Chọn môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng Vi khuẩn lactic

của Phòng Thí Nghiệm cùng các cán bộ đã tạo điều kiện để em hoàn thành tốt luận văn này. Hà Nội, ngày 30 tháng 5 năm 2008 Sinh viên Trương Thị Thanh Lê Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 2 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................... 1 MỤC LỤC..................................................................................................... 2 KÍ HIỆU VIẾT TẮT ..................................................................................... 4 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, ĐỒ THỊ.................................................. 5 LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................... 6 PHẦN I : TỔNG QUAN............................................................................... 7 I.1. Vi khuẩn lactic .................................................................................. 7 I.1.1. Lịch sử nghiên cứu về vi khuẩn lactic (LAB): ........................ 7 I.1.2. Úng dụng của vi khuẩn lactic ................................................... 8 I.1.3. Phân loại vi khuẩn lactic ......................................................... 10 I.1.4. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic.... 11 I.1.5. Hoạt động chuyển hóa của vi khuẩn lactic ........................... 11 I.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo sinh khối của vi khuẩn lactic ........................................................................................................ 15 I.2.1 Quá trình tạo sinh khối ............................................................ 15 I.2.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic...................................................... 17 I.2.2.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống........................................ 17 I.2.2.2. Ảnh hưởng của pH ........................................................... 17 I.2.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ................................................... 18 I.2.2.4. Ảnh hưởng của Oxy.......................................................... 18 I.2.2. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng lên khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic...................................................... 19 I.2.2.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon ......................................... 19 I.2.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ .............................................. 20 I.2.2.3. Ảnh hưởng của các muối vô cơ và chất kích thích sinh trưởng. ............................................................................................ 22 PHẦN II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................................................................... 24 II.1 Nguyên vật liệu – hóa chất- thiết bị nghiên cứu.......................... 24 II.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................ 24 II.1.2. Hóa chất ...................................................................................... 24 II.1.3. Thiết bị ........................................................................................ 25 II.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................. 25 II.2.1. Chuẩn bị môi trường ............................................................. 25 II.2.2. Phương pháp vi sinh .............................................................. 25 II.2.3. Phương pháp hóa lý ............................................................... 27 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 32 III.1. Kiểm tra các đặc tính của chủng VKL phân lập từ nem chua. ................................................................................................................. 32 Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 3 III.1.1. Đặc điểm hình thái: .............................................................. 32 III.1.2. Kiểm tra khả năng sinh khí của chủng .............................. 32 III.2. Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng tới quá trình tạo sinh khối của chủng VKL phân lập từ nem chua....................................... 33 III.2.1. Lựa chọn các điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi cấy chủng VKL phân lập từ nem chua. ................................................. 34 III.2.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ................................................ 34 III.2.1.2. Ảnh hưởng của độ thông khí ........................................ 36 III.2.1.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống .................................... 37 III.2.2. Lựa chọn nguồn dinh dưỡng thích hợp cho quá trình phát triển của chủng VKL phân lập từ nem chua .................................. 39 III.2.2.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon...................................... 39 III.2.2.1. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ .......................................... 40 III.2.3: Động học của quá trình sinh trưởng và phát triển của VKL phân lập từ nem chua.............................................................. 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 47 Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 4 KÍ HIỆU VIẾT TẮT 1. HSTSK: Hiệu suất tạo sinh khối. 2. HSLM: Hiệu suất lên men. 3. DTPNM: Dịch thuỷ phân nấm men. 4. VTM: Vitamin. 5. VLK: Vi khuẩn lactic. 6. HLA: Hàm lượng axit. Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 5 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, ĐỒ THỊ Bảng 1.1: Một số các sản phẩm lên men từ vi sinh vật lactic.[5] .............. 8 Hình 1.1: Sơ đồ quá trình lên men glucoza của vi khuẩn lactic [4]........ 13 Bảng 1.2: Nhu cầu axit amin của một số loài vi khuẩn lactic................. 21 Bảng 2.1. Thiết bị ..................................................................................... 25 Hình 3.1: Hình dáng khuẩn lạc...……………………………………….32 Hình 3.2: Hình ảnh nhuộm Gram ........................................................... 32 Bảng 3.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển của vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua ............................................................................... 34 Đồ thị 3.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ theo thời gian củavi khuẩn lactic phân lập từ nem chua ................................................................................ 35 Đồ thị 3.2: Ảnh hưởng của độ thông khí .................................................. 36 Đồ thị 3.3: Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giốngtheo thời gian nuôi cấy ........ 37 Đồ thị 3.4: Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống............................................... 38 Bảng 3.2: Lựa chọn hàm lượng đường Saccaroza thích hợp đến quá trình sinh trưởng và phát triển của VKL phân lập từ nem chua............. 39 Bảng 3.3: Các axit amin trong dịch nấm men thủy phân [4] .................. 40 Đồ thị 3.5: Ảnh hưởng của DTPNM......................................................... 42 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của DTPNM .......................................................... 43 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của 50% DTPNM và hàm lượng Saccaroza đến sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua............................................................................................................. 44 Đồ thị 3.8: Động học quá trình tạo sinh khối của vi khuẩn lacticphân lập từ nem chua khi thay thế môi trường mới. ............................................... 45 Bảng 3.6: Các chỉ tiêu đạt được ở môi trường thay thế ........................... 46 Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 6 LỜI MỞ ĐẦU Từ xa xưa việc lên men đã được biết đến nhưng chủ yếu sử dụng vào các sản phẩm có tính chất truyền thống và đặc trưng cho từng vùng miền. Khi nên khoa học kỹ thuật phát triển đã nghiên cứu và khám phá ra nhiều điều thú vị từ việc sử dụng vi khuẩn lactic trong quá trình lên men. Ở các nước trên thế giới nói chung và việt Nam nói chung quá trình lên men lactic trong các sản phẩm truyền thống thông thường là quá trình lên men tự nhiên, nó phụ thuộc rất nhiều vào yếu tố như điều kiên thời tiết, phụ thuộc vào nguyên liệu…Điển hình như sản phẩm nem chua của Việt Nam, là quá trình lên men thuần tuý là lên men tự nhiên, nguyên liệu làm nem chua là nguyên liệu giàu protein, vì vậy sự nhiểm tạp là không tránh khỏi. Vấn đề đặt ra là phải tạo chủng khởi động nhằm rút ngắn thời gian lên men nhưng vẫn phải giữ được tính đặc trưng của sản phẩm. Chủng 88 là chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua (đang tiến hành định tên) là chủng có nhiều đặc tính ưu việt đó là một chủng tạo axit tốt và có khả năng kháng khuẩn cao nên chúng tôi chọn chủng này để nuôi cấy thu hồi sinh khối, tạo chế phẩm lactic. Môi trường MRS là môi trường thích hợp cho chủng vi khuẩn lactic sinh trưởng và phát triển, song để sử dụng môi trường này làm môi trường nuôi cấy tạo sinh khối sẽ không kinh tế bởi hoá chất để pha môi trường đặc biệt là các thành phần như pepton,cao men, cao thịt thường phải nhập ngoại và có giá thành cao, nếu đưa vào sản xuất thu hồi sinh khối sẽ không hiệu quả kinh tế. vì thế việc nghiên cứu tạo ra được chế phẩm có chất lượng tốt trong điều kiện của Việt Nam là vô cùng quan trọng và cần thiết. Với mục đích đó chúng tôi tiến hành các thí nghiệm để tìm ra điều kiện và môi trường nuôi cấy nhằm giảm gia thành sản phẩm và sản xuất ở quy mô lớn. Môi trường thay thế phải đảm bảo đâỳ đủ các chất dinh dưỡng cho chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua sinh truởng và phát triển tốt. Xuất phát từ ý nghĩa thực tế như vậy chúng tôi tiên hành các nghiên cứu như sau: + Nghiên cứu chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua. + nghiên cứu chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn lactic phâ Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 7 PHẦN I : TỔNG QUAN I.1. Vi khuẩn lactic I.1.1. Lịch sử nghiên cứu về vi khuẩn lactic (LAB): Từ thế kỷ 20 thuật ngữ vi khuẩn lactic được sử dụng để chỉ những vi khuẩn làm chua sữa. Năm 1873 J.Lister lần đầu tiên đã phân lập đươc một loại vi khuẩn đặt tên là “Bacterium lactis” (hay có thể gọi là Lactococcus Lactis). Khi nghiên cứu về việc phân loại vi khuẩn lactic người ta đã tìm thấy những nét tương tự giữa vi khuẩn lactic trong sữa và các vi khuẩn trong các sản phẩm chứa axit lactic khác như thịt, rượu vang, và các loại vi khuẩn lactic có ích trong đường ruột [16] . Trong các định nghĩa trước đây thì vi khuẩn lactic được coi là nhóm vi khuẩn có khả năng lên men và đông tụ sữa, bao gồm cả vi khuẩn đường ruột và vi khuẩn lactic. Năm 1901, Beijernick đã miêu tả sinh vật có tên lactobacillus là dạng vi khuẩn G(+) và phân biệt hẳn vi khuẩn đường ruột với vi khuẩn lactic. Chúng là một trong những vi khuẩn lactic hữu ích nhất, hầu hết được tìm thấy trong bộ máy tiêu hoá. Bước vào thế kỉ 20 sự quan tâm về Lactobacillus xuất hiện trong thực đơn con người tăng lên khi Elie Metchnikoff ở viện Pasteur Paris phát triển và ứng dụng loại vi khuẩn này để bổ sung vào khẩu phần ăn nhằm ngăn ngừa và chữa bệnh. Nhưng lý thuyết của ông về việc kéo dài sự sống và sự khoẻ mạnh nhờ vào việc ăn dạng thực phẩm chứa vi khuẩn này đã gây tai tiếng cho ông. Bởi tác dụng của các sản phẩm này không được như mong muốn người tiêu dùng và hiển nhiên chưa đủ cơ sở khoa học để chứng minh sự ưu việt của nó. Từ đó tới nay đã có rất nhiều nghiên cứu về vi khuẩn lactic nhờ vào những kĩ thuật hiện đại con người đã miêu tả đầy đủ hơn về hình dáng, cấu tạo, đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn lactic. Trong đó kỹ thuật di truyền trở thành một công cụ phân loại vô cùng quan trọng với việc xác định hàm lượng phần trăm mol C+G chứa trong DNA hay phương pháp điện di để xác định các gen [4,8]. Ngoài ra, do có khả năng sinh ra các bacterioxin nên ngoài tác dụng bảo quản thực phẩm người ta còn dùng để sản xuất các loại kháng sinh tổng hợp dùng trong y học chẳng hạn như nisin đã từng được biết đến từ rất lâu, loại này có thể Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 8 được sinh ra từ các chủng của L.lactis, hay các pediococin được sinh ra từ giống Pediococcus spp. [6,11,21]. Dựa vào các thành tựu khoa học hiện đại, người ta đã phân lập và sản xuất được các chế phẩm sinh học từ vi khuẩn lactic để bổ sung vào khẩu phần ăn của người già, em bé và người bệnh nhằm cung cấp vi khuẩn lactic cho hệ vi khuẩn đường ruột để kích thích và điều tiết quá trình tiêu hóa, tiêu diệt các vi sinh vật nhiễm trùng, chữa bệnh đầy hơi và rối loạn tiêu hóa. Và cho tới nay, axit lactic vẫn là sản phẩm số một của vi khuẩn lactic. Axit lactic là nguyên liệu cần thiết cho công nghệ thuộc da, dệt, công nghệ tổng hợp chất dẻo và công nghệ thực phẩm [14] I.1.2. Úng dụng của vi khuẩn lactic Việc ứng dụng vi khuẩn lactic đã có từ xa xưa và càng về sau khi tìm ra được cơ sở khoa học của các quá trình sinh lý sinh hoá diễn ra thì việc ứng dụng càng rộng hơn và kiểm soát được quá trình nhiểm tạp đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm. Các thực phẩm lên men sử dụng các tác nhân là các vi khuẩn có ở tất cả các nước trên thế giới, phải kể đến là các sản phẩm lên men như sữa chua, rau cải muối chua, các sản phẩm thịt lên men….các sản phẩm hầu như sử dụng hệ vi sinh vật có sẵn trong nguyên liệu, song nếu sử dụng hệ vi sinh vật có sẵn này bên cạnh các ưu điểm nổi trội vẫn có một số các hạn chế như quá trình lên men sẽ kéo dài hơn và sẽ gây ra sự nhiễm tạp trong quá trình lên men. Vì thế nhờ sự tiến bộ của các ngành khoa học kỹ thuật đã nghiên cứu và sản xuất ra các loại chế phẩm bổ sung vào trong các quá trình lên men nhằm rút ngắn thời gian lên men hạn chế các sự nhiễm các loài vi sinh vật có hại khác Bảng 1.1: Một số các sản phẩm lên men từ vi sinh vật lactic.[5] Sản phẩm Nước Loại vi khuẩn Nguyên liệu Bánh mì Toàn thế giới Saccharomyces cerevisiae, các nấm men khác, vi khuẩn lactic Lúa mì, lúa mạch đen, một số loại hạt khác Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 9 Gari Tây phi Corynebacterium manihot, các nấm men, vi khuẩn lactic(Lb.plantarum, Streptococus spp.) Củ sắn Idli Nam Ấn Độ Vi khuẩn lactic Gạo, đậu đen Kim chi Hàn Quốc Vi khuẩn lactic Bắp cải, rau, đôi khi là hải sản, quả có hột Mahewu Nam Phi Vi khuẩn lactic, Cephalosporium, Fusarium, Aspergillus Ngô Ogi Nigeria, Tây Phi Penicillium spp., Saccharomyces cereviae, Candida mycoderma, C.valida, hoặc C.vini Ngô Xì dầu Phương Đông Aspergillus oryzae hoặc A.soyae,Lactobacillus Đậu tương, lúa mì Nan Ấn Độ Saccharomyces cereviae,Vi khuẩn lactic Bột mì trắng Phomat Toàn thế giới Vi khuẩn lactic (L.lactic, S.thermophilus, Lb. shermanii, Lb.bulgaricus, nấm mốc (Pencillium spp.) Sữa Sữa chua Toàn thế giới S.thermophilus, Lb. bulgaricus Sữa, sữa đặc Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 10 Xúc xích lên men Nam và Trung Âu, Mỹ Vi khuẩn lactic ( lactobacilli, pediococci), S. arnosus, S.xylosus, M. varians, nấm men và nấm mốc Thịt của động vật có vú, thường là thịt lợn và thịt bò, ít thịt gia cầm Dưa muối chua Toàn thế giới Vi khuẩn lactic( Ln. mesenterroides, Lb. brevis, Lb.platarum, Lb.curvatus, Lb.sake Các dạng rau cải Quả muối chua Toàn thế giới P. cerevisiae, Lb. plantarum Dưa muối Ôliu Địa Trung Hải Ln.mesenteroides, Lb. plantarum Ôliu xanh I.1.3. Phân loại vi khuẩn lactic Có rất nhiều cách phân loại vi khuẩn lactic. Dựa vào những tính chất cơ bản của chúng mà người ta có thể phân loại theo: hình thái học, kiểu lên men, khả năng phát triển ở các nhiệt độ khác nhau, khả năng chịu muối, chịu axit hay chịu kiềm… Năm 1919, Orla – Jensen là người tiên phong trong việc nghiên cứu, phân loại có hệ thống các vi khuẩn lactic. Về hình dáng ông phân chúng thành bốn giống: Lactobacillus; Pediococus; Streptococus và lactococus; Leuconostoc. Ngày nay người ta bổ sung thêm một giống nữa là Bifidobacterium có hình dạng biến đổi [17, 23]. - Lactobacillus: Trực khuẩn, có thể xếp đôi, chuỗi hoặc đứng riêng lẻ. Nhiệt độ tối ưu là 300C - 450C. Lên men được galactoza, glucoza, sacaroza, fructoza... Bao gồm ba nhóm có ba loài đặc trưng: L.bulgaricus, L. brevis, L. casei. -Leuconostoc: Cầu khuẩn, có hình ovan hoặc hình trứng. Lên men đường dextran, trioza, sản phẩm tạo thành là axit D- lactic, etanol, CO2. Có hai loài đặc trưng là L.mensenteroides và L. lactic. Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 11 -Pediococus: Cầu khuẩn, tồn tại dưới dạng bát cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn. Lên men đường glucoza theo con đường EMP, axit lactic tạo thành có dạng DL, D(-) hay D(+). Có ba loài đặc trưng là P.acidilactici, P.dextranicum, P. halophilus. -Streptococus và Lactococus: Dạng cầu khuẩn, xếp đôi hoặc chuỗi. Có khả năng lên men đường hexoza thành axit lactic và các loại đường khác. Có ba loài đặc trưng được sử dụng trong sữa: S. lactis, S.cremoris, S.thermophilus. -Bifidobacterium: Lên men dị hình, có hình dạng biến đổi, đôi khi có hình ovan, có lúc lại hình que. Có khả năng lên men lactoza sản phẩm tạo thành là axit lactic và axit axetic. I.1.4. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic Các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriacae. Chúng không đồng nhất về mặt hình thái,các giống vi khuẩn khác nhau có hình dạng và kích thước khác nhau. Ngoài ra hình dạng và kích thước tế bào vi khuẩn lactic còn phụ thuộc vào môi trường, điều kiện nuôi cấy, sự có mặt của oxy và tuổi tế bào [8]. Tuy nhiên về mặt sinh lý chúng lại tương đối đồng nhất. Chúng đều là các vi khuẩn Gram(+), không tạo bào tử, không di động, thu năng lượng nhờ phân giải hydratcacbon và tiết ra axit lactic. Chúng không chứa các riboxom và enzym catalaza nên không phân giải trực tiếp peroxit thành nước và oxy. Một đặc điểm quan trọng của các vi khuẩn lactic là có nhu cầu về chất dinh dưỡng rất phức tạp. Không một đại diện nào của nhóm này có thể phát triển trên môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucoza và NH4+. Mặc dù đường cung cấp nguồn năng lượng cần thiết cho sự chuyển hóa vi khuẩn lactic vẫn đòi hỏi các nhân tố phát triển khác như phôtphat, lưu huỳnh, vitamin, axit amin, lipit, những chất này phải có trong môi trường lên men [9]. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn latic khác nhau thì khác nhau, đặc biệt là nhu cầu về vitamin và nitơ. Lấy ví dụ Lactobacillus được coi là nhóm vi khuẩn có đòi hỏi về dinh dưỡng cao nhất. Chúng đòi hỏi không chỉ các cở chất phức tạp chứa cacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu rất lớn về các yếu tố cần cho sự phát triển như vitamin, muối vô cơ [18]. I.1.5. Hoạt động chuyển hóa của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic sử dụng được rất nhiều nguồn đường, thường có khả năng phân giải protein và lipit yếu, đòi hỏi nguồn axit amin sẵn có để sinh trưởng. Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 12 a) Chuyển hóa đường • Đường hexoza ( glucoza) Tất cả các vi khuẩn lactic đều sản sinh ra axit lactic từ hexoza và chúng thiếu chức năng để liên kết với electron vận chuyển của mạch và chu trình Krebs, nên chúng thu năng lượng thông qua cơ chất ở dạng photphoryl hóa. Axit lactic được sinh ra có thể ở dạng L (+), ít khi ở dạng D(-), hoặc có thể ở dạng hỗn hợp. Dạng axit lactic D(-) không được chuyển hóa bởi cơ thể người và không thấy có khuyến cáo đối với trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ. Con đường hexoza chuyển hóa đã phân chia vi khuẩn lactic thành 2 nhóm: lên men đồng hình và lên men dị hình. Ta thấy các dạng lên men đồng hình như Pediococus, Streptococus và một số Lactobacillus sinh axit lactic là thành phẩm chính và duy nhất của việc lên men glucoza. Tuy nhiên đưới điều kiện sinh trưởng thay đổi và khi cơ chất ban đầu là pentoza thì có thể thay đổi. Các chủng lên men đồng hình sử dụng con đường Embden-Meyergof-Parnas để sinh ra 2 mol lactate trên 1 mol glucoza và nhận được xấp xỉ gấp 2 lần năng lượng trên một mol glucoza so với các chủng lên men dị hình. Các chủng lên men dị hình sinh ra một lượng cân bằng giữa lactate, CO2, và etanol từ 1 mol glucoza theo con đường monophotphat hoặc pentoza. Lactobacillus fermentum chuyển hóa đường theo con đường 6- photphogluconat hoặc photphoketolaza (6-PG/PK) Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 13 Glucoza Lên men đồng hình Lên men dị hình Glucoza-6-P Glucoza-6-P Fructoza-6-P 6-photphogluconat CO2 Fructoza-1,6-DP Ribuloza-5-P Xyluloza-5-P Glyxerandehit-3-P Ù Dihydroxyaxeton-P Glyxerandehit-3-P Axetyl-P H2O 2 Pyruvat Pyruvat Axetaldehit 2 Lactat Lactat Etanol Hình 1.1: Sơ đồ quá trình lên men glucoza của vi khuẩn lactic [4] Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 14 Lên men lactic là một trong những quá trình sinh hoá phổ biến trong thiên nhiên, đó là quá trình chuyển hoá Gluxit thành axit lactic nhờ hoạt động sống trực tiếp của hệ vi sinh vật lactic. Trong thiên nhiên vi khuẩn lactic tồn tại dưới 2 dạng: Nhóm vi khuẩn lactic lên men đồng hình có khả năng phân huỷ đường đơn giản tạo thành axit lactic C6H12O6 CH3CHOHCOOH + 22,5 KCal Do hệ Enzim trong những vi sinh vật khác nhau thường khác nhau nên cơ chế hoá học của quá trình lên men lactic của các giống vi sinh vật thường không giống nhau. Ở vi sinh vật lactic lên men đồng hình sự chuyển hoá đường thành axit lactic đi theo con đường lên men rượu đến giai đoạn tạo thành axit pyruvic, axit này được khử 2 nguyên tử Hidro nhờ hoạt động của Enzim lacticodehydrogenase để trở thành axit lactic Nhóm vi khuẩn lactic lên men dị hình tạo ra quá trình lên men phức tạp hơn, chúng tạo nên trong môi trường ngoài axit lactic còn có các sản phẩm phụ như axit acetic, rượ etylic, CO2, H2 và một số chất thơm như diacetyl este C6H12O6 CH3CHOHCOOH + COOHCH2CH2COOH + CH3COOH + CH3CH2COOH +CO2 + H2 Số lượng sản phẩm phụ này hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh. Nói chung axit lactic thường chiếm 40% lượng đường đá phân huỷ, axit succinic gần 20%. Đôi khi lượng khí ít hơn và thường thay vào đó là lương axit fomic. Lên men lactic thì cần có sự lên men đồng thời của vi khuẩn lactic đồng hình và dị hình. Vì quá trình lên men lactic dị hình ngoài việc tạo thành axit lactic còn tạo ra các sản phẩm phụ như axit và rượu tạo nên este tạo nên mùi thơm đặc trưng cho sản phẩm [6]. • Đường disacarit Con đường chuyển hóa disacarit dựa vào các enzym hydrolase phân cắt mạch thành các monosacarit. Trong đó có chuyển hóa disacarit lactoza, lactoza có thể đi vào bên trong tế bào nhờ các chất mang lactoza và các lacto-pecmeaza để phân cắt lactoza thành glucoza và galactoza, hoặc theo con đường photphoenopyruvat photphotransferaza (PTS) bằng cách phân cắt thành glucoza và galactoza-6-photphat. Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 15 Chuyển hóa disacarit sacaroza, sacaroza có thể đi vào bên trong tế bào nhờ enzym sacaroza hydrolaza phân cắt sacaroza thành glucoza và fructoza theo nhiều con đường khác nhau. Như các giống lactococus chuyển hóa đường sacaroza theo con đường PTS và sacaroza-6-photphat hydrolaza, nó tách sacaroza-6-photphat thành glucoza-6-photphat và fructoza. Sacaroza-6-photphat hydrolaza và sacaroza PTS tăng lên khi trong môi trường có nhiều sacaroza. Sacaroza cũng có thể hoạt động như một chất cho monosacarit trong quá trình tạo ra exopolysacarit – làm tăng độ kết dính và cấu trúc của các sản phẩm sữa lên men - của vi khuẩn lactic [16, 22]. b) Chuyển hóa Protein Vi khuẩn lactic có nhu cầu rất lớn về các loại axit amin để phát triển, mà khả năng tổng hợp axit amin từ nguồn nitơ vô cơ của các vi khuẩn lactic là có giới hạn. Hoạt động thủy phân protein được nhắc đến khi trong môi trường không đủ axit amin cung cấp cho sự sinh trưởng và phát triển, ví dụ trong sữa chỉ có khoảng 10mg/100ml, vì vậy vi khuẩn lactic có thể thủy phân casein ở pH và nhiệt độ tối ưu để tạo các axit amin, di hoặc tri – peptit nhờ các enzym proteaza và peptidaza nằm trong tế bào chất, trên màng và thành tế bào. Trong một số trường hợp các proteaza ở thành tế bào không tổng hợp được do thiếu đoạn plasmit mã hóa thì lập tức các peptidaza ở màng tế bào và tế bào chất sẽ thực hiện quá trình thủy phân các peptit thành các axit amin tương ứng sau khi các oligopeptit đủ nhỏ để được vận chuyển vào trong màng nguyên sinh chất, vì chỉ có các phân tử thấp mới có khả năng xâm nhập vào tế bào qua màng nguyên sinh chất [8, 22]. Nhờ các loại enzim khác nhau mà vi khuẩn lactic có thể tham gia biến đổi tính chất một số sản phẩm thực phẩm trong quá trình sản xuất. I.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo sinh khối của vi khuẩn lactic I.2.1 Quá trình tạo sinh khối Quá trình tạo sinh khối của vi khuẩn được chia thành 4 giai đoạn sau: Pha tiềm phát, pha phát triển logarit, pha cân bằng và pha suy vong [1] - Pha thích nghi : Pha này được tính từ khi bắt đầu cấy đên khi tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn bắt đầu phát triển mạnh. Trong thời gian này vi khuẩn dần dần làm quen với môi trường và thích nghi với môi trường. ở giai đoạn này vi Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 16 khuẩn chưa sinh sản hoặc mới bắt đầu với tốc độ chậm. Thời gian của pha này phụ thuộc vào sự thích nghi của vi khuẩn đối với môi trường. - Pha phát triển logarit : Pha này là pha tăng trưởng mạnh nhất. Tế bào sinh trương với tốc độ nhanh nhất và sự tạo thành sinh khối được minh hoạ theo hàm số mũ. Tế bào ở pha này trẻ về sinh lý, có hoạt tính sinh học cao. Tế bào sinh ra nhanh , lượng cơ chất giảm mạnh và tỷ lệ nghịch với lượng tế bào sinh ra.Số lượng tế bào tăng theo phương trình: N= No.2n Trong đó: - No=Số tế bào ban đầu - N: tổng số tế bào -n: Số lần tế bào phân chia - Pha cân bằng : Việc chuyển từ pha logarit sang pha ổn định diễn ra dần dần. trong pha cân bằng, quần thế vi khuẩn ở trạng thái cân bằng động học, pha này thì lượng tế bào sinh ra bằng lượng tế bào chết đi,sinh khối sinh ra không tăng lên và cũng không giảm.Vì vậy khi nồng độ cơ chất giảm thì tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn cũng giảm. Nguyên nhân tồn tại pha này là do sự tích luỹ các sản phẩm độc của quá trình trao đổi chất (như các loại rượu, axit hữu cơ) và việc cạn dần các chất dinh dưỡng. Lượng sinh khối đạt được trong pha ổn định gọi là hiệu suất hoặc sản lượng. Sản lượng phụ thuộc vào tính chất và số lượng các chất dinh dưỡng sử dụng vào điều kiện nuôi cấy. Đó là sự sai khác giữa số lượng vi khuẩn cực đại và khối lượng vi khuẩn ban đầu. - Pha suy vong : Trong pha này lượng tế bào ngày càng già và chết đi, sự cân bằng bị phá vỡ, ngoài sự biến đổi về số lượng tế bào còn có sự biến đổi về kích thước. Từ việc đánh giá được sự phát triển của các pha, người ta có thể vẽ được đường cong sinh trưởng của vi khuẩn. nhìn vào đường cong sinh trưởng của vi khuẩn ta có thể thấy rõ vi khuẩn phát triển mạnh nhất ở giai đoạn nào và thời điểm nào là thu được số lượng sinh khối lớn nhất. Thời gian sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy ( như các chất dinh dưỡng cần thiết) và các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH, điều kiện thông khí, thời gian nuôi cấy… Luận văn tốt nghiệp Chọn MT và ĐK nuôi cấy thích hợp cho chủng VLK Trường ĐHBK Hà Nội Trương Thị Thanh Lê-CNCSPLM-K48 17 Vấn đề đặt ra ở đây đó là nên thu sinh khối ở giai đoạn nào là tốt nhất và chất lượng nhất, bởi chọn thời điểm lấy sinh khối nhằm tạo điều kiện cho quá trình sấy sau này. Nếu thu hồi sinh khối ở pha cân bằng thì sẽ có nhiều tế bào già và chết vì thế việc chịu đựng của việc xử lý sau này sẽ khó khăn. Theo một số tài liệu nghiên cứu thì sinh khối nên được lấy ra ở thời điểm đầu pha cân bằng là tốt nhất. I.2.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic I.2.2.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống Tỷ lệ tiếp giống có ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển của vi khuẩn. Nếu tỷ lệ tiếp giống quá thấp sẽ kéo dài thời gian nuôi cấy, dễ nhiễm tạp, hiệu suất thu hồi sinh khối thấp. Nếu tỷ lệ tiếp giống quá cao, mặc dù thời gian nuôi cấy rút ngắn nhưng hàm lượng sinh khối không cao do vi khuẩn phát triển nhanh quá làm nguồn thức ăn chóng cạn kiệt, và chúng sinh ra một số sản phẩm gây ức chế quá trình sinh trưởng. Vì vậy chọn tỷ lệ tiếp giống thích hợp sẽ tiết kiệm canh trường giống, đảm bảo quá trình lên men hiệu quả, rút ngắn thời gian lên men. I.2.2.2. Ảnh hưởng của pH Sống trong môi trường lỏng, vi khuẩn chịu tác động của ion H+ và OH- trực tiếp hoặc gián tiếp đến sự trao đổi chất và phát triển của vi khuẩn. Nếu pH không thích hợp, vi khuẩn lactic có thể bị ức ._.