Cải tiến qui trình nhân giống gừng (Zingiber officinale Rese) bằng phương pháp nuôi cấy

TRÌNH NHÂN GIỐNG GỪNG (Zingiber officinale Rosc.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ Chủ nhiệm đề tài: ThS. HUỲNH TRƯỜNG HUÊ Long Xuyên, tháng 10 năm 2009 CẢI TIẾN QUI TRÌNH NHÂN GIỐNG GỪNG (Zingiber officinale Rosc.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TÓM LƯỢC Đề tài: “Cải tiến qui trình nhân giống gừng (Zingiber officinale Rosc.) bằng phương pháp nuôi cấy mô” được thực hiện nhằm để tạo nguồn gừng giống in-vitro, khảo sát nồng độ kích thích tố tối ưu cho việc nhân giống gừng và xây dựng qui trình nhân giống gừng trong điều kiện in vitro. Đề tài được thực hiện với 4 thí nghiệm, kết quả đạt được như sau: - Xử lý khử trùng mẫu với hóa chất Ca(OCl)2 đạt hiệu quả khử trùng cao nhất, cho kết quả mẫu sống vô trùng cao (70%) trong thời gian 25-30 phút ở nồng độ 10%. - Nhân chồi với kích thích tố BA bổ sung vào môi trường MS ở nồng độ 2 mg.l-1, chồi gừng tăng trưởng và phát triển nhanh. - Kích thích tạo rễ ở nồng độ 1 mg.l-1 NAA trên môi trường MS, chồi gừng có số rễ và chiều dài rễ cao nhất. - Tạo cây hoàn chỉnh với 2 kích thích tố BA-NAA được bổ sung vào môi trường MS ở nồng độ 2-0,5 mg.l-1 và 1-1mg.l-1, cây có hệ thống rễ và chồi phát triển tốt nhất. Sau đó, cây con được thuần hóa trong điều kiện nhà lưới đạt tỷ lệ sống trên 90%. Từ các kết quả thí nghiệm, xây dựng được quy trình nhân giống gừng bằng phương pháp nuôi cấy mô. i MỤC LỤC Nội dung Tóm lược ……………………………………………………………………… Mục lục ……………………………………………………………………….. Danh sách bảng ………………………………………………………………. Danh sách hình ……………………………………………………………….. Danh sách phụ chương ………………………………………………………. Chương I MỞ ĐẦU …………………………………………………………... Trang i ii iv v vi 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 6 6 6 6 7 7 7 7 7 7 8 8 9 10 A. MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ……………………………………………. I. MỤC TIÊU …………………………………………………………………………………... II. NỘI DUNG …………………………………………………………………………………. B. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU ……………………………………………. I. ĐỐI TƯỢNG ………………………………………………………………………………… II. PHẠM VI NGHIÊN CỨU ………………………………………………………………….. C. CƠ SỞ LÝ LUẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……………………………… I. CƠ SỞ LÝ LUẬN …………………………………………………………………………… 1. Phân loại ……………………………………………………………………. 2. Nguồn gốc phân bố …………………………………………………………. 3. Đặc tính sinh học ……………………………………………………………. 4. Bệnh hại trên củ gừng ………………………………………………………. 5. Công dụng …………………………………………………………………... 6. Các phương pháp nhân giống cây gừng …………………………………….. 7. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật ……………… 7.1. Chọn lựa mẫu cấy ………………………………………………………. 7.2. Khử trùng mẫu cấy ……………………………………………………... 7.3. Môi trường nuôi cấy ……………………………………………………. 7.4. Chất điều hòa sinh trưởng ……………………………………………… 7.5. Điều kiện nuôi cấy ……………………………………………………... II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………………………………………………………... 1. Phương tiện nghiên cứu …………………………………………………….. 1.1. Vật liệu …………………………………………………………………. 1.2. Địa điểm thực hiện ……………………………………………………... 1.3. Dụng cụ và hóa chất ……………………………………………………. 2. Phương pháp nghiên cứu ……………………………………………………. 2.1. Môi trường nuôi cấy …………………………………………………... 2.2. Chuẩn bị mẫu cấy ……………………………………………………... 2.3. Cách khử mẫu và nuôi cấy ……………………………………………. 2.4 Bố trí thí nghiệm ………………………………………………………. 2.4.1. Khử mẫu …………………………………………………………... 2.4.2. Nhân chồi …………………………………………………………. 2.4.3. Tạo rễ ……………………………………………………………... 2.4.4. Tạo cây hoàn chỉnh …..…………………………………………. 2.4.5. Chuyển cây ra vườn ươm …………………………………………. 2.5. Phân tích số liệu ………………………………………………………. 10 11 11 11 12 Chương II KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ …….. I. KHỬ MẪU …………………………………………………………………………………... 1. Hypocanxiclorua [Ca(OCl)2] ……………………………………………….. 2. Hyposodiumchlorua (NaOCl – Javen) ……………………………………… ii II. NHÂN CHỒI ………………………………………………………………………………... III. TẠO RỄ …………………………………………………………………………………….. IV. TẠO CÂY ………………………………………………………………………………….. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ …………………………………………………... A. KẾT LUẬN …………………………………………………………………………………. B. ĐẾ NGHỊ ……………………………………………………………………………………. Tài liệu tham khảo …………………………………………………………… 13 15 19 28 28 29 30 iii DANH SÁCH BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1: Bảng 2: Bảng 3: Bảng 4: Bảng 5: Bảng 6: Bảng 7: Bảng 8: Nồng độ và thời gian của chất khử mẫu Ca(OCl)2 và Javen ………….. Nồng độ kích thích tố BA và NAA bổ sung vào môi trường MS ……... Ảnh hưởng của nồng độ Ca(OCl)2 và thời gian khử trùng lên mẫu cấy.. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung dịch Javen và thời gian khử trùng lên mẫu cấy ……………………………………………………………………. Sự tăng trưởng của chồi gừng ở thời điểm 4 và 8 tuần sau khi cấy ….. Sự phát triển của rễ ở thời điểm 2 tuần, 4 tuần và 6 tuần sau khi cấy ... Ảnh hưởng của kích thích tố BA và NAA lên quá trình sinh trưởng của chồi gừng ở thời điểm 4 tuần SKC ………………………………. Ảnh hưởng của kích thích tố BA và NAA lên quá trình sinh trưởng của chồi gừng ở thời điểm 8 tuần SKC ………………………………. 8 9 11 12 14 16 20 21 iv DANH SÁCH HÌNH Tên hình Trang Hình 1: Hình 2: Hình 3: Hình 4: Hình 5: Hình 6: Hình 7: Hình 8: Hình 9: Hình 10: Hình 11: Hình 12: Hình 13: Hình 14: Hình 15: Hình 16: Hình 17: Hình 18: Hình 19: Mẫu sống vô trùng sau 2 tuần nuôi cấy ……………………………… Chồi gừng bổ sung BA 2 mg.l-1 giai đoạn 4 tuần sau khi cấy ………... Chồi gừng bổ sung BA 2 mg.l-1 giai đoạn 8 tuần sau khi cấy ............... Tăng trưởng của rễ ở nghiệm thức đối chứng 4 tuần SKC ................... Tăng trưởng của rễ bổ sung 0,5 và 1 mg.l-1 NAA ở giai đoạn 4 tuần SKC ....................................................................................................... Tăng trưởng của rễ bổ sung 1 và 2 mg.l-1 NAA ở giai đoạn 4 tuần SKC ....................................................................................................... Tăng trưởng của rễ bổ sung 2,5 và 3 mg.l-1 NAA giai đoạn 4 tuần SKC …………………………………………………………………... Tăng trưởng của rễ bổ sung 4 và 5 mg.l-1 NAA giai đoạn 4 tuần SKC Chồi gừng bổ sung 1 mg.l-1 NAA giai đoạn 6 tuần SKC …………….. Tăng trưởng của chồi gừng giai đoạn 6 tuần SKC …………………… Chồi gừng bổ sung 2-0,5 mg.l-1 BA-NAA giai đoạn 4 tuần sau khi cấy…………………………………………………………………….. Chồi gừng bổ sung 2-05 mg.l-1 BA-NAA giai đoạn 8 tuần sau khi cấy Chồi gừng bổ sung 2-05 mg.l-1 BA-NAA ở giai đoạn 8 tuần sau khi cấy so với đối chứng………………………………………… Chồi gừng bổ sung 1-1 mg.l-1 BA-NAA giai đoạn 8 tuần sau khi cấy.. Cây gừng bổ sung 0,5-1 mg.l-1 BA-NAA giai đoạn 8 tuần sau khi cấy Cây gừng bổ sung 2-1 mg.l-1 BA-NAA giai đoạn 8 tuần sau khi cấy.... Cây gừng in-vitro trồng ươm trong điều kiện nhà lưới ………………. Cây gừng sau 2 tuần trồng ươm trong điều kiện nhà lưới ……………. Cây gừng sau 2 tuần trồng trong bầu trong điều kiện nhà lưới ………. 13 15 15 17 17 18 18 18 18 19 22 23 23 24 24 25 25 26 26 v vi PHỤ CHƯƠNG Tên phụ chương Trang Phụ chương 1: Phụ chương 2: Phụ chương 3: Phụ chương 4: Phụ chương 5: Phụ chương 6: Phụ chương 7: Phụ chương 8: Phụ chương 9: Phụ chương 10: Phụ chương 11: Phụ chương 12: Phụ chương 13: Phụ chương 14: Phụ chương 15: Phụ chương 16: Phụ chương 17: Phụ chương 18: Phụ chương 19: Phụ chương 20: Phụ chương 21: Phụ chương 22: ANOVA số chồi của thí nghiệm nhân chồi ở thời điểm 4 tuần SKC ……………………………………………………………. ANOVA số chồi của thí nghiệm nhân chồi ở thời điểm 8 tuần SKC ……………………………………………………………. ANOVA số lá của thí nghiệm nhân chồi ở thời điểm 4 tuần SKC ……………………………………………………………. ANOVA số lá của thí nghiệm nhân chồi ở thời điểm 8 tuần SKC ……………………………………………………………. ANOVA cao chồi của thí nghiệm nhân chồi ở thời điểm 4 tuần SKC ……………………………………………………………. ANOVA cao chồi của thí nghiệm nhân chồi ở thời điểm 8 tuần SKC ……………………………………………………………. ANOVA số rễ của thí nghiệm tạo rễ ở thời điểm 2 tuần SKC … ANOVA số rễ của thí nghiệm tạo rễ ở thời điểm 4 tuần SKC … ANOVA số rễ của thí nghiệm tạo rễ ở thời điểm 6 tuần SKC … ANOVA dài rễ của thí nghiệm tạo rễ ở thời điểm 2 tuần SKC .. ANOVA dài rễ của thí nghiệm tạo rễ ở thời điểm 4 tuần SKC .. ANOVA dài rễ của thí nghiệm tạo rễ ở thời điểm 6 tuần SKC .. ANOVA số chồi của thí nghiệm tạo cây ở thời điểm 4 tuần SKC …………………………………………………………… ANOVA số chồi của thí nghiệm tạo cây ở thời điểm 8 tuần SKC ……………………………………………………………. ANOVA số lá của thí nghiệm tạo cây ở thời điểm 4 tuần SKC ANOVA số lá của thí nghiệm tạo cây ở thời điểm 8 tuần SKC ANOVA cao chồi của thí nghiệm tạo cây ở thời điểm 4 tuần SKC ……………………………………………………………. ANOVA cao chồi của thí nghiệm tạo cây ở thời điểm 8 tuần SKC ……………………………………………………………. ANOVA số rễ của thí nghiệm tạo cây ở thời điểm 4 tuần SKC ANOVA số rễ của thí nghiệm tạo cây ở thời điểm 8 tuần SKC ANOVA dài rễ của thí nghiệm tạo cây ở thời điểm 4 tuần SKC ANOVA dài rễ của thí nghiệm tạo cây ở thời điểm 8 tuần SKC 32 32 32 32 32 33 33 33 33 33 34 34 34 34 34 35 35 35 35 35 36 36 Danh mục các từ viết tắt BA: Benzyladenine NAA: α-Naphtalenacetic acid Kn: Kinetin GA: Gibberellic Acid MS: Murashige và Skoog SKC: sau khi cấy w/v: trọng lượng/thể tích v/v: thể tích/thể tích Chương I MỞ ĐẦU Gừng (Zingiber officinale Rosc.) thuộc họ Zingiberaceae là một trong những cây quan trọng của vùng nhiệt đới. Gừng là cây thân thảo, sống lâu năm, thân ngầm phát triển dưới đất còn gọi là củ. Củ gừng có hương thơm và vị cay, được sử dụng làm gia vị trong chế biến thức ăn, góp phần tăng thêm hương vị cho một số loại thực phẩm. Gừng cũng là cây thảo dược, có nhiều đặc tính dược liệu quí rất có giá trị trong dược phẩm, được dùng làm thuốc và làm nguồn nguyên liệu bào chế thuốc điều trị một số bệnh như cảm lạnh, ho, nôn, mửa… Ở Ấn Độ và Trung Quốc từ thời cổ xưa đã sử dụng gừng điều trị bệnh trên người và gia súc (Ravindran và Nirmal Babu, 2005). Gừng cho năng suất rất cao, có thể đạt từ 40-80 tấn.ha-1 (năng suất bình quân 60 tấn.ha- 1). An Giang có diện tích đất trồng gừng trên 60 ha, phân bố ở các huyện như Tri Tôn, An Phú, Châu Phú và Chợ mới. Trong đó, huyện Chợ Mới có diện tích trồng gừng cao nhất, khoảng 53 ha (Số liệu tổng hợp từ phòng Nông Nghiệp các Huyện – Sở Nông Nghiệp An Giang, 2005). Tuy nhiên, gừng rất dễ bị sâu bệnh tấn công, nhất là bệnh thối củ do nấm Pythium sp. và vi khuẩn Erwinia sp. gây ra, làm thiệt hại rất lớn cho gừng giống cũng như gừng thương phẩm. Hơn nữa, cây gừng sinh sản vô tính bằng củ dưới đất, hệ số nhân này thường rất thấp 6-10 lần. Do đó, để có được năng suất 15-20 tấn.ha-1 phải cần ít nhất 2-4 tấn gừng giống. Cho nên, việc tồn trữ và giữ giống hàng năm gặp nhiều khó khăn và rất tốn kém, vì cần số lượng lớn và dịch bệnh thường xuyên tấn công gừng giống. Nhân giống gừng bằng phương pháp nuôi cấy mô sẽ tạo ra được sản lượng lớn cây giống sạch bệnh phục vụ cho sản xuất, khắc phục được những khó khăn trong việc lưu giữ và tồn trữ giống, giúp cho nông dân chủ động được mùa vụ một cách dễ dàng, không tốn kém diện tích cũng như chi phí tồn trữ giống. Vì vậy, đề tài “Cải tiến qui trình nhân giống gừng (Zingiber officinale Rosc.) bằng phương pháp nuôi cấy mô” được tiến hành để đáp ứng nhu cầu gừng giống cho thị trường, giúp ổn định sản xuất và đời sống của nông dân. A. MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU I. MỤC TIÊU - Tạo nguồn gừng giống in-vitro - Khảo sát nồng độ kích thích tố tối ưu cho việc nhân giống gừng - Xây dựng qui trình nhân giống gừng trong điều kiện in-vitro II. NỘI DUNG Thực hiện nuôi cấy và nhân giống gừng trong điều kiện in vitro, gồm các bước sau: 1. Tạo nguồn mẫu in vitro: khảo sát nồng độ và thời gian của các chất khử trùng mẫu (Hypocanxiclorite và Javen) 2. Nhân giống in-vitro: khảo sát nồng độ kích thích tố Auxin, Cytokinin thích hợp cho việc nhân chồi, tạo rễ và tạo cây 3. Chuyển cây ra vườn ươm 1 B. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU I. ĐỐI TƯỢNG Đề tài được thực hiện trên đối tượng cây gừng (Zingiber officinale Rosc.) được nhân giống trong điều kiện in vitro. II. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Nhân giống cây gừng trong điều kiện in vitro và thuần dưỡng cây con trong nhà lưới. Thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Khoa Nông Nghiệp & TNTN, trường Đại học An Giang, từ tháng 4-2008 đến tháng 2-2009. C. CƠ SỞ LÝ LUẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I. CƠ SỞ LÝ LUẬN 1. Phân loại Gừng (Zingiber officinale Rosc.) được nhà thực vật học người Anh William Roscoe (1753 - 1831) đặt tên vào năm 1807. Theo phân loại thực vật cây gừng thuộc: Ngành: Angiospermae Lớp: Monocotyledonae Bộ: Zingiberales Họ: Zingiberaceae Chi: Zingiber Loài: Officinale 2. Nguồn gốc phân bố Gừng là một trong những loài cây trồng phổ biến khắp thế giới, có nguồn gốc từ trung tâm Châu Á, được trồng ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Gừng đã trở thành cây trồng kinh tế cho nông dân ở Châu Mỹ La-tinh, Châu Phi và Đông Nam Á. Gần 50% sản lượng gừng thu hoạch xuất xứ từ Ấn Độ, một phần từ Châu Phi, Brazil, Jamaica. Trong vùng Đông Nam Á, Trung Quốc là nước có diện tích trồng gừng cao nhất (50.000 đến 80.000 ha), kế đến là Thái Lan, Hàn Quốc và Việt Nam (Ravindran và Nirmal Babu, 2005). Ở Việt Nam, gừng được trồng từ rất lâu đời, ở khắp mọi nơi trên khắp các địa phương từ Bắc vào Nam (Lã Đình Mỡi và ctv., 2002). Tuy nhiên, gừng chỉ được trồng rải rác trong các vườn hộ gia đình (Nguyễn Ngọc Bình và Phạm Đức Tuấn, 2001). 3. Đặc tính sinh học Gừng là cây thân thảo, đa niên, cao từ 50-100 cm tùy theo đất, có nơi cao hơn 150 cm. Gừng phát triển thân ngầm dưới đất, có nhiều đốt, mỗi đốt có mầm ngủ, khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ đâm chồi thành cây. Bẹ lá ôm sát nhau phát triển thành thân giả trên mặt đất. Lá đơn mọc cách (so le), lá trơn, không có cuống, hình lưỡi mác, mặt bóng nhẵn, mép lá phẳng, gân giữa hơi trắng nhạt. Trục hoa mọc từ gốc (củ gừng), dài khoảng 20 cm, hoa tự tạo thành bông, mọc sát nhau, hoa dài khoảng 5 cm, rộng khoảng 2-3 cm, lá bắc hình trứng, mép lưng màu vàng. Đài hoa dài khoảng 1 cm, có 3 răng ngắn, có 3 cánh hoa, màu vàng hơi nhạt, mép cánh hoa màu tím, nhị hoa cũng màu tím. 2 Tuy nhiên, ở nước ta gừng trồng ít ra hoa hoặc chưa ra hoa đã thu hoạch củ để bán (Mai Văn Quyền và ctv., 2001). Cây gừng được trồng phổ biến ở vùng khí hậu nhiệt đới ẩm, có nhiệt độ trung bình hàng năm từ 21-270C, lượng mưa từ 1500-2500 mm.năm-1, từ độ cao vài mét đến 1500 m trên mặt nước biển. Ở các vùng núi cao, khí hậu lạnh, nhiều sương không thích hợp đối với cây gừng (Nguyễn Ngọc Bình và Phạm Đức Tuấn, 2001). 4. Bệnh hại trên củ gừng Bệnh thối củ gừng do vi khuẩn Pseudomonas sp., Ervinia sp. gây ra. Cây gừng đang xanh tốt bổng dưng bị héo đột ngột vào giữa trưa, vài ngày sau toàn bộ cây bị vàng, khi nhổ lên thấy đỉnh sinh trưởng của gừng có nhựa đục. Phần củ bị nhiễm bệnh nhũn nước, có màu đen, dịch trắng sữa tiết ra trên bề mặt cắt. Đây là bệnh rất nguy hiểm và gây thiệt hại lớn đến năng suất gừng thương phẩm cũng như gừng giống vì vi khuẩn gây bệnh này lưu tồn lâu dài trong đất và là nguồn lây nhiễm giữa các củ gừng (Chi cục bảo vệ thực vật An Giang, 1998) Bệnh thối củ do nấm Rhizoctonia solani, Pythium sp., Fusarium sp. gây ra. Bệnh thường gây hại ở phần củ dưới đất nên khó phát hiện, trên thân gừng không có biểu hiện gì khi củ bị thối, chỉ khi củ bị thối nhũn hoàn toàn cây bị gãy gục hoặc bị héo nhẹ khi trời nắng. Bệnh thường ít hoặc không gây hại trên thân gừng, chỉ khi bụi gừng nào dày đặc thì bệnh mới gây hại đến phần thân (Trần Văn Hòa và ctv., 2000). Theo Nguyễn Bá Linh (2006), Nguyễn Phú Dũng (2008), kết quả điều tra nông dân trồng gừng tại Chợ Mới – An Giang, 100% hộ điều tra đều xuất hiện bệnh thối củ gừng. Mức độ gây hại bệnh rất cao và rất nguy hiểm khi gặp điều kiện thời tiết bất lợi, vì tốc độ lây lan rất nhanh, có thể làm nông dân mất trắng. Tuy nhiên, bệnh thối củ hiện nay chưa có thuốc đặc trị, chỉ phòng bệnh là chính. 5. Công dụng Gừng là một trong những loại cây trồng được sử dụng làm nguồn dược liệu phổ biến nhất trong các phương pháp điều trị truyền thống ở Ấn Độ, Trung quốc và Nhật Bản. Người Ấn Độ cổ xưa xem gừng là cây dược liệu quí và là nguồn nguyên liệu dùng chế biến nước uống và làm nhiều loại mứt khác nhau. Gừng là loại gia vị được sử dụng rất phổ biến trong các món ăn, trong các công nghệ chế biến và còn là nguyên dược liệu quí dùng trong y học. Gừng có những tính chất kháng vi trùng mạnh và chống oxy-hóa trong bảo quản thực phẩm. Trong củ gừng có chứa các hợp chất như: gingeron, shogaol và zingerone… làm cho gừng có hương thơm và mùi vị hăng nồng. Bên cạnh đó, còn chứa các enzymes và các chất chống oxy hóa (antioxidants). Chất gingeron có nhiều trong gừng tươi và bị biến đổi thành shogaol khi gừng khô. Shogaol có mùi hăng nồng và có hiệu quả chống viêm, giảm đau mạnh. Gingerol hổ trợ đối kháng độc tố trong gan bằng cách gia tăng bài tiết ra mật và còn là chất ức chế sinh tổng hợp prostaglandin (Chu Hữu Tín, 2006). Chất trích từ gừng đã được nghiên cứu rộng rãi trong nhiều hoạt động sinh học gồm có thuốc kháng vi khuẩn (antibacterial), thuốc kháng co giật (anticonvulsant), thuốc giảm đau (analgesic), thuốc chống loét (antiulcer), thuốc chống bài tiết trong dạ dày (gastric antisecretory), thuốc chống khối u (antitumor), thuốc kháng nấm (antifungal), thuốc trị co thắt (antispasmodic), thuốc chống phát sinh dị ứng (antiallergenic) và những hoạt động khác (Chu Hữu Tín, 2006). 3 6. Các phương pháp nhân giống cây gừng Hiện nay, gừng được trồng phổ biến bằng cách tách củ (gừng giống) có chứa chồi ngủ (mắt mầm) và đem giâm xuống đất. Sau một thời gian sẽ ra rễ, chồi phát triển sống thành cây độc lập và hoàn chỉnh. Tuy nhiên, số lượng chồi ngủ không nhiều, nếu trồng gừng tập trung trên phạm vi lớn thì phải dự trữ lượng gừng giống khá lớn (1 ha cần khoảng 3 tấn củ gừng giống hoặc có thể trữ lại 20-25% sản phẩm thu hoạch để làm giống). Hơn nữa, cây gừng hiếm khi ra hoa, nếu có hoa thì cũng khó có hạt hoặc hạt lép không thể nảy mầm, cho nên không thể nhân giống gừng từ hạt. Nhân giống gừng bằng phương pháp nuôi cấy mô sẽ tạo ra được số lượng lớn cây con đồng nhất và sạch bệnh, ít tốn kém chi phí và không gian tồn trữ giống. Nhân giống gừng bằng phương pháp nuôi cấy mô đã được thực hiện bởi Lâm Ngọc Phương (1997), Lê Trần Như Thảo (2005), Hosoki và Sagawa (1977), Yuji Noguchi và Osamu Yamakawa (1988), Wang (1989), Balachandran et al. (1990), Sharma và Singh (1997), Rout et al. (2001a, b), Yongqiang Zheng et al. (2008). Theo kết quả nghiên cứu của Lâm Ngọc Phương (1997), sử dụng môi trường MS có bổ sung kích thích tố BA 1-3 mg.l-1 thì thích hợp cho nhân chồi và khi bổ sung vào môi trường nhân chồi 0,5mg.l-1 NAA để tạo cây hoàn chỉnh có bộ rễ khỏe mạnh. Danh Giàu (2003) sử dụng BA trong khoảng 2-2,5 mg.l-1 chồi phát triển tốt. Yuji Noguchi và Osamu Yamakawa (1988), đã sử dụng 1mg.l-1 BA bổ sung vào môi trường MS chồi gừng phát triển tốt, thích hợp cho việc nhân chồi. Từ các kết quả nghiên cứu nhận thấy, khi sử dụng nồng độ BA cao sẽ kích thích tạo chồi nhưng ức chế tạo rễ, còn NAA thì không thể hiện sự ảnh hưởng giữa việc tạo chồi và rễ. Để gia tăng tần suất nhân nhanh gừng giống sạch bệnh, Sharma và Singh (1997) đã sử dụng môi trường MS kết hợp với 2 mg.l-1 Kn và 2 mg.l-1 NAA. Yongqiang Zheng et al. (2008), đã khảo sát sự ảnh hưởng của các kích thích tố Kn, GA và NAA lên việc hình thành củ gừng in- vitro. Rout et al. (2001b), đã khảo sát sự ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng và điều kiện nuôi cấy lên việc nhân chồi và hình thành củ gừng in-vitro. Để nhân nhanh chồi gừng sử dụng môi trường MS bổ sung 6 mg.l-1 BA, 1,5 mg.l-1 IAA, 3 mg.l-1 Adeninsulfate và 3% (w/v) sucrose. Tạo củ gừng in-vitro sử dụng môi trường MS bổ sung 1 mg.l-1 BA, 1 mg.l-1 IAA và từ 3-8% (w/v) sucrose, được nuôi cấy trong 8 tuần. Để kích thích hình thành hệ thống rễ trên chồi gừng, Rout et al. (2001a) đã sử dụng kích thích tố IAA hoặc IBA hoặc NAA. Khi sử dụng kích thích tố IAA hoặc IBA ở nồng độ 0,5-1 mg.l-1 bổ sung vào môi trường MS/2, rễ xuất hiện sau 7-9 ngày nuôi cấy. Còn khi sử dụng kích thích tố NAA rễ xuất hiện sau 6-7 ngày nuôi cấy. 7. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật 7.1. Chọn lựa mẫu cấy Sự chọn mẫu cấy là một trong những khâu quan trọng trong nuôi cấy mô, vì nó quyết định đến sự thành công hay thất bại trong việc tạo nguồn mẫu ban đầu. Mô non như chồi đỉnh, chồi nách hay chồi bất định sẽ tái sinh tốt hơn mô già của cùng một cây. Chồi hoa non hay cụm hoa non cũng thường có khả năng tái sinh rất tốt. Để có được kết quả tốt cần chọn mẫu cấy có tỷ lệ mô phân sinh lớn hay các tế bào có khả năng biểu hiện tính toàn năng (Dương Công Kiên, 2002). 4 7.2. Khử trùng mẫu cấy Trong nuôi cấy mô, khử trùng mẫu là khâu rất quan trọng nhất, vì chúng sẽ tạo ra được nguồn mẫu in-vitro ban đầu. Mục đích của khử trùng mẫu là loại hết những vi sinh vật gây nhiễm mẫu bám trên mẫu, nhằm tạo được lượng mẫu sống và vô trùng cao nhất cho nuôi cấy. Khử trùng mẫu cấy thường sử dụng các hoá chất có khả năng tiêu diệt vi sinh vật như: calcium hypochlorite [Ca(ClO)2], thủy ngân clorua (HgCl2), Chloramin B, sodium hypochlorite (NaOCl – nước Javen), oxy già (H2O2), nước Brome, các chất kháng sinh… Trong đó, Ca(ClO)2, NaOCl được sử dụng nhiều hơn vì chúng có độc tính thấp đối với mô cấy và an toàn cho người sử dụng, không gây ức chế sinh trưởng và hiệu quả diệt khuẩn tốt, mà giá thành lại rẻ. Tuy nhiên, khả năng diệt khuẩn của hóa chất phụ thuộc vào thời gian, nồng độ xử lý và mức độ xâm nhập của vi sinh vật trên bề mặt mô cấy (Vũ Văn Vụ và ctv., 2007). 7.3. Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy giữ vai trò quan trọng trong sự thành công của nuôi cấy mô. Các thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy bao gồm: nước, muối khoáng (đa lượng và vi lượng), nguồn cacbon, vitamin, chất làm đặc môi trường (agar) và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tùy theo loài, tùy theo bộ phận nuôi cấy, tùy theo từng giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy (Vũ Văn Vụ và ctv., 2005). Các loại môi trường được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật như: môi trường MS (Murashige và Skoog), môi trường White, Knop và B5 của Gamborg… Trong đó, môi trường White, Knop là môi trường nghèo dinh dưỡng; môi trường B5 của Gamborg là môi trường có hàm lượng dinh dưỡng trung bình; còn môi trường MS là môi trường giàu dinh dưỡng. Môi trường MS được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô, phù hợp với nhiều đối tượng nuôi cấy và được sử dụng rất nhiều trong các trường hợp nuôi cấy. 7.4. Chất điều hòa sinh trưởng Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật giữ vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh các quá trình sinh trưởng, phát triển và các hoạt động sinh lý của thực vật. Chúng hoạt động ở nồng độ và liều lượng rất thấp, có thể kích thích hoặc ức chế các hoạt động sinh lý của thực vật. Các chất điều hòa sinh trưởng của thực vật bao gồm các chất điều hòa sinh trưởng tự nhiên và các chất điều hòa sinh trưởng tổng hợp. Benzyladenine (BA) và Thidiazuron (TDZ) thuộc nhóm cytokinin tổng hợp; α– naphtalenacetic acid (NAA) và acid 2,4 – diclorophenoxyacetic (2,4D) thuộc nhóm auxin tổng hợp là những chất được sử dụng phổ biến trong các kỹ thuật vi nhân giống, giữ vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật in vitro, có hiệu quả tác động phụ thuộc vào nồng độ sử dụng, hoạt tính vốn có của chất, mẫu nuôi cấy (Vũ Văn Vụ và ctv., 2005; Võ Thị Bạch Mai, 2004) Trong nuôi cấy mô thực vật, auxin và cytokinin có vai trò quan trọng trong sự phân chia và kéo dài của tế bào. Khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy, auxin giúp thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích hình thành rễ và tham gia cảm ứng phát sinh phôi vô tính. Auxin kích thích tạo rễ ở nồng độ thấp, còn ở nồng độ cao thì ức chế sự thành lập rễ và thay vào đó là sự tạo thành mô sẹo. Nồng độ auxin trong môi trường tạo rễ thường là 0,5 – 3,0 mg.l-1 NAA hoặc IBA. Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ, sự hình thành và 5 Khi kết hợp auxin và cytokinin sẽ tăng hoạt tính hoạt động của chúng, kích thích sự tăng trưởng và thành lập chồi. Đối với sự phát triển chồi, auxin kích thích sự sinh trưởng của các chồi non và khởi phát mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô khi sử dụng phối hợp với cytokinin (chẳng hạn NAA kết hợp với BA) (Bùi Trang Việt, 2000; Nguyễn Như Khanh, 2007). Khi phối hợp với cytokinin để nhân chồi, nồng độ auxin thường dùng là 0,1 – 1,0 mg.l-1 (Bùi Bá Bổng, 1995). Tỷ lệ giữa auxin và cytokinin quyết định kết quả phát sinh hình thái đối với mô nuôi cấy in vitro cũng như đối với cây nguyên vẹn. Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin cao thì kích thích hình thành rễ, ngược lại auxin/cytokinin thấp dẫn đến sự xuất hiện và phát triển chồi. Tỷ lệ cân đối giữa auxin và cytokinin cho phép tạo cây hoàn chỉnh (rễ, thân, lá). Tỷ lệ này thay đổi tuỳ theo đối tượng nuôi cấy và loại mô được nuôi cấy (Bùi Trang Việt, 2000; Vũ Văn Vụ và ctv., 2005; Võ Thị Bạch Mai, 2004). 7.5. Điều kiện nuôi cấy Sự nuôi cấy phải đặt trong các điều kiện ổn định về ánh sáng và nhiệt độ. Yêu cầu về nhiệt độ cho sinh trưởng và phát triển cho từng đối tượng nuôi cấy là không giống nhau. Nhiệt độ thấp hoặc rất thấp được sử dụng để làm chậm hay làm ngừng hẳn sinh trưởng của mẫu nuôi cấy. Nhiệt độ của phòng nuôi cấy thường được giữ ổn định bằng máy điều hoà nhiệt độ trong suốt thời gian nuôi cấy. Ánh sáng có ảnh hưởng mạnh tới quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, bao gồm cường độ, chu kỳ và thành phần quang phổ ánh sáng. Cường độ ánh sáng 100 – 2500 lux dùng phổ biến trong nuôi cấy nhiều loại mô. Theo Murashige (1977) ở cường độ ánh sáng cao hơn thì chồi sinh trưởng chậm lại, nhưng sẽ thúc đẩy quá trình tạo rễ. Ánh sáng tham gia vào sự phát triển phôi soma. Ánh sáng ở cường độ cao gây nên sự sinh trưởng của mô sẹo, ở cường độ trung bình kích thích sự tạo chồi và ở cường độ thấp sẽ làm gia tăng chiều cao chồi và làm chồi có màu xanh đậm (trích dẫn từ Vũ Văn Vụ và ctv., 2007). II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Phương tiện nghiên cứu 1.1. Vật liệu: giống gừng tàu (Zingiber officinale Rosc.) 1.2. Địa điểm thực hiện: Đề tài được thực hiện tại phòng nuôi cấy mô trường Đại học An Giang. 1.3. Dụng cụ và hóa chất * Dụng cụ: Keo, nồi thanh trùng, microwave, tủ cấy, thước đo, đồng hồ báo thời gian, giấy nhôm, buồng nuôi cây, các vật dụng khác… * Hóa chất: khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, chất điều hòa sinh trưởng (BA và NAA), chất khử [Ca(OCl)2 và NaOCl (Javen)]… 6 2. Phương pháp nghiên cứu 2.1. Môi trường nuôi cấy Môi trường nền (MS) gồm có khoáng đa vi lượng theo Murashige-Shoog (1962), vitamin theo Morel (1951), đường (20 g.l-1), nước dừa (100 ml.l-1), agar (8 g.l-1). Các điều hòa sinh trưởng được bổ sung vào môi trường nền. pH của môi trường là 5,8. Các keo chứa 50 ml môi trường được hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong 30 phút. 2.2. Chuẩn bị mẫu cấy Chọn củ gừng giống đã già, phía trên đỉnh sinh trưởng củ gừng có eo thắt lại. Xử lý gừng giống với thuốc phòng bệnh (Validacine, Topsin…). Ủ hom gừng trong tro trấu đã được xử lý và trong điều kiện cách ly, để hom gừng nẩy mầm tốt và hạn chế nấm bệnh. Thời gian ủ thường 15 ngày. 2.3. Cách khử mẫu và nuôi cấy Tách lấy củ gừng non từ củ mẹ, tách bỏ các lớp bẹ lá, các vảy còn bao quanh củ dưới vòi nước chảy. Rửa sạch củ nhiều lần, ngâm trong nước xà phòng 10-15 phút; rửa sạch lại nhiều lần dưới vòi nước chảy. Sau đó ngâm củ trong cồn 700 trong 1 phút. Rửa lại với nước cất vô trùng 3 lần. Tiếp theo cho mẫu vào ngâm trong dung dịch khử trùng là Ca(OCl)2 và NaOCl (Javen) với nồng độ và thời gian tương ứng, sau đó rửa sạch lại mẫu nhiều lần với nước cất vô trùng. Dùng dao mổ tiệt trùng cắt bỏ phần mô bi tổn thương do khử trùng. Dùng kẹp chuyển mẫu vào keo có chứa môi trường, mỗi bình một mẫu. Các keo nuôi mẫu được đặt trong phòng nuôi cấy có nhiệt độ từ 25-280C với cường độ ánh sáng 3000-4000 lux và chu kỳ quang 12 giờ.ngày-1. 2.4. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm các thí nghiệm sau: 2.4.1. Khử mẫu Các mẫu được khử trùng với 2 dung dịch khử là hypocanxiclorua [Ca(OCl)2] và hyposodiumchlorua (NaOCl – Javen) tương ứng với từng nồng độ và thời gian khác nhau như sau: * Ca(OCl)2: ở 2 mức nồng độ 5% và 10% (w/v) với thời gian 10, 15, 20, 25, 30 phút. * NaOCl: tỷ lệ Javen với nước cất 1:2; 1:1; 2:1 (v/v) trong thời gian 10, 15, 20, 25, 30 phút. 7 Bảng 1: Nồng độ và thời gian của chất khử mẫu Ca(OCl)2 và NaOCl Ca(OCl)2 NaOCl Thời gian (phút) 5% 10% 1:2 1:1 2:1 10 15 20 25 30 C1-1 C1-2 C1-3 C1-4 C1-5 C2-1 C2-2 C2-3 C2-4 C2-5 J1-1 J1-2 J1-3 J1-4 J1-5 J2-1 J2-2 J2-3 J2-4 J2-5 J3-1 J3-2 J3-3 J3-4 J3-5 ™ Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 10 lần lập lại, mỗi lần lập lại 1 mẫu. ™ Chỉ tiêu theo dõi: quan sát tỷ lệ mẫu sống, không bị nhiễm và phát triển tốt, tỷ lệ mẫu chết và tỷ lệ mẫu nhiễm sau 2 tuần nuôi cấy. Sau khi khảo sát được nồng độ và thời gian tối ưu của chất khử trùng mẫu, mẫu được khử trùng và nuôi cấy trên môi trường MS để tạo nguồn mẫu in-vitro. Các chồi phát triển trên môi trường nuôi cấy được tách ra, cắt bỏ lá và rễ còn khoảng 1 cm, được cấy vào môi trường của thí nghiệm nhân chồi và tạo cây hoàn chỉnh. 2.4.2. Nhân chồi: Khảo sát nồng độ kích thích tố BA cho việc nhân chồi, gồm các nghiệm thức sau: A0 : MS (đối chứng) A0,5 : MS + BA (0,5 mg.l-1) A1 : MS + B._.