Đánh giá hàm lượng lưu huỳnh còn tồn dư, hàm lượng saponin toàn phần, hàm lượng đường và độc tính cấp của dược liệu được sơ chế với các phương pháp xông sinh khác nhau

chế bằng phương pháp xông sinh sau đó đem bán ra thị trường. Vậy vấn đề đặt ra là: tỉ lệ lưu huỳnh dùng để xông là bao nhiêu, xông sinh xong cần sấy ở nhiệt độ bao nhiêu , bảo quản bao lâu mới được sử dụng để đảm bảo không độc hại đến sức khoẻ con người, đảm bảo được chất lượng của thuốc đạt được tiêu chuẩn dược điển Viêt Nam và khu vực. Vì vậy chúng tôi đặt vấn đề Mục đích: Đánh giá hàm lượng lưu huỳnh còn tồn dư, hàm lượng saponin toàn phần, hàm lượng đường và độc tính cấp của dược liệu được sơ chế với các phương pháp xông sinh khác nhau”. Trên cơ sở đó có thể đề xuất phương pháp xông sinh thích hợp cho dược liệu chất lượng tốt và an toàn cho người sử dụng. Để đạt được mục đích trên, đề tài được tiến hành nghiên cứu với một số nội dung sau: - Xông sinh ngưu tất bằng các phương pháp khác nhau: Về liều lượng sinh, thời gian xông, nhiệt độ sấy. - Đánh giá hàm lượng lưu huỳnh tồn dư, hàm lượng saponin, đường tự do,và độc tính cấp của các mẫu dược liệu. Phần I: Tổng quan 1-Tổng quan về ngưu tất 1.1- Đặc điểm thực vật, phân bố và thu hái Vị thuốc Ngưu tất là rễ phơi hay sấy khô của cây Ngưu tất: Achyranthes bidentata Blume họ rau Dền Amaranthaceae. Cây thuộc thảo cao khoảng 1m. Thân mảnh, lá mọc đối, hình trứng, đầu nhọn, mép lá nguyên dài 5-12 cm. Cụm hoa là bông ở đầu cành hay kẽ lá. Hoa mọc hướng lên nhưng khi biến thành quả sẽ mọc quặp xuống. Quả nang, lá bắc còn lại và nhọn thành gai cho nên vướng phải có thể mắc vào quần áo. Cây mọc ở Trung quốc, Việt Nam và các nước Đông Nam Á. Trồng bằng hạt, ở đồng bằng thì trồng vào tháng 9-10 thu hoạch vào tháng 2-3. Vùng miền núi trồng vào tháng 2-3 thu hoạch vào tháng 9-10. Muốn lấy giống thì cây sau khi thu hoạch, cắt bớt rễ, cắt bớt thân và trồng lại khoảng 4 tháng nữa mới lấy hạt [2]. Năng suất hiện nay vào khoảng 1,2 tấn một hecta. 1.2- Thành phần hoá học Rễ có chứa các saponin, khi thuỷ phân cho các sapogenin là acid oleanolic., ngoài ra còn có ecdysteron và inokosteron, glucose, galactose, rhamnoza. Muối kali [2,8], và một số thành phần khác như: Betain, polysaccharide, emodin, physcion[ 15] - acid oleanolic - Ecdysteron - Inokosteron 1.3- Tác dụng dược lý · Làm giảm sức co bóp của tim ếch [8 ] · Giãn mạch hạ huyết áp, ức chế nhẹ tim ếch cô lập [2] · Tăng co bóp tử cung [2,6] · Tác dụng phá huyết và làm vón albumin [2,8] · Tác dụng hạ cholesterol trong máu và hạ huyết áp [2 ] · Ecdysteron và Inokosteron có tác dụng chống viêm,kháng khuẩn [8] · Lợi tiểu, hạ đường huyết, cải thiện chức năng gan [9]. · Thúc đẩy quá trình tổng hợp protein[9] · Kích thích miễn dịch [16] · Chống ung thư [17, 18] 1.4- Sơ chế và bào chế · Sơ chế: Dược liệu sau khi thu hoạch về chặt bỏ phần thân, rũ sạch đất, phơi nắng 1-2 ngày, rửa sạch bằng nước, để ráo nước, xếp vào xông sinh với lượng sinh xông và thời gian xông theo kinh nghiệm từng địa phương.[8, 10] · Chế biến cổ truyền [10] Khi sử dụng làm thuốc người ta phải qua khâu chế biến bào chế, có nhiều phương pháp chế biến khác nhau, tuỳ theo các mục đích điều trị chứng bệnh khác nhau mà người thầy thuốc chọn phương pháp chế biến thích hợp. - Ngưu tất thái dùng sống Ngưu tất được rửa sạch, làm mềm, thái phiến vát dày 1-3mm (nếu rễ to); cắt đoạn 3-5mm (nếu rễ nhỏ), phơi hoặc sấy khô để dùng. [10] - Ngưu tất sao cám Ngưu tất rửa sạch, thái phiến, để ráo nước. Sao cám nóng già, bốc khói trắng, cho ngưu tất phiến vào sao đều đến khi có màu vàng. Lấy ra rây bỏ cám. - Ngưu tất trích rượu Ngưu tất 10 kg Ruợu 2 kg Ngưu tất phiến sao nóng, phun rượu vào sao đến khô. Hoặc tẩm rượu vào ngưu tất, ủ 30 phút- 1 giờ cho ngấm rượu; sau sao tới khô. - Ngưu tất thán Đem ngưu tất sao đến khi phía ngoài bị đen hoàn toàn, bên trong vàng đậm; có thể trích rượu sao đen như trên. - Ngưu tất sao đen Lấy ngưu tất phiến, dùng nhỏ lửa sao cho đến khi xuất hiện các chấm đen. - Ngưu tất trích muối Ngưu tất phiến 10 kg Muối 0.2 kg Muối hoà thành dung dịch đủ để tẩm vào ngưu tất đã thái phiến ; ủ 30 phút , sao khô. 1.5- Công năng chủ trị [4, 8, 9, 10] - Hoạt huyết thông kinh hoạt lạc: dùng trong các trường hợp kinh nguyệt bế, kinh nguyệt không đều. - Thư cân, mạnh gân cốt, bổ can thận dùng cho các bệnh đau xương khớp, đau xương sống, đặc biệt đối với khớp của chân; sinh lý yếu, tiểu không tự chủ được, làm giảm bạc tóc. - Chỉ huyết: thường dùng trong các trường hợp hoả độc bốc lên gây nôn ra máu, chảy máu cam. - Lợi niệu, trừ sỏi:dùng trong các trường hợp tiểu tiện đau buốt, tiểu tiện ra sỏi, đục. -Giáng áp, giải độc chống viêm: dùng phòng bệnh bạch hầu -Làm tá dược dẫn huyết, hoả đi xuống. 2- Diêm sinh 2.1- Nguồn gốc. Diêm sinh còn gọi là sinh, diêm vàng, hoàng nha, lưu hoàng, thạch lưu hoàng, oải lưu hoàng, tên khoa học là sulfur. Là một nguyên tố có sẵn trong thiên nhiên hay do chế từ những hợp chất có lưu huỳnh trong thiên nhiên. Lưu huỳnh có thể tồn tại dưới dạng tự do, hay sunphua như pyrit, sunphua kẽm, hoặc sunphua các kim loại khác, sunphua hydro…[6]. Tuỳ theo nguồn gốc và cách chế biến khác nhau, lưu hoàng có khi là bột màu vàng, có khi là những cục to không đều màu vàng tươi, hơi có mùi đặc biệt, ít tan trong nước, trong rượu và ete, tan nhiều hơn trong dầu. Khi đốt lên cháy với ánh lửa xanh và toả ra mùi khét khó thở. [8] 2.2- Thành phần hoá học Thành phần chủ yếu của diêm sinh là chất sulfur nguyên chất, tuỳ theo nguồn gốc và cách chế tạo, có thể có những tạp chất như: đất, vôi, asen, sắt...[8]. 3.3- Công dụng và liều dùng [8] Diêm sinh được dùng trong cả đông và tây y.Theo tài liệu cổ, diêm sinh có vị chua, tính ôn, có độc, vào hai kinh tâm và thận. Có tác dụng bổ hoả, tráng dương, bổ mệnh môn chân hoả, lưu lợi đại trường, sát trùng. Dùng trong những trường hợp liệt dương, lỵ lâu ngày, người già yếu, hư hàn mà bí đại tiện, phong thấp. Dùng trong còn có tác dụng sát trùng, chữa mẩn ngứa, mụn nhọt. Ngày dùng 2-3g dưới dạng thuốc bột hay thuốc viên. Phần II:Thực nghiệm và kết quả 1- Nguyên liệu, phương tiện và phương pháp nghiên cứu 1.1- Nguyên liệu, phương tiện. · Nguyên liệu - Rễ ngưu tất tươi thu hoạch ở trung tâm nghiên cứu cây trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội. - Diêm sinh lấy mẫu tại một số nơi dùng để chế biến thuốc. . Xã Ninh Hiệp, huyện Gia Lâm Hà Nội(Ký hiệu mẫu:S1) .Thôn Nghĩa Trai, xã Tân Quang huyện Văn Lâm(Ký hiệu mẫu:S2) .Thôn Thiết Trụ, huyện Khoái Châu tỉnh Hưng Yên(Ký hiệu mẫu:S3) .Trung tâm nghiên cứu cây trồng và chế biến thuốc Hà Nội (Ký hiệu mẫu:S4) · Hoá chất,thuốc thử Cồn tuyệt đối, acid sulphuric 72%, dd KOH/cồn 0.5N, dd acid HCl 0.5N,ortho.Toluidin, Thioure, chỉ thị Methyl da cam,.. .đạt tiêu chuẩn do viện Dược liệu cung cấp. · Động vật thí nghiệm Chuột nhắt trắng khoẻ mạnh,có khối lượng 20-22g do đủ tiêu chuẩnthí nghiệm mua tại Hà Tây. · Máy móc và trang thiết bị - Máy đo độ ẩm Precisa MA300 Thuỵ Sĩ. - Máy quang phổ UV-VIS Cary 1E cua hãng Varian(Mỹ) - Máy đo quang phổ tử ngoại (máy ASIMCO của Anh) - Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử( máy AAS-Shimadza của Nhật) 1.2- Phương pháp thực nghiệm 1.2.1- Xông sinh ngưu tất 1.2.1.1- Xông sinh ngưu tất với lượng sinh khác nhau Các mẫu ngưu tất cùng khối lượng được xông sinh với những lượng sinh khác nhau, trong cùng một thời gian một ngày một đêm.Với khối lượng sinh như sau: 0,5kg S/tạ dược liệu; 1kg S/tạ dược liệu; 1.5kg S/tạ dược liệu; 3kg S/tạ dược liệu. Sấy ở 60°C đạt độ thuỷ phần <15%. 1.2.1.2- Xông sinh ngưu tất với thời gian khác nhau Xông sinh các mẫu có khối lượng bằng nhau với cùng lượng sinh 1.5kg S/tạ dược liệu nhưng thời gian khác nhau, xông 4h, 12h, 24h. Sấy khô ở 60°C đạt độ thuỷ phần < 15%. 1.2.1.3- Sấy ở các nhiệt độ khác nhau Sấy ở nhiệt độ khác nhau 60°C, 70°C, 80°C, 100°C đến đạt độ thuỷ phần < 15%. Sau khi chế biến tiến hành kiểm tra chất lượng đồng thời đóng túi bảo quản. 1.2.2- Định lượng một số thành phần trong ngưu tất sau khi xông 1.2.2.1- Định lượng saponin (TCCS VDL) Thực hiện tại Khoa hoá phân tích-Viện dược liệu. Theo phương pháp đo quang ở bước sóng l= 538, với chất chuẩn là acid oleanolic và thuốc thử tạo màu là cồn Vanilin trong H2SO4 đặc. Hàm lượng Saponin (tính theo acid oleanolic) được tính bằng công thức: X (%) = Trong đó: Dt: Mật độ quang ống thử Dc: Mật độ quang ống chuẩn Pt: Lượng dược liệu (g) Pc: Lượng acid oleanoic(g) B: Độ ẩm của dược liệu 1.2.2.2- Định lượng đường tự do (TCCS VDL) Thực hiện tại tại Khoa hoá phân tích-Viện dược liệu. Theo phương pháp đo quang ở bước sóng l=630nm , với chất chuẩn là glucoza 0.1%, thuốc thử là O.Toluidin và Thioure. Hàm lượng đường được tính theo công thức: X (%) = Trong đó: X%: Hàm lượng đường tự do tính theo Glucoza Dt: Mật độ quang ống thử Dc: Mật độ quang ống chuẩn P: Lượng dược liệu(gam) B: Độ ẩm của dược liệu(%) 1.2.2.3- Định lượng lưu huỳnh trong ngưu tất sau khi xông sinh và trong dịch chiết nước và cồn Thực hiện tại phòng phân tích môi trường- Viện công nghệ môi trường - Định lượng theo phương pháp cân Nguyên tắc: Mẫu được nghiền nhỏ, vô vơ hoá và kiềm chảy với Na2CO3. Hỗn hợp nóng chảy được lấy bằng nước cất nóng. Acid hoá bằng HCl và dùng để định lưu huỳnh dưới dạng BaSO4 bằng phương pháp trọng lượng. 1.2.3- Thử độc tính cấp của lưu huỳnh và ngưu tất sau khi xông sinh Thực hiện tại bộ môn phân tích - Trường đai học Dược Hà Nội - Liều LD50 được nghiên cứu theo phương pháp Karber thí nghiệm trên chuột nhắt trắng có khối lượng 18-20g. Những nhóm chuột 12 con được cho uống cao ngưu tất với các liều tăng dần; trong đó liều tối đa không gây chết con nào, liều tối thiểu gây chết toàn bộ lô chuột thí nghiệm(LD100) và một số liều trung gian, mà khoảng cách có thể không bằng nhau. Theo dõi và ghi số chuột chết ở mỗi nhóm. Thời gian theo dõi là ba ngày. 1.2.4- Xác định hàm lượng lưu huỳnh trong các mẫu diêm sinh Thực hiện tại Khoa hoá phân tích-Viện dược liệu Định lượng theo phương pháp acid-base thừa trừ, chỉ thị màu là Methyl da cam. Nguyên tắc phản ứng: Cân chính xác Pt gam mẫu thử, thêm V ml (chính xác) dung dịch KOH 0.5N/cồn và nước đun cách thuỷ sôi đến tan hết lưu huỳnh và cồn, thêm H202 đến khi mất màu dung dịch. Để nguội thêm 2 giọt Methyl da cam và định lượng KOH dư bằng acid HCL 0.5N.Song song tiến hành làm mẫu trắng, 1ml KOH 0.5N tương đương với 0.00817g lưu huỳnh Hàm lượng lưu huỳnh được tính theo công thức: X (%) = Trong đó: Vo: Thể tích acid HCL dùng cho mẫu trắng Vt: Thể tích acid HCl dùng cho mẫu thử Pt: Lưọng mẫu đem cân K : Hệ số hiệu chỉnh KOH 0.5N/cồn 2. Thực nghiệm và kết quả 2.1 Xông sinh ngưu tất 2.1.1 Xông sinh với lượng sinh khác nhau Ngưu tất sau khi thu hoạch về chặt bỏ phần thân, rũ sạch đất, chia thành 4 lô, mỗi lô khối lượng 20 kg, phơi nắng 2 ngày, rửa sạch bằng nước, để ráo nước, buộc thành các bó nhỏ, xếp vào lò xông sinh và xông sinh với thời gian 1 ngày, một đêm với những lượng sinh khác nhau, theo các mẫu sau: Mẫu 1: 0.5kg/tạ dược liệu (Ký hiệuM1). Mẫu 2: 1kg/tạ dược liệu (Ký hiệu M2) Mẫu 3: 1.5kg/tạ dược liệu (Ký hiệu M3). Mẫu 4: 3kg/tạ dược liệu (Ký hiệu M4) Xông sinh một ngàymột đêm, sau đó lấy ra sấy ở nhiệt độ 60°C cho đến khô đạt độ ẩm<15%. Bảo quản mẫu để nghiên cứu tiếp. Kết quả thu được trình bày ở bảng 2. - Nhận xét: Ngưu tất khi đã chế củ nhuận dẻo, bẻ gập của không bị gẫy như khi còn tươi. Ngưu tất xông sinh trắng hơn và nhuận dẻo hơn ngưu tất không xông sinh. Độ nhuận dẻo của ngưu tất phụ thuộc tỉ lệ thuận với độ thuỷ phần trong dược liệu. Màu sắc của cả 4 lô ngưu tất xông sinh với lượng lưu huỳnh khác nhau nhưng đều giống nhau(Xem ảnh) sau khi sấy khô ta không ngửi thấy mùi lưu huỳnh. Như vậy bằng cảm quan ta khó phát hiện được dược liệu có xông sinh hay không. Bảng 2: Tỷ lệ dược liệu khô và một số chỉ tiêu ở các lô thực nghiệm Các chỉ tiêu Các mẫu M1 M2 M3 M4 Khối lượng mẫu tươi (kg) 20 20 20 20 Độ ẩm % 13.23 10.15 12.32 11.33 Nhiệt độ sấy 60°C 60°C 60°C 60°C Khối lượng khô 5.9 6.1 5.7 5.8 Tỉ lệ % khô/ tươi 29.50 30.50 28.50 29.00 Màu sắc Vàng rơm Vàng rơm Vàng rơm Vàng rơm Độ nhuận dẻo Dẻo Dẻo Dẻo Dẻo 2.1.2 Xông sinh với thời gian khác nhau Ngưu tất sau khi thu hoạch làm tương tự như trên, chia thành 4 lô khối lượng mỗi lô 20kg, xông sinh với lượng sinh như nhau 1.5kg/tạ. Lô 1: Xông sinh 4 giờ (M5) Lô 2: Xông sinh 12 giờ (M6) Lô 3: Xông sinh 24 giờ (M7) Sau khi xông sinh đem sấy ở 60°C đến đạt độ thuỷ phần<15%, bảo quản các mẫu. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3 Bảng 3:Tỷ lệ dược khô và một số chỉ tiêu ở các lô thực nghiệm Các chỉ tiêu Các mẫu M5 M6 M7 Khối lượng mẫu tươi (kg) 20 20 20 Độ ẩm(%) 12.33 12.22 10.69 Nhiệt độ sấy 60°C 60°C 60°C Khối lượng khô(kg) 5.7 6.3 5.3 Tỉ lệ % khô/ tươi 28.50 31.50 26.50 Màu sắc Vàng rơm Vàng rơm Vàng rơm Độ nhuận dẻo Dẻo Dẻo Dẻo - Nhận xét: Mặc dù xông sinh với thời gian khác nhau nhưng màu sắc của các lô là như nhau.Sau khi sấy khô ta cũng không ngửi thấy mùi lưu huỳnh trong dược liệu (xem ảnh ) 2.1.3. Sấy ở nhiệt độ khác nhau Ngưu tất sau khi thu hoạch chặt bỏ phần thân, rũ sạch đất , phơi 2 ngày, đem rửa sạch, sấy ở nhiệt độ 60°C (kí hiệu mẫu T1), 70°C(kí hiệu T2) , 80°C(kí hiệu T3), 100°C(kí hiệu T4) đến khi đạt độ thuỷ phần <15%. Bảo quản các mẫu. Kết quả ghi ở bảng 4 Bảng 4:Tỉ lệ dược liệu khô và một số chỉ tiêu ở các lô thực nghiệm Các chỉ tiêu Các mẫu T1 T2 T3 T4 Khối lượng mẫu tươi(kg) 2 2 2 2 Độ ẩm 10.26 12.15 13.45 14.03 Nhiệt độ sấy 60°C 60°C 60°C 60°C Khối lượng khô(kg) 0.46 0.51 0.47 0.56 Tỉ lệ % khô/ tươi 23.00 25.50 23.50 28.00 Màu sắc Nâu tối Nâu tối Nâu tối Nâu tối Độ nhuận dẻo Dẻo kém Dẻo kém Dẻo kém Dẻo kém - Nhận xét: Sau khi chế dược liệu có màu nâu tối hơn mẫu xông sinh và không nhuận dẻo bằng các mẫu xông sinh. 2.2.Định lượng lưu huỳnh trong ngưu tất sau khi xông 2.2.1. Định lượng lưu huỳnh trong ngưu tất ngay sau khi xông Ngay sau khi xông xong, các mẫư được đem định lượng lưu huỳnh. Ta có: a.Kết quả các mẫu M1, M2, M3, M4 được ghi ở bảng 5, hình 1. Bảng 5: Hàm lượng lưu huỳnh trong dược liệu sau khi xông ở các sấy với lượng sinh khác nhau. Mẫu M1 M2 M3 M4 Độ ẩm(%) 59.74 58.04 61.89 62.68 Hàm lượng 2.88 3.69 6.66 8.44 Nhận xét: - Hàm lượng lưu huỳnh trong dược liệu sau khi xông với lượng lưu huỳnh đem xông từ 0.5 kg/tạ tới 3 kg/tạ thì hàm lượng lưu huỳnh trong dược liệu sau khi xông tỉ lệ thuận với lượng diêm sinh đem xông (Hình 1 ) Hàm lượng Hình 1: Hàm lượng lưu huỳnh sau khi xông ở các mẫu xông với lượng sinh khác nhau. b. Kết quả ở các mẫu M5, M6, M7 ghi ở bảng 6, hình 2. Bảng 6: Hàm lượng lưu huỳnh ở các mẫu xông sinh với thời gian khác nhau. Mẫu M5 M6 M7 Độ ẩm 61.55 62.78 58.67 Hàm lượng 4.81 5.21 6.13 Nhận xét: - Hàm lượng lưu huỳnh trong dược liệu sau khi xông tỉ lệ thuận với thời gian đem xông (Hình 2). Hình 2: Biểu đồ biểu diễn hàm lượng lưu huỳnh trong dược liệu sau khi xôngở các mẫu sấy với thời gian khác nhau. 2.2.2.Định lượng lưu huỳnh trong ngưu tất sau khi sấy Sau khi sấy khô các mẫu xông sinh, ta tiến hành định lượng lưu huỳnh trong các mẫu xông sinh được kết quả như ở bảng 7, và hình 3 Bảng 7: Hàm lượng lưu huỳnh trong dược liệu sau khi sấy. Mẫu M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 Độ ẩm 14.33 12.22 11.38 12.40 8.17 13.03 10.66 Hàm lượng 2.90 3.66 4.09 4.95 3.61 3.94 4.58 Hình 3:Hàm lượng lưu huỳnh ở các mẫu sau khi xông và sau khi sấy Nhận xét: Hàm lượng lưu huỳnh trong dược liệu sau khi sấy giảm đi so với sau khi xông. Lượng lưu huỳnh trong dược liệu sau khi xông càng cao thì sau khi sấy giảm đi càng nhiều (Hình 3) 2.2.3. Định lượng lưu huỳnh trong cao lỏng Ngưu tất thường được sử dụng dưới dạng nước sắc hoặc ngâm rưọu hoặc được chiết bằng cồn làm cao lỏng để bào chế các dạng thuốc khác vì vậy để kiểm tra chúng tôi tiến hành định lượng lưu huỳnh trong dịch chiết bằng cồn 80° và nước của ngưu tất đã xông sinh và sấy khô. Định lượng mẫu dược liệu M4 và M1. Tiến hành: chiết 100gam dược liệu bằng cồn và nước. Cô dịch chiết tới cao lỏng 1:1. Đem định lượng kết quả thu được như ở bảng 8 , hình 4. Bảng 8 :Hàm lượng lưu huỳnh trong các mẫu cao lỏng 1:1 Mẫu M1/cồn M1/nước M4/cồn M4/nước Hàm lượng lưu huỳnh % 0.14% 0.25% 0.14% 0.24% Hàm lượng Nhận xét: Hàm lượng lưu huỳnh trong dược liệu sau khi sấy và lượng lưu huỳnh trong cao 1:1 của dược liệu giảm đi hàng chục lần. Và khi chiết bằng cồn thì dư lượng lưu huỳnh giảm đi so với chiết bằng nước 1.7 lần. Hình 4: Hàm lượng lưu huỳnh trong dịch chiết nước và dịch chiết cồn (mẫu M1 và M4) 2.3. Định lượng một số thành phần hoá học trong ngưu tất 2.3.1- Định lượng đường tự do Tiến hành Cân chính xác khoảng 1g dược liệu cho vào cối sứ, nghiền kĩ. Dùng nước kéo dần vào bình định mức 100 ml, tráng kĩ chày cối và thêm nước vừa đủ 100ml, lắc đều, lọc qua giấy lọc, bỏ dịch đầu, thu lấy dịch trong. Pha mẫu chuẩn: - Cân chính xác 1g glucoza đã sấy khô ở 100-105°C đến khối lượng không đổi, hoà tan vào nước cất trong bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch. Lắc đều. Lấy 5 ml dung dịch này cho vào bình định mức 200 ml, thêm nước đến vạch. Lắc đều. - Pha thuốc thử O.Toluidin O.Toluidin 8ml Thiore 0.15g Acid acetic đậm đặc vừa đủ 100 ml Lần lượt hút chính xác vào các bình nón theo bảng sau: Ống nghiệm Ống trắng Ống chuẩn Ống thử Nước cất 0.1 ml DD chuẩn 0.1 ml Dịch lọc 0.1ml TT O.Toluidin 5 ml 5 ml 5 ml Trộn đều, nút bông và đun cách thuỷ sôi đúng 10 phút. Lấy ra làm nguội bằng nước lạnh. Đo mật độ quang ở bước sóng l=630 nm. Tiến hành làm 8 mẫu. Mỗi mẫu làm 3 lần lấy kết quả trung bình ta có kết quả như ở bảng 9. Bảng 9: Hàm lượng đường tự do trong dược liệu ở các mẫu Số lần thí nghiệm Các mẫu T0 M1` M2 M3 M4 M5 M6 M7 Lần 1 2.64 1.27 1.34 1.25 1.41 1.25 1.40 1.15 Lần 2 2.44 1.45 1.46 1.41 1.45 1.44 1.22 1.23 Lần 3 2.55 1.33 1.53 1.17 1.61 1.35 1.35 1.29 Trung bình 2.54 1.35 1.44 1.28 1.49 1.35 1.32 1.22 Hình 5: Hàm lượng đường tự do trong các mẫu thử Nhận xét: Hàm lượng đường tự do trong các mẫu xông sinh có sự biến đổi không đáng kể từ 1,22 % đến 1,49 % nhưng đều thấp hơn 2 lần so với mẫu không xông sinh (2,54 %). Chứng tỏ quá trình xông sinh ít nhiều ảnh hưởng tới hàm lượng đường tự do trong ngưu tất. 2.3.2 Định lượng saponin - Mẫu thử: cân chính xác khoảng 1 gam bột ngưu tất, cho vào cối sứ nghiền kĩ với cồn 80° , từng ít một, chuyển vào bình định mức 100ml. Tráng chày cối bằng cồn 80°, thêm cồn đến vạch, lắc đều, lọc lấy dịch trong. - Mẫu chuẩn: cân chính xác khoảng 0.04g acid oleanolic, hoà tan trong cồn 80° vừa đủ 100ml. - Pha thuốc thử: . Dung dịch Vanilin 8% . Acid sulfuric 72% Vanilin 800mg Nước cất 28 ml Cồn tuyệt đối 10ml Acid sulfuric 72 ml . Thuốc thử ortho toluidin O.Toluidin 8ml Thioure 0.15g Acid Acetic vừa đủ 100 ml - Tiến hành: Lần lượt hút chính xác thể tích các dung dịch thử và thuốc thử cho vào 3 ống nghiệm to như bảng sau: Ống nghiệm Ống trắng Ống chuẩn Ống thử Cồn 80° 0.5ml Dd chuẩn 0.5ml Dịch lọc 0.5ml Dd vanillin 8% 0.5ml 0.5ml 0.5ml Acid sulfuric 72% 5ml 5ml 5ml Trộn đều, đun cách thuỷ ở 60°C trong 10 phút. Lấy ra làm lạnh bằng nước đá. Đo mật độ quang của ống chuẩn và ống thử đối với ống trắng ở bước sóng l=538 nm. Định lượng saponin ở các mẫu xông sinh và trắng ta có kết quả trình bày ở bảng 10. Bảng 10: Hàm lượng saponin trong dược liệu ở các mẫu khảo sát Số lần Các mẫu T0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 Lần 1 10.08 9.12 10.36 10.12 10.04 10.46 9.28 10.02 Lần 2 9.48 10.20 9.28 9.76 9.78 9.70 10.46 9.56 Lần 3 10.46 10.26 9.96 10.20 10.30 10.06 10.14 10.38 Trung bình 10.01 9.86 9.87 10.03 10.04 10.07 9.96 9.99 Định lượng saponin trong các mẫu không xông sinh sấy ở các nhiệt độ khác nhau T1,T2,T4 ta có kết quả như ở bảng 11. Bảng 11:Hàm lượng saponin ở các mẫu không xông sinh Số lần Các mẫu T1 T2 T4 Lần 1 10.34 10.00 10.08 Lần 2 9.96 10.20 9.86 Lần 3 10.08 9.84 10.26 Trung bình 10.13 10.01 10.07 - Nhận xét: Ta thấy hàm lượng saponin trong các mẫu khác nhau không đáng kể. Như vậy lượng lưu huỳnh dùng để sấy và thời gian sấy không ảnh hưởng đến hàm lượng saponin trong dược liệu. 2.4-Thử độc tính cấp của lưu huỳnh và các mẫu xông sinh 2.4.1. Thử độc tính cấp của lưu huỳnh Thực hiện theo phương pháp Karber - Tiến hành: Pha hỗn dịch lưu huỳnh nồng độ 0.032gam/ml, dung môi là glycerin, chất gây thấm là tween 80. Những nhóm 12 chuột được cho uống hỗn dịch lưu huỳnh với liều tăng dần. Theo dõi và ghi số chuột chết trong 3 ngày ta có kết quả như ở bảng 12. Bảng 12: Liều độc LD50 của lưu huỳnh Số thứ tự Liều uống (g/kg) Số chuột thí nghiệm Số chuột chết Số chuột sống Tỉ lệ % chết / tổng số z d zd 1 0.64 12 0 0 0 2 0.96 12 2 10 16.67 1 0,32 0.32 3 1.28 12 6 6 50 4 0,32 1,28 4 1.92 12 6 6 50 6 0,64 3,84 5 2.56 12 10 2 83.33 8 0,64 5,12 6 3.2 12 12 12 100 11 0,64 7,04 Trạng thái của chuột chết: Tim, phổi, gan không có hiện tượng xung huyết. Co thắt cơ trơn, thành ruột căng, có biểu hiện hút nước vào lòng ruột Vì liều tối đa gây chết 100%, nên ta xác định LD50 theo công thức Benrens-Karber: LD50 = LD100 - Trong đó: d: khoảng cách giữa hai liều kế tiếp z:Trị số trung bình chuột chết gây bởi hai liều kế tiếp n:số chuột trung bình trong mỗi nhóm ta có kết quả LD50=LD100-=1.73 g/ kg 2.4.2.Thử độc tính cấp của các mẫu xông sinh -Chuẩn bị dịch chiết: Các sản phẩm chế biến được chọn để thử là các mẫu T0, M1, M3, M4 được sắc, gạn 3 lần và được cô thành cao với tỉ lệ 5 : 1 Thời gian theo dõi là 3 ngày. Nếu liều tối đa gây chết 100%, thì ta xác định LD50 theo công thức Benrens-Karber: LD50 = LD100 - Trong đó: d: khoảng cách giữa hai liều kế tiếp z: Trị số trung bình chuột chết gây bởi hai liều kế tiếp n: số chuột trung bình trong mỗi nhóm s: số chuột sống trung bình giữa 2 nhóm. Nếu liều tối đa có thể cho chuột uống mà không gây chết 100 %, mà chỉ gây chết ³ 50 % thì xác định LD50 theo công thức Benrens-Schrosser: LD50 =D1+a Trong đó a = d = D2-D1 D1:Liều gây chết ít hơn 50 % D2 :Liều gây chết lớn hơn hoặc bằng 50 % Từ trên xuống D2 + Từ D2 xuốmg Từ trên xuống D1 + Từ D2 xuống d: Hiệu giữa 2 liều liên tiếp z: Số chuột chết trung bình giữa 2 liều s: Số sống trung bình giữa 2 liều -Tiến hành thử LD50 ta có kết quả thí nghiệm sau: a. Mẫu T0 : Kết quả ghi ở bảng 13 Bảng 13:Kết quả thử độc tính cấp của T0 TT Liều uống g/kg Số chuột thí nghiệm Số chuột chết Trạng thái của chuột chết 1 100 12 0 Tim, phổi, gan không có hiện tượng xung huyết.Co thắt cơ trơn, thành ruột căng, có biểu hiện hút nước vào lòng ruột 2 150 12 0 3 200 12 0 4 250 12 2 Nhận xét: -Trạng thái chuột chết của mẫu T0 giống với trạng thái chuột chết của mẫu diêm sinh, chứng tỏ chuột chết do dư lượng lưu huỳnh. -Vì liều tối đa có thể cho chuột uống được không gây chết tối thiểu 50% số chuột thí nghiệm nên không tính được liều LD50 b. Mẫu M1 : Kết quả ghi ở bảng 14 Bảng 14 :Kết quả thử độc tính cấp của M1 TT Liều uống g/kg Số chuột thí nghiệm Số chuột chết Trạng thái của chuột chết 1 100 12 0 Tim, phổi, gan không có hiện tượng xung huyết.Co thắt cơ trơn, thành ruột căng, có biểu hiện hút nước vào lòng ruột 2 150 12 0 3 200 12 1 4 250 12 2 Nhận xét: -Trạng thái chuột chết của mẫu M1 giống với trạng thái chuột chết của mẫu diêm sinh, chứng tỏ chuột chết do dư lượng lưu huỳnh. -Vì liều tối đa có thể cho chuột uống được không gây chết tối thiểu 50% số chuột thí nghiệm nên không tính được liều LD50 c. Mẫu M3: Kết quả ghi ở bảng 15 Bảng 15 :Kết quả thử độc tính cấp của M3 TT Liều uống g/kg Số chuột thí nghiệm Số chuột chết Trạng thái của chuột chết 1 100 12 0 Tim, phổi, gan không có hiện tượng xung huyết.Co thắt cơ trơn, thành ruột căng, có biểu hiện hút nước vào lòng ruột 2 150 12 1 3 200 12 0 4 250 12 4 Nhận xét: -Trạng thái chuột chết của mẫu M3 giống với trạng thái chuột chết của mẫu diêm sinh, chứng tỏ chuột chết do dư lượng lưu huỳnh. -Vì liều tối đa có thể cho chuột uống được không gây chết tối thiểu 50% số chuột thí nghiệm nên không tính được liều LD50 d. Mẫu M4 : Kết quả ghi ở bảng 16 Vì liều tối đa có thể cho chuột uống được mà không gây chết 100%, mà chỉ gây chết ³ 50 % thì xác định LD50 theo công thức Benrens-Schrosser: LD50 =D1+a Trong đó a = d = D2-D1 D1:Liều gây chết ít hơn 50 % D1 = 150 D2 :Liều gây chết lớn hơn hoặc bằng 50 % D2 = 200 Từ trên xuống D2 + Từ D2 xuốmg A = 0,416 Từ trên xuống D1 + Từ D2 xuống B = 0,472 LD50 = 225 g/ kg Bảng 16 :Kết quả thử độc tính cấp của M4 TT Liều uống g/kg Số chuột thí nghiệm Số chuột chết Số chuột sống Tỉ lệ %chết so với tổng số z d s 1 100 12 0 12 0 50 12 2 150 12 4 8 2 50 10 3 200 12 8 4 6 50 6 4 250 12 10 2 9 50 3 Nhận xét: -Số chuột chết của các mẫu tăng theo hàm lượng lưu huỳnh có trong dược liệu, các biêu hiện của chuột chết giống với bị độc lưu hùnh chứng tỏ dư lượng lưu huỳnh trong dược liệu có ảnh hưởng đến độc tính cấp của ngưu tất. 2.5- Định lượng hàm lượng lưu huỳnh trong một số mẫu diêm sinh lưu hành trên thị trường Chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng lưu huỳnh trong các mẫu diêm sinh dùng để xông sinh dược liệu ở một số nơi: -Xã Ninh Hiệp huyện Gia Lâm Hà Nội (Ký hiệu mẫu:S1) -Thôn Nghĩa Trai xã Tân Quang huyện Văn Lâm (Ký hiệu mẫu:S2) -Thôn Thiết Trụ,huyện Khoái Châu tỉnh Hưng Yên (Ký hiệu mẫu:S3) -Trung tâm nghiên cứu cây trồng và chế biến thuốc Hà Nội (Ký hiệu mẫu:S4) Cách tiến hành: Cân chính xác 0.2g bột lưu huỳnh cho vào bình nón dung tích 250ml thêm 50ml dd KOH 0.5N/cồn và 10ml nước, đun cách thuỷ sôi đến khi tan hết lưu huỳnh và bay hết hơi cồn. Thêm 40 ml nước vào bình dung dịch có màu vàng, đậy nắp bình bằng phễu nhỏ đun sôi 10 phút, cho từ từ vào bình đang sôi 4ml H2O2 đến khi dung dịch mất màu. Đưa bình ra để nguội, phễu bằng nước, thêm 2 giọt Methyl da cam và định lượng kiềm dư bằng dung dịch acid HCL 0.5N. Song song tiến hành làm mẫu trắng. 1ml Dung dịch KOH 0.5Ntương đương với 0.008017g lưu huỳnh Kết quả được trình bày ở bảng 1. Nhận xét: Hàm lượng lưu huỳnh của các mẫu diêm sinh ở các nơi khác nhau có sự khác nhau không nhiều và có hàm lượng tương đối cao từ 94,42 % đến 98,72% Bảng 1:Hàm lượng lưu huỳnh trong các mẫu diêm sinh Lần định lượng Mẫu S1 Mẫu S2 Mẫu S3 Mẫu S4 Lần 1 96.31 95.43 101.01 100.61 Lần 2 95.67 94.11 98.23 98.22 Lần 3 94.62 95.23 99.11 97.33 Trung bình 95.53 94.92 99,45 98.72 2.6. Bàn luận kết quả -Từ kết quả trên, ta thấy khi xông sinh thì lượng sinh tăng thì dư lượng lưu huỳnh cũng tăng. Nếu ta không tăng lượng sinh mà tăng thời gian xông sinh thì dư lượng lưu huỳnh cũng tăng. Đó là do trong quá trình xông sinh ta phải dùng bao ướt để che kín lò không cho S02 bay ra, khi tăng thời gian xông sinh thì thời gian SO2 tiếp xúc với dược liệu lâu hơn nên lượng sinh bám vào nhiều hơn. -Sau khi sấy khô dư lượng lưu huỳnh giảm đi rất nhiều, do khi sấy chất khí (S02) được hấp phụ trên bề mặt của dược liệu được giải phóng do đó mà dư lượng lưu huỳnh giảm. -Khi xông sinh do SO2 là một chất o xy hoá mạnh, cho nên đã phá huỷ các enzyme trong đó có oxydase do đó làm bất hoạt enzyme này do đó mà làm cho dược liệu không bị màu nâu đen, cộng thêm H2SO4 (SO2 + O2 + H2O = H2SO4) như một chất làm sạch vì vậy mà xông sinh làm cho dược liệu có màu sắc vàng rơm. -Dư lượng sinh còn tồn trong nước sắc của ngưu tất giảm đi hàng chục lần. Đó là do, khi xông thì có cả lưu huỳnh tự do bám vào dược liệu. Khi sắc lưu huỳnh tự do rất ít tan trong nước. Hơn nữa khi sắc, do nhiệt độ nên H2SO3 =H2O+ SO2 bay lên. Vì vậy mà dư lượng lưu huỳnh giảm. -Do hoạt động của enzym, làm giải phóng đường tự do cho nên hàm lượng đường của mẫu không xônh sinh cao gấp 2 lần mẫu xông sinh. Cũng vì vậy mà xông sinh bảo quản được lâu hơn. -Hàm lượng lưu huỳnh tồn dư trong dược liệu ảnh hưởng rõ rệt đến độc tính của ngưu tất. Hàm lượng lưu huỳnh từ 2,90 % đến 4,09 % thì ít ảnh hưởng, biểu hiện số chuột chết ít (Liều 250 g/ kg chết 4 con). Nhưng đến 4,95 % thì ảnh hưởng rõ rệt liều 250 g/ kg chết 10 con. Đề xuất phương pháp xông sinh thích hợp cho ngưu tất chất lượng tốt và an toàn khi sử dụng: -Xông với lượng diêm sinh 0,5 - 1,5 kg/ tạ -Thời gian xông là 24 giờ Phần III: Kết luận và đề nghị 1- Kết luận Từ những kết quả đã thu được từ thực nghiệm ở trên, chúng tôi rút ra kết luận: * Ảnh hưởng của lượng diêm sinh và thời gian xông sinh đến dư lưọng lưu huỳnh trong ngưu tất : -Hàm lượng lưu huỳnh dư trong ngưu tất tỉ lệ thuận với lượng diêm sinh dùng để xông và thời gian xông sinh ( 2,90% đến 4,95 % ). * Ảnh hưởng của phương pháp xông sinh đến hàm lưọng saponin và đường tự do trong ngưu tất: -Lượng diêm sinh xông không ảnh hưởng đến hàm lượng saponin trong ngưu tất (9,8% đến 10 %) và làm tăng hàm lượng đường tự do(1,22 % đến 2,54 % ). * Ảnh hưởng của dư lượng lưu huỳnh đến độc tính cấp của ngưu tất -Dư lượng lưu huỳnh ảnh hưởng rõ rệt đến độc tính của ngưu tất * Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến hàm lượng saponin của ngưu tất -Nhiệt độ sấy không ảnh hưởng đến hàm lượng saponin trong ngưu tất (10,01 %- 10.13 % ) 2- Đề nghị -Tiếp tục theo dõi khả năng bảo quản của các mẫu dược liệu đã xông sinh -Nghiên cứu tiếp chế độ xông sinh định kỳ trong quá trình bảo quản dược liệu ngưu tất -Thử độc tính bán mãn của dược liệu ngưu tất có xông sinh. M1 : Mẫu dược liệu xông sinh với tỷ lệ 0.5 kg/tạ. M2 : Mẫu dược liệu xông sinh với tỷ lệ 1 kg/tạ. M3 : Mẫu dược liệu xông sinh với tỷ lệ 1.5 kg/tạ. M4 : Mẫu dược liệu xông sinh với tỷ lệ 3 kg/tạ. M5 : Mẫu dược liệu xông sinh với tỷ lệ 1.5 kg/tạ trong 4 giờ M6 : Mẫu dược liệu xông sinh với tỷ lệ 1.5 kg/tạ trong 12 giờ M7 : Mẫu dược liệu xông sinh với tỷ lệ 1.5 kg/tạ trong 24 giờ. T0 : Mẫu dược liệu được sấy khô ở 60°C. TCCS VDL : Tiêu chuẩn cơ sở Viện dược liệu Tài liệu tham khảo Tài liệu tiếng Việt [1]. Bộ môn Dược học cổ truyền(2000)-Trường đại học Dược Hà Nội-Bài giảng dược học c._.