Công nghệ nuôi cấy tế bào sâm Ngọc Linh

m Ngọc Linh (hay còn gọi là Sâm Khu Năm) Panax vietnamensis Ha & Grutzv., được biết đến trên thế giới với tên gọi Vietnamese ginseng. Sâm Ngọc Linh có thành phần ginsenosid, dược chất chính trong Nhân sâm, được đánh giá vào loại nhiều nhất so với các loài khác của chi Panax trên thế giới. Tuy nhiên, Sâm Ngọc Linh được phát hiện khá muộn (vào năm 1985) cho nên, tuy có nhiều cố gắng để phát triển cây thuốc quý giá này nhưng tiềm năng của Sâm Ngọc Linh vẫn chưa hoàn toàn được đánh thức. Cộng với địa bàn phân bố hẹp (chỉ có ở vùng núi Ngọc Linh), lại bị khai thác bừa bãi, nên Sâm Ngọc Linh sớm đứng trước nguy cơ tuyệt chủng. Với nỗ lực của những địa phương có Sâm Ngọc Linh phân bố, hiện nay loài dược liệu này đã có thể tránh bị tuyệt diệt. Nhưng để đưa Sâm Ngọc Linh thành cây thuốc ngang hàng với các loại Nhân sâm có trên thị trường dược liệu cả về số lượng và chất lượng, cần có nhiều nghiên cứu chuyên sâu ứng dụng sản xuất hiệu quả. Trên thế giới, cây Nhân Sâm Panax ginseng C. A. Meyer đã được nhân giống và sản xuất dược chất ginsenosid thành công bằng nuôi cấy mô. Ginsenosid chiết từ mô sẹo trong nuôi cấy mô cây Nhân sâm có cùng dạng với ginsenosid thu từ rễ Nhân Sâm tự nhiên, tác dụng dược lý của dịch chiết bằng rượu hoặc bằng methanol và bột ginsenosid từ mô sẹo hầu như giống với dịch chiết và bột thu từ rễ Nhân Sâm tự nhiên. Do đó đã có các hệ thống nuôi cấy lớn như bioreactor dùng để sản xuất ginsenosid theo quy mô công nghiệp, cung cấp cho thị trường tiêu thụ ngày càng rộng lớn, khắc phục được những hạn chế trong canh tác cây Nhân Sâm như: thời gian trồng kéo dài, bị giới hạn về khí hậu, thổ nhưỡng, nhiều sâu bệnh... Sâm Ngọc Linh được cả thế giới biết đến với tên gọi Vietnamese ginseng nhưng không có nhiều nhà khoa học quốc tế lưu ý nghiên cứu về nó. Việt Nam cần tự nghiên cứu cũng như sản xuất, cố gắng đánh thức giá trị y học và giá trị kinh tế của Sâm Ngọc Linh. Trong các hướng nghiên cứu, hướng nuôi cấy mô đã thật sự đưa nông nghiệp lên bước phát triển tiên tiến, vì vậy muốn nghiên cứu đưa cây Sâm Ngọc Linh phát triển theo hướng hiện đại, mang lại hiệu quả kinh tế cao không thể bỏ qua kỹ thuật này. Thực tế, cây Sâm Ngọc Linh đã được nhân giống thành công từ mô sẹo. Nhưng tiến hơn một bước để sản xuất ginsenosid Sâm Ngọc Linh bằng nuôi cấy mô thì chưa có nghiên cứu nào được công bố. Với mong muốn tìm hiểu về loại cây trồng có giá trị kinh tế này cùng với những công nghệ nuôi cấy tế bào đã và đang được thực hiện nhằm mục đích nhân giống và sản xuất các hợp chất có giá trị kinh tế, tôi đã thực hiện khóa luận tốt nghiệp: “Công nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) dưới sự hướng dẫn của thầy Bùi Văn Thế Vinh. 1.2. Mục đích của đề tài: Tổng quan về Sâm Ngọc Linh. Tìm hiểu một số công nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh. CHƯƠNG II. TỔNG QUAN 2.1. Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.1. Khái niệm Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật ( tế bào đơn, mô, cơ quan…) trong điều kiện vô trùng. Ø Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên hai nguyên tắc: Dựa vào tính toàn năng của tế bào: Mỗi một tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi. Mỗi tế bào là một hệ thống mở, tự duy trì và tự sản xuất để tiến hành các chức năng chuyên biệt và sản sinh thế hệ tế bào mới nếu cần thiết. Dựa vào khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào: Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến khi thể hiện một chức năng nào đó. Các tế bào dùng trong môi trường cấy đều có khả năng biệt hóa về cấu trúc và chức năng. Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng - tế bào phôi và quá trình đó gọi là quá trình phản biệt hóa. Vì vậy những tế bào càng gần với trạng thái của tế bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu. Ø Ý nghĩa: Nhân nhanh giống cây trồng. Bảo quản nguồn gen. Tạo cây sạch bệnh. Sản xuất các hoạt chất sinh học. Mang tính công nghiệp Ø Sơ lược lịch sử phát triển: 1665: Robert Hooke quan sát được tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra khái niệm tế bào. 1838: Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào. 1904: Hannig nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài họ cải. 1934: Kogl xác định vai trò của IAA. 1951: Skoog nghiên cứu sử dụng các hoá chất điều hoà sinh trưởng và phát sinh cơ quan. 1952: Morel và Martin thực hiện vi ghép invitro thành công. 1962: Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy tế bào thực vật. 1964: Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà rốt. 1969: Phân lập tế bào trần từ nuôi cấy tế bào dịch lỏng (huyền phù) của Hapopappus gracilis. 1973: Phát hiện Cytokinin có khả năng phá ngủ ở Gerberas. 1978: Marton và cộng sự xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần. 1983: Công ty Mitsui Petrochemicals lần đầu tiên đã sản xuất chất trao đổi thứ cấp trên quy mô công nghiệp bằng nuôi cấy tế bào dịch lỏng Lithospermum spp. Mitsui .0Petrochemicals. 1988: Klein và cộng sự tái sinh cây chuyển gen bằng phương pháp bắn gen. 1994: Thương mại hóa giống cà chua chuyển gen FlavrSavr. 2.1.2. Các kỹ thuật nuôi cấy 2.1.2.1. Nuôi cấy phôi Phôi phát triển qua hai giai đoạn dị dưỡng và tự dưỡng. Ở giai đoạn dị dưỡng cần có các chất điều hòa sinh trưởng để phát triển. Trong nuôi cấy phôi, đường đóng vai trò rất quan trọng, đường sucrose cho nhiều kết quả tốt hơn. Ngoài ra một số chất tự nhiên như nước dừa, dịch chiết malt, casein thủy phân là những chất rất cần trong nuôi cấy phôi. Đối với các chất điều hòa sinh trưởng, auxin thường dùng ở nồng độ thấp, kinetin có vai trò đặc biệt cho sự phát triển của phôi. Nhiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi, thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ, ánh sáng thấp hơn phôi phát triển tự nhiên. Nhiệt độ 25 ± 2oC thích hợp cho sinh trưởng và nảy mầm của phôi. Các phôi thứ cấp rất khó sinh trưởng đã hoạt động khi chúng được tách rời và nuôi ở điều kiện chiếu sáng 4.000 lux hoặc hơn trong 4 giờ chiếu sáng suốt 4 ngày nuôi đầu tiên. Ø Kỹ thuật nuôi cấy phôi mang lại nhiều hiệu quả như: Nhân giống cây trồng. Thử sức sống của phôi hạt. Duy trì phôi yếu và cứu phôi lai xa. Sản xuất hạt nhân tạo mà bản chất là tế bào phôi. 2.1.2.2. Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời Trong nuôi cấy mô và cơ quan tách rời, khâu chọn mẫu có tầm quan trọng đặc biệt, mẫu phải ở tình trạng sinh lý tốt và đang phát triển. Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây là khác nhau nhưng có một số yêu cầu chung như nguồn carbon, nguồn đường, nguyên tố đa lượng, vi lượng và các chất điều hòa sinh trưởng. Muốn duy trì sinh trưởng và phát triển của cơ quan nuôi cấy cần thường xuyên cấy chuyền qua môi trường mới. Đối với nuôi cấy mô cần bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ dưới dạng acide amine, đường và inositol. Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quan trọng hơn vì các mô tách rời không có khả năng tổng hợp các chất này. Ø Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời được ứng dụng trong: Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng đối với một bộ phận hoặc một mô của cây. Nhân cây invitro. Tạo mô sẹo phục vụ cho các nghiên cứu như chọn dòng tế bào, đột biến soma,… 2.1.2.3. Nuôi cấy mô phân sinh Đặc điểm của mô phân sinh là chứa các tế bào non trẻ, phân chia mạnh, không bị virus xâm nhập, vì vậy mô phân sinh là mô duy nhất của cây sạch virus. Mô phân sinh thường là các mô đỉnh chồi và cành. Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ các mầm non, các chồi mới hình thành hoặc các cành non. Trong nuôi cấy sự cân bằng giữa các chất điều hòa sinh trưởng rất quan trọng. Muốn tạo chồi cần bổ sung cytokinin hoặc tổ hợp cytokinin với auxin, muốn tạo rễ thì bổ sung auxin. Ø Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng trong: Tạo cây sạch virus. Nhân giống invitro. Tạo cây đa bội qua xử lý colchicin. Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan. 2.1.2.4. Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn Ưu điểm của nuôi cấy bao phấn là đơn giản về thao tác kỹ thuật và môi trường nuôi cấy, nhưng có thể tạo ra cả cây lưỡng bội từ soma của thành bao phấn, do vậy sẽ khó phân biệt với cây tự lưỡng bội từ cây đơn bội. Hạt phấn nuôi cấy có thể phát triển thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy invitro bằng con đường tạo phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tạo mô sẹo và tạo cơ quan. Phương pháp tạo cây đơn bội kép và phương pháp chọn lọc tạo giống có hiệu quả chọn lọc rất cao, đặc biệt nếu được kết hợp với các phương pháp tạo ra các biến dị di truyền khác nhau như lai hữu tính hoặc gây đột biến nhân tạo. Thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi tùy thuộc vào kiểu gen và tuổi của bao phấn cũng như các điều kiện mà ở đó cây cho bao phấn sinh trưởng. Quá trình sinh trưởng về sau của phôi hạt phấn đòi hỏi bổ sung các muối khoáng vào môi trường. Tần số phát sinh cây đơn bội và sinh trưởng của cây nói chung sẽ tốt hơn nếu chúng được nuôi trong điều kiện chiếu sáng, mặc dù cây hạt phấn của một số kiểu gen sinh trưởng trong cả hai điều kiện có chiếu sáng và trong tối. Ø Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn được dùng cho tạo các dòng thuần để: Nghiên cứu gen lặn vì chúng không biểu hiện ở cơ thể dị hợp tử. Chọn các dòng đột biến. 2.1.2.5. Nuôi cấy tế bào đơn Tế bào đơn có thể nhận được bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý enzyme. Sau đó chúng được nuôi cấy dịch lỏng, có khuấy hoặc lắc tạo điều kiện thuận lợi cho sự trao đổi khí và tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng. Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trong môi trường đặc biệt và tăng sinh khối. Mỗi loại cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy khác nhau. Yêu cầu dinh dưỡng cho nuôi cấy tế bào đơn khá phức tạp, do chúng bị mất nhiều chất cần thiết cho sinh trưởng khi tách rời khỏi quần thể tế bào. Ø Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng cho các mục đích: Chọn dòng tế bào. Nghiên cứu cấu trúc tế bào, phát triển và phân hóa tế bào trong những điều kiện khác nhau. Thu nhận các chất trao đổi thứ cấp. 2.1.2.6. Nuôi cấy protoplast Tế bào trần là tế bào đã được tách bỏ thành tế bào bằng phương pháp cơ học hay sử dụng enzyme. Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast có thể tái sinh thành tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Ưu thế của kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào trần là tế bào không có màng cứng, ở trạng thái đơn bào, mật độ tế bào thu được trên 1 đơn vị thể tích môi trường có thể rất cao (đạt 106 tế bào/1ml môi trường). Ø Ứng dụng nuôi cấy protopast: Tạo ra cây lai soma. Chuyển các bào quan và chuyển gen. Quá trình dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài. Quá trình sinh tổng hợp màng tế bào. 2.1.3. Môi trường nuôi cấy Ø Thành phần môi trường nuôi cấy gồm năm thành phần cơ bản sau: Muối khoáng đa lượng. Muối khoáng vi lượng Vitamin. Nguồn carbon. Chất điều hòa sinh trưởng. Ngoài ra có thể bổ sung các thành phần không xác định (nước dừa, dịch chiết nấm men,…) và agar. Ø Môi trường nuôi cấy có thể chia thành ba loại: Môi trường nghèo dinh dưỡng: White, Knop. Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: Gamborg. Môi trường giàu dinh dưỡng: MS. Cơ sở cho việc xây dựng các môi trường nuôi cấy là xem xét các thành phần cần cho sự sinh trưởng và phát triển của cây. Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm thì thành phần môi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy. Tế bào mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong nuôi cấy. Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào. Vì vậy cần điều chỉnh độ pH môi trường thích hợp trước khi nuôi cấy. Thường sử dụng NaOH hay HCl loãng để điều chỉnh độ pH. 2.1.4. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 2.1.4.1. Auxin Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô thực vật. IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực vật, còn NAA, IBA, 2,4-D là các auxin nhân tạo, thường các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn. Chúng có mặt ở các bộ phận của cây như mô phân sinh đỉnh, các bộ phận non khác của cây. Ø Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu. Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy. Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy. Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh. Đặc tính của auxin. Ø Vai trò của các chất thuộc nhóm auxin: Kích thích phân chia và kéo dài tế bào. Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ra ức chế sinh trưởng của chồi bên. Kích thích sự phân hoá của các mô dẫn. Ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín của quả, sự ra hoa trong mối quan hệ với điều kiện môi trường. Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus). Kích thích tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp). Tạo phôi soma (2,4-D). 2.1.4.2. Cytokinin Các cytokinin là dẫn xuất của adenine. Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là BAP, Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo. Chúng được hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng. Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các hệ thống nuôi cấy. Đối với sự phát sinh phôi (embryogenesis), để tạo callus và rễ cần có tỷ lệ auxin/ cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi và chồi nách. Cytokinin có mặt trong mô phân sinh đỉnh rễ, quả non. Ø Chức năng chủ yếu của các cytokinin: Kích thích phân chia tế bào. Tạo và nhân callus. Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô. Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh . Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào. Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài. Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) . Ức chế sự hình thành rễ. Ức chế sự kéo dài chồi. Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục. 2.1.4.3. Gibberellin Trong số hơn 20 chất thuộc nhóm gibberellin, GA3 là chất được sử dụng nhiều hơn cả trong thực tiễn. GA3 kích thích kéo dài chồi và nảy mầm của phôi vô tính.. GA3 có tính hoà tan trong nước. Gibberellin được tạo ra trong đỉnh rễ, chồi, lá non, hạt. Ø Gibberellin có các chức năng cơ bản sau: Kích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào. Phá ngủ hạt giống hoặc củ giống. Kiểm soát sự ra hoa của các cây 2 năm tuổi. Ức chế sự hình thành rễ bất định. Kích thích sinh tổng hợp của α-amylase ở hạt cây ngũ cốc nảy mầm. Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân hành và củ). Kích thích sự nảy mầm của phấn hoa và sinh trưởng của ống phấn. Có thể gây tạo quả không hạt hoặc làm tăng kích thước quả nho không hạt. Có thể làm chậm sự hoá già ở lá và quả cây có múi. 2.1.4.4. Abscisic acid (ABA) Abscisic acid là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật tự nhiên được tạo ra trực tiếp từ acid mevalonic hoặc do sự phân giải carotenoid. Chúng được tạo ra trong lá, quả, mũ rễ, hạt. Ø Các tác dụng cơ bản của ABA là: Kích thích sự rụng lá, hoa, quả ở hầu hết các cây trồng và gây ra sự nứt quả ABA thường được sản sinh khi có các yếu tố ức chế cây trồng như mất nước và nhiệt độ thấp đóng băng. Kích thích sự ngủ nghỉ, kéo dài thời gian ngủ nghỉ và làm chậm sự nảy mầm của hạt. Ức chế sự kéo dài thân và được sử dụng để kiểm soát sự kéo dài thân cành. Gây ra sự đóng khí khổng. 2.1.4.5. Ethylene Ethylene là một loại khí hiện diện trong bầu khí quyển với một nồng độ rất thấp. Ethylene được sinh ra bởi những mô thực vật còn sống và có vai trò điều hòa sự phát triển ở thực vật. Chúng được tạo ra ở các bộ phận như mô phân sinh đỉnh rễ, chồi, nốt lá, hoa hóa già, quả chín. Ø Các chức năng cơ bản của ethylene: Gây già hoá lá, kích thích sự rụng lá và quả. Làm chín quả. Sinh tổng hợp ethylene được tăng cường khi quả đang chín, cây đang bị úng, lão hoá, tổn thương cơ giới và bị nhiễm bệnh. Điều khiển sự chín của một số loại quả. Ethylene kìm hãm sự ra hoa của đa số cây. Tuy vậy, sự ra hoa của xoài, dứa, một số cây cảnh lại được kích thích bởi ethylene. Kích thích nở hoa, kích thích sự lão hoá của hoa và lá. 2.1.5. Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.5.1. Đảm bảo điều kiện vô trùng Môi trường nuôi cấy có chứa đường, muối khoáng,... rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển và với tốc độ phát triển nhanh hơn rất nhiều lần so với tế bào thực vật. Dụng cụ thuỷ tinh: Rửa sạch, hấp trong nồi áp suất ở 121 oC/15 phút. Nút đậy: Sử dụng nút cao su. Nút được nhét bông gòn không thấm nước để bụi và không khí không được đi qua. Sau đó đem đi hấp trong nồi hấp 121 oC/15 phút. Mẫu nuôi cấy: Các mẫu lấy ngoài tự nhiên như cây, lá, hoa, cành cần rửa sạch bằng xà bông dưới vòi nước nhiều lần để hạn chế sự tạp nhiễm. Sử dụng các chất có hoạt tính diệt khuẩn như cồn chlorua, nước javen,... Vô trùng nơi thao tác và tủ cấy. Môi trường: Môi trường thuờng được hấp khử trùng ở 121 oC, 1atm trong 30 phút. Có một số chất trong môi trường nuôi cấy không bền nhiệt (vitamin, kháng sinh,..), những chất này được lọc vô trùng sau đó được thêm vào môi trường sau khi đã được hấp, làm nguội đến khi cầm trên tay được. 2.1.5.2. Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách Tuỳ vào mục đích nuôi cấy, thu nhận sản phẩm. Tuỳ thuộc vào từng loại nuôi cấy sẽ có một môi trường tối ưu. Thông thường ta phải trải qua quá trình thực nghiệm, từ đó mới tìm một loại môi trường thích hợp cho từng mục đích Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng, vitamin rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn nhiều so với các tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy bị nhiễm bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày sẽ phủ đầy vi khuẩn hoặc nấm, khi đó mô nuôi cấy sẽ chết dần thí nghiệm phải bỏ đi. Mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi rất nghiêm ngặt, đặc biệt quan trọng trong nuôi cấy tế bào đơn trong các bioreactor. Nhiều loại protein, vitamin, amino axit, hormone,..không bền nhiệt vì vậy nên dùng phin lọc micropore để khử trùng. Ø Có 3 nguồn nhiễm tạp chính: Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối. Trên bề mặt hoặc bên trong mô nuôi cấy. Trong quá trình thao tác. Bảng 2.1: Thời gian tối thiểu để hấp khử trùng môi trường nuôi cấy mô ở 1210C. Thể tích môi trường (ml) Thời gian tối thiểu (phút) 20-25 24 50 26 100 28.5 250 31.5 500 35 1000 40 2000 48 3000 55 4000 63 2.1.5.3. Chọn mô cấy và xử lý đúng cách Tuỳ mục đích nuôi cấy để chọn loại mô cấy thích hợp. Thông thường các mô trong cơ thể thực vật đều có thể dùng làm mô cấy, trừ những mô đã hoá gỗ. Khi bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định thì trước tiên chú ý đến các chồi nách và mô phân sinh ngọn. Nguồn lấy mẫu, vị trí lấy mẫu cấy từ cây mẹ là những yếu tố quan trọng trong việc thiết lập quá trình nuôi cấy sạch. Lấy mẫu vào mùa xuân khi cây đâm lộc, các chồi mới nhú sạch hơn so với các chồi ngủ. Cây trồng ngoài ruộng dễ bị nhiễm hơn cây trồng trong nhà kính hoặc chậu trong phòng. Các phần như rễ, củ hoặc gần như nằm trên mặt đất như thân bò, dạng củ, protocom của lan thì khó làm sạch hơn các nguyên liệu thực vật khác. Có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, trong các rảnh nhỏ hoặc giữa các lớp vảy chồi, mầm. Để loại bỏ sự tạp nhiễm bề mặt, có thể rửa sơ bộ mô cấy với nước xà phòng để loại bỏ bụi, đất và làm tăng sự tiếp xúc với các chất khử trùng. Để làm tăng sự khử trùng có thể dùng chất hỗ trợ làm tăng sự tiếp xúc như Tween - 20, xà phòng. Thường dùng 1 - 3 giọt Tween cho 100 ml dung dịch nước khử trùng là tốt nhất. Ngoài ra để tăng sự tiếp xúc bằng cách lắc hoặc khuấy đều mẫu cấy trong lúc đang khử trùng. Ø Qui trình khử trùng bề mặt: Rửa mẫu bằng chất tẩy nhẹ trước khi thao tác với dung dịnh khử trùng. Rửa mẫu dưới vòi nước chảy từ 10-30 phút. Nhúng ngập mẫu vào dung dịch khử trùng trong điều kiện vô trùng. Đậy nắp lọ rồi lắc nhẹ trong thời gian khử trùng. Bỏ dung dịch khử trùng đi rồi rửa vài lần bằng nước cất vô trùng. Bảng 2.2: Nồng độ và thời gian sử dụng 1 số chất xử lí mô cấy thực vật: Stt Chất khử trùng Nồng độ Thời gian khử trùng (phút) Hiệu quả 1 Hypochlorite calcium 9-10% 5-30 Rất tốt 2 Hypochlorite sodium 0,5-5% 5-30 Rất tốt 3 Nước bromine 1-2% 2-10 Rất tốt 4 Oxy già 3-12% 5-15 Tốt 5 Chlorua thủy ngân 0,1-1% 2-10 Tốt 6 Nitrate bạc 1% 5-30 Tốt 7 Kháng sinh 4-50mg/l 30-60 khá 2.2. Giới thiệu cây Sâm Ngọc Linh 2.2.1. Phân loại Ø Lịch sử phân loại: Việt Nam có nhiều cây thuốc được gọi là Sâm. Nhưng chỉ có bốn loài Sâm thuộc họ Nhân Sâm (Araliaceae). Chi Panax gần gũi với cây Nhân Sâm Panax gingseng C. A. Meyer là Sâm Ngọc Linh, Sâm Tam Thất, Sâm Nam và Sâm Vũ Diệp, đều là các cây thuốc quý. Năm 1968, KS. Vũ Đức Minh đã tìm thấy cây Sâm Ngọc Linh tại vùng núi Ngọc Linh và tạm đặt tên nó là Sâm Khu 5. Năm 1973, đoàn điều tra cây thuốc của Ban dân y Khu 5 do DS. Đào Kim Long dẫn đầu đã phát hiện một loài Panax mọc hoang thành quần thể ở độ cao 1.800 m trên vùng núi Ngọc Linh và tạm đặt tên là Sâm Đốt Trúc với tên khoa học Panax articulatus, họ Nhân Sâm (Araliaceae) (Nguyễn Minh Đức, 2003). Tên khoa học của cây được công nhận là Panax vietnamensis Ha et Grush., họ Nhân Sâm Araliaceae, công bố tại Viện thực vật Kamarov (Liên Xô trước đây) nǎm 1985 do Hà Thị Dung và I. V. Grushvistky đặt tên (internet 4). Hình 2.1: Sâm Ngọc Linh ngoài tự nhiên Ø Phân loại: Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Bộ: Apiales Họ: Cam Tùng (Araliaceae) Chi: Panax Loài: Panax Loài: Panax vietnamensis Ha et Grush Tên khác: Sâm Việt Nam, Sâm Ngọc Linh, Sâm Khu Năm, Thuốc Dấu (Xê Đăng). Tên nước ngoài: Vietnamese ginseng. Hình 2.2: Hình thái Sâm Ngọc Linh 2.2.2. Đặc điểm hình thái Cây thảo, sống lâu năm nhờ thân rễ, cao khoảng 40 - 80 cm, đôi khi trên 1 m. Thân rễ nạc, mọc bò ngang như củ gừng, có nhiều đốt, không phân nhánh, dài 30 - 40 cm, có thể hơn, mang nhiều rễ nhánh và củ, có nhiều vết sẹo do thân khí sinh hàng năm để lại, mặt ngoài màu nâu nhạt, ruột trắng ngà, phần cuối đuôi đôi khi có một củ hình cầu. Thân rễ còn mang nhiều rễ phụ, ở cây hoang dại, thân rễ là phần phát triển mạnh nhất chứa chất dự trữ, hoạt chất. Hình dạng rất thay đổi, rễ củ ở cây sâm hoang dại rất phát triển có dạng con quay, hình trụ, có màu vàng nhạt mang nhiều rễ con với những vàm ngang. Đối với sâm trồng, rễ củ rất phát triển, tăng trưởng hàng năm rất rõ rệt, chúng có ba dạng chính: dạng củ cà rốt, dạng con quay và dạng bó củ, đây là dạng rất phổ biến. Sâm Ngọc Linh trồng thường cao đến 1 m mang nhiều lá kép có khi đến 7 lá chét to hơn bình thường. Thân khí sinh mảnh, thẳng màu xanh hay hơi tím, mọc thẳng, mang 2 - 4 lá kép chân vịt mọc vòng, mỗi lá kép có 5 lá chét hình trứng ngược hoặc hình mác, dài 10 - 14 cm, rộng 3 - 5 cm, gốc hình nêm, đầu thuôn dài thành mũi nhọn, mép khía răng nhỏ. Hoa tự, cụm hoa mọc thành tán đơn ở ngọn thân, có cuống dài 10 - 20 cm có thể kèm 1 - 4 tán phụ hay một hoa riêng lẻ ở phía dưới tán chính. Hoa nhiều màu lục vàng, hoa hình tán đơn mọc dưới các lá thẳng với thân. Mỗi tán 60 - 100 hoa, cuống hoa ngắn 1 - 1.5 cm, lá đài 5, cánh hoa 5, vàng nhạt, nhị 5, bầu 1 ô với 1 vòi nhụy. Đài có 5 răng dài, nhị 5, chỉ nhị hình sợi, bầu 1 ô với một vòi nhụy. Lá kép, chân vịt mọc vòng với 3-5 nhánh lá, cuống lá kép, mang 5 lá chét, lá chét phiến bầu dục, mép khía răng cưa, chóp nhọn, có lông ở cả hai mặt. Quả hạch, hình trứng, khi chín có màu đỏ hay vàng nhạt, sau đen, hạt hình thận màu trắng, bề mặt hạt có nhiều chỗ lồi lõm, có vân, quả mọc tập trung ở trung tâm của tán lá, dài độ 0,8 - 1cm và rộng khoảng 0,5 - 0,6 cm, mỗi quả chứa một hạt, một số quả chứa 2 hạt và số quả trên cây bình quân khoảng 10 đến 30 quả. Mùa hoa: tháng 4 – tháng 6, mùa quả: tháng 7 – tháng 9. Hình 2.3: Cây Sâm Ngọc Linh 2.2.3. Sinh thái và phân bố Ø Đặc điểm sinh thái: Sâm Ngọc Linh là loại cây thân thảo ưa ẩm và ưa bóng, sinh trưởng ở độ cao từ 1.200 – 2.100m so với mặt biển, mọc rải rác hay tập trung thành từng đám nhỏ dưới tán rừng. Môi trường rừng nơi có Sâm mọc luôn ẩm ướt, thường xuyên có mây mù, nhiệt độ khoảng 15-18 0C, lượng mưa khoảng 3000 mm/ năm. Đất rừng ở đây được tạo thành do lá cây mục lâu ngày, có màu nâu đen, tơi xốp, hàm lượng mùn cao và chứa nhiều nước. Sâm Ngọc Linh sinh trưởng mạnh trong mùa xuân hè. Mùa hoa quả từ tháng 5- tháng 10, cây ra hoa quả tương đối đều hàng năm. Sau khi quả chín rụng xuống đất, tồn tại qua mùa đông khoảng 4 tháng và sẽ nảy mầm vào đầu mùa xuân năm sau, Sâm có khả năng tái sinh tự nhiên từ hạt khá tốt. Sâm có phần thân trên mặt đất lụi hàng năm, để lại các vết sẹo rõ. Mỗi năm từ đầu mầm thân rễ (kể cả phần thân rễ phân nhánh) chỉ mọc lên một thân mang lá. Căn cứ vào vết sẹo trên thân rễ để tính tuổi của Sâm. Ø Đặc điểm phân bố: Trong số hơn mười loài và dưới loài đã biết của chi Nhân Sâm (Panax), ở Việt Nam có ba loài mọc tự nhiên và một loài là cây nhập trồng. Sâm Ngọc Linh được phát hiện sau cùng vào 1973. Đến 1985 nó mới được công bố là hoàn toàn mới đối với khoa học. Đến nay Sâm Ngọc Linh chỉ mới được phát hiện duy nhất ở vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum. Ngọc Linh là dãy núi cao thứ hai của Việt Nam, có tọa độ địa lý từ 107o50’ – 108o7’ kinh tuyến Đông và từ 15o0’ – 15o10’ vĩ tuyến Bắc, đỉnh cao nhất là Ngọc Linh cao 2598 m. Những điểm vốn trước đây có sâm Ngọc Linh mọc tự nhiên từ độ cao khoảng 1500 m đến 2200 m, chủ yếu tập trung ở 1800 – 2000 m, thuộc địa bàn của hai huyện Đăk Tô (tỉnh Kon Tum) và Trà My (tỉnh Quảng Nam). Về giới hạn cũng như phân bố của loài sâm này ở núi Ngọc Linh hiện nay đã có nhiều thay đổi. 2.2.4. Hiện trạng và tiềm năng của cây sâm Ngọc Linh Cây có vùng phân bố rất hẹp và mọc rất rải rác. Do là loài Sâm quí hiếm nên số lượng cá thể giảm sút nhanh chóng, hiện đang nằm trong 250 loài quí hiếm đang có nguy cơ tuyệt chủng do bị khai thác quá mức và buôn bán bất hợp pháp, hiện Sâm Ngọc Linh đã được đưa vào sách đỏ Việt Nam cần được bảo vệ. Để bảo vệ và phát triển cây dược liệu quí hiếm, hiện đã có những dự án để duy trì và bảo tồn giống tại hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum: Năm 1979: Uỷ Ban Nhân Dân Tỉnh Quảng Nam đã cho thành lập Trại dược liệu Trà Linh. Bằng cách nhân giống hữu tính và vô tính, Trại dược liệu đã có 223.000 cây con. Trại đã xây dựng quy trình trồng cây Sâm Ngọc Linh và phổ biến cho nhân dân trong vùng thực hiện. Năm 1995: Sở Khoa học, Công nghệ và Môi trường tỉnh Quảng Nam đã đầu tư nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật nhằm bảo vệ và phát triển cây Sâm Ngọc Linh. Nhằm hình thành vùng nguyên liệu Sâm Ngọc Linh và đưa cây Sâm trở thành loại cây trồng mang lại nguồn thu nhập ổn định cho người dân trong vùng dự án, Sở đã chủ trì thực hiện dự án “Ứng dụng kỹ thuật tiến bộ xây dựng mô hình phát triển vùng nguyên liệu sâm khu Năm tại xã Trà Linh”. Năm 2003: Viện Dược liệu Hà Nội phối hợp với Sở Khoa Học Công Nghệ và Môi Trường Kon Tum thực hiện dự án vùng trồng cây Sâm Ngọc Linh. Cây Sâm đã được nhân giống trong năm 2003 và trồng tập trung ở xã Ngọc Lay, huyện Đắk Tô. Năng suất hàng năm ước tính khoảng 50.000 cây. Mục đích của dự án là quy hoạch vùng có điều kiện thích hợp cho cây sâm Ngọc Linh phát triển và tìm ra phương pháp canh tác thích hợp nhất nhằm bảo tồn loài cây đặc hữu của vùng và giúp xóa đói giảm nghèo ở Kon Tum. Sâm Ngọc Linh là một dược liệu quý và có giá trị kinh tế cao, cần thiết ứng dụng những kỹ thuật mới trong sản xuất để nâng cao giá trị thương mại, xây dựng thương hiệu sâm Ngọc Linh trên thị trường thế giới. Trong đó bước đầu tiên là hiện đại hóa việc canh tác. Trong nhiều biện pháp, nuôi cấy mô là một kỹ thuật tiên tiến có thể ứng dụng tốt cho sản xuất sản phẩm Sâm Ngọc Linh. 2.2.5. Thành phần hóa học 2.2.5.1. Hợp chất saponin: Tên gọi saponin hay saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật. Hợp chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu của cây Sâm Việt Nam cũng như của các loài Sâm khác trên thế giới. Các saponin dammaran được xem là hoạt chất quyết định cho các tác dụng sinh học. Phần dưới mặt đất (thân rễ và rễ củ) chứa 49 hợp chất saponin, gồm 25 saponin đã biết và 24 saponin có cấu trúc mới được đặt tên là vina-ginsenosid-R1-R24. Phần trên mặt đất có 19 saponin damaran đã được phân lập, gồm 11 saponin đã biết và 8 saponin có cấu trúc mới đặt tên là vinaginsenosid-L1-L8. Bảng 2.3: Hàm lượng một số saponin chính trong sâm ( Đã trừ độ ẩm): Nguyên liệu Hàm lượng saponin chính (%) G-Rb1 GRd G-Ry1 R2 Tổng cộng Đầu mầm 0.943 0.898 1.359 2.859 6.059 Sâm 2 tuổi 0.979 0.426 1.235 1.868 4.236 Sâm 3 tuổi 0.846 0.678 1.419 2.409 5.352._.