo miễn dịch chủ ñộng cho ñàn gia cầm nhằm tiêu diệt mầm bệnh ñã ñem lại kết quả rõ rệt trên ñịa bàn Hải Phòng. Qua bảng chúng tôi rút ra một số nhận xét sơ bộ sau: + Không có sự cảm nhiễm và l−u hành của vi rút cúm H5N1 ở các ñàn gia cầm tr−ớc khi ñ−ợc tiêm vắc xin. + Không có sự cảm nhiễm và l−u hành của vi rút cúm ở gia cầm tại các thời ñiểm 1 tháng, 2 tháng, 3 tháng và 4 tháng sau khi tiêm vắc xin. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………88 ðồ thị 4.11. Các mẫu dịch swab âm tính với vi rút cúm H5 sau khi tiêm phòng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………89 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN Từ những kết quả nghiên cứu trên chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 5.1.1. Trước khi có dịch cúm gia cầm xảy ra, chăn nuôi gia cầm của thành phố Hải Phòng tăng từ 6% - 10%/năm. Do ảnh hưởng của dịch cúm gia cầm năm 2004 chăn nuôi gia cầm giảm 12,95%, cuối năm 2005 áp dụng biện pháp tiêm phòng, ñàn gia cầm ñã dần dần khôi phục, ñến năm 2008 tổng ñàn gia cầm tăng bằng năm 2003 khi chưa xảy ra dịch cúm. 5.1.2. Trước khi tiêm phòng vắc xin năm 2004 dịch xảy ra trên 39 xã, phường thuộc 10 quận, huyện; số gia cầm tiêu huỷ 236.977 con, thiệt hại kinh tế ước tính khoảng 8 tỷ ñồng. Năm 2005, 2007 nhờ áp dụng biện pháp tiêm phòng, dịch chỉ tái bùng phát ở khu vực gia cầm không ñ−ợc tiêm phòng, thiệt hại giảm xuống năm 2007 chỉ khoảng 0,7 tỷ ñồng. Như vậy do tác ñộng tích cực của việc tiêm phòng vắc xin ñã giảm ñáng kể thiệt hại kinh tế và bước ñầu khống chế ñược dịch cúm gia cầm tại Hải Phòng. 5.1.3. Tỷ lệ tiêm phòng từ năm 2005 ñến ñợt I năm 2008 ñạt từ 78,71% ñến 126,68% so với kế hoạch, chứng tỏ khâu tổ chức tiêm phòng của Hải Phòng là rất tốt. 5.1.4. Vắc xin ñạt tiêu chuẩn về ñộ an toàn khi tiêm. Số gia cầm phản ứng sau tiêm rất thấp 1/1910 con chiếm tỷ lệ 0,052% và chỉ ảnh h−ởng ñến tỷ lệ ñẻ trứng của gia cầm ngay sau khi tiêm 1 tuần. 5.1.5. Kết quả theo dõi ñàn gà, vịt thí nghiệm và các ñàn gà, vịt tiêm phòng vắc xin ñại trà cho kết quả hiệu giá cũng như ñộ dài miễn dịch tương ñương nhau tại thời ñiểm 30, 60, 90, 120 và 150 ngày sau tiêm phòng. Gà thí nghiệm có tỷ lệ bảo hộ là 69,23%, 90,00%; 93,33%; 78,57%; 55,56%. Gà thực ñịa có tỷ lệ bảo hộ là 64,61%; 88,57%; 79,65%; 59,38%; 54,88%). Vịt thí nghiệm có tỷ lệ bảo hộ 70%; 91,67%; 80%; 78,57%; 60%. Vịt thực ñịa có tỷ lệ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………90 bảo hộ 66,67%; 76,86%; 86,61%; 62,92%; 56,82%, chứng tỏ kỹ thuật tiêm phòng vắc xin của Hải Phòng ñạt kết quả tốt. 5.1.6. Hiệu giá kháng thể trung bình và tỷ lệ bảo hộ của gà ñược tiêm vắc xin năm 2008 ñạt cao nhất tại thời ñiểm 60 ngày (5,46 log2; 88,57%), của vịt ñạt cao nhất tại thời ñiểm 90 ngày (5,16 log2; 88,61%). 5.1.7. Kết quả giám sát vi rút mẫu dịch Swab của các ñàn gà, vịt trước và sau khi ñược tiêm vắc xin bằng phản ứng Real – time RT - PCR ñều cho kết quả âm tính. Như vậy, ñàn gia cầm ñược tiêm vắc xin không mang vi rút cúm. 5.2. ðỀ NGHỊ 5.2.1. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi trên ñàn thí nghiệm số lượng mẫu còn ít, vì vậy cần có những nghiên cứu tiếp với lượng mẫu nhiều hơn ñể cho kết quả có ñộ chính xác hơn. 5.2.2. Chăn nuôi gia cầm ở Việt Nam nói chung và Hải Phòng nói riêng chủ yếu quy mô nhỏ lẻ, tận dụng, số gia cầm phát sinh thêm từng ngày. Vì vậy cần tích cực tuyên truyền, từng bước xã hội hóa công tác tiêm phòng ñể người chăn nuôi chủ ñộng tự mua vắc xin phòng bệnh cúm gia cầm tiêm cho ñàn gia cầm của gia ñình theo quy trình chăn nuôi, có như vậy mới tạo ñược miễn dịch khép kín. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………91 TÀI LIỆU THAM KHẢO I. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Ban Chỉ ñạo Quốc gia phòng chống dịch cúm gia cầm (2005), Báo cáo tổng kết công tác 2 năm (2004-2005) phòng chống dịch cúm gia cầm, Hội nghị Tổng kết 2 năm phòng chống dịch cúm gà, ngày 18 tháng 4 năm 2005, Hà Nội. 2. Bùi Quang Anh, Văn ðăng Kỳ (2004), Bệnh cúm gia cầm: lưu hành bệnh, chẩn ñoán và kiểm soát dịch bệnh, Khoa học kỹ thuật thú y, 11(3), tr. 69-75. 3. Bùi Quang Anh (2005), Báo cáo về dịch cúm gia cầm, Hội nghị kiểm soát dịch cúm gia cầm khu vực châu á do FAO, OIE tổ chức, từ 23 - 25 tháng 2 năm 2005, thành phố Hồ Chí Minh 4. Cục Thú y (2004), Bệnh cúm ở gia cầm và biện pháp phòng chống, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 5. Cục thú y (2005), Sổ tay hướng dẫn phòng chống bệnh cúm gia cầm và bệnh cúm trên người, Hà Nội. 6. Ilaria Capua, Stefano Marangon (2004), Sử dụng tiêm chủng vacxin như một biện pháp khống chế bệnh cúm gà, Khoa học kỹ thuật thú y, 11(2),tr. 59-70. 7. Trần Hữu Cổn, Bùi Quang Anh (2004), Bệnh cúm gia cầm và biện pháp phòng chống. 8. Nguyễn Tiến Dũng, Malik Peiris, Robert Webster, ðào Thanh Vân, Bùi Ngọc Anh, Nguyễn Thế Vinh, Kent Inui, Bùi Nghĩa Vượng, Nguyễn Viết Không và Ngô Thanh Long (2004), “Nguồn gốc virus cúm gia cầm H5N1 tại Việt Nam năm 2003 - 2004 ”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 11(3), tr. 6-14. 9. Nguyễn Tiến Dũng (2004), Bệnh cúm gà, Hội thảo một số biện pháp khôi phục ñàn gia cầm sau dập dịch, Hà Nội, tr. 5-9. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………92 10. Nguyễn Tiến Dũng, ðỗ Quí Phương, ðào Thanh Vân, Bùi Ngọc Anh, Bùi Nghĩa Vượng, Nguyễn Thế Vinh, Nguyễn Thuý Duyên (2005), “Giám sát bệnh cúm gia cầm tại Thái Bình”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 12(2), tr. 6-12. 11. Nguyễn Tiến Dũng, ðào Thanh Vân, Bùi Ngọc Anh, Kenjiro Inui, Bùi Nghĩa Vượng, Nguyễn Thế Vinh, Nguyễn Bá Thành, Phạm Thị Kim Dung (2005), “Giám sát tình trạng nhiễm vi rút cúm gia cầm tại ñồng bằng Sông Cửu Long cuối năm 2004”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 12(2), tr. 13-18. 12. Lê Thanh Hoà (2004), Họ Orthomyxoviridae và nhóm virus cúm A gây bệnh cúm trên gà và người, Viện khoa học công nghệ. 13. Phạm Sĩ Lăng (2004), Diễn biến của bệnh cúm gà trên thế giới, Hội thảo một số biện pháp khôi phục ñàn gia cầm sau dập dịch, Hà Nội, tr. 33-38. 14. Phạm Sỹ Lăng (2004), “Diễn biến bệnh cúm gia cầm ở Châu Á và các hoạt ñộng phòng chống bệnh”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 11(3), tr. 91- 94. 15. Lê Văn Năm (2004), Kết quả khảo sát các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích ñại thể bệnh cúm gia cầm ở một số cơ sở chăn nuôi các tỉnh phía Bắc, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, Tập X, số 1, tr. 86-90. 16. Lê Văn Năm (2004), Bệnh cúm gà, Khoa học Kỹ thuật Thú y, 11(1), tr. 81-86. 17. Nguyễn Hoài Tao, Nguyễn Tuấn Anh, Một số thông tin về dịch cúm gia cầm, Chăn nuôi số 3 - 2004, tr. 27. 18. Nguyễn Như Thanh (1997), Miễn dịch học Thú y, Nhà xuất bản Nông nghiệp. 19. Tô Long Thành (2004), “Thông tin cập nhật về tái xuất hiện bệnh cúm gia cầm tại các nước Châu Á”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 11(4), tr. 87- 93. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………93 20. Tô Long Thành (2006), “Thông tin cập nhật về bệnh cúm gia cầm và vacxin phòng chống”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 13(1), tr. 66-76. II. TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI 21. Alexander D.J. (1993). Orthomyxovirus Infections. In Viral Inffections of Vertebrates, Volume 3: Viral Infections of Birds. McFerran J.B. & McNulty M.S., eds. Horzinek M.C., Series editor. Elserviers, Amsterdam, the Netherlands, 287 – 316. 22. Alexander D.J. (1996). Highly Pathogenic Avian Influenza (fowl plague). In OIE Manual of standards for diagnostic tests and vaccines. List A and B diseases of mammals, birds and bees, 3rd ed. Office International des Epizooties: Paris, 155-160. 23. Beard C.W., Schnitziein W.M, Trypathy D.N. Protection of chickens against hight pathogenic avian influenza virus by recombinant fowlpox viruses. Avian Dis.,35, 356-359. 24. B. C. Easterday, Virginia S, Hinshaw, David A. Halvorson (1997). Influenza. In B. W Calnek, H.John barnes, C. W. Beard, L. R. Mcdougal, Y. M. Saif (eds.) Diseases of Poultry, 10th edition. Iowa State University Press, Ame, pp.583-606. 25. Capua I. &. Marrangon S. (2000). Review article: The avian influenza epidermic in Italy, 1999 - 2000. Avian Pathol., 29, 289 - 294. 26. Capua I., Maragon S., Dalla Pozza M., Santucci U. (2000). Vaccination for Avian Influenza in Italy. Vet. Rec., 147, 751. 27. Franklin, R. M. and E. Wecker (1950) Inactivation of some animal viruses by hydroxylamine and the structure of Ribonucleic acid. Nature 84:343-345. 28. Fener, F., P. A. Murphy, M. J Studdert, D. O. White (eds.) (1987). Veterinary Virology. Academic Press. Orlando, FL. pp. 473- 484. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………94 29 37. Horimoto T and Kawaoka Y (2001), Pandemic threat posed by avian influenza viruses, Clind Microbiol Rev, 14(1): 129-149. 30. Hinshaw, V.S., R.G. Webster, B.C. Easterday and W.J. Bean (1981). Replication of avian influenza A viruses in mammals. Infect Immun 34:345-361. 31. Hinshaw, V.S., C. W. Olsen, N. Dybdahlsissoko, D. Evans (1994). Apotosis: A mechanism of cell killing by influenza A and b viruses. J. Virol 68:3667-3673. 32. Ito, T and Y. Kawaoka (1998), Avian influenza, p. 126-136. In K. G. Nicholson, R. G. Webster, and A. J. Hay (ed.). Textbook of influenza. Blackwell Sciences Ltd, Oxford, United Kingdom. 33. Ito. T, J. N. Couceiro, S. Kelm, L. G. Baum, S. Krauss, M. R. Castrucci, I. Donatelli, H. Kida, J. C Pauson, R. G. Webter, and Y. Kawoaka (1998), Molecular basic for the generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential, J. Virology, 72: 7367-7373. 34. Kawaoka. Y (1991), “Difference in receptor specificity among influenza A viruses from different species of animals”, J. Vet. Med. Sci 53, pp.357-358. 35. Katz JM, Lu X, Frace AM, Morken T, Zaki SR, Tumpey TM.(2000). Pathogenesis of and immunity to avian ifluenza A H5 viruses. Biomed Pharmacother, 54(4): 178-87. 36. Kishida N, Sakoda Y, Isoda N, Matsuda K, Eto M, Sunaga Y, Umemura T, Kida H. Pathogenicity of H5 influenza viruses for ducks. Arch Virol. 2005 Jul; 150(7):1383-92. 37. Kingsbury, D (1985) Orthomyxo- and paramyxoviruses and their replication. In B. Fields (ed) Virology. Raven Press. NewYork, pp.1157- 1178. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………95 38. Kida, H., Y. Kawaoka, C. W. Naeve and R. G. Webster (1987). Antigenic and genetic conservation of H3 influenza virus in wild Ducks. Virology 159:109-119. 39. Klenk, H. D., W. Keil, H. Niemann, R. Geyer, R. T schwarz (1983). The characterization of influenza virus by Carbohydrate analysis. Curr Top Microbiol Immuno 104:247-57. 40. Lu. X, T. M. Tumpey, T. Morken, S. R. Zaki, N. J. Cox, and J. M. Katz (1999), A mouse model for the evaluation of pathogenesis and immunity to influenza A (H5N1) viruses isolated from human, J. Virology, 73: 5903- 5911. 41. luschow D., werner o., mettenleiter t.c. & fuchs w.(2001). Protection of chickens from lethal avian influenza A virus infection by live- virus vaccination with infectious laryngotracheitis virus recombinants expressing the heamagglutinin (H5) gene. Vaccine, 19, 4249-4259. 42. Muphy. B. R and R. G Webter (1996), Orthomyxoviruses, p. 1397- 1445. In B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M Howley et al. (ed.), Fields Virology, 3rd ed. Lippincott-Raven Pblishers, Philadenphia, Pa. 43. OIE, Council of European Communities (1992), Council Directive 92/40/EEC of 19 th May 1992 introducing Community measures for the control of avian influenza, Official Journal of Eropean Communities, L167, 1- 15. 44. Seo. S and R. G Webter (2001), Cross-reactive cell-mediated immunity and protection of chickens from lethal H5N1 influenza virus infection in the HongKong poultry markets, J. Virology, 75: 2516-2525. 45. Schafer, W.1955, Vergleichende sero-immunolodische Untersuchun- gen uber die viren der influenza and klassichen Gefluegelpest Z Naturforsch 10b:81-91. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………96 46. Webster. R. G, W. J. Bean, O. T. Gorman, T. M. Chambers and Y. Kawaoka (1992), Evolution and ecology of influenza A viruses , Microbiol. Rev, 56: 152-179. 47. WHO Expert committee (1980). A revision of the system of clature for Influenza virus: a WHO memorandum. Bull. WHO, 58, 585 - 591. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………97 PHỤ LỤC Phương pháp lấy mẫu bệnh phẩm chẩn ñoán Cúm gia cầm theo hướng dẫn của Cục Thú y. 1. Mẫu bệnh phẩm dùng ñể chẩn ñoán - Với gia cầm thì mẫu bệnh phẩm nên lấy ở hệ hô hấp và ống tiêu hóa lớn như: + Dịch ngoáy ổ nhớp + Mẫu phân + Khí quản Dịch ngóay ổ nhớp nên ñược lấy trên gia cầm sống hoặc mới bị giết. Mẫu phân ñược lấy từ các chuồng nuôi gia cầm nghi mắc bệnh. 2. Bảo quản và vận chuyển mẫu Mẫu bệnh phẩm ñược lấy và vận chuyển trong môi trường vận chuyển có kháng sinh trong ñiều kiện lạnh (thùng ñá hoặc nitơ lỏng). * Cách lấy mẫu - Ngoáy ổ nhớp: cho que ngoáy vào sâu hậu môn gia cầm, ngoáy quanh thành hậu môn rồi rút ra cho vào ống có dung dịch vận chuyển. - Lấy mẫu huyết thanh: lấy 3-5ml máu gia cầm ñể chắt huyết thanh. Huyết thanh có thể bảo quản ở -200C trước khi xét nghiệm. * Vận chuyển mẫu ñến phòng thí nghiệm Mẫu dùng phân lập vi rút ñược bao gói kín trong hộp ñá và chuyển ñến phòng thí nghiệm. Mẫu huyết thanh có thể giữ ở 40C trong vòng 1 tuần nếu lâu hơn nên giữ ở -200C 3. Phương pháp làm phản ứng HI * Xử lý huyết thanh - Các mẫu máu gia cầm ñược Chi cục Thú y Hải Phòng gửi ñến ñược bảo quản lạnh trong hộp xốp. - Chắt huyết thanh trong seringe ra tube, ñánh dấu tube, ghi số lab. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………98 - Xếp các tube huyết thanh vừa chắt ñược vào khay, ñem xử lý nhiệt ở 560C/30 phút trong nồi hấp cách thuỷ ñể diệt bổ thể. - Huyết thanh sau khi ñã ñược xử lý bảo quản trong tủ 40C ñể dùng ngay hoặc bảo quản ở tủ -20°C ñể dùng sau. * Phương pháp làm phản ứng HI Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI - Hemagglutination inhibition test) theo qui trình của Trạm chẩn ñoán - Cơ quan Thú y vùng II. Dung dịch và dụng cụ: - Dung dịch chống ñông (citrat natri 1%): Citrat natri 1g Nước cất vừa ñủ 100ml - Dung dịch pha loãng kháng nguyên và hồng cầu: NaCl 0,85% NaCl 8,5 g Nước cất vừa ñủ 1000ml Tiến hành phản ứng: - Chuẩn bị hồng cầu gà: + Lấy máu:1ml citrat natri1% + 5ml máu gà + Rửa hồng cầu:
1 thể tích máu + 3 thể tích nước sinh lý (0,85%). Ly tâm 1500- 2000/10phút, loại bỏ nước nổi.
Làm tan cặn với 3 thể tích nước sinh lý (so với thể tích máu ban ñầu).
Ly tâm 1500-2000v/5phút, loại bỏ nước nổi.
Rửa thêm 1 lần nữa như trên. - Chuẩn ñộ hiệu giá kháng nguyên: (HA)
Kháng nguyên ñể tan ở nhiệt ñộ phòng .
Chuẩn ñộ hiệu giá kháng nguyên bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu vi lượng (HA).
Cho 50µl NaCl 0,85% vào một hàng 12 giếng. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………99
Cho 50µl kháng nguyên vào giếng 1, dùng pipet trộn ñều hút 50µl sang giếng thứ 2, trộn ñều, làm tương tự ñến giếng thứ 11. Ta có kháng nguyên pha loãng bậc 2. Giếng thứ 12 dùng làm ñối chứng hồng cầu
Cho vào tất cả các giếng 50µl hồng cầu gà 0,5%, lắc nhẹ ñĩa, ñể nhiệt ñộ phòng trong 30 phút, ñọc kết quả. Hiệu giá kháng nguyên tính ñến ñộ pha loãng cuối cùng còn khả năng làm ngưng kết hồng cầu gọi là 1 ñơn vị HA Trong phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu dùng kháng nguyên 4 ñơn vị (4 ñơn vị HA) pha trong dung dịch pha loãng kháng nguyên - Tiến hành phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu vi lượng (HI)
Cho 25µl NaCl 0,85% từ giếng A ñến giếng G
Cho 50µl NaCl 0,85% vào các giếng ở hàng H
Cho 25µl huyết thanh ñã xử lý vào giếng A. Dùng pipet trộn ñều và hút 25µl từ giếng A ñến giếng G (giữ lại 25µl ở hàng G) ta có huyết thanh pha loãng bậc 2. Hàng G dùng làm ñối chứng huyết thanh.
Cho 25µl kháng nguyên 4 ñơn vị HA vào các giếng trừ các giếng ở hàng G và H, lắc ñể nhiệt ñộ phòng 30 phút
Cho 25µl hồng cầu 1%, lắc ñều ñể nhiệt ñộ phòng 30 phút
ðọc kết quả. o Nhận ñịnh kết quả:
Huyết thanh có kháng thể kháng vi rút cúm khi có hiện tượng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (hồng cầu tụ lại dưới ñáy giếng).
Hiệu giá kháng thể là ñộ pha loãng cao nhất của huyết thanh còn có khả năng ngăn trở ngưng kết hồng cầu hoàn toàn. 4. Phương pháp làm phản ứng Real-time RT – PCR (RRT – PCR) * Dụng cụ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………100 - Ống 25 ml Smart Cycler® (catalog @900-0022 hoặc 900-0003, Cepheid® Smart Cycler, Sunnyvale, CA) - Giá ống phản ứng PCR làm lạnh và máy li tâm ống nhỏ. Cả 2 thiết bị này ñược cung cấp kèm theo hệ thống máy Smart Cycler® - Hệ thống bơm hút chân không 24 van QiaVac® có khả năng hút 18-20 lít/phút. * Nguyên liệu - Nước cất vô trùng (Rnase-free) - RNA ñối chứng dương tính M, H5 và H7 (ñược NVSL cung cấp) - Cồn tuyệt ñối. - Isopropanol, 99+% tinh khiết. - Chloroform, 99+% tinh khiết. - Trizol® LS reagent (Invitrogen, cat @10296-010 hoặc 10296-028). - Kít chiết tách Qiagen® Rneasy Extraction (cat @ 74104 50 prep hoặc @74106 250 prep). - Kit RT-PCR 1 bước Qiagen® (cat @ 210210 hoặc 210212) hoặcSuperscript® RT-PCR One-Step RT-PCR với Platinium Taq DNA Polymerase (cat @10928-034 hoặc 10928-042, Invitrogen®). - Mẫu dò và primer Có thể ñặt primer và mẫu dò: Integrated DNA Technologies, hoặc Operon. * Thực hiện phản ứng Trước khi làm RRT-PCR, ñặt các pipet, khay, ñầu pipet,... vào buồng vô trùng sạch. Tương tự, ñặt các dụng cụ làm mẫu vào buồng vô trùng khác. Bật ñèn tử ngoại trong nhiều giờ hoặc qua ñêm ñể giảm tạp nhiễm ARN từ pipet và các dụng cụ khác. + Chiết tách ARN từ mẫu dịch ngoáy (Phương pháp Qiagen® RNeasy) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………101 - Lắc mạnh (bằng máy Votex) ống chứa dịch ngoáy và chuyển lượng 500µl sang ống ly tâm nhỏ và ghi ký hiệu mẫu. - Cho 500µl Qiagen® buffer RLT có β-ME vào ống ly tâm trên. Lắc ñều trên máy Votex. - Ly tâm (bằng máy Spindown) ñể dịch bệnh phẩm ñọng trên nắp trôi xuống ñáy ống. Cho 500µl cồn ETOH 70% (ethanol), lắc mạnh bằng Votex. Ly tâm mẫu ñã bị dung giải trong 5 phút ở tốc ñộ 5000xg ở nhiệt ñộ phòng. - Chuyển tất cả dịch nổi chứa mẫu bị dung giải sang cột RNeasy® Qiagen ñã ghi sẵn ký hiệu mẫu. Ly tâm trong 15 giây tốc ñộ 8000xg ở nhiệt ñộ phòng. Kiểm tra dịch mẫu ñã thấm qua cột lọc chưa. Lặp lại bước này cho ñến khi toàn bộ mẫu ñã qua cột lọc. - Bổ sung 700µl dung dịch rửa1 (RW1 buffer) vào cột RNeasy® Qiagen, ly tâm trong 15 giây ở tốc ñộ 8000xg, thay ống thu mẫu mới (collection tube) vào cột lọc. - Cho 500µl RPE buffer vào cột RNeasy® và ly tâm trong 15 giây ở tốc ñộ ≥8000xg, thay ống thu mẫu mới vào cột lọc. - Lặp lại bước trên 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer. Sau lần rửa cuối cùng thay ống thu mẫu mới loại 2 ml vào cột lọc. - Ly tâm cột lọc trống không trong 2 phút ở tốc ñộ tối ña (khoảng 12.000 vòng/phút), bỏ ống thu mẫu. - ðặt cột lọc vào ống thu hoạch hoặc ống 1,5 ml ñã ñược ghi sẵn ký hiệu mẫu. Cho 50 µl RNase free H2O vào cột lọc. Chú ý không ñược chạm ñầu pipet vào mặt thạch Silica trong cột lọc. ủ ở nhiệt ñộ phòng trong ít nhất 1 phút. Tách ARN bằng cách ly tâm cột trong 1 phút ở 10.000vòng/phút. Bỏ cột lọc RNeasy®. - Bảo quản mẫu ARN thu ñược ở 40C trong thời gian ngắn trước khi làm RRT-PCR, nếu sau 24 giờ, mẫu nên bảo quản ở -200C hoặc nhiệt ñộ thấp hơn. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………102 + Chiết tách mẫu tổ chức bằng Trizol®LS: - Cho 0,75 ml Trizol® LS reagent (hoặc 1 ml Trizol® reagent) + 0,25 ml dịch bệnh phẩm (0,1 ml dịch bệnh phẩm nếu dùng Trizol® reagent) vào ống 1,5 ml. Lắc ñều và ñể ở nhiệt ñộ phòng 5 phút. - Thêm 0.2 ml chloroform vào mỗi ống. Lắc mạnh trong 15 giây và ñể ở nhiệt ñộ phòng 5 phút. - Ly tâm ống ở tốc ñộ 12.000 g trong 15 phút ở 4°C. - Chuyển phần nước (khoảng 500 µl) sang ống microtube mới. - Thêm 0.5 ml Isopropanol và lắc ñều. ðể 5-10 phút ở nhiệt ñộ phòng. - Ly tâm ống ở tốc ñộ 10.000 g trong 5 phút ở 4°C. Bỏ dung dịch trong ống ñi. - Rửa RNA ñóng ở ñáy ống bằng cồn 80%, lắc mạnh và ly tâm với tốc ñộ 10.000 g trong 5 phút ở 4°C. - Bỏ dung dịch trong ống và làm khô RNA 10 phút ở nhiệt ñộ phòng và hoà tan lại với 30 µl nước cất không có Rnase hoặc nước cất ñã xử lý DEPC. + Sao mã ngược và PCR Có 2 khu vực tiến hành xét nghiệm trong quy trình này: Một là khu vực “sạch” gồm có buồng cấy vô trùng (BSC), tủ âm cùng các dụng cụ và khu vực nhân gen (thermal cycling area). (Không ñược ñể các chất có ARN/ADN vào khu vực “sạch” và phải luôn thay găng tay trước khi vào khu vực “sạch”). - Trong buồng vô trùng “sạch”, chuẩn bị hỗn hợp nhân gen (master mix) với các thành phần sau ñủ dùng cho số lượng mẫu cần xét nghiệm. Quy trình này ñược áp dụng cho máy nhân gen Cepheid® Smart Cycler (Cephied®, Sunnyvale, CA). Chế ñộ chạy RRT-PCR cho máy Smart Cycler ñược hướng dẫn trong bảng 1 và 2. Bảng 1. Chu kỳ nhiệt của bước phiên mã ngược (RT) dùng cho Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………103 Quiagen® one step RT-PCR kit. Bước phiên mã ngược 1 chu kỳ 30 phút 500C 15 phút 950C Bảng 2. Chu kỳ nhiệt cho tổng hợp gen và các cặp mồi. Cặp mồi Bước Thời gian Nhiệt ñộ AIV matrix 45 chu kỳ Biến tính 1 giây 940C Bám của cặp mồi 20 giây 600C H5 40 chu kỳ Biến tính 1 giây 940C Bám của cặp mồi 20 giây 570C Kéo dài chuỗi tổng hợp 5 giây 720C Chú ý: Màu huỳnh quang ñược xác ñịnh ở bước bám gắn của cặp mồi. - Phản ứng Real-time RT-PCR ñược tiến hành với những thành phần sau cùng với cặp mồi và chu kỳ thích hợp. Khởi ñộng phản ứng với các ống phản ứng ñược ñặt trong giá ñựng ống lạnh và dùng các ñầu pipet có lọc. Chuẩn bị hỗn dịch phản ứng bằng pipet: nước, 5x reaction buffer (có trong bộ kit), dNTP’s (có trong bộ kit), MgCl2, các cặp mồi tổng hợp xuôi và tổng hợp ngược) trong ống ly tâm nhỏ với lượng cho từng phản ứng ñược tính theo bảng 3. Các nguyên liệu ñể trong ngăn ñá, kể cả MgCl2 phải ñược lắc bằng Votex và ly tâm trước khi lấy ra bằng pipet. Tiếp ñến cho RNase Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………104 inhibitor và enzym. Cho mẫu dò vào sau cùng, trộn ñều và ly tâm nhanh. Khi cho mẫu dò vào hỗn dịch tránh ñể tiếp xúc với ánh sáng. - Chuyển Master mix sang buồng cho mẫu ARN và cho hỗn dịch phản ứng (17 µl) vào ống Smart Cycler. - Cho 8 µl mẫu ARN vào ống Smart Cycler bằng pipet chuyên dùng cho lấy mẫu ARN. ðóng nắp ống, số ống phản ứng tương ứng với phiếu xét nghiệm. Cho 8 µl ARN ñối chứng dương vào ống ñối chứng dương tính và 8 ml nước sạch RNase vào ống ñối chứng âm tính. ARN ñối chứng dương tính ñược pha loãng bởi cán bộ xét nghiệm ở ñộ pha loãng thích hợp có ngưỡng chu kỳ khoảng 25. - Ống phản ứng ñược ñẩy bọt khí ra ngoài từ cửa sổ ñọc của ống PCR. Bọt khí trong ống cho biết lượng hỗn dịch RT-PCR master mix không ñủ hoặc thiếu mẫu ARN. - ðặt ống phản ứng vào máy chu kỳ nhiệt và chọn chương trình chạy PCR, bắt ñầu chạy, nhập ký hiệu mẫu kiểm tra cùng với mẫu ñối chứng dương tính, âm tính vào phần ký hiệu mẫu (sample identification) trong bảng kết quả. Lưu chương trình chạy máy. Bảng 3. Lượng chất phản ứng Real-time RT-PCR dùng cho các cặp mồi phát hiện gen MA (Cúm A), H5. Liều lượng cho 1 PƯ Hàm lượng cuối cùng H2O 6,95 µl 5X buffer 5 1X 25mM MgCl2 1,25 3,75 mM* dNTP's (10mM mỗi loại) 0,8 320 mM mỗi loại dNTP Mồi chạy xuôi (20 pmol/ml) 0,5 10 pmol/25 µl Mồi chạy ngược (20 pmol/ml) 0,5 10 pmol/25 µl Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………105 RNase Inhibitor (13,3 units/ml) 0,5 0,266 units/µl Enzyme Mix 1,0 Mẫu dò (6 pmol/ml) 0,5 0,12 µM Tổng lượng cho 1 phản ứng 17 µl Mẫu ARN 8 µl Lượng toàn bộ trong ống mẫu 25 µl * Quiagen buffer ñã có sẵn MgCl2 2,5mM ở hàm lượng 1X + Cài ñặt chương trình phân tích dữ liệu cho máy chu kỳ nhiệt Cepheid® Smart Cycler. Phần mềm Smart Cycler cung cấp nhiều phương pháp xác ñịnh ngưỡng chu kỳ (Ct). Tất cả các cách phân tích dữ liệu ñược lấy từ Analysis Settings trong View Results. Những thay ñổi trong cài ñặt mặc ñịnh tiêu chuẩn ñã ñược thiết lập ñối với các phân tích phát hiện vi rút Cúm A với các cặp mồi Matrix, H5. + Phân tích kết quả xét nghiệm ðộ ñặc hiệu của các phương pháp xét nghiệm matrix, H5 Phương pháp xét nghiệm matrix vi rút Cúm gia cầm (AIV) ñược dùng phát hiện tất cả các phân nhóm của AIV. Ngược lại phương pháp ñặc hiệu xác ñịnh phân nhóm H5, dùng giám ñịnh AIV H5. Phương pháp xét nghiệm H5 ñã cho thấy khả năng phát hiện AIV H5N1 chủng Asian (Châu Á). Vì phương pháp xét nghiệm matrix nhạy hơn (khoảng 10 lần) H5 nên thường dùng test này ñể kiểm tra tất cả các mẫu. Mẫu dương tính với matrix và cả H5 sẽ cho phép khẳng ñịnh mẫu chứa ARN của AIV. Tuy nhiên mẫu dương tính với matrix bằng kỹ thuật RRT-PCR mà âm tính với H5 thì có thể vẫn chứa ARN của phân nhóm H5, nhưng do số lượng ARN thấp hơn khả năng phát hiện của kỹ thuật xét nghiệm này hoặc có phân nhóm khác ngoài H5 ñang gây bệnh. Những mẫu bệnh phẩm này ñược xem là mẫu nghi ngờ. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………106 Phương pháp xét nghiệm matrix, H5, cũng có thể phát hiện các mẫu bệnh phẩm dương tính giả. Những mẫu có Ct bằng 35 hoặc lớn hơn ñược xem là dương tính nghi ngờ và ñược xét nghiệm lại bằng RRT-PCR Tất cả mẫu bệnh phẩm nghi ngờ và mẫu chỉ cho dương tính matrix với kỹ thuật RRT-PCR cần ñược xác chẩn bằng phương pháp phân lập vi rút trước khi thông báo kết quả dương tính. Tất cả các mẫu chưa chắc chắn thì phải xét nghiệm lại. Giá trị Ct của ñối chứng dương tính ARN ñược sao mã ðối chứng dương tính ARN ñã sao mã ñược pha loãng ở hàm lượng sử dụng cho giá trị Ct khoảng 25. Khi ñối chứng có Ct cao hơn 29 thì phải làm lại ñể xét nghiệm ñảm bảo. Nếu Ct của ñối chứng dương tính thấp hơn 20, nên chuẩn ñộ lại ñộ pha loãng của ñối chứng. Bất kỳ thời ñiểm nào Ct của ñối chứng dương tính hoặc ñường cong tăng trưởng khác thấp hơn 14, giá trị trừ nền có thể bị sai lệch. Hướng dẫn ñánh giá ñồ thị huỳnh quang - Giám ñịnh các mẫu dương tính yếu. Loại bỏ tất cả phản ứng lớn hơn 100 ñơn vị tăng huỳnh quang từ trong ñồ thị (ñiều này làm thay ñổi thước ño ñể dễ xác ñịnh các trường hợp dương tính yếu). Quan sát riêng từng mẫu sẽ giúp xác ñịnh các phản ứng dương tính yếu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………107 ðồ thị huỳnh quang của các mẫu chạy trên máy Smart Cycler. Giá trị trừ nền ñược bật. Tất cả các tiêu chí phân tích ñã ñược cài ñặt giá trị mặc ñịnh thích hợp. Chú ý thước ño từ 0 ñến 1000 ñơn vị huỳnh quang (trục Y) khó xác ñịnh ñược các mẫu dương tính yếu. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………108 Bảo quản vắc xin 2 - 80C Tiêm phòng vắc xin cúm gia cầm Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………109 Dụng cụ và nguyên liệu làm phản ứng HA, HI ðọc kết quả phản ứng HI Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………110 Tiêu bản chuẩn ñộ 4HA Tiêu bản phản ứng HI gia cầm tiêm phòng vắc xin ._.