Chọn giống vi khuẩn và khảo sát một số điều kiện lên men acetic để làm giấm trái cây

BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM TP.HCM NGUYEÃN TRÖÔNG BAÛO TRAÂN CHOÏN GIOÁNG VI KHUAÅN VAØ KHAÛO SAÙT MOÄT SOÁ ÑIEÀU KIEÄN LEÂN MEN ACETIC ÑEÅ LAØM GIAÁM TRAÙI CAÂY Chuyeân ngaønh : Vi sinh vaät hoïc Maõ Soá : 60 42 40 LUAÄN VAÊN THAÏC SÓ SINH HOÏC NGÖÔØI HÖÔÙNG DAÃN KHOA HOÏC: TS. TRÒNH THÒ HOÀNG Thaønh phoá Hoà Chí Minh – 2007 LÔØI CAÛM ÔN Em xin chaân thaønh caûm ôn COÂ- TIEÁN SÓ TRÒNH THÒ HOÀNG- ñaõ taïo ñieàu kieän vaø taän tình chæ baûo ñeå em hoaøn thaønh luaän vaên naøy. Em voâ cuøng caûm ôn CAÙC THAÀY COÂ KHOA SINH HOÏC TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM ñaõ truyeàn nhöõng kieán thöùc quyù baùu trong suoát quaù trình em hoïc taïi tröôøng. Em xin chaân thaønh caûm ôn CAÙC THAÀY COÂ VAØ CAÙC BAÏN PHOØNG THÍ NGHIEÄM BOÄ MOÂN VI SINH TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC KHOA HOÏC TÖÏ NHIEÂN ñaõ giuùp ñôõ vaø taïo ñieàu kieän toát cho em trong suoát thôøi gian em thöïc hieän ñeà taøi. Toâi xin caûm ôn CAÙC BAÏN HOÏC VIEÂN CAO HOÏC KHOAÙ 15 cuøng ÑOÀNG NGHIEÄP BAÏN BEØ ñaõ ôû beân caïnh giuùp toâi hoaøn thaønh luaän vaên naøy. Con voâ cuøng bieát ôn BA MEÏ vaø MOÏI NGÖÔØI TRONG GIA ÑÌNH maõi maõi laø choã döïa vöõng chaéc vaø aám aùp cho con. MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Trong các loại thực phẩm lên men thì giấm ăn là loại gia vị, thực phẩm phổ biến và phần lớn các gia đình Việt Nam đều sử dụng. Giấm sử dụng trong che biến thực phẩm hàng ngày, bảo quản thực phẩm, làm gia vị chế biến thực phẩm. Ngoài ra, giấm được dùng như bài thuốc chữa nấc cục, buồn nôn, tàn nhang, lở loét, các vết cắn của chó, bò cạp, rết hay côn trùng. Ở Việt Nam, quá trình “lên men” acetic rất quen thuộc với nhân dân thông qua việc nuôi giấm trong gia đình. Giấm được tạo ra bằng phương pháp lên men dân gian từ các nguyên liệu như chuối, dứa, nước dừa, rượu ngũ cốc, rượu trái cây. Nước ta có rất nhiều loại trái cây, có thể sử dụng các loại trái cây này để làm giấm. Do đó, đề tài “Chọn giống vi khuẩn và khảo sát một số điều kiện lên men acetic để làm giấm trái cây” rất có ý nghĩa đối với sản xuất và đời sống. 2. Mục đích của đề tài nghiên cứu  Tìm điều kien để vi khuẩn sinh acetic acid sinh trưởng mạnh.  Tìm biện pháp tối ưu để tăng hiệu suất lên men acetic trong thời gian ngắn, tạo ra những sản phẩm giấm trái cây thơm ngon và có giá trị dinh dưỡng cao. 3. Phương pháp nghiên cứu  Phương pháp nghiên cứu tài liệu nhằm xây dựng tổng luận nghiên cứu: Thu thập tài liệu, nghiên cứu, phân tích, tổng hợp những tài liệu về những nội dung có liên quan đến đề tài.  Phương pháp thực nghiệm, chứng minh. Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Các loại giấm thông dụng và một số vấn đề về giấm trái cây 1.1.1. Sơ lược lịch sử lên men acetic. [12], [31], [32] Từ đầu thế kỷ XIV ở Pháp đã có những cơ sở công nghiệp sản xuất giấm. Đến năm 1786 người ta đã bắt đầu để ý đến vai trò cua oxy và nhấn mạnh độ thoáng khí ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ tạo thành giấm . Năm 1822 Person đã chú ý đến 1 lớp màng mỏng phát triển trên bề mặt giấm và ông đặt tên Mycoderma (là 1 loài vi khuẩn hiếu khí ). Từ năm 1837 đến 1838 Turpin và Kiizing đã nhấn mạnh quá trình lên men acetic là do vi sinh vật và đặt tên vi sinh vật đó là Ulviva acetic. Năm 1862 đến 1868, nhà bác học người Pháp Louis Pasteur khám phá ra được bản chất của quá trình lên men này. Ông miêu tả được vi khuẩn sinh acid acetic hiện diện trong màng mỏng của giấm, và chứng minh được quá trình lên men giấm thực chất là quá trình chuyển hóa rượu thành acid acetic trong điều kiện có oxy và ông đặt tên vi khuẩn này là Mycoderma aceti. Năm 1901 M.W Bejerinck phân lập thuần khiết được vi khuẩn lên men acetic và gọi là vi khuẩn Acetobacter. Ngày nay ứng dụng của quá trình lên men acetic, người ta đã sản xuất nhiều loại giấm khác nhau, thường là giấm ăn chứa khoảng 3% acid acetic. 1.1.2. Các loại giấm thông dụng [28], [42]. - Giấm cồn “Spirit vinegar”: là sản phẩm của quá trình lên men chua, dung dịch cồn nguyên chất được pha loãng, có bổ sung các muối vô cơ và chất dinh dưỡng. - Giấm vang “Wine vinegar” : là sản phẩm của quá trình lên men chua dịch rượu vang nho. - Giấm gạo “Rice vinegar”: là sản phẩm của quá trình lên men chua dịch bột gạo đã được chuyển hoá thành đường rồi thành rượu. - Giấm mạch nha “Malt vinegar” là sản phẩm của quá trình lên men chua dịch tinh bột đã được chuyển hoá thành malt. - Ngoài ra giấm còn được làm từ các loại nước trái cây khác : nước ép thơm, nước ép trái điều, nước dừa. Từ rượu vang các loại: vang dứa, vang sơri, vang mít… 1.1.3. Thành phần của giấm ăn [28], [42]. Bên cạnh acetic acid và ethanol, giấm còn chứa các sản phẩm thứ cấp, có vai trò quan trọng trong việc tạo mùi vị… Những thành phần này có nguồn gốc từ nguyên liệu hay được bổ sung trong khi lên men, tạo thành do vi khuẩn Acetic hoặc do mối tương tác giữa các sản phẩm tạo thành. Trong giấm còn có những hợp chất không giải thích được nguồn gốc. Trong giấm chứa nhiều amino acid (ví dụ giấm cồn có 18 loại amino acid), nguồn gốc amino acid được tạo ra chủ yếu từ sự tự phân của vi khuẩn Acetic. Các hợp chất bay hơi: Trong giấm có chứa nhiều hợp chất bay hơi khác nhau như ethylacetate, aldehyt, ethylformate… 1.1.4. Nguyên liệu sử dụng để làm giấm [12], [24] Ethanol là nguyên liệu trực tiếp để lên men tạo acid acetic. Ngòai ra còn dùng dung dịch chứa đường như: mật rỉ đường, mật ong, các loại trái cây có chứa đường (nho, lê, đào, táo, chuối,mận,dứa…) hay tinh bột đã qua quá trình đường phân.  Nguyên liệu có bột  Đường  Rượu  acid acetic.  Nguyên liệu có đường  Rượu  acid acetic.  Nguyên liệu có rượu  acid acetic. Các muối khoáng, nguồn Nitơ dễ đồng hóa (muối Amon) hết một lượng ít acid acetic để tạo pH ban đầu thích hợp cho vi khuẩn họat động lên men. Nồng độ rượu thích hợp là 6-15%. Khi hết rượu vi khuẩn có thể oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O theo phương trình: CH3COOH + 2O2  CO2 + H2O Vì thế trong quá trình lên men bao giờ cũng phải đảm bảo hàm lượng ethanol tối thiểu là 0,3-0,5% . 1.1.5. Đặc điểm 1 số loại trái cây sử dụng để làm giấm I.1.5.1. Đặc điểm của dứa. [9] ,[29] Dứa có tên khoa học là Ananas Comonus thuộc họ Bromeliace (lớp thứ Một lá mầm ), là cây ăn quả nhiệt đới có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Châu Mỹ- Braxin hay Paragoay, do đó thích hợp nhiệt độ cao và độ ẩm cao. Dứa là loại cây không kén đất vì chúng có thể sinh trưởng trên các vùng gò đồi, dốc (20 độ trở xuống), nghèo dinh dưỡng như đất phèn ở Đồng bằng Sông Cửu Long, đất đá vôi, đất vàng đỏ ở ở các tỉnh miền Bắc. Sau 1-2 năm trong dứa có thể cho năng suất 10-12 tấn/ha, thậm chí là 30-35 tấn/ha. Hàm lượng đường trong dứa trung bình từ 8-12%, có nơi trồng giống tốt và chăm sóc tốt tỷ lệ đường đạt đến 15-16% (trong đó 66% đường dưới dạng saccaroz và 34% dưới dạng fructoz và glucoz ). Dứa có độ acid khoảng 0,6% (trong đó có tới 87% acid citric). Hàm lượng chất tro chiếm 0,4-0,6% trọng lượng (chủ yếu là kali, magie và canxi). Trong dứa có chứa nhiều vitamin C : 24-28mg/100g. Trong dứa có enzym Bromelin có tác dụng tiêu hoá rất tốt. Dứa cung cấp năng lượng đáng kể cho cơ thể con người: 1kg trái dứa cho 400-420 calo hoặc 150ml nước dứa cung cấp 100-150 calo. Bảng 1.1 : Thành phần dinh dưỡng của dứa Thành phần Hàm lượng Nước (%) 54,3 Protein(%) 0,5 Acid hữu cơ (g%) 0,6 Glucid (g%) 3,9 Tro (g% ) 0,2 Muối khoáng (mg%) Ca P Fe 9,0 10,2 0,3 Vitamin (mg%) B1 B2 PP C 0,05 0,01 0,1 14 1.1.5. Đặc điểm của nho. [9], [29] Nho là loại cây ăn trái có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao, được nhập vào Việt Nam vào đầu của thập niên 70 thế kỉ trước và ngày càng được trồng phổ biến ở một số vùng của nước ta. Thành phần dinh dưỡng của nho được trình bày ở bảng sau Bảng 1.2: Thành phần dinh dưỡng của nho Thành phần Hàm lượng Nước (%) 85% Đường tổng số g/100g trái cây 16,8 Acid malic g/100g trái cây 1,0 Protein g/100g trái cây 0,5 Chất tro g/100 g trái cây 0,4 Thiamin (B1) g 160-450 Riboflavin (B2) g 3-60 Acid panthothenic 0,5-1,4 Pyridoxin (B6) mg 0,16-0,5 Nicotinamit (PP) mg 0,68-2,6 Acid p-amiobenzoic g 15-92 1.1.6. Các tác nhân gây hại giấm [18], [20], [24], [28]. Giấm dễ bị hỏng trong thời gian bảo quản do nhiều nguyên nhân  Giấm chưa đạt chất lượng dễ bị oxy hóa quá mức tạo thành CO2 và H2O làm giấm bị giảm độ chua và vẩn đục.  Các vi sinh vật làm hư giấm như nấm men thuộc giống Candida.  Các sinh vật làm hư giấm như: lươn giấm, ruồi giấm, bọ giấm…  Lươn giấm có tên là Anguila aceti, là loại sâu phổ biến trong sản xuất giấm. Nó có dạng giống giun tròn, có thể nhìn thấy bằng kính lúp. Chúng xúât hiện trong thùng lên men giấm và trong dung dịch rượu trước khi lên acid hóa. Con đực trưởng thành dài 1mm, con cái dài 1-2mm. Lươn giấm sinh sản và phát triển mạnh ở nồng độ giấm thấp, ở nồng độ acid cao từ 9-10% chúng bị ưc chế nhưng không hoàn toàn ngưng sinh sản, với nồng độ cao hơn chúng mới chết. Lươn giấm sống bằng cách ăn vi khuẩn acetic, một phần rượu, acid acetic, đạm, các khoáng hòa tan làm giảm độ chua của giấm. Lươn giấm không độc đối với nguời, nhưng với số lượng lớn, chúng làm vỡ màng giấm, làm vẩn đục giấm và giấm không ngon. Lươn giấm có trong giấm là do không vệ sinh sạch sẽ trong quá trình lên men.  Ruồi giấm : làm giảm acid, sinh ấu trùng, có thể ăn vi khuẩn Acetic.  Vi khuẩn Lactic:Vi khuẩn Lactic tạo mùi khó chịu và làm mất màu giấm, giảm độ chua. Có 3 cách chống vi khuẩn lactic: o Lọc và tiệt trùng rượu đã lên men. o Bổ sung giấm ngon vào dịch trước khi lên men tạo độ chua ban đầu để hạn chế vi khuẩn lactic. o Bổ sung SO2 vào giấm.  Giấm chuyển thành màu đen: do 3 nhân tố là tannin,sắt và các men oxy hóa. Khắc phục tannin và sắt bằng cách thông khí và lọc. Một số men oxy hóa cũng làm thay đổi màu giấm, khắc phục bằng cách thanh trùng Pasteur. 1.1.7. Các tiêu chuẩn về thực phẩm của giấm ăn. [26], [28], [42] Giấm ăn là loại thực phẩm không độc đối với người và không có vi sinh vật gây bệnh. Một mẫu giấm phải đạt các tiêu chuẩn sau:  Trạng thái cảm quan tốt: giấm trong suốt hoặc hơi đục (nếu nguyên liệu là tinh bột), màu trắng trong (giấm rượu, nước dừa…) hoặc có màu vàng nhạt đến nâu (giấm bia, rượu vang, rỉ đường, trái cây…). Mùi vị chua dịu, có thể có mùi của nguyên liệu như rượu, bia, rỉ đường…Nếu giấm có nhiều mùi vị của nguyên liệu thì sự lên men chưa đạt, giấm chóng hỏng.  Không có lươn giấm.  Không chứa acid vô cơ tự do.  Không có kim loại nặng.  Không chứa phẩm màu.  Không chứa chất sát trùng.  Không chứa hơn 2% ethanol. 1.1.8. Bảo quản giấm ăn. [28], [42] Giấm thu được sau khi lên men gọi là giấm tươi, giấm có ít hoặc nhiều vẩn đục do chứa vi khuẩn acetic và các chất phân hủy từ nguyên liệu ban đầu nên cần được xử lý trước khi tiêu thụ.  Phương pháp thanh trùng Pasteur Các loại giấm sản xuất từ rượu vang, dịch ép trái cây thường tạo tủa ở đáy chai sau 1 thời gian bảo quản. Người ta thanh trùng bằng cách đun sôi ở 75o- 80oC trong 30-40 giây,nếu thanh trùng ở nhiệt độ cao thì ảnh hưởng đến mùi vị và giấm bị đục.  Sử dụng chất chống oxy hóa (Sulfit). SO2 là tác nhân chống oxy hóa được phép sử dụng trong bảo quản thực phẩm với hàm lượng thấp hơn 10mg/l SO2 được thêm vào dạng khí hoặc K2SO3 ngay trước khi đóng chai. SO2 có tác dụng làm giảmvận tốc oxy hóa các chất có gốc aldehyt, aceton tự do trong giấm.  Màu và sự khử màu Các chất màu có trong giấm có nguồn gốc từ nguyên liệu sử dụng ban đầu hoặc các chất tạo ra trong quá trình lên men. Ví dụ: màu vàng do caramen hoặc những chất màu khác cho phep sử dụng trong thực phẩm. Giấm làm từ nguyên liệu tự nhiên đôi khi cần có màu như màu đỏ của giấm làm từ vang đỏ có ý nghĩa cảm quan. Ở một số nước giấm được bán sau khi đã qua khử màu bằng than hoạt tính.  Đóng chai và bảo quản sản phẩm Giấm thành phẩm dùng trong gia đình được chứa trong chai nhựa hoặc chai thủy tinh và bảo quản bằng cách gắn xi trên nắp chai. Giấm sử dụng trong chế biến bảo quản thực phẩm được chứa trong những thùng có dung tích lớn và kín. Trong gia đình, có thể bảo quản những lọ giấm bằng cách cho cào vài tép tỏi hoặc 1 ít muối ăn. Bảo quản giấm ở điều kiện thóang mát, tránh ánh sáng mặt trời và nhiệt độ cao. Giấm đã qua lọc bảo quản được lâu hơn. 1.2. Vi khuẩn lên men sinh Acid Acetic. 1.2.1. Đặc điểm chung. [13], [30], [37], [42], [47],[50] Vi khuẩn sinh acetic acid là những vi sinh vật Gram âm, hiếu khí bắt buộc, có hình que và rất phổ biến trong tự nhiên. Chúng sử dụng oxygen làm chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi hô hấp. Vi khuẩn sinh acetic acid thường hiện diện trong những môi trường có đường, alcohol hay các môi trường acid hoá như trái cây, các loài hoa hoặc các sản phẩm lên men rượu Khả năng oxy hoá ethanol tạo thành acetic acid và tiết ra môi trường được xem là đặc điểm chung của vi khuẩn sinh acetic acid. Vi khuẩn Acetic di động nhờ 1-8 tiêm mao ở cực hay chu mao, hoặc không di động. Không hình thành nội bào tử. Đặc điểm hình thái [13] Các đặc điểm hình thái thường được khảo sát gồm màu sắc, hình dạng khuẩn lạc, trạng thái Gram, cách sắp xếp, hình dạng và kích thước tế bào. Ngoài ra, số lượng và cách sắp xếp roi trên tế bào cũng có vai trò trong việc định danh vi khuẩn sinh acid acetic. Đặc điểm sinh thái . [13], [39] Đặc điểm phân bố của vi khuẩn sinh acid acetic thường gắn liền với nguồn dinh dưỡng chứa đường hay alcohol như các loại hoa, quả, bia, rượu và ở các nơi sản xuất giấm. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa. [13], [30], [34], [38], 40], [41],[42], [48], [49] Các đơn vị phân loại thuộc nhóm vi khuẩn sinh acetic acid được phân biệt bởi các điểm sinh lý, sinh hoá sau: - Oxy hoá acetate và lactate tạo CO2 và H2O. - Phát triển ở các khoảng nhiệt độ, áp suất thẩm thấu và pH khác nhau. - Phát triển sinh khối khi nuôi cấy trong các môi trường chứa: D-glucose 30%; acid acetic 0.35%; KNO3 1.0%; methanol; glutamate; mannitol. - Sinh acetic acid từ nguồn cơ chất ethanol. - Tạo sắc tố hoà tan trong nước. - Tạo các polysaccharide có cấu trúc giống levan. - Đồng hoá ammonia trong môi trường chứa D-glucose, D-mannitol hay ethanol. - Tạo dihydroxyaceton từ glycerol. - Phát triển sinh khối và tạo acid trong các môi trường có nguồn carbon duy nhất là: D-glucose, D-mannose, D-galactose, D-fructose, L-sorbose, D- xylose, D-arabinose, L-rhamnose, D-mannitol, D-sorbitol, D-arabitol, meso- ribitol, dulcitol, meso-erythritol, myo-inositol, glycerol, maltose, lactose, melibiose, sucrose, sucrose, raffinose và ethanol. 1.2.2. Vai trò của vi khuẩn sinh acetic acid [13] Các ứng dụng và triển vọng sử dụng vi khuẩn sinh acetic acid - Sản xuất giấm. - Sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học: Đặc tính oxy hoá không hoàn toàn nhiều loại nguồn carbon khác nhau của giống Gluconobacter đặc biệt có ý nghĩa trong công nghệ sinh học và sản xuất công nghiệp. Ví dụ: G.oxydans có vai trò rất quan trọng ở giai đoạn chuyển hoá D-sorbitol thành L-sorbose trong nghành công nghiệp sản xuất vitamin C; G.oxydans còn được sử dụng trong sản xuất dihyroxyacetone (DHA) nhờ quá trình chuyển hoá glycerol. - Sản xuất một số loại nước giải khát lên men truyền thống. Ví dụ: sản xuất rượu Kombucha, 1 loại nước giải khát có vị hơi chua và sủi bọt được ưa thích ở Nhật Bản, Trung Quốc, An Độ và một số nước Châu Au, là quá trình lên men trà đen đã bổ sung đường bởi tổ hợp nấm men cùng 3 giống Acetobacter, Gluconobacter và Gluconacetobacter . -Sản xuất cellulose vi khuẩn. 1.2.3. Phân loại. [13] Vi khuẩn sinh acetic acid được phân loại trong họ Acetobacteraceae thuộc phân lớp -Proteobacteria. Theo International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM)- Tạp chí Quốc Tế về Phân loại và Tiến hóa của Vi sinh vật, cho đến nay họ Acetobacteraceae có 10 giống gồm: Acetobacter Beijerinck 1898, Gluconobacter Asai 1935, Acidomonas Urakami và cộng sự 1989, Gluconacetobacter Yamada và cộng sự 1998, Asaia Yamada và cộng sự 2000, Kozakia Lisdiyanti và cộng sự 2002, Saccharibacter Jojima và cộng sự 2004, Swaminathania Loganathan và Nair 2004, Neoasaia Yukphan và cộng sự 2006, và Granulibacter Greenberg và cộng sự 2006 1.2.3.1. Giống Acetobacter Beijerinck 1898 Beijerinck (1898) dùng thuật ngữ “ Acetobacter” để chỉ các vi khuẩn hiếu khí hình que, Gram âm, có khả năng sinh acetic acid từ ethanol. Các chủng Acetobacter có thể dễ dàng phân biệt với các loài thuộc những giống khác trong họ Acetobacteraceae bởi các đặc điểm kiểu hình sau: Q-9 là thành phần ubiquinone chính trong màng tế bào và oxy hoá 2 nguồn cơ chất acetate và lactate cho sản phẩm cuối cùng là CO2 và H2O. Hiện nay, giống Acetobacter gồm 16 loài gồm: A. aceti, A.pasteurianus, A.pomorum, A.indonesiensis, A.tropicalis, A.orientalis, A.syzygii, A.cibinogensis, A.tropicalis, A.orientalis, A.cibinogensis, A.estunensis, A.orleanensis, A.peroxydans, A.cerevisiae, A.malorum, A.oeni và A.nitrogenifigens; A.aceti là loài điển hình của giống. 1.2.3.2. Giống Gluconobacter Asai 1935 Giống thứ hai trong họ Acetobacteraceae, Gluconobacter được đề nghị bởi Asai vào năm 1935. Vào thời điểm này tất cả các chủng vi khuẩn có khả năng sinh acetic acid đều được định danh là giống Acetobacter, Asai đã đề nghị phân loại các chủng có khả năng tạo acetic acid từ ethanol kém nhưng oxy hoá mạnh D-glucose thành D-gluconic vào 1 nhóm phân loại mới với tên giống là Gluconobacter, các chủng có khả năng oxy hoá mạnh ethanol thành acetic acid vẫn được xác định là Acetobacter. 1.2.3.3. Giống Acidomonas Urakami và cộng sự-1989 Tên giống Acidomonas được đề nghị bởi Urakami và cộng sự (1989) với chỉ 1 loài là Acidomonas methanolica. Giống này được công nhận với các đặc điểm Gram âm, tế bào hình que, ưa acid và đặc biệt là có khả năng dinh dưỡng methyl tùy ý. 1.2.3.4. Gluconacetobacter Yamada và cộng sự- 1998 Thuật ngữ “ Gluconoacetobacter” được dùng đầu tiên cho cấp độ phân loại giống phụ trong giống Acetobacter khi Yamada và Kondo (1984) nhận thấy thành phần ubiquinone chính trong màng tế bào sinh vi khuẩn sinh acetic acid khác nhau. Các chủng có Q-10 là thành phần ubiquinone chính được phân loại trong giống phụ Gluconoacetobacter, trong khi Q-9 là thành phần ubiquinone chính trong màng tế bào Acetobacter. Sau đó, giống phụ Gluconoacetobacter được đưa lên thành giống thứ tư trong họ Acetobacteraceae dựa vào mối quan hệ phát sinh loài khi phân tích một phần trình tự mã hoá 16S rRNA. 1.2.3.5. Giống Asaia Yamada và cộng sự-2000 Giống Asaia được giới thiệu là giống thứ năm trong họ Acetobacteraceae bởi Yamada và cộng sự (2000). Các loài Asaia có những đặc điểm khá khác biệt so với các giống đã biết; Không sinh acetic acid hoặc tạo thành 1 lượng rất ít từ nguồn cơ chất ethanol và hầu như bị kìm hãm phát triển trong môi trường có chứa acid acetic với nồng độ 0,35%. Hầu như tất cả các chủng Asaia được phân lập từ các loài hoa ở vùng nhiệt đới và phát triển tốt trong môi trường có nguồn cơ chất là đường. 1.2.3.6. Giống Kozakia Lisdiyanti và cộng sự 2002 Giống mới Kozakia được phát hiện khi Lisdiyanti (2002) khảo sát 1 cụm phát sinh loài mới trên cây phát sinh loài của vùng trình tự 16S đối với các chủng vi khuẩn sinh acetic acid phân lập tại Indonesia. 1.2.3.7 Giống Swaminathania Loganathan và Nair 2004 Các chủng Swaminathania phân lập từ cây lúa hoang mọc ở khu vực sinh thái ngập mặn. Loganathan và Nair (2004) xác định giống Swaminathania dựa vào khả năng sinh acetic acid từ ethanol và vị trí phân loại của các chủng thuộc giống này trên cây phát sinh được xây dựng dựa vào trình tự 16S rDNA. 1.2.3.8. Giống Saccharibacter Jojima và cộng sự 2004 Đặc điểm nổi bật của Saccharibacter là tính ưa áp suất thẩm thấu, chỉ có thể tồn tại và phát triển trong môi trường có nồng độ đường cao từ 5-40%. Ngoài ra, Saccharibacter không sinh acid acetic từ ethanol và không thể phát triển trong môi trường có 0,35% c acid acetic. 1.2.3.9. Giống Neoasaia Yukphan và cộng sự 2006 Neoasaia, giống thứ chín trong họ Acetobacteraceae, được Yukphan và cộng sự phát hiện và chỉ có 1 loài là Ne. chiangmaiensis. Giống này được phân loại dựa vào đặc điểm kiểu hình cùng với kết quả phân tích trình tự vùng 16S rDNA, 16S-23S rDNA ITS và kết quả lai DNA bộ gen với loài điển hình của các chủng đã biết. 1.2.3.10. Giống Granulibacter Greenberg và cộng sự 2006 Granulibacter là giống thứ 10 trong họ Acetobacteraceae được công bố trên tạp chí IJSEM vào cuối năm 2006. Đây là giống đầu tiên thuộc họ Acetobacteraceae được biết đến như chủng gây bệnh cho người khi được phân lập từ bệnh nhân bị u hạch mãn tính. 1.3. Cơ chế của quá trình lên men “Acetic” và 1 số phương pháp lên men 1.3.1. Cơ chế của quá trình lên men acetic [2], [12] Acid acetic thu nhận từ nhiều phương pháp: Chưng cất gỗ, tổng hợp hóa học hay sinh học lên men. Lên men acetic thực chất là quá trình oxy hóa không hoàn toàn ethanol thành acid acetic dưới tác dụng của vi khuẩn. Louis Pasteur là người khám phá ra cơ chế của quá trình lên men acetic vào năm 1802. Phương trình tổng quát: CH3CH2OH + O2  CH3COOH +H2O + 117kcal Thực chất trải qua các giai đọan sau: 2CH3CH2OH + O2  CH3CHO +2H2O ethanol Acetaldehyt CH3CHO + H2O  CH3CH(OH)2 Hydrat của acetaldehyt CH3CH(OH)2 +1/2 O2 CH3COOH + H2O Acid acetic Ngoài ra vi khuẩn Acetic còn có khả năng oxy hóa nhiều chất khác nhau như: Propanol  acid propionic. Lactic acid  acetoin. Glycerine  dyhiroxyacetol. D-sorbitol  L-sorbose. D-Ribit  L-ribulose. D-Manit  D-Fructose. D-Glucose  acid gluconic  D-5-ketogluconic. Lactic acid  pyruvic acid. 1.3.2 . Những yếu tố ảnh hưởng đến sự lên men.[12] 1.3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ acid. Trong quá trình lên men acetic, nồng độ acid ảnh hưởng rất quan trọng đến sự lên men. Nếu nồng độ acid acetic đạt 8% sẽ ức chế họat động của vi khuẩn và nếu nồng độ đạt acid acetic từ 12-14% sẽ ức chế hoàn toàn vi khuẩn. 1.3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ rượu. Nồng độ rượu trong môi trường lên men là 6-7% thể tích hoặc 9- 14% đối với lọai vi khuẩn khác. Nếu trong môi trường không có rượu thì vi khuẩn tiếp tục oxy hóa acid acetic để thu nhận năng lượng dùng trong sự sống. Vì thế đây là 1 quá trình có hại. Việc sử dụng acid acetic bởi vi khuẩn dấm gọi là sự quá oxy hóa và acid acetic bị mất đi theo phản ứng: CH3COOH + 2O2 =2CO2 +2H2O Trong sản xuất người ta thường giữ lại độ rượu trong môi trường là 0,3-0,5%. Sự quá oxy hóa phụ thuộc vào độ acid của môi trường. Đối với những lòai vi khuẩn khác nhau tồn tại một giá trị pH giới hạn làm ngừng sự quá oxy hóa. Giá trị pH đối với sự quá oxy hóa luôn cao hơn giá trị pH giới hạn đối với sự oxy hóa rượu 1 ít. Do đó khi có rượu thì sẽ kìm hãm sự quá oxy hóa. Đầu tiên rượu có mặt bị oxy hóa và chỉ khi độ acid chuyển sang giá trị giới hạn thì sự quá oxy hóa bắt đầu. 1.3.2.3.Nhiệt độ Vi khuẩn Acetobacter thuộc nhóm ưa ấm, nhiệt độ thích hợp đối với chúng là từ 25-32oC. Ở nhiệt độ thấp thì quá trình lên men xảy ra chậm.Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế họat động và đến mức độ nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào làm tăng sự tổn thất cho vi khuẩn và hiệu suất của quá trình lên men giảm do sự bay hơi của acid acetic và rượu etylic. Tùy theo từng lòai mà nhiệt độ tối ưu cho quá trình oxy hóa sẽ thay đổi. Nhưng trong sản xuất người ta dùng những lòai vi sinh vật thích ứng cho quá trình oxy hóa là 30-400C. 1.3.2.4. Độ thoáng khí Oxy là 1 yếu tố quan trọng và là nhân tố điều chỉnh quá trình lên men. Theo cơ chế của quá trình oxy hóa, lượng không khí cung cấp cho quá trình lên men là tương đối lớn. Trong thực tế càng thóang khí năng suất càng cao( có giới hạn do năng suất của chủng vi khuẩn). 1.3.2.5. Ảnh hưởng của nguồn C.N. P và các nguyên tố vi lượng Để quá trình oxy hóa xảy ra nhanh, trong dịch lên men ngòai acid acetic, rượu etylic, dung dịch lên men cần đượcc bổ sung 1 số muối khóang (NH4)2SO4, (NH4)2PO4, KH2PO4, MgSO4, CaHPO4, FeCl3…tùy theo nhu cầu cụ thể của từng loài. Ngòai ra trong môi trường dung dịch còn được bổ sung thêm vitamin và chất kích thích sinh trưởng: pepton, cao nấm men, cao thịt, sữa…Theo nghiên cứu của 1 số tác giả Nhật Bản trong môi trường dung dịch còn được bổ sung sake, myglycerin, lactic acid … 1.3.3. Các phương pháp lên men [12], [20] 1.3.3.1. Phương pháp chậm Nguyên lý Phương pháp chậm còn được gọi là phương Pháp – Orleans, được biết đến từ năm 1670, khời đầu là vùng nho nổi tiếng cuả Pháp. Người ta thấy dịch vang nho để trong thùng gỗ bị hở nắp dần dần đục hơn, có màng phủ trên bề mặt và trở nên chua. Để sản xuất giấm theo phương pháp này, người ta dùng những thùng gỗ đứng có vòi tiếp nguyên liệu và rót giấm (thường bằng thủy tinh, nhựa…). Vật liệu cấy là dấm tươi lấy từ thùng lên men khác, cho vào 1/5 thể tích thùng là dấm tươi, sau đó đổ dịch lên men vào đến khoảng ½ thùng. Tiếp đó cứ theo 1 chu kỳ( 1tuần) đổ thêm dịch lên men vào cho đến khi đầy thùng. Thường dịch lên men là hỗn hợp của rượu vang và acid tạo nên dung dịch có nồng độ từ 1-2% acid, 2-4% rượu. Vi khuẩn Acetobacter phát triển trên bề mặt chất lỏng và “cái giấm” hình thành chứa chứa 1 lượng lớn vi khuẩn Acetobacter. Sở dĩ ngươi ta cho acetic acid trước là để tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển, mặt khác là để ngăn ngừa các vi khuẩn khác phát triển, không bị nhiễm. Quá trình lên men diễn ra chậm chạp do sự thâm nhập hạn chế của oxy qua bề mặt dung dịch bị che phủ một lớp cái dấm. Thường quá trình kết thúc sau 5 tuần nuôi cấy. Lúc đó nồng độ dịch lên men vào để lên men tiếp. Trong quá trình lên men do bị chấn động( va chạm )” cái dấm” chìm xuống và tiêu thụ 1 lượng cơ chất mà không tạo thành acid acetic. Đây là nguyên nhân giảm độ acid trong giấm thành phẩm. Sau đó trên bề mặt thóang khí lại hình thành 1 lớp màng vi khuẩn mới và lại diễn ra quá trình lên men như trên. Giấm lấy ra được lọc trong và thanh trùng Pasteur để bảo quản được lâu. Ưu điểm -Cho chất lượng giấm thơm ngon. -Thiết bị sản xuất không phức tạp, phù hợp với các cơ sở sản xuất nhỏ ở các địa phương. Nhược điểm - Thời gian lên men dài. - Năng suất thấp. - Nồng độ acid thấp. - Mặt bằng sản xuất phải lớn. - Khó cơ khí hóa, tự động hóa. - Hiện nay chỉ còn 1 vài nước chậm phát triển còn sử dụng như biện pháp duy nhất để sản xuất giấm trong đó có Việt Nam. 1.3.3.2. Phương pháp nhanh Nguyên lý Phương pháp nhanh còn được gọi là phương pháp Đức. Phương pháp này được tìm ra vào năm 1823, do Schiizenbachi, cho phép thời gian lên men giảm xuống đáng kể. Nguyên tắc của phương pháp này là tạo bề mặt tiếp xúc lớn hơn giữa vi khuẩn Acetobacter với không khí để oxy hóa rượu. Bề mặt lớn được tạo ra khi sử dụng vật liệu xốp (thường dùng vỏ bào, lõi ngô xếp trong thiết bị dạng thap, trụ, nón cụt…), tháp lên men thông thường làm bằng gỗ, thường có chiều cao gấp đôi đường kính 2,5 – 6m x 1,2 -3m. Vi khuẩn acetic được bám trên vat liệu xốp (vật liệu mang). Những vật liệu này có bề mặt tiếp xúc riêng lớn ,thể tích tự do lớn, khối lượng riêng bé, độ bền cơ học cao, rẻ tiền, dễ kiếm, phải có đủ độ nhám, độ xốp để màng vi sinh vật có thể bám lên đó, dịch lên men cho phương pháp nhanh thường là hỗn hợp acid 6% và 3% rượu etylic để thu được dấm 8-9%. Dịch lên men được chuyển từ trên xuống và không khí được chuyển từ dưới lên. Phản ứng sinh học được thực hiện trong khối tế bào cố định, dịch lên men được chuyển hóa nhanh thành acid acetic nhờ vi khuẩn. Khi hầu hết rượu etylic được oxy hóa thành acid acetic người ta thường để trong dung dịch lên men khỏang 0,2-0,5% rượu etylic để tránh quá trình oxy hóa ngược làm giảm nồng độ acid acetic. Cuối cùng rút giấm thành phẩm và bắt đầu 1 chu kỳ mới. Thời gian lên men khỏang 6 ngày. Trong thực tế sản xuất người ta cho dịch lên men chảy qua thành thùng theo nhiều phương pháp, nhưng phổ biến nhất là 1 trong 3 phương pháp sau: vận hành đơn, vận hành kép, tuần hòan. Trong thiết bị, dịch lên men không lấp trùm tháp mà chỉ thấm dần dần qua lớp đệm khi cho đi từ đỉnh tháp qua khối vật liệu mang. Dịch lên men được tuần hòan nhiều lần qua thiết bị , khi chảy qua lớp đệm, rượu dần dần bị oxy hóa thành acid acetic. Lưu lượng được tính sao cho quá trình oxy hóa trong tháp diễn ra nhanh nhất. Không khí được đưa vào trong thiết bị thông qua các lỗ nhỏ dưới đáy tháp và bên thành tháp. Sự thông khí nhờ sự chênh lệch nhiệt độ giữa trong và ngòai thiết bị. Để giảm bớt tổn hao acid acetic và rượu etylic do sự bay hơi theo khí thải, người ta bố trí 1 thiết bị hấp phụ phía sau tháp. Với thiết bị như vậy có thể ổn định làm việc trong 1 thời gian dài ( 20-30 năm), quá trình này được sử dụng trong 1 thế kỷ hoặc lâu hơn nữa, nhưng nếu phá vỡ quy định bình thường nào đó thì sẽ dẫn đến hậu quả không hay và có khi ngừng sản xuất. Do việc thông khí phụ thuộc nhiều vào độ chênh lệch giữa trong và ngoài thiết bị nên quá trình sản xuất phụ thuộc nhiều vào điều kiện thời tiết. Sự giảm hệ số nhiệt độ làm giảm sự thông khí cho thiết bị và họat động oxy hóa của vi khuẩn. Điều đó dẫn đến sự giảm nhiệt độ trong thiết bị và giảm độ thông khí, dẫn đến sự đình chỉ hòan tòan quá trình sản xuất khi nhiệt độ môi trường quá cao( to > 30oC ). Vấn đề kiểm tra nhiệt độ tự động trong thiết bị được giải quyết bằng cách làm lạnh dịch lên men trước khi bơm tuần hòan trở lại thiết bị tới nhiệt độ 26-28oC. Nồng độ oxy được kiểm tra bằng Oxygemeter, nồng độ oxy trong khí thải được bảo đảm lớn hơn 12%. Có thể coi phương pháp sản xuất acid acetic theo phương pháp công nghiệp của Đức là ứng dụng đầu tiên về phương pháp cố định tế bào vi sinh vật vào công nghiệp lên men. Ưu điểm - Thời gian lên men ngắn hơn so với phương pháp chậm khá nhiều, chỉ trong 5-6 ngày. -Giấm thu được có nồng độ cao . Nhược điểm -Hiệu suất kinh tế chưa cao do thiết bị khá phức tạp, điều chỉnh thiết bị thông gió khó và cần phải nghiên cứu kỹ hơn. -Hiệu suất của quá trình lên men không cao vì rượu và acid là chất dễ bay hơi ( lượng thất thóat tới 2-6%). Có thể khắc phục bằng cách đặt 1 thiết bị ngưng tụ bao gồm 2 thiết bị lọc tha._.n đặt kế tiếp nhau sau tháp lên men để ngưng tụ rượu và acid. 1.3.3.3. Phương pháp chìm Nguyên lý Phương pháp chìm còn gọi là phương pháp sục khí. Việc sử dụng phương pháp chìm cho oxy hóa rượu etylic thành acid acetic do Ebner và Hromatka phát hiện ra vào năm 1949. Trong phương pháp chìm không khí được sục qua khối dịch lên men mãnh liệt và tạo thành 1 thể huyền phù có pha rắn là Acetobacter và pha lỏng là dịch lên men trong các nồi lên men đặc biệt. Trong nồi lên men dịch rượu etylic được chuyển thành acid acetic khá nhanh. Để lên men, dịch lên men đưa vào thiết bị gồm 6-12% rượu etylic cộng 1-3% acid acetic. Thời gian 1 chu trình sản xuất khoảng 40-96 giờ. Sản phẩm tạo thành 7-13% acid acetic, 0,2-0,5% rượu sót. Thiết bị lên men chìm nổi tiếng nhất của Tây Đức gọi là Axetator-Frings. Cho tới năm 1981 tòan thế giơí có khỏang 440 Axetator- Frings họat động. Trong khi đó ở Việt Nam chưa có Axêtator-Frings nào họat động. Ở thiết bị Axetator-Frings tổng hàm lượng rượu và acid cho mỗi chu kỳ khỏang 7-15% khi hàm lượng rượu trong thùng lên men còn 0,2-0,5%, quá trình được coi là kết thúc. Người ta lấy 40-60% dịch lên men ra với tốc độ sao cho tránh tiêu hao toàn bộ rượu etylic. Sau đó cho dịch lên men mới vào đúng đến lượng ban đầu, quá trình này diễn ra từ từ tránh tác động đến tế bào do sự thay đổi nồng độ cơ chất trong dung dịch. Thùng lên men được gắn với 1 máy nén khí,một bộ phận khuấy và 1 bộ phận phá bọt. Acid acetic và rượu etylic được xác định tự động. Tùy loại nguyên liệu sử dụng và lượng rượu etylic cho vào, quá trình lên men có thể kéo dài 40-96 giờ với hiệu suất 90-95%. Mặc dù có những ưu điểm rất lớn nhưng mãi cho đến gần đây nó mới được sử dụng rộng rãi trong đời sống, nguyên nhân kìm hãm là do nhu cầu phức tạp của thiết bị, tính ổn định không cao, quan trọng nhất là yêu cầu nghiêm ngặt của việc cung cấp oxy liên tục. Những công trình ngiên cứu từ năm 1949 đã chỉ ra rằng các vi khuẩn Acetobacter khi ở trạng thái lơ lửng trong môi trường gồm dấm, cồn, nước sẽ trở nên nhạy cảm với việc cung cấp oxy ở những giai đọan ngắn nhất, đặc biệt khi nồng độ acid acetic đã khá cao. Ví dụ: nồng độ tổng là 5%, khi ngừng cung cấp oxy trong khỏang 120 giây sẽ làm chết 1/3 số vi khuẩn có mặt trong môi trường lên men, nếu nồng độ tổng là 12% thì chỉ cần ngắt oxy trong 10-12 giây đã đủ làm chết 1/3 tổng số vi khuẩn. Ưu điểm - Thời gian lên men nhanh. - Thiết bị nhỏ hơn, gọn hơn, năng suất cao hơn. - Hiệu suất cao( 90-95%). - Có khả năng tự động hóa cao. - Tổng sản lượng dấm sản xuất theo phương pháp đến năm 1981 là767 triệu lít năm (giấm10%), trong đó chủ yếu là nước Mỹ, Nhật Bản, Pháp, Tây Đức và 1 số nước khác. Ở Việt Nam đã tiên hành lên men dấm và acid acetic theo phương pháp chậm,đang nghiên cứu các phương pháp lên men nhanh và chìm. Nhược điểm -Thiết bị phức tạp. -Tính ổn định không cao. -Yêu cầu về việc cung cấp oxy rất phức tạp.. 1.3.3.4. Phương pháp phối hợp Nguyên lý Đây là phương pháp kết hợp 2 phương pháp nhanh và chìm. Nó xuất hiện gần đây ở Liên Xô cũ. Thiết bị lên men theo phương pháp này gồm 2 phần *Phần trên Như thùng lên men theo phương pháp nhanh.Bên trong thùng đổ đầy đệm theo phương pháp nhanh. *Phần dưới Phần chứa dịch lên men sau khi qua vật liệu xốp có lắp thêm bộ phận sục khí tạo thành vùng oxy hóa bổ sung như 1 nồi lên men của phương pháp chìm. Ưu điểm Phương pháp này có ưu điểm khi hệ thống lên men đang họat động, nếu ngừng cung cấp điện ( ngừng cung cấp oxy qua bộ phận sục khí ) vẫn không ảnh hưởng đến vi khuẩn. Lúc đó các van thông khí bên trong thiết bị được mở ra và không khí vào nhờ vào sự thông khí tự nhiên, do đó màng vi khuẩn trên đệm không bị chết, nhưng chỉ đảm bảo phần trên máy còn phần dưới vẫn phụ thuộc vào nguồn điện thông khí cho vi khuẩn họat động. Phương pháp này phát huy được ưu điểm của cả 2 phương pháp nhanh và chìm. Nhược điểm -Thiết bị yêu cầu phức tạp, cồng kềnh. -Giống vi khuẩn phải phù hợp cả 2 phương pháp. 1.3.3.5. Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật 1.3.3.5.1. Định nghĩa tế bào cố định Tế bào cố định là tế bào có sự chuyển động trong không gian bị giới hạn, sự giới hạn của tế bào có được bằng đưa nó vào 1 phase cách ly với phase dung dịch tự do. Phase chứa tế bào thường không tan trong nước, là polymer cao phân tử ưa nước. 1.3.3.5.2. Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trên bề mặt chất mang Phương pháp này dự trên sự liên kết giữa chất xúc tác sinh học và chất mang không tan trong nước. a.Phương pháp liên kết cộng hóa trị Đây là phương pháp sử dụng để cố định enzyme và không được sử dụng rộng rãi đối với tế bào vi sinh vật, vì tác nhân cần thiết đe tạo liên kết cộng hóa trị có thể gây độc đến tế bào và gây khó khăn cho việc cố định. Chất mang thường được sử dụng trong phương pháp này là polypeptide, polysaccharide, dẫn xuất cellulose như DEAE-cellulose, DEAE-saphadex…., agarrose, các polyme tổng hợp. Phương pháp tiến hành Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật theo phương pháp này dựa trên liên kết cộng hoá trị giữa bề mặt chất mang đã được họat hóa và tế bào vi sinh vật. Quá trình liên kết cộng hóa trị giữa tế bào vi sinh vật và bề mặt chất mang có thể xảy ra theo một hay hai giai đọan. Một giai đọan nếu chất mang có chứa các nhóm có khả năng tham gia trực tiếp với nhóm chức của protein màng tế bào vi sinh vật. 2 giai đọan diễn ra như sau Giai đọan 1 : Họat hóa chất mang bằng cách gắn lên bề mặt chất mang các nhóm chức có khả năng phản ứng hơn, dễ liên kết với tế bào vi sinh vật. Giai đọan 2 Tạo liên kết giữa các nhóm chức lên chất mang với tế bào vi sinh vật. Vì vậy, tế bào vi sinh vật sẽ được cố định lên chất mang. .Ưu nhược điểm của phương pháp Ưu diểm -Khả năng trao đổi chất cao. -Độ bền liên kết giữa tế bào vi sinh vật và chất mang tốt. - Tế bào cố định vi sinh vật theo phương pháp này có tính chống chịu tốt với các yếu tố gây biến tính. Nhược điểm - Ảnh hưởng đến sự sống và hoạt tính của tế bào. - Tế bào được cố định phải có phản ứng đặc thù để liên kết với chất mang và chất mang phải được họat hóa dẫn đến tốn chi phí và phức tạp. b. Phương pháp hấp phụ Cơ sở của phương pháp là dựa trên mối liên kết hóa học giữa màng tế bào và bề mặt chất mang. Ở phương pháp này ngòai liên kết cộng hóa trị ra, tế bào chất mang còn liên kết với nhau bởi nhiều liên kết khác . Các liên kết này thể hiện ở các cơ chế sau: tạo liên kết hóa học giữa màng tế bào và bề mặt chất mang, sự tương tác ion , và lực mao quản. Chất mang Chất không có cấu trúc xốp như thủy tinh. Chất mang có cấu trúc xốp như than họat tính. Chất mang có điện tích như nhựa trao đổi ion. Phương pháp tiến hành Phương pháp cổ điển Ngâm chất mang vào dung dịch huyền phù vi sinh vật, vi sinh vật sẽ tự động kết lắng và liên kết với chất mang bằng cách hấp phụ trên chất mang đó. Phương pháp cổ điển có cải tiến Sử dụng thêm cánh khuấy nhằm mục đích phân bố đều tế bào vi sinh vật và chất mang trong dung dịch. Phương pháp bơm canh trường vi sinh vật qua cột chứa chất mang Phương pháp này cần có hồi lưu dòng canh trường để nâng cao hiệu suất gắn tế bào vi sinh vật vào chất mang. Ưu nhược điểm của phương pháp Ưu điểm - Quá trình thực hiện đơn giản, dễ thực hiện,không đòi hỏi phải họat hóa chất mang và các tác nhân phản ứng. - Thực hiện trong điều kiện bình thường, tế bào vi sinh vật vẫn duy trì được khả năng sống và phát triển của nó. - Chi phí giá thành thấp. - Ít gây ảnh hưởng đến tế bào sau khi cố định. Nhược điểm - Tế bào vi sinh vật dễ bị tách khỏi chất mang khi có tác động cơ học hay điều kiện môi trường thay đổi. - Lượng vi sinh vật cố định lên bề mặt chất mang không cao. - Quá trình thực hiện thụ động và khó điều khiển vì vậy hiệu suất cố định thường không cao. - Giới han trong việc lựa chọn chất mang. - Vật mang có thể xảy ra hấp phụ không đặc hiệu 1 số protein khác hay các chất phi protein. c. Phương pháp cố định tế bào trong cấu trúc gel Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc gel là phương pháp nhốt tế bào vi sinh vật trong khuôn gel của nhiều loại polymer khác nhau. Việc cố định tế bào vi sinh vật trong khuôn gel tức là ngăn không cho tế bào khuếch tán vào môi trường xung quanh, nhưng đồng thời vẫn cho cơ chất có phân tử lượng nho thích hợp và các sản phẩm trao đổi chất của tế bào ra khỏi mạng lưới gel đó. Các loại gel cơ bản a. Ion gel: Khuôn gel được tạo nên bằng cách liên kết ion giữa chất mang đa điện tích và dung dịch đa điện tích trái dấu. b. Covalent gel : là 1 loại gel mà cấu trúc mạng lưới của nó được hình thành từ những phân tử polymer gắn kết với nhau bằng liên kết cộng hóa trị. c. Non-covalent gel: là loại gel mà mạng lưới được hình thành bằng những liên kế khác không phải là liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử polymer, thường là liên kết hydro. d. Cryogel: là cấu trúc gel polimer mới, là loại gel được tạo nên bơi phương pháp làm lạnh đông các tiền polime có phân tử lượng thấp hoặc cao. Phương pháp tiến hành a.Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc ion gel Hỗn hợp huyền phù tế bào vi sinh vật và chất mang đa điện tích được nhỏ vào dung dịch đa điện tích trái dấu để thực hiện phản ứng tạo mạng lưới gel. Qua đó, tế bào vi sinh vật sẽ được cố định trong hệ thống mạng lưới vừa được hình thành. b.Phương pháp cố định tế bào trong cấu trúc covalent gel Cách 1: ta trộn huyền phù tế bào vi sinh vật với dung dịch các monomer. Sau đó, tạo điều kiện để các monomer liên kết và tạo phân tử polimer. Các phân tử polimer liên kết với nhau bằng liên kết cộng hóa trị để tạo nên cấu trúc gel chứa tế bào vi sinh vật. Cách 2 :ta trộn huyền phù tế bào vi sinh vật với dung dịch chất mang polimer. Hỗn hợp sẽ được tiến hành với những phản ứng thích hợp để tạo liên kết giữa các sợi polimer với nhau.Những liên kết mới được hình thành sẽ tạo 1 mạng lưới dày đặc chứa tế bào vi sinh vật.Sau đó khối gel này được đưa đến thiết bị tạo hạt và thu được các hạt gel polimer chứa tế bào vi sinh vật cố định. c.Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc non-covalent gel Phương pháp này giống phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc covalent gel nhưng mạng lưới trong cấu trúc gel này được hình thành từ những liên kết khác liên kết khác liên kết cộng hóa trị, thường là liên kết hydro. Chất mang thường được sử dụng là carregeenan. d. Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấutrúc cryogel Cryogel được tạo thành bằng cách sử dụng phương pháp lạnh đông. Ở điều kịen nhiệt độ thấp, mẫu nguyên liệu sẽ biến đổi cứng lại và hình thành cấu trúc mới. Polyvinylalcohol là loại polimer được sử dụng trong tạo gel cryogel có khả năng cố định tế bào tốt, có cấu trúc lỗ xốp đặc trưng, bền chắc, lượng tế bào bị rửa trôi không nhiều sau chu kỳ lên men và giữ được hoạt tính trong thời gian dài do không tiếp xúc với dung môi hữu cơ. e.Các phương pháp khác Phương pháp làm thay đổi nhiệt độ: huyền phù dung dịch chất mang và tế bào gel khi hạ nhiệt độ. Chất mang sử dụng: agar, gelatin. Phương pháp này không thích hợp với những tế bào nhạy với nhiệt. Phương pháp đóng rắn polimer: tế bào hòa với polimer lỏng rồi được nhỏ vào bình chất đóng rắn tạo ra hạt xúc tác như cellulose triaxetat. Phương pháp này không thích hợp với tế bào sống. 1.3.3.5.4. Ưu nhược điểm chung của phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong lòng chất mang. a.Ưu điểm -Có thể áp dụng cho nhiều loại tế bào vi sinh vật cố định trong cấu trúc gel polimer. -Mật độ tế bào cố định trong cấu trúc gel lớn. -Không có sự hình thành liên kết giữa tế bào vi sinh vật và chất mang mà tế bào chỉ bị nhốt bên trong, vì vậy protein của màng tế bào vi sinh vật không bị phá hủy. -Không có sự tương tác trực tiếp giữa tế bào vi sinh vật với dung môi hữu cơ nên ít gây ảnh hưởng đến sự sống và họat tính của tế bào. b.Nhược điểm -Tế bào vi sinh vật phân bố không đều trong gel vì vậy ảnh hưởng đến hiệu suất quá trình trao đổi chất. -Không thích hợp khi cơ chất là những phân tử lượng lớn vì khó khuếch tán được qua màng gel. - Một số chất mang có thể ảnh hưởng không tốt đến họat tính của tế bào vì có thể gây cản trở đến sự trao đổi chất của vi sinh vật. - Gel polimer cóthể bị phá hủy bởi tốc độ sinh trưởng của tế bào gây ảnh hưởng đến quá trình sản xúât. 1.3.3.6. Cố định tế bào không chất mang 1.3.3.6.1.Phương pháp liên kết chéo giữa các tế bào Đây là phương pháp liên kết các tế bào vi sinh vật riêng biệt thành 1 khối tế bào cố định nhờ các tác nhân lưỡng hoặc đa chức mà không sử dụng chất mang. Trong phương pháp này, thông qua 1 số hợp chất đặc biệt có khả năng hình thành các liên kết nối mạng, sẽ diễn ra phản ứng giữa tế bào hoặc các tthành phần của tế bào như enzyme với các họat chất này. Nhờ vậy, các tế bào sẽ liên kết với nhau tạo thành cấu trúc dạng hình viên. Ứng dụng nổi bật nhất của phương pháp này trong công nghiệp là cố định trực khuẩn Bacillus cogulans để sản xúât các dạng đồng phân của đường glucose. a.Ưu điểm - Điều kiện nhẹ nhàng, có khả năng kéo dài thời gian họat động của tế bào. - Làm tăng tính chống chịu của tế bào đối với các yếu tố làm biến tính. b.Nhược điểm - Đây là phương pháp có độ bền cơ học kém nhất. 1.3.3.6.2. Cố định tế bào vi sinh vật bằng màng chắn membrane Đây là phương pháp cố định trong các cơ chất có phân tử lượng lớn có thể thẩm thấu vào trong tế bào, các chất mang có thể tái sử dụng.Ở dạng membrane tế bào được cố định thông qua quá trình siêu lọc và vi lọc bằng màng membrane. Màng membrane được tạo ra là polimer có tính bán thấm với những kích thước lỗ đủ nhỏ chỉ cho cơ chất đi vào và sản phẩm đi ra mà tế bào vẫn bị nhốt trong đó. Trước khi tạo màng bao tế bào lại cần phải biết trọng lượng phân tử của tế bào để có thể tạo lỗ phù hợp trên màng. a.Ưu điểm -Mật độ tế bào cố định khá lớn. -Độ bền cơ học cao. -Có thể ứng dụng cho nhiều loại tế bào khác nhau. b.Nhược điểm -Độ bền cơ học kém. -Sự sinh trưởng của tế bào làm phá hủy màng chắn. 1.3.3.7. Giá thể bacterial cellulose (BC) a.Vi khuẩn sản xuất bacterial cellulose (BC) BC được tổng hợp bởi 1 số vi khuẩn. Cấu trúc BC ở mỗi loài tuy khác nhau nhưng con đường tổng hợp và cơ chế điều hòa tổng hợp BC ở mỗi loài có lẽ giống nhau. Các đặc điểm khác nhau thường là các đặc điểm vật lý của sản phẩm BC, như chiều dài chuỗi glucan, tính kết tinh và trạng thái kết tinh của nó. Trạng thái kết tinh khác nhau xácđịnh các tính chất vật lý khác nhau như độ bền, độ hòa tan trong các dung môi, tính chịu ảnh hưởng của các tác nhân gây đột biến. Trong các lòai có thể dùng sản xúât BC thì Acetobacter xylinum có khả năng tổng hợp BC hiệu quả nhất và được tập trung nghiên cứu nhiều nhất. Acetobacter xylinum có dạng hình que, thẳng hoặc hơi cong, có thể di động hoặc không, không sinh bào tử, Gram âm nhưng Gram của chúng có thể già đi hay do điều kiện môi trường. Acetobacter xylinum là vi khuẩn hiei khí bắt buộc, pH tối ưu 5,5, nhiệt độ tối ưu để phát triển là 25-30oC. Nguồn hydrocacbon mà Acetobacter xylinum là gluccse, saccharose, maltose, manitol. Môi trường thích hợp cho sự phát triển của Acetobacter xylinum là nước dừa già. b. Cấu trúc của BC Ngày nay nhờ vào sự phát triển của công nghệ hiện đại người ta đã xác định được cấu trúc của BC.BC có cấu trúc gần giống như cấu trúc của cellulose thực vật, là chuỗi polymer của các nhóm glucose liên kết với nhau qua các nối -1,4-glucan. Các chuỗi đơn phân tử glucan liên kết với nhau bằng liên kết Vander Waals. Qua liên kết hydro, các lớp đơn phân tử này sẽ kết hợp với nhau tạo nên cấu trúc tiền sợi với chiều rộng 1,5nm. Các sợi kết hợp với nhau tạo thành các bó. Các bó kết hợp với nhau tạo thành các dãy có kích thước từ 3-4nm và chiều rộng 70-80nm. Theo Zaaz (1977) thì kích thước của dãy là 3.2x133nm, theo Brown và cộng sự (1976) là 4.1x177nm. So với PC thì BC có độ polimer hóa cao hơn và kích thước nhỏ hơn. BC có độ polymer hóa từ 2000-6000, có khi lên đến 16000 hay 20000.Còn ở PC thì khả năng polymer hóa của nó chỉ từ 13000-14000. Trong tự nhiên, cellulose kết tinh ở hai dạng I vàII,đây là 2 dạng phổ biến nhất. Tùy thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy và giống vi khuẩn mà dạng nào sẽ chiếm ưu thế nhưng thường trong tự nhiên dạng cellulose I được tổng hợp phổ biến hơn. Ngòai ra, cellulose I có thể chuyển thành cellulose II, nhưng cellulose II không thể chuyển ngược thành cellulose I được. c. Đặc điểm của BC BC là 1 sản phẩm polysaccharide ngọai bào của vi khuẩn. BC sẽ bao quanh và bám chặt lấy tế bào vi khuẩn khi nó được tổng hợp. BC có 1 số đặc điểm nổi bật thích hợp cho việc sử dụng làm giá thể cố định tế bào vi sinh vật. BC là dạng polimer có độ tinh sạch cao hơn các dạng cellulose khác, chúng không có ligin và hemicellulose. BC có thể bị phân hủy hòan tòan và có thể phục hồi. Sợi cellulose được tổng hợp có trọng lượng nhẹ, kíchthước ổn định và sức căng cao, có độ bền sinh học cao đặc biệt là cellulose I. Có khả năng giữ nước cao (99%). Trong điều kiện ngập nứơc, nước có thể vận chuyển xen vào các sợi cellulose. Lớp màng cellulose được tổng hợp trực tíêp. Đặc biệt vi khuẩn có thể tổng hợp được các loại màng mỏng và các sợi cực nhỏ. Trong cấu trúc BC có các trục đơn giúp cho lớp màng tạo thành trở nên mạnh hơn. Trong suốt quá trình nuôi cấy chúng ta có thể kiểm sóat được đặc điểm lý học của phân tử cellulose (trọng lượng phân tử và khả năng kết tinh) nhờ quan sát cấu trúc của chúng bằng cách cho thuớc nhuộm vào môi trường nuôi cấy. Có thể tác động lên các gel liên quan đến quá trình tổng hợp cellulose. Từ đó có thể kiểm soát các dạng kết tinh và trọng lượng phân tử của cellulose. Chương 2: VẬT LIỆU - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Mẫu giấm Mẫu giấm thu thập từ ở Tp.HCM, Long An, Bạc Liêu. Số mẫu thu thập ở mỗi vùng o Long An : 2 mẫu o Bạc Liêu : 1 mẫu o Tp HCM : 7 mẫu 2.1.2. Môi trường nuôi cấy [6], [7], [8], [45].  MT1 : Môi trường Ethanol-Cao nấm men - Ethanol 20ml - Cao nấm men 10g - CaCO3 20g - Agar 20g - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml (Ethanol cho vào sau khi hấp khử trùng)  MT2 : Môi trường làm giàu sinh khối - Glucose 10g - Cao nấm men 5g - Pepton 3g - Ethanol 5ml - Acid acetic 0,3ml - Dịch chiết khoai tây 10% 100ml - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml (Khoai tây gọt vỏ rửa sạch, cân 10g, cắt lát mỏng, thêm vào 100ml nước, đun sôi 5 phút, lọc  dịch chiết khoai tây 10%)  MT3: Môi trường lên men dùng định tính acid acetic - Glucose 30g - KH2PO4 15g - (NH4)2SO4 15g - Ethanol 30ml - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml  MT4 : Môi trường lên men dùng định lượng acid acetic - Ethanol 30ml - Glucose 5g - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml - pH 4,5  MT5 :Môi trường nhân giống cấp I - Glucose 10g - Pepton 5g - KH2PO4 3g - MgSO4 3g - (NH4)2SO4 0,1g - Cao nấm men 5g - CH3COOH 0,05g - Ethanol 1ml - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml  MT6 :Môi trường nhân giống cấp II -Glucose 5g - K2HPO4 0,1g - KH2PO4 0,1g - MgSO4 0,5g -(NH4)2SO4 0,1g -Cao nấm men 5g -CH3COOH 0,05g -Ethanol 5ml -Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml  MT7: Môi trường cao thịt- pepton dùng nuôi vi khuẩn Acetic để nhuộm Gram, quan sát hình dạng, kích thước tế bào. - Cao thịt 3g - Pepton 10g - NaCl 5g - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml - pH 7,2  MT8: Môi trường khảo sát ảnh hưởng của pH lên sự tăng trưởng của vi khuẩn Acetic - Glucose 20g - Cao nấm men 5g - Pepton 3g - Ethanol 5ml - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml  MT9: Môi trường khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của vi khuẩn Acetic - Glucose 20g - Cao nấm men 5g - Pepton 3g - Ethanol 5ml - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml  MT10 : Môi trường glutamate xác định khả năng phát triển của vi khuẩn - Sodium glutamate 5g - Glucose 10g - KH2PO4 1g - MgSO4.7H2O 0,2g - KCl 0,1g - Agar 20g - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml - pH 7,2  MT11 : Môi trường mannitol xác định khả năng phát triển của vi khuẩn - Mannitol 25g - Cao nấm men 5g - Pepton 3g - Agar 20g - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml - pH 6  MT 12: Môi trường thử khả năng tạo H2S - Cao thịt 3g - Pepton 10g - NaCl 5g - Na2S2O3 2,5g - Acetate chì 10% 5ml - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml  MT13: Môi trường thử khả năng phân giải dextrin - Dextrin 20g - Cao nấm men 10g - Agar 20g - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml  MT 14: Môi trường thử khả năng phân hủy canxi-lactate thành carbonate của vi khuẩn Acetic - Canxi-lactate 10g - Cao nấm men 10g - Agar 20g - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml - pH 7  MT 15 : Môi trường thử khả năng phân giải gelatin của vi khuẩn Acetic - Gelatin 4g - Glucose 0,05g - Pepton 0,01g - NaCl 3g - K2HPO4 1.5g - KH2 PO4 1,5g - Agar 20g - Nước thịt 5ml - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml (Hoà tan các muối vào 100ml nước cất. Gelatin được hoà tan riêng trong 400ml nước cất, bổ sung đường, pepton, nước thịt. Trộn 2 dung dịch trên với nhau rồi đun sôi vài phút. Agar được hoà tan riêng trong 500ml nước cất khác và trộn chung với các thành phần còn lại thành 1000ml môi trường).  MT 16: Môi trường thử khả năng tạo -pyrone - Glucose 30g - Cao nấm men 10g - CaCO3 20g - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml  MT 17: Môi trường thử khả năng oxy hoá acetate hoặc lactate - Sodium acetate 2g - Cao nấm men 2g - Pepton 3g - Brothymol blu 0,02g - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml - pH 6,4  MT 18:Môi trường lên men sản xuất Bacterial cellulose Môi trường nước dừa già - (NH4)2SO4 8g - (NH4)2HPO4 2g - Sucrose 20g - Nước dừa già 1000ml - pH=4,5 ( Được chỉnh bằng acid acetic đậm đặc ) 2.1.3. Thiết bị máy móc dùng cho quá trình thí nghiệm 1) Bếp từ NAMECO. NAMHONG MECHANICAL COMPANY. Made in VIETNAM 2) Cân kỹ thuật: AND EK – 600G. AC AC DAPTER DC 12 V MFD BY A&D CO. ,LTD 3) Cân phân tích: AND HR – 200G. AC AC DAPTER DC 12 V MFD BY A&D CO. ,LTD 4) Kính hiển vi : SELLER INSTRUMENT MICROSCOPE DIVISION ST.LOUIS, MO. 800-489-2282 5) Lò viba :MICROWAVE OVEN.SANYO. 6) Máy đo OD: THERMO ELECTRON CORPORATION. Made in USA 7) Máy đo pH: ACCUMET MODEL 15 pH METER.OSI – BP 124 – 78312 MAUREPAS CEDEX 8) Máy khuấy từ: SEM – PTV. LTD. Made by AUTRALIA. 9) Máy lắc ngang: 3006 GFL. Made by GERMANY 10) Tủ ấm 300C : PROLABO N0 32519 11) Tủ ấm 340C : PROLABO N0 32519 12) Tủ sấy và khử trùng dụng cụ: EASTOCEAN ZTD 98-A. 13) Tủ lạnh SANYO 14) Nồi hấp khử trùng 15) Tủ cấy vô trùng 16) Thiết bị sục khí : máy khúây từ, cá khuấy từ, thiết bị bơm oxy 17) Thiết bị lên men hồi lưu: thiết bị bơm oxy, máy bơm 18) Một số dụng cụ thí nghiệm khác như: petri, ống nghiệm, erlen, becher, buret, ống đong, pipet, pipetman, đèn cồn, que cấy…. 2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thu thập mẫu giấm Để phân lập được các chủng lên men Acetic tốt, chúng tôi đã thu thập nhiều mẫu giấm từ nhiêu nơi khác nhau, đồng thời các mẫu giấm này phải đạt 2 chỉ tiêu: - Phải là giấm nuôi. - Phải có vị chua. 2.2.2. Khảo sát 1 số đặc tính của mẫu giấm 2.2.2.1. Xác định hàm lượng acid tổng Xác định hàm lượng acid tổng trong các mẫu giấm thu được bằng phương pháp chuẩn độ dùng NaOH 0,1N với phenoltalein 1% làm chỉ thị màu. Hàm lượng acid tổng (qui ra acid acetic) được tính theo công thức: ( V- V0)*x*0a(g/l) = 006*1000; Số ml dịch lên men chuẩn Trong đó: V: số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ số ml dịch lên men chuẩn. V0 : số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu thử không. x :số hiệu chỉnh NaOH 0,1N so với acid oxalic 0,1N. 0,006 : Số mg acid acetic tương ứng 1ml NaOH 0,1N. 2.2.2.2. Xác định pH Xác định pH của mẫu giấm bằng máy đo pH. 2.2.2.3. Phân lập và khảo sát một số đặc điểm phân loại. 2.2.2.3.1. Phân lập Trong môi trường có sử dụng nguồn cacrbon là ethanol và có sự hiện diện của CaCO3, (MT1) các khuẩn lạc tạo được vòng phân giải xung quanh (làm tan CaCO3) có thể được xem là dự tuyển của vi khuẩn sinh acid acetic. Tiến hành pha loãng mẫu giấm ở các độ pha loãng khác nhau: 10-1, 10-2, 10-3 ,10-4,10-5 ,10-6. Ủ trong tủ ấm 300C trong 3 ngày. Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ có vòng làm tan CaCO3. Làm thuần bằng cách cấy ria nhiều lần cho đến khi quan sát chỉ còn 1 loại khuẩn lạc trên môi trường. Kiểm tra độ thuần khiết bằng cách quan sát hình dạng khuẩn lạc, nhuộm Gram. 2.2.2.3.2..Khảo sát đặc điểm phân loại  Dạng khuẩn lạc Tiến hành cấy vi khuẩn phân lập được trên bề mặt môi trường ethanol- cao nấm men có CaCO3 (MT1) sao cho có được những khuẩn lạc tách rời. Nuôi ở nhiệt độ phòng và theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc. Sau 3 ngày quan sát và mô tả đặc điểm của khuẩn lạc.  Hình thái vi khuẩn  Khả năng di động Quan sát khả năng di động của vi khuẩn dưới dạng tiêu bản giọt treo. Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường làm giàu sinh khối (MT2)  Nhuộm Gram Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường cao thịt-pepton (MT7) trong 16-24 giờ. Hút 1ml dịch vi khuẩn pha loãng trong nước cất vô trùng để mật độ tế bào trong thị trường kính hiển vi vừa phải và dễ quan sát. Làm vết bôi vi khuẩn với đối chứng là Bacillus Gram dương, E.coli Gram âm. Sau khi nhuộm, soi kính với vật kính dầu 100X.  Đặc điểm sinh lý, sinh hoá  Khả năng oxy hoá ethanol thành acid acetic  Định tính acid acetic tạo thành Nuôi các chủng khảo sát trên môi trường lên men định tính (MT3) ở nhiệt độ phòng trong 4 ngày. Cho vào ống nghiệm 3ml dịch lên men và 1ml dung dịch NaOH . Nhỏ vào ống nghiệm vài giọt dung dịch FeCl3 5%, lắc đều ống nghiệm và đun sôi trên ngọn đèn cồn. Nếu dung dịch có acid acetic thì sẽ có màu đỏ thẫm do sắt acetate tạo thành. Đối chứng dương là ống đựng acid acetic chuẩn, đối chứng âm là môi trường không nuôi cấy vi khuẩn. Phản ứng diễn ra theo phương trình sau: CH3COOH +NaOH  CH3COONa +H2O CH3COONa + FeCl3  Fe(CH3COO)3 +3NaCl Màu đỏ thẫm  Định lượng acid acetic tạo thành Sau khi nuôi các chủng khảo sát trên môi trường tăng sinh (MT2) rồi chuyển sang môi trường nhân giống cấp 1 (MT5), môi trường nhân giống cấp 2 (MT6). Sau 7 ngày định lượng acid acetic tạo ra theo phương pháp xác định acid tổng.  Khảo sát đặc tính sinh catalase Nguyên tắc Catalase xúc tác sự phân giải H2O2 thành H2O và O2. Nếu vi khuẩn khảo sát có khả năng tạo catalase thì khi nhỏ H2O2 vào dịch nuôi cấy vi khuẩn đó, H2O2 bị phân giải thành H2O và O2, gây hiện tượng sủi bọt. O2 2H2O2 2 H2O Catalase Thực hiện Nuôi cấy các chủng khảo sát trong ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh khối (MT2) trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Nhỏ 1 giọt dịch nuôi cấy lên tấm lam và nhỏ từ từ H2O2 vào. Quan sát và ghi nhận hiện tượng.  Khả năng tạo H2S Đây là đặc điểm của vi sinh vật có khả năng sử dụng các amino acid trong môi trường có Thiosulfate Natri. Chúng tạo thành những đường cấy màu đen do tạo được sulfua chì theo phản ứng sau: COOH.CH.NH2.CH2S.S.CH2.CH.NH2.COOH + H2 + 4H  2H2S + 2NH3 + 2CH3COOH+ 2HCOOH H2S + Pb(CH3COO)2  PbS + 2CH3COOH Sulfua chì màu đen Thực hiện Cấy chủng khảo sát lên ống thạch đứng chứa môi trường thử khả năng tạo H2S (MT13) bằng những đường cấy thẳng, sâu, gần sát thành ống nghiệm. Ủ ở nhiệt độ phòng, sau 2 ngày, quan sát những đường cấy, nếu vi khuẩn tạo H2S thì đường cấy sẽ có màu đen do tạo sulfua chì.  Khả năng oxy hoá acetate hoặc lactate Tiến hành theo phương pháp của Leifson. Đây là phương pháp nhanh và dễ dàng nhất để phân loại vi khuẩn Acetic đến cấp giống. Nếu chủng khảo sát có khả năng oxy hoá acetate hoặc lactate thì chủng đó thuộc giống Acetobacter còn ngược lại chủng đó thuộc giống Gluconobacter . Nguyên tắc Sử dụng môi trường sodium acetate hoặc sodium lactate có bromothymol-blue làm chất chỉ thị màu. Chỉ thị màu này có pH nhạy cảm trong khoảng pH 5,6-7,4 và biến đổi màu từ màu vàng sang xanh dương. Khi acetate hoặc lactate bị oxy hoá thì môi trường trở nên kiềm tính. Bằng cách quan sát sự chuyển màu của môi trường (vàng chuyển sang xanh dương) cho phép đánh giá được khả năng oxy hoá acetate hoặc lactate của chủng vi sinh vật khảo sát. Thực hiện Cấy chủng khảo sát vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường sodium acetate. Nuôi ở nhiệt độ 300C sau 7 ngày quan sát sự chuyển màu của môi trường. 2.2.3. Khảo sát đặc điểm lên men acetic 2.2.3.1.Chọn giống Trong quá trình lên men định lượng acid acetic tạo ra chúng tôi xác định được 2 chủng tạo acid acetic cao nhất là chủng A3 và A6. Do đó những thí nghiệm sau chúng tôi quyết định chọn 2 chủng này để khảo sát. 2.2.3.2. Chọn môi trường  Xác định pH thích hợp Tiến hành nuôi các chủng khảo sát trong môi trường tăng sinh khối (MT2) trong 24 giờ. Đối với mỗi chủng khảo sát huyền phù thật kỹ ống nghiệm chứa dịch nuôi cấy. Sau đó dùng pipetman hút chính xác 1 lượng dịch nuôi cấy (100l) phân vào các ống nghiệm chứa sẵn môi trường khảo sát ở các pH (MT8) tương ứng: 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 6,8. Nuôi các chủng cần khảo sát trong 4 ngày ở 300C, đo OD ở bước sóng 660nm và ghi nhận kết quả.  Xác định nhiệt độ thích hợp Tiến hành nuôi cấy các chủng khảo sát trên môi trường tăng sinh khối (MT2) trong 24giờ. Đối với mỗi chủng khảo sát huyền phù thật kỹ ống nghiệm chứa dịch nuôi cấy. Sau đó dùng pipetman hút chính xác 1 lượng dịch nuôi cấy (100l) phân vào các ống nghiệm chứa sẵn môi trường khảo sát nhiệt độ (MT 9 ) tương ứng là 150C, 180C, 250C , 300C ,350C, 370C, 400C, 450C. Đo OD ở bước sóng 660nm và ghi nhận kết quả.  Mật độ giống ban đầu thích hợp cho quá trình lên men Nuôi các chủng khảo sát trên môi trường tăng sinh và nhân giống cấp I, II và chuyển vào m._.