Đánh giá đáp ứng miễn dịch của Vịt được tiêm Vacxin Cúm gia cầm H5N1 tại Trung tâm nghiên cứu Vịt Đại Xuyên

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM -------------- NGUYỄN THỊ THUÝ NGHĨA ðÁNH GIÁ ðÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA VỊT ðƯỢC TIÊM VACXIN CÚM GIA CẦM H5N1 TẠI TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VỊT ðẠI XUYÊN Chuyên ngành: Thú y Mã số : 60.62.50 LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: TS. TÔ LONG THÀNH HÀ NỘI - 2008 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt 2 năm học tập và hoàn thành luận văn, với nỗ lực của bản thân, tôi ñã nhận ñược sự giúp ñỡ, hướng dẫn tận tình của nhiều cá nhân và tập thể, cho phép tôi ñược tỏ lòng biết ơn và cảm ơn chân thành tới: Ban ðào tạo Sau ðại học, Viên Khoa học Nông nghiêp Việt Nam. Ban Giám hiệu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, khoa Sau ðại học, Thú y. Trung tâm Chẩn ñoán Thú y Trung ương, các thầy cô giáo ñã giúp ñỡ, tạo ñiều kiện ñể tôi học tập, tiếp thu kiến thức của trương trình học. Trực tiếp là thầy hướng dẫn TS. Tô Long Thành, Phó Giám ñốc Trung tâm Chẩn ñoán Thú y Trung ương. Ban Lãnh ñạo và toàn thể cán bộ, ñồng nghiệp ñang làm việc tại Trung tâm Nghiên cứu Vịt ðại Xuyên. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi ñược gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia ñình, người thân cùng bạn bè ñã ñộng viên giúp ñỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, thực hiện ñề tài. Một lần nữa tôi xin ñược bày tỏ lòng biết ơn, cảm ơn chân thành tới những tập thể, cá nhân ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ tôi hoàn thành chương trình học tập. Hà Nội tháng 12 năm 2008 Tác giả Nguyễn Thị Thuý Nghĩa Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng: - Các kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. - Mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà nội, tháng 12 năm 2008 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thuý Nghĩa Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv MỤC LỤC Trang phụ bìa i Lời cảm ơn ii Lời cam ñoan iii Mục lục iv Danh mục chữ viết tắt vii Danh mục bảng viii Danh mục biểu ñồ ix Danh mục ñồ thị x MỞ ðẦU 1 1. ðặt vấn ñề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 3 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 3 4. ðối tượng và phạm vi nghiên cứu 3 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ðỀ TÀI 4 1.1. Giới thiệu chung về bệnh cúm gia cầm 4 1.2. Lịch sử bệnh cúm gia cầm 4 1.3. Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới và trong nước 6 1.3.1. Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới 6 1.3.2. Tình hình dịch cúm gia cầm ở Việt Nam 7 1.4. ðặc tính chung của virus cúm A 11 1.4.1. Hình thái và cấu trúc của virus cúm A 12 1.4.2. Danh pháp quốc tế về virus cúm A 13 1.4.3. Những nét ñặc trưng về kháng nguyên của virus 14 1.4.4. Thành phần hoá học của virus 16 1.4.5. Quá trình nhân lên của virus 16 1.4.6. ðộc lực của virus 17 1.4.7. Nuôi cấy và lưu giữ virus cúm gia cầm 19 1.4.8. Sức ñề kháng của virus 19 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v 1.5. Dịch tễ học bệnh cúm ở loài chim 20 1.5.1. ðộng vật cảm nhiễm 20 1.5.2. ðộng vật mang virus 20 1.5.3. Sự truyền lây 21 1.5.4. Mùa vụ phát bệnh 22 1.6. Miễn dịch chống bệnh của gia cầm 22 1.7. Triệu chứng, bệnh tích của bệnh cúm gia cầm 27 1.7.1. Triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm gia cầm 27 1.7.2. Bệnh tích ñại thể của bệnh cúm gia cầm 28 1.7.3. Bệnh tích vi thể 28 1.8. Chẩn ñoán bệnh 28 1.9. Kiẻm soát bệnh 29 1.10. Tình hình sử dụng vacxin trên thế giới 30 Chương2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1. Nội dung nghiên cứu 34 2.1.1. Giám sát huyết thanh, virus trước khi tiêm vacxin. 34 2.1.2. Giám sát các phản ứng lâm sàng sau khi tiêm vacxin. 34 2.1.3. Xác ñịnh ñáp ứng miễn dịch và ñộ dài miễn dịch của vịt ñược tiêm vacxin. 34 2.1.4. Giám sát virus ñàn vịt ñược tiêm vacxin. 34 2.1.5. ðánh giá ảnh hưởng của tiêm phòng ñến một số chỉ tiêu chăn nuôi. 34 2.1.6. ðánh giá tính khả thi của việc tiêm vacxin. 34 2.2. Vật liệu nghiên cứu 34 2.3. Phương pháp nghiên cứu 36 Chương3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1. Tình hình chăn nuôi, thú y tại Trung tâm Nghiên cứu Vịt ðại Xuyên 41 3.1.1. Tình hình chăn nuôi tại Trung tâm 41 3.1.2. Công tác vệ sinh thú y tại Trung tâm 41 3.2. Kết quả giám sát huyết thanh và virus trên ñàn vịt trước khi tiêm vacxin H5N1 44 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi 3.3. Kết quả tiêm phòng vacxin cúm gia cầm H5N1 cho vịt tại Trung tâm Nghiên cứu Vịt ðại Xuyên 45 3.4. ðánh giá mức ñộ an toàn của vacxin qua triệu chứng lâm sàng 46 3.5. ðáp ứng miễn dịch và ñộ dài miễn dịch của vịt ñược tiêm vacxin ñợt 2 năm 2007 47 3.5.1. ðáp ứng miễn dịch và ñộ dài miễn dịch của vịt ñược tiêm vacxin 47 3.5.2. Phân bố các mức kháng thể kháng H5 của vịt ñược tiêm vacxin tại các thời ñiểm lấy mẫu 50 3.6. ðáp ứng miễn dịch và ñộ dài miễn dịch của vịt ñược tiêm vacxin ñợt 1 năm 2008. 53 3.6.1. ðáp ứng miễn dịch và ñộ dài miễn dịch của vịt ñược tiêm vacxin 53 3.6.2. Phân bố các mức kháng thể của vịt ñược tiêm vacxin tại các thời ñiểm lấy mẫu 55 3.7. So sánh ñáp ứng miễn dịch của vịt qua các ñợt tiêm vacxin năm 2007 và 2008 58 4.8. Kết quả giám sát virus học trên ñàn vịt ñược tiêm vacxin cúm gia cầm H5N1 61 3.9. ðánh giá ảnh hưởng của việc tiêm phòng ñến một số chỉ tiêu chăn nuôi 62 3.9.1. ðánh giá ảnh hưởng của việc tiêm phòng ñến tỷ lệ nuôi sống và khối lượng cơ thể vịt SM vỗ béo 62 3.9.3. ðánh giá ảnh hưởng của việc tiêm phòng ñến chất lượng thịt và tiêu tốn thức ăn cho vịt SM nuôi vỗ béo 64 3.9.4. ðánh giá ảnh hưởng của việc tiêm phòng ñến năng suất sinh sản của vịt thí nghiệm 65 3.10. ðánh giá tính khả thi của chương trình sử dụng vacxin cúm gia cầm tại Trung tâm Nghiên cứu Vịt ðại Xuyên 67 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 68 4.1. Kết luận 68 4.2. ðề nghị 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT TN: Thí nghiệm ARN: Acid ribonucleic cADN: Complementary ADN GMT: Geographic Mean Titre HA: Hemagglutination test HI: Hemagglutination inhibitory test HPAI: High Pathogenicity Avian Influenza KN: Antigene KT: Antibody LPAI: Low Pathogenicity Avian Influenza OIE: Office Internationale des Epizooties PBS: Phosphate- Buffered- Saline RT - PCR: Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction TTTA : Tiêu tốn thức ăn TLð: Tỷ lệ ñẻ NST: Năng suất trứng KLTB: Khối lượng trung bình TLNS: Tỷ lệ nuôi sống Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… viii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 3.1 Lịch phòng bệnh và tiêm phòng cho các ñàn giống. 43 3.2 Tình hình dịch bệnh trên ñàn vịt tại TT Nghiên cứu Vịt ðại Xuyên 44 3.3 Kết quả giám sát huyết thanh và virus trên ñàn vịt trước khi tiêm phòng 44 3.4 Kết quả tiêm vacxin cúm gia cầm năm 2008 45 3.5 Số vịt phản ứng sau tiêm vacxin H5N1 46 3.6 Tỷ lệ bảo hộ và hiệu giá kháng thể trung bình của vịt tại các thời ñiểm sau tiêm vacxin mũi 1 ñợt 2 năm 2007 48 3.7 Phân bố các mức kháng thể của vịt tại các thời ñiểm sau tiêm vacxin mũi 1 ñợt 2 năm 2007 50 3.8 Hiệu giá kháng thể trung bình của vịt ñược tiêm vacxin H5N1 ñợt 1 năm 2008 53 3.9 Phân bố các mức kháng thể của vịt tại các thời ñiểm sau khi tiêm vacxin mũi 1 ñợt 1 năm 2008 55 3.10 ðáp ứng miễm dịch của vịt qua các ñợt tiêm vacxin H5N1 năm 2007-2008 59 3.11 Kết quả giám sát virus cúm gia cầm H5N1 trên vịt ñược tiêm vacxin 62 3.12 Khối lượng cơ thể vịt SM vỗ béo ở các tuần tuổi (g/con) và tỷ lệ nuôi sống 63 3.13 Kết quả mổ khảo sát của vịt SM nuôi vỗ béo 64 3.14 Năng suất sinh sản của vịt SM thí nghiệm 66 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ix DANH MỤC BIỂU ðỒ STT Tên biểu ñồ Trang 3.1 Tỷ lệ bảo hộ của ñàn giống ñã tiêm vacxin tại các thời ñiểm lấy mẫu ñợt 2 năm 2007 49 3.2 Phân bố các mức kháng thể của vịt tại thời ñiểm 30 ngày sau tiêm vacxin mũi 1 ñợt 2 năm 2007 51 3.3 Phân bố các mức kháng thể của vịt tại thời ñiểm 60 ngày sau tiêm vacxin mũi 1 ñợt 2 năm 2007 52 3.4 Phân bố các mức kháng thể của vịt tại thời ñiểm 150 ngày sau tiêm vacxin mũi 1 ñợt 2 năm 2007 52 3.5 Tỷ lệ bảo hộ của vịt ñược tiêm vacxin tại các thời ñiểm sau tiêm vacxin mũi 1 ñợt 1 năm 2008 54 3.6 Tần số phân bố các mức kháng thể của vịt tại thời ñiểm 30 ngày sau tiêm vacxin mũi 1 ñợt 1 năm 2008 56 3.7 Phân bố các mức kháng thể của vịt tại thời ñiểm 60 ngày sau tiêm vacxin mũi 1 ñợt 1 năm 2008 56 3.8 Phân bố các mức kháng thể của vịt tại thời ñiểm 150 ngày sau tiêm vacxin mũi 1 ñợt 1 năm 2008 58 3.9 So sánh tỷ lệ bảo hộ của ñàn vịt sau tiêm vacxin H5N1 qua 2 ñợt tiêm phòng tại các thời ñiểm sau khi tiêm 60 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… x DANH MỤC ðỒ THỊ STT Tên ñồ thị Trang 3.1 Biến ñộng hàm lượng kháng thể kháng H5 của ñàn giống ñã tiêm vacxin ñợt 2 năm 2007. 49 3.2 Biến ñộng hàm lượng kháng thể của vịt sau tiêm vacxin mũi 1 ñợt 1 năm 2008 55 3.3 So sánh hiệu giá kháng thể của ñàn vịt sau tiêm vacxin H5N1 qua 2 ñợt tiêm phòng tại các thời ñiểm khác nhau 61 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 1 MỞ ðẦU 1. ðặt vấn ñề Bệnh cúm gia cầm thể ñộc lực cao (HPAI) là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, do virus gây ra có tốc ñộ lây lan rất nhanh với tỷ lệ ốm và tỷ lệ chết rất cao trong ñàn gia cầm bị nhiễm bệnh. Virus gây bệnh cho gà, vịt, ngan, ngỗng, ñà ñiểu, các loài chim và có thể gây bệnh cho cả con người. Với những tính chất nguy hiểm của bệnh, Tổ chức Thú y Thế giới (OIE) xếp bệnh vào Bảng A – Bảng danh mục các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất của ñộng vật [7]. Bệnh xảy ra khắp nơi trên thế giới và gây thiệt hại kinh tế rất lớn. Căn bệnh do virus cúm gia cầm thuộc họ Orthomyxoviridae, là virus ARN phân mảnh có khả năng ñột biến rất mạnh. Hai kháng nguyên bề mặt H (từ H1 ñến H16) và N (từ N1 ñến N9) có vai trò quan trọng trong sinh bệnh học cũng như miễn dịch học và phân loại của virus. Cuối năm 2003, dịch cúm gia cầm xảy ra trên diện rộng ở các nước Châu Á, tính ñến ñầu tháng 1 năm 2008 ñã có 66 nước xảy ra dịch cúm gia cầm trong ñó 61 nước tìm thấy virus cúm type A H5N1, các nước còn lại là H5N2. Ở Việt Nam, từ tháng 12/2003 2004 dịch ñã xảy ra ở 59 tỉnh thành trên cả nước. Tính ñến nay ñã xảy ra nhiều ñợt dịch cúm gia cầm, làm ảnh hưởng trầm trọng tới ngành chăn nuôi gia cầm nước ta, gây thiệt hại rất lớn về kinh tế - xã hội. Không chỉ ảnh hưởng trực tiếp ñến ngành chăn nuôi, dịch bệnh còn làm ảnh hưởng lớn tới các hoạt ñộng xã hội, giao lưu văn hoá - thể thao với quốc tế và gây thiệt hại lớn cho ngành du lịch nước ta. Virus cúm type A H5N1 cũng ñã gây bệnh ở người với hàng chục ca tử vong. Theo thông báo của WHO Việt Nam xếp thứ 2 sau Indonesia về số ca nhiễm bệnh và tử vong ở người. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 2 ðể dập dịch cũng như khống chế, tiến tới thanh toán bệnh cúm gia cầm, Chính Phủ ñã áp dụng hàng loạt các biện pháp như: ban hành các văn bản pháp quy; giám sát phát hiện bệnh; tiêu huỷ triệt ñể ñàn gia cầm nhiễm bệnh; vệ sinh tiêu ñộc; kiểm dịch vận chuyển, kiểm soát giết mổ. Tuy nhiên, do tập quán chăn nuôi nhỏ lẻ và ý thức chấp hành pháp lệnh thú y của người dân còn thấp nên dịch vẫn liên tục xảy ra. Rõ ràng là việc áp dụng chính sách tiêu huỷ ñàn gia cầm bệnh và nghi bị bệnh không khống chế ñược bệnh cúm gia cầm ở các nước ðông Nam Châu Á như nhận ñịnh nêu trong Hội nghị Cúm gia cầm khu vực Châu Á tại Thành phố Hồ Chí Minh tháng 5 năm 2005. Qua kinh nghiệm sử dụng vacxin cúm gia cầm ở một số nước như Hồng Kông, Italia, Mê-xi-cô, Trung Quốc, tiêm phòng là một biện pháp hỗ trợ trong chương trình khống chế bệnh cúm gia cầm nhằm làm giảm thiệt hại do bệnh gây ra. Sử dụng vacxin trở nên rất có hiệu quả khi kết hợp với loại thải có kiểm soát và áp dụng các biện pháp an toàn sinh học. Các tổ chức FAO, OIE, WHO cũng khuyến cáo các nước nên sử dụng một chiến lược tiêm phòng có ñịnh hướng trong chính sách ñối phó với bệnh cúm gia cầm. Việt Nam cũng ñã sử dụng vacxin tiêm phòng ñại trà cho toàn bộ ñàn gà, vịt trong nước. Dịch cúm gia cầm ñã bị dập tắt trong một thời gian khá dài, ñến nay lại tái bùng phát trên phạm vi cả ba miền Bắc, Trung, Nam. ðầu năm 2008 lại xuất hiện rất nhiều ổ dịch ở các ñịa phương trên cả nước. Nguy hiển hơn là dịch xảy ra trên các ñàn vịt mặc dù ñược thông báo là ñã tiêm phòng vacxin cúm mũi thứ nhất. ` Trung tâm Nghiên cứu Vịt ðại Xuyên là cơ sở giữ giống vịt quốc gia. Ngoài nhiệm vụ nuôi giữ, nhân thuần các giống vịt nhập nội Trung tâm còn cung cấp con giống cho cả ba miền Bắc, Trung, Nam; ðể phòng dịch cho ñàn giống Trung tâm cũng thực hiện tiêm phòng vacxin cúm gia cầm cho ñàn giống theo chỉ ñạo của Chính phủ. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 3 Trước tình hình thực tế ñó chúng tôi tiến hành ñề tài: “ðánh giá ñáp ứng miễn dịch của vịt ñược tiêm vacxin cúm gia cầm H5N1 tại Trung tâm Nghiên cứu Vịt ðại Xuyên” 2. Mục tiêu nghiên cứu - ðánh giá ñộ an toàn của vacxin trong ñiều kiện tiêm phòng ñại trà. - ðánh giá ñáp ứng miễn dịch của vịt ñược tiêm phòng trong giải pháp tổng thể phòng chống bệnh cúm gia cầm. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài - ðánh giá ñược ñáp ứng miễn dịch của ñàn vịt ñược tiêm vacxin cúm gia cầm H5N1, từ ñó giúp cho công tác tiêm phòng và các biện pháp phòng chống bệnh cúm gia cầm. - Là cơ sở ñể ñưa ra tính khả thi của biện pháp tiêm phòng vacxin áp dụng ñồng thời với các biện pháp an toàn sinh học trong việc phòng chống bệnh cúm gia cầm. 4. ðối tượng và phạm vi nghiên cứu - ðối tượng nghiên cứu là vịt - Thời gian nghiên cứu từ tháng 02/2008 ñến tháng 12 /2008. - ðịa ñiểm nghiên cứu tại Trung tâm Nghiên cứu Vịt ðại Xuyên – Hà Nội và Trung tâm Chẩn ñoán Thú y Trung ương. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 4 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ðỀ TÀI 1.1. Giới thiệu chung về bệnh cúm gia cầm Bệnh cúm gia cầm thường gọi là bệnh cúm gia cầm hoặc bệnh cúm gà, là một bệnh truyền nhiễm gây ra bởi virus cúm typ A thuộc họ orthomyxoviridae [7]. Các virus cúm typ A có thể gây bệnh cho một số loài ñộng vật bao gồm các loài chim, ngựa, lợn, hải cẩu và cá voi. Virus gây bệnh ở ñường hô hấp, ñường tiêu hoá hoặc hệ thống thần kinh ở nhiều loài chim bởi vì tất cả các subtyp của các virus cúm A ñã biết ñều lưu hành trong các chim hoang và các chim hoang ñược coi là vật chủ tự nhiên của virus cúm A [23]. Trước ñây, bệnh này còn ñược gọi là bệnh dịch tả gà (fowlplague) nhưng từ hội nghị quốc tế lần thứ nhất về bệnh cúm gia cầm tại Beltsville, Mỹ, năm 1981 ñã thay thế tên này bằng tên bệnh cúm truyền nhiễm cao ở gia cầm (Highly pathogennic avian influenza, viết tắt là HPAI) ñểm chỉ virus cúm typ A có ñộc lực mạnh [7]. 1.2. Lịch sử bệnh cúm gia cầm Năm 412 trước công nguyên, Hipocrates ñã mô tả về bệnh cúm. Năm 1680 một vụ ñại dịch cúm ñã ñược mô tả kỹ và từ ñó ñến nay ñã xảy ra 31 vụ ñại dịch. Trong hơn 100 năm qua ñã xảy ra 4 vụ ñại dịch cúm vào các năm 1889, 1918, 1957 và 1968 [7]. Năm 1878 ở Italy ñã xảy ra một bệnh gây tử vong rất cao ở ñàn gia cầm, sau ñó ñược ñặt tên là bệnh dịch hạch gia cầm. ðến 1901, Centami và Savunozzi ñã ñề cập ñến ổ dịch này ñược gây ra bởi virus qua lọc. Nhưng phải ñến năm 1955 mới xác ñịnh ñược virus ñó chính là virus cúm typ A (H7N1 và H7N7) gây chết nhiều gà, gà tây và các loài khác [7]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 5 Từ sau khi phát hiện virus cúm typ A, các nhà khoa học ñã tăng cường nghiên cứu và thấy virus cúm có ở nhiều loài chim hoang dã và gia cầm nuôi ở những vùng khác nhau trên thế giới và thấy rằng bệnh dịch nghiêm trọng nhất xảy ra ñối với gia cầm là những chủng gây bệnh cao thuộc phân typ H5 và H7, như ở Scotland năm 1959 là H5N1, ở Mỹ năm 1983-1984 là H5N2 [7]. Năm 1963, virus cúm typ A ñược phân lập từ gà tây ở Bắc Mỹ do loài thuỷ cầm di trú dẫn nhập virus vào ñàn gà. Cuối thập kỷ, phân typ H1N1 thấy ở lợn và có liên quan ñến những ổ dịch ở gà tây với những biểu hiện ñặc trưng là những triệu chứng ở ñường hô hấp và giảm ñẻ. Mối liên quan giữa lợn- gà tây là những dấu hiệu ñầu tiên về virus cúm ở ñộng vật có vú có thể lây nhiễm và gây bệnh cho gia cầm. Những nghiên cứu ñều cho rằng virus cúm typ A H1N1 ñã ở lợn và truyền cho gà tây, ngoài ra phân typ H1N1 ở vịt còn truyền cho lợn [7]. Các công trình nghiên cứu có hệ thống về bệnh cúm gia cầm lần lượt ñược công bố ở Australia năm 1975, ở Anh năm 1979, ở Mỹ năm 1983-1984, ở Ailen năm 1983-1984 về ñặc ñiểm sinh học, bệnh học và dịch tễ học, các phương pháp chẩn ñoán miễn dịch và biện pháp phòng chống bệnh [22]. Sự lây nhiễm từ chim hoang dã sang gia cầm ñã có từ trước năm 1970 nhưng chỉ ñược công nhận khi xác ñịnh ñược tỷ lệ nhiễm virus cúm cao ở một số loài thuỷ cầm di trú [7]. ðến nay dịch cúm gia cầm ñã xảy ra ở khắp các châu lục với mức ñộ ngày càng nguy hiểm hơn với các loài gia cầm với sức khoẻ cộng ñồng, ñã thôi thúc hiệp hội các nhà chăn nuôi gia cầm tổ chức hội thảo chuyên ñề về bệnh cúm gà. Hội thảo lần ñầu tiên tổ chức vào năm 1981, lần thứ 2 tại Ailen năm 1987, lần thứ ba cũng tại Ailen năm 1992. Từ ñó ñến nay trong các hội nghị về dịch tễ trên thế giới, bệnh cúm gia cầm luôn là một trong những nội dung ñược coi trọng [25]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 6 1.3. Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới và trong nước 1.3.1. Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới Sự phân bố và lưu hành virus cúm gia cầm ñã xảy ra trên phạm vi toàn cầu do sự di trú của các dã cầm. Vì vậy, dịch ñã xảy ra ở nhiều nước trên thế giới. Năm 1983-1984 ở Mỹ, dịch cúm gà ñã xảy ra do chủng H5N2 ở 3 bang Pensylvania, Virginia, Newtersey làm chết và tiêu huỷ hơn 19 triệu gà [23]. Cũng trong thời gian này tại Areland người ta ñã phải tiêu huỷ 270 nghìn con vịt tuy không có triệu chứng lâm sàng nhưng ñã phân lập ñược virus cúm chủng ñộc lực cao (HPAI) ñể loại trừ bệnh một cách hiệu quả nhanh chóng. Năm 1977 ở Minesota ñã phát hiện dịch trên gà tây do chủng H7N7. Năm 1986 ở Australia dịch cúm gà xảy ra tại bang Victoria do chủng H5N2. Năm 1997 ở Hồng Kông dịch cúm gà xảy ra do virus cúm typ A subtyp H5N1. Toàn bộ ñàn gia cầm của lãnh thổ này ñã bị tiêu diệt và ñã gây tử vong cho con người [7]. Như vây ñây là lần ñầu tiên virus cúm ñã vượt “rào cản về loài” ñể lây cho người ở Hồng Kông làm cho 18 người nhiễm bệnh, trong ñó có 6 người chết [31]. Năm2003, ở Hà Lan dịch cúm ga cầm ñã xảy ra với quy mô lớn do chủng H7N7, 30 triệu gia cầm bị tiêu huỷ, 83 người lây nhiễm và 1 người chết, gây thiệt hại về kinh tế hết sức nghiêm trọng [23]. Cuối năm 2003 ñầu năm 2004 ñã có 11 quốc gia ở Châu Á thông báo có dịch cúm là Nhật Bản, Hàn Quốc, Thái Lan, Lào, Campuchia, Indonesia, Trung Quốc, Hồng Kông, ðài Loan, Việt Nam và Pakistan. -Nhật Bản: Dịch cúm gia cầm H5N1 phát ra từ ngày 27/1/2004, ổ dịch sau cùng ngày xảy ra ngày 5/3/2004. -Hàn Quốc: Dịch cúm gia cầm H5N1 xảy ra từ 12/12/2003 ñến 24/03/2004. Qua chương trình giám sát virus cúm trên vịt tại Hàn Quốc, ngày Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 7 21/11/2007 ñã phát hiện một trang trại chăn nuôi vịt ở Kwangju Jikhalsi (Yongdoo- dong), phía tây nam Hàn Quốc lưu hành chủng virus thể ñộc lực thấp H7N8. Toàn bộ 19.200 vịt con trong trang trại bị nhiễm bệnh và 3 trại xung quanh ñã bị tiêu huỷ. Trước ñó, trong tháng 3 năm 2007 cũng ñã xuất hiện một ñợt dịch cúm tại nước này. -Thái Lan: Ổ dịch H5N1 ñầu tiên ñược xác ñịnh vào ngày 23/01/2004 tính ñến giữa tháng 3 năm 2004 Thái Lan ñã phát hiện 11 tỉnh có dịch cúm gia cầm với tổng số gia cầm bị tiêu huỷ ñợt 1 khoảng 30 triệu con. ðợt dịch thứ 2 phát hiện từ 3/7/2004 ñến 14/02/2005. -Hồng Kông: Dịch xảy ra vào 26/01/2004. Từ ñó ñến nay dịch xảy ra lẻ tẻ và hàng chục triệu gia cầm ñã bị tiêu huỷ. -Indonesia: Dịch cúm gia cầm phát hiện vào tháng 1/2004. Dịch xuất hiện lần thứ 2 vào 23/03/2005. ðến nay số người tử vong do cúm gia cầm ở nước này ñã tăng tới 100 người chiếm gần nửa tổng số người tử vong vì cúm gia cầm trên thế giới. -Trung Quốc: Ổ dịch ñầu tiên xuất hiện ngày 27/01/2004 ở tỉnh Quảng Tây, sau ñó lan ra 15 tỉnh khác, ñặc biệt các tỉnh có biên giới Việt Nam ñều có dịch. -Campuchia: Dịch H5N1 xảy ra từ 24/1/2004. - Lào: Dịch H5N1 xảy ra từ ngày 27/01/2004 ñến 13/02/2004. -Malaysia: Ổ dịch ñầu tiên phát ra ngày 19/08/2004, ổ dịch sau cùng xảy ra ngày 22/01/2004. Tính ñến ñầu tháng 1 năm 2008 ñã có 66 nước xảy ra dịch cúm gia cầm trong ñó 61 nước tìm thấy virus cúm type A H5N1. 1.3.2. Tình hình dịch cúm gia cầm ở Việt Nam Dịch cúm gia cầm xuất hiện lần ñầu tiên ở nước ta vào cuối tháng 12 năm 2003 và ñến nay xảy ra thành các ñợt chính như sau: Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 8 * ðợt dịch thứ nhất từ tháng 12/2003 ñến 30/3/2003. Cuối tháng 12/2003 dịch cúm gia cầm thể ñộc lực cao với tác nhân gây bệnh là virus cúm gia cầm H5N1 xảy ra ở Việt Nam. ðây là lần ñầu tiên bệnh xuất hiện tại Việt Nam và vì thế nó có thể ñược coi là một bệnh mới ở gia cầm. ðặc ñiểm của ñợt dịch thứ nhất này là dịch lây lan một cách nhanh chóng với nhiều ổ bệnh xuất hiện cùng một lúc ở nhiều ñịa phương khác nhau ñã gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi gia cầm. Ngay cả những trại gia cầm nằm ở những vùng không có dịch cũng gặp phải những khó khăn trong việc duy trì ñàn gia cầm dẫn ñến việc phải tiêu huỷ. ðợt dịch này ñã làm cho gia cầm của 2.574 xã (phường) thuộc 381 huyện (thị trấn) của 57 tỉnh (thành phố) của Việt Nam bị mắc bệnh.. Tổng số gia cầm bị chết và bị tiêu huỷ là hơn 43,9 triệu con chiếm 16,8% tổng số gia cầm của cả nước. Trong ñó, 30,4 triệu con gà, 13,5 triệu con thuỷ cầm. Ngoài ra còn có 14,76 triệu con chim cút và các loại khác bị chết và bị tiêu huỷ. Ca bệnh ñầu tiên ñược báo cáo xảy ra vào cuối tháng 12 năm 2003 ở một xã thuộc tỉnh Hà Tây, miền Bắc Việt Nam. Dồng thời với thời ñiểm ñó, các ổ bệnh cúm gia cầm cũng xảy ra ở tỉnh Tiền Giang và Long An ở phía Nam. Sau thời ñiểm này, bệnh lây lan rất nhanh từ tỉnh này sang tỉnh khác, bao gồm cả các tỉnh thuộc miền Trung và Tây Nguyên. ðến ñầu tháng 2 năm 2004, bệnh cúm gia cầm ñã lan ra hầu như khắp cả nước với diễn biến phức tạp. Bình quân một ngày có khoảng 13-230, 15-20 huyện phát sinh ổ dịch mới trong cả nước. Số gia cầm phải tiêu huỷ lên tới 2- 3 triệu con/ ngày, cao ñiểm nhất lên ñến 4 triệu con. Sau ngày 29 tháng 2 năm 2004 không có thông báo về các ổ dịch mới và không còn gia cầm bị tiêu huỷ. Như vậy ñợt dịch thứ nhất có 57 tỉnh có dịch trên tổng só 61 trong cả nước, số lượng xã có dịch cũng rất khác nhau, dao ñộng từ 1% ñến 99% số Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 9 xã. Có 4 tỉnh là Tuyên Quang, Phú Yên, Khánh Hoà và Bình Thuận không bị dịch. Hầu hết các tỉnh có dịch ñều có trên 10% số xã có dịch. Theo thống kê cho ñến cuối ñợt dịch, ñồng bằng sông Hồng và ñồng bằng sông Cửu Long là những khu vực có tỷ lệ số xã có gia cầm bị mắc bệnh cao nhất. *ðợt dịch thứ 2 từ tháng 4 ñến tháng11 năm 2004: Các ổ dịch cúm gia cầm thể ñộc lực cao ñã tái xuất hiện vào tháng 4 năm 2004 ở một số tỉnh thuộc ñồng bằng sông Cửu Long. Bệnh chủ yếu xuất hiện ở các hộ chăn nuôi nhỏ lẻ và hầu như không có trại chăn nuôi lớn nào bị nhiễm bệnh. Dịch có khuynh hướng xuất hiện ở những vùng có chăn nuôi nhiều thuỷ cầm. Dịch ñã xảy ra ở 46 xã phường của 32 quận, huyện, thị xã thuộc 17 tỉnh. Thời gian cao ñiểm nhất là tháng 7 sau ñó giảm dần, ñến tháng 11 cả nước chỉ có 1 ñiểm phát dịch. Tổng số gia cầm bị tiêu huỷ trong thời gian này là 84.078con, trong ñó 55.999 con gà, 8.132 con vịt và gần 20.000 con chim cút. * ðợt dịch thứ 3 từ tháng 12 năm 2004 ñến tháng 5 năm 2005: Trong thời gian này dịch ñã xuất hiện ở 670 xã của 182 huyện thuộc 36 tỉnh, thành phố (15 tỉnh phía Bắc, 21 tỉnh phía Nam). Thời ñiểm xuất hiện các ổ dịch nhiều nhất là vào tháng 11/2005 với 143 ổ dịch xảy ra trên 31 tỉnh thành phố, số gia cầm tiêu huỷ là 470.495 con gà, 8250.000 con vịt ngan và 551.000 con chim cút. Bệnh xuất hiên ở tất cả các tỉnh thành phố thuộc ñồng bằng sông Cửu Long [2]. * ðợt dịch thứ 4 từ 01/10/2005 ñến 15/12/2005: Từ ñầu tháng 10/2005 ñến 15/12/2005 dịch ñã tái phát ở 285 xã, phường, thị trấn thuộc 100 quận, huyện của 24 tỉnh, thành phố. Số gia cầm ốm, chết và tiêu huỷ là 3.700.000 con, trong ñó 1.250.000 con gà, 2.000.000 con vịt; 484.781 chim cút, bồ câu, chim cảnh. *ðợt dịch thứ 5: Sau gần một năm khống chế thành công dịch cúm gia cầm, ngày 06/12/2006 dịch cúm gia cầm ñã tái phát tại Cà Mau, Bạc Liêu, sau ñó Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 10 xuất hiện ở 6 tỉnh khác (Hậu Giang, Cần Thơ, Trà Vinh, Vĩnh Long, Kiên Giang và Sóc Trăng) thuộc ñồng bằng sông Cửu Long và 3 tỉnh (Hà Nội, Hà Tây, Hải Dương) thuộc ñồng bằng sông Hồng. Sau gần 2 tháng, dịch ñã ñược dập tắt. Trong ñợt này, dịch ñã xảy ra trên 83 xã, phường của 33 huyện, quận thuộc 11 tỉnh, thành phố. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là hơn 100 ngàn con. Các ổ dịch xảy ra chủ yếu trên ñàn vịt chăn nuôi nhỏ lẻ, dưới 3 tháng tuổi, ấp nở trái phép và chưa ñược tiêm phòng vacxin. Ngoài 2 tỉnh Cà Mau và Bạc Liêu, còn ở các ñịa phương khác dịch lây lan chậm , quy mô dịch nhỏ (dịch ở 1 hoặc 2 hộ chăn nuôi) nên ñược bao vây và dập tắt ngay. *ðợt dịch thứ 6: Dịch bắt ñầu tái phát tại Nghệ An từ ngày 1/5/2007, ñến 23/8/007 dịch ñược kiểm soát. Trong ñợt dịch này, dịch ñược phát hiện tại 167 xã phường của 69 huyện, quận thuộc 21 tỉnh. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 245,5 ngàn con (gà chiếm 5,91% và thuỷ cầm chiếm 94%). Dịch xảy ra chủ yếu trên ñàn thuỷ cầm, ñặc biệt là thuỷ cầm dưới hai tháng tuổi. Phần lớn là vịt chưa ñược tiêm phòng vacxin, một số ổ dịch xuất hiện trên ñàn ñã ñược tiêm phòng một mũi. *Một số nhận xét chung về dịch cúm gia cầm tại Việt Nam -Tại thời ñiểm 2003-2004, Việt Nam là quốc gia có ổ dịch cúm gia cầm bệnh, chết tiêu huỷ nhiều nhất (chiếm hơn 90%), có số người nhiễm bệnh và tử vong do virus cúm cao nhất thế giới, do ñó các nước và các Tổ chức quốc tế coi Việt Nam là tâm ñiểm của ñại dịch cúm. +Dịch xảy ra chủ yếu ở vùng ñồng bằng sông Hồng và sông Cửu Long (vùng ñất trũng, kênh rạch nhiều, mật ñộ chăn nuôi gia cầm cao, có tập quán chăn nuôi vịt chạy ñồng ...), diện tích rộng. +Giai ñoạn này dịch thường phát theo chu kỳ từ tháng 12 năm trước ñến tháng 3 năm sau, cao ñiểm thường vào cuối tháng 1 ñầu tháng 2. Thời gian này, thời tiết thuận lợi cho virus tồn tại và phát triển, ñồng thời mật ñộ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 11 chăn nuôi cao cũng như các hoạt ñộng vận chuyển, buôn bán gia cầm tăng cao ñể phục vụ tết nguyên ñán. +Tỷ lệ mắc cao ở ñàn có quy mô từ 100-500 con (chiếm khoảng 30%) và giảm dần ở những trại có quy mô lớn. Loại hình chăn nuôi hỗn hợp (cả gà và thuỷ cầm) có tỷ lệ mắc cao hơn (chiếm khoảng 50%). +Tỷ lệ gà mắc bệnh chết nhiều hơn thuỷ cầm. -Năm 2005, sau khi áp dụng các biện pháp ñồng bộ phòng chống dịch ñặc biệt là việc tiêm vacxin phòng bệnh, dịch ñã giảm rõ rệt cả về quy mô, mức ñộ; dịch xuất hiện rải rác ở diện hẹp. Số lượng ổ dịch và số gia cầm mắc bệnh, chết giảm rất nhiều. Ổ dịch xuất hiện chủ yếu trên ñàn gia cầm chăn nuôi nhỏ lẻ tại các hộ gia ñình. Trong năm 2005, dịch tập chung chủ yếu trên dàn vịt, tỷ lệ mắc bệnh và chết ở vịt cao nhất chiếm 50,80%, gà chiếm 31,14%. Các ổ dịch phần lớn là trên ñàn gia cầm chưa kịp tiêm phòng và một số ñàn mới tiêm phòng ñược 1 mũi, chưa có ñủ kháng thể bảo hộ. -Năm 2006, Việt Nam ñã khống chế thành công dịch cúm gia cầm. -Từ cuối năm 2006 ñến nay, các ổ dịch chủ yếu xuất hiện trên vịt, sau ñó lây sang cho gà. Các ổ dịch phát ra 100% trên ñàn thuỷ cầm chăn nuôi nhỏ lẻ của các hộ gia ñình, phần lớn là trên ñàn không tiêm phòng. Dịch phát ra không theo quy luật, xuất hiện cả trong thời ñiểm mùa hè. 1.4. ðặc tính chung của virus cúm A Virus cúm A là một trong bốn nhóm của họ Orthomyxoviridae, bao gồm: + Nhóm virus cúm A (Influenza A virus): gây bênh cho mọi loài chim, một số ñộng vật có vú và cả con người. + Nhóm virus cúm B (Influenza B virus): Chỉ gây bệnh cho người. + Nhóm virus cúm C (Influenza C virus): Gây bệnh cho người, lợn. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 12 + Nhóm Thogotovirus. Virus cúm gà typ A thuộc họ Orthomyxoviridae, chứa hệ gen là ARN 1 sợi âm [ss(-)ARN] bao gồm 8 phân ñoạn, trong ñó phân ñoạn 4 mã hoá cho protein hemagglutinin (HA) và phân ñoạn 6 mã hoá cho protein neuraminidase (NA) là những protein kháng nguyên bề mặt. Trong tự nhiên, virus cúm A tồn tại trong các phân typ là kết quả tái tổ hợp của 15 HA (H1- 15) và 9 NA (N1-9). Gần ñây người ta phát hiện thêm 1 phân typ HA mới (H16) từ chim hải âu ñen tại Thuỵ ðiển [16]. 1.4.1. Hình thái và cấu trúc của virus cúm A ARN của virus là một sợi ñơn chia thành 8 ñoạn kế tiếp nhau mang 10 mật mã cho 10 loại virion protein khác nhau: HA, NA, NP, M1, M2, PB1, PB2 và PA. ðoạn ARN có trọng lượng nhỏ nhất mang mật mã cho 2 loại không có cấu trúc protein là NS1 và NS2, chúng dễ dàng tách ñược ở các tế bào bị nhiễm. Tất cả 8 ñoạn của sợi ARN có thể tách và phân biệt dẽ dàng qua phương pháp ñiện di. Hạt virus (ñược gọi là virion) có cấu trúc hình khối hoặc ñôi khi có dạng hình khối kéo dài, ñường kính khoảng 80-120nm, thậm chí nhiề._.u khi viron có dạng kéo dài thành hình sợi, có thể có ñộ dài ñến vài µm. Phân tử lượng của một hạt viron vào khoảng 250 triệu Dalton [16,59]. - Phân ñoạn 1-3: Mã hoá cho protein PB1, PB2 và PA là các protien có chức năng là enzim polymerase tổng hợp axit Ribonucleic nguyên liệu cho hệ gen và các ARN thông tin tổng hơp protein của virus [39]. - Phân ñoạn 4: Mã hoá cho protein Hemagglutinin (HA) là một protein bề mặt cắm vào gốc bên trong, có chức năng hợp nhất vỏ virus với màng tế bào nhiễm và tham gia vào phản ứng trung hoà virus [40]. HA là polypeptit gồm 2 chuỗi HA1 và HA2 nối với nhau bằng ñoạn oligopeptit ngắn, thuộc loại hình mô typ riêng ñặc trưng cho các subtyp H (H1- H16) trong tái tổ hợp Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 13 tạo nên biến chủng [40, 67]. Mô typ của chuỗi oligopeptit này chứa một số axit amin cơ bản làm khung, thay ñổi ñặc hiệu theo từng loại hình subtyp H. Sự thay ñổi ñặc hiệu theo từng loại hình subtyp H. Sự thay ñổi thành phần của chuỗi nối quyết ñịnh ñộc lực của virus thuộc biến chủng mới [16, 40, 50, 67]. - Phân ñoạn 5: mã hoá cho protein Nucleoprotein (NP) một loại protein ñược phosphoryl hoá, có biểu hiện tính kháng nguyên ñặc hiệu theo nhóm, tồn tại trong hạt virion trong dạng liên kết với mỗi phân ñoạn ARN nên loại NP còn ñược gọi là Ribonucleo protein [16, 43]. - Phân ñoạn 6: Mã hoá cho protein enzim Neuraminidae (NA), có chức năng là một enzim phân cắt HA sau khi virus vào bên trong tế bào bị nhiễm [49]. - Phân ñoạn 7: Mã hoá cho 2 tiểu phần protein ñệm (matrix protein) M1 và M2 là protein màng không ñược glycosyl hoá, có vai trò làm ñệm bao bọc lấy ARN hệ gen. M2 là một tetramer có chức năng tạo khe H+ giúp cởi bỏ virus sau khi xâm nhập vào tế bào cảm nhiễm. M1 có chức năng tham gia vào quá trình tổng hợp và nảy mầm của virus [49]. - Phân ñoạn 8: Có ñộ dài ổn ñịnh (890 nucleotit) mã hoá cho 2 tiểu phần protein không cấu trúc NS1 và NS2 có chức năng chuyển ARN từ nhân ra kết hợp với M1, kích thích phiên mã, chống interferol [60]. 1.4.2. Danh pháp quốc tế về virus cúm A ðể lưu trữ một cách khoa học và ñầy ñủ các chủng virus cúm sau khi phân lập phải ñược ký hiệu theo danh pháp quy ñịnh, với trật tự như sau: tên serotyp/loài/loài bị nhiễm/nơi phân lập/số hiệu của chủng/thời gian phân lập/loại hình phân typ [HA(H) và NA(N)]. Ví dụ, virus cúm có ký hiệu (A/Gs/HK/427-4/99/H5N1), có nguồn thông tin về danh pháp là: cúm nhóm A; loài nhiễm là ngỗng (Gs = Goose); nơi phân lập là Hồng Kông (HK); số hiệu 437- 4; thời gian phân lập năm 1999; phân typ H5N1 [16]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 14 1.4.3. Những nét ñặc trưng về kháng nguyên của virus Các loại kháng nguyên ñược nghiên cứu nhiều nhất là protein nhân (Nucleoprotein, NP), protein ñệm (matrix protein, M1), protein gây ngưng kết hồng cầu (Hemagglutinin, HA) và protein enzim cắt thụ thể (Neuraminidase, NA), NP và M1 là protein thuộc loại hình kháng nguyên ñặc hiệu nhóm (genusspecific antigen), ký hiệu là GS kháng nguyên; HA và NA là protein thuộc loại hình kháng nguyên ñặc hiệu typ và dưới typ (typ- specific antigen), ký hiệu là ts kháng nguyên. Một ñặc tính quan trọng là virus cúm có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của nhiều loại ñộng vật. ñó là sự kết hợp giữa mấu lồi kháng nguyên HA trên bề mặt của virus cúm với thụ thể có trên bề mặt hồng cầu, làm cho hồng cầu ngưng kết thông qua cầu nối virus, gọi là phản ứng ngưng kết hồng cầu HA (Hemagglutination test). Kháng thể ñặc hiệu của kháng nguyên HA có khả năng trung hoà các loại virus tương ứng, chúng là kháng thể trung hoà có khả năng tiêu diệt virus gây bệnh. Nó có thể phong toả sự ngưng kết bằng cách kết hợp với kháng nguyên HA. Do vậy thụ thể của hồng cầu không bám vào ñược ñể liên kết tạo thành mạng ngưng kết. Người ta gọi là phản ứng ñặc hiệu KN-KT có hồng cầu tham gia là phản ứng ngăn cản ngưng kết hồng cầu HI (hemagglutination inhibition test). Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) và phản ứng ngăn cản ngưng kết hồng cầu (HI) ñược sử dụng trong chẩn ñoán cúm gia cầm. Theo Ito và Kawaoka (1998), sự phức tạp trong diễn biến kháng nguyên của virus cúm là sự biến ñổi trao ñổi trong nội bộ gen dẫn ñến sự biến ñổi liên tục về tính kháng nguyên [51, 53]. Có 2 cách biến ñổi kháng nguyên của virus cúm: + ðột biến ñiểm (ñột biến ngẫu nhiên hay hiện tượng trôi trượt, lệch lạc Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 15 về kháng nguyên- Antigenic drift). ðây là kiểu ñột biến xảy ra thường xuyên liên tục trong quá trình tồn tại của virus mà bản chất là do có sự thay ñổi nhỏ về trình tự nucleotit của gen mã hoá, ñặc biệt ñối với kháng nguyên H và kháng nguyên N. Kết quả là tạo ra các phân typ cúm hoàn toàn mới có tính thích ứng loài vật chủ khác nhau và mức ñộ ñộc lực gây bệnh khác nhau. Chính nhờ sự biến ñổi này mà virus cúm A tạo nên 16 biến thể gen HA (H1- 16) và 9 kháng nguyên N (N1-9) [8]. + ðột biến tái tổ hợp di truyền (hiện tượng thay ca – antigenic Shift). Hiện tượng tái tổ hợp gen ít xảy ra hơn so với hiện tượng ñột biến ñiểm. Hiện tượng này chỉ xảy ra khi 2 hoặc nhiều loại virus cúm khác nhau cùng nhiễm vào một tế bào chủ do sự trộn lẫn 2 bộ gen của virus. ñiều này tạo nên sự sai khác cơ bản về bộ gen của virus cúm ñời con so với virus bố mẹ. Khi hiện tượng tái tổ hợp gen xuất hiện có thể sẽ gây ra các vụ dịch lớn cho người và ñộng vật với mức ñộ nguy hiểm không thể lường trước ñược. Ví dụ năm 1918-1920 làm chết 20-40 triệu người trên toàn thế giới mà tác nhân gây bệnh là virus H1N1 từ lợn lây sang người kết hợp với virus cúm người tạo ra chủng virus mới có ñộc lực rất mạnh [23]. Do hạt virus cúm A có cấu trúc là 8 ñoạn gen nên về lý thuyết từ 2 virus có thể xuất hiện 256 kiểu tổ hợp của virus thế hệ sau [7]. Khi nghiên cứu về ñặc tính kháng nguyên của virus cúm thấy giữa các biến thể tái tổ hợp và biến chủng subtyp về huyết thanh học không hoặc rất ít có phản ứng chéo. ðây là ñiểm trở ngại lớn cho việc nghiên cứu nhằm tạo ra vacxin cúm ñể phòng bệnh cho người và ñộng vật [54, 55]. Khi xâm nhiễm vào cơ thể ñộng vật, virus cúm A kích thích cơ thể sản sinh ra kháng thể ñặc hiệu, trong ñó quan trọng hơn cả là kháng thể kháng HA, chỉ có kháng thể này mới có vai trò trung hoà virus cho bảo hộ miễn dịch. Một số kháng thể khác có tác dụng kìm hãm sự nhân lên của virus, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 16 kháng thể kháng M2 ngăn cản chức năng M2 không cho quá trình bao gói virus xảy ra [61, 63]. 1.4.4. Thành phần hoá học của virus ARN của virus chiếm 0.8 -1.1%; protein chiếm 70-75%; lipit chiếm 20- 24%; hydratcacbon chiếm 5-8% khối lượng hạt virus. Lipit tập chung ở màng virus và chủ yếu là lipit có gốc phospho, số còn lại là cholesterol, glucolipit và một ít hydrocacbon gồm các hạt men galactose, ribose, fructose, glucosamin. Thành phần chính protein của virus chủ yếu là glycoprotein [25]. 1.4.5. Quá trình nhân lên của virus Theo kingrbury 1985, Fenner và cộng sự mô tả quá trình nhân lên (sinh sản) của virus ñược tóm tắt như sau: Virus xâm nhập vào tế bào nhờ chức năng của protein HA thông qua hiện tượng ẩm bào (endocytosis) qua cơ chế trung gian tiếp hợp thụ thể. Thụ thể liên kết tế bào của virus cúm có bản chất là axit sialic cắm sâu vào glycoprotein hay glycolipit của vỏ virus. Trong khoang ẩm bào, khi nồng ñộ pH ñược ñiều hoà ñể giảm xuống mức thấp xẽ xảy ra quá trình hợp nhất màng tế bào virus, và sự hợp nhất này phụ thuộc vào sự cắt rời protein HA nhờ enzim peptidase và enzim protease của tế bào. Lúc này nucleocapsid của virus ñi vào trong nguyên sinh chất rồi vào trong nhân tế bào, chuẩn bị thực hiện quá trình tổng hợp ARN nguyên liệu hệ gen cho các virion mới. Hệ thống enzim sao chép của virus ngay lập tức tạo nên các ARN thông tin. Các phân ñoạn ARN hệ gen ñược mũ hoá ở 10-13 nucleotit ñầu 5’ với nguyên liệu mũ hoá lấy từ ARN tế bào, nhờ vào hoạt tính enzim PB2 của virus. ARN thông tin của virus sao chép trong nhân ñược chuyển vận ra nguyên sinh chất, ñược ribosom trợ giúp tổng hợp nên protein cấu trúc và protein nguyên liệu. Protein H, N,M2, ở lại trong nguyên sinh chất, ñược vận Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 17 chuyển xuyên qua hệ thống võng mạc nội mô (RE) và hệ golgi sau ñó ñược cắm lên màng tế bào nhiễm. Protein NS1, NP, M1 ñược chuyển vận vào nhân ñể bao bọc ñệm lấy nguyên liệu ARN hệ gen mới ñược tổng hợp [16, 56]. Song song với quá trình sao chép ARN thông tin và tổng hợp protein cấu trúc, protein nguyên liệu, virus tiến hành tổng hợp nguyên liệu di truyền là các sợi ARN mới. Từ sợi ARN âm ñơn của virus ban ñầu, một sợi dương ARN toàn vẹn ñược tạo ra theo cơ chế bổ sung, sợi dương mới này lại làm khuôn ñể tổng hợp nên sợi âm ARN mới làm nguyên liệu. Các sợi âm ARN mới, một số vừa làm nguyên liệu ñể lắp ráp virion mới, số khác lại làm khuôn ñể tổng hợp ARN theo cơ chế như với sợi ARN của virus ñầu tiên. Các sợi ARN hệ gen ñược tạo ra là một sợi hoàn chỉnh về ñộ dài và ñược các protein ñệm (NS1,M1, NP) bao gói tạo nên ribonucleocapsid (nucleoriboprotein) ngay trong nhân tế bào nhiễm, sau ñó ñược vận chuyển ra nguyên sinh chất rồi ñược vận chuyển ñến vị trí màng tế bào có sự biến ñổi ñặc hiệu với virus. Sự kết hợp cuối cùng của tổ hợp nucleoriboprotein với các protein cấu trúc (HA, NA, M2) tạo nên hạt virus hoàn chỉnh mới và giải phóng ra khỏi tế bào nhiễm theo hình thức nảy chồi. 1.4.6. ðộc lực của virus ðộc lực của virus cúm gia cầm có sự giao ñộng lớn, phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trước hết là protein HA. Các nghiên cứu ở mức ñộ phân tử cho thấy khả năng lây nhiễm của virus phụ thuộc vào tác ñộng của men proteaza vật chủ ñến sự phá vỡ của liên kết hoá học sau khi dịch mã của phân tử ngưng kết, thực chất là sự cắt rời protein HA thành 2 tiểu phần HA1 và HA2. Tính thụ cảm của ngưng kết tố và sự phá vỡ liên kết của men protease lại phụ thuộc vào số lượng các amino axit cơ bản tại ñiểm bắt ñầu phá vỡ các liên kết. Các enzim giống trypsin có khả năng phá vỡ liên kết khi chỉ có một phân tử Arginin, trong khi ñó cá enzim protease khác lại cần nhiều amino axit cơ bản. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 18 ðể ñánh giá ñộc lực của virus cúm sử dụng phương pháp gây bệnh cho gà 3-6 tuần tuổi bằng cách tiêm tĩnh mạch 0.2ml nước trứng ñã ñược gây nhiễm virus với tỷ lệ pha loãng 1/10, sau ñó ñánh giá mức ñộ bệnh của gà ñể ño ñiểm (chỉ số IVPI). ðiểm tối ña là 3 ñiểm và ñó là virus có ñộc lực cao nhất. Theo quy ñịnh của tổ chức thú y thế giới (OIE), virus nào có chỉ số IVPI từ 1.2 trở lên thuộc loại có ñộc lực cao. Các nhà khoa học ñã thống nhất chia ñộc lực của virus ra 3 loại: - Virus có ñộc lực cao: Nếu sau khi tiêm tĩnh mạch cho gà 10 ngày làm chết 75-100% số gà thực nghiệm và virus gây cúm gà phải làm chết 20% số gà mẫn cảm thực nghiệm và phát triển tốt trên môi trường tế bào xơ phôi gà và tế bào thận trong môi trường nuôi cấy không có trypsin. - Virus có ñộc lực trung bình: Là những chủng virus gây bệnh cúm gà với triệu chứng lâm sàng rõ rệt nhưng gây chết không quá 15% số gà bị nhiễm bệnh tự nhiên hoặc không quá 20% số gà mẫn cảm thực nghiệm. - Virus có ñộc lực thấp (nhược ñộc): Là những virus phát triển tốt trong cơ thể gà, có thể gây ra dịch cúm nhưng không có triệu chứng lâm sàng rõ rệt và không tạo ra bệnh tích ñại thể, không làm chết gà. Trong thực tế người ta chia virus cúm gia cầm ra làm 2 loại: Virus có ñộc lực thấp – LPAI (Light Pathogenic Avian Influenza). Loại virus có ñộc lực cao – HPAI (Hight Pathogenic Avian Influenza). Cho ñến nay người ta thừa nhận chỉ có 2 biến chủng virus có cấu trúc kháng nguyên H5 và H7 ñược coi là loại có ñộc lực cao gây bệnh ở gia cầm, nhưng không phải tất cả các chủng mang gen H5, H7 ñều gây bệnh [51]. Thực tế chứng minh rằng các chủng có ñộc lực thấp trong quá trình lưu hành trong thiên nhiên và trong ñàn thuỷ cầm có thể ñột biến nội gen hoặc ñột biến tái tổ hợp ñể trở thành các chủng có ñộc lực cao – HPAI [45, 58]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 19 1.4.7. Nuôi cấy và lưu giữ virus cúm gia cầm Virus cúm gia cầm phát triển tốt trên môi trường phôi gà 9-11 ngày tuổi, trong nước phôi gà tập chung khá nhiều virus và có thể lưu giữ virus ñược vài tuần ở ñiều kiện 4oC. Khả năng tồn tại và gây bệnh của virus rất cao nếu ta bảo quản nước phôi ñó ở 70oC hoặc cho ñông khô [25]. Virus cúm gia cầm cũng phát triển tốt trên môi trường tế bào xơ phôi gà (CEF) và tế bào thận chó MDCK (Madin- Darby Canine Kidney cell) với ñiều kiện môi trường nuôi cấy tế bào không chức trypsin [25]. 1.4.8. Sức ñề kháng của virus Virus rất nhạy cảm với nhiệt ñộ và một số chất sát trùng thông thường: ở nhiệt ñộ 56oC virus mất ñộc thường sau 60 phút, 60oCsau 10 phút. Virus không còn khả năng lây nhiễm khi giữ ở 4oC trong 4 tháng và ở nhiệt ñộ phòng 18oC trong 4 tuần [68]. Trong thức ăn, nước uống bị ô nhiễm virus có khả năng tồn tại hàng tuần. ðây chính là nguồn bệnh nguy hiểm và tiềm tàng ñể làm lây lan dịch bệnh [25]. Trong nước ao hồ virus vẫn có thể duy trì ñặc tính gây bệnh tới 4 ngày ở nhiệt ñộ 22oC và trên 30 ngày ở nhiệt 0oC [68]. Trong phân gà virus hoàn toàn không hoạt ñộng trong vòng 30 phút sau khi chịu tác ñộng trực tiếp của ánh sáng mặt trời ở nhiệt ñộ môi trường là 32- 35oC, nhưng khả năng lây nhiễm vẫn không mất ñi sau 4 ngày trong bóng râm ở 25-32oC. Do cấu trúc vỏ ngoài của virus là lipit nên chúng mẫn cảm với các chất dung môi và chất tẩy rửa như formalin, axit pha loãng, ête, sodium deoxycholat, sau khi tẩy vỏ các hoá chất như phenolic, NH4+, axit loãng, natrihypochlorit và hydroxylamone có thể phá huỷ virus cúm gia cầm. Người ta thường dùng các hoá chất này như các chất sát trùng hữu hiệu ñể tẩy uế chuồng trại, dụng cụ và các thiết bị chăn nuôi [17]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 20 1.5. Dịch tễ học bệnh cúm ở loài chim Sự phân bố và lưu hành virus cúm gia cầm ñã xảy ra trong phạm vi toàn cầu do sự di trú của các dã cầm, do ñó rất khó dự ñoán khi nào virus xuất hiện, gây thành dịch cho ñàn gia cầm nuôi và việc ngăn chặn tiếp xúc giữa các loài dã cầm với gia cầm nuôi có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển chăn nuôi gia cầm. 1.5.1. ðộng vật cảm nhiễm Tất cả các loài chim thuần dưỡng (gia cầm) hoặc hoang dã (ñặc biệt các loài thuỷ cầm di cư) ñều mẫn cảm virus. Bệnh thường phát hiện khi lây nhiễm cho gia cầm (gà, vịt, gà tây, chim cút). Phần lớn các loài gia cầm non ñều mẫn cảm với virus cúm typ A. Virus cúm của loài chim có thể gây bệnh cho các loài ñộng vật có vú (lợn, ngựa...) và cả con người. Virus cúm typ A phân bố hầu như tất cả các loài chim và ñộng vật có vú từ loài sống trên cạn ñến loài sống dưới nước (cá voi, hải cẩu...). Lợn mắc bệnh cúm thường do phân typ H1N1, H3N3. Vịt nuôi cũng bị nhiễm virus cúm nhưng rất ít phát hiện do vịt có sức ñề kháng với virus gây bệnh kể cả chủng có ñộc lực cao gây bệnh nặng cho gà, gà tây. Tuy nhiên năm 1961 ở Nam Phi ñã phân lập ñược virus cúm typ A H5N1 gây bệnh cho cả gà và vịt [1, 7]. 1.5.2. ðộng vật mang virus Virus cúm ñã phân lập ñược ở hầu hết các loài chim hoang dã như vịt, thiên nga, hải cẩu, vẹt, mòng biển, diều hâu, chim sẻ... Tuy nhiên, tần suất và số lượng virus phân lập ở loài thuỷ cầm ñều cao hơn ở các loài khác [1]. Kết quả ñiều tra thuỷ cầm di trú ở Bắc Mỹ cho thấy trên 60% chim non mang virus do tập hợp ñàn trước khi di trú. Trong các loài thuỷ cầm di trú thì vịt trời có tỷ lệ bị nhiễm virus cao hơn các nhóm khác. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 21 Những kết quả ñiều tra về sự phân bố rộng của virus cúm typ A ở chim hoang dã và ñặc biệt là vịt trời ñã cho thấy: Sự kết hợp kháng nguyên bề mặt H và N của các phân typ virus cúm typ A diễn ra ở chim hoang dã. Những virus này không gây ñộc ñối với vật chủ, chúng ñược nhân lên ở ñường ruột khiến cho các loài này mang virus và là nguồn reo rắc virus cho các loài khác ñặc biệt là gia cầm [38]. Cuối tháng 10/2004 FAO, OIE và WHO ñã lưu ý các nước ñã trải qua dịch cúm gia cầm H5N1 rằng vịt nuôi có thể ñóng một vai trò quan trọng trong việc làm lây lan chủng virus cúm gia cầm H5N1 thể ñộc lực cao cho các gia cầm khoẻ và rất có thể lây truyền virus trực tiếp cho người vì vật nuôi nhiễm virus, gà bệnh và gà có biểu hiện ốm bài thải một lượng virus xấp xỉ nhau nhưng vịt nuôi không thể hiện các triệu chứng lâm sàng bệnh lý. Vịt có thể là con vật tàng trữ “thầm lặng” ñối với virus cúm H5N1 gây bệnh thể ñộc lực cao cho gà. Hiện tại, FAO và OIE ñang phối hợp với nhau ñánh giá vai trò của vịt nuôi nhằm ñưa ra chiến lược lâu dài với mục ñích khống chế các ổ dịch cúm gia cầm ở châu Á. Virus H5N1 lưu hành ở một số khu vực châu Á có ñộc lực ñối với gà và chuột ñã ñược tăng lên và virus này ñã mở rộng phổ gây bệnh của nó trên cả loài mèo. 1.5.3. Sự truyền lây Khi gia cầm bị nhiễm virus cúm, virus ñược nhân lên trong ñường hô hấp và ñường tiêu hoá. Sự truyền lây bệnh ñược thực hiện theo hai phương thức là trực tiếp và chủ yếu là gián tiếp. Lây trực tiếp: Do con vật mẫn cảm tiếp xúc với con vật mắc bệnh thông qua các hạt khí dung ñược bài xuất từ ñường hô hấp hoặc qua phân, thức ăn và nước uống bị nhiễm. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 22 Lây gián tiếp: Qua các hạt khí dung trong không khí với khoảng cách gần hoặc những dụng cụ chứa virus do gia cầm mắc bệnh bài thải qua phân hoặc lây qua chim, thú, thức ăn, nước uống, lồng nhốt, quần áo, xe vận chuyển, côn trùng. Như vậy, virus dễ dàng truyền tới những vùng khác do con người, phương tiện vận chuyển, dụng cụ chăn nuôi... ðối với các virus gây bệnh cúm truyền nhiễm cao ở gia cầm thì sự truyền lây chủ yếu qua phân, ñường miệng. 1.5.4. Mùa vụ phát bệnh Bệnh cúm gia cầm xảy ra quanh năm nhưng thường tập chung vào vụ ñông xuân từ tháng 10 năm trước ñến tháng 2 năm sau. Khi có những biến ñổi bất lợi về ñiều kiện thời tiết như nhiệt ñộ lạnh, ñộ ẩm cao, thời tiết có những biến ñổi ñột ngột, làm giảm sức ñề kháng tự nhiên của con vật. Mặt khác thời ñiểm này có mật ñộ chăn nuôi cao nhất trong năm, các hoạt ñộng vận chuyển, giết mổ gia cầm diễn ra cao nhất trong năm cũng là ñiều kiện thuận lợi ñể dịch bệnh phát sinh lây lan [13]. 1.6. Miễn dịch chống bệnh của gia cầm Miễn dịch là trạng thái ñặc biệt của cơ thể không mắc phải tác ñộng có hại của yếu tố gây bệnh, trong khi ñó cơ thể cùng loài hoặc khác loài lại bị tác ñộng trong ñiều kiện sống như nhau. Cũng như các ñộng vật khác, miễn dịch chống virus cúm của gia cầm có 2 loại là miễn dịch ñặc hiệu và không ñặc hiệu. *Miễn dịch không ñặc hiệu Khi mầm bệnh xâm nhập và cơ thể, gia cầm bảo vệ trước hết bằng miễn dịch không ñặc hiệu nhằm ngăn cản hoặc giảm số lượng và khả năng gây bệnh của chúng. Miễn dịch không ñặc hiệu có vai trò quan trọng khi miễn dịch ñặc hiệu chưa phát huy tác dụng. Hệ thống miễn dịch không ñặc hiệu của gia cầm rất phát triển bao gồm: Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 23 - Hàng rào vật lý như da, niêm mạc và các dịch tiết có tác dụng bảo vệ cơ thể ngăn cản tác nhân gây bệnh xâm nhập và cơ thể. - Hàng rào hoá học: Khi mầm bệnh qua hàng rào da và niêm mạc nó gặp phải hàng rào hoá học là kháng thể dịch thể tự nhiên không ñặc hiệu. + Bổ thể có tác dụng làm tan màng vi khuẩn, làm tăng khả năng thực bào của ñại thực bào (opsonin hoá), ngoài ra bổ thể cũng có vai trò nhất ñịnh trong cơ chế ñáp ứng miễn dịch ñặc hiệu (nhiều trường hợp tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể cần có sự có mặt của bổ thể) [32]. + Interferol: Do nhiều loại tế bào tiết ra nhưng nhiều nhất là tế bào diệt tự nhiên (NK). Khi Interferol ñược sản sinh ra, nó gắn vào tế bào bên cạnh và cảm ứng tế bào ñó sản sinh ra protein AVP (antivirus protein), do ñó khi virus xâm nhập vào tế bào nhưng không nhân lên ñược. - Hàng rào tế bào gồm: + Tiểu thực bào, quan trọng nhất là bạch cầu ña nhân trung tính chiếm 60-70% tổng số bạch cầu ở máu ngoại vi, Nó thực bào những phân tử nhỏ và vi khuẩn ngoài tế bào. + ðại thực bào là các tế bào lớn có khả năng thực bào, khi ñược hoạt hoá nó sẽ nhận biết và loại bỏ các vật lạ, ngoài ra nó còn giữ vai trò quan trọng trong sự trình diện kháng nguyên tới tế bào T và kích thích tế bào T sản sinh ra IL-1. ðại thực bào còn tiết ra Interferol có ñặc tính kháng virus, lysozyme và các yếu tố khác có tác dụng kích thích phản ứng viêm. + Các tế bào diệt tự nhiên (NK) là một quần thể tế bào lâm ba cầu có nhiều hạt với kích thước lớn. Các tế bào này có khả năng tiêu diệt các tế bào ñã bị nhiễm virus và các tế bào ñích ñã biến ñổi, nó còn tiết ra interferol làm tăng khả năng thực bào của ñại thực bào. *Miễn dịch ñặc hiệu Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, cơ thể sẽ sản sinh ra kháng thể Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 24 ñặc hiệu ñể loại trừ kháng nguyên ñó. Kháng thể ñặc hiệu có thể là dịch thể hoặc có thể là tế bào. ðó là các lymphô T mẫn cảm. Vì vậy người ta chia miễn dịch ñặc hiệu ra miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào. - Miễn dịch thể: Do tế bào lymphô B ñảm nhiệm, nó tiết ra các loại globulin miễn dịch (Ig) gồm có 3 lớp chính là IgM, IgG, IgA. IgG của gia cầm lớn hơn của ñộng vật có vú nên thường ñược gọi là IgY. Các lyphô bào bắt nguồn từ tế bào nguồn ở tuỷ xương ñi tới túi Fabricius, ở ñây chúng ñược huấn luyện ñể trở thành các lymphô B, sau ñó di tản ñến các cơ quan lymphô ngoại biên, chúng khu trú ở các tâm ñiểm mầm và vùng tuỷ của lách, hạch bạch huyết. Mỗi tế bào B ñều có một kháng thể khác nhau trên bề mặt của nó. Khi tế bào B ñã có thể sản sinh IgM trên bề mặt thì nó cũng có thể có khả năng sản sinh một kháng thể khác lớp khác, nhưng dù là lớp nào thì tất cả kháng thể do tế bào ñó sản sinh ra ñều có khả năng nhận biết cùng loại kháng nguyên ñó mà thôi. Tức là vùng Fab của phân tử kháng thể không thay ñổi mà chỉ có vùng Fc là khác nhau tuỳ vào lớp kháng thể. Trong hạch lâm ba các lymphô B có thể gặp một kháng nguyên và ñược nhận biết bởi các kháng thể có trên bề mặt của chúng. Sau khi ñã nhận biết kháng nguyên và ñược kích thích bởi các cytokines do tế bào T tiết ra. Chúng ñược biệt hoá thành tương bào (plasma) ñể sản sinh kháng thể. ðáp ứng của kháng thể khi gặp kháng nguyên lần ñầu tiên ñược gọi là ñáp ứng tiên phát (sơ cấp). Sau khi xuất hiện vài ngày, hàm lượng kháng thể trong máu mới tăng và các kháng thể ñầu tiên chủ yếu là IgM. ðáp ứng tiên phát cũng có thể có IgG nhưng với hàm lượng thấp. Kháng thể dịch thể chỉ có tác dụng với virus khi nó còn ở ngoài tế bào, lớp IgM và IgG kết hợp với virus với sự tham gia của bổ thể làm tiêu diệt virus, 2 lớp kháng thể này còn ngăn virus không cho kết hợp với receptor của tế bào tương ứng, ngăn cản sự hoà màng giữa vỏ virus và màng tế bào. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 25 Lớp IgA có trong niêm mạc, nó diệt virus ngay trong hàng rào niêm mạc, không cho virus xâm nhập vào trong. Khi virus kích thích sinh ra kháng thể thì kháng thể có tính ñặc hiệu cao giúp ta ñịnh typ virus gây bệnh bằng các phản ứng huyết thanh học. Một số lyphô B sau khi nhận biết kháng nguyên sẽ thành thục thành lymphô B nhớ, kết quả là làm cho ñáp ứng miễn dịch lần 2 ñối với kháng nguyên nhanh hơn, mạnh hơn lần 1 và lớp kháng thể thường là IgG. - Miễn dịch ñặc hiệu qua trung gian tế bào: Quá trình ñáp ứng miễn dịch ñặc hiệu qua trung gian tế bào do tế bào lymphô T ñảm nhiệm. Các lymphô bào bắt nguồn từ tuỷ xương di chuyển ñến tuyến ức, tại ñó chúng ñược huấn luyện, biệt hoá thành tiền lymphô T, rồi thành lymphô T chưa chín, rồi thành lymphô T chín. Từ tuyến ức chúng di tản ñến các cơ quan lymphô ngoại vi như các hạch lâm ba, các mảng payers ở ruột hoặc tới lách. Khi ñại thực bào ñưa thông tin ñến các lymphô T, chúng tiếp nhận, biệt hoá thành nguyên bào lymphô T rồi thành tế bào mẫn cảm với kháng nguyên có chức năng như một kháng thể ñặc hiệu và gọi là kháng thể tế bào. Các lymphô T thực hiện 2 chức năng quan trọng: + Chức năng hỗ trợ: Do các lymphô T có dấu ấn CD4 ñảm nhiệm (TH) Giúp ñỡ các tế bào lymphô B phát triển thành tương bào ñể sản xuất kháng thể. Giúp các tế bào TCD8 trở thành tế bào Tc gây ñộc. Tế bào Tc ñược hoạt hoá và tiêu diệt tế bào ñích. Thực hiện phản ứng quá mẫn muộn. Sản xuất ra các cytokines có tác dụng ñiều khiển sự phát triển của các dòng tế bào bạch cầu và các tế bào mầm của hệ thống tạo máu. Sản xuất các cytokines có tác dụng hoạt hoá các ñại thực bào. Thúc ñẩy quá trình sản xuất các phân tử glycoprotein MHC trên các tế bào trình diện kháng nguyên. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 26 ða số các tế bào T hỗ trợ thể hiện dấu ấn CD4 nhận biết kháng nguyên ñược trình diện trên bề mặt của các tế bào trình diện kháng nguyên với các phân tử MHC lớp II. Chức năng này do 2 tiểu quần thể TH ñảm trách: TH1 tham gia phản ứng quá mẫn muộn, sản xuất IL-2 và Inteferol γ, TH2 hỗ trợ tế bào B và sản xuất chủ yếu IL-4, IL-5. + Chức năng thực hiện: Do các lymphô mang dấu ấn CD8 ñảm nhiệm có 2 loại: Lymphô T gây ñộc (Tc): Chúng gây ñộc ñối với tế bào bị nhiễm virus, tế bào ung thư và mảnh ghép dị loài. Chúng có khả năng nhận biết các mảnh peptit của kháng nguyên của tế bào ñích gắn với phân tử MHC lớp I. Lymphô T ức chế (Ts): Chúng triệt thoái quá trình sản xuất imunoglobulin của tế bào B và triệt thoái hoặc ức chế các phản ứng quá mẫn muộn và miễn dịch tế bào. *.Những yếu tố ảnh hưởng ñến sự hình thành kháng thể: Sự hình thành kháng thể và quá trình ñáp ứng miễn dịch phụ thuộc rất nhiều yếu tố như trạng thái sức khoẻ của cơ thể, ñiều kiện ngoại cảnh, sự chăm sóc nuôi dưỡng...Nhưng quan trọng hơn cả là phụ thuộc vào bản chất kháng nguyên. Một số yếu tố ảnh hưởng ñến sự hình thành kháng thể như sau: - Bản chất kháng nguyên: kháng nguyên có bản chất là protein và có tính kháng nguyên cao sẽ kích thích sinh kháng thể tốt. - ðường xâm nhập của kháng nguyên: ðường xâm nhập của kháng nguyên tốt nhất là dưới da và trong bắp thịt. - Liều lượng kháng nguyên: Lượng kháng nguyên ñưa vào vừa ñủ sẽ kích thích cơ thể sản sinh miễn dịch ở mức tối ña mà không gây ức chế và tê liệt miễn dịch. - Số lần ñưa kháng nguyên vào cơ thể: Tiêm nhắc lại vacxin có tác dụng tốt, kháng thể sinh ra nhiều hơn và ñược duy trì trong thời gian nhiều hơn. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 27 - Chất bổ trợ: Chất bổ trợ cho vào khi chế vacxin với mục ñính giữ và duy trì lượng kháng nguyên lâu trong trong cơ thể nhờ ñó tạo kích thích liên tục, ñều ñặn các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch tạo ra kháng thể ở mức cao và duy trì ñược lâu hơn. Những chất bổ trợ thường dùng là keo phèn, nhũ tương, dầu khoáng, dầu thực vật, saponin. 1.7. Triệu chứng, bệnh tích của bệnh cúm gia cầm 1.7.1. Triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm gia cầm Các biểu hiện lâm sàng của bệnh diễn biến rất ña dạng và phức tạp, nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố như ñộc lực của virus, số lượng virus, loài vật nhiễm bệnh, tuổi, giới tính, tiểu khí hậu chuồng nuôi, tình trạng dinh dưỡng, tình trạng miễn dịch của vật chủ trước khi nhiễm virus và sự cộng nhiễm cùng với virus cúm gia cầm của các vi khuẩn, virus khác như E.coli, các Mycoplasma, Newcastle... Thời gian ủ bệnh ngắn thường chỉ vài giờ ñến 21 ngày, Tổ chức Thú y thế giới ñề nghị nâng lên 28 ngày [9]. Các triệu chứng về ñường hô hấp thường xuất hiện ñầu tiên và khá ñiển hình như khẹc, lắc ñầu, vẩy mỏ, khó thở, chảy nước mũi, nước mắt. Tiếp theo là mí mắt viêm, sưng mọng, phù mặt, phù ñầu. Mào và tích dầy lên do phù thũng tím tái, xuất huyết. Thịt gà bị bệnh thâm tím. Xuất huyết dưới da chân là ñặc ñiểm ñặc trưng của bệnh cúm gia cầm. Ngoài các triệu chứng trên còn thấy các triệu chứng về thần kinh như ñi lại không bình thường, siêu vẹo, run rẩy, mệt mỏi, nằm lì một chỗ, tụ ñống với nhau. Gia cầm tiêu chảy mạnh, phân loãng trắng, trắng xanh. Với gia cầm ñang ñẻ thì tỷ lệ ñẻ giảm rất nhanh. Bệnh lây lan nhanh, gia cầm chết ñột ngột. Với chủng virus ñộc lực cao (HPAI) tỷ lệ chết từ 15-100%, với chủng virus ñộc lực thấp (LPAI) tỷ lệ chết thấp hơn và mức ñộ biểu hiện triệu chứng cũng nhẹ hơn. Tuy nhiên khi có sự bội nhiễm hoặc ñiều kiện chăn nuôi bất lợi tỷ lệ tử vong cao hơn có thể tới 60-70% với các biểu hiện triệu chứng nặng hơn [25]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 28 1.7.2. Bệnh tích ñại thể của bệnh cúm gia cầm Mức ñộ biến ñổi bệnh tích ñại thể bệnh cúm gia cầm cũng ña dạng và rất khác nhau trong cùng một ñàn, phụ thuộc rất nhiều vào ñộc lực của virus, quá trình diễn biến của bệnh [25]. Những biến ñổi mang tính tổng quan như sau: - Mào tích thâm tím, phù nề, xuất huyết dưới da và rìa tích. Xuất huyết dưới da ống chân thành vệt, nốt. - Khí quản viêm xuất huyết, chứa nhiều ñờm. Túi khí phù nề, thành túi khí dầy có nhiều fibrin bám dính. Phổi viêm cata, xuất huyết ñến viêm fibrin làm phổi dính vào lồng ngực. - Viêm xuất huyết ñường ruột, ñặc biệt vùng hậu môn, van hồi manh tràng, dạ dày tuyến và niêm mạc tá tràng. - Bao tim tích nước vàng, xuất huyết màng bao tim, mỡ vành ti._.,30 100,0 36 3184,60 30,30 100,0 6 3 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 64 Tỷ lệ nuôi sống là một chỉ tiêu rất quan trọng quyết ñịnh năng suất chăn nuôi, và giá thành sản phẩm qua thí nghiêm cho thấy tỷ lệ nuôi sống của vịt ñược tiêm và vịt ñối chứng là như nhau và ñều ñạt tỷ lệ 100% sau 8 tuần tuổi. Khối lượng cơ thể của vịt thí nghiệm và vịt ñối chứng ở 8 tuần tuổi không có sự sai khác. Vịt thí nghiệm ñạt 3184,60g/con, trong khi vịt ñối chứng ñạt 3187,60g/con. Như vậy, tiêm vacxin cúm gia cầm H5N1 không ảnh hưởng ñến tỷ lệ nuôi sống cũng như khối lượng cơ thể của vịt nuôi vỗ béo. 3.9.3. ðánh giá ảnh hưởng của việc tiêm phòng ñến chất lượng thịt và tiêu tốn thức ăn cho vịt SM nuôi vỗ béo Chất lượng thịt và tiêu tốn thức ăn là những chỉ tiêu rất quan trọng mà các nhà chăn nuôi quan tâm. ðể ñánh giá việc tiêm phòng có ảnh hưởng ñến những chỉ tiêu ñó hay không chúng tôi tiến hành theo dõi trên ñàn vịt thí nghiệm ñược nuôi vỗ béo ñến thời ñiểm ñạt tiêu chuẩn giết thịt ở 7 và 8 tuần tuổi cho kết quả như sau: Bảng 3.13. Kết quả mổ khảo sát của vịt SM nuôi vỗ béo 7 tuần tuổi 8 tuần tuổi Chỉ tiêu ðối chứng Thí nghiệm ðối chứng Thí nghiệm Khối lượng (g) 3056,17 3097,75 3156,67 3185,23 Khối lượng thịt xẻ (g) 2085,22 2123,82 2266,17 2290,18 Tỷ lệ thịt xẻ (%) 68,23 68,56 71,79 71,90 Khối lượng thịt lườn (g) 285,05 285,65 358,74 363,91 Tỷ lệ thịt lườn (%) 13,67 13,45 15,83 15,89 Khối lượng thịt ñùi (g) 308,82 316,87 295,51 296,81 Tỷ lệ thịt ñùi (%) 14,81 14,92 13,04 12,96 Tiêu tốn thức ăn (kg) 2,34 2,34 2,76 2,76 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 65 Qua bảng 3.13 cho thấy khối lượng cơ thể vịt thí nghiệm và ñối chứng ở cùng thời ñiểm giết thịt là tương ñương nhau. Tại thời ñiểm 7 tuần tuổi khối lượng cơ thể vịt thí nghiệm ñạt 3097,75g/con, vịt ñối chứng ñạt 3056,17g/con. ðồng thời các chỉ tiêu về tỷ lệ thịt xẻ, khối lượng thịt lườn, tỷ lệ thịt lườn, khối lượng thịt ñùi, tỷ lệ thịt ñùi của vịt thí nghiệm và ñối chứng cũng không có sự sai khác. Tiêu tốn thức ăn cho vịt thí nghiệm ở 7 tuần tuổi 2,34 kg vịt ñối cũng là 2,34 kg. Tại thời ñiển 8 tuần tuổi tiêu tốn thức ăn của cả vịt thí nghiệm và ñối chứng cùng là 2,76kg. Như vậy, tiêm vacxin H5N1 cho vịt nuôi thương phẩm không làm giảm khả năng tăng trọng của vịt, không làm tăng chi phí thức ăn cho quá trình chăn nuôi. 3.9.4.ðánh giá ảnh hưởng của việc tiêm phòng ñến năng suất sinh sản của vịt thí nghiệm ðể xác ñịnh việc tiêm phòng vacxin H5N1 cho ñàn vịt ñẻ trứng có ảnh hưởng ñến năng suất trứng của ñàn vịt cũng như tỷ lệ phôi của trứng hay không. Chúng tôi tiến hành theo dõi trên ñàn vịt tại Trung tâm. Kết quả thí nghiệm tiêm vacxin H5N1 cho ñàn vịt ñẻ trứng vào tuần ñẻ thứ nhất và tuần thứ 17, 34 ñược trình bày ở bảng 3.14. Qua bảng 3.14 cho thấy: Sau khi tiêm vacxin ñàn vịt vẫn có tỷ lệ ñẻ tương ñương với ñàn ñối chứng (không tiêm). Kết thúc 42 tuần ñẻ lô vịt ñược tiêm vacxin ñạt 218,79 quả/mái, lô không tiêm ñạt 220,70 quả/mái. Tuy có sự chênh lệch về số trứng nhưng không có sự sai khác. Tiêu tốn thức ăn cho một qủa trứng của cả hai lô cũng như nhau 3,6- 3,7g/quả. Bảng 3.14. Năng suất sinh sản của vịt SM thí nghiệm ðối chứng Thí nghiệm Tuần ñẻ TLð (%) NST (quả/mái) TTTA/ trứng (kg) TL phôi (%) TLð (%) NST (quả/mái) TTTA/ trứng (kg) TL phôi (%) 1-4 48,73 13,65 0,84 85,23 49,63 13,90 0,59 81,45 5-8 87,67 38,19 0,29 94,08 87,56 38,41 0,33 94,34 9-12 76,38 59,58 0,38 95,17 75,74 59,62 0,41 94,99 13-16 73,93 80,28 0,43 94,39 72,66 79,97 0,45 95,32 17-20 79,64 102,58 0,38 94,03 79,93 102,34 0,40 94,78 21-24 73,57 123,18 0,41 93,25 72,91 122,76 0,45 92,89 25-28 78,94 145,28 0,39 92,18 77,34 144,41 0,41 93,32 29-32 81,38 168,07 0,37 92,01 79,19 166,59 0,36 92,26 33-36 77,30 189,71 0,36 91,34 78,08 188,45 0,34 91,41 37-40 72,70 210,07 0,39 90,57 72,66 208,79 0,37 90,62 41-42 71,43 220,07 0,37 89,95 71,43 218,79 0,36 90,63 TB 92,018 92,001 6 6 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 67 Tỷ lệ phôi của hai lô cũng không có sự khác biệt vẫn ñạt bình quân 92%. Như vậy, tiêm vacxin H5N1 không làm ảnh hưởng ñến năng suất sinh sản của vịt. Trái lại còn tạo cho vịt có miễn dịch chống lại bệnh cúm gia cầm. 3.10. ðánh giá tính khả thi của chương trình sử dụng vacxin cúm gia cầm tại Trung tâm Nghiên cứu Vịt ðại Xuyên Các kết quả giám sát về hiệu lực của vacxin cúm gia cầm ñược sử dụng trong 2 năm 2007 - 2008 tại Trung tâm Nghiên cứu Vịt ðại Xuyên cho thấy vacxin tạo ñược miễn dịch chống phơi nhiễm virus cúm cho ñàn thủy cầm ñược tiêm phòng. Kết quả tiêm phòng của năm 2007 ñạt hiệu giá kháng thể GMT=6,7log2, tỷ lệ bảo hộ cao nhất 96% . Năm 2008, GMT=6,6%, tỷ lệ bảo hộ cao nhất ñạt 100% và giảm xuống GMT=3,9log2, tỷ lệ bảo hộ 66% sau khi tiêm ít nhất 4 tháng. Giám sát cho thấy không có virus cúm lưu hành. Như vậy, về mặt hiệu lực, các loại vacxin cúm ñã tạo ñược ñáp ứng miễn dịch tốt cho ñàn gia cầm ñược tiêm. Hơn nữa, tiêm phòng vacxin cúm H5N1 không ảnh hưởng ñến tỷ lệ nuôi sống, khả năng tăng trọng cũng như năng suất sinh sản của vịt. Chương trình sử dụng vacxin nhằm khống chế bệnh cúm gia cầm tại Trung tâm Nghiên cứu Vịt ðại Xuyên là có tính khả thi nếu kết hợp tốt tiêm vacxin, giám sát sau tiêm phòng với biện pháp chăn nuôi an toàn sinh học bảo ñảm tính bền vững. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 68 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Từ các kết quả nghiên cứu trong luận văn, chúng tôi rút ra các kết luận sau: 1. Công tác tiêm phòng vacxin cúm gia cầm H5N1 của Trung tâm Nghiên cứu Vịt ðại Xuyên năm 2008 ñạt 100% kế hoạch. Tính ñến tháng 6/2008 ñã tiêm phòng ñợt 1 cho 10.370 vịt. Việc sử dụng vacxin trong những năm vừa qua ñã có tác ñộng tích cực ñến công tác phòng chống cúm. 2. Vacxin ñạt tiêu chuẩn về ñộ an toàn khi tiêm trên thực ñịa số vịt phản ứng sau tiêm rất thấp (0,040-0,048%), trong ñó ñáng lưu ý một số vịt có phản ứng cục bộ do vacxin nhũ dầu khi tiêm dưới da sát vùng ñầu. 3. Hiệu giá kháng thể trung bình và tỷ lệ bảo hộ của vịt ñược tiêm vacxin năm 2007 ñạt cao nhất tại thời ñiểm 60 ngày (6,7log2; 96%). Hiệu giá kháng thể trung bình và tỷ lệ bảo hộ của vịt ñược tiêm vacxin năm 2008 ñạt cao nhất tại thời ñiểm 60 ngày ( 6,6log2; 100%). Hiệu giá kháng thể bảo hộ cho vịt kéo dài 4 tháng (150 ngày sau tiêm mũi 1) 4. Hiệu giá kháng thể và tỷ lệ bảo hộ của vịt ñược tiêm vacxin năm 2008 cao hơn năm 2007. Nhưng biểu ñồ biểu diễn ñáp ứng miễn dịch của hai năm có ñường cong tương ñồng như nhau. 5. Kết quả giám sát virus mẫu dịch Swab của ñàn vịt ñược tiêm vacxin bằng phản ứng RT-PCR ñều cho kết quả âm tính. Như vậy ñàn vịt ñược tiêm vacxin không mang virus cúm. 6. Tiêm vacxin cúm H5N1 không ảnh hưởng ñến khả năng tăng trọng, tỷ lệ ñẻ, tỷ lệ phôi của vịt. Tiêm vacxin không làm ảnh hưởng ñến các chỉ tiêu kinh tế kỹ thuật trong chăn nuôi vịt. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 69 7. Tiêm vacxin cúm gia cầm H5N1 ñại trà nhằm thanh toán dịch cúm gia cầm có tính khả thi cao nếu kết hợp tốt tiêm phòng với chăn nuôi an toàn bảo ñảm tính bền vững. 4.2. ðề nghị - Tiếp tục nghiên cứu về ñộ dài miễn dịch sau tiêm phòng ñể có ñánh giá chặt chẽ hơn, từ ñó ñưa ra chiến lược tiêm phòng phù hợp về thời gian tiêm nhắc lại, số mũi tiêm nhắc lại… - Tiếp tục triển khai dự án sử dụng vacxin cúm trong nhiều năm tới ñể không chế ñược dịch bệnh. Cần có các nghiên cứu tiêm mũi 1 sớm hơn ñể tránh ñể phòng bệnh cho ñàn vịt dưới 2 tuần tuổi. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt 1. Bùi Quang Anh, Văn ðăng Kỳ (2004), ”Bệnh cúm gia cầm”: Lưu hành bệnh, chẩn ñoán và kiểm soát dịch bệnh, Khoa học kỹ thuật Thú y, XI (3), tr.69 - 75. 2. Ban chỉ ñạo quốc gia phòng chống dịch cúm gia cầm (2005), Kế hoạch hành ñộng khẩn cấp khi xảy ra dịch cúm gia cầm (H5N1) và ñại dịch cúm ở người, Hà Nội. 3. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2005), Kế hoạch dự phòng chống dịch cúm gia cầm chủng ñộc lực cao tại Việt Nam, Hà Nội 4. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2005), Tiêu chuẩn ngành - Quy trình chẩn ñoán bệnh cúm gia cầm,Hà Nội. 5. Các văn bản hướng dẫn sử dụng vaxcin cúm gia cầm và giám sát sau tiêm phòng; Báo cáo tình hình dịch cúm gia cầm và tiến ñộ tiêm phòng của Cục Thú y tại trang web: www.cucthuy.gov.vn/index.php?option=com_ _content&task=view&id=13&Itemid=64 6. Capua, S. Maragon (2002), DIVA - Một chiến lược ngăn trừ bệnh cúm gia cầm rất thành công ở Italia (Trần ðức Minh dịch), Khoa học kỹ thuật Thú y, XII số 5 - 2005, tr.80 - 81. 7. Trần Hữu Cổn, Bùi Quang Anh (2004), ”Bệnh cúm gia cầm và biện pháp phòng chống”, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 8. Cục thú y (2005), Sổ tay hướng dẫn phòng chống bệnh cúm gia cầm và bệnh cúm trên người, Hà Nội. 9. Nguyễn Tiến Dũng (2004), ”Bệnh cúm gà”, Hội thảo một số biện pháp khôi phục ñàn gia cầm sau dập dịch, Hà Nội, Tr. 5-9. 10. Nguyễn Tiến Dũng và cộng sự (2004), ”Nguồn gốc virus cúm gia cầm H5N1 tại Việt Nam năm 2003 – 2004”, Tạp chí KHKT Thú y, XI (3), tr.6 - 14. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 71 11. Nguyễn Tiến Dũng (2008), ”Vài nét về virus cúm gia cầm H5N1”, Khoa học kỹ thuật Thú y, XV(4), tr.80 - 86. 12. Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Thế Vinh, Dhanasekaran Vijaykrishna, Robert C. Webster, Yi Guan, J.S. Malik Peiris và Gavin J.D. Smith (2008), ”Sự ña dạng của các dòng virus cúm A (H5N1) tại Việt Nam từ 2005 – 2007”, Khoa học kỹ thuật Thú y, XV (4), tr.9 - 15. 13. Dự án sử dụng vacxin nhằm khống chế và thanh toán bệnh cúm gia cầm thể ñộc lực cao H5N1 (2005), Bộ Nông nghiệp & PTNT. 14. Vũ Thị Mỹ Hạnh, Tô Long Thành và cộng sự (2008), ”Kiểm nghiệm vacxin cúm gia cầm H5N1 của Trung Quốc sử dụng trong giai ñoạn 2006- 2007”, Khoa học kỹ thuật Thú y, XV (4) - 2008, tr.25 - 32. 15. Ninh Văn Hiểu (2006), Tình hình dịch cúm gia cầm và Kết quả tiêm vacxin H5N2, H5N1 của Trung Quốc ñể phòng bệnh cho gà, vịt trên ñịa bàn tỉnh Nam ðịnh, Luận văn Thạc sĩ Nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội. 16. Lê Thanh Hoà (2004), ”Họ Orthomyxovirridae và nhóm virus cúm A gây bệnh cúm trên gà và người”, Viện khoa học công nghệ. 17. Ilaria Capua, Stefano Marangon (2004), Sử dụng tiêm chủng vacxin như một biện pháp khống chế bệnh cúm gà, Khoa học kỹ thuật thú y, XI (2), tr. 59-70. 18. Ken Inui (2008), ”Sự thay ñổi của virus cúm gia cầm thể ñộc lực cao H5N1 ở Việt Nam”, Hội thảo quốc tế : Nghiên cứu phục vụ hoạch ñịnh chính sách phòng chống cúm gia cầm, 16 - 18/6/2008, Hà Nội. 19. Ken Inui (2008),” Kiểm chứng hiệu quả vacxin cúm gia cầm ñối với các virus mới phân lập gần ñây (2007 - 2008) ở Việt Nam”, Hội thảo quốc tế Nghiên cứu phục vụ hoạch ñịnh chính sách phòng chống cúm gia cầm, 16 - 18/6/2008, Hà Nội. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 72 20. Văn ðăng Kỳ (2008), ”Diễn biến tình hình dịch cúm gia cầm ở Việt Nam và những giải pháp phòng chống”, Khoa học kỹ thuật Thú y, XV (4), tr.87 - 91. 21. ðào Yến Khanh (2005), Kiểm nghiệm và khảo nghiệm vacxin cúm gia cầm ngoại nhập, Luận văn Thạc sỹ Nông nghiệp, Trường ðại Học Nông Nghiệp I. 22. Phạm Sỹ Lăng (2004), ”Diễn biến bệnh cúm gia cầm ở Châu á và các hoạt ñộng phòng chống bệnh”, Khoa học Kỹ thuật Thú y, 11(3), tr. 91-94. 23. Phạm Sỹ Lăng, Tô Long Thành, Cù Hữu Phú, Nguyễn Hoài Nam (2004), ”Bệnh mới ở gia cầm và kỹ thuật phòng trị”, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 24. Nguyễn Văn Long (2008), ”Giám sát sau tiêm phòng và giám sát lưu hành virus cúm tại Việt Nam”, Hội thảo quốc tế Nghiên cứu phục vụ hoạch ñịnh chính sách phòng chống cúm gia cầm, 16 - 18/6/2008, Hà Nội. 25. Lê Văn Năm (2004), ”Bệnh cúm gà”, Khoa học Kỹ thuật Thú y,11(1), tr81-86. 26. Lê Văn Năm (2004), ”Kết quả khảo sát các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích ñại thể bệnh cúm gia cầm ở một số cơ sở chăn nuôi các tỉnh phía Bắc”, Khoa học kỹ thuật thú y, 11(3), tr. 86-90. 27. Lê Văn Năm (2007),” ðại dịch cúm gia cầm và nguyên tắc phòng chống, Khoa học kỹ thuật Thú y”, XIV(2), tr.91 - 94. 28. Mary J. Pantin-Jackwood, Jenny Pfeiffer, Tô Long Thành, Nguyễn Tùng và David Suarez (2008), ”ðộc tính của virus cúm gia cầm thể ñộc lực cao H5N1 của Việt Nam trên gà và vịt”, Hội thảo quốc tế Nghiên cứu phục vụ hoạch ñịnh chính sách phòng chống cúm gia cầm, 16 - 18/6/2008, Hà Nội. 29. D.L. Suarez và Mary Pantin-Jackwood (2008), ”Tiêm vacxin ñể khống chế bệnh cúm gia cầm thể ñộc lực cao”, Hội thảo quốc tế Nghiên cứu phục vụ hoạch ñịnh chính sách phòng chống cúm gia cầm, 16 - 18/6/200808, Hà Nội. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 73 30. D.L. Suarez, S. Schultz-Cherry (2007), ”Miễn dịch học của virus cúm gia cầm (Trần ðức Minh dịch)”, Khoa học kỹ thuật Thú y, XIV (4), tr. 71 - 83. 31. Nguyễn Hoài Tao, Nguyễn Tuấn Anh (2004), ”Một số thông tin về dịch cúm gia cầm”, Tạp chí Chăn nuôi (3), tr-27. 32. Nguyễn Như Thanh, Lê Thanh Hoà (1997), Miễn dịch học Thú y, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 33. Tô Long Thành (2004), ”Thông tin cập nhật về tái xuất hiện bệnh cúm gia cầm tại các nước Châu Á”, Tạp chí KHKT Thú y, XI (4), tr.87 - 93. 34. Tô Long Thành (2005), ”Một số thông tin mới về bệnh cúm gia cầm, Tạp chí KHKT Thú y”, XII (1). tr.84 - 91. 35. Tô Long Thành (2005), ”Kinh nghiệm phòng chống dịch cúm gia cầm và sử dụng vacxin cúm gia cầm tại Trung Quốc”, Khoa học kỹ thuật Thú y, XII (3), tr.87 - 90. 36. Tô Long Thành (2006), ”Thông tin cập nhật về bệnh cúm gia cầm và vacxin phòng chống”, Khoa học Kỹ thuật Thú y,13(1), tr. 66-76. 37. Tô Long Thành (2007), ”Các loại vacxin cúm gia cầm và ñánh giá hiệu quả tiêm phòng”, Tạp chí KHKT Thú y, XVI (2), tr. 84 - 90. Tiếng anh 38. Alexander. D. J. (2000), “A review of avian in different bird species”,Vet. Microbiol, (7)4: pp. 3-13. 39. Biswas. S. K and D. P. Nayak (1996), “Influenza virus polymerase basic protein 1 interacts with influenza virus polymerase basic protein 2 at multiple sites”,J. Virol, (70), pp. 6716-6722. 40. Bosch. F. X, M. Orlich, H. D. Klenk and R. Rott (1979), “The structure of the hemagglutinin, a determinant for the pathogenicity of influenza viruses”. Virology, (95), pp. 197-207. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 74 41. Bruschke C. (2007), International Standards and Guidelines on Poultry HPAI Vaccination, AI vaccine conference: Vaccination: a tool for the control of avian influenza, 20 - 22 March 2007, Verona, Italy. 42. Bublot M. et al Ann. N.Y. Acad. Sci (2006), Development and Use of Fowlpox Vectored Vaccines for Avian Influenza, (1081), pp. 193-201. 43. Buckler White and B. R. Muphy (1998), “Nucleotide sequence analysis of the nucleoprotein gene of an avian and a human influenza virus strain identifies two classes of nucleoproteins”, Virology (155), pp. 345-355. 44. Capua I. & Cattoli G. (2007), Diagnosing avian influenza infections in vaccinated populations using "DIVA" systems, AI vaccine conference: Vaccination: a tool for the control of avian influenza, 20 - 22 March 2007, Verona, Italy. 45. Collins RA, Ko LS, So KL, Ellis T, Lau LT, Yu AC (2002), “Detection of hyghly pathogenic avian influenza subtype H5(Euracian lineage) using NASBA”, J. Virology Methods, 103(2), pp. 213-215.37. 46. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO) (2004), FAO, OIE & WHO Technical consultation on the Control of Avian Influenza, Animal health special report. 47. Garcia-Garcia J., Rodriguez V.H. & Hernandez M.A. (1998), ”Experimental studies in field trials with recombinant fowlpox vaccine in broilers in Mexico”, Proceedings of the Fourth International Symposium on Avina Influenza, Athens, Georgia, USA, pp. 245 - 252. 48. Guus Kock (2007), Efficacy of vaccination in different poultry species, AI vaccine conference: Vaccination: a tool for the control of avian influenza, 20 - 22 March 2007, Verona, Italy. 49. Holsinger, L. J, D. Nichani, L. H. Pinto and R. A. Lamb (1994), “Influeza A virus M2 ion chanel protein: a structurefunction analysis”, J. Virology, (68), pp. 1551-1563. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 75 50. Horimoto T and Kawaoka Y (1995), “Direct reverse transcriptase PCR to determine virulence potential of influenza A viruses in birds”, J. Clin Microbiol, 33(3), pp. 748-751. 51. Horimoto T and Kawaoka Y (2001), “Pandemic threat posed by avian influenza viruses”, Clind Microbiol Rev, 14(1), pp. 129-149. 52. International Association for Boilogicals (2005), Control of Infectious Animal Diseases by Vaccination-Development in Biologicals, Vol. 119, Karger, Buenos Aires, Argentina. 53. Ito, T and Y. Kawaoka In K. G. Nicholson, R. G. Webster, and A. J. Hay (ed.) (1998),Textbook of influenza. Blackwell Sciences Ltd, Oxford, United Kingdom. Avian influenza, p. 126-136. 54. Ito. T, J. N. Couceiro, S. Kelm, L. G. Baum, S. Krauss, M. R. Castrucci, I. Donatelli, H. Kida, J. C Pauson, R. G. Webter, and Y. Kawoaka (1998), “Molecular basic for the generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential, J. Viroloy”, (72), pp. 7367-7373. 55. Kawaoka. Y (1991), “Difference in receptor specificity among influenza A viruses from different species of animals”, J. Vet. Med. Sci, (53), pp. 357- 358. 56. Kingrbuy (1985), “Protective immunity against avian influenza induced by a fowlpox virus recombinant”. Virology, Raven press NewYork, pp. 1157-1178. 57. Mingxiao M. et al (2006), ”Construction and immunogenicity of recombinant fowlpox vaccines coexpressing HA of AIV H5N1 and chicken IL18”, Elsevier Inc. Vaccine (24), pp. 4304 - 4311. 58. Mo. I. P, M. Brugh, O. J Fletcher, G. N. Rowland, and D. E. Swayne (1997), ‘Comparative pathology of chickens experimentaly inoculated with avian influenza viruses of low and high pathogenicity’, Avian Dis, (41). 125-136. 59. Muphy. B. R and R. G Webter (1996), Orthomyxoviruses, pp. 1397-1445. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 76 60. Luong. G and Palese. P (1992), “Genetic analysis of influenza virus”, Curr Opinion Gen Develop (2), pp. 77-81. 61. Lu. X, T. M. Tumpey, T. Morken, S. R. Zaki, N. J. Cox, and J. M. Katz (1999), “A mouse model for the evaluation of pathogenesis and immunity to influenza A (H5N1) viruses isolated from human”, J. Virology, (73), pp 5903-5911. 62. luschow D., werner o., mettenleiter t.c. & fuchs w.(2001),“Protection of chickens from lethal avian influenza A virus infection by live-virus vaccination with infectious laryngotracheitis virus recombinants expressing the heamagglutinin (H5) gene”, Vaccine, (19), pp. 4249-4259. 63.Seo. S and R. G Webter (2001), “Cross-reactive cell-mediated immunity and protection of chickens from lethal H5N1 influenza virus infection in the HongKong poultry markets”, J. Virology, (75), pp. 2516-2525. 64. Swayne D.E. (2003), ”Vaccines for list A poultry diseases; emphasison avian influenza”, Dev. Boil., (114), pp. 201 - 212. 65. Swayne D. E. & Suarez D.L. (2000). “Highly pathogenic avian influenza”. Rev. sci. tech. Off. Int. epiz., (20), pp. 463-482. 66. T.L. To, Q.A. Bui, N.H. Dau, V.N. Hoang, D.K. Van, N. Taylor & H.D. Do (2007), Mass vaccination in controling H5N1-HPAI in Vietnam, AI vaccine conference: Vaccination: a tool for the control of avian influenza, 20 - 22 March 2007, Verona, Italy. 67. Vey. M, M. Orlich, S. Adle, H. D. Klenk, R. Rott and W. Garten (1992), “Hemagglutinin activation of pathogenic avian influenza viruses of serotype H7 requires the protease recognition motif R-X-K/R-R”, Virology, (188): 408-413. 68.. Webster. R. G, W. J. Bean, O. T. Gorman, T. M. Chambers and Y. Kawaoka (1992), “Evolution and ecology of influenza A viruses”, Microbiol. Rev, (56), pp. 152-179. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 77 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần và cách pha các nguyên liệu dùng trong chẩn ñoán cúm gia cầm. - Môi trường 199 chứa 0,5% BSA (Albumin huyết thanh bò) - Bổ sung kháng sinh Penicillin G 2.000.000U/lớt Streptomycin 200 mg/lít Polymyxin B 2.000.000 U/lít Gentamicin 250 mg/lít Nystatin 500.000 U/lít Ofloxacin HCl 60 mg/lít Sulfmethoxasole 200 mg/lít - Môi trường Glycerol + Pha chế PBS NaCl 8 g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,15 g KH2PO4 0,2 g Nước cất vñ 1000 ml + Hấp vô trùng (1210C/15 phút), bổ sung kháng sinh (như trên) và trộn với glycerol theo tỷ lệ 1:1 - Ngoài ra có thể sử dụng các môi trường bảo quản khác như: Muối ñệm Hank, môi trường M.E.M, PBS, Tryptose Phosphate broth, Veal Infusion Broth, Sucrose-phosphate buffer. Các dung dịch này có thể ñược bổ sung BSA, gelatin 0,5 - 1%, các chất kháng sinh, kháng nấm. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 78 - Dung dịch PBS 0,01M pH7.2 Na2HPO4 1,096 g NaH2PO4.H2O 0,316 g Na Cl 8,5 g Nước cất 1 lít Chỉnh pH = 7.2 bằng NaOH 1N hoặc HCl 1N, hấp vô trùng, bảo quản 40C không quá 3 tuần. - Dung dịch nước muối sinh lý 0,85%: 8,5 g NaCl trong 1 lít nước cất. Hấp vô trùng, bảo quản 40C không quá 3 tuần. - Huyễn dịch hồng cầu gà 1%: + Gà trống khoẻ mạnh ñã trưởng thành, không có kháng thể cúm và newcastle. + Dùng bơm tiêm 5 - 10 ml hút sẵn 1ml (10 % thể tích) dung dịch chống ñông (Natri Citrat 4%, Alserver…) rồi lấy máu gà ở tĩnh mạch cánh, cho máu vào ống nghiệm. + Ly tâm 1000 - 1500 vòng/phút, trong 15 phút, ñổ bỏ huyết tương, cho thêm nước sinh lý (NaCl 0,85%) vào hồng cầu, lắc ñều. Ly tâm như trên 3 - 4 lần ñể rửa hồng cầu. Sau lần ly tâm cuối hút bỏ nước ở trên. + Pha hồng cầu thành huyễn dịch 1% bằng cách pha 1 ml hồng cầu với 99 ml nước muối sinh lý. + Bảo quản huyễn dịch hồng cầu ở nhiệt ñộ 4 - 80 C. Hồng cầu sau khi pha có thể dùng trong 4 - 5 ngày (nếu hồng cầu bị dung huyết loại bỏ không dùng). Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 79 Phụ lục 2: Bảng trình tự chuỗi của mẫu dò và Primer cho RRT-PCR phát hiện cúm gia cầm ðặc hiệu Trình tự chuỗi M+25* 5’ Primer 5’-AgA TgA gTC TTC TAA CCg Agg TCg-3’ M+64* mẫu dò 5’-FAM-TCA ggC CCC CTC AAA gCC gA- TAMRA-3’ M (cho bất kỳ cúm A) M-124* 3’Primer 5’-TgC AAA AAC ATC TTC AAg TCT CTg-3’ H7+ 1244* 5’ Primer 5’-ATT ggA CAC gAg ACg CAA Tg-3’ H7+1281* Mẫu dò a 5’-FAM-TAA TgC TgA gCT gTT ggT ggC- TAMRA-3’ H7 (Bắc Mỹ) H7-1342* 3’Primer 5’-TTC TgA gTC CgC AAg ATC TAT Tg-3’ H5+1456* 5’ Primer 5’-ACg TAT gAC TAT CCA CAA TAC TCA- 3’ H5+1637* Mẫu dò 5’-FAM-TCA ACA gTg gCg AgT TCC CTA gCA-TAMRA-3’ H5 H5-1685* 3’Primer 5’-AgA CCA gCT ACC ATg ATT gC-3’ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 80 Phụ lục 3: Lượng chất phản ứng Real time RT-PCR dùng cho các cặp mồi phát hiện gen MA (Cúm A), H5 và H7. Chất phản ứng Liều lượng cho 1 phản ứng Hàm lượng cuối cùng H2O 6,95 µl 5X buffer 5 1X 25mM MgCl2 1,25 3,75 mM* dNTP's (10mM mỗi loại) 0,8 320 µM mỗi loại dNTP Mồi chạy xuôi (20 pmol/µl) 0,5 10 pmol/25 µl Mồi chạy ngược (20 pmol/µl) 0,5 10 pmol/25 µl RNase Inhibitor (13,3 units/µl) 0,5 0,266 units/µl Enzyme Mix 1,0 Mẫu dò (6 pmol/µl) 0,5 0,12 µM Tổng lượng cho 1 phản ứng 17 µl Mẫu ARN 8 µl Lượng toàn bộ trong ống mẫu 25 µl * Quiagen buffer ñã có sẵn MgCl2 2,5mM ở hàm lượng 1X Phụ lục 4: Bảng chu kỳ nhiệt của bước phiên mã ngược (RT) dùng cho Quiagen one step RT-PCR kit. Bước phiên mã ngược 1 chu kỳ 30 phút 500C 15 phút 950C Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 81 Phụ lục 5: Bảng chu kỳ nhiệt cho tổng hợp gen và các cặp mồi. Cặp mồi Bước Thời gian Nhiệt ñộ 45 chu kỳ Biến tính 1 giây 940C AIV matrix Bám của cặp mồi 20 giây 600C 40 chu kỳ Biến tính 1 giây 940C H7 Bám của cặp mồi 20 giây 580C 40 chu kỳ Biến tính 1 giây 940C Bám của cặp mồi 20 giây 570C H5 Kéo dài chuỗi tổng hợp 5 giây 720C Phụ lục 6: Các thông số và hướng dẫn cài ñặt chương trình phân tích dữ liệu của máy chu kỳ nhiệt Cepheid Smart Cycler Phần mềm Smart Cycler cung cấp nhiều phương pháp xác ñịnh ngưỡng chu kỳ (Ct). Tất cả các cách phân tích dữ liệu ñược lấy từ Analysis Settings trong View Results. Những thay ñổi trong cài ñặt mặc ñịnh tiêu chuẩn ñã ñược thiết lập ñối với các phân tích phát hiện virus Cúm A với các cặp mồi Matrix, H5 và H7. Biên tập các phần phân tích mặc ñịnh của Smart Cycler ñược mô tả dưới ñây, các dữ liệu thô sẽ ñược phân tích tuỳ theo mức ñộ phân tích ñược mô tả. Phân tích ñường cong (Curve analysis): Chấp nhận cài ñặt ñường cong sơ cấp "Primary curve" – Ct ñược phát hiện và thông báo ở chu kỳ có ñường cong sơ cấp cắt chéo ngưỡng. Cách sử dụng (Usage): Chấp nhận cài ñặt mặc ñịnh "Assay" ñối với kênh FAM. Trừ giá trị nền (Background Subtraction): Chấp nhận giá trị mặc ñịnh "ON" Giá trị tối thiểu nền (Background Minimum): Chấp nhận giá trị mặc ñịnh "5" (phút). Chu kỳ ñầu tiên ñã tính giá trị nền khi phần trừ giá trị nề ñược Bật Chu kỳ cực ñại giá trị nền (Background Maximum cycle): Nhập số "28" là Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 82 chu kỳ cực ñại ñể tính toán giá trị nền khi trừ giá trị nền ñược Bật. Mặc ñịnh là 40. ðặt ngưỡng (Threshold Settings): chấp nhận mặc ñịnh của "Manual" ðơn vị huỳnh quang ngưỡng xác ñịnh (Manual Threshold Fluorescence units): Nhập số "25" là ñơn vị huỳnh quang. Ct nằm phía trên huỳnh quang nền. Nếu cài ñặt huỳnh quang nền càng gần giấ trị cận ngưỡng thì giới hạn phát hiện càng nhạy hơn. Tuy nhiên nếu giá trị ngưỡng quá gần với giá trị huỳnh quang nền thì ñộ ồn của nền có thể cắt chéo ngưỡng và cho kết quả không chính xác là mẫu ñó dương tính (phản ứng dương tính giả). Nếu ñơn vị huỳnh quang ngưỡng thấp từ 30 ñến 25 (giá trị mặc ñịnh), ñộ nhạy phân tích sẽ tăng lên. Khả năng cho kết quả âm tính giả giảm trong khi ñó khả năng cho kết quả dương tính giả tăng. Boxcar Average: chấp nhận mặc ñịnh "0" - Kiểm tra các kết quả xét nghiệm Chỉ những thay ñổi trong phần mặc ñịnh của máy chu kỳ nhiệt Cepheid Smart Cycler ñược cài ñặt Giá trị nền cực ñại và giá trị ngưỡng. Với phần cài ñặt phân tích, mẫu ñược xem là dương tính (cắt chéo Ct) khi các ñơn vị huỳnh quang vượt quá 25 ñơn vị. Những cài ñặt này ñược thiết kế nhằm tối ưu hóa khả năng phân biệt mẫu dương tính và âm tính trong quy trình hướng dẫn cụ thể này, tuy nhiên kết của của mỗi lần chạy phản ứng cần phải ñược xác nhận bởi cán bộ xét nghiệm. ðường cong phải nằm trong pha tuyến tính log khi cắt chéo ngưỡng. Khi giá trị nền cực ñại thấp, ảnh hưởng của các vệt hình chữ V cũng giảm xuống. Các mẫu vẫn còn vệt chình chữ V, có thể ñặt giá trị nền cực ñại xuống 15 cho ñén khi các chu kỳ còn xuất hiện vệt nằm ngang và thẳng hàng với giá trị huỳnh quang là "số không". Phải luôn nhớ ñặt giá trị cực ñại thấp hơn nếu muốn chạy càng nhiều chu kỳ càng tốt khi tính toán giá trị nền. ðây là một sự ñiều chỉnh của phần mềm cung cấp dữ liệu và giảm số lượng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 83 chu kỳ khi tính toán giá trị nền và căn chỉnh ñường cong. Nếu có các câu hỏi về các vệt, hãy xem các vệt với giá trị trừ nền ñược tắt. Nó sẽ cho thấy dữ liệu huỳnh quang thô và ñôi khi cần có những phân tích hỗ trợ. Huỳnh quang nền cũng phải ñược theo dõi thường xuyên. Sự suy giảm của mẫu dò sẽ xảy ra khi tăng huỳnh quang nền. Vệt huỳnh quanh trong mẫu cần ñược xem xét trước khi chấp nhận kết quả dương tính/âm tính của máy chu kỳ nhiệt Smart Cycler. Các mẫu bệnh phẩm có vệt huỳnh quang làm gia tăng các ñơn vị huỳnh quang và giá trị tiếp cận, nhưng không cắt ngang Ct, nên ñược gửi ñến NVSL ñể xét nghiệm thêm. Những mẫu này ñược xem là tăng chậm "late riser – LR" và thường cho kết quả gần với ngưỡng phát hiện. Hiện nay các mẫu LR này chưa ñược tìm hiểu rõ nên cần xét nghiệm thêm bằng phương pháp phân lập virus. Các chất phản ứng H5 sẽ phát hiện ñược cả 2 chủng virus thuộc phân nhóm (subtype) Eurasian H5 và North American H5. Phản ứng này không phân biệt ñược phả hệ của virus. Phụ lục 7: Phương pháp xử lý huyết thanh dùng trong phản ứng HI - Xử lý với RDE (Receptor Destroying Enzyme): Trộn 3 phần RDE với 1 phần huyết thanh ủ ở nhiệt ñộ 370C trong nồi ñun cách thuỷ (water bath) qua ñêm. Sau ñó ủ tiếp ở nồi ñun cách thuỷ nhiệt ñộ 560C/30 phút ñể vô hoạt RDE còn dư. Huyết thanh ñã xử lý ñể nguội, cho thêm 6 phần nước muối sinh lý, ñộ pha loãng cuối cùng của kháng huyết thanh sẽ là 1/10. - Xử lý với hồng cầu gà: Hiện tượng gây ngưng kết hồng cầu giả có thể xử lý bằng cách hấp phụ huyết thanh kiểm tra với hồng cầu gà. Thêm 25 µl hồng cầu ñặc vào 500 µl huyết thanh, lắc nhẹ và ñể ở nhiệt ñộ phòng trong 30 phút, sau ñó ly tâm ở tốc ñộ 800 g trong 2 - 5 phút. Thu lấy huyết thanh ñã xử lý. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 84 MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG THỜI GIAN LÀM LUẬN VĂN Hình 1, 2: Tiêm vacxin cúm gia cầm cho vịt Hình 3, 4: Lấy mẫu máu vịt thí nghiệm Hình 5: Phản ứng RT-PCR xác ñịnh virus cúm trong bệnh phẩm Hình 6: Chuồng chăn nuôi vịt tại Trung tâm Nghiên cứu Vịt ðại xuyên ._.