Bước đầu phân tích proteomics tế bào bệnh leukemia

trưng của bệnh là sự tăng sinh không kiểm soát được của một hoặc vài dòng tế bào non (blast), bắt đầu và chủ yếu tại tuỷ xương. Các khối tế bào này gây tổn thương các cơ quan tạo máu, hệ thống miễn dịch và một số cơ quan khác, nhanh chóng đe dọa đến sức khỏe và tính mạng của người bệnh. Việc điều trị bệnh leukemia đạt hiệu quả cao đòi hỏi phải có sự phân loại và chẩn đoán chính xác các thể bệnh. Những nghiên cứu đầu tiên về bệnh leukemia bắt đầu từ đầu thế kỷ XIX, và cho đến nay, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về vấn đề phân loại và chẩn đoán bệnh. Cùng với sự tiến bộ của khoa học, bệnh leukemia đã được nghiên cứu và phân loại từ cấp độ phân tử, nhờ đó việc điều trị leukemia cấp đã có những tiến bộ rõ rệt. Một trong những phương pháp mới nhất bước đầu được áp dụng để nghiên cứu bệnh leukemia chính là proteomic. Đây là một phương pháp hữu dụng trong việc phân tích hệ protein của một cơ thể sinh vật, mang lại nhiều ứng dụng quan trọng trong sinh học, y học, dược học và trong nghiên cứu cơ chế các quá trình sinh học của cơ thể. Với kỹ thuật proteomics người ta đã nghiên cứu chỉ thị sinh học của nhiều loại bệnh khác nhau, đặc biệt là các bệnh ung thư như ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thanh quản, ung thư phổi, ung thư gan, ung thư buồng trứng… Trong khuôn khổ luận văn này, tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu: “Bước đầu phân tích proteomics tế bào bệnh leukemia” nhằm mục tiêu tách các tế bào bạch cầu của bệnh nhân bị bệnh leukemia và phân tách các protein của chúng phục vụ cho nghiên cứu proteome bệnh leukemia. CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 1.1. Khái quát về bệnh leukemia 1.1.1. Leukemia là gì? Leukemia là một dạng ung thư liên quan đến hệ thống tạo máu của cơ thể, bao gồm hệ bạch huyết và tủy xương, được đặc trưng bởi sự tăng sinh ác tính của các các dòng tế bào máu, đặc biệt là bạch cầu. Leukemia chiếm khoảng 2% tổng số các bệnh ung thư[6]. Nam giới dường như mắc leukemia nhiều hơn phụ nữ và người da trắng mắc bệnh nhiều hơn các nhóm chủng tộc người khác. Người trưởng thành bị leukemia tấn công và phát triển nhiều hơn 10 lần so với trẻ em. Leukemia gặp ở hầu hết các lứa tuổi trưởng thành. Khi leukemia diễn biến ở trẻ em, nó thường xảy ra nhất ở độ tuổi dưới 4. Riêng tại Mỹ năm 2008, theo tính toán có khoảng 44 270 người (25180 nam và 19090 nữ) được chuẩn đoán leukemia và nó sẽ cướp đi sinh mạng của 21700 người. 11% số người mắc bệnh ở độ tuổi dưới 20 [18]. 1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh leukemia Cho tới nay nguyên nhân gây leukemia vẫn chưa được làm sáng tỏ. Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu đã nhấn mạnh đến 4 nhóm nhân tố chính có thể gây ra bệnh leukemia: - Các bức xạ tự nhiên và nhân tạo. - Một vài dạng chất hóa học như các hóa chất nhómAlkyl - Một số dạng virus: HTLV1, 2 gây leukemia dòng T lympho - Các yếu tố di truyền: các dạng bất thường ở nhiễm sắc thể như chuyển đoạn, thiếu hoặc thừa nhiễm sắc thể,… Cũng giống như các bệnh ung thư khác, leukemia là kết quả từ các đột biến ADN trong quá trình nguyên phân. Các đột biến này gây hoạt hóa các gen ung thư hoặc bất hoạt các gen triệt tiêu u bướu, làm hỏng quá trình phá hủy tế bào chết cũng như quá trình biệt hóa và phân bào. Những đột biến này có thể phát sinh một cách ngẫu nhiên hoặc là kết quả của việc phơi nhiễm bức xạ hoặc hợp chất gây ung thư và những chất ảnh hưởng đến bộ máy di truyền. Virus cũng có liên quan đến một vài dạng leukemia. Bệnh thiếu máu Fanconi cũng là một tác nhân dẫn đến sự hình thành bệnh leukemia dòng tủy [24]. Do chưa tìm được nguyên nhân của bệnh, người ta không có bất cứ biện pháp nào để có thể phòng bệnh. 1.1.3. Phân loại bệnh leukemia Leukemia được chia làm 2 loại là Leukemia cấp (Acute leukemia - AL) và Leukemia kinh (Chronic leukemia – CL). Leukemia cấp là sự tăng sinh của các tế bào non, đôi khi một số tế bào đã biệt hóa, còn leukemia kinh là sự tăng sinh của các tế bào trưởng thành hơn hoặc đã biệt hóa. Dựa vào nguồn gốc của tế bào ác tính thuộc dòng lympho hay dòng tủy, người ta chia thành leukemia cấp dòng lympho (acute lymphocytic leukemia, ALL), leukemia cấp dòng tủy (acute myelocytic leukemia, AML), leukemia kinh dòng lympho (Chronic lymphocytic leukemia-CLL) và leukemia kinh dòng tủy (Chronic myelocytic leukemia - CML). Nhờ những đặc điểm về hình thái học, hóa học tế bào, phương pháp miễn dịch sử dụng kháng thể đơn dòng để xác định dấu ấn màng tế bào (CD), di truyền tế bào, sinh học phân tử, người ta phân loại leukemia cấp dòng tủy thành 8 thể từ Mo đến M7 và leukemia dòng lympho thành 3 thể L1, L2, L3. Ngoài ra còn một số thể khác như Leukemia tế bào gốc sinh máu chưa biệt hóa, Leukemia tế bào hỗn hợp (Mixed Leukemia): tủy lai với lympho, tủy lai với tế bào diệt tự nhiên (NK), tủy lai T hoặc B lympho. L1 L2 L3 M0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 Leukemia Leukemia kinh (CL) Leukemia cấp (AL) Leukemia cấp dòng tủy (AML) Leukemia cấp dòng lympho (ALL) Leukemia kinh dòng tủy (CML) Leukemia kinh dòng lympho (CLL) Hình 1. Sơ đồ phân loại bệnh leukemia 1.1.3.1. Leukemia cấp Đặc điểm của leukemia cấp là sự tăng sinh tế bào non chưa trưởng thành (immature hemopoietic), tủy xương có ≥ 30% tế bào non (blast) trong tổng số các tế bào có nhân. Các tế bào máu non sinh sản nhanh chóng trong tủy xương, chúng lấn át các tế bào bình thường, gây ức chế tạo hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, đôi khi có thể lan ra các cơ quan khác (hiện tượng thâm nhiễm hay xâm lấn). Leukemia cấp được chia làm hai nhóm chính * Leukemia cấp dòng lympho xảy ra phổ biến ở trẻ em và người mới trưởng thành. Theo thống kê ở Mỹ năm 2008 có 5430 người mắc ALL trong đó 61% ở dưới độ tuổi 20 [18]. ALL xảy ra khi các tế bào tạo máu sơ cấp gọi là nguyên bào lympho tăng sinh mà không phát triển thành các tế bào máu bình thường. Những tế bào bất thường này lấn át các tế bào máu khỏe mạnh. Chúng có thể tập trung lại trong các hạch bạch huyết và gây ra sưng tấy. Tỷ lệ sống sót đối với bệnh biến thiên theo lứa tuổi, 85% ở trẻ em và 50% ở người lớn[14] Dựa vào hình thái và hóa học tế bào (hệ thống phân loại FAB), ALL được chia thành 3 thể khác nhau[5]: + L1: Tế bào tương đối đồng nhất về mặt hình thái, đó là các tế bào nhỏ, kích cỡ tương đối đồng đều, tỷ lệ nhân và nguyên sinh chất rất hẹp. + L2: Hình thái tế bào to nhỏ khác nhau, tỷ lệ nhân, nguyên sinh chất không đồng đều, nhân có biểu hiện không thuần nhất. + L3: Tế bào ác tính cao: to, nhân có nhiều hốc (vacuole). Dựa vào dấu ấn miễn dịch của màng tế bào, ALL được phân loại theo bảng 1 Bảng 1. Phân loại theo miễn dịch ALL Thể % Hình thái Miễn dịch Dòng lympho B Tiền tiền B Tiền B Chung B biệt hóa 11 10 51 3 L1, L2 L1, L2 L1, L2 L3 HLA-DR, TdT, CD19 HLA-DR, TdT, CD19, Ig trong bào tương HLA-DR, TdT, CD19, CD10 (CALLA) HLA-DR, TdT, CD19, Ig trên bề mặt tế bào Dòng lympho T Tiền T T biệt hóa 7 17 L1, L2 L1, L2 TdT, CD3, CD7 TdT, CD3, CD&, CD1a/2 * Leukemia cấp dòng tủy là dạng leukemia cấp phổ biến nhất ở người trưởng thành, tỷ lệ mắc bệnh tăng dần theo tuổi. Ở Mỹ, tử vong do AML chiếm tỷ lệ 1,2% trong tổng số các ca tử vong vì ung thư [16]. AML xảy ra khi các tế bào non tăng sinh quá mức nhưng không hoặc kém biệt hóa để phát triển thành tế bào máu bình thường. Các nguyên tủy bào non chất đầy trong tủy xương và cản trở sự sản sinh của các tế bào máu khỏe mạnh bình thường. Điều này dẫn tới thiếu máu (không có đủ tế bào hồng cầu), chảy máu và thâm tím (do thiếu các tế bào tiểu cầu, yếu tố giúp tạo thành cục máu đông) và thường xuyên bị nhiễm trùng vì không có đủ các tế bào bạch cầu làm nhiệm vụ bảo vệ. Tỷ lệ sống sót trong 5 năm của bệnh nhân mắc AML là 40% [9]. Dựa vào hình thái và hóa học tế bào (FAB), AML được chia thành 8 thể khác nhau [5] + M0: Tế bào tủy không biệt hóa hoặc biệt hóa rất ít, phản ứng PO+ <3% + M1: Tế bào tủy biệt hóa rất ít, phản ứng PO+ >3% + M2: Tế bào tủy đã biệt hóa một phần, phản ứng PO+ >20% + M3: Tế bào biệt hóa ở giai đoạn tiền tủy bào – gọi là leukemia cấp tiền tủy bào + M4: Bệnh lý xảy ra ở tế bào nguồn giai đoạn hạt/mono – gọi là leukemia cấp dòng hạt/mono + M5: Bệnh lý xuất hiện ở tế bào đầu dòng mono - gọi là leukemia cấp dòng mono + M6: Bệnh lý xảy ra ở tế nào đầu dòng hồng cầu gọi là leukemia cấp dòng hồng cầu + M7: Bệnh lý xảy ra ở đầu dòng mẫu tiểu cầu gọi là leukemia dòng mẫu tiểu cầu. Dựa vào dấu ấn miễn dịch của màng tế bào, AML được phân loại như bảng 2 Bảng 2. Phân loại theo miễn dịch AML Thể Hình thái Miễn dịch + Dòng tủy chung: M0, M1-M3 CD33+, CD34 + Dòng hạt/mono: M4 CD33+, CD14+, CD13, CD11+, + Dòng tủy mono: M5 CD14+, CD33+ + Dòng hồng cầu M6 Glycophorin –A, CD71 + Dòng mẫu tiểu cầu: M7 CD41, CD61 Hiện nay, hệ thống phân loại của tổ chức y tế thế giới (WHO) cũng được khuyến cáo sử dụng và thêm vào đó các dữ liệu về mặt lâm sàng cũng như các đặc tính sinh học đáng quan tâm như hình thái học, hoá học tế bào, kiểu hình miễn dịch, di truyền tế bào và sinh học phân tử. Việc phân chia các phân nhóm cũng dựa vào sự khác biệt các thông số chẩn đoán và xác định các bệnh nhân phù hợp hơn với các phương pháp điều trị đặc biệt. 1.1.3.2. Leukemia kinh Leukemia kinh phân biệt với Leukemia cấp là cơ thể sản sinh quá nhiều tế bào máu gần trưởng thành, chúng phát triển theo các con đường khác nhau nhưng thường không thực hiện chức năng giống như các tế bào máu trưởng thành. Leukemia kinh thường phát triển chậm hơn và ít biểu hiện rầm rộ hơn leukemia cấp. Có hai dạng leukemia kinh chủ yếu: - Leukemia kinh dòng lympho thường gặp ở những người trên 55 tuổi. Tỷ lệ người mắc bệnh này cao nhất là ở độ tuổi từ 60 đến 70 tuổi. Ở CLL, các tế bào ác tính trong tủy xương là tế bào thuộc lympho. Những tế bào bất thường này không có khả năng chống lại sự nhiễm trùng như các tế bào bình thường. Ở CLL, các tế bào ung thư có trong tủy xương, máu, lách và hạch bạch huyết, chúng gây ra lách to, hạch to. Tỷ lệ sống sót trong 5 năm của bệnh nhân mắc CLL là 75% [18]. - Leukemia kinh dòng tủy hay gặp nhất ở độ tuổi từ 25 đến 60 tuổi. Ở CML, các tế bào ác tính là tế bào thuộc dòng tủy. Các tế bào CML thường chứa một dạng bất thường trong mã di truyền gọi là nhiễm sắc thể Philadelphia. Tuy nhiên, bệnh này không di truyền. Leukemia kinh dòng tủy có thể được chữa khỏi bằng việc cấy ghép tủy xương. Tỷ lệ sống sót trong 5 năm của bệnh nhân mắc CML là 90% [20]. Ngoài ra còn có Leukemia tế bào tóc (Hairy cell leukemia - HCL). HCL đôi khi được coi là một dạng của CLL, tuy nhiên nó không hoàn toàn giống những đặc điểm của CLL. Khoảng 80% những người bị bệnh này là nam giới và chưa có một trường hợp nào xảy ra ở trẻ em. Tỷ lệ sống của bệnh này trong 10 năm là từ 96-100% [12]. 1.1.4. Triệu chứng của bệnh leukemia Các biểu hiện ban đầu của leukemia cũng giống như triệu chứng của cảm cúm hay các bệnh thông thường khác, bao gồm 4 hội chứng chủ yếu: - Hội chứng nhiễm trùng: sốt, mệt mỏi, đau khớp, thường xuyên nhiễm trùng. - Hội chứng thiếu máu: da xanh, đau đầu, chóng mặt, chảy máu hay sưng tấy ở răng, lợi. - Hội chứng xuất huyết ở da, niêm mạc, cơ khớp, chậm lành các vết thương, chảy máu mũi hay thường xuyên bị bầm tím. - Hội chứng hạch: hạch to, lách to, gan to, cảm thấy đầy bụng, chướng bụng. 1.4.5. Chẩn đoán bệnh leukemia Bác sỹ có thể không phát hiện ra leukemia nếu chỉ dựa trên những triệu chứng của bệnh nhân. Tuy nhiên, qua quá trình khám sức khỏe, bác sỹ có thể phát hiện ra rằng bệnh nhân có hạch bạch huyết nổi lên hay hiện tượng tăng kích thước của gan hoặc lách. Việc chẩn đoán có thể trở nên rõ ràng hơn khi các xét nghiệm máu định kỳ (đặc biệt là đếm tế bào máu) cho kết quả khác thường. Bệnh nhân được chỉ định tiến hành lần lượt các xét nghiệm cho đến khi xác định chính xác thể bệnh mắc phải. Các xét nghiệm bao gồm: huyết đồ, tủy đồ, sinh thiết tủy, hóa học tế bào, miễn dịch tế bào và di truyền tế bào. Dựa vào đó, bác sĩ đưa ra phác đồ điều trị thích hợp cho từng bệnh nhân. Huyết đồ là xét nghiệm cho phép xác định số lượng các tế bào máu và các thành phần liên quan của máu ngoại vi: hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu, hàm lượng huyết sắc tố, tỷ lệ hồng cầu trên thể tích máu toàn phần, phản ánh tình trạng thiếu máu hoặc cô đặc máu (hematocrit). Huyết đồ được tiến hành nhằm: - Sàng lọc những bệnh lý đặc trưng bởi những thay đổi nghiêm trọng về số lượng tế bào máu (ví dụ trong các bệnh nhiễm trùng, một số bệnh ung thư, ở các bệnh nhân tiếp xúc với hóa chất độc hại…) - Theo dõi diễn biến của một số bệnh như: bệnh leukemia, u bạch huyết, các bệnh liên quan tới máu, bệnh mạn tính… - Theo dõi tác dụng phụ của một số thuốc có khả năng ức chế hoạt động của tủy xương. Điều này đặc biệt quan trọng đối với những bệnh nhân bị một số bệnh ung thư (nhất là ung thư máu, u bạch huyết), và những người phải dùng hóa trị liệu hoặc xạ trị. Nếu số lượng tế bào máu giảm xuống mức quá thấp, bác sĩ sẽ cho bệnh nhân nhập viện ngay vì lúc này họ rất dễ bị nhiễm trùng, chảy máu hoặc bị các biến chứng nghiêm trọng khác, gây nguy hiểm cho tính mạng. Ở bệnh nhân leukemia cấp, huyết đồ thể hiện tình trạng giảm 1-3 dòng tế bào của máu ngoại vi và xuất hiện bạch cầu non trong công thức bạch cầu. Các chỉ số hồng cầu máu ngoại vi thường cho thấy một tình trạng thiếu máu bình sắc hồng cầu bình thường không hồi phục. Số lượng bạch cầu có thể từ dưới 1G/l cho đến trên 200G/l. Đa số các bệnh nhân có số lượng bạch cầu khoảng từ 5-30G/l [4][1]. Tủy đồ của bệnh nhân leukemia cấp thường cho thấy một tình trạng tủy giàu tế bào. Tuy nhiên trong những trường hợp leukemia thứ phát tủy thường nghèo tế bào hoặc có mật độ bình thường. Các dòng tế bào tạo máu bình thường trong tủy bị thay thế bởi những tế bào non ác tính. Các tế bào này phải chiếm một tỷ lệ ≥30% các tế bào có nhân trong tủy thì mới có thể xác định chẩn đoán là leukemia. Bên cạnh đó có thể quan sát thấy sự trưởng thành không bình thường của các dòng tế bào còn lại, thể Auer trong bào tương của tế bào leukemia, đặc biệt trong các trường hợp leukemia cấp dòng tủy. Ở bệnh nhân leukemia kinh dòng tủy, huyết đồ thể hiện tình trạng thiếu máu (thường là nhẹ hoặc vừa) bình sắc, kích thước hồng cầu bình thường. Số lượng bạch cầu tăng cao (thường trên 50-80G/l), gặp đủ các tuổi của dòng bạch cầu hạt trong công thức bạch cầu máu ngoại vi, tỷ lệ tế bào blast hoặc nguyên tủy bào và tiền tủy bào dưới 15%, tăng tỷ lệ bạch cầu đoạn ưa acid và bạch cầu đoạn ưa base, số lượng tiểu cầu tăng trên 400G/l. Tủy đồ thường giàu tế bào, số lượng tế bào tủy trên 100G/l, tăng sinh dòng bạch cầu hạt đủ các lứa tuổi, tỷ lệ dòng bạch cầu hạt/dòng hồng cầu trên 10:1 (tỷ lệ bình thường là 3-4:1), tỷ lệ tế bào blast hoặc nguyên tủy bào và tiền tủy bào dưới 15% [4]. Ở bệnh nhân CLL, huyết đồ thể hiện sự tăng các tế bào thuộc dòng lympho trưởng thành về số lượng, có khi tăng trên 5G/l thậm chí tăng hơn 500G/l, số lượng hồng cầu giảm, tiểu cầu giảm, dòng bạch cầu hạt giảm nặng. Xét nghiệm tủy cho thấy tế bào thuộc dòng lympho xâm lấn, lán át toàn bộ tủy, các tổ chức mỡ bị lấn át. 1.2. Proteomics 1.2.1. Proteomics là gì Từ "proteome" được cấu thành từ "protein" và "genome". Proteome của cơ thể sinh vật là tập hợp của tất cả các loại protein được sản xuất trong suốt cuộc đời chúng, cũng giống như khái niệm "genome" để chỉ tập hợp của các loại gen. Thời kỳ “proteome” bắt đầu từ năm 1994 bởi Mark Wilkins và cộng sự ở Macqarie University tại Sydney, Australia, và nó bao hàm tất cả những protein trong tế bào, mô, hay cơ quan [17]. Proteomics là môn khoa học rộng lớn nghiên cứu protein sản phẩm của gen, không chỉ là tất cả các protein của một tế bào nào đó, mà còn là tập hợp của tất cả các dạng, những protein đã được cải biến, những tương tác giữa chúng, cấu trúc không gian và cả những phức hệ cao hơn của protein. Nghiên cứu proteomics thường được coi như là bước tiếp theo trong quá trình nghiên cứu hệ thống sinh học. Vì sao phải nghiên cứu hệ protein? Việc giải mã hoàn chỉnh hệ gen người là một bước tiến lớn của nền khoa học nhưng đồng thời cũng đặt ra một thực tế là thông tin di truyền của bộ gen người cho biết không đầy đủ chức năng của nó. Ở mức độ phiên mã, mặc dù đã đạt được những thành tựu đáng kể trong nghiên cứu mức độ biểu hiện, nhưng vẫn còn nhiều hạn chế, nhiều vấn đề không thể giải quyết được như: sau dịch mã, đa số các protein bị biến đổi hóa học bởi các quá trình cải biến, các tương tác protein-protein, các phản ứng với gốc cacbonhydrat, gốc photphat. Những biến đổi này đóng vai trò chủ yếu trong việc kích hoạt chức năng của protein. Kết quả là từ một gen ban đầu có thể tìm thấy sự đa dạng về biểu hiện, cấu trúc, và chức năng dưới nhiều loại protein khác nhau. Có nhiều nghiên cứu cho thấy, ở người có 25.000 gen đã được nhận diện nhưng có khoảng lớn hơn 500.000 protein được tạo ra từ các gen đó [17]. Điều này là tăng thêm phần khó khăn với những thay đổi do sự tác động cơ học, sự cải biến của các protein (các quá trình glycosyl hóa, phosphory hóa) và sự biến tính của protein. Như vậy, mức độ biểu hiện gen không phản ánh đúng về số lượng protein có hoạt tính trong tế bào. Ngoài ra, theo các kết quả nghiên cứu thì chỉ có khoảng 2% số bệnh tật đã biết được xác định là do các sai lệch về gen: ví dụ như ở bệnh bạch cầu cấp dòng tủy, thể M2 là do chuyển đoạn nhiễm sắc thể số 8 và nhiễm sắc thể số 21 hoặc thể M3 là sự chuyển đoạn nhiễm sắc thể số 15 và nhiễm sắc thể số 17, 98% số bệnh còn lại cần được làm sáng tỏ ở mức tương tác protein hay còn gọi là mạng lưới protein. Do đó cần xác định cấu trúc không gian ba chiều của những protein này, từ đó cho thấy việc nghiên cứu hệ protein người là cần thiết. Các nhà khoa học trên thế giới rất quan tâm đến proteomics bởi vì nó mang lại những hiểu biết về thế giới sinh học nhiều hơn so với những hiểu biết về cấu trúc cơ thể cũng như là hệ gen. Từ khi protein đóng vai trò trung tâm trong cơ thể sống thì proteomics chính là công cụ hữu hiệu trong việc khám phá ra các chỉ thị sinh học (biomarkers), nhằm nhận diện các loại bệnh khác nhau. Cơ thể con người thậm chí có thể có đến trên 2 triệu loại protein, mỗi loại đóng một vai trò khác nhau. Tính chất không đồng nhất giữa các loại protein đã cho thấy sự đa dạng của protein không thể giải thích và mô tả hoàn toàn thông qua quá trình phân tích hệ gen. Do đó proteomics được sử dụng hữu hiệu hơn trong việc nghiên cứu tế bào và các loại mô. 1.2.2. Proteomics và chỉ thị sinh học Một trong những ứng dụng quan trọng của proteomics là sử dụng các protein đặc hiệu làm các chỉ thị sinh học trong chẩn đoán bệnh. Một số kỹ thuật cho phép kiểm tra quá trình sinh ra của các protein trong suốt quá trình hình thành của từng loại bệnh, từ đó có thể chẩn đoán các loại bệnh rất nhanh chóng. Các kỹ thuật này bao gồm Western blot, nhuộm mô hóa miễn dịch, hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme (enzyme linked immunosorbent assay-ELISA) hoặc khối phổ. Theo đó có một vài loại bệnh mà những chỉ thị sinh học có thể nhận ra một cách dễ dàng để chẩn đoán bệnh. Ở người bị bệnh Alzheimer, sự tăng lên của β-Secretase tạo nên amyloid/beta-protein, chúng tập hợp tạo thành mảng trong não bệnh nhân, gây ra chứng mất trí. Tấn công vào enzyme này làm giảm amyloid/beta-protein và làm chậm tiến trình của bệnh. Để xác định sự tăng của amyloid/beta-protein, người ta đã áp dụng kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch (immunohistochemical staining), trong đó kháng thể được gắn vào amyloid/beta-protein có mặt trong các mô[15]. Đau tim là căn bệnh thường được đánh giá bằng một vài loại protein chỉ thị sinh học. Các protein chuẩn làm chỉ thị cho các bệnh tim mạch bao gồm interleukin-6, interleukin-8, serum amyloid A protein, fibrinogen, và troponins. cTnI cardiac troponin I sẽ tăng lên và tập trung trong vòng từ 3 đến 12 giờ trước khi những triệu chứng ban đầu khi bị đau tim xuất hiện và có thể dự đoán trước nhiều ngày sau khi có cơn nhồi máu cơ tim cấp tính. Có rất nhiều thương phẩm đã được sản xuất và được dùng trong bệnh viện như là những phương thức chính để kiểm tra chứng nhồi máu cơ tim cấp. Phân tích proteomics của tế bào thận và tế bào ung thư thận đã được tiến hành hứa hẹn tạo ra chỉ thị sinh học cho các tế bào ung thư biểu mô ở thận và phát triển thành bộ kit thử để kiểm tra bệnh. Ở các bệnh liên quan đến thận, nước tiểu là một nguồn chỉ thị sinh học đầy tiềm năng. Gần đây, người ta đã nghiên cứu được các polypeptides trong nước tiểu có thể là những chỉ thị sinh học của các bệnh liên quan đến thận, cho phép người ta có thể phân tích, chẩn đoán bệnh một vài tháng trước khi xuất hiện các triệu chứng của bệnh [22]. Việc nắm được thông tin của hệ proteome, cấu trúc và chức năng của từng protein và phức hệ tương tác protein-protein sẽ quyết định đến việc phát triển các kỹ thuật chẩn đoán hữu hiệu cũng như những phương pháp chữa trị bệnh trong tương lai. 1.2.3. Một số kỹ thuật quan trọng sử dụng trong Proteomics Proteomics phát triển dựa trên sự tiến bộ của rất nhiều công nghệ. - Kỹ thuật điện di một chiều và hai chiều : Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các vật thể mang điện tích dưới tác động của điện trường. Điện di hay điện di trên gel áp dụng trong sinh học phân tử là một kĩ thuật để phân tích các phân tử ADN, ARN hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện (isoelectric point). Kĩ thuật này hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trường tác động vào các phân tử tích điện và kích thước lỗ của thể nền (gel). Các phân tử được phân tách khi di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào sự khác nhau của lực điện trường tác động lên chúng (nếu các phân tử tích điện khác nhau), kích thước của phân tử so với kích thước lỗ của gel và hình dạng, độ cồng kềnh của phân tử. Điện di protein thường sử dụng là điện di trên gel acrylamide có SDS (SDS-PAGE), hoặc điện di 2 chiều (2-DE). Phương pháp nền tảng trong nghiên cứu proteomics là điện di hai chiều (2-DE), cho đến nay vẫn được coi là phương pháp không thể thay thế trong việc mô tả thành phần protein (hệ proteome) của một cơ thể. 2-DE được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1975 bởi Klose và O'Farrell [19]. Kỹ thuật này cho phép phân tích và nhận rõ ràng đến hàng nghìn protein trong một bản gel điện di, trong đó các protein được phân tách dựa trên hai đặc tính là điểm đẳng điện và khối lượng phân tử. Ứng dụng của điện di hai chiều là phân tách phức hệ protein hỗn hợp và phân tích sự cải biến protein sau khi phiên mã. Điện di hai chiều còn cho ta biết những thông tin có giá trị về đặc tính phân tử protein, mối quan hệ giữa điểm đẳng điện (pI) của protein và khối lượng phân tử. - Các phần mềm phân tích ảnh Các phần mềm phân tích ảnh điện di có khả năng định lượng và tự động nhận ra các điểm của protein trong gel mẫu. Mặc dù các phần mềm này chưa thật hoàn hảo nhưng kết hợp với năng lực xử lý và kinh nghiệm người sử dụng, các phần mềm này đều cho những kết quả rất tốt. - Sắc ký lỏng đa chiều (Multidimentional Liquid Chromatography-MDLC) Mặc dù điện di hai chiều có nhiều ưu điểm như đã trình bày ở trên nhưng phương pháp này còn có hạn chế là: khó phát hiện các protein có hàm lượng thấp, có điểm đẳng điện quá thấp hoặc quá cao cũng như các protein không hòa tan là thành phần cấu trúc của màng. Một phương pháp khác cho phép khắc phục những nhược điểm ấy là kỹ thuật sắc ký đa chiều (MDLC). MDLC cho phép phân tích hiệu quả các thành phần protein phức tạp, trong đó mỗi hỗn hợp protein có thể giảm độ phức tạp qua một loạt cột sắc ký lỏng khác nhau. Dựa vào số lần mẫu được tiến hành phân tích qua sắc ký mà người ta chia thành sắc ký lỏng một chiều, hai chiều (2DLC) (kết hợp sắc ký trao đổi ion hoặc sắc ký ái lực và sắc ký pha đảo), hoặc ba chiều - Khối phổ Phương pháp khối phổ xuất hiện từ những năm đầu của thế kỉ XX do Thomson và các nhà khoa học khác tìm ra từ năm 1912 [17]. Nó đóng vai trò quan trọng trong việc xác định cấu trúc của những phân tử nhỏ. Sau đó, phương pháp này cũng được cải tiến để ứng dụng trong nghiên cứu sinh học đặc biệt là xác định cấu trúc của các đại phân tử như protein. Proteomics dựa trên nguyên lý khối phổ đã trở thành một môn khoa học thật sự nhờ các dữ liệu về trình tự gen và genome cùng với nhiều thành tựu kỹ thuật vượt bậc trong nhiều lĩnh vực khác, trong đó đặc biệt phải kể đến sự phát triển của những phương pháp ion hóa protein. Các kỹ thuật này là những kỹ thuật không thể thiếu được để diễn giải những thông tin được mã hóa trong hệ genome. Cho đến nay những phân tích về protein (trình tự bậc 1, những biến đổi sau phiên mã, dịch mã hoặc tương tác giữa protein-protein v.v.) bằng khối phổ không chỉ thành công với những nhóm protein có chức năng riêng biệt, mà cả với phức hệ protein được biểu hiện trong tế bào. Trong những năm gần đây, khối phổ (MS) đã trở thành công cụ được lựa chọn để hoàn thiện phân tích những mẫu protein. Khối phổ là một phương pháp kỹ thuật ở đó đo được 2 đặc tính: tỷ lệ khối lượng/điện tích của phân tử ở dạng ion hóa (m/z); và số lượng những ion biểu hiện cho mỗi giá trị m/z. Một cách đơn giản, kỹ thuật phân tích này làm cho từng phân tử protein tách khỏi nhau thành các peptid nhỏ và phát tán rộng như một đám mây gồm các ion mang điện tích và di chuyển tự do. Phương pháp phổ biến để xác định khối lượng của các ion này - là gia tốc chúng trong buồng chân không, để đo được thời gian bay (Time of Flight - TOF) của chúng. Chúng "đạt tới mục tiêu" trong một trật tự được xác lập, một phần bởi điện tích và một phần bởi khối lượng của chúng. Những ion nhanh nhất là những ion nhẹ nhất và có điện tích lớn nhất. Sản phẩm cuối cùng là một phổ khối lượng hay đồ thị với một loạt những đỉnh nhọn, mỗi một đỉnh tiêu biểu cho ion hoặc chất mang những mảnh protein có mặt trong mẫu thử đã cho. Chiều cao của đỉnh và khoảng cách giữa chúng là dấu hiệu của mẫu và cung cấp đầu mối để nhận dạng chúng 1.3. Proteomics trong nghiên cứu bệnh leukemia Với những tiến bộ trong chẩn đoán và điều trị bệnh leumkemia, tỷ lệ bệnh nhân tử vong đã giảm và tỷ lệ bệnh nhân sống sót cũng tăng ở cả người trưởng thành và trẻ em trong tất cả các thể bệnh. Tuy nhiên vẫn có tới 21790 người chết ở Mỹ vào năm 2007 vì loại bệnh máu ác tính này. Với các thể bệnh leukemia, tỷ lệ sống sót chỉ chỉ hơn 50%. Mặc dù tỷ lệ tử vong ở trẻ em từ 0-14 tuổi mắc leukemia đã giảm đến 70% qua ba thập kỷ nhưng bệnh này vẫn gây ra nhiều cái chết hơn bất cứ bệnh ung thư nào khác đối với trẻ em Mỹ. Ước tính đã có 515 trẻ em chết vì leukemia tại Mỹ năm 2007[18]. Do đó, việc điều trị bệnh leukemia vẫn luôn là một trong những thách thức to lớn của nền y học hiện đại. Mục tiêu của việc điều trị là làm giảm hoàn toàn các triệu chứng, bệnh lý của bệnh và bệnh nhân trở lại sức khỏe bình thường với các tế bào máu và tủy bình thường. Đối với bệnh leukemia cấp, sự lui bệnh hoàn toàn (không có các biểu hiện về bệnh trong máu và tế bào) trong 5 năm liên tục là dấu hiệu chứng tỏ bệnh đã được chữa trị. Các báo cáo gần đây cho thấy càng ngày càng có nhiều bệnh nhân leukemia đã lui bệnh hoàn toàn ít nhất sau 5 năm khi họ chẩn đoán phát hiện bệnh. Để nâng cao khả năng chẩn đoán và đẩy lui bệnh, ngày càng có nhiều phương pháp mới được áp dụng trong nghiên cứu leukemia. Phương pháp quan sát kiểu nhân đã cung cấp các thông tin quan trọng nhất trong chẩn đoán ở AML trưởng thành. Ngoài ra, bằng việc sử dụng các phân tích trên nhiễm sắc thể thấy rằng xấp xỉ 50% số bệnh nhân AML không có các bất thường nhiễm sắc thể [13]. Đối với các bệnh nhân AML này, các phương pháp di truyền phân tử trở thành yếu tố quan trọng chính. Liệu pháp miễn dịch cung cấp cơ hội loại bỏ các tế bào miễn dịch còn sót lại trong quá trình lui bệnh và có thể giảm đáng kể hay thậm chí loại trừ rủi ro của sự tái phát. Trong suốt 20 năm qua, y học đã có sự cải tiến đáng kể trong khả năng đánh giá xác định các kháng nguyên ung thư. Phân tích huyết thanh qua các ngân hàng biểu hiện cADN tái tổ hợp cho phép việc nhận dạng các kháng nguyên liên kết với leukemia dựa vào việc nhận ra chúng bằng các phản ứng dịch thể nhưng cũng đưa ra một chứng minh rằng những kháng nguyên này được nhận biết bằng các tế bào T CD4+ và CD8+ cũng tốt như tế bào B. Gần đây, kỹ thuật vi chuỗi phản ứng (microarray), phân tích đa hình nucleotide đơn (SNPs) và điện di hai chiều cho phép chúng ta phân tích sâu rộng về sự khác biệt về gen, ARN và protein giữa bệnh nhân và các mẫu đối chứng bình thường. Hiện nay, với việc áp dụng các kỹ thuật proteomics trong phân tích leukemia người ta đã đi sâu vào nghiên cứu leukemia theo nhiều con đường và mục đích khác nhau. Tất cả các nghiên cứu này hướng tới mục đích cuối cùng là làm tăng hiệu quả điều trị bệnh leukemia. Các nghiên cứu proteomics bệnh leukemia thường dựa trên một trong hai nguồn nguyên liệu chính là huyết tương và tế bào bệnh nhân 1.3.1. Phân tích proteomics trong huyết tương bệnh nhân leukemia Huyết tương (plasma) là phần dịch lỏng màu vàng nhạt còn lại sau khi máu đã loại bỏ các tế bào máu. Một người trưởng thành chứa khoảng 2,5 lít huyết tương với gần 250gram protein. Hàm lượng protein trong huyết tương thay đổi từ 60-80mg/ml. Dịch huyết tương có tính lỏng, keo nhớt, có tỷ trọng 1,051±0,005, pH=7,3-7,4, ở 370C, áp suất thẩm thấu trong khoảng 7,2-8,1. Người ta ước lượng có khoảng từ 1000 đến 2000 protein khác nhau có mặt trong huyết tương tại một thời điểm nhất định, phần lớn trong số chúng là các protein có nồng độ rất thấp (<1ng/ml). Các protein trong huyết tương thay đổi khác nhau về số lượng và nồng độ, nó được coi là hệ protein phức tạp nhất ở người. Huyết tương cũng được coi là hệ protein hoàn thiện nhất, chứa một loạt các protein khác nhau, là mẫu proteome hàng đầu được dùng cho chẩn đoán y học. Những hiểu biết hệ protein huyết tương rất quan trọng về mặt lâm sàng, cung cấp những thông tin chắc chắn thúc đẩy nhanh quá trình phát hiện bệnh. Một số protein có hàm lượng cao (>mg/ml) như albumin thông thường thay đổi từ 35-50 mg/ml (chiếm từ 50-70%), do sự tổng hợp hàng ngày của gan (12g) và có chu kỳ sống là 21 ngày nên nó được coi là chỉ thị của bệnh sơ gan hay bệnh suy dinh dưỡng . Các protein có hàm lượng thấp (<ng/ml) chỉ chiếm 1% hàm lượng protein tổng số, như interleukin 6 thông thường thay đổi trong khoảng 0-5 pg/ml được coi là chất chỉ thị có độ nhạy cao._.